CN108865996A - 无血清t淋巴细胞培养基、其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无血清T淋巴细胞培养基，其包括DMEM/F12培养基、人血清白蛋白、人过氧化氢酶、蛋氨酸脑啡肽、干细胞生长因子、人转铁蛋白、亚油酸、叶酸、白介素4、白介素2、次黄嘌呤、膦胺霉素、庆大霉素、IL‑7、IL‑15异二聚体等组分。本发明还公开制备所述培养基的方法及利用其培养T淋巴细胞的方法。本发明提供的培养基在用于培养人源T淋巴细胞时，通过培养基中各组分的协同作用，可以使人源T淋巴细胞高效扩增，并保持较高的免疫细胞功能，为后续回输病人体内的基因修饰淋巴T细胞的质量提供保障，以便能够特异杀伤其抗原靶向的肿瘤细胞，同时其还具有保质期长，易于制备等优点。

Description

无血清T淋巴细胞培养基、其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种人源T淋巴细胞培养基，特别涉及一种无血清T淋巴细胞培养基、其制备方法与应用，属于生物医疗技术领域。
背景技术
目前，肿瘤免疫细胞治疗已越来越被人们青睐，它被认为是21世纪肿瘤综合治疗模式中最有发展前途的治疗手段。肿瘤免疫细胞治疗技术是运用生物技术和生物制剂从患者体内分离免疫细胞进行体外培养、激活和扩增后，回输到患者体内，直接杀伤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤目的。在基因修饰免疫细胞治疗领域，CAR-T疗法(嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)、TCR-T疗法(T细胞受体修饰的T细胞疗法)等已经得到了越来越广泛的应用。在免疫细胞治疗过程中，人源T淋巴细胞的培养是必不可少的。一般来说，在培养人源T淋巴细胞时，不仅需要营养比例协调且丰富的培养基来帮助其维持生长，更需要培养基在能够促进其高速扩增的同时肿瘤杀伤能力不会减弱。现有的细胞培养基，如RPMI1640、DMEM/F12培养基等，虽然能基本维持抗原特异性T细胞的生长所需营养，但仍存在一些缺陷，例如不能有效促进其增殖，以及培养后肿瘤杀伤能力减弱等问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种免疫细胞培养基与其应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种无血清T淋巴细胞培养基，其包括DMEM/F12培养基、人血清白蛋白500.0mg/L～3000.0mg/L、人过氧化氢酶200.0mg/L～2200.0mg/L、蛋氨酸脑啡肽385mg/L～425mg/L、干细胞生长因子5mg/L～40mg/L、人转铁蛋白40～180mg/L、亚油酸100.0mg/L～1200.0mg/L、叶酸2.45mg/L～2.65mg/L、白介素410mg/L～80mg/L、白介素217～70mg/L、次黄嘌呤1mg/L～3mg/L、膦胺霉素10IU/ml～40IU/ml、庆大霉素10IU/ml～50IU/ml、IL-77μg/L～9μg/L、IL-15异二聚体3μg/L～5μg/L、亚硒酸钠维生素e 0.5mg/L～5mg/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠30mmol/L～45mmol/L。
本发明实施例还提供了所述无血清T淋巴细胞培养基的制备方法，其包括：
将人血清白蛋白、人过氧化氢酶、蛋氨酸脑啡肽、干细胞生长因子、人转铁蛋白、白介素4、白介素2、次黄嘌呤、IL-7、IL-15异二聚体、溶于未加碳酸氢钠的DMEM培养基中，形成第一溶液；
将亚油酸、叶酸、亚硒酸钠维生素e溶于无水乙醇中，形成第二溶液；
将第一溶液、第二溶液与4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠、膦胺霉素、庆大霉素混合，再以DMEM/F12培养基稀释，形成所述无血清T淋巴细胞培养基。
本发明实施例还提供了所述的无血清T淋巴细胞培养基在培养T淋巴细胞中的应用。
本发明实施例还提供了一种T淋巴细胞培养方法，其包括：采用所述的无血清T淋巴细胞培养基培养T淋巴细胞。
进一步地，所述的培养方法包括：将抗原特异性人源T淋巴细胞以所述无血清T淋巴细胞培养基培养进行高效扩增培养5～8天，在所述高效扩增培养过程中，调整细胞的浓度为0.8×106个/mL～1.2×106个/mL，得到扩增后的抗原特异性人源T淋巴细胞。
较之现有技术，本发明提供的无血清T淋巴细胞培养基通过在DMEM/F12培养基的基础上添加多种功能组分，在用于培养人源T淋巴细胞时，通过培养基中各组分的协同作用，使人源T淋巴细胞高效扩增，并保持较高的免疫细胞功能，起到很好的肿瘤特异性杀伤功能，为后续回输病人体内的基因修饰淋巴T细胞的质量提供保障，以便能够特异杀伤其抗原靶向的肿瘤细胞，同时其还具有保质期长，易于制备等优点。
附图说明
图1示出了分别采用本发明实施例1-实施例4及对照组1-3的培养基进行抗原特异性人源T淋巴细胞培养的细胞增殖倍数。
图2示出了分别采用本发明实施例1-实施例4及对照组1-3的培养基扩增培养的抗原特异性人源T淋巴细胞培养的肿瘤细胞杀伤效率。
具体实施方式
鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要涉及一种改进的无血清T淋巴细胞培养基及其在培养抗原特异性人源T淋巴细胞中的应用。
若非特殊说明，本说明书中所涉及的技术术语的释义与本领域的常规释义相同。
本发明的无血清T淋巴细胞培养基中各原料均应是符合美国药典或《国家标准化学试剂》或《中华人民共和国药典》2010年版第二部的超纯或分析纯试剂，以满足临床安全合理的要求。本发明的无血清T淋巴细胞培养基不含任何动物源成份，其中的生物来源成分均为药物级或高度纯化的人源物质，因此安全性是有保证的。
本说明书中述及的无血清T淋巴细胞培养基中各组分及细胞培养方法中所使用的细胞、原料均是从公众途径获取。
以下结合若干实施例对本发明的技术方案作更为具体的说明。
实施例1-实施例4的无血清T淋巴细胞培养基的组分详见下表：
组分 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
人血清白蛋白 3000.0mg/L 1500.0mg/L 500.0mg/L 1000.0mg/L
人过氧化氢酶 2200.0mg/L 1200.0mg/L 800.0mg/L 200.0mg/L
蛋氨酸脑啡肽 398mg/L 385mg/L 425mg/L 405mg/L
干细胞生长因子 20mg/L 40mg/L 15mg/L 5mg/L
人转铁蛋白 40mg/L 80mg/L 180mg/L 120mg/L
亚硒酸钠维生素e 3mg/L 5mg/L 1mg/L 0.5mg/L
4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠 45mmol/L 35mmol/L 30mmol/L 40mmol/L
亚油酸 100.0mg/L 500.0mg/L 800.0mg/L 1200.0mg/L
IL-15异二聚体 3μg/L 4μg/L 5μg/L 5μg/L
IL-7 9μg/L 7μg/L 9μg/L 8μg/L
叶酸 2.45mg/L 2.65mg/L 2.45mg/L 2.65mg/L
白介素4 10mg/L 30mg/L 50mg/L 80mg/L
白介素2 17mg/L 70mg/L 39mg/L 50mg/L
次黄嘌呤 2mg/L 3mg/L 1mg/L 3mg/L
膦胺霉素 40IU/ml 30IU/ml 10IU/ml 20IU/ml
庆大霉素 10IU/ml 30IU/ml 50IU/ml 25IU/ml
DMEM/F12培养基 余量 余量 余量 余量
前述实施例1-实施例4中无血清T淋巴细胞培养基的制备方法包括：将人血清白蛋白、人过氧化氢酶、蛋氨酸脑啡肽、干细胞生长因子、人转铁蛋白、白介素4、白介素2、次黄嘌呤、IL-7、IL-15异二聚体、溶于未加碳酸氢钠的DMEM培养基中，形成第一溶液；
将亚油酸、叶酸、亚硒酸钠维生素e溶于无水乙醇中，形成第二溶液；
将第一溶液、第二溶液与4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠、膦胺霉素、庆大霉素混合，再以DMEM/F12培养基稀释，再在4℃震荡混匀1小时，然后通过0.22μm的滤膜过滤除菌待用。
采用实施例1-实施例4的无血清T淋巴细胞培养基进行抗原特异性人源T淋巴细胞培养，过程如下：
(一)抽取病人血液，并用单采机采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；采用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)洗涤，得到PBMC。
(二)取上述分离出的人外周血单个核细胞(PBMC)，加入X-VIVO基础培养基，配制成细胞悬浮液，之后加入30ng/mL的CD3单抗，室温孵育3小时后，采用流失细胞仪进行分离，并用PBS洗涤，得到CD3阳性T淋巴细胞。
(三)取上述CD3阳性T淋巴细胞，加入本发明实施例1-实施例4的培养基，重悬制成细胞悬浮液，培养1天，之后换液(去除旧培养基，重新加入实施例1-实施例4的培养基)，继续培养1天，再加入相应病毒滴度的病毒，其中，所述病毒为腺病毒，所述病毒的病毒滴度为1×108TU/mL(transducing units)，采用所述培养基调整细胞浓度为1×106个/mL接种，得到抗原特异性T淋巴细胞，经1-2天后，将得到的抗原特异性T淋巴细胞，采用前述培养基进行扩增培养，并注意控制细胞浓度为1×106个/mL，在扩增培养过程中观察细胞形态、检测细胞活性；待扩增培养到5-7天后，收集细胞，即得到扩增后的抗原特异性T淋巴细胞细胞。将抗原特异性T淋巴细胞细胞按106/mL的浓度接种后，分别采用F-12培养基、1640培养基、DMEM/F12培养基作为对照组培养基(编号分别为对照组1至3)，以及本发明实施例1提供的所述细胞培养基作为实验组的培养基来进行细胞培养，在37℃，5％CO2下进行培养5天后，通过CFSE流式细胞仪检测法来检测细胞增殖情况，结果如附图1所示。
将抗原特异性T淋巴细胞细胞按106/mL的浓度接种后，分别采用F-12培养基、1640培养基、DMEM/F12培养基作为对照组培养基(编号分别为对照组1至3)，以及本发明实施例1提供的所述细胞培养基作为实验组的培养基，与肿瘤细胞系Nalm-6在37℃，5％CO2下进行共培养，其中，控制各组的效应T细胞与肿瘤细胞系的比例为1:1，分别使用流式抗体CD3(FITC)、CD19(APC)来染色，培养16小时后通过流式细胞仪来检测肿瘤杀伤情况，结果如图2所示。从图1可以看出，与对照组的3种常规培养基相比，采用本发明提供的所述细胞培养基可以使抗原特异性T淋巴细胞的增殖速度提高3倍以上。
从图2可以看出，与对照组的3种常规培养基相比，采用本发明提供的所述细胞培养基，可以使抗原特异性T淋巴细胞的肿瘤杀伤活性提高了3倍以上。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种无血清T淋巴细胞培养基，其特征在于包括DMEM/F12培养基、人血清白蛋白500.0mg/L～3000.0mg/L、人过氧化氢酶200.0mg/L～2200.0mg/L、蛋氨酸脑啡肽385mg/L～425mg/L、干细胞生长因子5mg/L～40mg/L、人转铁蛋白40～180mg/L、亚油酸100.0mg/L～1200.0mg/L、叶酸2.45mg/L～2.65mg/L、白介素410mg/L～80mg/L、白介素217～70mg/L、次黄嘌呤1mg/L～3mg/L、膦胺霉素10IU/ml～40IU/ml、庆大霉素10IU/ml～50IU/ml、IL-77μg/L～9μg/L、IL-15异二聚体3μg/L～5μg/L、亚硒酸钠维生素e 0.5mg/L～5mg/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠30mmol/L～45mmol/L。
2.如权利要求1所述无血清T淋巴细胞培养基的制备方法，其特征在于包括：
将人血清白蛋白、人过氧化氢酶、蛋氨酸脑啡肽、干细胞生长因子、人转铁蛋白、白介素4、白介素2、次黄嘌呤、IL-7、IL-15异二聚体、溶于未加碳酸氢钠的DMEM培养基中，形成第一溶液；
将亚油酸、叶酸、亚硒酸钠维生素e溶于无水乙醇中，形成第二溶液；
将第一溶液、第二溶液与4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠、膦胺霉素、庆大霉素混合，再以DMEM/F12培养基稀释，形成所述无血清T淋巴细胞培养基。
3.权利要求1所述的无血清T淋巴细胞培养基在培养T淋巴细胞中的应用。
4.一种T淋巴细胞培养方法，其特征在于包括：采用如权利要求1所述的无血清T淋巴细胞培养基培养T淋巴细胞。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于包括：将抗原特异性人源T淋巴细胞以所述无血清T淋巴细胞培养基培养进行高效扩增培养5～8天，在所述高效扩增培养过程中，调整细胞的浓度为0.8×106个/mL～1.2×106个/mL，得到扩增后的抗原特异性人源T淋巴细胞。
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