CN107002029A - 用于干细胞培养和治疗的诱导培养基和方法 - Google Patents

Abstract

新型MSC干细胞培养和治疗方法以及培养基组合物，其目的在于诱导、激活或引发分立、均匀的细胞表型，以选择性地促进或抑制炎症和免疫，从而产生在基于细胞的治疗中使用的被极化、引发、激活或诱导的细胞。

Description

用于干细胞培养和治疗的诱导培养基和方法

关于联邦政府资助的研究的声明

本发明是通过NIH 1R43AR061902-01和1P20RR20152-01以及国防部OC073102和OC110218在美国政府支持下进行的。政府对本发明享有一定的权利。

发明内容

本发明提供了新型干细胞培养和治疗方法以及培养基组合物，其目的在于诱导、激活或引发分立、均匀的细胞表型，以选择性地促进或抑制炎症和免疫，从而提供在基于细胞的治疗中使用的、与已知培养基和方法相比显著的优点。本发明可用来提供更均匀和可预测的离体扩充的和诱导、引发或激活的间充质干细胞(MSC)群体，其可用于基于细胞的治疗。本领域长期以来一直需要一种提供基于细胞的治疗所需的均匀且有效的大量干细胞的改进方法。本发明的各个实施方案的优点是它们可用来将间充质干细胞的培养物诱导、激活或引发为均匀且分立的表型，这些表型在引入患者中时以可预测的方式表现。

在某些实施方案中，本文公开了一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的诱导培养基，该诱导培养基包含：Toll样受体3(TLR3)配体、红细胞生成素和0.5-2％氧或低氧模拟物(hypoxia mimetic)，其中该免疫极化的间充质干细胞群体具有以抗炎或免疫抑制介质的表达为标志的抗炎特性。在某些实施方案中，该Toll样受体3(TLR3)配体为聚(I:C)。在某些实施方案中，该Toll样受体3(TLR3)配体为聚(A:U)。在某些实施方案中，红细胞生成素以低于10ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，该低氧模拟物为氯化钴。在某些实施方案中，该氯化钴以5μM至500μM的浓度存在。在某些实施方案中，该诱导培养基进一步包含白介素4(IL-4)。在某些实施方案中，该诱导培养基进一步包含白介素13(IL-13)。在某些实施方案中，该诱导培养基不包含人或动物来源的血清。在某些实施方案中，该诱导培养基为浓缩液。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的人间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的犬、猫或马的间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中该细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的CXCL9 mRNA表达为标志。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中该细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的OAS1 mRNA表达为标志。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中该细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的ISG15 mRNA表达为标志。在某些实施方案中，本文公开了包含用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中该疾病为炎性或自身免疫病症。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为类风湿性关节炎。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为炎性肠病。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为急性视神经炎。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为克拉伯病(Krabbe disease)。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为糖尿病视网膜病变。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为克罗恩病。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为急性肺损伤。

在某些实施方案中，本文公开了一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的诱导培养基，该诱导培养基包含：Toll样受体4(TLR4)配体、红细胞生成素和0.5-2％氧或低氧模拟物，其中该免疫极化的间充质干细胞群体具有以促炎介质的表达为标志的促炎特性。在某些实施方案中，该Toll样受体4(TLR4)配体为脂多糖(LPS)。在某些实施方案中，该Toll样受体4(TLR4)配体为氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯。在某些实施方案中，红细胞生成素以低于10ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，该低氧模拟物为氯化钴。在某些实施方案中，该氯化钴以5μM至500μM的浓度存在。在某些实施方案中，该诱导培养基进一步包含干扰素。在某些实施方案中，该诱导培养基进一步包含肿瘤坏死因子α(TNFα)。在某些实施方案中，该诱导培养基不包含人或动物来源的血清。在某些实施方案中，该诱导培养基为浓缩液。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的人间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的犬、猫或马的间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中该间充质干细胞来源于多能干细胞。在某些实施方案中，本文公开了用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中该细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的TNFSF10(TRAIL)mRNA表达为标志。在某些实施方案中，本文公开了包含用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中该疾病为癌症。在某些实施方案中，该癌症为卵巢癌。在某些实施方案中，该癌症为葡萄膜黑色素瘤。在某些实施方案中，本文公开了包含用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中该疾病为病毒性病况。在某些实施方案中，本文公开了包含用该诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中该疾病为细菌感染。

在某些实施方案中，本文公开了一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的诱导培养基，该诱导培养基包含：浓度为0.1μg/mL至100μg/mL的聚(I:C)、浓度低于10ng/mL的红细胞生成素和浓度为5μM至500μM的氯化钴，其中该免疫极化的间充质干细胞群体具有抗炎特性，并且以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的CXCL9、OAS1和ISG15 mRNA表达为标志。

在某些实施方案中，本文公开了一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的诱导培养基，该诱导培养基包含：浓度为0.1ng/mL至1μg/mL的LPS、浓度低于10ng/mL的红细胞生成素和浓度为5μM至500μM的氯化钴，其中该免疫极化的间充质干细胞群体具有促炎特性，并且以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的TNFSF10(TRAIL)表达为标志。

在某些实施方案中，本文公开了一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的方法，该方法包括使未受刺激的间充质干细胞群体与组合物相接触，该组合物包含：Toll样受体3(TLR3)配体、红细胞生成素和低氧或低氧模拟物，其中该免疫极化的间充质干细胞群体具有以抗炎或免疫抑制介质的表达为标志的抗炎特性。在某些实施方案中，该TLR3配体为聚(I:C)。在某些实施方案中，该TLR3配体为聚(A:U)。在某些实施方案中，红细胞生成素以低于10ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，该低氧模拟物为氯化钴。在某些实施方案中，该氯化钴以5μM至500μM的浓度存在。在某些实施方案中，该组合物进一步包含白介素4(IL-4)。在某些实施方案中，该组合物进一步包含白介素13(IL-13)。在某些实施方案中，该组合物不包含人或动物来源的血清。在某些实施方案中，该组合物为浓缩液。在某些实施方案中，该未受刺激的间充质干细胞群体与Toll样受体3配体、红细胞生成素和低氧或低氧模拟物同时接触。在某些实施方案中，该组合物与该未受刺激的间充质干细胞群体相接触至少30分钟但少于8小时。在某些实施方案中，该方法进一步包括在RNA或蛋白质水平上监测CXCL9的表达。在某些实施方案中，该方法进一步包括在RNA或蛋白质水平上监测OAS1的表达。在某些实施方案中，该方法进一步包括在RNA或蛋白质水平上监测ISG15的表达。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的人间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的犬、猫或马的间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的间充质干细胞群体，其中该间充质干细胞来源于多能干细胞。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的间充质干细胞群体，其中该细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的CXCL9 mRNA表达为标志。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的间充质干细胞群体，其中该细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的OAS1 mRNA表达为标志。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的间充质干细胞群体，其中该细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的ISG15 mRNA表达为标志。在某些实施方案中，本文提供了包含通过该方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中该疾病为炎性或自身免疫病症。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为类风湿性关节炎。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为炎性肠病。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为急性视神经炎。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为克拉伯病。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为糖尿病视网膜病变。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为克罗恩病。在某些实施方案中，该炎性或自身免疫病症为急性肺损伤。

在某些实施方案中，本文公开了一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的方法，该方法包括使未受刺激的间充质干细胞群体与组合物相接触，该组合物包含：Toll样受体4(TLR4)配体、红细胞生成素和低氧或低氧模拟物，其中该免疫极化的间充质干细胞群体具有以促炎或免疫抑制介质的表达为标志的促炎特性。在某些实施方案中，该TLR4配体为脂多糖(LPS)。在某些实施方案中，TLR4配体为氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯。在某些实施方案中，红细胞生成素以1ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，该低氧模拟物为氯化钴。在某些实施方案中，该氯化钴以5μM至500μM的浓度存在。在某些实施方案中，该组合物进一步包含干扰素。在某些实施方案中，该组合物进一步包含肿瘤坏死因子α(TNFα)。在某些实施方案中，该组合物不包含人或动物来源的血清。在某些实施方案中，该组合物为浓缩液。在某些实施方案中，该未受刺激的间充质干细胞群体与Toll样受体4配体、红细胞生成素和低氧或低氧模拟物同时接触。在某些实施方案中，该组合物与该未受刺激的间充质干细胞群体相接触至少30分钟但少于8小时。在某些实施方案中，该方法进一步包括在RNA或蛋白质水平上监测TNFSF10(TRAIL)的表达。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的人间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的犬、猫或马的间充质干细胞群体。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的间充质干细胞群体，其中该间充质干细胞来源于多能干细胞。在某些实施方案中，本文提供了通过该方法处理的间充质干细胞群体，其中该细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的TNFSF10(TRAIL)mRNA表达为标志。在某些实施方案中，本文提供了包含通过该方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中该疾病为癌症。在某些实施方案中，该癌症为卵巢癌。在某些实施方案中，该癌症为葡萄膜黑色素瘤。在某些实施方案中，本文提供了包含通过该方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中该疾病为病毒性病况。在某些实施方案中，本文提供了包含通过该方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中该疾病为细菌感染。

发明的效用

对于用于诱导、激活或引发来源于多种成体组织的均匀MSC群体——干细胞、间充质干细胞、骨髓基质细胞、多能基质细胞、多能干细胞——的改进的治疗方法和改进的细胞培养方法以及培养基存在需要。MSC的临床应用需要可重现的细胞培养方法和细胞扩充方法，该方法提供足够数量的合适质量且一致的治疗益处的细胞。不同的培养基和方法已取得不同程度的成功。仍然需要进一步改进MSC培养基和方法，以确保获得在具有安全且一致可重现的治疗效果的基于细胞的治疗中使用的引发、激活或诱导的细胞的扩大产量。

在疾病的临床前模型中已证实了诱导、激活或引发的MSC相对于未诱导的常规MSC的效力或治疗益处。抗炎诱导的MSC治疗以相对于传统MSC治疗显著改进的方式减轻痛苦的糖尿病性周围神经病变、类风湿性关节炎、炎性肠病和急性肺损伤的模型中的疼痛和炎症。此外，抗炎诱导的MSC治疗改善多发性硬化(EAE)和克拉伯病的临床前模型中的临床评分、步态和运动功能。在鼠免疫活性的卵巢癌模型中，基于促免疫抗肿瘤诱导的MSC细胞的免疫疗法导致肿瘤生长和扩散的减弱，而常规MSC治疗则促进肿瘤生长和扩散。

发明的科学依据

刺激特定的Toll样受体(TLR)影响MSC的免疫调节反应。Toll样受体识别“危险”信号，并且它们的激活导致动员先天性和适应性宿主免疫细胞的有意义的细胞和系统响应。触发TLR的危险信号在大多数组织病理之后释放。因为危险信号将免疫细胞募集至损伤部位，所以发明人推断MSC可能以类似的方式被募集。发明人观察到，MSC表达若干种TLR(例如，本领域已知的TLR3和TLR4)，并且它们的迁移、侵袭和免疫调节因子之分泌受特定的TLR-激动剂参与的强烈影响。特别地，发明人观察了在通过低水平、短期TLR引发方案刺激TLR3(当与TLR4相比时)之后的MSC的多种后果。基于这些发现，发明人提出了一种从单核细胞文献中得到其线索的MSC的新范例。具体地，该MSC可通过下游TLR向分类为MSC1和MSC2的两种同源作用的表型发信号而得以极化(诱导、激活或引发)。TLR4引发的MSC或MSC1大部分表达促免疫炎性介质，而TLR3引发的MSC或MSC2大部分表达抗炎或免疫抑制介质。此外，发明人证实，TLR引发的MSC与外周血单核细胞(PBMC)的同种异体(非自体)共培养可预测地导致在MSC2共培养之后抑制T淋巴细胞激活以及在与MSC1共培养时允许T淋巴细胞激活。MSC通过TLR4激活而诱导为促免疫MSC1表型或通过TLR3激活而诱导为抗炎MSC2表型确保获得一致且确定的细胞，这样通过提供用于基于细胞的治疗应用的确定且可预测的细胞来解决行业难题。

红细胞生成素也被称为EPO，是一种控制红细胞生成或红血细胞产生的糖蛋白激素。它是骨髓中红细胞(红血细胞)前体的细胞因子或细胞信号传导分子。人EPO具有34kDa的分子量，并且也被称为促红细胞生成素或促红素。EPO由肾脏中与小管周毛细血管和管状上皮小管密切相关的间质成纤维细胞产生，以及在肝脏的窦周细胞中产生。虽然肝脏产生在发育早期(胎儿和围产期)占主导地位，但肾脏是成体中主要的EPO产生部位。除了红细胞生成之外，红细胞生成素还具有其他已知的生物学功能。例如，它通过提供促存活抗凋亡(程序性细胞死亡)信号在脑对神经元损伤的反应中发挥重要作用。EPO还参与伤口愈合过程。合成的红细胞生成素也通过重组DNA技术在细胞培养物中产生。此外，存在具有多种糖基化模式的若干种不同的药物EPO样药剂，并且被统称为红细胞生成刺激剂(ESA)。EPO在本发明中作为一种手段而用来防止过早细胞死亡和延长在基于细胞的治疗中使用的产生的引发、激活或诱导的细胞的存活。

始终如一的氧供应是影响细胞生物学的所有主要方面(包括存活、增殖、分化和迁移)的重要因素。通常，哺乳动物细胞(非干细胞)需要始终如一的氧供应来维持强大的能量产生以及保持正常的细胞功能和细胞存活。相反，哺乳动物干细胞显示在骨髓的低氧环境(氧含量的范围为0.5％至7％)中的生长和存留。若干项研究已表明，低氧环境是维持骨髓中干细胞的增殖和自我更新能力所需的。特别地，即使在短期培养MSC之后，降低氧含量的作用已被描述为改善其在基于细胞的治疗中的移植能力的通用方法。低氧环境在本发明中作为一种手段而用来维持在基于细胞的治疗中使用的产生的引发、激活或诱导的细胞的自我更新和增殖潜能。

定义和优选值

为了清楚的理解，在此处以及必要时还在本文各处定义术语并强调优选值。

术语“癌症”意指由身体一部分中的细胞不受控制的分裂引起的任何疾病。癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌、肉瘤、腺瘤或由遗传、环境或随机机制引起的任何其他恶性肿瘤或瘤。

术语“干细胞”意指能够产生多种不同类型细胞的细胞。术语“间充质干细胞”或“MSC”意指最初来源于间充质的干细胞。该术语是指能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌细胞中的至少两种或更多种的细胞。MSC可以从任何类型的成体组织中分离出。通常，MSC从骨髓、脂肪组织、脐带或外周血中分离出。在本发明的优选方面，MSC从骨髓或(本身从脂肪组织中得到的)脂肪抽吸物中获得。

术语“多能”和供替代的术语“多潜能”意指能够产生不同组织谱系的多种细胞类型的细胞。术语“多能”或“多潜能”还包括诱导的多能干细胞或诱导的多潜能干细胞，或已使用任何化学或遗传方法诱导为多能阶段的细胞。在某些实施方案中，本公开内容的多能或多潜能干细胞为间充质干细胞。

本公开内容的细胞来源于包括人、灵长类、狗、猫、马、牛、山羊、绵羊和猪在内的任何哺乳动物物种的任何细胞。该细胞可以是原代细胞或永生化细胞系。

术语“细胞疗法”或“基于细胞的治疗”意指移植人或动物细胞以预防、治疗或改善与疾病或病症相关的一种或多种症状，例如但不限于代替或修复受损的组织或器官，调节免疫反应以及减少炎症症状和癌症。

术语“受试者”是指动物，优选包括非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠或小鼠)或灵长类(例如，猴子或人)的哺乳动物。在优选的实施方案中，该受试者是人。

术语“治疗”和“处理”在直接用于患者或受试者时意指改善与病症相关的一种或多种症状，该病症包括但不限于任何癌症、任何肿瘤或瘤、炎性病症、自身免疫病或免疫介导的疾病，包括移植器官和组织的排斥反应，其中该改善因将本发明所产生的免疫调节细胞或包含本发明所产生的免疫调节细胞的药物组合物施用于需要这种治疗的受试者而得到。

术语“未受刺激的”是指未经本公开内容的方法处理、极化或诱导的细胞群体。新鲜或冷冻的原代分离的间充质干细胞被认为是未受刺激的。先前已用缺少toll样受体配体、红细胞生成素、低氧或低氧模拟物中至少一种的化合物或组合物处理的细胞被认为是未受刺激的。

术语“修复”在直接用于受损的组织时意指通过直接机制如受损组织的再生，以及通过间接机制，例如，减少炎症从而使组织能够形成来改善这样的损伤。

“同种异体的”意指来自相同物种的不同个体。当个体在一个或多个基因座处具有不同的基因时，则认为它们是同种异体的。相反，“自体的”意指来自同一个体。

术语“免疫疾病”是指以受试者的免疫反应引起的细胞、组织和/或器官损伤为特征的受试者的病况。

术语“自身免疫病症”是指以受试者对其自身的细胞、组织和/或器官的免疫反应所引起的细胞、组织和/或器官损伤为特征的受试者的病况。可采用本发明所产生的免疫调节细胞来治疗的自身免疫疾病的说明性、非限制性实例包括斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮炎(celiac sprue-dermatitis)、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CF1DS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、盘状狼疮、自发混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、幼年型关节炎、扁平苔藓、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、赖特尔综合征、结节病、硬皮病、进行性系统性硬化病、舍格伦综合征、古德帕斯丘综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎脉管炎、白癜风、韦格纳肉芽肿病、抗肾小球基膜疾病、抗磷脂综合征、神经系统自身免疫疾病、家族性地中海热、兰-伊肌无力综合征、交感性眼炎、多内分泌腺病、银屑病等。

“免疫病症”包括自身免疫疾病和免疫介导的炎性疾病。

“免疫介导的炎性疾病”意指以正常免疫应答的调节异常导致、相关或引发的慢性或急性炎症为特征的任何疾病：例如，克罗恩病、1型糖尿病、类风湿关节炎、炎性肠病、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、桥本病、移植物抗宿主病、舍格伦综合征、恶性贫血、艾迪生病、硬皮病、古德帕斯丘综合征、溃疡性结肠炎、自身免疫性溶血性贫血、不育、重症肌无力、多发性硬化、巴泽多病、血小板减少性紫癜、格林巴利综合征、变态反应、哮喘、特应性疾病、动脉硬化、心肌炎、心肌病、肾小球肾炎、发育不良性贫血和器官移植后的排斥反应。

术语“免疫调节的”是指免疫系统的一种或多种生物活性的改变、加强、抑制或减少，它包括但不限于免疫应答的下调、免疫应答的增加以及由细胞因子谱、细胞毒素活性和抗体产生量的变化及其对免疫和免疫相关细胞的影响介导的炎性状态的变化。

术语“炎性病症”是指以炎症为特征的受试者的病况，例如，慢性炎症。炎性病症的说明性、非限制性实例包括但不限于，急性视神经炎、糖尿病神经病、克拉伯病、急性肺损伤、克罗恩病、乳糜泻、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、哮喘、脑炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、炎性骨质溶解、变态反应性病症、感染性休克、肺纤维化(例如，特发性肺纤维化)、血管炎(vacultides)(例如，结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病、高安动脉炎、颞动脉炎和淋巴瘤样肉芽肿病)、创伤后血管成形术(例如，血管成形术后的再狭窄)、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎性骨质溶解、慢性肝炎和由慢性病毒或细菌感染导致的慢性炎症。

术语“病毒性病况”是指由病毒引起的任何疾病。合适的疾病包括但不限于：流感、腺病毒感染、呼吸道合胞体疾病、鼻病毒感染、单纯疱疹、水痘(水痘(Varicella))、麻疹(麻疹(Rubeola))、德国麻疹(风疹(Rubella))、流行性腮腺炎(流行性腮腺炎(EpidemicParotitis))、天花(天花(Variola))、川崎病、黄热病、登革热、甲型肝炎、乙型肝炎、非甲非乙型肝炎、病毒性胃肠炎、病毒性发热、巨细胞病毒病、艾滋病(HIV)、狂犬病、脊髓灰质炎、埃博拉病毒、出血热、EB病毒以及包括由引起任何前述疾病的病毒所引起的癌症的疾病。

术语“细菌感染”是指由医学相关细菌引起的任何感染，其包括但不限于百日咳、麻风、结核病、中毒性休克综合征、食物中毒、沙门氏菌属、大肠杆菌中毒、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、败血症、莱姆病、霍乱、痢疾等等。

“分离的细胞群体”意指从人体或动物体中分离出的细胞群体，它基本上不含通常在体内或体外与该细胞群体相关的一种或多种其他细胞群体。

术语“配体诱导物”意指导致这种配体的产生量增加的一种药剂或多种药剂。Toll样受体(TLR)配体的配体诱导物将产生增加的TLR配体，并且因此实质上等同于TLR配体本身。

术语“MHC”(主要组织相容性复合物)是指编码细胞表面抗原呈递蛋白的基因的子集。在人体中，这些基因被称为人白细胞抗原(HLA)基因。缩写MHC或HLA可互换使用。

术语“细胞的群体”意指大于1但至少为1x 10³个细胞、至少1x 10⁴个细胞、至少1x10⁵个细胞、至少1x 10⁶个细胞、至少1x 10⁷个细胞、至少1x 10⁸个细胞或至少1x 10⁹个或更多个细胞的任何数目的细胞。细胞的群体还指采用旨在培养大量细胞的生物反应器或其他工业方法生长的批量形成的细胞。

在本发明的优选实施方案中，在原始细胞群体中至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％的干细胞(细胞数目％)将会是未分化的MSC。

术语“显著表达”或其等同术语“阳性”和“+”当针对细胞表面标志物使用时意指在细胞群体中超过20％，优选超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％，或甚至100％的细胞表达该细胞表面标志物。

例如，细胞表面标志物的表达可使用常规方法和装置(例如，与商购可得抗体和本领域已知的标准方案一起使用的BECKMAN COULTER EPICS XL FACS系统)通过针对特定细胞表面标志物的流式细胞术来测定，其显示比使用常规方法和装置的背景信号更高的流式细胞术中特定细胞表面标志物的信号。将该背景信号定义为通过与用来在常规FACS分析中检测每一种表面标志物的特异性抗体相同的同种型的非特异性抗体给出的信号强度。对于被认为是阳性的标志物，所观察到的特定信号比使用常规方法和装置的背景信号强度要强20％，优选强30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、500％、1000％、5000％、10000％或以上。此外，针对所述细胞表面标志物的商购可得和已知的单克隆抗体(例如，细胞受体和跨膜蛋白质)可用来鉴定相关细胞。

mRNA的表达通过任何合适的技术来测定，该技术包括但不限于基因表达阵列(基因芯片)、mRNA-SEQ、Northern印迹法或聚合酶链反应(PCR)，包括定量PCR(qPCR)方法，它包括逆转录酶的使用。QPCR方法包括但不限于：基于探针的定量，例如基于染料的定量，例如SYBR Green；数字PCR。qPCR方法可以是利用绝对定量方法的一种方法，或是需要相对于管家基因如肌动蛋白、GAPDH或核糖体亚基来归一化的相对定量方法。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用并入。

附图说明

图1示出了利用PCR阵列由采用TLR3配体聚(I:C)极化为具有抗炎特性的MSC所生成的基因表达数据。灰色指示基因表达的至少两倍诱导；黑色指示基因表达减少为二分之一；粗框指示上调超过两倍且选择用于在图2中进一步验证的基因(除了至少减少为二分之一的PIAS2以外)。

图2示出了利用qPCR验证来自图1的实验的所选基因(A和B)。误差条指示SEM。

图3示出了在用TLR4配体(MSC1)或TLR4配体加上EPO和氯化钴(MSC1*)处理之后MSC细胞中IL-6和IL-8分泌的诱导。

图4示出了在用TLR3配体(MSC2)或TLR3配体加上EPO和氯化钴(MSC2*)处理之后，MSC细胞中CCL5和CXCL10分泌的诱导。

图5示出了在用TLR4配体(无*)或TLR4配体加上EPO和氯化钴(有*)处理之后，根据来自不同的人供体的MSC细胞中TNFSF10(TRAIL)的表达，MSC1表型的诱导。

图6示出了在用TLR3配体(无*)或TLR3配体加上EPO和氯化钴(有*)处理之后，根据来自不同的人供体的MSC细胞中CXCL9的表达，MSC2表型的诱导。

图7示出了在用TLR4配体(MSC1)或TLR4配体加上EPO和氯化钴(MSC1*)处理之后，来自MSC的MSC细胞中TNFSF10(TRAIL)表达诱导的时间进程。

图8示出了在用TLR3配体(MSC2)或TLR3配体加上EPO和氯化钴(MSC2*)处理之后，来自MSC的MSC细胞中CXCL9表达诱导的时间进程。

图9示出了与已用TLR4配体(MSC1)、TLR4配体加上EPO和氯化钴(MSC1*)、TLR3配体(MSC2)以及TLR3配体加上EPO和氯化钴(MSC2*)刺激的MSC相比，未受刺激的MSC(阴性对照)的Transwell迁移测定。误差条指示SEM。

图10示出了与已用TLR4配体(MSC1)、TLR4配体加上EPO和氯化钴(MSC1*)、TLR3配体(MSC2)以及TLR3配体加上EPO和氯化钴(MSC2*)刺激的MSC相比，未受刺激的MSC(阴性对照)的细胞增殖/活力测定。误差条指示SEM。

图11示出了测量TNFSF10(TRAIL)表达的qPCR测定的验证，其示出了TNFSF10(TRAIL)引物PCR扩增产物的琼脂糖凝胶。

图12(A)示出了在极化为MSC2的MSC中CXCL9表达的时间进程；(B)示出了CXCL9引物PCR扩增产物的琼脂糖凝胶。

具体实施方式

本发明的实施采用——除了本发明自身以外——细胞培养、分子生物学和微生物学的常规技术，它们在本领域技术人员的技能范围内。

本发明提供了用于间充质干细胞群体的诱导、激活、极化或引发培养诱导培养基，其包含与红细胞生成素(EPO)以及低氧或低氧模拟物暴露组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物，加上本领域已知和本文描述的细胞培养基的附加标准组分。

本发明还提供了包含与红细胞生成素(EPO)以及低氧或低氧模拟物暴露组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物的培养基诱导补充物，它可添加至其他现有的培养基中。当异常组分或异常浓度的其他组分适于特定情况时，这种补充物可能是合适的。

本发明还提供了含有本发明的培养诱导培养基或培养基诱导补充物的气密培养容器。

本发明还提供了用于制备本文公开的培养诱导培养基的方法，其包括步骤：(a)获得培养基；和(b)向该培养基中添加与红细胞生成素(EPO)以及低氧或低氧模拟物暴露组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物。

本发明还提供了包含(a)根据本发明的培养基和(b)干细胞的组合物。

本发明还提供了含有(a)根据本发明的培养基和(b)固体表面的组合物。在某些实施方案中，固体表面是任何组织培养相容性表面，其包括用于2D细胞培养的任何大小的组织培养板、烧瓶和瓶子。在某些实施方案中，固体表面是用于3D培养的细胞的微载体或任何其他支持基质。

本发明还提供了本发明的培养基对于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的用途。

本发明还提供了用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法，其包括：(a)提供间充质干细胞群体；(b)提供本发明的培养基；(c)使该干细胞与该培养基相接触；以及(d)在适当的条件下培养该细胞。

本发明的一方面提供了与红细胞生成素以及低氧或低氧模拟物暴露组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物在制备细胞治疗药物中的用途。因此，在一个实施方案中，本发明还提供了细胞治疗药物的制备方法，其包括：(a)提供间充质干细胞群体；(b)提供本发明的培养基；(c)使该干细胞与该培养基相接触；以及(d)在适当的条件下培养该细胞。本发明还提供了包含(a)根据本发明的培养基和(b)干细胞的组合物用于制备细胞治疗药物的用途。本发明还提供了包含(a)根据本发明的培养基和(b)固体表面的组合物用于制备细胞治疗药物的用途。

所述药物用于治疗、修复、预防和/或改善受损组织，或一种或多种症状，该症状与炎性和/或免疫病症例如但不限于自身免疫疾病、炎性病症和免疫介导的疾病(包括移植器官和组织的排斥反应，以及癌症)相关。本发明的细胞治疗药物包含预防上或治疗上有效量的干细胞和药物载体。特别优选间充质来源的干细胞。这些细胞类型中的每一种的剂量和剂量方案的实例是本领域已知的。合适的药物载体是本领域已知的，并且优选由美国联邦或州政府的管理机构批准，或在美国药典或欧洲药典或其他公认药典中列出的用于动物且特别用于人的那些药物载体。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。如果需要的话，该组合物还可以含有少量的pH缓冲剂。合适的药物载体的实例由EW Martin在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述。此类组合物将含有预防上或治疗上有效量的优选纯化形式的预防剂或治疗剂以及合适量的载体，以便提供适于施用于受试者的形式。该制剂应适合于施用方式。在优选的实施方案中，该药物是无菌的且为适合于施用于受试者的形式，该受试者优选动物受试者，更优选哺乳动物受试者，最优选人类受试者。

在某些实施方案中，本公开内容的方法、细胞和诱导培养基用于治疗急性疼痛或慢性疼痛。在某些实施方案中，该疼痛与特定的诊断无关。在某些实施方案中，该疼痛与创伤相关。在某些实施方案中，该疼痛为背痛。在某些实施方案中，该疼痛与椎间盘突出或退行性椎间盘病相关。在某些实施方案中，该疼痛为神经性的。在某些实施方案中，该疼痛由坐骨神经痛引起。

在某些实施方案中，本公开内容的方法、细胞和诱导培养基用于治疗癌症。在某些实施方案中，本公开内容的方法、细胞和诱导培养基用于治疗肿瘤。在某些实施方案中，本公开内容的方法、细胞和诱导培养基用于加强癌症的治疗。在某些实施方案中，该癌症为成年急性成淋巴细胞白血病；儿童急性成淋巴细胞白血病；成年急性髓样白血病；儿童急性髓样白血病；肾上腺皮质癌；与艾滋病有关的癌症；与艾滋病有关的淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎瘤/杆状瘤；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤；脑瘤；中枢神经系统胚胎瘤；星形细胞瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；脑瘤、室管膜瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；中间分化的松果体瘤；幕上原始神经外胚层瘤和松果体母细胞瘤；脑和脊髓肿瘤；乳腺癌；男性乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；中枢神经系统非典型畸胎瘤/杆状瘤；中枢神经系统胚胎瘤；中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性宫颈癌；宫颈癌；儿童癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞源性白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；胚胎瘤，中枢神经系统；子宫内膜癌；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤；尤因肉瘤家族肿瘤；颅外胚细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；胚细胞瘤，颅外；生殖细胞瘤，性腺外；生殖细胞瘤，卵巢；妊娠滋养细胞瘤；胶质瘤；多毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；成年肝细胞(肝)癌(原发性)；肝细胞(肝)癌；组织细胞增生症，朗格汉斯细胞；成年霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；下咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤；肾(肾细胞)癌；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增多症；喉癌；儿童喉癌；白血病，急性成淋巴细胞，成年；白血病，急性成淋巴细胞，儿童；白血病，急性髓样，成年；白血病，急性髓样，儿童；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓性白血病；多毛细胞白血病；唇和口腔癌；成年肝癌(原发性)；肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；与艾滋病有关的淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；成年霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；成年非霍奇金淋巴瘤；儿童非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；骨的恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；眼内(眼)黑色素瘤；梅克尔细胞癌；成年恶性间皮瘤；间皮瘤；隐性原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌瘤形成综合征；多发性骨髓瘤/血浆细胞瘤；真菌病；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤；慢性髓性白血病；成年急性髓样白血病；儿童急性髓样白血病；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性疾病；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；成神经细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤，成年；非霍奇金淋巴瘤，儿童；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌，唇和口咽癌；骨肉瘤和骨的恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低度恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰岛细胞胰腺癌肿瘤；乳头状瘤病；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；中间分化的松果体瘤；垂体瘤；浆细胞瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；染色体15变化的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；唾液腺癌；尤因肉瘤家族肉瘤；卡波西肉瘤；成年软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；子宫肉瘤；塞泽里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌；皮肤癌(黑色素瘤)；梅克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤，成年；软组织肉瘤，儿童；鳞状细胞癌；转移性隐性原发性的鳞状颈癌；胃(胃)癌；幕上原始神经外胚层瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；妊娠期滋养细胞瘤；原发性部位未知的癌；输尿管和肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；葡萄膜黑色素瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。

在某些实施方案中，本公开内容的方法、细胞和诱导培养基用于向需要治疗癌症、自身免疫病症或炎性病症的受试者施用。在某些实施方案中，本公开内容的方法、细胞和诱导培养基包括不同的施用途径。在某些实施方案中，该施用途径为皮下、壁内、肌肉内、静脉内、瘤内、眼内、视网膜内、玻璃体内或颅内。

在某些实施方案中，本公开内容的方法、细胞和诱导培养基用于向需要治疗癌症、自身免疫病症或免疫介导的炎性疾病的受试者施用。在某些实施方案中，本公开内容的方法、细胞和诱导培养基包括不同的剂量频率。在某些实施方案中，本公开内容的细胞和药物每日施用一次、每周施用一次、每月施用一次或每年施用一次。在某些实施方案中，本公开内容的细胞和方法每日施用两次、每周施用两次、每月施用两次或每年施用两次。在某些实施方案中，本公开内容的细胞和方法每日施用三次、每周施用三次、每月施用三次或每年施用三次。在某些实施方案中，本公开内容的细胞和方法每日施用四次、每周施用四次、每月施用四次或每年施用四次。在某些实施方案中，首次治疗之后是一年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次的维持剂量。在某些实施方案中，该维持剂量持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在某些实施方案中，每剂施用至少1x10⁶个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少2x10⁶个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少3x10⁶个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少4x10⁶个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少5x10⁶个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少6x10⁶个细胞。在某些实施方案中，施用细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少7x10⁶个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少8x10⁶个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少9x10⁶个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少1x10⁷个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少2x10⁷个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少3x10⁷个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少4x10⁷个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少5x10⁷个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少6x10⁷个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少7x10⁷个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少8x10⁷个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少9x10⁷个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少1x10⁸个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少2x10⁸个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少3x10⁸个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少4x10⁸个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少5x10⁸个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少6x10⁸个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少7x10⁸个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少8x10⁸个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少9x10⁸个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少1x10⁹个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少2x10⁹个细胞。在某些实施方案中，每剂施用至少3x10⁹个细胞。

本发明的药物可以是各种形式。这些形式包括例如，半固体和液体剂型，如冻干制剂、液体溶液或悬浮液，可注射和可输注溶液等，该药物优选为可注射的。

在某些实施方案中，药物用于治疗或修复受损组织(优选间充质组织)，和/或用于治疗、调节、预防和/或改善与炎性和/或免疫病症相关的一种或多种症状。因此，本发明的方法和细胞用于治疗以所述症状中的任一种或全部为特征的任何病症。此类病症的代表性而非穷尽的清单提供于定义部分。特别优选用于治疗免疫介导的炎性疾病的药物。进一步优选用于治疗糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD，包括克罗恩病和/或溃疡性结肠炎)和多发性硬化(MS)的药物。本发明还提供与红细胞生成素以及暴露于用于间充质干细胞培养的低氧或低氧模拟物组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物的用途。

本发明的培养基、补充物和组合物的特定成分以及成分的比例可根据特定需要和应用而变化。同样地，本发明的方法的精确步骤可根据特定需要和应用而变化。根据本发明的培养基、补充物、方法、组合物和用途可通过常规实验进行优化。例如，如果所需结果为抗炎性治疗效果，则培养基、补充物或组合物将具体地含有与红细胞生成素以及低氧或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺)暴露组合的TLR3配体或TLR配体诱导物，相反，如果所需结果为促免疫治疗效果，则培养基、补充物或组合物将具体地含有与红细胞生成素以及低氧或低氧模拟物暴露组合的TLR4配体或TLR配体诱导物。本文所述成分中每一种的量可独立于其他成分通过常规优化进行优化，或可添加或去除一种或多种成分。可通过将培养基与已知的培养基或方法一起或代替其进行测试来测试该培养基支持诱导、激活或引发间充质干细胞的能力。以下更详细地描述了本发明的培养基、补充物、方法、组合物和用途。

本发明的诱导培养基包含与红细胞生成素以及低氧或低氧模拟物暴露组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物。在一方面，本发明的诱导培养基包含Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物。在备选方面，本发明的诱导培养基包含红细胞生成素以及低氧或低氧模拟物暴露。在进一步的方面，本发明的诱导培养基包含与红细胞生成素以及低氧或低氧模拟物暴露组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物。在某些实施方案中，TLR配体为TLR4配体。在某些实施方案中，TLR配体为TLR3配体。

本发明的诱导培养基可包含Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物与红细胞生成素(EPO)以及低氧或低氧模拟物暴露组合的两种或更多种、三种或更多种、4、5、6、7、8、9、10种或更多种组合。

本发明的诱导培养基可包含与约0.5mU/mL至约100mU/mL红细胞生成素(EPO)以及暴露于约0.5％至约2％氧条件(低氧)或浓度为约10微摩尔至约1mM的低氧模拟物如氯化钴或去铁胺组合的约0.10皮摩尔(pM)至约100毫摩尔(mM)的TLR配体或TLR配体诱导物，或上述TLR配体或TLR配体诱导物、红细胞生成素和低氧的任何其他组合。

所述诱导培养基中所用的TLR3配体可以是IL4、IL13、聚(A:U)、聚(I:C)及其组合，并且可通过温育、转染、由载体分子转导或通过其组合来递送。优选地，TLR3配体或激动剂为聚(I:C)。

所述诱导培养基中所用的TLR4配体可以是氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯、干扰素、TNF-α、GM-CSF、脂多糖(LPS)及其组合，并且可通过温育、转染、由载体分子转导或通过其组合来递送。优选地，TLR4配体或激动剂为LPS。

TLR3配体或激动剂可以以在如上所述的培养基或补充剂中约10pg/mL至约100μg/mL、约100pg/mL至约100μg/mL、约1ng/mL至约100μg/mL、约5ng/mL至约100μg/mL、约10ng/mL至约100μg/mL、约100ng/mL至约100μg/mL、约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约10μg/mL、约0.25μg/mL至约7.5μg/mL、约0.5μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约2.5μg/mL，且优选约1μg/mL至约1.5μg/mL的量来提供。

在某些实施方案中，TLR3配体为聚(I:C)，且以约10pg/mL至约100μg/mL、约100pg/mL至约100μg/mL、约1ng/mL至约100μg/mL、约5ng/mL至约100μg/mL、约10ng/mL至约100μg/mL、约100ng/mL至约100μg/mL、约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约10μg/mL、约0.25μg/mL至约7.5μg/mL、约0.5μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL和约1μg/mL至约2.5μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约1μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约2μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约3μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约4μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约5μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约6μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约7μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约8μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约9μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以约10μg/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以低于约100ng/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以低于约50ng/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以低于约20ng/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以低于约10ng/mL的量提供。在某些实施方案中，聚(I:C)以低于约50ng/mL的量提供。

TLR4配体或激动剂可以以在如上所述的培养基或补充剂中约10pg/mL至约10μg/mL、约100pg/mL至约10μg/mL、约1ng/mL至约1μg/mL、约5ng/mL至约1μg/mL、约10ng/mL至约1μg/mL、约100ng/mL至约1μg/mL，优选约5ng/mL至约50ng/mL，以及还优选约5ng/mL至约25ng/mL的量提供。

在某些实施方案中，TLR4配体为LPS。在某些实施方案中，LPS以约10pg/mL至约10μg/mL、约100pg/mL至约10μg/mL、约1ng/mL至约1μg/mL、约5ng/mL至约1μg/mL、约10ng/mL至约1μg/mL、约100ng/mL至约1μg/mL，优选约5ng/mL至约50ng/mL，以及还优选约5ng/mL至约25ng/mL的量存在。在某些实施方案中，LPS以约5ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以约10ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以约15ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以约20ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以约25ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以约30ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以约35ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以约40ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以约45ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以约50ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以低于约100ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以低于约50ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以低于约20ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，LPS以低于约10ng/mL的浓度存在。

在某些实施方案中，本发明的诱导培养基包括在低氧或氧耗尽的环境中温育。在某些实施方案中，低氧环境具有低于2％的氧。在某些实施方案中，低氧环境具有低于1.5％的氧。在某些实施方案中，低氧环境具有低于1.0％的氧。在某些实施方案中，低氧环境具有低于0.5％的氧。在某些实施方案中，低氧环境具有实际上0％的氧。在某些实施方案中，低氧环境具有0.5％至2.0％的氧。在某些实施方案中，低氧环境具有0.5％至1.5％的氧。在某些实施方案中，低氧环境具有0.5％至1.0％的氧。在某些实施方案中，低氧环境具有1.0％至2.0％的氧。在某些实施方案中，低氧环境具有1.5％至2.0％的氧。

在某些实施方案中，本发明的诱导培养基包含氯化钴。在某些实施方案中，氯化钴以约50μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约100μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约200μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约300μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约400μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约500μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约600μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约700μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约800μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约900μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约1mM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约10μM至约1mM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约10μM至约800μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约10μM至约500μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约10μM至约400μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约10μM至约300μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约50μM至约300μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约100μM至约300μM的浓度存在。在某些实施方案中，氯化钴以约150μM至约300μM的浓度存在。

在某些实施方案中，本发明的诱导培养基包含去铁胺。在某些实施方案中，去铁胺以约50μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约200μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约300μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约400μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约500μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约600μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约700μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约800μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约900μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约1mM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约10μM至约1mM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约10μM至约800μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约10μM至约500μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约10μM至约400μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约10μM至约300μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约50μM至约300μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约100μM至约300μM的浓度存在。在某些实施方案中，去铁胺以约150μM至约300μM的浓度存在。

在某些实施方案中，本发明的诱导培养基包含红细胞生成素。在某些实施方案中，本发明的诱导培养基包含重组红细胞生成素。在某些实施方案中，本发明的诱导培养基包含人重组红细胞生成素。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为约0.1ng/mL至约1.0mg/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为约0.1ng/mL至约100ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为约0.1ng/mL至约50ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为约0.1ng/mL至约10ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为约0.1ng/mL至约1.0ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为约0.2ng/mL至约0.8ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为约0.3ng/mL至约0.6ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于10mg/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于5mg/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于1mg/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于100ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于30ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于10ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于5ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于4ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于1ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于0.8ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于1ng/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于5U/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于1U/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于0.5U/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于0.1U/mL。在某些实施方案中，红细胞生成素的量为低于0.05U/mL。

细胞诱导培养基通常含有支持维持培养细胞所必需的大量成分。因此，除了与红细胞生成素及低氧或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺)暴露组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物之外，本发明的诱导培养基将通常含有许多其他成分。考虑到下面的公开内容，技术人员可以容易地配制合适的成分组合。根据本发明的诱导培养基将通常为包含以下更详细描述的标准细胞培养成分，如氨基酸、维生素、痕量金属、无机盐、碳源和缓冲液的营养液。

本发明的诱导培养基可含有血清。血清含有活力和扩充可能所必需的细胞和非细胞因子以及组分。可以使用从任何合适来源获得的血清，其包括胎牛血清(FBS)、牛血清(BS)、小牛血清(CS)、胎牛血清(FCS)、新生小牛血清(NCS)、山羊血清(GS)、马血清(HS)、猪血清、绵羊血清、兔血清、大鼠血清(RS)等。同样在本发明的范围内的是，如果所述MSC为人源的，则该细胞诱导培养基用人血清来补充，优选自体来源。可以理解，如果认为有必要灭活补体级联的组分，则血清可在55-65℃下热灭活。在采用血清替代物的情况下，根据常规技术它可以以该培养基体积的约2％至约40％予以使用。

在其他的实施方案中，本发明的诱导培养基可含有血清替代物。多种不同的血清替代物制剂是商购可得的且为技术人员已知的，例如但不限于血清白蛋白、血清转铁蛋白、硒和重组蛋白，该重组蛋白包括但不限于胰岛素、血小板衍生生长因子(PDGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)。在使用血清替代物的情况下，根据常规技术它可以以该培养基体积的约2％至约40％予以使用。在其他的实施方案中，本发明的诱导培养基可以是无血清和/或无血清替代物的。无血清培养基是不含有任何类型的动物血清的培养基。可以优选无血清培养基以避免干细胞可能的异种污染。无血清替代物培养基是未用任何商业血清替代物制剂补充的培养基。

本发明的诱导培养基通常在去离子蒸馏水中配制。本发明的诱导培养基通常在使用前例如通过紫外线、加热、辐照或过滤来灭菌以防止污染。该诱导培养基可以(例如，在-20℃或-80℃下)冷冻以供储存或运输。抗微生物剂通常在培养基中使用以减轻细菌、支原体和真菌污染。该培养基可含有一种或多种抗微生物剂或抗生素以防止污染。通常，所用的抗生素或抗霉菌化合物是青霉素/链霉素的混合物，但还可以包括但不限于两性霉素氨苄青霉素、庆大霉素、博来霉素、潮霉素(hygromacin)、卡那霉素、丝裂霉素等。

在本发明的一个实施方案中，所述诱导培养基是已通过添加与红细胞生成素以及低氧或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺)暴露组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物诱导的细胞而调整的培养基。条件培养基的产生是通过在诱导培养基中将所述细胞的群体培养足以调整该培养基的时间，随后收获该条件培养基。在采用条件培养基的情况下，该培养基可针对哺乳动物细胞，例如，小鼠细胞或人细胞来调整。可使用多种不同类型的哺乳动物细胞来产生适于间充质干细胞诱导的条件培养基。

诱导培养基可以是1x制剂或浓缩制剂，例如，2x至250x浓缩培养基制剂。在1x制剂中，该培养基中的每种成分都在用于细胞诱导的浓度下。在浓缩制剂中，一种或多种该成分以比用于细胞诱导高的浓度存在。诱导培养基可利用已知方法例如盐沉淀或选择性过滤予以浓缩。浓缩培养基可以用水(优选去离子水和蒸馏水)或任何合适的溶液，例如，水性盐溶液、水性缓冲液或培养基来稀释以供使用。

在适当的条件下，如本文所公开的诱导培养基可以能够诱导、激活或引发在多能、未分化和增殖状态下的干细胞群体达到仅单次传代或群体倍增。如果干细胞表现出如本文别处更详细描述的某些特性，则它们被认为是在多能、未分化和增殖状态下。适当的条件可由技术人员从通常用于间充质干细胞培养的那些条件中选择。

如本文别处所述，本发明还提供含有本发明的诱导培养基的气密容器。气密容器可优选用于运输或储存该诱导培养基以防止污染。该容器可以是任何合适的容器，如生物反应器、烧瓶、培养板、瓶子、罐子、小瓶或袋子。如本文别处所述，本发明还提供用于制备诱导培养基的方法，其包括步骤：(a)获得培养基；和(b)向该培养基中添加与红细胞生成素(EPO)以及低氧或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺)暴露组合的Toll样受体(TLR)配体或TLR配体诱导物。根据该诱导培养基中包含的具体成分，可以想到用于制备诱导培养基的多种不同方法。例如，用于制备诱导培养基的方法可包括步骤：(a)获得培养基；和(b)向该培养基中添加与红细胞生成素(EPO)以及低氧或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺)暴露组合的TLR配体或TLR配体诱导物。在一个实施方案中，用于制备诱导培养基的方法可包括步骤：(a)获得培养基；和(b)向该培养基中添加TLR配体、EPO和氯化钴。

本发明的诱导培养基可用来诱导、激活或引发间充质干细胞的群体。因此，本发明提供如本文所公开的任何诱导培养基对于将间充质干细胞群体诱导、激活或引发为用于基于细胞的治疗的分立、均匀的表型的用途。

在某些实施方案中，本文公开的诱导培养基诱导或减少某些基因的表达，其可通过本领域技术人员已知的方法来测量，包括但不限于PCR、qPCR、qRT-PCR、半定量RT-PCR、数字PCR、Northern印迹法、mRNA-SEQ、微阵列等。在某些实施方案中，本文公开的诱导培养基提高或降低蛋白质水平，其可通过本领域技术人员已知的方法来测量，包括但不限于基于抗体的测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫或Western印迹法、流式细胞术、质谱法等。在某些实施方案中，本文公开的诱导培养基诱导细胞信号传导途径的激活或衰减，其可通过本领域技术人员已知的方法来测量，包括但不限于激酶测定、蛋白质磷酸化/去磷酸化测量、蛋白质泛素化/去泛素化测量、蛋白质乙酰化/脱乙酰测量、蛋白质降解/稳定性测量、第二信使如钙或二酰甘油的测量或由非活性形式裂解为活性形式的监测。

在某些实施方案中，本文公开的诱导培养基导致细胞群体的基因表达、蛋白质水平或细胞信号传导途径的可测量的变化。在某些实施方案中，该变化为基因表达、蛋白质水平或细胞信号传导的增加。在某些实施方案中，该变化为所测得的未受刺激或对照样品与刺激的或测试样品之间的任何统计显著性变化。在某些实施方案中，未受刺激的或对照样品与刺激的或测试样品之间的变化为增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在某些实施方案中，未受刺激的或对照样品与刺激的或测试样品之间的变化为增加至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，未受刺激的或对照样品与刺激的或测试样品之间的变化为减少为至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或更低。在某些实施方案中，未受刺激的或对照样品与刺激的或测试样品之间的变化为减少为至多1/100或更低。

在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包含TLR3配体的诱导培养基诱导任何以下基因的mRNA表达至少2倍：CXCL9、EGFR、IRF1、A2M、FAS、IL2RG、MMP3、GBP1、ISG15、FCGR1、NFKB1、NOS2A、USF1、YY1、JAK2、STA2、STAT4、STAT5、SOCS1或IRF1。在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包含TLR3配体的诱导培养基使任何以下基因的mRNA表达减少为至多1/2：EPOR、F2R、STAM、PDGFRA、PIAS2、MYC、SH2B1或CSF2RB。在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包含TLR3配体的诱导培养基诱导任何以下基因的mRNA表达至少10倍：CXCL9、GBP1、ISG15、SOCS1、MMP3、JAK2或IRF1。在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包含TLR3配体的诱导培养基诱导任何以下基因的mRNA表达至少20倍：CXCL9、GBP1、ISG15或SOCS1。在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包含TLR3配体的诱导培养基诱导CXCL9的mRNA表达至少100倍。

在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包含TLR4配体的诱导培养基诱导TNFSF10(TRAIL)的mRNA表达至少2倍、10倍、100倍或1000倍。

本发明还提供了用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法，其包括：(a)提供间充质干细胞群体；(b)提供如本文所公开的诱导培养基；(c)使该干细胞与该诱导培养基相接触；以及(d)在适当的条件下培养该干细胞。

在某些实施方案中，本文公开的用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法诱导或减少某些基因的表达，其可通过本领域技术人员已知的方法来测量，包括但不限于PCR、qPCR、qRT-PCR、半定量RT-PCR、数字PCR、Northern印迹法、mRNA-SEQ、微阵列等。在某些实施方案中，本文公开的诱导培养基提高或降低蛋白质水平，其可通过本领域技术人员已知的方法来测量，包括但不限于基于抗体的测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫或Western印迹法、流式细胞术、质谱法等。在某些实施方案中，本文公开的用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法诱导细胞信号传导途径的激活或衰减，其可通过本领域技术人员已知的方法来测量，包括但不限于激酶测定、蛋白质磷酸化/去磷酸化测量、蛋白质泛素化/去泛素化测量、蛋白质乙酰化/脱乙酰测量、蛋白质降解/稳定性测量、第二信使如钙或二酰甘油的测量或由非活性形式裂解为活性形式的监测。

在某些实施方案中，本文公开的用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法导致干细胞群体的基因表达、蛋白质水平或细胞信号传导途径的可测量的变化。在某些实施方案中，该变化为基因表达、蛋白质水平或细胞信号传导的增加。在某些实施方案中，该变化为所测得的未受刺激的或对照样品与刺激的或测试样品之间的任何统计显著性变化。在某些实施方案中，未受刺激的或对照样品与刺激的或测试样品之间的变化为增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在某些实施方案中，未受刺激的或对照样品与刺激的或测试样品之间的变化为增加至少100倍或更多倍。在某些实施方案中，未受刺激的或对照样品与刺激的或测试样品之间的变化为减少为至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或更低。在某些实施方案中，未受刺激的或对照样品与刺激的或测试样品之间的变化为减少为至多1/100或更低。

在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包括TLR3配体的本文公开的用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法诱导任何以下基因的mRNA表达至少2倍：CXCL9、EGFR、IRF1、A2M、FAS、IL2RG、MMP3、GBP1、ISG15、FCGR1、NFKB1、NOS2A、USF1、YY1、JAK2、STA2、STAT4、STAT5、SOCS1或IRF1。在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包括TLR3配体的本文公开的用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法使任何以下基因的mRNA表达减少为至多1/2：EPOR、F2R、STAM、PDGFRA、PIAS2、MYC、SH2B1或CSF2RB。在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包括TLR3配体的本文公开的用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法诱导任何以下基因的mRNA表达至少10倍：CXCL9、GBP1、ISG15、SOCS1、MMP3、JAK2或IRF1。在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包括TLR3配体的本文公开的用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法诱导任何以下基因的mRNA表达至少20倍：CXCL9、GBP1、ISG15或SOCS1。在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包括TLR3配体的本文公开的用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法诱导CXCL9的mRNA表达至少100倍。

在某些实施方案中，当与未受刺激的细胞群体相比时，包括TLR4配体的本文公开的用于诱导、激活或引发间充质干细胞群体的离体方法诱导TNFSF10(TRAIL)的mRNA表达至少2倍、10倍、100倍或1000倍。

本发明还提供了细胞治疗方法，其包括：(a)提供间充质干细胞群体；(b)提供本发明的诱导培养基；(c)使该干细胞群体与该诱导培养基相接触；以及(d)在适当的条件下培养该细胞。

本发明的方法可包括培养与如本文别处所述的固体表面相接触的该细胞。例如，本发明提供了一种方法，其包括：(a)提供间充质干细胞群体；(b)提供如本文所公开的诱导培养基；(c)使该干细胞与该诱导培养基相接触；以及(d)在适当的条件下培养该细胞并使之与固体表面相接触。本发明还提供如本文所公开的诱导培养基和固体表面对于扩充间充质干细胞群体的用途。间充质干细胞可以粘附、附着或接种在所述支持物上。通常，在诱导、激活或引发该干细胞之前以所需的密度来接种细胞，如约100个细胞/cm²至约100,000个细胞/cm²(如约500个细胞/cm²至约50,000个细胞/cm²，或更特别地，约1,000个细胞/cm²至约20,000个细胞/cm²)。在特定的实施方案中，该细胞密度为200-10,000个细胞/cm²。

可以理解，本文公开的方法的步骤在适当时可以以任何顺序执行或在同一时间内执行，并且不必以它们所列出的顺序执行。例如，在上述方法中，提供间充质干细胞群体的步骤可以在提供诱导培养基的步骤之前、之后或同时执行。

本发明的方法及用途可包括如本文所述的任何诱导培养基或补充物。因此，在一些实施方案中，本发明的方法可以是不存在血清和/或血清替代物的方法。在一些实施方案中，本发明的方法可以在不存在与饲养细胞层接触的情况下用来诱导细胞。

本发明的优选方法及用途用于在该细胞已扩充时以及在冷藏保存并在基于细胞的治疗中使用之前进行间充质干细胞群体的诱导、激活或引发。

优选所述干细胞群体为成体来源的，且进一步优选所述细胞为(如在骨髓衍生或脂肪组织衍生的细胞中的)间充质干细胞群体。

用于干细胞培养的条件是本领域技术人员已知的。优选在适合于粘附间充质干细胞的固体支持物的存在下进行所述培养。

所述制备方法可任选进一步包括步骤：(a)将该细胞传代至如本文所公开的培养基中；(b)在适当的条件下进一步培养该细胞，以及(c)诱导、激活或引发该细胞。

已证明在没有诱导分化的情况下MSC的离体扩充可例如通过采用特别筛选的大量合适的血清(如胎牛血清或人血清)长期进行。用于测量活力和产量的方法是本领域已知的(例如，台盼蓝排除法)。

必要时，可手动执行用于分离本发明的细胞群体的细胞的任何步骤和程序。或者，分离此类细胞的过程可以通过一种或多种合适的设备来促进和/或自动化，该设备的实例是本领域已知的。

本发明的实施可利用任何合适的细胞培养容器作为支持物来执行。由多种不同的材料(例如，塑料、玻璃)构成的具有多种形状和大小的细胞培养容器(例如，烧瓶、单孔或多孔培养板、单孔或多孔盘、瓶子、罐子、小瓶、袋子、生物反应器)是本领域已知的。技术人员可以容易地选择合适的细胞培养容器。

本发明还提供可用来产生如本文所公开的培养诱导培养基的培养基诱导补充物。“培养基诱导补充物”是多种成分的混合物，该混合物不能自身支持间充质干细胞，但当与其他细胞培养基成分组合时能实现或改善间充质干细胞培养。因此，该补充物可用来通过使其与其他细胞培养成分组合而产生合适的培养基制剂，从而产生本发明的功能性细胞培养基。培养基补充物的用途是本领域公知的。本发明提供了一种培养基诱导补充物，其包括添加与红细胞生成素(EPO)以及低氧或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺)暴露组合的TLR配体或TLR配体诱导物。该补充物可含有本文公开的任何配体。该补充物还可以含有一种或多种附加的细胞培养成分，例如，选自氨基酸、维生素、无机盐、痕量元素、碳源和缓冲液的一种或多种细胞培养成分。

培养基诱导补充物可以是浓缩的液体补充物(例如，2x至250x浓缩的液体补充物)或可以是干燥的补充物。液体类型和干燥类型的补充物均是本领域公知的。补充物可以冻干。

本发明的培养基诱导补充物通常在使用前例如通过紫外线、加热、辐照或过滤来灭菌以防止污染。培养基诱导补充物可以(例如，在-20℃或-80℃下)冷冻以供储存或运输。

本发明还提供了含有本发明的培养基补充物的气密容器。气密容器可优选用于运输或储存本文公开的培养基补充物以防止污染。该容器可以是任何合适的容器，如生物反应器、烧瓶、培养板、瓶子、罐子、小瓶或袋子。

已使用多种物质作为粘附干细胞培养物的表面，并且技术人员可以容易地选择合适的材料。优选地，该固体表面包括塑料但可以替代地包括玻璃、细胞外基质。该表面可以是平面的、管状的或是支架、珠子或纤维的形式。

如本文别处所述，本发明的组合物可包含血清，或可以是无血清和/或无血清替代物的。

本发明中采用的间充质干细胞可利用公知的方法(参见下文)获得。可以想到，多种类型的间充质干细胞可结合本发明使用，无论是从胚胎、胎儿或是从成体组织中获得，但优选来源于成体组织来源。

本文公开的诱导培养基可用来培养哺乳动物干细胞，特别是人成体干细胞。可结合本发明使用的人成体干细胞优选间充质干细胞。还可以采用小鼠或灵长类干细胞。在优选的实施方案中，该干细胞为人骨髓衍生干细胞(MSC)。

间充质干细胞可通过其分化为所有三种胚层的细胞的能力来鉴定，例如通过测定该间充质干细胞分化为显示特异于所有三种胚层的标志物的可检测表达的细胞的能力。除非上下文另有要求，否则提及单数(例如，提及“一个细胞”和等效引用)包括复数(例如“多个细胞”)。

本发明的诱导培养基可用来诱导、激活或引发间充质干细胞的群体。因此，本发明提供如本文所公开的任何诱导培养基对于将间充质干细胞群体诱导、激活或引发为用于基于细胞的治疗的分立、均匀的表型的用途。这些分立且均匀的表型可以是抗炎MSC表型(MSC2)和均匀且分立的促免疫抗肿瘤MSC表型(MSC1)。

均匀且分立的抗炎MSC表型(MSC2)的优选诱导方法是在70-90％汇合生长时将MSC和含有与红细胞生成素(1mU/mL或5ng/mL)以及低氧(1％氧)或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺，均为200μM)暴露组合的Toll样受体3(TLR3)配体如聚肌苷：聚胞苷酸(或聚(I:C)；1μg/mL)的培养基一起温育1小时。

均匀且分立的促免疫抗肿瘤MSC表型(MSC1)的优选诱导方法是在70-90％汇合生长时将MSC和含有与红细胞生成素(1mU/mL或5ng/mL)以及低氧(1％氧)或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺，均为200μM)暴露组合的Toll样受体4(TLR4)配体如脂多糖(10ng/mL的LPS，内毒素)的培养基一起温育1小时。

向新鲜培养基中添加与红细胞生成素以及低氧或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺)暴露组合的TLR配体，或将它作为培养补充物与该细胞一起温育1hr。在该诱导步骤之后，将该MSC在不含TLR配体的培养基或合适的缓冲盐溶液中洗涤两次，以去除细胞和培养物碎片。不希望受到理论的束缚，在上述(或更低)浓度下的短温育时间(<1hr)和最少的TLR配体暴露对于得到所需表型是重要的，并且进一步地，该方案模拟了内源性MSC在与损伤部位相距一定距离处遇到并响应的危险信号的梯度。一经洗涤，被诱导、激活或引发的MSC可通过传统方法例如胰蛋白酶和EDTA在37℃下收获5秒至15分钟，或采用胰蛋白酶替代物(例如，来自Invitrogen的TrypLE)、胶原酶、分散酶、细胞消化酶(accutase)或本领域技术人员已知的其他试剂。在细胞收获之后，被引发、激活或诱导的MSC可通过标准方法予以冷藏保存。

TLR3激动剂或TLR4激动剂可通过温育、转染、由载体分子转导或通过本领域技术人员已知的其他技术予以递送。

可将该细胞与TLR配体或激动剂配体(与红细胞生成素(EPO)以及低氧或低氧模拟物(氯化钴或去铁胺)暴露组合)一起温育约1分钟至约480分钟、约5分钟至约475分钟、约10分钟至约470分钟、约15分钟至约400分钟、约20分钟至约120分钟、约25分钟至约90分钟、约30分钟至约80分钟、约35分钟至约70分钟、约40分钟至约65分钟、约45分钟至约60分钟、约55分钟至约60分钟，且优选约60分钟。

实施例

实施例1-来自人原代MSC的MSC2基因表达标记的诱导

针对本实验，将原代人MSC在含2μg/mL聚(I:C)的无血清培养基中在37℃和5％CO₂下温育6小时。随后，将细胞洗涤两次，用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)提取RNA，随后用TURBO无DNA试剂盒(Ambion,Austin,TX)处理。将RNA逆转录并将得到的cDNA在iCycler iQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad,Hercules,CA)上根据制造商的说明书在JAK/STAT信号途径RT2ProfilerTM PCR阵列(SuperArray Bioscience,Frederick,MD)中使用。来自未处理组和处理组的原始数据均利用GEarray Analyzer软件(SuperArray Inc.,Bethesda,MD)进行分析。该阵列测量了JAK/STAT信号途径中84种不同基因的RNA表达水平。结果示于图1中，显示2倍或更多倍诱导的基因在灰色框中，显示减少为1/2或更低的基因在黑色框中，而诱导超过两倍且选择用于进一步验证的基因(除了减少为低于1/2的PIAS2以外)描绘在粗框中。图2显示了选自图1的基因的进一步qPCR验证。利用具有基因特异性引物的SYBR Green Master Mix通过qPCR对图1中分析的相同样品进行验证。

实施例2-来自原代人MSC的MSC1和MSC2极化

将原代人MSC供体极化为MSC1或MSC2。在不存在(MSC1)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC1*)的情况下，利用含10ng/mL LPS的培养基来极化人MSC。在不存在(MSC2)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC2*)的情况下，利用含2μg/mL聚(I:C)的培养基来极化人MSC2细胞。收获培养的上清液，随后通过如前所述的bio-plex分析趋化因子/细胞因子表达。简而言之，将MSC以50,000个细胞的密度接种在24孔培养板中，允许其粘附过夜，随后根据指示用TLR激动剂引发1hr。48hr后收集条件培养基，并按照制造商的说明书利用Bio-Plex细胞因子测定(Human Group I&II；Bio-Rad,Hercules,CA)进行分析。对三个单独MSC供体库进行这些实验至少三次。与配方无关的MSC1诱导导致包括IL6和IL8在内的细胞因子的显著分泌(图3)，而与配方无关的MSC2诱导导致IP10(CXCL10)和RANTES(CCL5)的显著分泌(图4)。误差条指示+/-SEM。

实施例3-MSC1和MSC2极化在MSC的多种来源中是一致的

将来自3种不同商业来源和多达六种不同供体的人MSC供体极化为MSC1。在不存在(MSC1)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC1*)的情况下，利用含10ng/mL LPS的培养基来极化人MSC。将总RNA分离、纯化并逆转录为cDNA。利用SYBR GreenMaster Mix进行定量实时PCR。利用定量比较CT方法来分析数据，以将靶基因表达相对于18S rRNA管家基因进行归一化，并显示为相对于未处理的对照的倍数增加。在包括混合供体在内的所有供体中，MSC1诱导后Trail基因表达显著增加(图5)。误差条表示+/-平均值的标准误差(SEM)。人cDNA引物使用：Cxcl9正向-CTT TCCTGG CTA CTC CAT GTT反向-GTT GGTCACTGG CTG ATC TAT AA；Trail正向-CTT CAC AGT GCT CCT GCA GT反向-TTA GCC AACTAAAAA GGC CCC；18SrRNA正向-GAGGGAGCCTGAGAAACGG，反向-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC，其中方案为：1：95.0℃持续0:30，2：95.0℃持续0:10，3：68.0℃持续0:30，读板，4：去往2，39次以上。

将来自3种不同商业来源和多达六种不同供体的人MSC供体极化为MSC2。在不存在(MSC2)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC2*)的情况下，利用含2μg/mL聚(I:C)的培养基来极化人MSC。将总RNA分离、纯化并逆转录为cDNA。利用SYBR GreenMaster Mix进行定量实时PCR。利用定量比较CT方法来分析数据，以将靶基因表达相对于18S rRNA管家基因进行归一化，并显示为相对于未处理的对照的倍数增加。在包括混合供体在内的所有供体中，MSC2诱导后CXCL9基因表达显著增加(图6)。误差条表示+/-平均值的标准误差(SEM)。

实施例4-MSC1和MSC2极化的时间进程。

将人MSC供体极化为MSC1。在不存在(MSC1)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC1*)的情况下，利用含10ng/mL LPS的培养基来极化人MSC。根据指示在不同时间收获细胞。将总RNA分离、纯化并逆转录为cDNA。利用SYBR Green Master Mix来进行定量实时PCR。利用定量比较CT方法来分析数据，以将靶基因表达相对于18S rRNA管家基因进行归一化，并显示为相对于未处理的对照的倍数增加。MSC1诱导后4小时，Trail基因表达显著增加(图7)。误差条表示+/-平均值的标准误差(SEM)。

将人MSC供体极化为MSC2。在不存在(MSC2)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC2*)的情况下，利用含2μg/mL聚(I:C)的培养基来极化人MSC。根据指示在不同时间收获细胞。将总RNA分离、纯化并逆转录为cDNA。利用SYBR Green Master Mix进行定量实时PCR。利用定量比较CT方法来分析数据，以将靶基因表达相对于18S rRNA管家基因进行归一化，并显示为相对于未处理的对照的倍数增加。MSC2诱导后4小时，Cxcl9基因表达显著增加(图8)。误差条表示+/-平均值的标准误差(SEM)。

实施例5-MSC1和MSC2细胞的生物分布

进行了测定极化MSC与幼稚MSC相比的体内功效的实验。针对本实验，通过腹膜内注射入野生型小鼠中来施用人幼稚MSC、MSC1和MSC2(100万个细胞)并在4小时后收获所有器官。随后，针对人GAPDH测定所提取的RNA，并与小鼠GAPDH DNA进行比较以确定组织溯源(tissue homing)。结果示于以下表1中。

实施例6-在MSC极化过程中与红细胞生成素和氯化钴一起温育增加了MSC1和MSC2细胞的迁移、增殖/活力

为了测定在有或没有红细胞生成素和低氧的情况下所培养的MSC的迁移能力，将人幼稚MSC细胞和MSC1或MSC2极化细胞添加至单独的Transwell插入物(8uM孔，50,000个细胞/插入物)中。在不存在(MSC1)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC1*)的情况下，利用含10ng/mL LPS的培养基来极化MSC1细胞。在不存在(MSC2)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC2*)的情况下，利用含2μg/mL聚(I:C)的培养基来极化人MSC2细胞。将膜降低至含有阴性对照无血清培养基(SFM)或阳性对照含血清的生长培养基(CCM)或所指相应的诱导培养基的24孔伴侣培养板中。温育16小时后用Nikon Eclipse TE300倒置荧光显微镜拍摄显微照片。图9显示从来自超过三个独立进行的三次重复实验(n＝3)的4个代表性图像象限中计数的迁移MSC的代表性数据。误差条指示SEM。

利用增殖试验来测定在有或没有红细胞生成素和低氧的情况下所培养的MSC的增殖能力和活力。在不存在(MSC1)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC1*)的情况下，利用含10ng/mL LPS的培养基来极化人MSC。在不存在(MSC2)或存在0.5ng/mL人重组红细胞生成素和200μM氯化钴(MSC2*)的情况下，利用含2μg/mL聚(I:C)的培养基来极化人MSC2细胞。将细胞与特定培养基一起温育48小时。来自每个样品的细胞增殖和活力分别通过CyQUANT测定(Life Technologies,CA)和台盼蓝测定来测量。对于细胞增殖，将细胞一式三份以每孔50μl中1×10³个细胞接种在96孔培养板中，并在37℃，5％CO₂下培养。在处理后第0小时、第24小时、第48小时、第72小时和第96小时收获样品，并根据制造商(CyQUANT测定,Life Technologies,CA)的描述进行加工。显示的数据相对于未处理对照来表示。在至少三个独立实验中进行细胞增殖试验，其中每个样品沿着96孔培养板的8个孔重复(n＝3)。误差条指示SEM。结果示于图10中。

实施例7-针对CXCL9和TNFSF10的qPCR测定的验证

将人MSC诱导为MSC1。将总RNA分离、纯化并逆转录为cDNA。利用SYBR GreenMaster Mix进行定量实时PCR。利用定量比较CT方法来分析数据，以将靶基因表达相对于18S rRNA管家基因进行归一化，并显示为相对于未处理的对照的倍数增加。MSC1诱导后，Trail基因表达显著增加。误差条表示+/-平均值的标准误差(SEM)。确定引物效率和产物特异性(图11)。

将人MSC诱导为MSC2。将总RNA分离、纯化并逆转录为cDNA。利用SYBR GreenMaster Mix进行定量实时PCR。利用定量比较CT方法来分析数据，以将靶基因表达相对于18S rRNA管家基因进行归一化，并显示为相对于未处理的对照的倍数增加。MSC2诱导后，Cxcl9基因表达显著增加。误差条表示+/-平均值的标准误差(SEM)。确定基因表达的时间进程(图12A)和产物特异性(图12B)。

虽然特别提及其优选实施方案而详细描述了本发明，但是本说明书中还描述了本发明的原理和工作模式。本发明不应被解释为限于所公开的具体形式，这些形式是说明性的而不是限制性的。在不脱离如所附权利要求所述的本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以作出修改、变形和改变。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变形、改变和替换。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在由以下权利要求限定本发明的范围，并且旨在由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (101)

1.一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的诱导培养基，该诱导培养基包含：

a.Toll样受体3(TLR3)配体，

b.红细胞生成素，和

c.0.5-2％氧或低氧模拟物，

其中所述免疫极化的间充质干细胞群体具有以抗炎或免疫抑制介质的表达为标志的抗炎特性。

2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其中所述Toll样受体3(TLR3)配体为聚(I:C)。

3.根据权利要求1所述的诱导培养基，其中所述Toll样受体3(TLR3)配体为聚(A:U)。

4.根据权利要求1所述的诱导培养基，其中所述红细胞生成素以低于10ng/mL的浓度存在。

5.根据权利要求1所述的诱导培养基，其中所述低氧模拟物为氯化钴。

6.根据权利要求5所述的诱导培养基，其中所述氯化钴以5μM至500μM的浓度存在。

7.根据权利要求1所述的诱导培养基，其进一步包含白介素4(IL-4)。

8.根据权利要求1所述的诱导培养基，其进一步包含白介素13(IL-13)。

9.根据权利要求1所述的诱导培养基，其不包含人或动物来源的血清。

10.根据权利要求1所述的诱导培养基，其为浓缩液。

11.用权利要求1的诱导培养基处理的间充质干细胞群体。

12.用权利要求1的诱导培养基处理的人间充质干细胞群体。

13.用权利要求1的诱导培养基处理的犬、猫或马的间充质干细胞群体。

14.用权利要求1的诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中所述间充质干细胞来源于多能干细胞。

15.用权利要求1的诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中所述细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的CXCL9mRNA表达为标志。

16.用权利要求1的诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中所述细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的OAS1mRNA表达为标志。

17.用权利要求1的诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中所述细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的ISG15mRNA表达为标志。

18.一种包含用权利要求1的诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中所述疾病为炎性或自身免疫病症。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述炎性或自身免疫病症为类风湿性关节炎。

20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述炎性或自身免疫病症为炎性肠病。

21.根据权利要求18所述的组合物，其中所述炎性或自身免疫病症为急性视神经炎。

22.根据权利要求18所述的组合物，其中所述炎性或自身免疫病症为克拉伯病。

23.根据权利要求18所述的组合物，其中所述炎性或自身免疫病症为糖尿病视网膜病变。

24.根据权利要求18所述的组合物，其中所述炎性或自身免疫病症为克罗恩病。

25.根据权利要求18所述的组合物，其中所述炎性或自身免疫病症为急性肺损伤。

26.一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的诱导培养基，该诱导培养基包含：

a.Toll样受体4(TLR4)配体，

b.红细胞生成素，和

c.0.5-2％氧或低氧模拟物，

其中所述免疫极化的间充质干细胞群体具有以促炎介质的表达为标志的促炎特性。

27.根据权利要求26所述的诱导培养基，其中所述Toll样受体4(TLR4)配体为脂多糖(LPS)。

28.根据权利要求26所述的诱导培养基，其中所述Toll样受体4(TLR4)配体为氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯。

29.根据权利要求26所述的诱导培养基，其中所述红细胞生成素以低于10ng/mL的浓度存在。

30.根据权利要求26所述的诱导培养基，其中所述低氧模拟物为氯化钴。

31.根据权利要求30所述的诱导培养基，其中所述氯化钴以5μM至500μM的浓度存在。

32.根据权利要求26所述的诱导培养基，其进一步包含干扰素。

33.根据权利要求26所述的诱导培养基，其进一步包含肿瘤坏死因子α(TNFα)。

34.根据权利要求26所述的诱导培养基，其不包含人或动物来源的血清。

35.根据权利要求26所述的诱导培养基，其为浓缩液。

36.用权利要求26的诱导培养基处理的间充质干细胞群体。

37.用权利要求26的诱导培养基处理的人间充质干细胞群体。

38.用权利要求26的诱导培养基处理的犬、猫或马的间充质干细胞群体。

39.用权利要求26的诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中所述间充质干细胞来源于多能干细胞。

40.用权利要求26的诱导培养基处理的间充质干细胞群体，其中所述细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的TNFSF10(TRAIL)mRNA表达为标志。

41.一种包含用权利要求26的诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中所述疾病为癌症。

42.一种包含用权利要求26的诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中所述疾病为卵巢癌。

43.一种包含用权利要求26的诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中所述疾病为葡萄膜黑色素瘤。

44.一种包含用权利要求26的诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中所述疾病为病毒性病况。

45.一种包含用权利要求26的诱导培养基处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的组合物，其中所述疾病为细菌感染。

46.一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的诱导培养基，该诱导培养基包含：

a.浓度为0.1μg/mL至100μg/mL的聚(I:C)，

b.浓度低于10ng/mL的红细胞生成素，和

c.浓度为5μM至500μM的氯化钴，

其中所述免疫极化的间充质干细胞群体具有抗炎特性，并且以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的CXCL9、OAS1和ISG15mRNA表达为标志。

47.一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的诱导培养基，该诱导培养基包含：

a.浓度为0.1ng/mL至1μg/mL的LPS，

b.浓度低于10ng/mL的红细胞生成素，和

c.浓度为5μM至500μM的氯化钴，

其中所述免疫极化的间充质干细胞群体具有促炎特性，并且以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的TNFSF10(TRAIL)表达为标志。

48.一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的方法，该方法包括使未受刺激的间充质干细胞群体与组合物相接触，该组合物包含：Toll样受体3(TLR3)配体、红细胞生成素和低氧或低氧模拟物暴露，其中所述免疫极化的间充质干细胞群体具有以抗炎或免疫抑制介质的表达为标志的抗炎特性。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述Toll样受体3(TLR3)配体为聚(I:C)。

50.根据权利要求48所述的方法，其中所述Toll样受体3(TLR3)配体为聚(A:U)。

51.根据权利要求48所述的方法，其中所述红细胞生成素以低于10ng/mL的浓度存在。

52.根据权利要求48所述的方法，其中所述低氧模拟物为氯化钴。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述氯化钴以5μM至500μM的浓度存在。

54.根据权利要求48所述的方法，其中所述组合物进一步包含白介素4(IL-4)。

55.根据权利要求48所述的方法，其中所述组合物进一步包含白介素13(IL-13)。

56.根据权利要求48所述的方法，其中所述组合物不包含人或动物来源的血清。

57.根据权利要求48所述的方法，其中所述组合物为浓缩液。

58.根据权利要求48所述的方法，其中所述未受刺激的间充质干细胞群体与Toll样受体3(TLR3)配体、红细胞生成素和低氧或低氧模拟物同时接触。

59.根据权利要求48所述的方法，其中所述组合物与所述未受刺激的间充质干细胞群体接触至少30分钟但少于8小时。

60.根据权利要求48所述的方法，其进一步包括在RNA或蛋白质水平上监测CXCL9的表达。

61.根据权利要求48所述的方法，其进一步包括在RNA或蛋白质水平上监测OAS1的表达。

62.根据权利要求48所述的方法，其进一步包括在RNA或蛋白质水平上监测ISG15的表达。

63.通过权利要求48的方法处理的间充质干细胞群体。

64.通过权利要求48的方法处理的人间充质干细胞群体。

65.通过权利要求48的方法处理的犬、猫或马的间充质干细胞群体。

66.通过权利要求48的方法处理的间充质干细胞群体，其中所述间充质干细胞来源于多能干细胞。

67.通过权利要求48的方法处理的间充质干细胞群体，其中所述细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的CXCL9mRNA表达为标志。

68.通过权利要求48的方法处理的间充质干细胞群体，其中所述细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的OAS1mRNA表达为标志。

69.通过权利要求48的方法处理的间充质干细胞群体，其中所述细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的ISG15mRNA表达为标志。

70.一种包括通过权利要求48的方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的方法，其中所述疾病为炎性或自身免疫病症。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述炎性或自身免疫病症为类风湿性关节炎。

72.根据权利要求70所述的方法，其中所述炎性或自身免疫病症为炎性肠病。

73.根据权利要求70所述的方法，其中所述炎性或自身免疫病症为类风湿性关节炎。

74.根据权利要求70所述的方法，其中所述炎性或自身免疫病症为急性视神经炎。

75.根据权利要求70所述的方法，其中所述炎性或自身免疫病症为克拉伯病。

76.根据权利要求70所述的方法，其中所述炎性或自身免疫病症为糖尿病视网膜病变。

77.根据权利要求70所述的方法，其中所述炎性或自身免疫病症为克罗恩病。

78.根据权利要求70所述的方法，其中所述炎性或自身免疫病症为急性肺损伤。

79.一种用于由未受刺激的间充质干细胞群体产生免疫极化的间充质干细胞群体的方法，该方法包括：使未受刺激的间充质干细胞群体与组合物相接触，该组合物包含：Toll样受体4(TLR4)配体、红细胞生成素和低氧或低氧模拟物暴露，其中所述免疫极化的间充质干细胞群体具有以促炎介质的表达为标志的促炎特性。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述Toll样受体4(TLR4)配体为脂多糖(LPS)。

81.根据权利要求79所述的方法，其中所述Toll样受体4(TLR4)配体为氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯。

82.根据权利要求79所述的方法，其中所述红细胞生成素以低于10ng/mL的浓度存在。

83.根据权利要求79所述的方法，其中所述低氧模拟物为氯化钴。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述氯化钴以5μM至500μM的浓度存在。

85.根据权利要求79所述的方法，其中所述组合物进一步包含干扰素。

86.根据权利要求79所述的方法，其中所述组合物进一步包含肿瘤坏死因子α(TNFα)。

87.根据权利要求79所述的方法，其中所述组合物不包含人或动物来源的血清。

88.根据权利要求79所述的方法，其中所述组合物为浓缩液。

89.根据权利要求79所述的方法，其中所述未受刺激的间充质干细胞群体与Toll样受体4(TLR4)配体、红细胞生成素和低氧或低氧模拟物同时接触。

90.根据权利要求79所述的方法，其中所述组合物与所述未受刺激的间充质干细胞群体接触至少30分钟但少于8小时。

91.根据权利要求79所述的方法，其进一步包括在RNA或蛋白质水平上监测TNFSF10(TRAIL)的表达。

92.通过权利要求79的方法处理的间充质干细胞群体。

93.通过权利要求79的方法处理的人间充质干细胞群体。

94.通过权利要求79的方法处理的犬、猫或马的间充质干细胞群体。

95.通过权利要求79的方法处理的间充质干细胞群体，其中所述间充质干细胞来源于多能干细胞。

96.通过权利要求79的方法处理的间充质干细胞群体，其中所述细胞以与未受刺激的间充质干细胞群体相比增加的TNFSF10

(TRAIL)mRNA表达为标志。

97.一种包括通过权利要求79的方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的方法，其中所述疾病为癌症。

98.一种包括通过权利要求97的方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的方法，其中所述癌症为卵巢癌。

99.一种包括通过权利要求97的方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的方法，其中所述癌症为葡萄膜黑色素瘤。

100.一种包括通过权利要求79的方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的方法，其中所述疾病为病毒性病况。

101.一种包括通过权利要求79的方法处理的间充质干细胞群体的用于治疗疾病的方法，其中所述疾病为细菌感染。