CN105726583A - 人工栽培桑黄提取物抗炎活性成分制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人工栽培桑黄提取物抗炎活性成分制备方法，采用实体烘干、粉碎、高温水浸泡过夜，煎煮提取，合并滤液，减压浓缩得水提取物；水提取物乙醇沉淀过夜，离心去沉淀，收集上清液减压浓缩得水提取物，冷冻干燥得干粉，用甲醇溶剂萃取，去除甲醇溶剂部分得到甲醇不溶解沉淀，沉淀物冷冻低压干燥去除甲醇残留，即得目的提取物。本发明工艺简单，操作合理，同时可以得到桑黄提取物的抗炎有效部位，是桑黄人工栽培子实体这种中药材在抗炎作用中的新发现；为桑黄在结肠炎、细菌引起的感冒发烧炎症的临床应用方面，提供了科学依据和新的药用材料。

Description

人工栽培桑黄提取物抗炎活性成分制备方法

技术领域

本发明涉及人工栽培桑黄提取物抗炎活性成分制备方法。

背景技术

桑黄作为我国传统的中药材，最早记载于《神农百草经》和李时珍的《本草纲目》，主要用于止泻、崩漏带下、脾虚泄泻，此外还能利五脏、排毒、活血。在20世纪70年代就已经认识到桑黄的抗肿瘤效果(SasakiT，AraiY，IkekawaT，etal.Antitumorpolysaccharidesfromsomepolyporaceae，Ganodermaapplanatum(Pers.)PatandPhellinuslinteus(Berk.etCurt)Aoshima[J].ChemPharmBull(Tokyo)，1971，19(4):821)。在过去的30年里，其20多种药效逐渐为人们所探知，如增强机体免疫、保肝护肝、治疗关节炎等(张维博，王家国，李正阔，杨丽群，秦俭，向仲怀，崔红娟.药用真菌桑黄的研究进展，中国中药杂志，2014；39(15)：2838-2845)；桑黄的乙醇提取物已被证实具有消炎和止痛功效(KimSH，SongYS，KimSK，etal.Anti-inflammatoryandrelatedpharmacologicalactivitiesofthen-BuOHsubfractionofmushroomPhellinuslinteus[J].JEthnopharmacol，2004，93(1):141)；该提取物还可以降低CD3+(Tcells)，CD19+(Bcells)，CD4+(T-helper)，CD8+(T-cytotoxic)，MHCclassⅡ/CD11c+(antigen-presentingcells)，CD4+/CD25+(activatedT-helper)等免疫相关蛋白的表达，抑制白细胞向红肿部位的募集，同时减少TNF-α，IL-1β和IL-6细胞因子以及免疫球蛋白IgG的释放，从而缓解小鼠的关节炎(KimGY，RohSI，ParkSK，etal.AlleviationofexperimentalsepticshockinmicebyacidicpolysaccharideisolatedfromthemedicinalmushroomPhellinuslinteus[J].BiolPharmBull，2003，26(4):1418)。

由于野生桑黄生长缓慢，产量十分稀少。本发明申请人前期开展了大量的桑黄子实体人工袋料栽培技术研究，并对相关技术申请了“一种具有抗肿瘤活性的桑黄高效工厂化袋料栽培工艺(申请号：201511009405.2)”，现在需要一种提取该桑黄抗炎活性成分的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供人工栽培桑黄提取物抗炎活性成分制备方法，能够有效解决目前没有提取桑黄抗炎活性成分方法的问题。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：人工栽培桑黄提取物抗炎活性成分制备方法，由2015年10月23日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.11407的桑黄菌培育成对桑黄子，依次包括以下步骤：

A、取人工栽培的桑黄子实体经50-70℃干燥，粉碎后过40-60目筛，以20-30倍量水90-95℃浸提18-24h，重复上述浸提3次，冷却，过滤，合并滤液，减压浓缩得水提取物；

B、取水提取物加3倍体积100％乙醇沉淀18-24h，离心去沉淀，收集上清液减压浓缩得水提取物，重复上述沉淀步骤1次，获得的水提取物冷冻干燥得干粉；

C、干粉用100％甲醇溶剂萃取，去除甲醇溶剂得到甲醇不溶解沉淀，沉淀物冷冻低压干燥去除甲醇残留，即得目的提取物。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、本发明工艺简单，操作合理，同时可以得到桑黄水提取物抗炎有效部位，该有效部位与已报道的桑黄抗炎有效部位(乙醇提取物)不同，是桑黄这种中药材在抗炎作用中的新发现；

2、以本发明所述的桑黄提取物1克/千克体重剂量给小鼠灌胃后，连续观察14d，小鼠全部健存，其外观、食欲、行为活动、排泄等均未见异常；第14d脱颈处死并解剖，各个脏器官未见异常，说明桑黄提取物在该剂量及以下剂量下研究其抗炎性较安全；

3、本发明研究结果为桑黄在结肠炎、细菌引起的感冒发烧炎症治疗的临床用药方面，提供了理论与实验基础；

4、本发明得到抗炎有效部位，具有易溶于水，长期常温保存不吸潮等优点，可以在药学上接受载体或赋形剂制备成药物制剂，这些药物制剂可以选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。

附图说明

图1受试药物对结肠炎患者PBMC的影响；

图2受试药物对正常人外周血CD4+细胞的影响；

图3受试药物对结肠炎患者人外周血CD4+细胞的影响；

图4受试药物对发烧患者人外周血CD4+细胞的影响；

图5受试药物对结肠炎患者人外周血CD4+细胞凋亡的影响；

图6受试药物对3％DSS诱导的急性结肠炎小鼠体重的影响；

图7受试药物对3％DSS诱导的急性结肠炎小鼠血液指标的影响；

图8受试药物对1％DSS诱导的慢性结肠炎小鼠体重的影响；

图9受试药物对1％DSS诱导的慢性结肠炎小鼠血液指标的影响。

其中图1至图4中A代表正常组，B代表受试药物组(50ug/ml)。

具体实施方式

人工栽培桑黄提取物抗炎活性成分制备方法，本发明所使用的桑黄菌(Inonotuslinteus)来自浙江省农业科学院蚕桑所，是从浙江省桐庐县桑树上寄生的野生桑黄子实体分离纯化菌株，该菌株经过ITS分子生物学鉴定后，于2015年10月23日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.11407，依次包括以下步骤：

A、取人工栽培的桑黄子实体经50-70℃干燥，粉碎后过40-60目筛，以20-30倍量水90-95℃浸提18-24h，重复上述浸提3次，冷却，过滤，合并滤液，减压浓缩得水提取物；

B、取水提取物加3倍体积100％乙醇沉淀18-24h，离心去沉淀，收集上清液减压浓缩得水提取物，重复上述沉淀步骤1次，获得的水提取物冷冻干燥得干粉；

C、干粉用100％甲醇溶剂萃取，去除甲醇溶剂得到甲醇不溶解沉淀，沉淀物冷冻低压干燥去除甲醇残留，即得目的提取物。

所述的桑黄提取物抗炎活性成分在制备抗炎药物中的应用：

所述的桑黄提取物抗炎活性成分与医学上可接受载体制备成片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。

为了更好的理解本发明中桑黄提取物的抗炎作用，采用结肠炎、高烧炎症患者外周血白细胞(PBMC)、CD4+细胞、DSS诱导产生的结肠炎小鼠模型考察了桑黄提取物抗炎效果，具体实施如下：

1.材料与方法

1.1受试材料

桑黄子实体：来自浙江省农业科学院蚕桑所人工袋料栽培。本工艺生产的受试原料，形状：棕黄色粉末，批号：20150307，贮存方法：避光、干燥、常温(25℃)保存。

2.试剂与仪器

2.1试剂

Ficoll分离液、CD4+EasySep阴性分离试剂盒、RPMI1640完全培养基，加拿大Stemcell公司；CD3、CD28、IL-2美国Ebioscience公司；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒，美国Invitrogen公司；碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)染液，美国BD公司；

2.2仪器设备

CO2培养箱，美国Therom公司；超净工作台，新加坡Esco公司；倒置显微镜，美国Leica公司；TECAN酶标仪，瑞士Tecan公司。-86℃低温冰箱美国FORMA公司；AG204-电子分析天平瑞士METTLER公司。Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司，流式细胞仪，美国BD公司。

2.3PBMC、CD4+激活

PBMC采用Ficoll分离液分离、CD4+采用EasySep阴性分离试剂盒分离，纯度用流式细胞仪检测＞95％。采用CD3(2ug/ml)、CD28(1ug/ml)对分离的PBMC、CD4+进行激活。

2.4细胞凋亡检测

将PBMC、CD4+细胞以3×10⁸L^-1的密度接种于U型96孔板中，每孔100μl。给予受试药物桑黄提取物50ug/ml处理细胞，每组均设4复孔，并于第3、4、5、6天利用显微镜观察细胞；按照AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒说明书，分别取各组孵育6天的细胞悬液，500g4℃离心10min，弃上清，PBS洗涤2遍。然后分别将细胞重悬于100μl缓冲液,再加入5μlAnnexinV-FITC标记早期凋亡和1μlPI染料标记晚期凋亡，轻轻混匀，避光室温反应15min后加入400μl缓冲液，1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.5试验动物

品种品系：C57/B6小鼠，级别：SPF级，性别：雄性，体重：22-24g，来源：中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可证：SCXK(沪)2012-0005]。

2.6实验条件

屏障系统实验饲养室，温度：22±1℃，湿度：50-70％，光照：150-200Lx，12小时明暗

交替，噪音<50dB，使用许可证：SYXK(浙)2003-0003。饮水：自来水过滤灭菌，置于高压灭菌的饮水瓶中自由饮用。饲料：全价营养颗粒饲料。饲养方式：自由饮食，小鼠饲养笼中给予充足的饲料和水，每笼饲养5只小鼠，试验前，每只小鼠称重、标记编号。

2.7试验方法

(1)急性肠炎实验

取体重为22-24g的雄性C57/B6小鼠30只，按体重随机分成3组，即：正常对照组：

蒸馏水；模型对照组：3％DSS，用蒸馏水配制，饮用。受试药物组：3％DSS，用蒸馏水配制，饮用，同时给予本工艺生产的药剂250μg/kg，给药途径及容量：经口灌胃，10ml/kg，实验周期为6天，实验小鼠每天称重，末次给药后小鼠取血，用7020全自动生化仪测定WBC、RBC、PLT、SCC、MCC、LCC生化指标。

(2)慢性肠炎实验

取体重为22-24g的雄性C57/B6小鼠30只，按体重随机分成3组，即：正常对照组：

蒸馏水；模型对照组：1％DSS，用蒸馏水配制，饮用。受试药物组：1％DSS，用蒸馏水配制，饮用。连续给予1％DSS7天后，换为蒸馏水给予7天，继续连续给予1％DSS7天，同时给予本工艺生产的药剂250μg/kg进行治疗，然后模型对照组继续给予蒸馏水3天，受试药物组继续给予本工艺生产的药剂250μg/kg3天，实验小鼠每天称重，末次给药后小鼠取血，用7020全自动生化仪测定WBC、RBC、PLT、SCC、MCC、LCC生化指标。

2.8数据处理

用SPSS12.0软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差表示，计量资料应用t检验评价试验结果。

2.结果与分析

2.1受试药物对结肠炎患者PBMC、CD4+细胞增殖的影响

由图1可知，显微镜观察发现受试药物桑黄提取物可显著抑制结肠炎患者(IBD)PBMC的体外增殖。由于CD4+为PBMC的主要细胞群组成，因此为了探讨这一作用机制，进一步从PBMC中通过EasySep阴性分离试剂盒分离出CD4+细胞。经流式细胞仪检测，纯化的CD4+细胞纯度高于95％。

50ug/ml桑黄提取物处理不同来源的CD4+细胞。显微镜观察发现对正常CD4+细胞，桑黄提取物并不表现出明显的抑制作用如图2所示，但对IBD、高烧等炎症患者CD4+细胞，桑黄提取物处理6天后表现出显著的增殖抑制作用，如图3、图4。

2.2桑黄提取物对结肠炎患者CD4+细胞凋亡的影响

通过流式细胞仪测定桑黄提取物对CD4+细胞凋亡的影响，结果发现：桑黄提取物对正常CD4+无明显的诱导凋亡作用；但可极显著诱导IBD和高烧炎症患者CD4+的凋亡，特别是晚期凋亡和坏死细胞比例显著升高，但不同患者对桑黄的敏感性并不相同，如图5。

2.3桑黄提取物对结肠炎小鼠的影响

DSS可诱导小鼠产生结肠炎。给予小鼠3％DSS可诱导小鼠急性肠炎，小鼠于第6天出现便血，体重显著下降(图6)，小鼠血液中白细胞总数、血小板数量、小细胞群(淋巴细胞)、中间细胞群(嗜酸细胞、嗜碱及单核)和大细胞群(中性粒细胞)均显著升高，同时给予受试药物250μg/kg则可预防小鼠体重减轻，降低白细胞、血小板、小细胞群、中间细胞群和大细胞群的数量如图7；给予1％DSS诱导小鼠慢性肠炎，给予给予受试药物250μg/kg治疗10天后，小鼠体重未减轻如图8，血常规指标趋向正常如图9。

以上实验结果证实本发明中的受试药物具有显著的抗炎作用。

以上所述仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (1)

1.人工栽培桑黄提取物抗炎活性成分制备方法，由2015年10月23日保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.11407的桑黄菌培育成对桑黄子，其特征在于：依次包括以下步骤：

A、取人工栽培的桑黄子实体经50-70℃干燥，粉碎后过40-60目筛，以20-30倍量水90-95℃浸提18-24h，重复上述浸提3次，冷却，过滤，合并滤液，减压浓缩得水提取物；

B、取水提取物加3倍体积100％乙醇沉淀18-24h，离心去沉淀，收集上清液减压浓缩得水提取物，重复上述沉淀步骤1次，获得的水提取物冷冻干燥得干粉；

C、干粉用100％甲醇溶剂萃取，去除甲醇溶剂得到甲醇不溶解沉淀，沉淀物冷冻低压干燥去除甲醇残留，即得目的提取物。