CN103550244A - 一种具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖，按质量份包括香菇多糖，25份；黄芪多糖，50份；党参多糖，125份。该中药复合多糖针对小鼠口服的最佳剂量为每天每公斤体重1g，连续给药7～10天；应用于猪的最佳添加量为每天每公斤体重0.111g，连续给药14～21天。该发明将三味多糖进行科学合理的配伍组合，可以产生互补和协调增强作用，形成的多糖组合物可全面恢复和增强机体的免疫功能，具有明显的免疫增强功效，并且均为常用的原料药，安全性好，无毒副作用。

Description

一种具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖及应用

技术领域

本发明涉及动物药学、医学和兽医学领域，具体涉及由真菌多糖和植物多糖组合而成的具有既能增强体液免疫，又能协同增强细胞免疫作用的中药复合多糖及应用。

背景技术

免疫机能是机体防御抗病能力的主要力量。免疫系统分为非特异性免疫和特异性免疫，二者相互作用，相互补充；非特异性免疫是第一道屏障，特异性免疫是在非特异性免疫后更有针对性、更强烈的免疫反应，是清除病毒或细菌更有效的防御机制。特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫，二者相互配合共同发挥免疫效应；病毒感染过程中，通常是先通过体液免疫来阻止病毒在机体内传播，若病毒已经侵染到寄主细胞中，就要通过细胞免疫来清除。许多传染病如猪瘟、禽流感、口蹄疫、猪肺疫、猪蓝耳病等都是在机体免疫力较弱的情况下感染发病，而猪蓝耳病、猪伪狂犬病等的发生可以破坏免疫细胞，引起免疫抑制，使疾病更加严重。因此，恢复和提高机体各种免疫功能是保证其防御抗病能力的关键。

免疫增强剂是指在不干扰正常免疫功能的情况下，纠正免疫水平异常低下的物质，自1925年法国兽医兼免疫学家Gaston Ramon发现在疫苗中加入某些与抗原无关的物质，能特异地增强机体对白喉和破伤风毒素的抗病力以来，在医学和兽医学领域中，许多国家都不同程度的开展了这方面的研究。目前免疫增强剂的种类繁多，按组成材料可分为：矿物质类，如硒、锌等；中草药类，如黄芪、白芍、芦荟、当归等；免疫佐剂类，如蜂胶、弗氏佐剂等；微生物制剂类，如卡介苗、霍乱毒素B亚单位等；维生素类，如维生素A、E等；氨基酸类，如精氨酸、亮氨酸等；激素或激素样物质类，如生长激素、胸腺肽等；核酸制剂类，如多(聚)核苷酸、免疫核糖核酸等；抗寄生虫药物类，如左旋咪唑、甲硝唑等；其它免疫增强剂，如干扰素、蜂花粉、热休克蛋白等。在这些物质中，最符合世界卫生组织提出的理想免疫增强剂要求的，最有发展前途的就是多糖。多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中。多糖在免疫增强剂或免疫调节剂中，具有独特的优势，其卓越的双向调节功能和较小的毒副作用成为新世纪免疫增强剂研究的重点对象。对免疫增强剂的研究已成为当今免疫学和化学界的一个活跃的领域。未来的免疫增强剂应该有以下特征：能促进体液免疫和细胞免疫；能增强弱免疫性抗原的抗原性，而没有毒副作用；能以不同途径免疫，也能用于不同抗原；能在免疫抑制个体中发挥作用；应用于食品动物不应留有残余毒素；能有效影响免疫反应的质量稳定；便宜而且容易生产和保存。

多糖(polysaccharides)又称多聚糖，按其来源不同可分为真菌多糖、高等植物多糖、藻类地衣多糖、动物多糖、细菌类多糖五大类。20世纪70年代以来,科学家们发现多糖及多糖复合物参与和介导细胞各种生命现象的调节，可能与基因的遗传密码类似，以多糖密码的形式按照一定的规则排列组合，构成信息分子,相互识别决定生物的多样性，促RNA、DNA和蛋白质的合成，清除自由基，激活免疫系统活性，对机体特异性与非特异性免疫、细胞免疫与体液免疫均有重要调节作用。因而受到世界各国的高度重视，对多糖的生物学基础研究与应用技术和产品的研发日趋活跃。多糖的免疫调节作用主要包括激活巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性细胞(CTL)等免疫细胞；激活补体系统，调节红细胞免疫；影响蛋白质的合成以及抗体的生成；影响cAMP和cGMP浓度和相对比值，促进白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)的生成；打破机体免疫系统损伤造成的免疫耐受，提高免疫系统对抗原的识别能力。

植物多糖代表黄芪多糖应用最为广泛，黄芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）可增加机体胸腺、脾脏和淋巴结等免疫器官的重量，促进巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、骨髓干细胞和NK细胞增殖和增强其活性，还可通过改善微循环、抗应激、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤作用，拮抗感染和创伤引起的免疫细胞减少和保护脾脏、肝脏等器官损伤等多种药理功效。真菌多糖中的典型代表香菇多糖（Lentinan,LNT）是典型的T细胞激活剂，并促进有巨噬细胞参与的免疫调节，LNT体内外均能增强正常小鼠与免疫功能低下小鼠的迟发型超敏反应(DTH)、促进细胞毒T淋巴细胞(CTL)的产生、提高CTL的杀伤活力、提高抗体依赖性细胞毒细胞(ADDC)活性。香菇多糖以促进T细胞和巨噬细胞增殖为主，而黄芪多糖与香菇多糖具有显著的协同作用。

近些年来，对单味多糖免疫增强作用的研究较多见，而对复合多糖免疫增强作用的研究较少，更少见对复合多糖最佳配比用于免疫增强剂的研究。试验证实，每种单味多糖的免疫调节作用均有其自身特点，在免疫调节作用方面既有其独特优势，也有其不足，单独应用某种多糖均难以达到全面调节免疫功能的目的，因此，依据需要，选择具有独特免疫活性和协同作用的不同种类多糖进行组合优化，研制具有恢复和提高全面免疫功能的复合多糖免疫增强剂，是防治畜禽传染病的迫切需要。以猪为例，目前，我国规模化猪场猪病频发，病原的毒力增强，多病原混合感染使疾病更为复杂且难以控制净化，免疫失败现象普遍存在，其元凶就是免疫抑制性疾病的存在。大家公认的免疫抑制性疾病如猪繁殖与呼吸疾病综合征、圆环病毒病、伪狂犬病、支原体肺炎等都能破坏猪的免疫系统，造成不同程度的免疫抑制，除了容易导致细菌性疾病混合感染或继发感染外，更为严重的是导致相关疫苗免疫失败。因此，在防控猪病中首先要使用免疫增强剂提高猪体的特异性与非特异性免疫力，消除免疫抑制性疾病，才能保障猪群的健康水平。药物之间的协同配伍使用是中医的一个重要原则，许多研究证明香菇多糖和黄芪多糖具有协调免疫增强作用，免疫增强剂之间的联合应用具有广阔的发展前景。因此，本研究选用香菇多糖、黄芪多糖和党参多糖组成复合多糖，预期可以达到全面恢复和增强感染猪免疫功能的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种由香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖组成的具有既能增强体液免疫，又能协同增强细胞免疫作用的中药复合多糖，并应用于畜禽传染病的防治。

一种具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖，按质量份包括：香菇多糖，25份；黄芪多糖，50份；党参多糖，125份。

所述中药复合多糖针对小鼠口服的最佳剂量为每天每公斤体重1g，连续给药7～10天。

所述中药复合多糖应用于猪的最佳添加量为每天每公斤体重0.111g，连续给药14～21天。

一种具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖的制备方法，有以下步骤：

1）取新鲜香菇清水洗净，按质量比加10～20倍量蒸馏水煎煮1～2h，取香菇的一次续滤液并收集药渣；

2)取黄芪中药饮片，按质量比加10～20倍量蒸馏水超声浸渍20～30min后，煎煮1～2h，取黄芪的一次续滤液并收集药渣；

3）取党参中药饮片，按质量比加10～20倍量蒸馏水超声浸渍20～30min后，煎煮1～2h，取党参的一次续滤液并收集药渣；

4）将步骤1）、2）、3）中的药渣分别再按质量比加入5～10倍量蒸馏水煎煮30～60min，得香菇、黄芪、党参各自的二次续滤液并分别收集药渣；

5）将步骤4）中的药渣再分别加入按质量比5～10倍量蒸馏水煎煮30～60min，得香菇、黄芪、党参各自的三次续滤液；

6）分别将香菇、黄芪、党参各自的一次续滤液、二次续滤液、三次续滤液合并，用旋转蒸发仪减压浓缩至1/4～1/3体积，用95%乙醇沉淀，使溶液中乙醇浓度达到80%，4℃冰箱过夜，弃上清，回收沉淀；

7）将步骤6）的沉淀用喷雾冷冻干燥机干燥3～6h后用研磨机将干燥物研磨成粉末，分别得到香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖；

8）按照权利要求1的香菇多糖25份，黄芪多糖50份，党参多糖125份，分别称取香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖，组成复合多糖，按质量比复合多糖：可溶性淀粉=1:4称取可溶性淀粉，将复合多糖和可溶性淀粉置入小型中药拌料机中混合20～30min，然后用超微粉碎机粉碎10～30S,在拌料机内重复混合、粉碎1次后，再混合5～10min得到20%的中间浓度粉末，再按质量比中间浓度粉末：可溶性淀粉=1:20称取可溶性淀粉，将中间浓度粉末和可溶性淀粉置入小型中药拌料机中混合20～30min，然后用超微粉碎机粉碎10～30S，在拌料机内重复混合、粉碎1次后，再混合1～4min，即得1%的具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖。

本发明的有益效果为：

（1）选取香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖三种多糖，皆具有一定的免疫增强作用，但都有各自的偏向性，将三味多糖进行科学合理的配伍组合，则可以产生互补和协调增强作用，形成的多糖组合物可全面恢复和增强机体的免疫功能，具有明显的免疫增强功效，并且均为常用的原料药，安全性好，无毒副作用。

（2）该复合多糖组合物能明显增强正常小鼠外周血淋巴细胞百分率；能明显增强小鼠脾淋巴细胞增殖能力，增强正常小鼠的脾脏指数；能明显增强正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力；能明显增强免疫抑制小鼠CD4+、CD8+单阳性及双阳性T淋巴细胞亚群百分比；能明显增强免疫抑制小鼠外周血细胞因子白介素2、γ-干扰素的分泌量；能明显增强免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的活性；能显著增强猪瘟、猪蓝耳病抗体水平。

（3）确定了多糖组合物的应用剂量和使用方法，便于推广应用。

具体实施方式

实施例：

1）取2Kg新鲜香菇清水洗净，按质量比加20Kg蒸馏水煎煮1h，取香菇的一次续滤液并收集药渣；

2)取0.5Kg黄芪中药饮片，按质量比加5Kg蒸馏水超声浸渍20min后，煎煮1h，取香菇的一次续滤液并收集药渣；

3）取0.5Kg党参中药饮片，按质量比加5Kg蒸馏水超声浸渍20min后，煎煮1h，取党参的一次续滤液并收集药渣；

4）将步骤1）、2）、3）中的药渣分别再按质量比加入5倍量蒸馏水煎煮30min，得香菇、黄芪、党参各自的二次续滤液；

5）将步骤4）中的药渣分别再按质量比加入5倍量蒸馏水煎煮30min，得香菇、黄芪、党参各自的三次续滤液；

6）分别将香菇、黄芪、党参各自的一次续滤液、二次续滤液、三次续滤液合并，用旋转蒸发仪减压浓缩至1/3体积，用95%乙醇沉淀，使溶液中乙醇浓度达到80%，4℃冰箱过夜，弃上清，回收沉淀；

7）将步骤6）的沉淀用喷雾冷冻干燥机干燥3～6h后用研磨机将干燥物研磨成粉末，即分别得到香菇多糖83.6g、黄芪多糖132.6g、党参多糖111.5g；

8）按照权利要求1的香菇多糖25份，黄芪多糖50份，党参多糖125份，分别称取香菇多糖5g、黄芪多糖10g、党参多糖25g，组成复合多糖40g，按质量比复合多糖：可溶性淀粉填料=1:4称取可溶性淀粉填料160g，将复合多糖和可溶性淀粉填料置入小型中混合，先将可溶性淀粉填料倒入拌料机，然后徐徐加入复合多糖，转速24r/min，搅拌20～30min，然后用超微粉碎机粉碎10～30S,在拌料机内重复混合、粉碎1次后，再混合5～10min得到20%的中间浓度粉末，再按质量比中间浓度粉末：可溶性淀粉填料=1:20称取可溶性淀粉填料4.0Kg，将中间浓度粉末和可溶性淀粉填料置入小型中药拌料机中混合20～30min，然后用超微粉碎机粉碎10～30S，在拌料机内重复混合、粉碎1次后，再混合1～4min，即得1%的具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖4.2Kg。按照2010版《中国兽药典》粉剂含量均匀度的限度≤15.0，复合多糖产物检测合格。

实验例1：采用CCK8法检测单味中药多糖及复合中药多糖体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

试验方法：无菌取雄性，周龄6-8周，体重20g±2g的Balb/c小鼠脾于RPMI-1640培养液中吹出细胞。收集细胞悬液用Tris-NH4Cl去除红细胞，用RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀，Trypan Blue染色计数活细胞95%以上，调整细胞密度为5×10⁶个/毫升，制成脾细胞悬液。分组及给药情况见表1。上述细胞和药物均加完，标记好后，将96孔细胞培养板置37℃、5%CO₂培养箱中连续培养44小时；取出培养板，每孔加入20μl CCK8液，继续培养4小时；取出用酶标仪于570nm处测定吸光度OD值，结果吸光度OD值的高低，来反映小鼠脾淋巴细胞增殖的情况。结果见表2。

表1 多糖分组及给药情况

表2 中药多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

注：表中*代表差异显著（P<0.05）；**代表差异极显著（P<0.01）。

依据表2结果，与空白对照比较（0mg/L），香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖、枸杞多糖、五味子多糖、女贞子多糖体外剂量分别为25 mg/L、25 mg/L、100 mg/L、25 mg/L、25 mg/L、50 mg/L时，均能显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）促进小鼠脾淋巴细胞增殖。据此剂量组合成不同的复合中药多糖，通过其体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响来筛选最佳的中药多糖组合，组合情况及结果详见表3。

表3不同中药多糖组合对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

中药多糖组合及浓度（mg/L）	OD值
		空白对照	0.499±0.13
香菇25+黄芪25+女贞子25	0.586±1.48
		香菇25+黄芪25+党参100	0.641±2.14**
香菇25+黄芪25+五味子25	0.588±1.98*
		香菇25+黄芪25+枸杞25	0.540±2.17
香菇25+黄芪25+党参100+女贞子50	0.573±3.14*
		香菇25+黄芪25+党参100+枸杞25	0.601±2.07*
香菇25+黄芪25+党参100+五味子25	0.564±1.47

注：表中*代表差异显著（P<0.05）；**代表差异极显著（P<0.01）。

据表3可见，与空白对照组相比，香菇+黄芪+党参的组合能极显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖（P<0.01）,确定香菇、黄芪、党参为最佳中药多糖组合。

实验例2：采用正交实验筛选中药组合刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的最佳比例

无菌取健康6-8周龄Balb/c雄性小鼠脾于RPMI-1640培养液中吹出细胞。收集细胞悬液用Tris-NH4Cl去除红细胞，用RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀，Trypan Blue染色计数活细胞95%以上，调整细胞密度为5×10⁶个/毫升，制成脾细胞悬液。依据表2的结果，香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖体外刺激小鼠脾淋巴细胞细胞增殖的最佳浓度分别为25mg/L、25mg/L、100mg/L，加入100μl；采用正交实验设计多糖组合加入细胞，细胞和药物均加完，标记好后，将96孔细胞培养板置37℃、5%CO₂培养箱中连续培养44小时；取出培养板，每孔加入20μl CCK8液，继续培养4小时；取出用酶标仪于570nm处测定吸光度OD值，结果吸光度OD值的高低，来反映小鼠脾淋巴细胞增殖的情况。多糖组合情况及结果见表4。

表43种中药多糖组合对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

方差分析结果表明，A、C因素对细胞增殖有显著性影响（P<0.05)，B因素对细胞增殖无显著性影响，A因素对细胞增殖有极显著性影响(P<0.01)。通过选择平均数大的水平A2、B3、C3组合成最优水平组合A2B3C3，即复合多糖剂量最优组合为25:50:125。

实验例3：通过组合多糖体内对小鼠免疫功能的影响，筛选组合多糖最佳给药剂量

用实施例制备的中药复合多糖，取健康6-8周龄Balb/c小鼠，雄性，体重(20±2)g，随机分为7组，每组8只。其中复方一组小鼠按每公斤体重每天灌服复合多糖0.5g；复方二组每公斤体重每天灌服复合多糖1g；复方二组每公斤体重每天灌服复合多糖2g，黄芪对照组每公斤体重每天灌服黄芪多糖1g；香菇对照组每公斤体重每天灌服香菇多糖1g；党参对照组每公斤体重每天灌服党参多糖1g；生理盐水对照组每天灌服等量的生理盐水，连续7天。

第8天清晨小鼠摘眼球采血进行白细胞分类计数。培养液冲洗腹腔，收集细胞悬液离心弃上清，用培养液重悬，Trypan Blue染色计数活细胞数为95%以上，调整细胞密度为5×10⁹个/L。将细胞移入96孔细胞培养板，培养2小时；取出弃上清，洗板1次弃上清，再加入培养液，培养板孔内的贴壁细胞即为纯化的小鼠PMΦ。细胞培养板离心弃上清，加入中性红，继续培养30分钟；取出离心弃上清，PBS冲洗2次；加细胞溶解液（乙酸：无水乙醇=50：50），室温静置过夜待细胞溶解；翌日用酶标仪于540nm波长处测量吸光度A值，以A₅₄₀值表示小鼠PMΦ对中性红的吞噬能力。取脾脏称重，计算脾脏指数。结果见表5。

表5复合多糖对小鼠免疫功能的影响

注：表中*代表差异显著（P<0.05）；**代表差异极显著（P<0.01）。

表5可见，与生理盐水组和各单味药对照组相比，复方二组能极显著增强巨噬细胞吞噬功能，以及外周血淋巴细胞百分率（P<0.01），复方一组与复方三组显著增强淋巴细胞百分率（P<0.05），复方二组与三组能极显著增强小鼠脾脏指数（P<0.01）有明显的免疫增强作用。因此确定复方多糖给小鼠的最佳添加量为每公斤体重1g。

实验例4：复合多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

用实施例制备的中药复合多糖；根据实验例3的结果，确定用药剂量。取健康6-8周龄Balb/c小鼠，雄性，体重(20±2)g，随机分为5组，每组8只。小鼠分组及给药情况详见表6。处理10天后摘眼球采血200μl，EDTA抗凝血用流式细胞数测淋巴细胞亚群CD4、CD8的比例，结果见表7。

小鼠眼球采血后，分离血清采用双抗夹心ELISA法检测细胞因子IL-2、IFN-γ的含量。按照ELISA产品说明上的步骤操作，简述步骤如下：加待测样品、酶标二抗于酶标板中振荡反应1小时；洗板5次，加显色液显色10分钟后加终止液，终止反应；在450nm处测吸光值。按照事先做好的各种细胞因子的标准曲线，在标准曲线上查找相对应的该种细胞因子的分泌量，结果用细胞因子分泌量(pg/ml)表示，结果见表8。

培养液冲洗腹腔，收集细胞悬液离心弃上清，用培养液重悬，Trypan Blue染色计数活细胞数为95%以上，调整细胞密度为5×10⁹个/L。将细胞移入96孔细胞培养板，培养2小时；取出弃上清，洗板1次弃上清，再加入培养液，培养板孔内的贴壁细胞即为纯化的小鼠PMΦ。细胞培养板离心弃上清，加入中性红，继续培养30分钟；取出离心弃上清，PBS冲洗2次；加细胞溶解液（乙酸：无水乙醇=50：50），室温静置过夜待细胞溶解；翌日用酶标仪于540nm波长处测量吸光度A值，以A₅₄₀值表示小鼠PMΦ对中性红的吞噬能力。结果见表8。

表6小鼠分组及给药情况

表7复合多糖对免疫抑制小鼠淋巴细胞亚群的影响

组别	CD8+CD4-（%）	CD8+CD4+（%）	CD4+CD8-（%）
				第1组	0.05±0.57	0.25±0.31**	13.23±1.24**
第2组	3.07±0.92	0.26±0.47**	12.91±1.12**
				第3组	2.51±0.67	0.06±0.09	4.44±0.61
第4组	5.13±0.82	0.15±0.32*	22.24±1.79**
				第5组	5.34±0.41	0.07±0.04	17.23±1.11**

注：表中*代表差异显著（P<0.05）；**代表差异极显著（P<0.01）。

表7可见，与3组相比，1,2,4,5组CD4+T淋巴细胞亚群百分比差异极显著（P<0.01），CD4+CD8+双阳性T淋巴细胞百分率1.2组与3组差异极显著，4组差异显著,饲喂复合多糖低、高剂量（第1,2组）能显著增强免疫抑制小鼠CD4单阳性和CD4CD8双阳性T淋巴细胞百分比（P<0.01）,1,2组之间差异不显著。

表8复合多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

注：表中*代表差异显著（P<0.05）；**代表差异极显著（P<0.01）。

表8可见，IL-2的分泌量1,2,4,5组与3组相比差异均极显著（P<0.01）；巨噬细胞吞噬中性红活性均差异显著（P<0.05），除第4组外，IFN-γ的分泌量1,2,5组与3组相比均差异显著（P<0.05）。说明饲喂复合多糖低高剂量（第1,2组）能显著增强免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬中性红活性均（P<0.05）,1,2组之间差异不显著，第4组与第5组之间差异显著。因此复合中药多糖对正常小鼠和氢化可的松免疫抑制模型小鼠的免疫功能均有明显的增强作用，用药的最佳剂量为每公斤体重1克，每天1次，连用7-10天。

实验例5：复合多糖对猪免疫功能的影响

用实施例制备的中药复合多糖；选取40日龄猪蓝耳病（PRRS）血清型检测为阴性的仔猪42头，试验猪随机分成7组，每组6头，每头猪肌肉注射PRRS弱毒苗1ml，免疫当天开始在饲料中添加复合多糖，每组的用药情况详见表9。分别采集试验猪免疫后0天、7天、21天、45天血液分离血清，测定PRRSV抗体效价。检测方法和步骤按武汉前科动物生物制品有限责任公司的PRRSELISA抗体检测试剂盒使用说明书进行，用酶标仪于630nm波长测定各反应孔中的OD值，样品OD值大于0.42为阳性；结果详见表10。

表9试验猪分组及给药情况

组别	多糖饲喂量	饲喂天数
			1	复合多糖0.037g/公斤.天	14
2	复合多糖0.111g/公斤.天	14
			3	复合多糖0.333g/公斤.天	14
4	复合多糖0.111g/公斤.天	7
			5	复合多糖0.111g/公斤.天	21
6	黄芪多糖0.111g/公斤.天	14
			7	空白对照组正常饲喂	14

表10试验猪血清PRRSV抗体ELISA检测结果（OD值）

组别	0天	7天	21天	45天
					1	0.058±0.004	0.47±0.02	1.11±0.14*	0.98±0.14*
2	0.063±0.005	0.48±0.05	1.37±0.12**	1.78±0.17**
					3	0.062±0.004	0.45±0.08	1.46±0.07**	1.81±0.12**
4	0.061±0.009	0.48±0.01	1.39±0.18**	0.91±0.19
					5	0.059±0.007	0.46±0.03	1.42±0.09**	1.82±0.15**
6	0.064±0.009	0.45±0.01	1.08±0.11	0.93±0.18
					7	0.061±0.004	0.44±0.02	0.89±0.04	0.79±0.07

注：表中*代表差异显著（P<0.05）；**代表差异极显著（P<0.01）。

表10可见，饲喂复合免疫多糖的试验猪免疫后21天时较空白对照组（第7组）PRRSV抗体水平均有提高，差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）；免疫后45天时，与第7组相比，除第4、6组外，其余各组PRRSV抗体水平均有提高，差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01），其中第2,3,5组效果最好，且差异不显著（P＞0.05）。

选取21日龄仔猪42头，试验猪随机分成7组，每组6头，每头猪肌肉注射猪瘟细胞兔化弱毒苗1ml，免疫当天开始在饲料中添加复合多糖，每组的用药情况同表8。分别采集试验猪免疫后0天、7天、21天血液分离血清，采用间接血凝试验（IHA）检测猪瘟抗体，用log₂N表示，结果详见表11。

表11试验猪猪瘟抗体IHA平均效价

组别	0天	7天	21天
				1	19.7	108.8	79.4
2	19.0	207.4	175.5
				3	17.9	214.5	159.1
4	18.4	119.4	90.4
				5	18.8	212.7	168.8
6	19.4	118.2	96.1
				7	19.7	50.2	43.7

从表11可以看出免疫前各组猪瘟平均抗体效价均较低，而且差异不大，免疫后7天，各试验组猪瘟平均抗体效价均明显高于空白对照组，第21天时，第2、3、5组的抗体效价仍明显高于对照组。

依据以上2组试验数据，可见饲喂复合多糖能明显提高试验猪PRRSV抗体水平和猪瘟抗体效价，即复合多糖能显著增强试验猪的体液免疫功能；并且复合免疫多糖饲喂猪的最佳剂量为每天每公斤体重0.111g，饲喂时间为14～21天。

Claims (4)

1.一种具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖，其特征在于：按质量份，包括：香菇多糖，25份；黄芪多糖，50份；党参多糖，125份。

2.根据权利要求1所述的一种具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖，其特征在于：所述中药复合多糖针对小鼠口服的最佳剂量为每天每公斤体重1g，连续给药7～10天。

3.根据权利要求1所述的一种具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖，其特征在于：所述中药复合多糖应用于猪的最佳添加量为每天每公斤体重0.111g，连续给药14～21天。

4.一种具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖的制备方法，其特征在于有以下步骤：

1）取新鲜香菇清水洗净，按质量比加10～20倍量蒸馏水煎煮1～2h，取香菇的一次续滤液并收集药渣；

2)取黄芪中药饮片，按质量比加10～20倍量蒸馏水超声浸渍20～30min后，煎煮1～2h，取黄芪的一次续滤液并收集药渣；

3）取党参中药饮片，按质量比加10～20倍量蒸馏水超声浸渍20～30min后，煎煮1～2h，取党参的一次续滤液并收集药渣；

4）将步骤1）、2）、3）中的药渣分别再按质量比加入5～10倍量蒸馏水煎煮30～60min，得香菇、黄芪、党参各自的二次续滤液并分别收集药渣；

5）将步骤4）中的药渣再分别加入按质量比5～10倍量蒸馏水煎煮30～60min，得香菇、黄芪、党参各自的三次续滤液；

6）分别将香菇、黄芪、党参各自的一次续滤液、二次续滤液、三次续滤液合并，用旋转蒸发仪减压浓缩至1/4～1/3体积，用95%乙醇沉淀，使溶液中乙醇浓度达到80%，4℃冰箱过夜，弃上清，回收沉淀；

7）将步骤6）的沉淀用喷雾冷冻干燥机干燥3～6h后用研磨机将干燥物研磨成粉末，分别得到香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖；

8）按照权利要求1的香菇多糖25份，黄芪多糖50份，党参多糖125份，分别称取香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖，组成复合多糖，按质量比复合多糖：可溶性淀粉=1:4称取可溶性淀粉，将复合多糖和可溶性淀粉置入小型中药拌料机中混合20～30min，然后用超微粉碎机粉碎10～30S,在拌料机内重复混合、粉碎1次后，再混合5～10min得到20%的中间浓度粉末，再按质量比中间浓度粉末：可溶性淀粉=1:20称取可溶性淀粉，将中间浓度粉末和可溶性淀粉置入小型中药拌料机中混合20～30min，然后用超微粉碎机粉碎10～30S，在拌料机内重复混合、粉碎1次后，再混合1～4min，即得1%的具有协同增强体液和细胞免疫作用的中药复合多糖。