CN106729699A - 一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液 - Google Patents

一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液，每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：肉苁蓉多糖1‑5g、香菇多糖60‑80mg、芍药苷20‑40mg、L‑谷氨酸钠0.5‑1g和酚红5‑10mg。本发明所提供的稀释液可有效增强猪伪狂犬活疫苗的免疫效果，延长疫苗保护期。

Description

一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液。
背景技术
伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）属于疱疹病毒（Herpesviridae）α疱疹病毒亚科（Alphaher-pesririnae）水痘病毒属（Varicello virus）的疱疹病毒亚科Ⅰ型（Porcine herpesvirus Typel）。猪既是伪狂犬病毒的贮存者，也是伪狂犬病毒的传染源，控制猪伪狂犬病不仅对养猪事业本身，而且对其它动物养殖的顺利发展也有着十分重要的意义。在欧美等发达国家，得利于PRV基因缺失活苗和相应鉴别方法的应用，该病得到控制或根除，但在发展中国家，该病仍频繁发生，严重制约了这些国家和地区养猪业的健康发展。
目前为预防和控制猪伪狂犬病，我国已开发出了多种猪伪狂犬病疫苗，但针对疫苗稀释液研究甚少，现有的疫苗稀释液免疫效果不够理想，且疫苗保护期较短。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液，该稀释液可有效增强疫苗的免疫效果，延长疫苗保护期。
为解决上述技术问题，本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：肉苁蓉多糖1-5g、香菇多糖60-80mg、芍药苷20-40mg、L-谷氨酸钠0.5-1g和酚红5-10mg。
进一步的，本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：肉苁蓉多糖2-4g、香菇多糖65-75mg、芍药苷25-35mg、L-谷氨酸钠0.6-8g和酚红6-8mg。
进一步的，本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：肉苁蓉多糖3g、香菇多糖70mg、芍药苷30mg、L-谷氨酸钠0.75g和酚红7.5mg。
其中，本发明所述肉苁蓉多糖的制备包括以下步骤：将肉苁蓉粉末按1：20-30料液比，加入至0.5%吐温水溶液，在超声功率400-600W、温度40-60℃条件下超声处理25-40min，抽滤，将所得滤液进行真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即可得肉苁蓉多糖。
其中，本发明所述香菇多糖的制备包括以下步骤：
（1）将新鲜香菇子实体除杂后于60℃条件下烘干至恒重，以24000r/min粉碎1-2min后过40目筛，得香菇粉末；
（2）称取步骤（1）中所得香菇粉末并按30-45:1的液料比加入注射用水，混合均匀，在800-950W功率下微波提取7-10min，抽滤，收集滤液；
（3）重复步骤（2）2-3次，收集滤液；
（4）将步骤（2）和（3）中所得滤液混合，真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即得香菇多糖。
其中，本发明所述pH=7的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：
a．称取下列原料组分：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g和六水氯化镁0.05-0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
本发明中芍药苷购买于百灵威科技有限公司。
本发明的有益效果：
1、本发明所制备的一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液可以提前产生抗体，降低免疫空白期，还能延长疫苗保护期，进而提高猪的免疫效果。
2、本发明所制备的一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液具有易生产、成本低廉、使用方便等特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体说明。本发明中所述实施例仅用于说明解释本发明而不对本发明的范围构成限制。
实施例1:
1、制备肉苁蓉多糖，包括以下步骤：
将肉苁蓉粉末按1：20料液比，加入至0.5%吐温水溶液，在超声功率400W、温度40℃条件下超声处理25min，抽滤，将所得滤液进行真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即可得肉苁蓉多糖。
2、制备香菇多糖，包括以下步骤：
（1）将新鲜香菇子实体除杂后于60℃条件下烘干至恒重，以24000r/min粉碎1-2min后过40目筛，得香菇粉末；
（2）称取步骤（1）中所得香菇粉末并按30：1的液料比加入注射用水，混合均匀，在800W功率下微波提取7-10min，抽滤，收集滤液；
（3）重复步骤（2）2-3次，收集滤液；
（4）将步骤（2）和（3）中所得滤液混合，真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即得香菇多糖。
3、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠6g、氯化钾0.05g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾0.05g、氯化钙0.05g和六水氯化镁0.05g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
4、制备稀释液
A．称取原料组分：肉苁蓉多糖1g、香菇多糖60mg、芍药苷40mg、L-谷氨酸钠0.5g和酚红5mg。
B．将步骤A中所称取的中药多糖组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，过滤除菌，即得猪伪狂犬活疫苗用稀释液。
实施例2：
1、制备肉苁蓉多糖，包括以下步骤：
将肉苁蓉粉末按1：25料液比，加入至0.5%吐温水溶液，在超声功率500W、温度50℃条件下超声处理30min，抽滤，将所得滤液进行真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即可得肉苁蓉多糖。
2、制备香菇多糖，包括以下步骤：
（1）将新鲜香菇子实体除杂后于60℃条件下烘干至恒重，以24000r/min粉碎1-2min后过40目筛，得香菇粉末；
（2）称取步骤（1）中所得香菇粉末并按38：1的液料比加入注射用水，混合均匀，在880W功率下微波提取7-10min，抽滤，收集滤液；
（3）重复步骤（2）2-3次，收集滤液；
（4）将步骤（2）和（3）中所得滤液混合，真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即得香菇多糖。
3、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠10g、氯化钾0.5g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钙0.2g和六水氯化镁0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
4、制备稀释液
A．称取原料组分：肉苁蓉多糖3g、香菇多糖70mg、芍药苷30mg、L-谷氨酸钠0.75g和酚红7.5mg。
B．将步骤A中所称取的原料组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，过滤除菌，即得猪伪狂犬活疫苗用稀释液。
实施例3：
1、制备肉苁蓉多糖，包括以下步骤：
将肉苁蓉粉末按1： 30料液比，加入至0.5%吐温水溶液，在超声功率600W、温度60℃条件下超声处理40min，抽滤，将所得滤液进行真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即可得肉苁蓉多糖。
2、制备香菇多糖，包括以下步骤：
（1）将新鲜香菇子实体除杂后于60℃条件下烘干至恒重，以24000r/min粉碎1-2min后过40目筛，得香菇粉末；
（2）称取步骤（1）中所得香菇粉末并按45：1的液料比加入注射用水，混合均匀，在950W功率下微波提取7-10min，抽滤，收集滤液；
（3）重复步骤（2）2-3次，收集滤液；
（4）将步骤（2）和（3）中所得滤液混合，真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即得香菇多糖。
3、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠8g、氯化钾0.35g、磷酸氢二钠1.1g、磷酸二氢钾0.25g、氯化钙0.12g和六水氯化镁0.15g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
4、制备稀释液
A．称取原料组分：肉苁蓉多糖5g、香菇多糖80mg、芍药苷20mg、L-谷氨酸钠1g和酚红10mg。
B．将步骤A中所称取的原料组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，过滤除菌，即得猪伪狂犬活疫苗用稀释液。
日龄断奶仔猪免疫试验：
将本发明实施例1所制备的猪伪狂犬活疫苗用稀释液稀释至1头份/ml，备用。将30头检测结果为伪狂犬抗体、抗原双阴性的28日龄健康断奶仔猪分为三组，每组10头，A1组注射实施例1制得的稀释液稀释后的猪伪狂犬活疫苗1.0ml/头；B1组注射用pH=7的磷酸盐缓冲液稀释后的猪伪狂犬活疫苗1.0ml/头；C1组作为空白对照组，注射pH=7的磷酸盐缓冲液1.0ml/头。各组均在首免第14 d 、21d、28d、35 d、45d、60d、90d、120d、180d 采血并分离血清，采用IDEXX猪伪狂犬抗体检测试剂盒检测各组的gB IgG抗体，测定结果如表1所示。
表1. 28日龄育肥猪免疫试验结果
70日龄断奶仔猪免疫试验：
将本发明实施例2所制备的猪伪狂犬活疫苗用稀释液稀释至1头份/ml，备用。将30头检测结果为伪狂犬抗体、抗原双阴性的70日龄健康断奶仔猪分为三组，每组10头，A2组注射实施例2制得的稀释液稀释后的猪伪狂犬活疫苗1.0ml/头；B2组注射用pH=7的磷酸盐缓冲液稀释后的猪伪狂犬活疫苗1.0ml/头；C2组作为空白对照组，注射pH=7的磷酸盐缓冲液1.0ml/头。各组均在首免第7d、14d、21d、42d、63d、84d采血并分离血清，采用IDEXX猪伪狂犬抗体检测试剂盒检测各组的gB IgG抗体，测定结果如表2所示。
表2. 70日龄育肥猪免疫试验结果
由此可以看出，本发明所制备的猪伪狂犬活疫苗用稀释液可有效提高机体免疫力，提前产生抗体降低免疫空白期，延长疫苗保护期，从而有效提高伪狂犬活疫苗的免疫效果。
需说明的是，本发明中所用芍药苷购买于百灵威科技有限公司，L-谷氨酸钠购买于南京化学试剂股份有限公司，酚红购买于上海恒远生物科技有限公司，本发明中未提及的具体实验方法，按常规实验方法进行。

Claims (6)

1.一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液，其特征在于每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：肉苁蓉多糖1-5g、香菇多糖60-80mg、芍药苷20-40mg、L-谷氨酸钠0.5-1g和酚红5-10mg。
2.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液，其特征在于每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：肉苁蓉多糖2-4g、香菇多糖65-75mg、芍药苷25-35mg、L-谷氨酸钠0.6-8g和酚红6-8mg。
3.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液，其特征在于每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：肉苁蓉多糖3g、香菇多糖70mg、芍药苷30mg、L-谷氨酸钠0.75g和酚红7.5mg。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液，其特征在于所述肉苁蓉多糖的制备包括以下步骤：将肉苁蓉粉末按1：20-30料液比，加入至0.5%吐温水溶液，在超声功率400-600W、温度40-60℃条件下超声处理25-40min，抽滤，将所得滤液进行真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即可得肉苁蓉多糖。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液，其特征在于所述香菇多糖的制备包括以下步骤：
（1）将新鲜香菇子实体除杂后于60℃条件下烘干至恒重，以24000r/min粉碎1-2min后过40目筛，得香菇粉末；
（2）称取步骤（1）中所得香菇粉末并按30-45：1的液料比加入注射用水，混合均匀，在800-950W功率下微波提取7-10min，抽滤，收集滤液；
（3）重复步骤（2）2-3次，收集滤液；
（4）将步骤（2）和（3）中所得滤液混合，真空浓缩，经乙醇沉淀法处理后即得香菇多糖。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种猪伪狂犬活疫苗用稀释液，其特征在于所述pH=7的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：
a．称取下列原料组分：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g和六水氯化镁0.05-0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
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