CN1209837A - 用于轮状病毒感染的轮状病毒属抗原、疫苗和诊断试剂以及用于产生抗原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于产生轮状病毒抗原(这种抗原很难大量培养)的方法,这种方法包括从细胞培养物中克隆出高度允许轮状病毒增殖的细胞;通过在产生的克隆细胞株中传代轮状病毒并使轮状病毒适应克隆的细胞株来制备一种适应克隆细胞的病毒毒株;培养适应的轮状病毒毒株或者通过使用适应的轮状病毒毒株作为亲本毒株来制备的重排列毒株作为种子病毒;和从种子病毒的培养基中分离和纯化轮状病毒抗原。本发明还通过使用所说的抗原提供了一种轮状病毒抗原、一种抗轮状病毒感染的疫苗和所说的疾病的诊断试剂。这些抗原、疫苗和诊断试剂对与轮状病毒感染相关的基础研究工作和临床应用的各个领域可以产生很大的作用。
Description
技术领域
本发明涉及轮状病毒抗原(这种抗原很难通过细胞培养大量产生)、用于轮状病毒感染的疫苗、用于诊断疾病的试剂和产生上述物质的方法。更具体地说,本发明涉及一种对轮状病毒感染的预防和诊断有用且使用轮状病毒抗原作为有效成分的疫苗和诊断试剂。特别是本发明对人类轮状病毒感染的预防与诊断有很大贡献。
背景技术
轮状病毒是一种能引起人类、猴子、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、兔、大鼠、鸡、火鸡等腹泻的病原微生物,这种病毒广泛分布于世界各地。在人类中,轮状病毒感染特别引起人们的注意,如婴儿呕吐和腹泻、婴儿冬季腹泻、腹泻且粪便白色、儿童假霍乱等等。世界各地已经非常重视对轮状病毒感染的预防和诊断。
下面将要叙述的内容与轮状病毒相关。形态学特征和基因组结构
按照病毒分类学国际委员会第6次报告,此病毒属于呼吸道肠道病毒科,其为直径大约为70nm的精确二十面体,其包括内壳和外壳的双层壳结构(总共三层,包括中间层),而且没有被膜,而且轮状病毒在内壳的中心有一个直径大约为50nm的核。在核的内部有一条染色体组,这条染色体组包含具有11个片段的线性双链RNA,并且这些染色体组片段的长度在0.6-3.3kbp之间(“病毒分类学:病毒分类学国际委员会第6次报告”,病毒学档案,增刊10,pp.219-222,1995)。基因型和血清型
从产生疫苗和诊断试剂的角度来看,在上述的11个染色体组片段中,人们特别关注第四条染色体组片段和第九条染色体组片段(相当于一些毒株的第七条或第八条染色体组片段)。在世界范围内,分离的轮状病毒毒株已经分为A-F6个组(血清组),每个组分成各种血清型;另外,为了方便,按照基因型将轮状病毒毒株概括性地分组。这些分离的毒株具有各种各样的抗原性和基因型("病毒学领域",第3版,vol.12,pp.1625-1629,B.N.Fields等编辑,tippincott-Raven出版社,1996,美国)。下面描述的是关于以上所提到的这些方面。
第四条染色体组片段编码暴露在病毒粒子表面刺突中的结构蛋白VP4,据报道或推测VP4在功能上可能与血细胞凝集素、中和抗原、蛋白酶促进的传染性、致病性、膜融合、细胞的吸附等有关。在VP4的氨基酸序列以及基因的RNA或cDNA同源性的基础上,目前将轮状病毒毒株分成20种基因型("在下文称作“P基因型”);在中和试验的基础上,将轮状病毒毒株也分成10或14个血清型(下文称为“血清型P”)。
第九条染色体组片段(在一些毒株中为第七条或第八条染色体组片段)编码病毒粒子的外壳VP7,据报道或推测VP7在功能上可能保持中和抗原的表位和两个疏水区。在VP7的中和试验基础上,将轮状病毒毒株分为14个血清型(下文称作“血清型G”)。轮状病毒毒株的分类
在目前报道("病毒学领域",第3版,vol.2,p.1627)的许多各种分离的毒株中,将A组的典型人轮状病毒毒株和由本发明人分离并报道的菌株(即AU-1(临床微生物学杂志,25,1159-1164,1987)、AU32(微生物学和免疫学,34,77-82,1990)和AU64(病毒学档案,19,67-81,1991))概括性地分为表1所示的几类。
表1毒株名称 血清型G和P[基因型]Wa G1P1A[8]DS-1 G2P1B[4]P G3P1A[8]AU-1 G3P3[9]Hochi G4P1A[8]ST3 G4P2A[6] AU32 G9P1A[8]AU64 G1P1B[4]血清型的检测频率
按照世界范围的大约20个关于轮状病毒的血清型G的检测频率研究报告,G1型是主要的,在日本、欧洲国家、澳大利亚和中非等国中占大约60-85%,而余下的主要是G2型和G3型。另外,在印度、泰国、孟加拉国、墨西哥等国发现G1、G2、G3和G4有零星分布,它们占总量的比例大约为20-80%,同时,也明显地观察到零星存在这些病毒以外的其它类型。病毒培养
因为从猴子和牛中分离的轮状病毒一般生长在相对容易得到的培养细胞中,所以这种轮状病毒的培养和传代不是特别的困难。然而,通过细胞培养进行人轮状病毒传代的过程中会发生所谓的失败的感染,其特征包括产生了用于获得感染性的病毒粒子的不可能连续传代的病毒抗原。因此,病毒传代是非常困难的。因而设计了一种方法,这种方法包括制备介于具有低生长潜力的人轮状病毒和具有高生长潜力的来源于猴子或牛的轮状病毒之间的重排列病毒,以改进人轮状病毒的生长潜力;或者这种方法包括把用胰蛋白酶预先处理的人轮状病毒接种到猴子的细胞株MA104(ECACC 85102918)和AGMK(非洲绿猴肾)细胞中,其后将轮状病毒注射到滚管培养物中,所说的培养物使用了保持培养基(添加了胰蛋白酶,并进行了混合)。目前,几乎所有的A组的人轮状病毒都可以直接培养或者从实验室中分离出来。然而,即使是通过上述滚管培养,也不能回收能够引起产生疫苗或者诊断试剂量的病毒抗原。而且,就目前来说,培养或传代除了A组病毒之外的轮状病毒还是非常困难的。病毒培养的宿主
为了培养能使轮状病毒增殖的细胞,已知的有下列各种不同于MA104和GMK细胞的单个细胞株:FBK(胎牛肾)、CMK(猕猴肾)、MK(食蟹短尾猴肾)等的单个细胞;来源于猴子的CV-1、FRh L2、BSC-1和Vero细胞的单个细胞株;来源于狗的MDCK和来源于人小肠表皮的CaCO-2等(WO92/01784,日本公开专利06-328107、“病毒学领域”,第三版,vol.2,pp.1647-1648,pp.1661-1162)。为了大量生产轮状病毒抗原以便产生疫苗,可以使用下列细胞株以产生其它的病毒疫苗,例如Vero、DBS-FLC-1、DBS-FLC-2、DBS-FRh L2、ESK-4、HEL、IMR-90、MRC-5、MRC-9、WI-38和WRL68(“在保护时间范围内的ATCC微生物和细胞”,第二版,p.144,美国典型培养物保藏中心1991,美国)疫苗
大约从1985年开始,人们就试图产生抗人轮状病毒感染的疫苗。其主流在于通过所谓的Jennerian方法产生活体疫苗,其中使用了具有相似抗原性的非人类来源的减毒疫苗(如天花疫苗)用作替代疫苗;例如,已知通过使用来源于牛或猴的减毒疫苗或者介于两种病毒毒株(每种来源于人和牛、人和猴)的减毒重排列病毒进行活体疫苗临床实验(WO92/01784;EPO130906;日本专利公开06-328107;“现代疫苗学”,pp.213-229,E.Kurstak编辑,Plenum医药图书公司1994,美国;"疫苗",第二版,pp.809-822,S.A.Plotolokin和E.A.Mortimer编辑,W.B.Saundors公司1994,美国;“约旦报告-加速开发的1996年疫苗”,p.46和p.68,美国国家健康研究所,美国)。已经积累了这些活体疫苗的临床试验或它的口服剂量的数据,然而,人们还注意到它的预防效果是不令人满意的。因此,目前人们努力通过与Jennerian方法不同的方法来产生疫苗。诊断试剂
目前主要使用多克隆或者单克隆抗体来检测抗原,例如,可以从市场上买到EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、乳汁凝集和无源血细胞凝集的试剂盒。现在PAGE-SS(使用银染色的聚丙烯酰胺凝胶电泳)、PCR(聚合酶链反应)等作为基因水平的诊断方法(“感染性疾病的原理和实践”,第4版,vol.2,pp.1450-1451,G.L.Mandell等编辑,ChurchillLivingstone1995,美国)。因为在抗体的检测中还没有使用病毒抗原作为诊断试剂,所以在患者中各种抗轮状病毒抗原的抗体随时间变化的相关数据还可能不太充分,尽管这些数据对说明轮状病毒感染和其预防和治疗手段来说是特别有用的。
在这种情况下,本发明得到了上面所述的人轮状病毒。本发明的一个目标是改观目前通过细胞培养大量产生轮状病毒抗原较困难的状态;提供大规模产生轮状病毒抗原(即产生抗轮状病毒感染的疫苗所需的抗原)的方法;以及产生这些疾病的诊断试剂的方法。
本发明的另一个目的是提供通过上述方法回收的抗原,并通过使用这种抗原提供抗轮状病毒感染的疫苗和这种疾病的诊断试剂。
本发明的公开内容
为了解决这些问题,本申请提供了下列的发明。
更具体地说,本发明的第一部分是产生轮状病毒抗原的方法,这种方法包括从细胞培养物中克隆出高度允许轮状病毒增殖的细胞;通过在产生的克隆细胞株中传代轮状病毒和使轮状病毒适应克隆的细胞株来制备一种适应克隆细胞的病毒毒株;培养适应的轮状病毒毒株或者通过使用适应的轮状病毒毒株作为亲本毒株制备的重排列病毒作为种子病毒;和从种子病毒的培养基中分离和纯化轮状病毒抗原。
在本发明第一部分优选的实施方案中,培养细胞是Vero细胞(ATCCCCL81)。
在本发明第一部分的另一个优选的实施方案中,克隆细胞株是VeroCL-9(FERM BP-6028)。
在本发明第一部分的另一个优选的实施方案中,轮状病毒是人轮状病毒株AU32n和/或AU64n。
本发明的第二部分是通过上面提及的方法回收轮状病毒抗原。
本发明的第三部分是通过使用一种灭活剂灭活本发明第二部分的轮状病毒抗原来制备的灭活的抗原。
本发明的第四部分是抗轮状病毒感染的疫苗,这种疫苗含有能引起免疫应答量的本发明的第二部分的轮状病毒抗原或者本发明的第三部分的灭活的抗原。
本发明的第五部分是抗轮状病毒感染的组合多价疫苗,这种疫苗含有能引起免疫应答量的两种或多种抗原,其中所说的抗原是本发明的第二部分的轮状病毒抗原或者本发明的第三部分的灭活的抗原,并且这些抗原的血清型或者基因型互不相同。
本发明的第六部分是一种诊断试剂,这种试剂中含有能引起抗原-抗体反应量的第二部分的轮状病毒抗原或者第三部分的灭活的抗原。
本发明的第七部分是克隆的细胞株Vero C1-9(FERM BP-6028 )。
本发明的第八部分是适应克隆细胞的人轮状病毒毒株AU32n。
本发明的第九部分是适应克隆细胞的人轮状病毒毒株AU64n。
在本申请中,术语“克隆的细胞株”是指由单细胞(种类)的子代单独组成的克隆的培养细胞。
术语“适应”是指促进突变或选择病毒增殖能力以适应增殖力,使之在病毒培养时,可以在细胞类型和温度不变的条件下大量产生病毒。例如,适应了某种细胞的病毒可以在细胞中很好地增殖,适应了低温的病毒在低温下可能很好地增殖。
术语“允许”是指细胞允许病毒增殖的“允许”属性。例如,术语“允许轮状病毒细胞”是指轮状病毒在所说的细胞中增殖或可以在细胞中培养轮状病毒。
术语“适应克隆细胞的病毒毒株”是指通过病毒在克隆细胞株中的连续传代适应了克隆细胞株的病毒。
在下面的描述中,将以实施本发明最好的方式详尽地说明其它术语。实施本发明的最佳方式
通过进行下面的第一至第四步,可以实现本申请的每个发明。
第一步:通过细胞培养克隆高度允许轮状病毒增殖的细胞,即高度允许的细胞。
第二步:在克隆细胞株中进行病毒连续的传代的条件下,制备适应于上述的步骤中回收的克隆细胞株的适应克隆细胞的轮状病毒毒株,也就是说在克隆细胞株中具有特别高的活性或能够高度增殖的适应的轮状病毒毒株。如果需要,使用适应的轮状病毒毒株作为亲本毒株制备重排列病毒。在第一步中使用的轮状病毒不必与在第二步中培养的轮状病毒相同。
第三步:通过培养在前面步骤中得到的适应毒株或重排列病毒作为子病毒,大量产生轮状病毒抗原,即完全的轮状病毒粒子、不完全轮状病毒粒子、抗原蛋白质、基因组、基因等。
第四步:通过纯化、加工、或修饰前面步骤中得到的完全的轮状病毒粒子、不完全轮状病毒粒子、抗原蛋白质、基因组、基因等制备和产生疫苗、诊断试剂以及试剂等。
下面依次描述了这些过程。在第一步使用的培养细胞
使用在前面的背景技术部分“病毒培养宿主”所述的各种细胞或者细胞株作为用于克隆高度允许轮状病毒增殖的细胞的目标培养细胞。然后,使用缺少反向污染因子或癌基因的培养细胞,例如,优选地使用Vero细胞(ATCC CCL81)。用于第二步的轮状病毒
使用在参考文献(“病毒学领域”,第三版,vol.2,p.1627,病毒学档案,19,67-81,1991,等)中描述的分离毒株或合适的轮状病毒毒株作为传代到并适应上述步骤中回收的克隆细胞株的轮状病毒。特别优选的是在细胞培养期间很难传代的毒株或希望增加抗原的产生的毒株。例如,已知毒株AU-1、AU32、AU64和在产生疫苗中作为病毒毒株并且具有合适的传代史的新型人轮状病毒毒株(例如本发明提供的AU32n和AU64n)是优选的。细胞培养基和用于病毒生长的培养基
可以使用已知的和市售的培养基,例如199培养基、MEM(Eagle的基本必需培养基)、BME(Eagle的基础培养基)、Hanks溶液和Dulbecco磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)。在一般的有关病毒实验、细胞培养、组织培养的文章(例如“细胞和组织培养;实验室方法”,共二卷,Doyle等编辑,JohnWiley和Sons1993,美国)和产品目录中详细描述了这些培养基的组成和制备方法。可以将辅助试剂或添加剂加入到这些培养基或盐溶液中。可以使用常规的物质作为添加剂;例如,可以从市售人血清、胎牛血清、抗体、碳酸氢钠、氯化钠、非必需氨基酸等中选择,并以合适的量加入。例如加入的添加剂的最终浓度(与1升培养基混合)如下:血清大约3-25%(V/V);碳酸氢钠大约1-6g;氯化钠大约为0.1-0.15摩尔;非必需氨基酸的量为产品目录中描述的标准量。已知将蛋白酶或者胰蛋白酶加入并混合到轮状病毒增殖培养基中是优选的。本发明中的用于轮状病毒生长的培养基中,胰蛋白酶最终浓度为大约0.1-10μg/ml。细胞培养和细胞克隆
细胞株的传代一般包括在细胞培养基中制备浓度大约为1×105-4×105细胞/ml的细胞悬浮液;传代大约为培养容器的1/10-1/5体积(例如在100ml容器中大约10-20ml)的悬浮液;然后在大约37℃下培养细胞。一般使用大约最终浓度为0.25%(W/V)的胰蛋白酶溶液(预先在已经除去了Ca和Mg离子的PBS中制备)从培养容器表面区域的底部剥去形成的单层细胞,然后分散细胞。
按照常规方法(上述的“细胞和组织培养;实验室方法”,vol.1,pp.4B:3)克隆细胞。例如通过制备只由单个细胞子代构成的克隆的方法(集落形成方法)可以很好地完成细胞克隆,所说的方法包括在胰蛋白酶溶液中剥去单层的培养细胞,并且将细胞层分散在细胞培养基中以制备游离细胞的悬浮液(大约1-5个细胞/ml),然后将悬浮液接种到培养容器(例如,培养皿或者微量试验平板)中培养。分别培养得到的集落以增加细胞数量,因此得到了克隆细胞或克隆细胞株。病毒培养、传代和适应
在细胞培养的宿主中进行病毒培养的温度一般为大约20-37℃,培养时间为大约2-16天。可以使用静止培养或滚管培养。在培养后将培养的上清液进行病毒传代以得到病毒悬浮液。通过依次在新鲜培养细胞中接种病毒悬浮液以使病毒增殖。通过在特异性的细胞中重复进行病毒的传代,大约2-50次,优选的为3-20次,这样就得到了在细胞中高度增殖的适应特异性细胞的病毒毒株。通过制备介于适应的病毒毒株(作为亲本毒株)和另一种病毒毒株之间的重排列病毒,可以将适应的病毒的高增殖力转移到不同的病毒毒株中。将用紫外线(UV)辐射灭活的轮状病毒毒株和适应的病毒毒株混合并培养混合物,由此诱导两种毒株的病毒染色体组片段重新组配;用抗亲本毒株中和抗体除去亲本毒株病毒,就得到了作为重排列病毒余下的感染病毒。轮状病毒的高度允许克隆细胞株的选择
通过在每一种克隆细胞中接种和培养轮状病毒,测定了通过病毒增殖产生的感染性病毒和病毒粒子的数量或病毒抗原的水平。此时,由于在MOI(感染复数)方面的差异,通过下面的方法测定增殖的程度(即所谓的病毒产生水平、高或低,其取决于病毒的接种水平的差异)是重要的。通过使用测量值作为标志筛选使得病毒能够高度增殖的细胞,可以产生高度允许的克隆细胞株。通过噬斑形成方法(计数PFU(噬斑形成单位))、病灶形成方法(计数FFU(病灶形成单位))、ELISA、IME(免疫电子显微术)等方法进行测量。在本发明中,通过荧光抗体技术进行FFU计数,这种技术包括通过EIA(酶免疫测定)等用荧光染料FITC(异硫氰酸荧光素)标记的抗体对由于病毒感染和增殖而形成的感染细胞区域进行染色。病毒和抗原的大量产生和制备
通过使用高度允许克隆细胞株的细胞培养物作为宿主细胞和培养适应细胞株的病毒毒株,大规模生产病毒和抗原。更具体地说,在培养结束后在低速离心后收集病毒培养液上清液(例如,在干冰及有机溶液中冷冻和解冻的病毒感染细胞悬浮液的上清液)以制备完全病毒粒子和抗原。这种制剂可以作为病毒悬浮液使用。所说的悬浮液可以通过膜过滤消毒,或也可以将抗体加入到悬浮液中。可以通过膜浓缩、密度梯度超速离心、在蔗糖垫层上的超速离心等将悬浮液中的病毒抗原等浓缩和纯化。将病毒悬浮液放置到蔗糖溶液(作为垫层)上,例如,其后进行超速离心并在离心管底部沉淀出病毒抗原,将沉淀物再一次悬浮以制备纯化的病毒抗原。疫苗批量溶液的制备
可以通过使用病毒悬浮液或纯化的病毒抗原制备疫苗的批量溶液。可以使用病毒悬浮液中的完全病毒粒子、不完全病毒粒子、毒粒结构蛋白(例如VP4和VP7)、中和反应表位、翻译后修饰的结构蛋白等以及非毒粒结构蛋白和翻译后修饰蛋白、抗感染的保护性抗原等作为疫苗的抗原。可以使用灭活剂固定这种疫苗的抗原,以便稳定立体结构。例如,可以使用福尔马林、苯酚、戊二醛、β-丙醇酸内酯等灭活剂,将灭活剂在制备溶液之前或之后加入疫苗的批量溶液中。如果使用福尔马林,福尔马林加入的量大约为0.005-0.5%(V/V),灭活的温度大约为2-38℃,灭活时间为大约5-180天。然而,当通过这种灭活作用破坏抗原性时,需要用仪器测量改变灭活条件,例如包括减少灭活剂的量、加入中性氨基酸或碱性氨基酸以及降低灭活温度等。可以通过加入等量的亚硫酸氢钠中和或者通过透析除去在灭活过程中剩余的游离甲醛。将这样产生的制剂作为疫苗批量溶液进行下列的过程。疫苗的制备
例如在培养基BME中,将疫苗批量溶液稀释以将其抗原水平调节为产生抗体所需水平。
然后,可以加入增强疫苗耐热性的稳定剂或作为辅助剂来增加免疫原性的佐剂,使之与批量溶液混合。例如,可以使用糖和氨基酸作为稳定剂;矿物油、植物油、明矾、磷酸铝、皂土、硅石、胞壁酰二肽衍生物、胸腺素、白细胞介素等作为辅助剂。
为了诱导粘膜的免疫性或局部的免疫性,可以处理或修饰疫苗批量溶液中的病毒抗原。为了诱导,可使用与DDS(药物转移系统)相关的技术,在此技术中使用例如脂质体、乳剂、中心体、微胶囊、聚乳酸、聚乙醇酸。
然后,将疫苗溶液分装到小药瓶中,例如瓶的体积大约1-20ml,接下来塞住和密封,得到的疫苗溶液就可以使用了。这种疫苗不仅可以以液体形式使用,而且在分装后可以通过冷冻干燥溶液制成干燥制剂。为了便于口服施用,可以将疫苗溶液加工成,例如糖浆或糖果形式。
关于使用前的质量保证问题,即在疫苗的加工过程中和在把溶液分成小部分的分装时,要检验制备的疫苗制剂的安全性和有效性以验证这种溶液是否适合作为疫苗。可以按照和本发明轮状病毒疫苗相似的制剂标准进行检验,例如按照药物法(第145条,1960)和1960年健康和福利部的315号通告和1961年健康和福利部的337号通告(修订版)的"生物制剂标准"中定义的“灭活的急性多脊髓炎疫苗标准”规则;按照上述药物法和1993年健康和福利部的217号通告的"生物制剂标准"中定义的“日本B脑炎疫苗”和“干燥的日本B脑炎疫苗”规则;或者按照上述药物法和1994年健康和福利部的332号通告中的"生物制剂标准"中规定的“干燥组织培养灭活A型肝炎疫苗”规则等。疫苗的剂量
例如,以大约0.25-0.5ml的剂量皮下接种疫苗,口服施用的剂量为每次0.1ml;或通过以大约0.05ml的剂量进行口腔注射。而且,这样的接种最好以2-4周的间隔进行1-3次。然而,疫苗的剂量并不限于上述的例子。诊断试剂的制备
以与上述相同的方式制备病毒悬浮液或纯化的抗原,这种抗原就可以作为诊断抗原(例如沉淀反应、凝集反应、中和反应、荧光抗体技术、酶免疫测定、放射免疫测定等的抗原)。通过动物(如兔、豚鼠、小鼠等)腹膜、皮下、肌内接种诊断抗原疫苗批量溶液,可是从动物的血清中制备抗体。通过上述的各种诊断方法提供用于抗原测定的抗体。在使用前把按照本发明的诊断抗原和抗体稀释、将其调整到能够诱导抗原-抗体反应的量。而且,按照本发明的轮状病毒的基因组和它的cDNA片段可以作为,例如基因诊断的探针试剂和鉴定试剂。
在下面的实施例中将更详细地描述本发明,但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1(1)细胞克隆
在37℃下将Vero细胞(ATCC CCL81)培养在添加了FCS(由美国Gibco公司生产)(最终浓度为9%(V/V))的细胞培养基中以形成单层细胞,培养容器的培养面积为25cm2。用0.25%(W/V)胰蛋白酶(胰蛋白酶1∶250,美国Gibco公司生产)溶液从培养容器的培养区域剥去单层细胞,将细胞分散以将细胞制成游离的单细胞,此后通过低速离心(1500rpm,5分钟)收集细胞,以便在培养基中制备2个细胞/ml的游离单细胞悬浮液。将悬浮液以每孔0.2ml的量接种在96-孔微量检验平板上(Falcon,微量检验Ⅲ平板,美国Becton Dickinson公司),然后在37℃下在CO2培养箱中培养14天,以便在每个孔的表面形成只由单细胞的子代构成的集落。在一个大的容器中依次将每个集落的细胞传代三次,由此使细胞数量增加,最后得到了每个Vero细胞集落总共40个细胞的悬浮液。(2)轮状病毒允许克隆细胞株的筛选
将在(1)的每个克隆细胞中得到的轮状病毒培养并增殖以便通过ELISA测定培养物上清液中的轮状病毒抗原,然后按照下面描述的a)-c)步骤筛选具有远远高于克隆前的Vero细胞的抗原滴度的克隆细胞株。
a)在每一个克隆细胞中培养病毒
将每个克隆细胞加入到一个微量检验平板(96孔;横向8个孔×纵向12个孔)的横向8个孔中,然后将每个菌落的总共40个细胞的悬浮液分别以0.2ml/孔的量接种,并在37℃培养以形成每个克隆的单层细胞。此后,将每个孔中的培养液转移到没有加血清的新鲜MEM中并进一步培养过夜。37℃下在下面描述的病毒生长的培养基(假如胰蛋白酶的终浓度为20μg/ml)中用胰蛋白酶灭活轮状病毒AU64毒株液体20分钟,并加入到每个孔的细胞培养液中,每个孔加入0.05ml,然后在37℃下保持30分钟以便细胞能吸附病毒。此后,将添加胰蛋白酶(最终浓度为0.5μg/ml)的MEM作为病毒生长的培养基以每孔0.2ml的量加入到每个孔中,并在37℃下将病毒培养增殖7天。在培养结束后,将每个孔中的培养液作为病毒悬浮液(样品)用于下面的病毒抗原分析测定。在本文中,把克隆前的Vero细胞作为对照。
b)病毒抗原的测定(初步筛选)
将A组中的抗轮状病毒抗体(从豚鼠的超免疫的血清纯化的IgG)在50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释,以便制备浓度为1.0μg/ml的抗体溶液。将抗体溶液以0.1ml/孔的量加入到用于ELISA的96孔检验平板(ELISA-平板,德国Greiner公司生产)中,然后将平板在4℃下放置过夜以吸附孔表面的抗体。在吸附之后,将每个孔用冲洗溶液[最终浓度为0.05%(W/V)含有Tween20的PBS]冲洗。同时,将上述每种病毒悬浮液在抗体稀释溶液[在去离子水中把Block Ace(由Snow Brand牛奶工业有限公司生产)稀释10倍]中稀释5倍,将得到的每份制备样品以0.1ml的量加入到每个孔中,并在25℃下进行初步反应90分钟。在用前面提到的冲洗液冲洗每个孔之后,在抗原稀释液中将标记的过氧化物酶抗轮状病毒山羊抗体(由美国Viro Stat公司生产)稀释2000倍,将生成的抗体溶液以0.1ml/孔的量加入到孔中以进行第二次反应(25℃,90分钟)。此后,用冲洗液冲洗每个孔,然后以0.1ml/孔的量加入底物溶液[含有终浓度为0.4mg/ml的邻-苯二胺(Wako Pure化学工业公司生产)和含水的35%(V/V)的过氧化氢溶液(Wako Pure化学工业公司生产)的0.5M柠檬酸-磷酸缓冲液(pH5.0)],并在室温下进行10分钟的生色反应,接下来在每个孔中加入0.05ml的4N硫酸以终止反应。在反应停止后,在波长为490nm的单色射线下测量每个孔的吸收率(OD)。作为上述初步筛选的结果,选择了比对照高5倍或更多倍OD的6份样品,并将相应的克隆细胞株进行下面的第二次筛选。c)病毒抗原的测定(第二次筛选)
以上面描述(1)相同的方式将6个克隆株培养在微量检验平板中,同时,在每个孔的细胞中将AU64毒株培养并繁殖。另外,为了观察由于MOI不同而引起的生长方面的差异,将病毒悬浮液连续稀释4倍,将每个系列的样品装入到纵向的一行和在横向的行的2个孔中。另外,使用与初步筛选中相同的方式通过ELISA测定病毒抗原。最后可以得到三种高度允许轮状病毒增殖的高度允许克隆细胞株,将这些株分别命名为Vero CL-9(FERM BP-6028)、Vero CL-16和Vero CL-81-7。
实施例2:轮状病毒的适应
37℃下在细胞培养基MEM[添加了终浓度为9%(v/v)的FCS(美国Gibco公司生产)]中将在实施例1中得到的单个克隆细胞株,即Vero CL-9、Vero CL-16和Vero CL-81-7以及克隆前的Vero细胞对照一起培养,以便形成单个细胞的单层细胞。每个细胞株使用了2个组织培养试管作为培养容器。在单层细胞形成后,将每个容器的培养基换成没有添加血清的新鲜培养基以便进一步培养过夜。然后,把AU64毒株的病毒悬浮液(0.2ml)接种到每个容器的细胞中,然后在37℃静置60分钟以使病毒吸附到细胞上,接下来弃去接种溶液。此后,以每个容器1ml的量将作为病毒增殖培养基的MEM[添加了终浓度为0.5μg/ml的Ⅸ型胰蛋白酶(美国Sigma公司生产)]加入到滚管中,并在37℃下培养7天。在培养结束后,收集培养液并作为病毒悬浮液在-80℃保存。通过使用每一种这些病毒悬浮液重复进行上述培养,将病毒传代7代。按照荧光抗体技术(FA)和酶抗体技术(EIA)测定每一代病毒悬浮液的感染滴度(FFU)。
将每一个克隆细胞株和对照细胞以上述的相同的方式在chamberslide(美国Nunc公司生产)中培养后,加入每一代的连续稀释10倍的病毒悬浮液,并在37℃培养2天以固定单个细胞,其后通过直接FA和EIA计算FFU。通过PBS和去离子水轻轻冲洗细胞,然后在添加了终浓度为10%(v/v)甲醇的丙酮中在室温下浸渍5分钟,从而把细胞固定。
通过使用抗人轮状病毒豚鼠超免疫血清进行初步反应,标记的FITC山羊IgG(美国Cappel公司生产)用于第二步反应来进行FA。
同时,通过使用抗A组的轮状病毒的豚鼠超免疫血清初步反应,标记的过氧化物酶抗豚鼠IgG山羊血清(美国Cappel公司生产)用于第二步反应来进行EIA;使用底物溶液[终浓度为1mg/ml的4-氯-1-萘酚(美国Bio-Rad公司生产)、20%(v/v)甲醇和含有1/1000体积35%(v/v)含水的过氧化氢的Tris-HCl缓冲液]进行生色反应。
上述的FFU测定结果列于表2中。以一种平稳的方式提高了轮状病毒对实施例1中得到的每种高度允许增殖的克隆细胞株的适应,将具有6.5或更多对数体积(FFU/ml单位)的感染病毒的传代病毒作为适应Vero细胞的病毒毒株储存在-80℃下。
图2
克隆细胞株 对照病毒传代数 Vero CL-9 Vero CL-16 Vero L81-7 Vero CCL81
1 5.3 4.8 5.1 2.7
2 5.8 5.3 5.5 2.7
3 6.0 5.4 5.7 2.8
4 6.7 6.0 6.2 -
5 6.9 6.1 6.4 -
6 7.2 6.2 6.6 -
7 7.3 6.5 6.8 -表中的数字:对数值(FFU/ml)。-:未实验Vero CCL81:克隆前的Vero细胞(ATCC CCL81)
实施例3(1)新型人轮状病毒毒株AU64n的分离
以与实施例1中相同的方式,在培养试管中培养AGMK(非洲绿猴肾)细胞以形成单层细胞,此后,在下面描述的病毒分离材料接种的前一天,将培养基换成不含血清的新鲜MEM。
另一方面,按照如下方式制备病毒分离材料。把从感染轮状病毒的婴儿中得到的腹泻排泄物(0.1g)悬浮在0.9ml的MEM中,在生成的悬浮液中加入上述的Ⅸ型胰蛋白酶并混合,使其最终浓度为10μg/ml,将所得到的溶液在37℃保温20分钟。此后,使用微型高速离心机在10,000rpm下将悬浮液离心30秒,收集所得的上清液,并用MEM稀释10倍,然后将稀释液通过直径为0.22μm的过滤器消毒。用病毒增殖培养基(添加了Ⅸ型胰蛋白酶(最终浓度为0.5μg/ml)的MEM)将滤液连续稀释10倍,生成的溶液被定义为病毒分离材料。
在弃去用于AGMK细胞的培养基之后,将上述的1ml每种病毒分离材料加入到每个试管的细胞中。将试管在37℃保温1小时以将分离材料中的病毒吸附到细胞上,然后弃去接种溶液。在病毒增殖培养基(1ml/试管)中将细胞冲洗一次。在弃去冲洗液后,将新鲜病毒增殖培养基(1ml/试管)加入到单个的细胞中,以进行滚管培养。通过使用培养期间观察到的CPE冷冻和解冻细胞和培养液,制备样品。通过ELISA(实施例1),测定每个样品中的轮状病毒抗原,然后,回收抗原阳性的样品。将经低速离心的样品的上清液作为初始病毒以用于下面的传代。(2)新型人轮状病毒毒株的传代
将Ⅸ型胰蛋白酶加入到初始病毒溶液中并混合,并在37℃温育90分钟(下文称为“病毒激活”),用与上述(1)中相同的方式用MEM将生成的溶液稀释10倍,把稀释液接种并培养在下面描述的新鲜细胞中,以用于病毒的连续传代。结果,人轮状病毒毒株包括在AGMK细胞中传代5代,之后在Vero细胞(ATCC CCL81)中传代5代和另外在Vero CL-9细胞(FERM BP-6028)中传代2代(按照规定描述传代史,例如下面的“AGMK/5,Vero CCL81/5,Vero CL-9/2”)。
按照血清型和病毒基因组RNA的分析方法,通过本发明人在报告(微生物学和免疫学,38(4),p.317-320,1994)中描述的电泳模型分析新近分离的人轮状病毒毒株的血清型和基因型。分析表明血清型和基因型为G1P1B[4]。由于血清型和基因型与AU64毒株相同,按照表1所示的分类,将新型人轮状病毒毒株命名为AU64n。(3)AU64n毒株病毒对“AGMK/5,Vero CCL81/5和Vero CL-9/2”的适应
通过如下的噬斑克隆进行适应。在CO2培养箱中在6孔Falcon平板(由美国Becton Diclinson公司生产)上培养Vero CL-9细胞,一直到形成单层细胞为止。然后,用不含血清的MEM代替原来的培养基再进行培养过夜。此后,将上述用胰蛋白酶激活的AU64n毒株病毒用病毒增殖培养基稀释10倍,将生成的溶液以1ml/孔的量接种到细胞中。在37℃下使混合物保温1小时使病毒吸附到细胞上之后,弃去接种溶液。然后,将添加了琼脂糖ME(终浓度为0.7(W/V))和0.5μg/mlⅨ型胰蛋白酶的琼脂培养基[199培养基(FMOBIO产品公司生产)]以2ml/孔的量加入到孔中,在琼脂凝固后,将平板朝下继续培养。在病毒接种的第4天和第7天后,分别重新加入琼脂培养基继续培养,另外,在第11天,加入添加了终浓度为0.003%(W/V)中性红(Wako Pure化学工业公司生产)的琼脂培养基并继续培养以形成经细胞染色的噬斑。在第12天,收集(克隆)具有较大直径的分离的单个噬斑。通过与(2)中所述病毒传代方法相同的方式将噬斑悬浮在MEM中,在VeroCL-9细胞中把病毒增殖1次,此后克隆另一个噬斑。在共进行3次克隆和病毒增殖过程后,另外,在Vero CL-9细胞中进行2代的传代,接着进行4次噬斑克隆和增殖,并将生成的AU64毒株病毒在Vero CL-9细胞中进一步传代一次,以便制备人轮状病毒AU64毒株的原始种子病毒(传代史为“AGMK/5,Vero CCL81/5,Vero CL-9/12”)。使用与实施例2描述的相同的方式测定每一个传代水平的感染滴度对数值(FFU/ml)。滴度值如下(按传代顺序):
2.5,3.7,4.6,5.4,5.8(在AGMK中传代5代);
2.8,3.5,3.6,4.0,4.4(在Vero CCL81中传代5代);
5.9,6.4,6.8,7.0,7.1,7.1,7.1,7.2,7.2,7.2,7.2,7.2,(在Vero CL-9中传代12代)。
实施例4(1)AU64n毒株病毒的大量培养
一次使用10个滚瓶大量培养病毒,将此过程重复8次。具体地说,在使用滚瓶(使用Falcon滚瓶(由美国Becton Diclinson公司生产,产品号为3027)培养后,将Vero CL-9细胞培养基换成不含血清的MEM进一步进行培养过夜,然后弃去培养基。在每瓶细胞中以20ml/瓶的量接种实施例3中获得的AU64毒株原始种子病毒。在本发明中,原始种子病毒预先用Ⅸ型胰蛋白酶激活。此后,在37℃下把细胞在滚瓶中培养1小时以将病毒吸附到细胞上,并弃去接种溶液,接下来以80ml/瓶的量加入新鲜病毒增殖培养基并在滚瓶中培养2天(37℃)。在停止培养后,将每瓶中的培养物冷冻和解冻,以便制备病毒悬浮液,然后收集此悬浮液。此后,在3000rpm下将病毒悬浮液离心10分钟,从而得到上清液(每次培养800ml),将其作为粗提纯的病毒悬浮液。按照与实施例3中相同的方式测定通过培养8次而得到的每个单独粗提纯的病毒悬浮液的病毒感染滴度值(×106FFU/ml)。结果,生成的对数滴度值(FFU/ml)为4.9,5.5,10.0,7.0,7.5,8.0,4.2和4.0。(2)AU64n毒株病毒的纯化
通过使用粗提纯的病毒悬浮液,共制备4份样品,每份样品1.2升。按照如下的方式纯化每份样品的病毒。将每份样品粗提纯的病毒悬浮液离心(10,000rpm,10分钟),收集生成的上清液,然后进行超速离心(19000rpm,6小时),将沉淀物悬浮在15mM PBS(pH7.5)中,终体积为40ml,是30倍的浓缩溶液。将浓缩溶液离心(10000rpm,10分钟)并收集上清液,然后将上清液置于30%(W/V)的蔗糖垫层上进行超速离心(38000rpm,3小时)。超速离心后,再次将生成的沉淀物悬浮在15mM PBS(pH7.5)中以得到纯化的AU64n菌株病毒。测量了再悬浮的4份样品(每份样品6ml)的病毒感染滴度值;同时,通过酚试剂法测定蛋白质。结果,病毒感染滴度(×106PFU/ml)和[蛋白质水平(mg/ml)]如下:样品#1,3.8[1.36];样品#2,4.8[1.10];样品#3,3.3[0.94];和样品#4,1.3[1.57]。(3)AU64n毒株病毒的灭活
从每份样品(#1-#4)中收集了3ml再悬浮溶液(纯化的AU64n毒株病毒),将其混合,共12ml,并使用15mM PBS(pH7.5)稀释,使其蛋白质含量为100μg/ml蛋白质,然后加入福尔马林,使终浓度为0.1%(V/V),将生成的溶液在4℃下放置2周。然后在5℃下用15mM PBS(pH7.5)渗析30小时。为了检验渗析后的含有灭活的病毒的溶液是否适合作为灭活的轮状病毒批量溶液,进行了许多试验。具体地说,按照“日本B肝炎疫苗”中规定的生物制剂标准规则,进行蛋白质含量检验、颜色检验、无菌检验、灭活检验、和不存在反常毒性的检验,通过使用Vero CL-9细胞进行灭活检验。结果证明含有灭活的病毒的溶液适合作为疫苗的批量溶液。(4)抗轮状病毒感染疫苗的制备
使用15mM PBS(pH7.5)稀释疫苗批量溶液,使蛋白质的含量为50μg/ml,从而制备灭活的AU64n疫苗。同时,从每一种未灭活的4份样品中取出0.5ml并混合,按照与上述相同的方式将混合的再悬浮液(纯化的AU64n毒株病毒)蛋白质含量调整为50μg/ml,将生成的溶液作为粗制的含有AU64n的溶液。(5)灭活的AU64n疫苗致免疫性的测定
以10μg蛋白质/剂量的量将灭活的AU64n疫苗接种到4-5周龄的ddy小鼠(共7只)中,共接种2次,间隔2周,在第2周进行抽血。使用粗制的含有AU64n的溶液和15mM PBS(pH7.5)作为对照;在收集血液前将粗制的含有AU64n的溶液接种到19只小鼠中,然后接种到10只小鼠中。通过使用60%噬斑减少方法测定从AU64n毒株得到的每种血清的中和抗体滴度值。列于表3的结果证明生成的疫苗具有极好的致免疫性。
表3用于免疫的抗原 中和抗体滴度±置信界限灭活的AU64n疫苗 2.20±0.23粗制的含有AU64n的溶液 2.30±0.1215mM PBS,pH7.5 ≤1.60中和抗体滴度:以每个小鼠的普通对数值表示的抗体滴度的几何平均置信界限:在5%水平上显著(6)灭活的AU64n疫苗的免疫效果
通过60%病灶减少方法,对使用抗轮状病毒的灭活的AU64n疫苗(具有不同的基因型和血清型)接种的7只小鼠的血清的中和能力进行了测定。结果如图4所示。结果表明,通过使用AU64n毒株作为有效成分而制备的疫苗不仅能有效地预防AU64n毒株的感染,而且能有效地抵抗毒株Wa(其血清型P和基因型与AU64n毒株不同)以及具有不同的血清型G的DS-1毒株的感染。
表4
攻击的病毒 血清型P和G[基因型] 中和抗体±置信界限
AU64n G1P1B[4] 2.19±0.52
Wa G1P1A[8] 2.43±0.43
DS-1 G2P1B[4] 1.90±0.25中和抗体滴度:以每只小鼠的普通对数值表示的抗体滴度的几何平均置信界限:在5%水平上显著
实施例5:新型人轮状病毒毒株AU32n的回收
通过使用与实施例3中描述的相同方法分离和传代新型的人轮状病毒毒株,并测定感染滴度值和分析血清型与基因型。具体地说,通过使用AGMK细胞,从感染轮状病毒的婴儿的腹泻排泄物中分离人轮状病毒毒株,在同样的细胞中传代2代后,将毒株在Vero CL-9细胞中传代8代[1-3代(噬斑克隆)、第4代(静止培养)、第5代(噬斑克隆)、第6代(静止培养)、第7-8代(滚瓶培养)]以得到适应克隆细胞的人轮状病毒毒株(传代史为AGMK/3、Vero CL-9/8)。人轮状病毒毒株的感染滴度对数值(FFU/ml)为6.0。其血清型[基因型]是G9P1A[8],与AU32毒株的相同。因此,将新型人轮状病毒命名为AU32n。
实施例6:在Vero CL-9中分离轮状病毒
通过使用与实施例3(1)中描述的相同方法分离轮状病毒。但是,使用Vero CL-9细胞代替AGMK细胞进行分离。
工业实用性
本发明提供了与轮状病毒感染相关的疫苗、诊断试剂和试剂,以及它们的生产方法,因此本发明对人类健康、世界范围内的医药行政管理、环境卫生、牛的饲养、基础研究工作和轮状病毒感染的临床实践和应用具有很大的贡献。本发明提供了主要针对于婴儿呕吐和腹泻、白便腹泻、婴儿假霍乱等的强有力的预防手段。因此本发明不仅给世界范围的每个家庭带来了长期的福利,而且也有益于全世界的从事医药和健康事业的工作人员。
Claims (12)
1.用于产生轮状病毒的方法,这种方法包括:
从细胞培养物中克隆出高度允许轮状病毒增殖的细胞;通过在产生的克隆细胞株中传代轮状病毒和使轮状病毒适应克隆的细胞株来制备一种适应克隆细胞的病毒毒株;培养适应的轮状病毒毒株或者通过使用适应的轮状病毒毒株作为亲本毒株来制备的重排列毒株作为种子病毒;和从种子病毒的培养基中分离和纯化轮状病毒抗原。
2.按照权利要求1的方法,其中所说的细胞培养物是Vero细胞(ATCC CCL81)。
3.按照权利要求1或2的方法,其中所说的克隆的细胞株是Vero CL-9(FERM BP-6028)。
4.按照权利要求1-3任一之方法,其中所说的轮状病毒是人轮状病毒毒株AU32n和/或AU64n。
5.通过按照权利要求1-4任一之方法得到的轮状病毒抗原。
6.通过使用灭活剂进一步灭活权利要求5的轮状病毒抗原而制备的灭活的抗原。
7.一种用于轮状病毒感染的疫苗,这种疫苗包含能引起免疫应答量的权利要求5的轮状病毒抗原或者灭活的权利要求6的抗原。
8.一种用于轮状病毒感染的组合的多价疫苗,这种疫苗包含能够引起免疫应答量的两种或多种抗原,其中所说的抗原是权利要求5的轮状病毒抗原或者灭活的权利要求6的抗原,这种抗原的血清型或者基因型各不相同。
9.一种诊断试剂,这种诊断试剂包含能引起抗原-抗体反应量的权利要求5的轮状病毒抗原或者灭活的权利要求6的抗原。
10.克隆的细胞株Vero C1-9(FERM BP-6028)。
11.适应克隆细胞的人的轮状病毒菌株AU32n。
12.适应克隆细胞的人的轮状病毒菌株AU64n。
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