CN109562159B - 无缓冲剂的、酸稳定的、低剂量体积的轮状病毒疫苗 - Google Patents

无缓冲剂的、酸稳定的、低剂量体积的轮状病毒疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无缓冲剂的、酸稳定的、低剂量体积的轮状病毒疫苗。该疫苗在口服给药的体积剂量小于1ml/剂，并且不含任何缓冲剂。在将该疫苗给予受试者口服时，该疫苗也不需要在施用之前或之后施用任何抗酸剂以中和胃酸。该疫苗例证了在pH2‑4时在30分钟的时间跨度内疫苗效价的名义下降。该疫苗在‑20℃稳定至少60个月。

Description

无缓冲剂的、酸稳定的、低剂量体积的轮状病毒疫苗
技术领域
本发明涉及轮状病毒疫苗领域。更具体地，本发明涉及无缓冲剂的或者在施用轮状病毒疫苗之前、期间或之后不需要任何抗酸剂的轮状病毒疫苗领域。本发明还涉及每单位疫苗，特别是轮状病毒疫苗的剂量体积领域。
背景技术
众所周知，轮状病毒是全世界的婴儿和儿童罹患严重肠胃炎的主要原因。即使卫生、水质和卫生方面的改善，这些改善通常可以控制导致其他类型腹泻的许多细菌和寄生虫，也不能充分防止轮状病毒的传播。因此，疫苗接种是全球欠发达国家和发展中国家能够显著减少轮状病毒感染引起的疾病负担的唯一策略。对于缺乏必要经济支持和基础设施来解决感染患者的轮状病毒感染的国家而言，疫苗接种更为重要。迄今为止，世界上至少有四种商业化的轮状病毒疫苗，其中第一种是1999年由惠氏控股公司提供的
Figure BDA0001970439990000011
这是一种活的、口服的、四价轮状病毒疫苗，由1种恒河猴轮状病毒、3种恒河猴-人重配病毒的疫苗生产并且在美国获得许可。然而，由于其与肠套叠的不良影响相关，它在14个月后退出市场。
Figure BDA0001970439990000012
为一种包含在两性霉素培养基中的蔗糖、谷氨酸一钠、一磷酸钾、二磷酸钾、胎牛血清和硫酸新霉素的组合物。关于轮状病毒疫苗组合物的相应专利WO2000006196A2公开教导了该疫苗组合物可包含接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、柠檬酸盐-碳酸氢盐等。当通过口服施用该组合物时，可能还需要向个体提供缓冲溶液以部分中和胃酸，并在向肠道传递时保护该重配轮状病毒。适用于该用途的缓冲溶液包括碳酸氢钠、柠檬酸盐碳酸氢盐等。
Figure BDA0001970439990000013
是由默克集团制造的一种五价人-牛(WC3)重配减毒口服疫苗，包含牛轮状病毒株WC3和涉及5个重配株的P7[5]G6；其中4个重配株具有来自G1、G2、G3或G4的VP7基因，以及1个重配株具有来自人轮状病毒亲本菌株的VP4P1A[8]基因，其余基因来自WC3牛轮状病毒亲本。该疫苗制剂(默克的相应专利公开文本，即WO1998/13065、WO2001/08495和WO2002/011540)包含在组织培养基中的特定稳定剂以及制剂本身中存在的缓冲剂，所述缓冲剂为柠檬酸钠和磷酸钠。使用被专利保护的权利要求中的羧酸盐能够起到缓冲剂的作用，当病毒抗原被施用于婴儿的胃时使得该轮状病毒抗原能够耐受胃的酸度。
此外，
Figure BDA0001970439990000021
是一种单价疫苗，包含来源于89-12菌株的经传代后的人轮状病毒株RIX4414。
Figure BDA0001970439990000022
(由葛兰素史克生物制品公司生产)是一种活疫苗，其包含减毒的单价G1，P[8]人轮状病毒株。该疫苗可以是与稳定剂混合的冻干形式，在将该疫苗施用于受试者之前用碳酸钙基缓冲稀释剂复原。
通过用预填充注射器中包含的1.0ml GSK的CaCO3缓冲液复原冻干的活性成分(RIX4414菌株+赋形剂)来制备Rotarix。将缓冲液注入含有冻干疫苗的小瓶中后，将小瓶充分摇动以重悬疫苗。然后将全部体积的重悬产品回收到同一注射器中，丢弃注射器的针头(或转移装置)，并以单一口服剂量迅速施用该产品。可选地，商业冻干疫苗的复原将遵循相同的流程，使用填充有缓冲液的口服涂药器并且使用转移适配器代替注射器和针头。复原疫苗的外观应呈乳白色。应目测检查是否有颗粒物质和/或变色，如果存在这些条件中的任何一种，则不应施用。Rotarix是通过口服给药。婴儿应采取斜倚的坐姿，并且应在脸颊内侧施用含有复原疫苗的口腔涂药器的全部内容物。Rotarix不能通过注射给药。因此，很明显的，缓冲稀释剂的复原包含如此多的步骤，从确保复原已经适当地完成到疫苗的施用节点。所有这些因素肯定会导致疫苗的依从性降低，相当于对免受轮状病毒感染的部分保护，而非实现了完全的保护。
GSK在轮状病毒疫苗制剂的相应专利申请WO2001/012797、WO2005/02133、WO2006/087205中涉及连续传代带有特定突变的减毒活轮状病毒株P43，还补充了用于复原的抗酸缓冲液。所述轮状病毒株G蛋白(VP4和VP7)对至少4种其他轮状病毒株能够诱导G1血清型，和G2至G14血清型中的至少一种的免疫应答。
巴拉特生物技术国际有限公司(Bharat Biotech International Limited)的其他专利中公开了具有稳定剂和缓冲剂的轮状病毒疫苗组合物，该组合物包括分离自一个人类儿童的印度无症状菌株116E。这些疫苗需要在接受疫苗之前向疫苗接种者单独施用抗酸缓冲液以增加胃的pH，以便在施用该轮状病毒疫苗抗原时中和胃酸，其中所述抗酸缓冲液是柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液。专利公开文本WO2013160913提供了包含轮状病毒抗原、稳定剂和某些新型缓冲液组合的轮状病毒疫苗组合物。该发明中的缓冲液预先混合在轮状病毒疫苗组合物中，以中和胃的高酸性pH，而不需要在疫苗施用前单独施用抗酸剂。
因此，很显然已经通过使用包括人和动物重配型的不同菌株开发出了不同的轮状病毒疫苗。这些菌株的特征存在一些重要差异，典型的差异如下所列。
Figure BDA0001970439990000031
表1：人源单价疫苗和动物源重配疫苗之间的差异
本发明背后的原理
因此，已知轮状病毒对酸性环境是高度敏感的(Estes,M.,Graham,D.,Smith,E.and Gerba,C.(1979).Rotavirus Stability and Inactivation.Journal of GeneralVirology,43(2),pp.403-409)。还有报道称，在经受pH小于3.0的环境时婴儿胃肠炎病毒会变得不稳定，它们的外壳和壳粒会瓦解(Palmer,E.,Martin,M.and Murphy,F.(1977).Morphology and Stability of Infantile Gastroenteritis Virus:Comparison withReovirus and Bluetongue Virus.Journal of General Virology,35(3),pp.403-414)。还有报道称，当暴露于pH为2的环境时，许多轮状病毒株在一分钟内已经失活，并且用pH为1.8的人胃液获得了类似的结果(Weiss,C.and Clark,H.(1985).Rapid Inactivation ofRotaviruses by Exposure to Acid Buffer or Acidic Gastric Juice.Journal ofGeneral Virology,66(12),pp.2725-2730)。进一步有报道称，人血清型1轮状病毒在经受pH2.5的环境时完全失活(Meng,Z.,Birch,C.,Heath,R.and Gust,I.(1987).Physicochemical Stability and Inactivation of Human and SimianRotaviruses.Applied and Envirnmental Microbiology,53(4),pp.727-730)。通常来说，轮状病毒在经受酸性环境时是高度不稳定的并且迅速失活。暴露于pH2.0，pH 3.0或pH 4.0的酸缓冲剂后，测定了三种牛源轮状病毒和几种灵长类动物源轮状病毒的灭活率。每种轮状病毒在pH2.0(最接近正常空腹胃的酸度)时很快灭活，测得感染的半衰期是1分钟或更短。每种轮状病毒在pH3.0时以较慢的速率灭活，在pH 4.0时的灭活是最慢的。检测到不同轮状病毒株之间的耐酸性差异。尽管这些测定是在室温(23℃)下进行的，但在不同温度下的实验表明，在正常体温(37℃)下，酸灭活病毒的速度更快。暴露于pH 1.8或pH 2.1的天然人胃液的轮状病毒的研究揭示了与相同pH的甘氨酸缓冲液观察到的类似的病毒灭活速率。(参考：Geigy Scientific Tables,volume 1,1981,page 126)。
轮状病毒的灭活在pH 2.0至pH 3.0之间时发生，但在pH 4.0时不发生或发生最小程度的灭活。由于胃中含有高度胃酸环境，因此迄今为止必须在轮状病毒疫苗制剂中加入缓冲剂，轮状病毒制剂中的缓冲剂有助于保持轮状病毒疫苗制剂的恒定pH值，从而使疫苗制剂具有抗酸或缓冲能力。轮状病毒疫苗的抗酸能力(也称为酸中和能力)已通过GSK专利中的婴儿动态制酸力实验(Baby Rossett Rice Assay)测定。给定制剂的酸中和能力定义为维持pH高于4.0所测量出的时间，并通过婴儿动态制酸力实验(评估。据报道，婴儿动态制酸力实验据称可模拟人胃的胃环境。GSK的最新专利US8821891B2主张较低浓度的磷酸盐，以及加大浓度的羧酸盐，优选范围为100mM至1M的己二酸盐，优选400mM至700mM并且剂量体积低至每人轮状病毒疫苗的剂量为1.5ml。己二酸是能够承受高胃酸度(pH 1至2)的缓冲剂。其耐受人胃酸度的能力通过婴儿动态制酸力实验进行测量，得到8至23分钟的值，说明其能够且足够好地避免在向人类婴儿施用轮状病毒疫苗后疫苗制剂中的轮状病毒抗原失活。
因此，为了有效地施用轮状病毒疫苗，该疫苗能够引发足以赋予针对轮状病毒感染的保护的免疫原性应答，每个人的口服给药剂量需要至少1.5至2ml的轮状病毒疫苗或复原疫苗制剂，以有效地允许轮状病毒抗原通过胃的高酸性环境。所以，通过上述对迄今为止可获得的轮状病毒疫苗现状的描述，本领域技术人员也容易理解和认识到轮状病毒抗原是高度酸不稳定的抗原，并且轮状病毒疫苗的施用总是需要抗酸剂或缓冲剂组分，从而增加了疫苗施用所需的量(就每单位疫苗的体积剂量而言)。
事实上，轮状病毒抗原也是一种高度不稳定的病毒，并且考虑到活的减毒轮状病毒疫苗抗原会更不稳定的情况；因此在轮状病毒抗原中补充各自专有的疫苗稳定剂，以稳定疫苗制剂，其增加了以每单位疫苗的体积计的疫苗剂量。此外，包含缓冲剂或抗酸剂或需要用基于缓冲液的疫苗稀释剂复原疫苗，增加了以每单位疫苗的体积计的疫苗剂量。因此，提供一种不含缓冲剂/抗酸剂的轮状病毒疫苗肯定会降低每单位疫苗的剂量。同时，至关重要的是，这种不含缓冲剂的轮状病毒疫苗不应影响轮状病毒疫苗的功效性和稳定性。
由于轮状病毒疫苗接种者的受试者始终是6周至6个月大的年龄组中的婴儿，因此很有可能大量递送到婴儿口中的轮状病毒疫苗制剂会溢出。这产生了疫苗仅部分施用的可能性，从而降低了疫苗依从性，并且尽管接种了疫苗但仍未保护其疾病负荷。因此，总是希望在不损害疫苗制剂功效的情况下尽可能地减少每单位轮状病毒疫苗的体积剂量。目前，现有技术中公开的轮状病毒疫苗的最小剂量范围为1.5ml-2.5ml。该疫苗含有疫苗稳定剂和疫苗缓冲剂，加起来是总疫苗剂量。因此，减少每单位轮状病毒疫苗的剂量体积，同时具有相同的提高所需的免疫原性以预防婴儿中的轮状病毒感染的能力，将降低施用婴儿疫苗制剂时溢出的可能性。因此，在不含缓冲剂的情况下，每个人的剂量可以最多达1ml，优选仅0.8ml，或最优选0.5ml的低剂量，其与含缓冲剂或抗酸剂并且具备每单位疫苗高剂量体积的轮状病毒疫苗具有同等或更高效力，这种轮状病毒疫苗制剂是非显而易见的。
现有技术公开了所有轮状病毒疫苗制剂，所有这些制剂都要在5±3℃的冷藏温度下稳定在液体制剂中，或者作为冻干粉末，这需要在施用疫苗之前用合适的稀释剂复原疫苗。已经讨论过，冻干粉末疫苗的复原需要特殊的技能和谨慎。此外，稀释剂与疫苗的单独制造要求使疫苗制造成本和运输成本加倍。技能、谨慎和满足仓储要求的适当的基础设施的缺乏加剧了冻干轮状病毒疫苗供应的问题。对于5±3℃的液体疫苗，疫苗的保质期仅限于2年。在储存和运输期间，在2-8℃的疫苗也存在相关的效价损失，这是不希望的。但是，在-20℃的轮状病毒疫苗配方中，已经发现根本没有运输和储存的损失。对于-20℃的疫苗，疫苗污染的可能性也大大降低。此外，已在全球近120个国家建立了用于脊髓灰质炎疫苗供应的-20℃疫苗供应设施。因此，根据疫苗储存和疫苗供应的现有设施，类似于脊髓灰质炎疫苗的供应将大大有助于减少世界轮状病毒疾病的负担。期望开发替代策略，其中进一步增加轮状病毒疫苗的稳定性，使得疫苗可以被提供给全球最偏远的角落。因此，在本专利申请中公开了新的轮状病毒疫苗制剂，其中轮状病毒疫苗制剂至少在5年内是稳定的，该制剂是绝对新颖的并且在现有技术中根本没有说明。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种无缓冲剂并且酸稳定的轮状病毒疫苗。
本发明的另一个主要目的是提供一个低剂量体积的轮状病毒疫苗，所述剂量体积低至1ml或甚至仅0.8ml，优选0.5ml。
本发明的另一个目的是提供一种稳定的轮状病毒疫苗组合物，其疫苗体积低至每剂量0.5ml。
本发明的另一个目的是减少轮状病毒疫苗的溢出并使疫苗接种者的相关疫苗浪费最小化并由此增加疫苗的依从性。
本发明的另一个目的是制备轮状病毒疫苗组合物，其在疫苗施用之前或施用期间不需要任何特定的稀释或复原技术。
本发明的另一个目的是提供一种在-20℃下稳定至少5年的轮状病毒疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种低剂量体积的轮状病毒疫苗，其在5±3℃下稳定2年，在25℃下稳定6个月，在37℃下稳定1周。
本发明的另一个目的是提供一种无缓冲剂、至多1ml的低剂量体积的轮状病毒疫苗组合物，其在pH 2至pH 4的胃中稳定至少20分钟。
本发明的另一个目的是提供一种无缓冲剂、至多1ml的低剂量体积的轮状病毒疫苗组合物，其在酸性pH2-4的条件下是稳定的，不需要任何缓冲剂或酸稳定剂的补充。
本发明的另一个目的是提供一种不含缓冲剂、酸稳定的、低剂量的轮状病毒疫苗组合物，在将该疫苗施用于受试者之前或之后或施用期间不需要施用任何抗酸剂或缓冲剂。
可选地，本发明的另一个目的是提供0.5ml的低剂量体积轮状病毒疫苗，其伴随着缓冲剂的存在，且对人类的轮状病毒感染同样有效。
本发明的另一个目的是提供一种不含缓冲剂的低剂量体积轮状病毒疫苗，其能够产生与在疫苗组合物中补充有抗酸剂或缓冲剂的轮状病毒疫苗相当的或更强的免疫应答。
发明概述
本发明的一个实施例提供了一种疫苗组合物，其中在pH2-4时，在至少1小时的时间内，轮状病毒疫苗效价的损失不超过0.55FFU/0.5ml。
在另一个实施例中，本发明提供了一种疫苗组合物，其中在pH2-4时，在至少20分钟的时间内，轮状病毒疫苗效价的损失不超过0.68FFU/0.5ml。
本发明的另一个实施例提供了各种轮状病毒疫苗组合物，其剂量体积范围为1ml至0.5ml，其中该疫苗制剂不含任何缓冲剂或抗酸剂，并举例说明了在pH2和该pH下30分钟时间跨度内疫苗效价有极小的下降。
本发明的另一个实施例通过婴儿动态制酸力实验(Baby Rossett Rice Assay)建立的酸中和能力，与有缓冲剂存在的轮状病毒疫苗组合物相比，提供每单位疫苗0.5ml至1ml的低剂量体积轮状病毒组合物的酸中和能力。
本发明的另一个实施例提供了剂量仅为0.5ml的无缓冲剂轮状病毒疫苗，其能够在疫苗接种后产生四倍血清转化的免疫应答，其与疫苗制剂在存在缓冲剂或施用抗酸剂的情况下产生的血清转化相当或比之更强。
在另一个实施例中，本发明提供了一种预防人类轮状病毒性腹泻的方法，该方法包括在所述轮状病毒疫苗制剂中不存在任何缓冲剂的情况下，施用有效量的稳定的轮状病毒疫苗制剂的步骤，该制剂包含轮状病毒株116E，选自蔗糖、乳糖和海藻糖的糖的组合，乳清蛋白水解物，重组人血清白蛋白。
本发明的另一个实施例提供了稳定的轮状病毒疫苗组合物，其在-20℃下稳定至少5年。
本发明的另一个实施例提供了稳定的轮状病毒疫苗组合物，其在2-8℃、25℃和37℃下分别稳定2年、6个月和3周。
发明详述
实施例1：缓冲的轮状病毒制剂和胃酸
在上述本发明的背景技术中已经提到，缓冲剂的使用是轮状病毒疫苗制剂策略的一种常用方法，迄今为止已被各种轮状病毒疫苗的制造商采用，因此包含116E菌株的Rota疫苗在-20℃的制剂(SPG和DMEM)已经用柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液和生理盐水条件进行了初步测试。
巴拉特生物技术国际有限公司(Bharat Biotech International Limited)根据与美国贝塞斯达的美国国立卫生研究院(NIH)的美国国立过敏和传染病研究所(NIAID)签订的材料转让协议，从美国国立卫生研究院获得了人轮状病毒株116E。轮状病毒株116E的完整基因组序列已在文献中有报道。
将储存在-20℃下的包含轮状病毒116E的三种轮状病毒疫苗制剂分成3组(组I、II和III)，如下所述。以下所有三组中的轮状病毒疫苗组合物包含溶解在10％SPG(蔗糖、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾)和达尔伯克氏最低基础培养基(Dulbecco's Minimum EssentialMedium)中的菌株116E的活的减毒轮状病毒抗原。所述疫苗制剂分别处理，详述如下：
组I：在-20℃的0.5ml轮状病毒116E制剂A。
组II：2ml(相当于每人0.5ml的4个人剂量)轮状病毒116E制剂A与5ml生理盐水混合。
组III：0.570ml的轮状病毒116E制剂A+[1.42ml的柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液+8ml的34.8mEq HCl]的混合物。
如上所述，组I包括-20℃的轮状病毒疫苗制剂，其中没有向疫苗制剂中加入缓冲剂或盐水，并且在接下来的120分钟测量了疫苗效价。在组II中，取2ml的轮状病毒116E疫苗制剂(储存于-20℃)并加入5ml生理盐水，并以10^6FFU/ml的目标效价测量疫苗效价，直至120分钟。在组III中，取0.57ml的轮状病毒116E疫苗制剂(储存于-20℃)并加入1.42ml的柠檬酸盐碳酸氢盐缓冲液和8ml的34.8mEq盐酸。
Figure BDA0001970439990000091
Figure BDA0001970439990000101
表2：在缓冲剂存在下，0分钟、60分钟和120分钟时的轮状病毒疫苗制剂(储存温度：-20℃)的疫苗效价。
因此，上表确定了将病毒暴露于生理盐水条件或存在缓冲溶液时，轮状病毒抗原效价都是稳定的，因此疫苗是稳定的。
实施例2：轮状病毒疫苗制剂在不同pH下的免疫过氧化物酶测定。
实例1：通过将34.8mEq盐酸(HCl)直接加入轮状病毒疫苗制剂中，使轮状病毒疫苗制剂直接暴露酸性环境中后进行免疫过氧化物酶测定。通过直接添加酸将疫苗制剂的pH从pH7直接降至pH2和pH4的各种较低pH值，随后在给定的较低pH值pH2和pH4下测量疫苗抗原效价。此后，在各种较低pH2和4下测量疫苗效价长达1小时。进行了下述观察。在各种时间点和各种pH水平下研究反应混合物。详细信息如下表所示。所述轮状病毒疫苗制剂(在-20℃的储存温度下)含有活的减毒轮状病毒抗原116E，以及溶解在达尔伯克氏最低基础培养基中的10％SPG(磷酸谷氨酸钠)。
Figure BDA0001970439990000102
表3：通过向轮状病毒疫苗制剂中直接添加酸(储存温度：-20℃)，在0分钟和60分钟时目标效价为10^5.0FFU/0.5ml剂量的免疫过氧化物酶测定结果。
备注：稀释导致计算出的感染性效价值减少＝101.47FFU。因此，稀释后的实际疫苗效价在pH2时为102.93。通过免疫过氧化物酶测定将所有样品一式三份进行滴定。口服轮状病毒疫苗(目标效价105.0FFU/0.5mL)在pH4.0下稳定。目标效价是指在给定的小药瓶中想要达到的疫苗小药瓶中轮状病毒116E抗原的最小浓度。在0分钟时，疫苗在中性pH下的原始效价为104.95FFU/0.5ml。在0分钟时，在pH2下的疫苗效价为103.54FFU/0.5ml，并且在1小时内效价降至102.93FFU/0.5ml。因此，在加入酸后增加了1.47的稀释因子值后，此时实际效价值为(102.93FFU/0.5ml)，加入酸1小时后pH值为2时的校正疫苗效价为104.40，而在0分钟pH值为7时的原始疫苗效价为104.95。因此，在pH2.0下、1小时内，疫苗仅发生了0.55疫苗效价的总对数损失。这表明，即使在较低的pH值2下，也就是说在人胃中出现的特定酸性环境中，轮状病毒疫苗制剂能够维持其疫苗效价为104.40FFU/0.5ml。在这种疫苗效价下，疫苗能够对随后的轮状病毒感染产生足够的免疫应答。在用效价为104.0的Rota 116E疫苗进行的临床试验中，该疫苗产生了约62％的4倍血清转化，这是非常令人鼓舞的(Nita Bhandariet al，JInfect Dis2009,200,421-9)。
实例2：用不同的疫苗(在-20℃的储存温度下)重复相同的实验，其中目标效价为10^6.0FFU/0.5ml(剂量)。下表中提供了在0分钟和1小时后的各种pH值下计算出的效价值以及稀释因子。所述轮状病毒疫苗制剂(在-20℃的储存温度下)含有活的减毒轮状病毒抗原116E和溶解在DMEM中的10％SPG。
Figure BDA0001970439990000111
Figure BDA0001970439990000121
表4：通过向轮状病毒疫苗制剂中直接添加酸(储存温度：-20℃)，在0分钟和60分钟时，目标效价为10^6.0FFU/0.5ml剂量的免疫过氧化物酶测定结果。
结论：在pH4.0时，疫苗样品中疫苗效价仅有0.24log的损失，这被认为在实际情况下保持1小时pH未造成影响。在pH2.0时，效价上0小时时效价下降0.46Log，及1小时时失去0.68log10FFU。也就是说在这种酸性较低的pH值为2时，pH对疫苗效价值具有非常微小的影响。
根据上表，我们看到10^4.89FFU/0.5ml的疫苗效价在pH2时保持效价值为10^4.21FFU/0.5ml；4.89-4.21的对数效价足以在6周至2岁龄婴儿的胃肠道中复制轮状病毒。婴儿的胃酸度也是pH 2，代表着一个模拟的胃环境。效价为4.89Log10FFU/0.5ml的该疫苗仍然能够存活，并且足以穿过胃，然后进入肠绒毛并进一步复制轮状病毒，负责在婴儿中产生免疫反应，从而获得保护和预防轮状病毒肠胃炎。因此，本发明发现疫苗在酸性pH 2下稳定至少持续1小时，而疫苗效价根本没有任何显著的损失。
实施例3：体外实验证明轮状病毒116E疫苗不需要抗酸剂：
除了在专利说明书后面的临床试验结果的结论之外，本发明还证明了在体外模拟胃酸的类似条件，在没有缓冲剂时直接施用疫苗。
实例3.1：取1mL含有轮状病毒116E，蔗糖(50％)、乳糖(0.5％)和海藻糖(0.5％)的组合物，乳白蛋白水解物(1％)，人血清白蛋白(0.4％)的疫苗(制剂3A)，并加入1.25mL的0.1N HCl充分混合。在不同的pH水平下以不同的时间间隔取样并测试病毒含量。结果如下表5.1所示。
Figure BDA0001970439990000122
Figure BDA0001970439990000131
表5.1：1ml轮状病毒116E疫苗(制剂3A)的免疫过氧化物酶测定
实例3.2：取0.8mL含轮状病毒116E、蔗糖(40％)和海藻糖(0.5％)的组合物、乳白蛋白水解物(20％)、聚乙烯吡咯烷(0.5％)的疫苗(制剂3B)，并加入1.25mL的0.1N HCl充分混合。在不同的pH水平下以不同的时间间隔取样并测试病毒含量。结果如下表5.2所示。
Figure BDA0001970439990000132
表5.2：0.8ml轮状病毒116E疫苗(制剂3B)的免疫过氧化物酶测定
实例3.3：取0.5mL含有蔗糖(60％)和海藻糖(0.5％)的组合物、大豆蛋白(20％)、吡哆醇-HCL(0.1％)、聚乙烯吡咯烷(0.25％)的轮状病毒116E疫苗(制剂3C)，并加入1.25mL的0.1N HCl充分混合。在不同的pH水平下以不同的时间间隔取样并测试病毒含量。结果如下表5.3所示。
Figure BDA0001970439990000133
Figure BDA0001970439990000141
表5.3：0.8ml轮状病毒116E疫苗(制剂3C)的免疫过氧化物酶测定
实例3.4：取0.5mL含有溶于DMEM中的10％SPG的轮状病毒116E疫苗(制剂3D)，并加入1.25mL的0.1N HCl充分混合。在不同的pH水平下以不同的时间间隔取样并测试病毒含量。结果显示在下表5.4中。
Figure BDA0001970439990000142
表5.4：0.8ml轮状病毒116E疫苗(配方3D)的免疫过氧化物酶测定
实例3.5：取0.5mL含有蔗糖(40％)、海藻糖(0.5％)、乳糖(5％)、rHSA(0.5％)、LAH(1％)和混合缓冲液(乙酸铵+碳酸氢铵+正磷酸氢二胺)的轮状病毒116E疫苗(配方3D)，并加入1.25mL的0.1N HCl充分混合。在不同的pH水平下以不同的时间间隔取样并测试病毒含量。结果显示在下表5.5中。
Figure BDA0001970439990000143
Figure BDA0001970439990000151
表5.5：0.8ml轮状病毒116E疫苗(配方3D)的免疫过氧化物酶测定
结论：从上表中可以明显看出，在pH2.0下30分钟，任何轮状病毒116E疫苗制剂都能够在没有任何缓冲剂或任何抗酸剂的情况下耐受。
实施例4：婴儿动态制酸力分析(Baby Rossett Rice Analysis)
BRR测定是轮状病毒疫苗制剂的酸中和能力的验证程序。因此，使用该测定法评估所选的含有柠檬酸盐磷酸盐缓冲液和柠檬酸盐碳酸氢盐缓冲液的疫苗制剂的酸中和能力。使用婴儿动态制酸力实验(BRR)在模拟婴儿胃的条件下进行体外实验。选择具有各种缓冲剂组合的各种制剂用于酸中和实验，模拟婴儿胃部的各种pH值的状态的结果在下表中以给出。将疫苗制剂用注射用水稀释至10ml，然后加入4ml的0.1N HCl，然后每分钟加入0.5ml的0.1N HCl直至pH达到4.0。ANC定义为维持pH值高于4.0所需的时间分钟。
Figure BDA0001970439990000152
表6：疫苗制剂的细节：
利用上面列出的疫苗制剂4A至4D进行的婴儿动态制酸力实验进行以下观察(表7)。
Figure BDA0001970439990000153
Figure BDA0001970439990000161
表7：对比婴儿动态制酸力分析下含缓冲剂和不含缓冲剂的轮状病毒疫苗制剂。
结论：因此，从上表中我们发现，即使上述疫苗制剂4A从pH 7.48立即下降到pH1.95，疫苗效价仍保持在10^4.83FFU/0.5ml和10^3.83FFU/0.5ml。同样地，pH在2分钟内从7.28降至pH3.98时，疫苗制剂4C的疫苗效价也保持在10^5.30至10^5.02FFU/0.5ml之间。因此，即使BRR值仅为2分钟，疫苗效价也能相当好地保持，即10^5.02FFU/0.5ml。这么多量的疫苗效价足以产生免疫应答，从而获得保护和预防人类婴儿轮状病毒胃肠炎。
实施例4：包含轮状病毒116E菌株的无缓冲剂的
Figure BDA0001970439990000162
用于临床试验。
假设和研究理由
假定轮状病毒的自然传播通过粪口途径发生。轮状病毒通常是酸不稳定的，并且据信酸性环境会影响病毒的存活力。
鉴于轮状病毒的酸不稳定性，对于无处不在地感染哺乳动物是如此有效，因为大多数哺乳动物具有约为2的胃pH值。一种可能性是，人类婴儿的胃可能比成人的胃更容许轮状病毒的存活，如婴儿的胃的pH值往往约为3.2，相比较而言成人约为1.0。这就可以解释这样的事实，即60％至90％报道的人类轮状病毒疾病发生在3岁以下的儿童中。
研究设计
为了检验这一假设，进行了一项大型多中心随机对照试验，以评估和比较接受含柠檬酸盐碳酸氢盐缓冲剂的ROTAVAC的受试者与接受无缓冲剂的ROTAVAC的受试者的疫苗免疫应答。
因此，该研究包括以下三个治疗组：
-第I组(接受
Figure BDA0001970439990000175
前5分钟施用2.5ml缓冲剂)，
-第II组(接受无缓冲剂的
Figure BDA0001970439990000174
)，
-第III组(在施用前立即与2.5ml缓冲液混合以接受
Figure BDA0001970439990000176
)。
研究调查员和安全评估员(研究协调员)对治疗组的分配不知情。通过按照分配的治疗组给予疫苗的研究护士是不知情的。所有受试者在间隔4周时接受3剂疫苗。在第三次疫苗剂量(第84天)后4周测试疫苗免疫应答，并与基线(第0天)进行比较。根据治疗组中血清抗轮状病毒IgA的几何平均效价(GMT)和血清转化(从疫苗接种前到接种后的抗体水平的水平增加)测试免疫原性。
研究结果和结论
接种疫苗后治疗组之间抗轮状病毒IgA的免疫应答相当，无统计学差异。重要的是，组II(施用无缓冲液剂
Figure BDA0001970439990000172
)的血清转化和GMTs与其他两个施用有缓冲剂的
Figure BDA0001970439990000173
的治疗组相似。
在无缓冲剂的情况下施用ROTAVAC的组中，接种疫苗后抗轮状病毒IgA的GMT为20.7U/mL，而在疫苗接种前5分钟接受抗酸缓冲剂并同时与疫苗混合的两组分别为19.6U/mL和19.2U/mL(表8)。各组之间的差异无统计学意义(p>0.05，学生T检验)。
表8：几何平均效价和95％CI的结果(第0天和第84天)
Figure BDA0001970439990000171
Figure BDA0001970439990000181
N＝每组评估的受试者数量；GMT＝几何平均值；95％CI(LL，UL)＝置信区间(下限，上限)
类似地，在没有抗酸缓冲剂和缓冲剂的情况下接受
Figure BDA0001970439990000184
的组中观察到的四倍血清转化率接近，分别为29.2％、24.5％和25.1％(表9)。此外，治疗组之间血清转化差异(2倍)的95％置信区间的下限>-10％，表明用所有三种治疗方案实现的免疫应答的非劣效性(表10)。
表9：疫苗接种后基线和第84天之间的血清转化和95％CI(抗体效价的2、3或4倍变化)
Figure BDA0001970439990000182
N＝每组评估的受试者数量；(95％CI)＝置信区间(下限，上限)
表10：治疗组中接种疫苗后％2倍血清转化的差异
Figure BDA0001970439990000183
在三组之间，对于被请求和未经请求的不良事件的反应原性和安全性是具有可比性，没有统计学上的显著差异。在接受含或不含抗酸缓冲剂的疫苗的所有三个治疗组中，
Figure BDA0001970439990000191
疫苗都具有良好的耐受性。
实施例5：新的轮状病毒116E制剂
ORV 116E液体制剂在37℃，25℃和2-8℃下的稳定性数据
以下提供了一段长达5年范围的持续时间内检测的剂量体积为0.5ml而没有缓冲剂(样品1至12、14至16)的轮状病毒疫苗制剂和有0.5ml剂量体积的混合缓冲剂(样品13)的轮状病毒疫苗制剂。下面提供了各种配方细节以及它们在37℃下长达4周、25℃下至少6个月、以及5±3℃下长达2年到5年的稳定性。研究表明，剂量体积为0.5ml的无缓冲剂的轮状病毒疫苗制剂在冷藏温度下长时间保持稳定至少2年。还发现轮状病毒疫苗制剂在冷藏温度下也可稳定5年。
配制样品1，其含有轮状病毒116E、蔗糖50％、乳糖0.5％、HSA 0.5％和乳清蛋白水解物0.05％。
样品1的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 24M 36M 60M
5+3℃ 6.02 6.0 6.43 6.21 6.16 6.16 6.07
25℃ 6.02 6.07 5.81 5.9 5.51 4.65
37℃ 6.02 5.32 2.63
配制样品2，其含有轮状病毒116E、蔗糖50％、海藻糖0.5％、HSA 0.5％和乳清蛋白水解物0.5％。
样品2的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 24M 36M 60M
5+3℃ 6.09 6.14 6.19 6.07 6.10 6.05 6.01
25℃ 6.09 6.02 6.06 5.63 5.51 2.48
37℃ 6.09 5.47 3.23
配制样品3，其含有轮状病毒116E、蔗糖50％、海藻糖1.0％、HSA 0.5％和乳清蛋白水解物0.5％。
样品3的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 24M 36M 60M
5+3℃ 6.22 6.24 6.26 6.14 6.20 6.13 6.04
25℃ 6.22 6.18 6.15 5.80 5.34 2.03
37℃ 6.22 5.35 3.22
配制样品4，其含有轮状病毒116E、蔗糖40％、乳糖0.5％和乳清蛋白水解物1.0％。
样品4的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 15M 24M 60M
5+3℃ 6.19 6.18 6.08 6.21 6.24 6.12
25℃ 6.19 5.66 5.10 4.8 3.01
37℃ 6.19 4.23 2.01
配制样品5，其含有轮状病毒116E、蔗糖40％、麦芽糖5.0％和乳清蛋白水解物1.0％。
样品5的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 15M 24M 60M
5+3℃ 6.35 6.37 6.18 6.01 6.17 6.08
25℃ 6.35 5.89 5.11 4.77 2.43
37℃ 6.35 5.31 3.58
配制样品6，其含有轮状病毒116E、蔗糖40％、海藻糖0.5％和乳清蛋白水解物1％。
样品6的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 15M 24M 60M
5+3℃ 6.19 6.15 6.10 6.03 6.22 6.13
25℃ 6.19 5.87 5.43 5.12 3.25
37℃ 6.19 4.02 2.52
配制样品7，其含有轮状病毒116E、蔗糖40％、海藻糖1.0％和乳清蛋白水解物1.0％。
样品7的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 15M 24M 60M
5+3℃ 6.34 5.79 6.00 5.55 6.07 6.09
25℃ 6.34 6.07 5.81 5.9 5.51 4.65
37℃ 6.34 5.32 2.63
配制样品8，其含有轮状病毒116E、蔗糖50％、海藻糖0.5％和乳清蛋白水解物0.5％。
样品8的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 15M 18M 24M 36M 60M
5+3℃ 6.34 6.34 6.33 6.31 6.24 6.14 6.08
25℃ 6.34 6.32 6.14 6.01 5.25
37℃ 6.34 5.11 4
配制样品9，其含有轮状病毒116E、蔗糖70％、海藻糖0.5％。
样品9的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 15M 18M 24M 36M 60M
5+3℃ 6.38 6.31 6.23 6.44 6.35 6.26 6.18
25℃ 6.38 6.41 6.35 6.23 5.57
37℃ 6.38 5.07 4.01
配制样品10，其含有轮状病毒116E、蔗糖50％、乳糖0.5％、麦芽糖0.5％、HSA0.5％和乳清蛋白水解物0.05％。
样品10的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 15M 18M 24M 36M 60M
5+3℃ 6.25 6.15 6.03 6.34 6.08 6.12 6.11 6
25℃ 6.25 6.14 6.27 6.12 5.88
37℃ 6.25 5.02 4.35
配制样品11，其含有轮状病毒116E、蔗糖50％、海藻糖0.5％、麦芽糖0.5％、HSA0.5％。
样品11的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 24M 36M 60M
5+3℃ 6.68 6.62 6.95 6.84 6.64 6.65 6.37 6.72 6.05
25℃ 6.68 6.50 6.20 6.04 5.32 4.47
37℃ 6.68 6.10 5.58 4.26
配制样品12，其含有轮状病毒116E、蔗糖50％、海藻糖0.5％、HSA 0.5％和乳清蛋白水解物0.05％。
样品12的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 24M 36M 60M
5+3℃ 6.62 6.76 6.98 7.00 6.86 6.74 5.99 6.46 6.17
25℃ 6.62 6.46 6.42 5.99 5.13 3.25
37℃ 6.62 5.58 5.06
配制样品13，其含有轮状病毒116E、蔗糖(40％)、海藻糖(0.5％)、乳糖(5％)、rHSA(0.5％)、LAH(1％)和混合缓冲液(乙酸铵+碳酸氢铵+正磷酸氢二铵)。
样品13的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 24M 36M 60M
5+3℃ 6.61 6.59 6.58 6.60 6.53 6.54 6.18 6.01 5.83
25℃ 6.61 6.46 6.44 5.79 5.25 4.15
37℃ 6.61 5.56 5.01
样品13在-20℃时的稳定性：
温度 0天 1M 2M 3M 6M 9M 12M 24M 36M 60M
-20℃ 6.61 6.59 6.59 6.56 6.54 6.52 6.21 6.11 6.13 6.09
用轮状病毒116E、10％SPG溶解在DMEM中配制样品14、15和16。将样品14、15和16保持在-20℃，并检查60个月内的稳定性。发现疫苗制剂13、14和15在-20℃下非常稳定，至少持续5年的时间。
Figure BDA0001970439990000231
因此，确定0.5ml剂量体积的各种轮状病毒疫苗组合物在-20℃下稳定5年，2-8℃下稳定2年，25℃下稳定6个月和37℃下稳定1周。不考虑疫苗制剂，还发现0.5ml至1ml剂量体积的轮状病毒疫苗是酸稳定的，如pH范围为2-4的实施例3中所示。因此，申请人希望提到的是，不管疫苗组成的细节如何，任何包含活的减毒轮状病毒116E的轮状病毒疫苗都能够耐受人婴儿胃中的强酸性环境，并产生针对轮状病毒感染的所需免疫应答。本专利申请中提供的疫苗制剂仅用于解释本发明的广度和深度。尽管申请人已在实施例3、实例3和实施例5中给出了许多制剂策略，申请人提供所有可能的疫苗制剂细节是不切实际的。因此，对本领域技术人员来说，包含轮状病毒116E菌株的轮状病毒疫苗制剂策略的所有可能的明显变体也包括在本发明内。应被理解并相应被解释地是，本专利申请中未具体包括的包含减毒活轮状病毒116E的疫苗组合物也包括在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种液态的轮状病毒疫苗组合物，其特征在于，所述轮状病毒疫苗组合物包含：
a）轮状病毒株116E；
b）蔗糖和乳糖；所述蔗糖的浓度为50%，所述乳糖的浓度为0.5%；
c）乳白蛋白水解产物，所述乳白蛋白水解产物的浓度为0.05%；和
d）重组人血清白蛋白，所述重组人血清白蛋白的浓度为0.5%；
或者，
所述轮状病毒疫苗组合物包含：
a）轮状病毒株116E；
b）蔗糖和海藻糖；所述蔗糖的浓度为50%，所述海藻糖的浓度为0.5%；
c）乳白蛋白水解产物，所述乳白蛋白水解产物的浓度为0.5%；和
d）重组人血清白蛋白，所述重组人血清白蛋白的浓度为0.5%；
或者，
所述轮状病毒疫苗组合物包含：
a）轮状病毒株116E；
b）蔗糖和海藻糖；所述蔗糖的浓度为50%，所述海藻糖的浓度为1%；
c）乳白蛋白水解产物，所述乳白蛋白水解产物的浓度为0.5%；和
d）重组人血清白蛋白，所述重组人血清白蛋白的浓度为0.5%；
其中，所述轮状病毒疫苗组合物不含缓冲剂或抗酸剂，并且所述轮状病毒疫苗组合物的剂量体积为0.5ml。
2.如权利要求1所述的轮状病毒疫苗组合物，其特征在于，所述轮状病毒的效价为106FFU/0.5ml。
3.如权利要求1所述的轮状病毒疫苗组合物，其特征在于，所述轮状病毒疫苗组合物在2-8℃下稳定至60个月。
4.如权利要求1所述的轮状病毒疫苗组合物，其特征在于，所述轮状病毒疫苗组合物在施用于受试者之前或之后不需要施用任何抗酸剂或缓冲剂。
5.如权利要求1所述的轮状病毒疫苗组合物，其特征在于，所述轮状病毒疫苗组合物在25℃下稳定6个月，在37℃下稳定至少4周。
6.如权利要求1所述的轮状病毒疫苗组合物，其特征在于，所述轮状病毒疫苗组合物是液体的口服疫苗制剂。
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