KR20220063302A - 완충제를 사용하지 않고 산에 안정적인 저용량의 로타바이러스 백신 - Google Patents
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Abstract
완충제를 사용하지 않으며, 산에 안정적이고, 투여 용량이 작은 로타바이러스 백신을 개시한다. 본 백신은 경구 투여시 1회 투여 당 1 ml 미만의 투여 용량으로 사용가능하며, 어떠한 완충제도 사용되지 않는다. 또한, 이 백신은 백신의 경구 투여시 위의 산성을 중화하기 위한 어떠한 제산제도 사전 또는 사후 투여할 필요가 없다. 본 백신은 pH 2-4에서 30분 동안은 백신 역가의 실질적인 감소를 보이지 않는다. 본 백신은 -20℃에서 적어도 60분간 안정적이다.
Description
본 발명은 로타바이러스 백신 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 로타바이러스 백신의 투여 전, 투여 중 또는 투여 후 완충제나 어떠한 제산제도 필요없는, 로타바이러스 백신 분야에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단위 백신, 특히 로타바이러스 백신의 투여 용량 분야에 관한 것이다.
로타바이러스는 전세계적으로 유아와 어린이에서 중증의 위장염을 유발하는 주요 요인으로 잘 알려져 있다. 다른 유형의 설사를 유발하는데 원인이 되는 다수의 박테리아 및 기생충을 일반적으로 방제할 수 있는 위생, 수질 및 소독 측면에서의 개선에도 불구하고 로타바이러스의 전파는 적절하게 방지되지 않고 있다. 따라서, 백신 접종이 전세계적으로 저개발국가 및 개발도상국에서 로타바이러스 감염으로 인한 질병 부담을 현저하게 줄일 수 있는 유일한 전략이다. 백신 접종은 감염 환자에서 로타바이러스 감염을 해결하기 위해 필요한 경계적인 뒷받침과 기반 시설이 부족한 국가에서 더욱 중요하다. 지금까지, 세계적으로 4종 이상의 로타바이러스 백신이 시판되었으며, 그 첫번째는 1999년 Wyeth Holdings 사에서 공급한 Rotashield®이다. 이 백신은 레수스 원숭이 로타바이러스 1종과 레수스-인간 재편성 바이러스 3종을 이용해 제조되고 미국에서 허가된 로타바이러스의 경구 4가 생백신이다. 그러나, 이 백신은 장 중첩증이라는 부작용으로 인해 14개월 후 시판 중단되었다.
Rotashield®는 암포테리신 매질 중에 슈크로스, 모노소듐 글루타메이트, 포타슘 모노포스페이트, 포타슘 다이포스페이트, 소 태아 혈청 및 네오마이신 설페이트를 포함하는 조성물로 구성된다. 로타바이러스 백신 조성물에 대한 관련 특허 공개공보 WO2000006196A2는, 백신 조성물이 pH 조절제 및 완충제 등, 예를 들어 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리-에탄올아민 올리에이트, 사이트레이트-바이카보네이트 등과 같이 생리학적 조건에 가깝게 하기 위해 필요한 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 포함할 수 있는 것으로, 교시되어 있다. 조성물이 경구 투여되는 경우, 장까지 이동하는 중에 위 산을 부분적으로 중화시키고 재편성 로타바이러스를 보호하기 위해, 개체에게 완충제 용액을 제공하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 용도로 적합한 완충제 용액으로는 소듐 바이카보네이트, 사이트레이트 바이카보네이트 등이 있다.
RotaTeq®는, 5종의 재편성체를 포함하는 소 로타바이러스 균주 WC3, P7[5]G6를 포함하는, Merck & Co.에서 제조된 5가의 인간-소 (WC3) 약독화된 경구 생-재편성 백신으로, 이중 4종은 G1, G2, G3 또는 G4 유래 VP7 유전자와의 재편성체이고, 나머지 하나는 인간 로타바이러스 모 균주 유래의 VP4 P1A[8] 유전자와의 재편성체이며, 나머지는 WC3 보바인 로타바이러스 모 균주의 유전자이다. 백신 제형 (Merck viz.의 대응되는 출원 공개공보 WO1998/13065, WO2001/08495 및 WO2002/011540)은 제형 자체에 완충제가 존재하며 조직 배양 배지에 특정 안정화제를 포함하는데, 완충제는 소듐 사이트레이트와 소듐 포스페이트이다. 특허된 청구항의 카르복실레이트가 사용되며 완충제로 작용함으로써, 바이러스 항원이 유아의 위에 투여되었을 때 로타바이러스 항원이 위의 산성도를 견딜 수 있게 해준다.
또한, Rotarix®는, 89-12 균주로부터 유래되어 계대 배양된 인간 로타바이러스 균주 RIX4414를 포함하는, 1가 백신이다. Rotarix® (제조사: GlaxoSmithKline Biologicals)는, 약독화된 1가 G1, P[8] 인간 로타바이러스 균주를 함유하는 생 백신이다. 이 백신은 안정화제가 혼합된 동결건조된 형태로 이용가능하며, 개체에 투여하기 전에 칼슘 카보네이트계 완충제 희석제를 사용해 재구성되어야 한다.
Rotarix는, 사전 충전된 시린지 안에 수용된 GSK's CaCO3 완충제 1.0 ml를 이용하여, 동결건조된 활성 성분 (RIX4414 균주 + 부형제)을 재구성함으로써 준비된다. 동결건조된 백신이 수용된 바이얼에 완충제를 주입한 후, 바이얼을 잘 흔들어 백신을 현탁시킨다. 현탁된 생성물 전량을 다시 동일 시린지에 빼낸 다음, 시린지의 바늘 (또는 전달 디바이스)은 버리고, 생성물을 신속하게 경구 1회 투여로 투여한다. 다른 예로, 시판 동결건조 백신의 재구성은, 시린지 및 바늘 대신 완충제가 충전된 경구 어플리케이터와 전달 어댑터를 사용해 동일한 과정으로 이루어질 것이다. 재구성된 백신은 외양상 유백색이어야 한다. 입자 물질 및/또는 변색에 대해 육안 검사를 거쳐야 하며, 이러한 상태일 경우 투여해서는 안 된다. Rotarix는 경구 투여하기 위한 것이다. 유아는 뒤로 기대는 자세로 앉아 있어야 하며, 재구성된 백신이 수용된 경구 어플리케이터의 전량이 볼 안쪽 면을 통해 투여되어야 한다. Rotarix는 주사에 의해 투여되어서는 안 된다. 그래서, 완충제 희석제를 이용한 재구성은, 백신의 투여 시점에 재구성이 적절하게 확실하게 행해지도록 하기 위해, 많은 단계를 포함한다는 것은 분명한 사실이다. 이러한 요인들 모두 궁극적으로는 백신 순응도의 저하를 유발하여, 완전한 방제를 달성하기 보다는 로타바이러스 감염을 부분적으로 예방하게 된다.
로타바이러스 백신 제형에 대한 GSK의 특허 출원 WO2001/012797, WO2005/02133, WO2006/087205에서는, 특정 돌연변이를 가진 연속 계대 배양된 약독화된 로타바이러스 생 균주 P43을 이용하고, 재구성을 위해 제산제 완충제가 추가된다. 상기한 로타바이러스 균주 G 단백질 (VP4 및 VP7)은 4종 이상의 다른 로타바이러스 균주 내지 G1과 G2 - G14 혈청형 중 적어도 하나에 대해 면역 반응을 유발할 수 있다.
또한, 어린 아이로부터 분리된 인도 무증상 균주 116E를 이용한 안정제와 완충제가 포함된 Bharat Biotech International Limited 사의 특허 출원된 또 다른 로타바이러스 백신 조성물 역시 개시되어 있다. 이 조성물은 백신을 투여하기 전에 위의 pH를 높이기 위해 백신 접종자에게 제산제 완충제를 별도로 투여하여야 하며, 이 제산제 완충제는 로타바이러스 백신 항원을 투여하는 시점에 위 산성도를 중화하기 위한 사이트레이트-포스페이트 완충제이다. 특허 공개공보 WO2013160913은 로타바이러스 항원, 안정화제 및 새로운 특정 완충제 조합을 포함하는 로타바이러스 백신 조성물을 제공한다. 이 특허에서 완충제는, 백신을 투여하기 전에 별도로 제산제를 투여할 필요없이, 위의 높은 산성 pH를 중화하기 위해, 로타바이러스 백신 조성물과 사전-혼합된다.
즉, 여러가지 로타바이러스 백신들이 인간 및 동물 재편성 타입 등의 여러가지 균주들을 이용해 개발되어 왔다는 것은 분명하다. 이러한 균주들의 특성에는 몇가지 중요한 차이점이 있는데, 대표적인 차이점들은 아래 열거된 바와 같다.
| 인간 균주를 이용한 로타바이러스 백신 | 동물 재편성 로타바이러스 백신 |
| 자연 감염은 이후 로타바이러스 질환에 대해 예방을 제공한다 | 동물 로타바이러스는 천연적으로 약동화된 균주로, 인간에서 복제성이 낮다 |
| 인간 바이러스는 숙주에서 높은 복제력을 가지므로, 복수의 숙주에서 여러번의 조직 배양 계대를 통해 약독화시킨다. 이는 인간 균주이므로, 10^4 FFU/0.5 ml의 백신 역가는 인간에서 로타바이러스 감염에 대한 필요한 면역원성을 유발하는데 충분하다 | 동물 재편성 균주를 포함하는 로타바이러스 백신은 필요한 면역 반응을 유도할 수 있도록 매우 높은 백신 역가가 필수적이다 |
| 넓은 면역은 다양한 면역 작동자 기전을 통해 획득된다 | 장 내강 내 중화 항체가 필요할 것으로 예상됨. 달성되는 면역성은 인간 균주를 이용한 백신만큼 높지 않다 |
| 넓은 면역을 통해 헤테로타입 예방이 달성된다. 이는, 여러가지 균주에 대한 교차 면역을 제공한다는 것을 의미한다 | 재편성 백신 구조체는 공통 인간 로타바이러스 항원을 포함한다 |
표 1: 인간 1가 백신과 동물 재편성 백신의 차이점
본 발명에 대한 근거
즉, 로타바이러스가 산성 환경에 매우 민감하다는 것은 공지의 사실이다 (Estes, M., Graham, D., Smith, E. and Gerba, C. (1979). Rotavirus Stability and Inactivation. Journal of General Virology, 43(2), pp.403-409). 또한, pH 3.0 미만인 환경에 노출되면, 유아의 위장염 바이러스가 불안정해지고 외막과 캡소머가 분해된다는 것도 보고된 바 있다 (Palmer, E., Martin, M. and Murphy, F. (1977). Morphology and Stability of Infantile Gastroenteritis Virus: Comparison with Reovirus and Bluetongue Virus. Journal of General Virology, 35(3), pp.403-414). 또한, 다수의 로타바이러스 균주들이 pH2 환경에 노출되면 1분 이내에 불활성화되는 것으로 보고되었으며, 비슷한 결과는 pH 1.8의 인간 위액에서 확인되었다 (Weiss, C. and Clark, H. (1985). Rapid Inactivation of Rotaviruses by Exposure to Acid Buffer or Acidic Gastric Juice. Journal of General Virology, 66(12), pp.2725-2730). 나아가, 인간 혈청형 1 로타바이러스가 pH 2.5 환경에 노출되면 완전히 불활성화된다는 것도 보고되어 있다 (Meng, Z., Birch, C., Heath, R. and Gust, I. (1987). Physicochemical Stability and Inactivation of Human and Simian Rotaviruses. Applied and Envirnmental Microbiology, 53(4), pp.727-730). 로타바이러스는, 일반적으로, 산성 환경에 노출되면, 매우 불안정해지고, 빠르게 불활성화되는 것으로 알려져 있다. 소 기원의 로타바이러스 3종과 영장류 기원의 수종의 로타바이러스에 대한 불활성화 속도는 pH 2.0, pH 3.0 또는 pH 4.0에 노출시켜 측정되었다. 각각의 로타바이러스는 pH 2.0 (정상적인 공복 위와 가장 비슷한 산성도)에서 매우 신속하게 불활성화되며, 감염성의 반감기는 1분 이하로 측정되었다. 각 로타바이러스는 pH 3.0에서는 훨씬 느리게 불활성화되고; pH 4.0에서는 불활성화가 최소 수준이었다. 여러가지 로타바이러스 균주들 간의 일부 내산성 차이도 검출되었다. 이러한 측정은 실온 (23℃)에서 수행되었지만, 다양한 온도에서의 실험 결과, 정상적인 체온 (37℃)에서는 산에 의한 바이러스 불활성화가 훨씬 빠른 속도로 이루어졌다. pH 1.8 또는 pH 2.1의 일반적인 인간 위액에 노출된 로타바이러스에 대한 연구에서, 동일한 pH의 글리신 완충제를 이용한 실험에서 관찰된 결과와 비슷한 바이러스 불활성화 속도가 확인되었다 (참조: Geigy Scientific Tables, volume 1, 1981, page 126).
로타바이러스 불활성화는 pH 2.0 - pH 3.0에서 발생하지만, pH 4.0에서도 불활성화가 최소한으로 발생하거나 또는 발생하지 않는다. 위는 상당한 위산 환경을 가지고 있기 때문에, 지금까지는 로타바이러스 백신 제형에 완충제의 첨가가 필수적이었으며, 로타바이러스 제형 내 완충제는 로타바이러스 백신 제형의 pH를 일정하게 유지시켜 백신 제형의 제산력 또는 완충력을 발휘할 수 있게 해준다. 로타바이러스 백신의 제산력 (산 중화력이라고도 함)은 GSK 특허에서 Baby Rossett Rice 분석으로 측정된다. 소정의 제형의 산 중화력은 pH를 4.0 이상으로 유지시키는 측정 시간으로 정의되며, Baby Rossette Rice 분석으로 측정된다. Baby Rosset 분석은 인간 위의 산성 환경을 시뮬레이션하는 것으로 보고되어 있다. GSK의 최근 특허 US8821891B2에서는, 인간 1회 투여량 1.5 ml 수준의 용량 부피에서, 포스페이트의 농도는 줄이고 카르복실레이트 바람직하게는 아디페이트는 100 mM - 1M, 바람직하게는 400 mM - 700 mM 범위로 농도를 높인, 로타바이러스 백신을 개시하였다. 아디페이트는 높은 위 산성도 (pH 1 - 2)를 견딜 수 있는 완충제로서 작용한다. 인간 위 산성도를 견디는 내산성은 Baby Rosset Rice 분석으로 측정시 8 - 23분으로 측정되며, 이는 로타바이러스 백신을 인간 유아에 투여하였을 때 백신 제형 내 로타바이러스 항원의 불활성화를 피할 수 있으며 피할 수 있을 만큼 충분하다고 할 수 있다.
따라서, 로타바이러스 감염에 대해 예방을 부여하기에 충분한 면역원성 반응을 유발할 수 있는 로타바이러스 백신을 효과적으로 투여하기 위해서는, 로타바이러스 항원이 위의 높은 산성 환경을 효과적으로 통과할 수 있도록 경구 투여시 인간 투여 당 로타바이러스 백신 또는 재구성된 백신 제형이 적어도 1.5 - 2 ml 필요하다. 그러므로, 지금까지 이용가능한 로타바이러스 백신에 대한 현재의 특성 상태에 대한 전술한 설명들을 통해, 당해 기술 분야의 당업자라면, 로타바이러스 항원이 매우 산에 약한 항원이고, 로타바이러스 백신의 투여시 항상 제산제 또는 완충제 성분이 필요하며, 따라서 백신 투여의 필수 용량 (단위 백신 당 부피량)이 커진다는 것을, 쉽게 파악 및 이해할 것이다.
또한, 로타바이러스 항원은 매우 불안정한 바이러스이라는 것 역시 사실이며, 약독화된 로타바이러스 생백신 항원이 더 불안정할 것이라는 상황을 감안하면, 로타바이러스 항원에는 백신 제형을 안정화하기 위한 각각의 전용 백신 안정화제가 제공되며, 이는 역시 단위 백신 당 부피 측면에서 백신의 투여량을 증가시킨다. 또한, 완충제 또는 제산제를 포함하거나 또는 백신을 완충제 기반의 백신 희석제를 이용한 재구성이 필요할 경우, 단위 백신 당 부피 측면에서 백신의 투여량을 증가시킨다. 그래서, 완충제/제산제 없이 로타바이러스 백신이 제공한다면 단위 백신 당 투여량 부피는 확실히 줄어들 것이다. 동시에, 완충제를 사용하지 않는 로타바이러스 백신은 로타바이러스 백신의 효능 및 안정성과 반드시 타협해서는 안된다.
로타바이러스 백신 접종자 개체는 항상 6주 내지 6개월 연령대의 유아이므로, 입으로 전달된 로타바이러스 백신 제형의 상당량이 흘러나올 가능성이 존재한다. 이로써 백신은 일부만 투여될 수 있으며, 따라서 백신 순응도가 떨어지고, 백신 접종에도 불구하고 질병 부담을 예방하지 못한다. 따라서, 단위 로타바이러스 백신 당 투여 용량을 백신 제형의 효능을 손상시키지 않는 범위내에서 가능한 많이 줄이는 것이 항상 바람직하다. 현재, 로타바이러스 백신에 대한 최신 기술에 언급된 최소 투여 용량은 1.5 ml - 2.5 ml 범위이다. 이 백신에는 백신의 총 투여 용량까지 첨가되는 백신 안정화제와 백신 완충제가 포함되어 있다. 그래서, 유아에서 로타바이러스 감염 예방에 필요한 면역원성을 유발하기 위한 능력과 동일한 능력을 가진 로타바이러스 백신의 단위 로타바이러스 백신 당 투여 용량 감소는 유아에 투여된 백신 제형이 흘러나올 가능성을 줄여줄 것이다. 따라서, 완충제 또는 제산제를 사용하여 준비되고 단위 백신 당 용량 부피가 큰 로타바이러스 백신(들)과 동일하거나 또는 오히려 더 효과적인, 완충제를 사용하지 않는 인간 투여 당 최대 1 ml, 바람직하게는 단 0.8 ml, 가장 바람직하게는 단 0.5 ml의 저 용량의 로타바이러스 백신 제형을 이용가능하게 만드는 것은, 충분히 자명하지 않을 것이다.
선행 기술은 5±3℃의 냉장 온도에서 액체 제형 형태로 안정화되거나, 또는 백신을 적절한 희석제와 함께 투여하기 전에 백신의 재구성이 필요한 동결건조된 산제로서 안정화되는, 모든 로타바이러스 백신 제형들을 개시하고 있다. 동결건조된 산제의 경우 백신의 재구성에 특별한 기술과 관리가 필요하다는 것은 이미 논의된 바 있다. 또한, 백신과 더불어 별도의 희석제 제조 필요성은 백신 제조 단가 뿐만 아니라 수송 비용을 두배로 증가시킨다. 기술, 관리 및 웨어하우스 요건 (warehouse requirement)에 적절한 기반시설의 부족 역시 동결건조된 로타바이러스 백신 공급과 관련된 문제를 추가시킨다. 5±3℃에서 액체 백신은, 백신의 유효 기간이 불과 최대 2년으로 제한된다. 또한, 2-8℃에서 이용가능하게 제조된 백신은 부적절한 보관 및 수송 시 역가 감소도 발생한다. 그러나, -20℃의 로타바이러스 백신 제형은 수송 및 보관 손실이 전혀 없는 것으로 확인되었다. 백신 오염 가능성 역시 -20℃ 백신의 경우 상당한 수준으로 떨어진다. 또한, -20℃의 백신 공급 시설은 이미 전세계 거의 120여 국가들에 소아마비 백신 공급시설에 확립되어 있다. 따라서, 소아마비 백신 시설과 비슷한 백신 보관 및 백신 공급 시설이 이미 존재하므로, 전세계적으로 로타바이러스 질병 부담을 줄이는데 크게 도움일 될 것이다. 로타바이러스 백신의 안정성을 추가로 증가시켜, 가장 외딴곳에서도 이용가능할 수 있는, 대안적인 전략 개발이 요망되고 있다. 이에, 본 특허 출원에서는, 적어도 5년간 안정적이며, 전혀 새로운 것이며 당해 기술 분야의 현재 기술 수준에서 전혀 언급된 바 없는, 새로운 로타바이러스 백신 제형을 개시한다.
본 발명의 주요 목적은 완충제를 사용하지 않으며 산 안정적인 로타바이러스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 주요 목적은 1 ml 이하 또는 심지어 단 0.8 ml, 바람직하게는 0.5 ml의 투여 용량이 작은 저 투여 용량의 로타바이러스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 투여 당 0.5 ml 수준의 백신 부피로 사용되는 안정적인 로타바이러스 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 백신 접종자에서 내뱉어지는 로타바이러스의 유출을 줄여 백신 낭비 문제를 최소화하고, 그에 따라 백신 순응도를 높이는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 백신 투여 전 또는 투여 중에 임의의 특별한 희석 또는 재구성 기술이 필요없는 로타바이러스 백신 조성물을 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 -20℃에서 적어도 5년간 안정적인 로타바이러스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 5±3℃에서 2년간, 25℃에서 6개월간, 37℃에서 1주일간 안정적인, 저-투여 용량의 로타바이러스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, pH 2 - pH 4에서 위에서 20분 이상 안정적인, 완충제를 사용하지 않는 최대 1 ml의 저-투여 용량을 가진 로타바이러스 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 완충제 또는 산 안정화제의 첨가없이 pH 2 - pH 4의 산성 pH에서 안정적인, 완충제를 사용하지 않는 최대 1 ml의 저-투여 용량을 가진 로타바이러스 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 백신의 개체 투여 전, 투여 중 또는 투여 후 어떠한 제산제 또는 완충제를 투여할 필요가 없는, 완충제 비-사용의, 산 안정적인, 저-투여 용량을 가진 로타바이러스 백신 조성물을 제공하는 것이다.
다른 예로, 본 발명의 목적은 완충제를 사용하면서도 0.5 ml의 저 투여 용량을 가지며, 인간에서 로타바이러스 감염을 동일하게 효과적으로 방지하는, 로타바이러스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 백신 조성물에 제산제 또는 완충제가 첨가된 로타바이러스 백신과 비슷하거나 더 강력한 면역 반응을 구축할 수 있는, 완충제가 사용되지 않는 저-투여 용량의 로타바이러스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명은, 일 구현예에서, pH 2-4에서 1시간 이상의 기간 동안 로타바이러스 백신의 역가 감소가 0.5 ml 당 0.55 FFU 이하인, 백신 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, pH 2-4에서 20분 이상의 기간 동안 로타바이러스 백신의 역가 감소가 0.5 ml 당 0.68 FFU 이하인, 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은, 또 다른 구현예에서, 어떠한 완충제 또는 제산제도 사용하지 않으며, 30분 동안 pH 2 및 pH에서 실질적인 감소가 없는 (nominal drop), 1 ml - 0.5 ml 범위의 투여 용량을 가지는 다양한 로타바이러스 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은, 또 다른 구현예에서, Baby Rosset Rice 분석에 의해 확립된, 완충제가 존재하는 로타바이러스 백신 조성물과 비교해, 단위 백신 당 0.5 ml - 1 ml의 투여 용량이 작은 로타바이러스 조성물의 산 중화력을 제공하는 것이다.
본 발명은, 다른 구현예에서, 완충제가 존재하거나 또는 제산제의 투여시 백신 제형으로 달성되는 혈청변환 (serconversion)과 비교하여, 비슷하거나 또는 4배 높은 수준으로 면역 반응을 백신 접종 후 구축할 수 있는, 투여 용량이 0.5 ml에 불과한 완충제를 포함하지 않는 로타바이러스 백신을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 로타바이러스 백신 제형에 어떠한 완충제 제형이 존재하지 않는, 로타바이러스 균주 116E; 슈크로스, 락토스 및 트레할로스로부터 선택되는 당의 조합물; 락트알부민 가수분해물; 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는, 안정화된 로타바이러스 백신 제형을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서 로타바이러스성 설사 (rotaviral diarrhea)를 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 또 다른 구현예에서, 적어도 5년간 -20℃에서 안정적인 안정한 로타바이러스 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예는 2-8℃, 25℃ 및 37℃에서 각각 2년, 6개월 및 3주간 안정적인, 안정한 로타바이러스 백신 조성물을 제공한다.
구현예 1: 완충제 사용된 로타바이러스 제형 및 위 산성도
본 발명의 배경기술에서 언급한 바와 같이, 완충제를 사용하는 것이 실제 일반적인 로타바이러스 백신 제형의 전략이며, 지금까지 다양한 로타바이러스 백신 제형의 제조사들에 의해 채택되고 있어, 116E 균주를 포함하는 -20℃ 로타 백신 제형 (SPG 및 DMEM)을 먼저 사이트레이트-바이카보네이트 완충제 및 생리식염수 조건에서 테스트하였다.
Bharat Biotech International Limited 사는 미국 베데스다 NIH NIAID (National Institute of Allergy and Infectious Disease)의 물질 이송 동의 하에 국립 보건기구로부터 인간 로타바이러스 균주 116E를 입수하였다. 로타바이러스 균주 116E의 전체 게놈 서열은 이미 문헌에 보고되어 있다.
-20℃에서 보관되는 로타바이러스 116E를 포함하는 3가지 로타바이러스 백신 제형을 후술한 바와 같이 3가지 그룹 (그룹 I, II 및 II)으로 채택하였다. 이들 3가지 그룹들에서 로타바이러스 백신 조성물은 10% SPG (슈크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트 및 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트)에 용해된 균주 116E의 약독화된 생 로타바이러스 항원과 둘베코의 최소 필수 배지로 구성된다. 이들 백신 제형은 후술한 바와 같이 각각 처리하였다:
그룹 I: 로타바이러스 116 E 제형 0.5 ml, -20℃.
그룹 II: 로타바이러스 116 E 제형 A 2 ml (인간 1회 투여 0.5 ml의 4배 투여량에 해당됨) + 생리식염수 5 ml.
그룹 III: 로타바이러스 116 E 제형 A 0.570 ml + 믹스 [사이트레이트-바이카보네이트 완충제 1.42 ml + 34.8 mEq HCl 8 ml].
전술한 바와 같이, 그룹 I은 백신 제형에 완충제 또는 식염수가 첨가되지 않은 -20℃의 로타바이러스 백신 제형으로, 백신 역가는 이후 120분간 측정하였다. 그룹 II의 경우, 로타바이러스 116E 백신 제형 (-20℃에서 보관) 2 ml을 취하고 생리식염수 5 ml을 첨가하였으며, 백신 역가는 최대 120분까지 타겟 역가 10^6 FFU/ml로 측정되었다. 그룹 III의 경우, 로타바이러스 116E 백신 제형 (-20℃에서 보관) 0.57 ml을 취하고, 여기에 사이트레이트 바이카보네이트 완충제 1.42 ml과 34.8 mEq 염산 8 ml을 첨가하였다.
| 그룹# | FFU/0.5 ml 중에 0분 | FFU/ml 중에 60분 | FFU/ml 중에 120분 |
특이사항
|
| 그룹 I | 106.35 | 106.17 | 106.32 | 매우 안정적임 |
| 그룹 II | 105.76 | 105.84 | 105.69 | 충분히 안정적임 |
| 그룹 III | 104.61 | 105.30 | 105.11 | 충분히 안정적임 |
표 2: 완충제의 존재 하에 0분, 60분 및 120분 경과시, 로타바이러스 백신 제형 (보관 온도: -20℃)의 백신 역가.따라서, 전술한 표에 따르면, 바이러스를 생리식염수 조건 또는 완충제 용액의 존재 조건에 노출시킬 경우, 로타바이러스 항원 역가는 안정적이며, 즉 백신은 안정적인 것으로 확인된다.
구현예 2: 여러가지 pH에서 로타바이러스 백신 제형의 면역퍼옥시다제 분석
실시예 1: 로타바이러스 백신 제형에 34.8 mEq 염산 (HCl)를 직접 첨가하여 로타바이러스 백신 제형을 산성 환경에 직접 노출시킨 후 면역퍼옥시다제 분석을 수행하였다. 백신 제형에 산을 직접 첨가하여 백신 제형의 pH를 pH 7에서 pH2 및 pH4의 다양한 더 낮은 pH 값으로 직접 낮춘 다음 백신 항원 역가를 소정의 낮은 pH 값, 즉 pH 2 및 pH 4에서 측정하였다. 그런 후, 백신 역가를 소정의 낮은 pH, 즉 pH 2 및 pH 4에서 최대 1시간 동안 측정하였다. 추적 관찰하였다. 다양한 시점과 다양한 pH 수준에서 반응 혼합물을 테스트하였다. 상세 내용은 아래 표에 나타낸다. 본 로타바이러스 백신 제형 (보관 온도 -20℃)은 약독화된 생 로타바이러스 항원 116E, 둘베코의 최소 필수 배지에 용해된 10% SPG (소듐 포스페이트 글루타메이트)를 포함한다.
| 샘플 상세 내용 | FFU/0.5 mL 용량의 역가 | 특이사항 |
||||
| 실제 역가, 0분 | 희석 인자로 보정한 역가, 0분 | 1시간 후 실제 역가 | 희석 인자로 보정한 역가, 1시간 후 | 1시간 후 Log 감소 | ||
| 0.5 ml 로타바이러스 116E 백신 제형, pH 7.4 | 104.95 | NA | 104.94 | 104.94 | - | - |
| 0.5 ml 로타바이러스 116E 백신 제형 + 34.8 mEq HC, pH 4.0 | 103.58 | 105.05 | 103.58 | 105.05 | Nil | pH 효과 없음 |
| 0.5 ml 로타바이러스 116E 백신 제형 + 34.8 mEq HCl, pH 2.0 | 103.54 | 105.01 | 102.93 | 104.40 | 0.55 | pH 효과 미약 |
표 3: 로타바이러스 백신 제형에 직접 산 첨가에 따른 0분 및 60분 경과시 타겟 역가 10^5.0 FFU/0.5 ml에 대한 면역퍼옥시다제 분석 결과 (보관 온도: -20℃).
주석: 희석에 따라 계산된 감염 역가 감소 = 101.47 FFU. 따라서, 희석 후 실제 백신 역가는 pH2에서 102.93이다. 샘플들은 모두 3세트로 면역퍼옥시다제 분석으로 역가를 측정하였다. 경구 로타바이러스 백신 (타겟 역가 105.0 FFU / 0.5 mL)은 pH 4.0에서 안정적이었다. 타겟 역가는, 소정의 바이얼에서 달성되도록 의도된 백신 바이얼 내 로타바이러스 116E 항원의 최소 농도를 의미한다. 중성 pH에서 백신의 오리지날 역가는 0분에 104.95 FFU/0.5 ml이다. 백신은 pH2에서 0분 역가는 103.54 FFU/0.5 ml이고, 1시간 이내에 102.93 FFU/0.5 ml로 떨어진다. 그래서, 산 첨가에 따른 희석 인자 1.47를 실제 역가 값 (102.93 FFU/0.5ml)에 적용하면, 산 첨가 후 1시간 경과시 pH2에서 보정된 백신 역가는 104.40이며, 이를 pH7에서 0분 오리지날 백신 역가 104.95와 비교한다. 즉, pH 2.0에서 1시간 내에, 백신의 역가는 총 0.55의 log 감소를 나타내었다. 이는, pH2 보다 낮은 pH, 즉 인간 위에서 관찰되는 특수한 산성 환경에서도, 로타바이러스 백신 제형이 백신 역가를 104.40 FFU/0.5 ml로 유지할 수 있다는 것을, 의미한다. 이러한 백신 역가에서, 백신은 후속적인 로타바이러스 감염에 대해 충분한 면역 반응을 구축할 수 있다. 104.0 역가의 Rota 116E 백신으로 수행한 임상 실험에서, 백신은 약 62%의 4배-혈청변환을 나타내었으며, 이는 꽤 고무적인 결과이다 (Nita Bhandari et al, J Infect Dis 2009, 200, 421-9).
실시예 2: 타겟 역가가 10^6.0 FFU/0.5 ml (용량)인 다른 백신 (보관 온도 -20℃)으로 동일한 실험을 반복 실시하였다. 희석 인자에 따라 계산된 역가 값을 아래 표에 0분 및 1시간 경과시 다양한 pH 조건에서 나타낸다. 이러한 로타바이러스 백신 제형 (보관 온도 -20℃)은 약독화된 생 로타바이러스 항원 116E와 DMEM에 용해된 10% SPG를 포함한다.
| 백신 샘플에 대한 상세 내용 | pH | FFU/0.5 ml 중의, '0시간 희석 인자에 따라 보정된 역가' | FFU/0.5 ml 중의, '1시간 경과시 희석 인자에 따라 보정된 역가' | 1시간 후 Log 감소 | 특이사항 |
| 0.5 ml 로타바이러스 116E 백신 제형 |
7.2 | 105.35 | 105.30 | 0.05 (손실 무) |
pH 효과 없음 |
| 0.5 ml 로타바이러스 116E 백신 제형 + 34.8 mEq HCl | 4.0 | 105.33 | 105.09 | 0.24 (한계 손실) | pH 효과 없음 |
| 0.5 ml 로타바이러스 116E 백신 제형 + 34.8 mEq HCl | 2.0 | 104.89 | 104.21 | 0.68 (한계 손실) |
pH 효과 미약 |
표 4: 로타바이러스 백신 제형에 직접 산 첨가에 따른 0분 및 60분 경과시 타겟 역가 10^6.0 FFU/0.5 ml에 대한 면역퍼옥시다제 분석 결과 (보관 온도: -20℃).
결론: 백신 샘플은 pH 4에서 백신 역가의 log 감소가 0.24에 불과하며, 이는 실제 조건에서 pH에 대한 효과가 1시간 동안 유지되는 것으로 간주된다. pH 2.0일 경우, 0시간째 log 역가 감소는 0.46였으며, 1시간 경과시 감소는 0.68 log10 FFU이었다. 이는, pH 2의 낮은 산성 pH에서 백신 역가에 대한 pH 효과가 매우 미미하다는 것을, 의미한다.
상기 표에 나타낸 바와 같이, pH2에서 백신 역가 10^4.89 FFU/0.5ml은 여전히 역가 10^4.21 FFU/0.5 ml까지 유지되며; log 역가 4.89-4.21은 6개월에서 2세 연령대 유아의 위장에서 로타바이러스를 복제하기에 충분히 양호한 값이다. 유아의 위 산성도는 시뮬레이션한 위 환경인 pH 2이다. 이 백신은 여전히 4.89 Log 10 FFU/0.5 ml의 역가로 생존할 수 있는데, 이는 위를 통과해 장 융모에 도달하여, 유아에서 면역 반응을 구축하기 위해 추가적으로 로타바이러스를 복제하며, 그래서 로타바이러스성 위장염에 대한 보호 및 예방을 부여하기에 충분하다. 따라서, 본 백신은 백신 역가에 전혀 어떠한 상당한 손실 없이 적어도 1시간 동안 pH2의 산성 환경에서 안정적인 것으로 확인되었다.
구현예 3:
로타바이러스 116E 백신에 제산제가 필요없음을 입증하기 위한 시험관내 실험:
명세서에 후술한 임상 실험 결과의 결론과는 별개로, 완충제의 사용없이 백신을 직접 투여하는 비슷한 위 산성도 조건들을 시뮬레이션하는 시험관내에서도 입증되었다.
실시예 3.1: 로타바이러스 116E, 슈크로스 (50%), 락토스 (0.5%) 및 트레할로스 (0.5%)의 조합물, 락트알부민 가수분해물 (1 %), 인간 혈청 알부민 (0.4%)을 포함하는 백신 (제형 3A) 1 mL을 취하고, 여기에 0.1 N HCl 1.25 mL을 첨가한 다음 잘 혼합하였다. 샘플을 취하여, 다양한 시간 간격으로 다양한 pH 수준에서 바이러스 함량을 검사하였다. 그 결과는 아래 표 5.1에 나타낸다.
| 샘플 번호 | 샘플의 상세 내용 | 바이러스 함량 (FFU/mL) |
| 1 | pH 2.0-0분 | 5.72 |
| 2 | pH 2.0-10분 | 4.78 |
| 3 | pH 2.0-30분 | 3.84 |
| 4 | pH 3.0-0분 | 5.96 |
| 5 | pH 3.0-10분 | 5.96 |
| 6 | pH 3.0-30분 | 5.91 |
| 7 | 대조군 | 6.10 |
표 5.1: 로타바이러스 116E를 포함하는 백신 (제형 3A) 1 ml에 대한 면역퍼옥시다제 분석실시예 3.2: 로타바이러스 116E, 슈크로스 (40%) 및 트레할로스 (0.5%)의 조합물, 락트알부민 가수분해물 (20%), 폴리비닐 피롤리딘 (0.5%)을 포함하는 백신 (제형 3B) 0.8 mL을 취하고, 여기에 0.1 N HCl 1.25 mL을 첨가하여 잘 혼합하였다. 샘플을 취하여, 여러가지 간격으로 다양한 pH 수준에서 바이러스 함량을 검사하였다. 그 결과는 아래 표 5.2에 나타낸다.
| 샘플 번호 | 샘플 상세 내용 | 바이러스 함량 (FFU/mL) | 바이러스 함량 (FFU/0.8mL) |
| 1 | pH 2.0-0분 | 4.71 | 4.62 |
| 2 | pH 2.0- 10분 | 4.69 | 4.60 |
| 3 | pH 2.0- 30분 | 4.41 | 4.32 |
| 4 | pH 3.0-0분 | 5.97 | 5.88 |
| 5 | pH 3.0- 10분 | 5.94 | 5.85 |
| 6 | pH 3.0- 30분 | 5.93 | 5.84 |
| 7 | 대조군 | 6.10 |
표 5.2: 로타바이러스 116E 백신 (제형 3B) 0.8 ml에 대한 면역퍼옥시다제 분석
실시예 3.3: 슈크로스 (60%) 및 트레할로스 (0.5%)의 조합물, 콩 단백질 (20%), 피리독신-HCL (0.1%), 폴리비닐 피롤리딘 (0.25%)을 포함하는 로타바이러스 116E 백신 (제형 3C) 0.5 mL을 취하고, 여기에 0.1 N HCl 1.25 mL을 첨가하여 잘 혼합하였다. 샘플을 취하여, 여러가지 간격으로 다양한 pH 수준에서 바이러스 함량을 검사하였다. 그 결과를 아래 표 5.3에 나타낸다.
| 샘플 번호 | 샘플 상세 내용 | 바이러스 함량 (FFU/0.5 mL) |
| 1 | pH 2.0-0분 | 4.29 |
| 2 | pH 2.0- 10분 | 4.21 |
| 3 | pH 2.0- 30분 | 3.39 |
| 4 | pH 3.0-0분 | 5.20 |
| 5 | pH 3.0- 10분 | 5.17 |
| 6 | pH 3.0- 30분 | 5.08 |
| 7 | 대조군 | 5.80 |
표 5.3: 로타바이러스 116E를 포함하는 백신 (제형 3C) 0.8 ml에 대한 면역퍼옥시다제 분석
실시예 3.4: DMEM에 용해된 10% SPG를 포함하는 로타바이러스 116E 백신 (제형 3D) 0.5 mL을 취하고, 여기에 0.1 N HCl 1.25 mL을 첨가하여 잘 혼합하였다. 샘플을 취하여, 여러가지 간격으로 다양한 pH 수준에서 바이러스 함량을 검사하였다. 그 결과를 아래 표 5.4에 나타낸다.
| 샘플 번호 | 샘플 상세 내용 | 바이러스 함량 (FFU/0.5 mL) |
| 1 | pH 2.0-0분 | 4.78 |
| 2 | pH 2.0- 10분 | 4.48 |
| 3 | pH 2.0- 30분 | 4.29 |
| 4 | pH 3.0-0분 | 5.22 |
| 5 | pH 3.0- 10분 | 5.17 |
| 6 | pH 3.0- 30분 | 4.70 |
| 7 | 대조군 | 5.80 |
표 5.4: 로타바이러스 116E를 포함하는 백신 (제형 3D) 0.8 ml에 대한 면역퍼옥시다제 분석
실시예 3.5: 슈크로스 (40%), 트레할로스 (0.5%), 락토스 (5%), rHSA (0.5%), LAH (1%) 및 완충제 혼합물 (암모늄 아세테이트 + 암모늄 바이카르보네이트 + 다이암모늄 오르토포스페이트)을 포함하는 로타바이러스 116E 백신 (제형 3D) 0.5 mL을 취하고, 여기에 0.1 N HCl 1.25 mL을 첨가하여 잘 혼합하였다. 샘플을 취하여, 여러가지 간격으로 다양한 pH 수준에서 바이러스 함량을 검사하였다. 그 결과를 아래 표 5.5에 나타낸다.
| 샘플 번호 | 샘플 상세 내용 | 바이러스 함량 (FFU/0.5 mL) |
| 1 | pH 2.0-0분 | 4.77 |
| 2 | pH 2.0- 10분 | 4.65 |
| 3 | pH 2.0- 30분 | 4.39 |
| 4 | pH 3.0-0분 | 5.21 |
| 5 | pH 3.0- 10분 | 5.19 |
| 6 | pH 3.0- 30분 | 4.87 |
| 7 | 대조군 | 5.80 |
표 5.5: 로타바이러스 116E를 포함하는 백신 (제형 3D) 0.8 ml에 대한 면역퍼옥시다제 분석
결론: 상기 표에 나타낸 바와 같이, pH 2.0에서, 30분간, 모든 로타바이러스 116E 백신 제형들이 어떠한 완충제 또는 제산제를 사용하지 않고도 견딜 수 있는 것으로 확인된다.
구현예 4: Baby Rossett Rice 분석
BRR 분석은 로타바이러스 백신 제형의 산 중화력에 대한 검증된 절차이다. 사이트레이트 포스페이트 완충제 및 사이트레이트 바이카보네이트 완충제를 포함하는 선택한 백신 제형들을 대상으로 이러한 분석으로 산 중화력을 평가한다. Baby Rosette Rice (BRR) 분석을 이용하여 유아의 위 시뮬레이션 조건 하에 시험관내 실험으로 수행하였다. 산 중화 실험을 위해 다양한 완충제 조합을 포함하는 다양한 제형들을 선택하였으며, 그 결과를 아래 표에 유아의 위를 시뮬레이션하는 다양한 pH에서의 결과로 나타낸다. 백신 제형을 주사용수로 10 ml로 희석한 다음 0.1 N HCl 4 ml을 첨가한 다음, pH가 4.0이 될때까지 0.1 N HCl을 분당 0.5 ml씩 첨가하였다. ANC는 > pH 4.0을 유지하는 시간 (분)으로서 정의된다.
| 백신 제형 4A | 로타바이러스 항원 116E의 타겟 역가 10^6 FFU/0.5ml; 10% SPG, 및 DMEM (충분량) |
| 백신 제형 4B | 로타바이러스 항원 116E 타겟 역가 10^6 FFU/0.5ml; 10% SPG, 및 DMEM (충분량)를 사이트레이트 바이카보네이트 완충제 2.5 ml에 첨가하였다. |
| 백신 제형 4C | 로타바이러스 항원 116E 타겟 역가 10^6 FFU/0.5ml, 2종 이상의 당 조합물 (슈크로스 50% 및 트레할로스 0.5%) 및 락트알부민 가수분해물 0.5% (아래 샘플 8). |
| 백신 제형 4D | 로타바이러스 항원 116E 타겟 역가 10^6 FFU/0.5ml, 2종 이상의 당 조합물 (슈크로스-40%, 트레할로스-0.5%), 0.5% 락트알부민 가수분해물, 0.35% 인간 혈청 알부민 및 1.1M 포스페이트 완충제. |
표 6: 백신 제형에 대한 상세 내용:
상기한 백신 제형 4A - 4D를 대상으로 Baby Rosset Rice 분석을 수행하여 다음과 같은 결과를 관찰하였다 (표 7).
| 백신 제형 | 초기 pH | 산 첨가 후 pH | 0.1N HCl 첨가량 | Baby Rosset Rice 분석 결과 | 백신 초기 역가, FFU/0.5 ml | FFU/0.5 ml에서 1시간 후 백신 역가 |
| 백신 제형 4A, -20℃, 완충제 무첨가, 용량 0.5 mL | 7.48 | 1.95 | 4.0 mL | BRR = 0분 미만 (pH에 즉시 감소) | 10^4.83 | 10^3.83 |
| 백신 제형 4B, -20℃, 사이트레이트 바이카보네이트 완충제 2.5 ml/용량 0.5 mL | 8.35 | 4.22 | 10.0 mL | BRR = 12분 | 10^6.17 | 10^6.15 |
| 백신 제형 4C, 5±3℃, 완충제 무첨가, 용량 0.5 mL | 7.28 | 3.98 | 5.0 mL | BRR = 2분 | 10^5.30 | 10^5.02 |
| 백신 제형 4D, 5±3℃, 완충제 첨가, 용량 1.5 mL 또는 2 mL | 6.75 | 4.33 | 10.5 mL | BRR = 약 13분 | 10^6.12 | 10^6.11 |
표 7: 완충제 첨가 및 무첨가된 로타바이러스 백신 제형들을 비교하기 위한 Baby Rosset Rice 분석.
결론: 상기 표에 나타낸 바와 같이, pH 7.48에서 pH 1.95로의 즉각적인 감소를 보인 백신 제형 4A의 경우에도, 백신 역가는 10^4.83 FFU/0.5 ml 및 10^3.83 FFU/0.5 ml로 유지된다. 동일한 방식으로, 백신 제형 4C의 경우, pH가 2분 이내에 pH 7.28에서 pH 3.98로 감소되었을 때 10^5.30 내지 10^5.02 FFU/0.5 ml에서 유지된다. 따라서, BRR 값이 2분에 불과한 경우에도, 백신 역가는 충실하게, 즉 10^5.02 FFU/0.5 ml로 유지된다. 이러한 높은 백신 역가는 면역 반응을 구축하여, 인간 유아에서 로타바이러스성 위장염을 보호 및 예방하기에 충분하다.
구현예 4: 로타바이러스 116E 균주를 포함하는 ROTAVAC®에 대한 완충제를 사용하지 않을 경우의 임상 실험.
가설 및 실험 근거
로타바이러스의 자연 전파는 변-구강 경로를 통해 이루어지는 것으로 추측된다. 로타바이러스는 일반적으로 산에 약하며, 산성 환경이 바이러스의 생존성에 영향을 미치는 것으로 보인다.
로타바이러스의 산-취약성 특성을 감안하면, 대부분 위의 pH가 약 2인 보편적으로 감염성 포유류들에서 매우 효과적이다. 한가지 가능성은, 유아의 위 pH가 성인 약 1.0과 비교해 약 3.2이기 때문에, 인간 유아의 위가 로타바이러스의 생존에 있어 성인의 위 보다 다소 더 허용적일 수 있다는 것이다. 이는, 보고된 인간 로타바이러스 질병의 60 내지 90%가 3세 미만의 어린이에서 발생한다는 사실을 설명해줄 수 있다.
실험 설계
이 가설을 테스트하기 위해, 대규모 다기관 랜덤 대조군 실험을 수행하여, ROTAVAC를 사이트레이트 바이카보네이트 완충제와 함께 투여받는 개체에서 백신 면역 반응을 평가하고, 완충제없이 ROTAVAC를 투여받은 개체와 비교하였다.
즉, 본 실험은 아래 3가지 처리 그룹을 포함한다:
-
그룹 I (ROTAVAC® 투여한 다음 5분 후 완충제 2.5 ml 투여),
-
그룹 II (완충제 없이 ROTAVAC® 투여),
-
그룹 III (투여 직전에 완충제 2.5 ml과 혼합한 ROTAVAC® 투여).
실험 조사자 및 안전성 평가자 (실험 코디네이터)는 처리 그룹 할당에 대해 맹검이었다. 실험 간호사가 백신을 할당된 처리 그룹에 따라 투여함으로써 맹검으로 수행하였다. 개체들 모두 4주 간격으로 백신을 3회 투여하였다. 백신의 면역 반응은 백신 3차 투여 후 (84일) 4주째에 테스트하였으며, 베이스라인 (0일)과 비교하였다. 처리 그룹들에서, 혈청 항-로타바이러스 IgA의 GMT (Geometric Mean Titre) 및 혈청변환으로, 면역원성을 테스트하였다 (백신접종 전 대비 백신접종 후 항체 수준의 배수 증가).
실험 결과 및 결론
백신 접종 후 면역 반응은 비슷하였으며, 처리 그룹들 간에 항-로타바이러스 IgA 반응에는 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. 중요하게도, 그룹 II (완충제 없이 ROTAVAC® 투여)에서 수득된 혈청변환 및 GMT가 완충제와 함께 ROTAVAC®를 투여한 다른 2가지 처리 그룹들에서의 결과와 비슷하였다.
완충제 없이 ROTAVAC를 투여하는 그룹의 경우, 백신 접종 후 항-로타바이러스 IgA GMT는, 백신 투여하기 5분 전에 제산제를 투여하는 그룹 또는 백신과 동시에 혼합하는 그룹 각각에서의 19.6U/mL 및 19.2U/mL과 비교해, 20.7U/mL이었다 (표 8). 그룹들 간의 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다 (p>0.05, 스튜던트의 t-검정).
표 8: 기하 평균 역가 & 결과들의 95% CI (0일 & 84일)
| 방문 | 그룹 I (N = 290) | 그룹 II (N = 287) | 그룹 III (N = 286) | |||
| GMT | 95% CI | GMT | 95% CI | GMT | 95% CI | |
| 0일 | 10.5 | (9.4, 11.7) | 10.8 | (9.7, 11.9) | 10.2 | (9.2, 11.3) |
| 84일 | 19.6 | (17.0, 22.7) | 20.7 | (17.9, 24.0) | 19.2 | (16.8, 22.1) |
N = 각 그룹의 테스트 개체의 수; GMT = 기하 평균; 95 % CI (LL, UL) = 신뢰구간 (하한, 상한)
마찬가지로, 제산제 완충제 없이 ROTAVAC®를 투여한 그룹과 완충제를 사용해 ROTAVAC®를 투여한 그룹에서 관찰된 4배 혈청변환은 각각 29.2%, 24.5% 및 25.1%로 비슷하였다 (표 9). 또한, 처리 그룹들 간의 혈청변환 (2배) 차이에 대한 95% 신뢰구간의 하한은 >-10%이었으며, 이는 전체 3가지 처리 용법으로 달성되는 면역 반응에서의 비-열등성 (non-inferiority)을 의미한다 (표 10).
표 9: 베이스라인 및 백신접종 후 84일째, 혈청변환 및 95% CI (항체 역가의 2, 3 또는 4배 변화)
| 배수 변화 | 그룹 I (N = 290) | 그룹 II (N = 287) | 그룹 III (N = 286) | |||
| % | 95% CI | % | 95% CI | % | 95% CI | |
| 2 | 30.7 | (25.7, 36.2) | 35.2 | (29.9, 40.9) | 33.5 | (28.3, 39.2) |
| 3 | 27.6 | (22.8, 33.1) | 32.4 | (27.3, 38.1) | 31.8 | (26.7, 37.4) |
| 4 | 24.5 | (19.8, 29.7) | 29.2 | (24.3, 34.8) | 25.1 | (20.5, 30.5) |
N = 각 그룹의 테스트 개체의 수; 95 % CI = 신뢰구간 (하한, 상한)
표 10: 처리 그룹들에서 백신 접종 후 2배 혈청변환 % 차이
기재된 및 비-기재된 이상 반응에 대한 반응원성 및 안전성은 3가지 그룹들에서 비슷하였으며, 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. ROTAVAC® 백신은 제산제 완충제를 사용하거나 또는 사용하지 않고 투여한 처리 그룹들 3가지 모두에서 잘 허용되었다.
구현예 5: 새로운 로타바이러스 116E 제형
37℃, 25℃ 및 2-8℃에서 ORV 116E 액체 제형의 안정성 데이타
투여 용량 0.5 ml의 로타바이러스 백신 제형을 완충제를 사용하지 않거나 (샘플 1-12, 14-26), 혼합 완충제를 사용하여 투여 용량 0.5 ml (샘플 13)로 투여하여, 최대 5년 범위의 장기간 동안 로타바이러스 백신 제형을 검사하였으며, 이를 이하 제시한다. 다양한 제형 설명을, 최대 4주 37℃, 6개월 이상 25℃ 및 2-5년간 5±3℃에서의 안정성 결과와 함께, 아래에 나타낸다. 본 실험을 통해, 완충제를 사용하지 않는 투여 용량 0.5 ml의 로타바이러스 백신 제형은 적어도 2년간 냉장 온도에서 장기간 특성이 안정적인 것으로, 확인된다. 또한, 로타바이러스 백신 제형은 냉장 온도에서 5년간 안정적인 것으로 물론 확인된다.
샘플 1은 로타바이러스 116E, 슈크로스 50%, 락토스 0.5%, HSA 0.5% 및 락트알부민 가수분해물 0.05%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 1의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 24M | 36M | 60M |
| 5±3℃ | 6.02 | 6.0 | 6.43 | 6.21 | 6.16 | 6.16 | 6.07 | |||
| 25℃ | 6.02 | 6.07 | 5.81 | 5.9 | 5.51 | 4.65 | ||||
| 37℃ | 6.02 | 5.32 | 2.63 |
샘플 2는 로타바이러스 116E, 슈크로스 50%, 트레할로스 0.5%, HSA 0.5% 및 락트알부민 가수분해물 0.5%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 2의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 24M | 36M | 60M |
| 5±3℃ | 6.09 | 6.14 | 6.19 | 6.07 | 6.10 | 6.05 | 6.01 | |||
| 25℃ | 6.09 | 6.02 | 6.06 | 5.63 | 5.51 | 2.48 | ||||
| 37℃ | 6.09 | 5.47 | 3.23 |
샘플 3은 로타바이러스 116E, 슈크로스 50%, 트레할로스 1.0%, HSA 0.5% 및 락트알부민 가수분해물 0.5%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 3의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 24M | 36M | 60M |
| 5±3℃ | 6.22 | 6.24 | 6.26 | 6.14 | 6.20 | 6.13 | 6.04 | |||
| 25℃ | 6.22 | 6.18 | 6.15 | 5.80 | 5.34 | 2.03 | ||||
| 37℃ | 6.22 | 5.35 | 3.22 |
샘플 4는 로타바이러스 116E, 슈크로스 40%, 락토스 0.5%, 및 락트알부민 가수분해물 1.0%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 4의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 15M | 24M | 60M |
| 5±3℃ | 6.19 | 6.18 | 6.08 | 6.21 | 6.24 | 6.12 | ||||
| 25℃ | 6.19 | 5.66 | 5.10 | 4.8 | 3.01 | |||||
| 37℃ | 6.19 | 4.23 | 2.01 |
샘플 5는 로타바이러스 116E, 슈크로스 40%, 말토스 5.0% 및 락트알부민 가수분해물 1.0%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 5의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 15M | 24M | 60M |
| 5±3℃ | 6.35 | 6.37 | 6.18 | 6.01 | 6.17 | 6.08 | ||||
| 25℃ | 6.35 | 5.89 | 5.11 | 4.77 | 2.43 | |||||
| 37℃ | 6.35 | 5.31 | 3.58 |
샘플 6은 로타바이러스 116E, 슈크로스 40%, 트레할로스 0.5% 및 락트알부민 가수분해물 1%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 6의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 15M | 24M | 60M |
| 5±3℃ | 6.19 | 6.15 | 6.10 | 6.03 | 6.22 | 6.13 | ||||
| 25℃ | 6.19 | 5.87 | 5.43 | 5.12 | 3.25 | |||||
| 37℃ | 6.19 | 4.02 | 2.52 |
샘플 7은 로타바이러스 116E, 슈크로스 40%, 트레할로스 1.0% 및 락트알부민 가수분해물 1.0%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 7의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 15M | 24M | 60M |
| 5±3℃ | 6.34 | 5.79 | 6.00 | 5.55 | 6.07 | 6.09 | ||||
| 25℃ | 6.34 | 6.07 | 5.81 | 5.9 | 5.51 | 4.65 | ||||
| 37℃ | 6.34 | 5.32 | 2.63 |
샘플 8은 로타바이러스 116E, 슈크로스 50%, 트레할로스 0.5%, 및 락트알부민 가수분해물 0.5%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 8의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 15M | 18M | 24M | 36M | 60M |
| 5±3℃ | 6.34 | 6.34 | 6.33 | 6.31 | 6.24 | 6.14 | 6.08 | |||
| 25℃ | 6.34 | 6.32 | 6.14 | 6.01 | 5.25 | |||||
| 37℃ | 6.34 | 5.11 | 4 |
샘플 9는 로타바이러스 116E, 슈크로스 70%, 트레할로스 0.5%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 9의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 15M | 18M | 24M | 36M | 60M |
| 5±3℃ | 6.38 | 6.31 | 6.23 | 6.44 | 6.35 | 6.26 | 6.18 | |||
| 25℃ | 6.38 | 6.41 | 6.35 | 6.23 | 5.57 | |||||
| 37℃ | 6.38 | 5.07 | 4.01 |
샘플 10은 로타바이러스 116E, 슈크로스 50%, 락토스 0.5%, 말토스 0.5%, HSA 0.5% 및 락트알부민 가수분해물 0.05%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 10의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 15M | 18M | 24M | 36M | 60M |
| 5±3℃ | 6.25 | 6.15 | 6.03 | 6.34 | 6.08 | 6.12 | 6.11 | 6 | ||
| 25℃ | 6.25 | 6.14 | 6.27 | 6.12 | 5.88 | |||||
| 37℃ | 6.25 | 5.02 | 4.35 |
샘플 11은 로타바이러스 116E, 슈크로스 50%, 트레할로스 0.5%, 말토스 0.5%, HSA 0.5%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 11의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 24M | 36M | 60M |
| 5±3℃ | 6.68 | 6.62 | 6.95 | 6.84 | 6.64 | 6.65 | 6.37 | 6.72 | 6.05 | |
| 25℃ | 6.68 | 6.50 | 6.20 | 6.04 | 5.32 | 4.47 | ||||
| 37℃ | 6.68 | 6.10 | 5.58 | 4.26 |
샘플 12는 로타바이러스 116E, 슈크로스 50%, 트레할로스 0.5%, HSA 0.5% 및 락트알부민 가수분해물 0.05%를 포함하도록 제형화된다.
샘플 12의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 24M | 36M | 60M |
| 5±3℃ | 6.62 | 6.76 | 6.98 | 7.00 | 6.86 | 6.74 | 5.99 | 6.46 | 6.17 | |
| 25℃ | 6.62 | 6.46 | 6.42 | 5.99 | 5.13 | 3.25 | ||||
| 37℃ | 6.62 | 5.58 | 5.06 |
샘플 13은 로타바이러스 116E, 슈크로스 (40%), 트레할로스 (0.5%), 락토스 (5%), rHSA (0.5%), LAH (1%) 및 혼합 완충제 (암모늄 아세테이트 + 암모늄 바이카르보네이트 + 다이암모늄 오트로포스페이트)를 포함하도록 제형화된다.
샘플 13의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 24M | 36M | 60M |
| 5±3℃ | 6.61 | 6.59 | 6.58 | 6.60 | 6.53 | 6.54 | 6.18 | 6.01 | 5.83 | |
| 25℃ | 6.61 | 6.46 | 6.44 | 5.79 | 5.25 | 4.15 | ||||
| 37℃ | 6.61 | 5.56 | 5.01 |
-20℃에서 샘플 13의 안정성:
| 온도 | 0일 | 1M | 2M | 3M | 6M | 9M | 12M | 24M | 36M | 60M |
| -20℃ | 6.61 | 6.59 | 6.59 | 6.56 | 6.54 | 6.52 | 6.21 | 6.11 | 6.13 | 6.09 |
샘플 14, 15 및 16은 로타바이러스 116E, DMEM에 용해된 10% SPG를 포함하도록 제형화된다. 샘플 14, 15 및 16을 -20℃에서 보관하고, 60개월 동안 안정성을 체크하였다. 백신 제형 13, 14 및 15는 적어도 5년간 -20℃에서 매우 안정적인 것으로 확인된다.
| 백신 샘플 | 0일 | 3M | 6M | 9M | 12M | 24M | 36M | 48M | 60M |
| 샘플 14 (10^4.0 FFU/0,5 mL) | 4.25 | 4.01 | 4.08 | 4.15 | 4.25 | 4.02 | 4.18 | 4.12 | 4.08 |
| 샘플 15 (10^5.0 FFU/0.5 mL) | 5.55 | 5.42 | 5.68 | 5.37 | 5.77 | 5.89 | 5.32 | 5.40 | 5.32 |
| 샘플 16 (10^6.0 FFU/0.5 mL) | 6.12 | 6.12 | 6.06 | 6.33 | 6.36 | 6.27 | 6.15 | 6.11 | 6.05 |
따라서, 투여 용량이 0.5 ml인 다양한 로타바이러스 백신 조성물들이 -20℃에서 5년간, 2-8℃에서 2년간, 25℃에서 6개월간, 그리고 37℃에서 1년간 안정적인 것으로 확인되었다. 백신 제형과 무관하게, 로타바이러스 백신은, 0.5 ml - 1 ml 투여 용량에서, 구현예 3에서 예시된 바와 같이 산 뿐만 아니라 pH 2-4의 범위에서 안정적인 것으로 확인되었다. 이에, 본 출원인은, 백신 조성물의 상세 내용과 무관하게, 약독화된 생 로타바이러스 116E를 포함하는 모든 로타 바이러스 백신이 인간 유아의 위내 강한 산성 환경을 견딜 수 있으며, 로타바이러스 감염에 대한 필수적인 면역 반응을 구축할 수 있다고, 단언한다. 본원에 제시된 백신 제형은 본 발명의 범위와 심층적인 내용을 설명하기 위한 목적으로만 의도된다. 본 출원인은, 구현예 3, 실시예 3 및 구현예 5에서 여러가지 제형화 전략들을 제공하였지만, 가능한 모든 백신 제형들에 대해 상세 내용을 제공하는 것은 비-현실적이다. 따라서, 당해 기술 분야 당업자에 의해 행해지는 로타바이러스 116E 균주를 포함하는 로타바이러스 백신 제형 전략에 대한 가능한 모든 명백한 변형들 모두 본 발명에 포함된다. 약독화된 생 로타바이러스 116E를 포함하는 본 발명에 구체적으로 포함되어 있지 않은 백신 조성물들 역시 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해되고 해석되어야 한다.
Claims (21)
- 완충제를 사용하지 않는 내산성의 로타바이러스 백신으로서,
로타바이러스 균주 116E를 포함하며,
상기 백신의 제형은 로타바이러스에 대해, 완충제를 사용하는 통상의 로타바이러스 백신에 의해 구축되는 면역 반응과 등가이거나 또는 이보다 높은 면역 반응을 유발할 수 있는, 로타바이러스 백신. - 제1항에 있어서,
상기 제형은 상기 로타바이러스 항원을 위 산성도 (stomach acidity)로부터 보호하기 위한 어떠한 종류의 완충제도 포함하지 않는, 로타바이러스 백신. - 제1항에 있어서,
상기 백신의 제형이 제산제 또는 완충제의 보충 없이, 위내 pH 2 - pH 4에서 역가의 감소없이 안정적이며, 인간의 위 산성도를 적어도 20분간 견딜 수 있는, 로타바이러스 백신. - 제1항에 있어서,
상기 백신은 개체에 백신 투여 전, 투여 중 또는 투여 후 제산제 또는 완충제의 사용이 필요없는 것인, 로타바이러스 백신. - 로타바이러스 116E를 포함하며,
단위 백신 당 투여 용량이 1 ml 이하인, 로타바이러스 백신. - 제5항에 있어서,
상기 단위 백신 당 투여 용량이 단위 백신 당 0.8 ml인, 로타바이러스 백신. - 제5항에 있어서,
상기 단위 백신 당 투여 용량이 단위 백신 당 0.5 ml인, 로타바이러스 백신. - 제1항 또는 제5항에 있어서,
상기 백신이 -20℃에서 60개월 이상 안정적인, 로타바이러스 백신. - 제1항 또는 제5항에 있어서,
상기 백신이 2-8℃에서 적어도 36개월 동안, 25℃에서 적어도 6개월 동안, 37℃에서 적어도 4주간 안정적인, 로타바이러스 백신. - 제5항 또는 제6항에 있어서,
완충제를 포함하거나 또는 포함하지 않는, 로타바이러스 백신. - 제7항에 있어서,
완충제를 포함하거나 또는 포함하지 않는, 로타바이러스 백신. - 제1항 또는 제5항에 있어서,
상기 면역 반응이, 완충제의 존재 하에 또는 제산제의 투여시 백신 제형으로 달성되는 혈청변환 (seroconversion)과 비교하여 비슷하거나 또는 4배 더 높은 수준으로 구축되는, 로타바이러스 백신. - 제1항 또는 제5항에 있어서,
상기 백신이 당 조합물, 락트알부민 가수분해물 및 재조합 인간 혈청 알부민을 더 포함하는, 로타바이러스 백신. - 제13항에 있어서,
상기 당 조합물이 슈크로스, 락토스 및 트레할로스의 조합을 포함하는, 로타바이러스 백신. - 제1항 또는 제5항에 있어서,
상기 제형이 액체의 경구 백신 제형인, 로타바이러스 백신. - 개체에서 로타바이러스에 대한 면역 반응을 구축하는 방법으로서,
안정화된 로타바이러스 백신 제형 0.5 ml을 제산제 또는 완충제의 사용없이 경구 투여하는 단계를 포함하며,
상기 제형이 로타바이러스 균주 116E, 슈크로스, 락토스 및 트레할로스로부터 선택되는 당의 조합물, 락트알부민 가수분해물 및 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하며, 상기 로타바이러스 백신 제형에 완충제가 존재하지 않는, 면역 반응을 구축하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 로타바이러스 백신 제형은 개체에 백신 투여 전 또는 투여 후 제산제 또는 완충제의 투여가 필요없는 것인, 면역 반응을 구축하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 로타바이러스 백신 제형이 pH 2 - pH 4 범위에서 적어도 20분 동안 인간의 위 산성도를 견딜 수 있는, 면역 반응을 구축하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 로타바이러스 백신 제형이 -20℃에서 60개월 이상 안정적인, 면역 반응을 구축하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 로타바이러스 백신 제형이 2-8℃에서 적어도 36개월 동안, 25℃에서 적어도 6개월 동안, 37℃에서 적어도 4주간 안정적인, 면역 반응을 구축하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 백신 제형이, 제산제 또는 완충제의 사용없이 개체에 경구 투여되었을 때, 완충제의 존재 하에 또는 제산제의 투여시 백신 제형으로 달성되는 혈청변환과 비교하여, 비슷하거나 또는 4배 더 높은 수준으로, 면역 반응을 구축할 수 있는, 면역 반응을 구축하는 방법.
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