CN106676151A - 一种重组猪干扰素γ成品冻干制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组猪干扰素γ成品冻干制剂的制备方法。以重组猪干扰素γ的BL21/pET‑32a‑rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种为原料制备得到重组猪干扰素γ成品冻干制剂，本发明制备的重组猪干扰素γ为冻干型，干扰素含量≥1×106单位/瓶，2～8℃可长期保存，在低于25℃室温下可保存两年。本发明与现有技术相比，所建立的重组猪干扰素γ是在大肠埃希工程菌菌体破碎后在上清液中表达的目的蛋白，免去了由包涵体形式表达蛋白所需要的变性和复性过程，同时对每一步的制备及生产过程建立了详细的技术参数以及相应的质量控制体系，为重组猪干扰素γ产业化奠定了基础。

Description

一种重组猪干扰素γ成品冻干制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及基因工程干扰素蛋白的冻干制剂生产领域，具体涉及一种重组猪干扰素γ成品冻干制剂的制备方法。
背景技术
随着近年来全球肉猪养殖业的迅猛发展，我国养殖业规模位于世界前列。然而，养猪业还存在很多问题，如猪口蹄疫病毒(FMDV)、蓝耳病病毒(PRRSV)和非洲猪瘟病毒(ASFV)，每年都会在不同的季节暴发，这些动物一旦感染发病，具有发病急、临床症状严重、极易传播扩散以及病死率和死亡率均较高的特点，给养殖业造成巨大经济损失；目前猪类传染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和药物治疗，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒的血清型复杂，毒株变异快，其次当前还存在疫苗免疫后对部分机体产生的保护力不够，常导致疫苗免疫失败。
目前针对猪传染病常用的药物治疗主要采用人用抗生素和抗病毒化学药物进行治疗，但是引起的食品药物残留问题，给人类健康带来威胁。干扰素-γ可以作为新型生物佐剂能够很好的提高当前猪疫苗保护力。因此，使用无任何毒副作用的干扰素来治疗和预防猪类病毒性疾病，同时利用重组猪干扰素-γ作为猪类疫苗的佐剂将是当前较为关注的问题。
干扰素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，在机体免疫系统中发挥重要作用。根据对干扰素基因核酸序列分析，发现干扰素是存在于生物体内的一种古老的保护因子，而且普遍存在于生物体中。自从Issacs等于1957年发现干扰素以来，已经证明不论高等动物还是低等动物都有干扰素类似物质产生。已有研究发现，由于IFN-γ的免疫调节、抗病毒和抗肿瘤独特作用，重组猪干扰素γ在体外不但能有效抑制猪口蹄疫病毒(FMDV)、蓝耳病病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒、流感病毒和非洲猪瘟病毒(ASFV)的繁殖，同时还对免疫抑制猪具有良好免疫调节作用，可有效增强某些疫苗的免疫效果。研究结果进一步证实，IFN-γ在疾病的诊断、治疗和疫苗免疫效果检测等方面起着重大作用，是现代分子生物学、免疫学和临床医学研究的热点之一。
目前重组猪干扰素γ在大肠埃希菌中表达已有报道，但是工艺均为发酵菌体中包涵体表达目的蛋白，导致生产过程中需要对包涵体表达的蛋白进行变性和复性，导致生产工艺较复杂且成本较高，制约了其在兽医领域的应用。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种重组猪干扰素γ成品冻干制剂的制备工艺，重组猪干扰素γ在大肠埃希工程菌菌体破碎后上清中表达的制备生产工艺，免去了由包涵体形式表达蛋白需要变性和复性的制备过程，同时对每一步的制备及生产过程建立了详细的技术参数以及相应的质量控制体系，为重组猪干扰素γ产业化奠定了基础。
本发明采取的技术方案为：
一种重组猪干扰素γ成品冻干制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)以重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种为原料，培养后得到一级生产种子，所述BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌的基因序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示；
(2)将一级生产种子再次培养至OD值为0.8～1.2，制得二级种子菌液；
(3)二级种子菌液经发酵、诱导表达后，离心，得到湿菌体；
(4)湿菌体破碎，离心收集上清液，即得粗制重组猪干扰素γ；
(5)粗制重组猪干扰素γ先后经亲和层析纯化和离子交换层析纯化后，即可得到纯化后的重组猪干扰素γ；
(6)纯化后的重组猪干扰素γ中加入冻干保护剂，真空冷冻干燥，即可得到重组猪干扰素γ成品冻干制剂。
进一步地，所述步骤(5)后还包含对纯化后的重组猪干扰素γ进行效价测定、蛋白质含量检测、比活性检测、纯度测定和分子量检测。
进一步地，所述步骤(1)具体包括以下步骤：开启表达重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种一支，加无菌生理盐水2ml缓冲液溶解成菌悬液，四区划线法接种LB固体培养基平板，37℃培养18～30小时，挑取单个菌落，接种LB固体培养基斜面，37℃培养18～30小时，用LB液体培养基洗下菌苔，加入30％～40％菌液体积的无菌甘油，定量分装成1ml/瓶，即可得到一级生产种子。
进一步地，所述步骤(2)具体包括以下步骤：取出一级BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌生产种子，置室温30～40min后，接种LB固体培养基平板，37℃培养18～30小时，用LB液体培养基洗下菌苔，按菌液与LB液体培养基体积比1∶10～15接种LB液体培养基，以180～3000r/min的转速37℃摇床震荡培养至OD值为0.8～1.2，即可制得二级种子菌液供发酵罐接种用。
进一步地，所述步骤(3)具体包括以下步骤：配制LB液体培养基，高压在位灭菌，按培养基量的10％～20％接种二级种子菌液，37℃条件下发酵，控制pH值为7.0～7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧>30％，每小时取样检测菌体OD600nm值，待菌液的OD600nm值达到0.6～1.0时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，调整培养温度至30～32℃，开始诱导表达，诱导4～6小时后2～8℃条件下以4000～8000r/min离心15～30min，湿菌体称重，-20℃冻存。
进一步地，所述步骤(4)具体包括以下步骤：用10～15％菌液体积的10mmol/L pH＝7.2的PBS重悬湿菌体，以压力800～1500bar的高压细胞破碎机破碎，连续破碎两次后，再将该悬液置2～8℃条件下，以8000～12000r/min离心10～30min，取上清后，重复离心一次，收集上清液即得粗制重组猪干扰素γ。
进一步地，所述步骤(5)中，亲和层析纯化所用洗脱液为10mmol/L pH＝7.2的PBS和300mmol/L咪唑组成的混合液，其pH为8.0。
进一步地，所述步骤(5)中，离子交换层析纯化使用25mMTris-HCl和1M NaCl组成的混合溶液进行梯度洗脱，其pH为8.0。
进一步地，所述步骤(6)中具体包括以下步骤：将纯化后的重组猪干扰素γ用2～3倍体积10mmol/L pH＝7.2的PBS稀释后加入终浓度5％体积浓度的甘油、0.12g/ml甘露醇和0.025g/ml蔗糖冻干保护剂混匀后，以7ml西林瓶分装，分装规格为2.2ml/瓶，半成品经细菌内毒素检验、无菌试验。在生物制品的冷冻干燥过程中，甘露醇一般用作填充剂，在慢速冻结时会结晶，从而为活性组分提供支撑结构，而且甘露醇也不会与活性组分发生反应；甘油作为作低温保护剂比较适合蛋白类生物制品的保护；葡萄糖与蛋白质活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置，对蛋白质活性起保护作用。
进一步地，所述步骤(6)中，真空冷冻干燥的参数为：半成品分装后在-40～-30℃的条件下冷冻真空干燥：首先将搁架温度降温到-10～-15℃，保持30min～60min，继续降温至-20℃保持30min～60min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并将搁板温度加热至-25℃进行一次干燥，保持3～5h得到白色干燥物，隔板逐渐升温至25～30℃，维持4h，将安瓿瓶压塞封口，铝塑盖压盖后保存于2～8℃。
本发明所制的重组猪干扰素γ成品冻干制剂是一类能诱导猪类细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子及提高机体对抗原的反应能力，增强疫苗免疫效果，可采用肌肉注射的方式给药，治疗周期短，疗效迅速，能够用于猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病毒和猪流感病毒性疾病的防治，同时也可以作为疫苗的佐剂进行一定比例的配方添加提高疫苗的保护力。
本发明的优点是：使用本发明提供的制备方法得到的重组猪干扰素γ冻干制剂产品，无论是在纯度、蛋白含量、效价和内毒素等方面均可达到兽用生物制品的要求，且生产工艺适合规模化生产。
附图说明
图1为发酵破碎菌体离心后表达的重组猪干扰素γ蛋白SDS-PAGE图；M：蛋白Marker；1：空载；2：发酵破碎后全菌；3：发酵破碎后上清；4：发酵破碎后包涵体；
图2A为重组猪干扰素γ亲和层析纯化色谱图；
图2B为重组猪干扰素γ离子交换层析纯化色谱图；
图3为重组猪干扰素γ原液纯化前后SDS-PAGE图；M：蛋白Marker；1：重组猪干扰素γ原液；2：重组猪干扰素γ亲和层析纯化后样品；3：重组猪干扰素γ离子交换层析洗脱样(杂蛋白)；4：重组猪干扰素γ离子交换层析纯化后目的蛋白样；
图4为重组猪干扰素γ原液HPLC检测纯度色谱图；
图5为重组猪干扰素γ成品免疫印迹检测结果图；M：蛋白Marker；1：重组猪干扰素γ成品；
图6为重组猪干扰素γ成品生物学活性检测结果图；A1～A10为2倍梯度稀释安徽九川生物科技有限公司重组猪干扰素γ冻干粉针剂企业标准品溶液，其中第1列为将样品稀释10000倍加入第1孔；B1～B10/C1～C10/D1～D10为A1～A10复孔；11列：PK-15细胞对照；V列：VSV病毒对照。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作详细的说明，但这并不仅限于本发明的范围。
LB液体培养基的配制方法为：胰化蛋白胨100g；酵母提取物50g；氯化钠100g用8L纯水溶解后，加5M NaOH调节pH值至7.0，再加入纯水至总体积10L。
重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种的构建方法如下：
(1)构建克隆载体
特异性PCR引物如下：上游：5'-GCA GGATCC ATGAGTTATACAAC-3’
下游：5'-AAC CTCG AG TTTTGATGCTCTCT-3’
利用设计的特异性引物进行PCR获得猪干扰素γ的目的基因，并将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector并转化至JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定，根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序；
(2)构建猪γ干扰素表达工程菌
鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体pET-32a进行连接，并相应转化至BL-21大肠杆菌，分别进行培养，鉴定出表达载体构建成功的重组表达菌进行放大培养。并加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导剂低温诱导表达，应用抗猪干扰素γ阳性血清做中和实验，证明型别无误，成功构建重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌。并将重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌加入终浓度为10％的脱脂奶粉，分装成2mL/支的溶液，真空冷冻干燥后制成重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种，其基因序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。
实施例1
1.1原液制造与检测
1.1.1一级生产种子繁殖
开启表达重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种1支，加无菌生理盐水2ml溶解成菌悬液，划线接种LB固体培养基平板，37℃培养24小时，挑取单个菌落，接种LB斜面，37℃培养24小时，用LB液体培养基洗下菌苔，按30％加入无菌甘油，定量分装成1ml/瓶。
1.1.2二级生产种子繁殖
取出一级BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌生产种子1支，置室温30min后，划线接种LB固体培养基平板，37℃培养24小时，用LB培养基洗下菌苔，按1∶10接种LB液体培养基，37℃摇床震荡(300r/min)培养至OD值0.8，即可供发酵罐接种用。
1.1.3发酵
配制LB液体培养基，高压灭菌，此时罐体应在位灭菌。按培养基量的10％接种二级种子菌液，37℃条件下发酵。控制pH值为7.0，通过搅拌速度及通气量控制溶氧>30％。每小时取样检测菌体OD600nm值。待菌液的OD600nm值达到0.6时加入终浓度为1mmol/L IPTG，调整培养温度至32℃，开始诱导表达。诱导5小时后4℃条件下以4000r/min离心15min，湿菌体称重，-20℃冻存，并同时在容器上标明批号、罐别、重量和日期。发酵液灭菌后弃去。取少量菌体作SDS-PAGE电泳，电泳胶扫描后用软件分析目的蛋白的分子量与理论值一致(34kD)，目的蛋白的表达水平不低于40％(图1)。
1.1.4破碎
用10％菌液体积的10mmol/L pH＝7.2的PBS重悬菌体，以压力1000bar的高压细胞破碎机破碎细菌，连续破碎两次后，再将该悬液置4℃条件下，以12000r/min离心10min，取上清后，重复离心一次，收集上清液。
1.1.5纯化
采用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用Binding Buffer(10mmol/L PBS，25mmol/L咪唑，pH 8.0)平衡2～3个柱体积，在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，将粗制重组猪干扰素γ采用上样泵上样过层析柱(流速6ml/min)，再用Binding Buffer过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到A280稳定。再用Elution Buffer(10mmol/L pH＝7.2的PBS，300mmol/L咪唑，pH 8.0)收集洗脱下来的蛋白吸收峰，将此步得到的重组猪干扰素γ过脱盐柱，用缓冲液(25mMTris-HCl，pH＝8.0)置换，准备下一步离子交换层析。使用Binding buffer(25mM Tris-HCl，pH＝8.0)平衡好柱子，上样后用Elution buffer(25mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0)梯度洗脱，收集干扰素峰，即为纯化后的重组猪干扰素γ原液(图2)。
1.1.6原液检测
效价测定：采用“微量细胞病变抑制法”，猪肾细胞(PK-15)/VSV检测系统，采用PK-15/VSV病毒系统，效价为1.6×106单位/ml。
蛋白质含量检测：Lowry法检测蛋白含量为1.2mg/ml。
比活性检测：比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，计算得比活性为1.3×106单位/mg。
纯度测定：纯度采取SDS-PAGE和HPLC同步检测，检测结果均大于95％(图3、图4)。
分子量检测：分离胶浓度为15％，加样量不小于10μg，同时用已知分子量标准品作对照，制品的分子量为34kD。
1.2半成品制备与检测
1.2.1半成品制备
将上步所得的重组猪干扰素γ原液用3倍体积10mmol/L PBS稀释后加入终浓度5％(体积浓度)甘油、0.12g/ml甘露醇和0.025g/ml蔗糖冻干保护剂混匀后，以7ml西林瓶分装，分装规格为2.2ml/瓶，半成品经细菌内毒素检验、无菌试验。
1.2.2半成品检定
细菌内毒素检验：
参照《中华人民共和国兽药典》2010版一部附录“细菌内毒素检测法”进行检验，重组猪干扰素γ中内毒素含量为14EU/ml。
无菌试验：
参照《中华人民共和国兽药典》2010版附录“无菌检测或纯粹检测法”进行，无菌实验符合规定。
1.3成品制备与检测
1.3.1成品制备
将上述1.2.1制得的半成品分装后在在-40～-30℃的条件下冷冻真空干燥：首先将搁架温度降温到-10℃，保持30min，继续降温至-20℃保持30min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并将搁板温度加热至-25℃进行一次干燥，保持3h得到白色干燥物，隔板逐渐升温至25℃，维持4h，将安瓿瓶压塞封口，铝塑盖压盖。包装按照兽用生物制品的标签、说明书与包装的规定。
1.3.2成品检定
性状：
成品为白色或淡黄色疏松体，加入注射用水后迅速复溶为澄明液体。
无菌检验：
无菌实验参照《中华人民共和国兽药典》2010版附录“无菌检测或纯粹检测法”进行，无菌生长。
鉴别检验:
与商品化重组猪干扰素γ单克隆抗体经免疫印迹法测定，结果为阳性(图5)。
安全检验:
重组猪干扰素γ溶于2ml生理盐水中，用10日龄SPF猪10只，各肌肉注射重组猪干扰素γ2ml，观察10日，全部健活，不出现异常反应。
效价测定：
按照细胞病变抑制法进行，采用PK-15细胞/VSV病毒系统，效价检测结果为1.6×106单位/支(图6)。
细菌内毒素检验：
内毒素检测参照《中华人民共和国兽药典》2010版一部附录“细菌内毒素检测法”进行检验，每瓶重组猪干扰素γ中内毒素含量为8EU。
剩余水份测定：
水分测定参照《中华人民共和国兽药典》2010版三部附录“剩余水分测定法”，含水量为2.1％。
真空度测定：
真空度检测参照《中华人民共和国兽药典》2010版三部附录“真空度测定法”，真空度符合兽药典规定。
实施例2
2.1原液制造与检测
2.1.1一级生产种子繁殖
开启表达重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种1支，加无菌生理盐水2ml溶解成菌悬液，划线接种LB固体培养基平板，37℃培养28小时，挑取单个菌落，接种LB斜面，37℃培养28小时，用LB液体培养基洗下菌苔，按32％加入无菌甘油，定量分装成1ml/瓶。
2.1.2二级生产种子繁殖
取出一级BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌生产种子1支，置室温35min后，划线接种LB固体培养基平板，37℃培养28小时，用LB培养基洗下菌苔，按1∶11接种LB液体培养基，37℃摇床震荡(280r/min)培养至OD值0.9，即可供发酵罐接种用。
2.1.3发酵
配制LB液体培养基，高压灭菌，此时罐体应在位灭菌。按培养基量的14％接种二级种子菌液，37℃条件下发酵，控制pH值为7.0～7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧>30％。每小时取样检测菌体OD600nm值。待菌液的OD600nm值达到0.8时加入终浓度为1mmol/L IPTG，调整培养温度至32℃，开始诱导表达。诱导4小时后5℃条件下以6000r/min离心20min，湿菌体称重，-20℃冻存，并同时在容器上标明批号、罐别、重量和日期。发酵液灭菌后弃去。取少量菌体作SDS-PAGE电泳，电泳胶扫描后用软件分析目的蛋白的分子量与理论值一致(34kD)，目的蛋白的表达水平不低于40％(图1)。
2.1.4破碎
用12％菌液体积的10mmol/L PBS pH＝7.2的重悬菌体，以压力900bar的高压细胞破碎机破碎细菌，连续破碎两次后，再将该悬液置2℃条件下，以8000r/min离心25min，取上清后，重复离心一次，收集上清液。
2.1.5纯化与检测
采用与实施例1中步骤1.1.5相同的方法纯化，并对原液进行效价测定、蛋白质含量检测、比活性检测、纯度测定和分子量检测。
2.2半成品制备与检测
2.2.1半成品制备
将上步所得的重组猪干扰素γ原液2.5倍体积10mmol/L PBS稀释后加入终浓度5％甘油、0.12g/ml甘露醇和0.025g/ml蔗糖冻干保护剂混匀后，以7ml西林瓶分装，分装规格为2.2ml/瓶，半成品经细菌内毒素检验、无菌试验。
2.3成品制备与检测
将上述1.2.1制得的半成品分装后在-40～-30℃的条件下冷冻真空干燥：首先将搁架温度降温到-12℃，保持45min，继续降温至-20℃保持45min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并将搁板温度加热至-25℃进行一次干燥，保持4h得到白色干燥物，隔板逐渐升温至28℃，维持4h，将安瓿瓶压塞封口，铝塑盖压盖。包装按照兽用生物制品的标签、说明书与包装的规定。制得的成品进行性状、无菌检验、鉴别检验、安全检验、效价测定、细菌内毒素检验、剩余水份测定和真空度测定。
实施例3
3.1原液制造与检测
3.1.1一级生产种子繁殖
开启表达重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种1支，加无菌生理盐水2ml溶解成菌悬液，划线接种LB固体培养基平板，37℃培养26小时，挑取单个菌落，接种LB斜面，37℃培养26小时，用LB液体培养基洗下菌苔，按36％加入无菌甘油，定量分装成1ml/瓶。
3.1.2二级生产种子繁殖
取出一级BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌生产种子1支，置室温35min后，划线接种LB固体培养基平板，37℃培养26小时，用LB培养基洗下菌苔，按1∶12接种LB液体培养基，37℃摇床震荡(300r/min)培养至OD值1.0，即可供发酵罐接种用。
3.1.3发酵
配制LB液体培养基，高压灭菌，此时罐体应在位灭菌。按培养基量的20％接种二级种子菌液，37℃条件下发酵，控制pH值为7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧>30％。每小时取样检测菌体OD600nm值。待菌液的OD600nm值达到1.0时加入终浓度为1mmol/L IPTG，调整培养温度至32℃，开始诱导表达。诱导5.5小时后2℃条件下以8000r/min离心25min，湿菌体称重，-20℃冻存，并同时在容器上标明批号、罐别、重量和日期。发酵液灭菌后弃去。取少量菌体作SDS-PAGE电泳，电泳胶扫描后用软件分析目的蛋白的分子量与理论值一致(34kD)，目的蛋白的表达水平不低于40％(图1)。
3.1.4破碎
用15％菌液体积的10mmol/L PBS重悬菌体，以压力1000bar的高压细胞破碎机破碎细菌，连续破碎两次后，再将该悬液置3℃条件下，以10000r/min离心15min，取上清后，重复离心一次，收集上清液。
3.1.5纯化与检测
采用与实施例1中步骤1.1.5相同的方法纯化，并对原液进行效价测定、蛋白质含量检测、比活性检测、纯度测定和分子量检测。
3.2半成品制备与检测
3.2.1半成品制备
将上步所得的重组猪干扰素γ原液用2.6倍体积10mmol/L PBS稀释后加入终浓度5％甘油、0.12g/ml甘露醇和0.025g/ml蔗糖冻干保护剂混匀后，以7ml西林瓶分装，分装规格为2.2ml/瓶，半成品经细菌内毒素检验、无菌试验。
3.3成品制备与检测
将上述1.2.1制得的半成品分装后在-40～-30℃的条件下冷冻真空干燥：首先将搁架温度降温到-15℃，保持60min，继续降温至-20℃保持60min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并将搁板温度加热至-25℃进行一次干燥，保持3～5h得到白色干燥物，隔板逐渐升温至30℃，维持4h，将安瓿瓶加塞封口。制得的成品进行性状、无菌检验、鉴别检验、安全检验、效价测定、细菌内毒素检验、剩余水份测定和真空度测定。
实施例4
重组猪干扰素γ成品冻干制剂对猪蓝耳病毒的治疗作用
合肥市郊区某养猪场2015年暴发疑似猪蓝耳病毒，主要临床表现为呼吸道症状，呼吸困难，有时呈腹式呼吸，食欲减退或废绝，体温升高到40℃以上，腹泻。被毛粗乱，共济失调，渐进性消瘦，眼睑水肿。少部分仔猪可见耳部、体表皮肤发紫。将10头发病断奶仔猪随机分为两组，A组为“重组猪干扰素γ成品冻干制剂”治疗组，猪干扰素冻干剂型采用实施例2方法制备；B组为对照组，用生理盐水治疗，，A组以肌肉注射方式给予“重组猪干扰素γ成品冻干制剂”100万单位/头，每天1次，连用3天；B组给予生理盐水2ml/头，每天1次，连用3天，用药后，A组猪1天后病情开始好转，3天后未见猪只死亡。B组猪出现症状第2天后病情恶化，开始出现死亡，第3天达到死亡高峰，死亡率达到25％，说明以肌肉注射方式给予“重组猪干扰素γ成品冻干制剂”对猪新城疫有一定的治疗作用。
实施例5
重组猪干扰素γ成品冻干制剂攻毒保护试验
将10头10日龄的SPF猪用人工感染猪流行性腹泻病毒的方法使仔猪发病，同时设置模型对照组。经口饲喂的方式攻毒SPF仔猪，在攻毒18h后，临床症状为呕吐和水样腹泻，病猪精神沉郁，食欲减退，此时给药组仔猪给予肌肉注射重组猪干扰素γ1.0×106单位/头，每日一次，连续注射3天。模型对照组给予等量的生理盐水。3天后治疗组仔猪腹泻呕吐好转，由水样粪便变成半成型，食欲恢复，精神状态恢复。模型组仔猪腹泻脱水严重，其中3头仔猪死亡，死亡率达到60％，解剖观察仔猪胃内有未消化的凝乳块，，小肠扩张，内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛缩短，为典型的流行性腹泻病毒导致的仔猪肠道病变。
上述参照实施例对重组猪干扰素γ成品冻干制剂进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组猪干扰素γ成品冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)以重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种为原料，培养后得到一级生产种子，所述BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌的基因序列表如SEQUENCELISTING 400〈1〉所示；
(2)将一级生产种子再次培养至OD值为0.8～1.2，制得二级种子菌液；
(3)二级种子菌液经发酵、诱导表达后，离心，得到湿菌体；
(4)湿菌体破碎，离心收集上清液，即得粗制重组猪干扰素γ；
(5)粗制重组猪干扰素γ先后经亲和层析纯化和离子交换层析纯化后，即可得到纯化后的重组猪干扰素γ；
(6)纯化后的重组猪干扰素γ中加入冻干保护剂，真空冷冻干燥，即可得到重组猪干扰素γ成品冻干制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)后还包含对纯化后的重组猪干扰素γ进行效价测定、蛋白质含量检测、比活性检测、纯度测定和分子量检测。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括以下步骤：开启表达重组猪干扰素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基础种子批冻干菌种一支，加无菌生理盐水2ml溶解成菌悬液，四区划线法接种LB固体培养基平板，37℃培养18～30小时，挑取单个菌落，接种LB固体培养基斜面，37℃培养18～30小时，用LB液体培养基洗下菌苔，加入30％～40％菌液体积的无菌甘油，定量分装成1ml/瓶，即可得到一级生产种子。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括以下步骤：取出一级BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌生产种子，置室温30～40min后，接种LB固体培养基平板，37℃培养18～30小时，用LB液体培养基洗下菌苔，按菌液与LB液体培养基体积比1∶10～15接种LB液体培养基，以180～300r/min的转速37℃摇床震荡培养至OD值为0.8～1.2，即可制得二级种子菌液供发酵罐接种用。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下步骤：配制LB液体培养基，在位灭菌，按培养基量的10％～20％接种二级种子菌液，37℃条件下发酵，控制pH值为7.0～7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧>30％，每小时取样检测菌体OD600nm值，待菌液的OD600nm值达到0.6～1.0时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，调整培养温度至30～32℃，开始诱导表达，诱导4～6小时后2～8℃条件下以4000～8000r/min离心15～30min，湿菌体称重，-20℃冻存。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括以下步骤：用10～15％菌液体积的10mmol/L pH＝7.2的PBS重悬湿菌体，以压力800～1500bar的高压细胞破碎机破碎，连续破碎两次后，再将该悬液置2～8℃条件下，以8000～12000r/min离心10～30min，取上清后，重复离心一次，收集上清液即得粗制重组猪干扰素γ。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，亲和层析纯化所用洗脱液为10mmol/L pH＝7.2的PBS和300mmol/L咪唑组成的混合液，其pH为8.0。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，离子交换层析纯化使用25mMTris-HCl和1M NaCl组成的混合溶液进行梯度洗脱，其pH为8.0。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中具体包括以下步骤：将纯化后的重组猪干扰素γ用2～3倍体积10mmol/L pH＝7.2的PBS稀释后加入终浓度5％体积浓度的甘油、0.12g/ml甘露醇和0.025g/ml蔗糖冻干保护剂混匀后，以7ml西林瓶分装，分装规格为2.2ml/瓶，半成品经细菌内毒素检验、无菌试验。
10.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，真空冷冻干燥的参数为：半成品分装后在-40～-30℃的条件下冷冻真空干燥：首先将搁架温度降温到-10～-15℃，保持30min～60min，继续降温至-20℃保持30min～60min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并将搁板温度加热至-25℃进行一次干燥，保持3～5h得到白色干燥物，隔板逐渐升温至25～30℃，维持4h，将安瓿瓶压塞封口，铝塑盖压盖后保存于2～8℃。
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