CN101475639A - 一种防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents
一种防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体及其制备方法，属于生物制剂制备与禽病防治技术领域。本发明以鸭疫里氏杆菌主要流行血清型菌株为抗原，制备了鸭疫里氏杆菌高免卵黄抗体，感染治疗试验结果表明，所制备的卵黄抗体对血清I型血清II型鸭疫里氏杆菌的保护率分别达到80％和90％。本产品将为鸭传染性浆膜炎防治提供一条新的途径，可以用于制备预防治疗该病的兽药，也可制成保健品或作为饲料添加剂使用，同时为提高畜产品质量，减少药物残留和促进人类食品安全提供物质基础。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂制备与禽病防治技术领域，涉及一种防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体及其制备方法。
背景技术
鸭疫里默氏菌(RA)病，又称鸭传染性浆膜炎，是目前对养鸭业危害最严重的传染病之一，临床上常引起雏鸭、雏鹅、雏火鸡等多种禽类的纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎、结膜炎、关节炎等，发病率和病死率均很高。此病由鸭疫里氏杆菌引起，对部分抗菌药物敏感，但难于根治，尤其是病菌侵入气囊后，药物难以到达，清除更加困难。当前，由于不合理的用药方案，鸭疫里氏杆菌耐药现象普遍存在，耐药率高且广泛，给该病的防治带来很大的困难，同时造成严重的药物残留等问题，严重威胁着人类健康和食品安全。
目前，控制鸭传染性浆膜炎的主要手段是疫苗接种，但由于该病发生日龄早，发病急，部分雏鸭往往来不及免疫或免疫后还未产生抗体，感染鸭就已经发病，因此，该病的治疗仍然是一个难题。
卵黄抗体(IgY)是禽类的一种免疫球蛋白，来源于血液，由卵泡选择性地将血液中的抗体主动转运到卵黄当中，具有IgG的典型构象，已广泛地用于畜禽病毒性和细菌性传染病的防控。实验证明卵黄中的IgY浓度长期维持在相当于或高于血液浓度的水平，并且具有高度的稳定性，对热、酸、碱环境具有良好的耐受性。利用禽类规模化生产特异性免疫抗体，不仅成本低、特异性抗体效价高、安全性好，而且极为实用，易于推广。
当前，大多数的病毒性疾病，如鸡新城疫、减蛋综合佂、鸡传染性法氏囊病、鸭病毒性肝炎等，都已有成功开发出卵黄抗体，但鸭疫里氏杆菌卵黄抗体研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体，此抗体的免疫性好，保护率高，且无残留。
本发明的另一目的是提供该防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体，该抗体所用的抗原为鸭疫里氏杆菌混合抗原。
本发明所用的混合血清抗原可为鸭疫里氏杆菌其它血清型的混合，但本发明优选血清I型与血清II型的混合抗原，血清I型与血清II型的混合比例为1:2～6。
本发明所用的血清I型与血清II型抗原的混合比例优选为1:4。
本发明的防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体可以为其它剂型，但本发明优选注射剂。
本发明还提供了该防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)鸭疫里氏杆菌菌体抗原的纯培养、浓缩和灭活；
(2)按比例混合抗原，并加入免疫佐剂；
(3)选用健康的未经免疫的产蛋家禽，免疫所制备的混合抗原；
(4)收集家禽所产的蛋，将蛋壳消毒，分离卵黄，收集卵黄抗体。
其中，该制备方法中所述的免疫佐剂可为弗氏佐剂、蜂胶或注射用白油中的任一种。若以弗氏佐剂为免疫佐剂，则基础免疫使用完全弗氏佐剂，强化免疫使用不完全弗氏佐剂。
该制备方法中所述的产蛋家禽可为鸡、鸭或其它家禽，但本发明优选鸡或鸭，免疫部位可为腿部、胸部肌肉或皮下多点注射。免疫程序包括基础免疫1次，强化免疫两次，每次间隔7天，剂量均为1ml，第三次免疫后的第7天收集蛋备用。
该制备方法中收集卵黄抗体的方法可以为辛酸硫酸铵分级沉淀法、水稀释法或膜过滤法中的任一种，上述各方法的过程如下：
(1)辛酸硫酸铵分级沉淀法
从免疫蛋中分离卵黄，用4倍体积的醋酸钠缓冲液(60mmol/L，pH4.0)稀释，调pH4.5。将辛酸(25μl/mL样品)逐滴慢慢加入样品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，3000rpm离心20min，去沉淀，取上清与10×PBS混合(每体积上清加1体积10×PBS)，用1mol/LNaOH调pH7.4。上清冷至4℃，加硫酸铵(0.277g/mL，使最终饱和度为45％)，搅拌30min，8000rpm离心15min，去上清。将沉淀悬浮于少量PBS中(通常为原卵黄液体积的1/10)，悬浮液装入透析袋用50-100倍体积的PBS透析过夜，最后通过0.45μm滤膜过滤除菌，加入硫柳汞(终浓渡为0.02％)或叠氮钠(终浓度为0.01％)，分装，储存于-20℃。
(2)水稀释法
分离卵黄，以生理盐水5～8倍稀释卵黄液，调PH值为5.2，4℃搅拌5小时，3000rpm离心去沉淀，将上清液浓缩，通过0.45μm滤膜过滤除菌，加入硫柳汞(终浓渡为0.02％)或叠氮钠(终浓度为0.01％)，分装，储存于-20℃。
(3)膜过滤法
分离卵黄，以去离子水稀释卵黄液，以分子量为150KD和200KD的膜分别过滤，收集150kD～200kD的蛋白，溶于PBS液即为高免卵黄抗体液，通过0.45μm滤膜过滤除菌，加入硫柳汞(终浓渡为0.02％)或叠氮钠(终浓度为0.01％)，分装，储存于-20℃。
按照国家兽用生物制品质量标准，将高免卵黄抗体制备成注射液并进行该制剂的安全性试验后，该抗体即可用于规模化的有效治疗鸭疫里氏杆菌病。
本发明的防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体可用于制备防治鸭传染性浆膜炎的药物，也可作为饲料添加剂使用。
本发明的混合抗体可有效用于鸭传染性浆膜炎的防治，解决了当前该病的防治难题：(1)该抗体的保护率高，感染保护试验结果表明，采用本发明方法制备的卵黄抗体对血清I型血清II型鸭疫里氏杆菌的保护率分别超过80％和90％；(2)该产品产业化的成功实施，将极大地促进养鸭业的发展，同时势必将减少抗生素的使用，为解决肉、蛋等食品药物残留等安全问题提供了物质基础。
具体实施方式：
实施例1 鸭疫里氏杆菌卵黄抗体的制备
(1)鸭疫里氏杆菌菌体抗原的纯培养、浓缩和灭活；
取鸭疫里氏杆菌RA1(血清I型)和RA2(血清II型)菌种分别接种于含0.5％血清的胰蛋白胨酵母肉汤中，置36～37℃振荡培养18小时至对数生长期，4℃条件下3000rpm离心15分钟，沉淀溶于PBS缓冲液中，然后在同样条件下离心15分钟，收集菌体，按菌液总量的0.3％缓慢加入分析纯甲醛溶液，在36～37℃恒温条件下灭活36小时；
(2)按比例混合抗原，并加入免疫佐剂；
将灭活后的RA1和RA2菌体抗原按1:2混合，部分等量加入已灭菌的弗氏完全佐剂，部分等量加入弗氏不完全佐剂，乳化得到菌体抗原；
(3)选用健康的未经免疫的产蛋鸡，免疫所制备的混合抗原；
A.基础免疫：选用健康产卵非免疫鸡隔离饲养，皮下或肌肉多点注射步骤1所制备的完全弗氏佐剂菌体抗原1ml/只；
B.强化免疫：基础免疫一周后，进行强化免疫，注射步骤所制备的不完全弗氏佐剂菌体抗原1ml/只；在第二次强化免疫后一周开始收集所产的蛋，4℃储存备用；
(4)收集家禽所产的蛋，将蛋壳消毒，分离卵黄，收集卵黄抗体。
从收集的免疫鸡蛋中分离卵黄，用4倍体积的醋酸钠缓冲液(60mmol/L，pH4.0)稀释，调pH4.5；将辛酸(25μl/mL样品)逐滴慢慢加入样品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，3000rpm离心20min，去沉淀，取上清与10×PBS混合(每体积上清加1体积10×PBS)，用1mol/L NaOH调pH7.4；上清冷至4℃，加硫酸铵(0.277g/mL，使最终饱和度为45％)，搅拌30min，8000rpm离心15min，去上清；将沉淀悬浮于少量PBS中(通常为原卵黄液体积的1/10)，悬浮液装入透析袋用50倍体积的PBS透析过夜，最后通过0.45μm滤膜过滤除菌，加入硫柳汞(终浓渡为0.02％)，分装，储存于-20℃。
实施例2 鸭疫里氏杆菌卵黄抗体的制备
(1)鸭疫里氏杆菌菌体抗原的纯培养、浓缩和灭活；
取鸭疫里氏杆菌(血清I型)和RA2(血清II型)菌种分别接种于含0.5％血清的胰蛋白胨酵母肉汤中，置36～37℃振荡培养18小时至对数生长期，4℃条件下3000rpm离心15分钟，沉淀溶于PBS缓冲液中，然后在同样条件下离心15分钟，收集菌体，按菌液总量的0..3％缓慢加入分析纯甲醛溶液，在36～37℃恒温条件下灭活36小时；
(2)按比例混合抗原，并加入免疫佐剂；
灭活后将RA1和RA2菌体抗原按1:4混合，等体积加入已灭菌蜂胶，乳化得到菌体抗原；
(3)选用健康的未经免疫的产蛋鸭，免疫所制备的混合抗原；
A.基础免疫：选用健康产卵非免疫鸭隔离饲养，皮下注射步骤1所制备的蜂胶佐剂菌体抗原1ml/只；
B.强化免疫：基础免疫一周后，进行强化免疫，注射步骤所制备的蜂胶佐剂菌体抗原1ml/只；在第二次强化免疫后一周开始收集所产的蛋，4℃储存备用；
(4)收集家禽所产的蛋，将蛋壳消毒，分离卵黄，水稀释法收集卵黄抗体。
将收集的蛋分离卵黄，以生理盐水10倍稀释卵黄液，调PH值为5.2，4℃搅拌5小时，3000rpm离心后，去沉淀，将上清液浓缩，即得抗体溶液，最后通过0.45μm滤膜过滤除菌，加入硫柳汞(终浓渡为0.02％)，分装，储存于-20℃。
实施例3 鸭疫里氏杆菌卵黄抗体的制备
(1)鸭疫里氏杆菌菌体抗原的纯培养、浓缩和灭活；
取鸭疫里氏杆菌(血清I型)和RA2(血清II型)菌种，分别接种于含0.5％血清的胰蛋白胨酵母肉汤中，置36～37℃振荡培养18小时至对数生长期，4℃条件下3000rpm离心15分钟，沉淀溶于PBS缓冲液中，然后在同样条件下离心15分钟，收集菌体，按菌液总量的0.3％缓慢加入分析纯甲醛溶液，在36～37℃恒温条件下灭活36小时；
(2)按比例混合抗原，并加入免疫佐剂；
灭活后将RA1和RA2菌体抗原按1:6混合，等体积加入已灭菌注射用白油，乳化得到菌体抗原；
(3)选用健康的未经免疫的产蛋鸭，免疫所制备的混合抗原；
A.基础免疫：选用健康产卵非免疫鸭隔离饲养，肌肉多点注射步骤1所制备的菌体抗原1ml/只；
B.强化免疫：基础免疫一周后，进行强化免疫，注射步骤1所制备的菌体抗原1ml/只；在第二次强化免疫后一周开始收集所产的蛋，4℃储存备用；(4)收集家禽所产的蛋，将蛋壳消毒，分离卵黄，膜过滤法收集卵黄抗体。
将收集的蛋分离卵黄，以去离子水10倍稀释卵黄液，以分子量为150KD和200KD的膜分别过滤，收集150KD～200KD的蛋白，溶于PBS液即为高免卵黄抗体液，最后通过0.45μm滤膜过滤除菌，加入硫柳汞(终浓渡为0.02％)，分装，储存于-20℃。
实施例4 鸭疫里氏杆菌卵黄抗体分子量及纯度分析
用PAGE电泳检测实施例1～3中所制备的卵黄抗体纯度，具体过程如下：分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％，电泳4小时，以次高分子量蛋白作为Marker，以考马斯亮兰染色，结果显示在130kD～200kD处只有一条电泳带。
实施例5 感染保护试验
雏鸭感染和治疗实验(见表1)：取5-10日龄雏番鸭40只，随机分成四组，每组10只：第I、II组攻击RA1，第III、IV组攻击RA2，均采用颈部皮下注射方法攻击，剂量为0.5ml/只(含菌量为2亿)。第I组和第III组在攻击后36小时分别以实施例1、3所制备的高免卵黄抗体治疗，每只颈部皮下注射2ml，第II、IV组不做治疗留作对照，注射等量生理盐水，观察卵黄抗体的治疗效果。
试验结果表明，攻击后5-8天内所有对照鸭应全部发病或死亡，剖检可见严重心包膜炎，肝或胸膜发生粘连。而治疗组对血清I型和血清II型鸭疫里氏杆菌的保护率分别为80％和90％。
表1.感染保护实验
注“-”表示未治疗对照
Claims (7)
1、一种防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体，其特征在于所用的抗原为鸭疫里氏杆菌混合抗原。
2、如权利要求1所述的防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体，其特征在于所述的抗原为血清I型与血清II型混合抗原，血清I型与血清II型的混合比例为1:2～6。
3、如权利要求2所述的防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体，其特征在于血清I型与血清II型的混合比例优选为1:4。
4、如权利要求1至3任一项所述的防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体，其特征在于抗体的剂型为注射剂。
5、如权利要求1至3任一项所述的防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)鸭疫里氏杆菌菌体抗原的纯培养、浓缩和灭活；
(2)按比例混合抗原，并加入免疫佐剂；
(3)选用健康的未经免疫的产蛋家禽，免疫所制备的混合抗原；
(4)收集家禽所产的蛋，将蛋壳消毒，分离卵黄，收集卵黄抗体。
6、如权利要求4所述的防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述的免疫佐剂为弗氏佐剂、蜂胶或注射用白油中的任一种。
7、如权利要求1至3任一项所述的防治鸭传染性浆膜炎的混合卵黄抗体用于制备防治鸭传染性浆膜炎的药物及作为饲料添加剂的应用。
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