CN101186647B - 鸡球虫高免卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种鸡球虫高免卵黄抗体的制备方法，其具体步骤是：(1)提取、纯化鸡球虫各发育阶段的孢子生殖阶段抗原、裂殖子生殖阶段抗原、配子生殖阶段抗原；(2)按一定比例混合以上三种抗原，选择适宜免疫佐剂与抗原混合制备成混合抗原；(3)选用未免疫的产蛋鸡，采用不同免疫佐剂制备的混合抗原胸肌注射免疫鸡；(4)收集被免疫鸡所产鸡蛋，分离出卵黄，采用水稀释法分离纯化卵黄抗体，并测定其抗体效价。临床试验结果表明，对鸡柔嫩艾美尔球虫病和鸡毒害艾美尔球虫病的保护率分别为100％和96.7％，其抗球虫指数分别为184.8和165.4，该产品产业化的成功实施，将为防治鸡球虫疾病提供一条新的途径，为解决药物残留等与人类健康相关的新问题提供基础。

Description

鸡球虫高免卵黄抗体的制备方法

技术领域

本发明公开了一种鸡球虫高免卵黄抗体的制备方法，属于生物制剂制备与禽病防治技术领域。

背景技术

鸡球虫病是由是由危害养鸡业的重大疾病之一，全世界每年因鸡球虫病造成的损失达80亿美元，目前在临床上防治该疾病主要是通过化学药物，由于不合理的用药方案，造成耐药性的普遍存在和严重的药物残留等问题，给防治该疾病带来很大的困难，同时造成食品安全等问题。

禽卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin，IgY)是禽类B淋巴细胞在抗原物质刺激下所产生并沉积在卵黄中的能与抗原发生特异性反应的一种球蛋白，抗体作为治疗药物具有作用迅速、疗效确切等优点。IgY来源于禽的血液，卵泡可以将禽血液中的抗体选择性地主动转运到卵黄中，许多实验证明卵黄中的IgY浓度能长期维持在相当于甚至超过血液浓度的水平上。目前大多数禽类疾病，特别是用抗生素治疗无效的病毒性疾病，如鸡法氏囊病、鸡新城疫、鸡减蛋综合征、鸭病毒性肝炎、小鹅瘟等，都已有成功开发出高效卵黄抗体的报道。例如《抗轮状病毒卵黄免疫球蛋白制备工艺及生物活性研究》荫俊等，解放军药学学报，第16卷第2期，2000年。《仔猪腹泻多病原特异性卵黄抗体治疗和预防剂的研究》王金洛等，2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集，2005年。与本发明最相关的是中国专利号为ZL 200510027330.0的《抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法》。尽管两者都利用了抗原产生抗体的原理，但是与本发明在目的，技术路线尤其在所选抗原的构思及制备上完全不同。

发明内容

根据IgY在疾病防治方面的应用领域空前扩大，理论上能引起动物体液免疫的疾病都可以通过卵黄抗体治疗，不仅可用于防治细菌、病毒等微生物引起的疾病，而且还能用于防治寄生虫疾病的原理。因此，本发明的目的是提供一种抗鸡球虫病的高免卵黄抗体制备方法，采用高纯度免疫混合抗原，加免疫佐剂后接种未免疫的产蛋鸡，诱导其产生高免卵黄抗体。该抗体经注射或口服后，可以有效预防和治疗鸡球虫病，减少鸡群临床耐药性产生，解决药物残留等问题。

实现本发明目的技术方案是：提取球虫各发育阶段的免疫抗原，混合后加入适宜的免疫佐剂，选择合理的免疫程序免疫未免疫的产蛋鸡，收集卵黄分离纯化卵黄抗体，并进行效价测定，选择高效价卵黄抗体制备成口服或注射液，用于鸡球虫病的防治。其具体的步骤如下：

(1)免疫抗原的提取、纯化和免疫佐剂的选择，包括提取、纯化鸡球虫各发育阶段的孢子生殖阶段抗原、裂殖子生殖阶段抗原和配子生殖阶段抗原。

(2)按1∶1∶1比例混合以上三种抗原，选择蜂胶作为免疫佐剂与抗原混合制备成免疫用混合抗原。

(3)制定合理的免疫程序，选用未免疫的产蛋鸡，采用以蜂胶作为免疫佐剂制备的免疫用混合抗原胸肌注射免疫鸡。

(4)收集被免疫鸡所产鸡蛋，即在鸡三免后一周开始收集所产鸡蛋，分离出卵黄，采用水稀释法分离纯化卵黄抗体，并测定其抗体效价。

根据合理的免疫程序在采用免疫用混合抗原胸肌注射免疫蛋鸡时，必须连续免疫三次，每间隔7天免疫一次，第三次免疫后的第7天收集鸡蛋备用，用琼脂扩散试验检测蛋黄中抗体的效价；同时设立对照组。

卵黄抗体的提取纯化采用水稀释法即将卵黄液用10倍水稀释后，调节pH值至5.2，4℃静置6小时以上，离心去除颗粒，再用硫酸盐沉淀浓缩，并经过超滤方法进一步纯化、浓缩。

通过以上述步骤获得的球虫各发育阶段的免疫抗原，是球虫各发育阶段的孢子生殖阶段、裂殖子生殖阶段和配子生殖阶段所提取、纯化的混合抗原；其获得的鸡球虫高免卵黄抗体，是鸡柔嫩艾美尔球虫株和毒害艾美尔球虫株的高免卵黄抗体。

按照国家兽用药品质量标准将高免卵黄抗体制备成注射液或口服液并进行该制剂安全性试验后即可用于规模化的有效预防和治疗鸡球虫病。

本发明的明显效果是：

临床试验结果表明，对鸡柔嫩艾美尔球虫病和鸡毒害艾美尔球虫病的保护率分别为100％和96.7％，其抗球虫指数分别为184.8和165.4，该产品产业化的成功实施，将为防治鸡球虫疾病提供一条新的思路和途径，势必将会改变业内对该疾病防治观念，同时为解决药物残留等一系列与人类健康相关的新问题提供了基础。

具体实施方式

首先需要一些预处理。先进行鸡球虫株的分离与鉴定。采集各大、中型养鸡场粪样，分离、鉴定并保存鸡球虫虫株。本实施例采用的是鸡柔嫩艾美尔球虫株和毒害艾美尔球虫株。其次是收集虫体卵囊分离、纯化。采用糖溶液漂浮法分离虫体卵囊，将分离的卵囊加入2.5％重铬酸钾液体，放置在25-28℃的恒温培养箱中培养1-7天，每天将培养液轻轻搅拌3次，显微镜下观察全部孢子化后收集卵囊备用。

1、免疫抗原的提取、纯化和免疫佐剂的选择。

(1)孢子生殖阶段抗原的提取：将纯化的孢子化卵囊置灭菌PBS液中，超声波裂解，显微镜下检查卵囊破碎情况，裂解完全后，在裂解物中加入试剂TritonX一100(终浓度为0.5％)，于4℃下27000×g离心30min。取上清液即为全可溶性抗原，然后将可溶性抗原用SephadexG一200凝胶过滤层析，按峰收集。

(2)裂殖子生殖阶段抗原的提取：用孢子化卵囊感染12～24日龄无球虫雏鸡，感染后5天扑杀，剪开肠壁，去掉盲肠内容物并清洗，随后将洗过的载玻片刮下黏膜，将黏膜放于匀浆器中匀浆5min，使裂殖子充分游离出来。再通过标准分样筛过滤、离心10min，将沉淀用洗脱液重悬，如此洗涤、沉淀3次。加入PBS液，以600r/min离心8min，收集上清即获得裂殖子，并经DEAE一52纤维素层析柱纯化。在纯化后的裂殖子加人TritonX一100，裂解物于4℃下27000×g离心30min。取上清液即为裂殖子抗原，然后将可溶性抗原用SephadexG凝胶过滤层析，收集230KD蛋白。

(3)配子生殖阶段抗原的提取：剪下严重感染的肠段，去掉肠内容物并清洗，随后将洗过用载玻片刮下黏膜，将黏膜置研磨管中研磨使裂殖子充分游离出来，收集裂殖子并加入裂解液，离心取上清，并用SephadexG凝胶过滤层析，收集82KD蛋白。

2、按一定比例混合以上三种抗原，选择适宜免疫佐剂与抗原混合制备成免疫用混合抗原。本实施例选择的免疫佐剂为蜂胶，免疫佐剂蜂胶的含量为10mg/ml，获取的三种抗原混合比例是1∶1∶1，充分混合后制备成免疫用混合抗原；混合抗原蛋白含量终浓度为2.0-3.0mg/ml。

3、制定合理的免疫程序，采用琼脂扩散试验检测卵黄中抗体效价。

(1)选用未免疫的产蛋鸡，采用蜂胶作为免疫佐剂制备的免疫用混合抗原胸肌注射免疫鸡，每间隔7天免疫一次，连续3次后，于第7天收集鸡蛋备用，同时设立对照组。

(2)用琼脂扩散试验检测蛋黄中抗体的效价

4、卵黄抗体的分离、纯化。

水稀释法：将卵黄液用10倍水稀释后，调节pH值至5.2，4℃静置6h以上，离心去除颗粒，在用硫酸盐沉淀浓缩，并经超滤等方法进一步纯化、浓缩。

5、高免卵黄抗体注射液(口服液)的制备以及该制剂安全性试验。

将高免卵黄抗体按注射液(口服液)质量标准制备成兽用药品，并按注射液(口服液)稳定性技术操作规范考察其稳定性。

实施例1

采用鸡柔嫩艾美尔球虫株各发育阶段的孢子生殖阶段抗原、裂殖生殖阶段抗原和配子生殖阶段抗原，按照上述步骤制成免疫用混合抗原。选用未免疫的产蛋鸡50只，将制备的混合免疫抗原每只鸡胸肌注射免疫，每间隔7天注射免疫一次，连续注射免疫3次，每次注射免疫剂量为1ml。于第三次免疫后的第7天收集鸡蛋。分离蛋清获得卵黄，将卵黄液用10倍水稀释后，调节pH值至5.2，4℃静置6h以上，离心去除颗粒，用硫酸盐沉淀浓缩，经超滤后纯化为需要的高免卵黄抗体，并用琼脂扩散试验检测，其效价在1∶64以上为合格。

实施例2

采用鸡毒害艾美尔球虫株各发育阶段的孢子生殖阶段抗原、裂殖子生殖阶段抗原和配子生殖阶段抗原，按照上述步骤制成免疫用混合抗原。

选用未免疫的产蛋鸡50只，将制备的免疫用混合抗原每只鸡胸肌注射免疫，每间隔7天注射免疫一次，连续注射免疫3次，每次注射免疫剂量为1ml。第三次免疫后的第7天收集鸡蛋。分离蛋清获得卵黄，将卵黄液用10倍水稀释后，调节pH值至5.2，4℃静置6小时以上，离心去除颗粒，用硫酸盐沉淀浓缩，经超滤后纯化为需要的高免卵黄抗体，并用琼脂扩散试验检测，其效价在1∶64以上为合格。

Claims (4)

1.一种鸡球虫高免卵黄抗体的制备方法，其特征包括如下步骤：

(1)免疫抗原的提取、纯化和免疫佐剂的选择，包括提取、纯化鸡球虫各发育阶段的孢子生殖阶段抗原、裂殖子生殖阶段抗原和配子生殖阶段抗原。

(2)按1∶1∶1比例混合以上三种抗原，选择蜂胶作为免疫佐剂与抗原混合制备成免疫用混合抗原。

(3)选用未免疫的产蛋鸡，采用以蜂胶作为免疫佐剂制备的免疫用混合抗原胸肌注射免疫鸡。

(4)收集被免疫鸡所产鸡蛋，即在鸡三免后一周开始收集所产鸡蛋，分离出卵黄，采用水稀释法分离纯化卵黄抗体，并测定其抗体效价。

2.根据权利要求1所述的鸡球虫高免卵黄抗体的制备方法，其特征是采用免疫用混合抗原胸肌注射免疫蛋鸡，连续免疫三次，每间隔7天免疫一次，第三次免疫后的第7天收集鸡蛋备用，用琼脂扩散试验检测蛋黄中抗体的效价；同时设立对照组。

3.根据权利要求1所述的鸡球虫高免卵黄抗体的制备方法，其特征是卵黄抗体的提取、纯化采用水稀释法，即将卵黄液用10倍水稀释后，调节pH值至5.2，4℃静置6小时以上，离心去除颗粒，再用硫酸盐沉淀浓缩，并经过超滤方法进一步纯化、浓缩。

4.根据权利要求1所述方法，其中鸡球虫高免卵黄抗体是鸡柔嫩艾美尔球虫株和毒害艾美尔球虫株的高免卵黄抗体。