CN1385442A - 抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗体活性的抗鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸡大肠杆菌复合卵黄抗体(抗—BA IgY)、制备该抗体的方法及其在制备用于治疗因鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸡大肠杆菌混合和/或单一感染引起的相关疾病药物或饲料添加剂中的应用。上述方法为:制备鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸡大肠杆菌复合抗原,将该抗原免疫健康母鸡,收集其所产的卵,再从卵中提取抗—BA IgY。

Description

抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及了一种具有抗体活性的卵黄抗体物质——抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体(抗—BA IgY)产品，并涉及其制备工艺及在禽类药学上的应用。

技术背景

鸡白痢是由沙门氏菌引起的在各种年龄的以鸡为代表的禽类均可发生的一种烈性传染病，主要通过消化道感染。种鸡中的病鸡或带菌鸡是该病的主要传染来源，同时在同群鸡中又互相感染传播；由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)所引起的禽霍乱，是一种呈世界性分布的重要禽细菌性传染病；大肠杆菌是家禽最常见的病原菌之一，可引起家禽胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎和全眼球炎等一系列表现。这些病一年四季均可发生，造成的危害贯穿了整个养鸡周期，在目前条件下，大多数鸡群均有不同程度感染。若得不到有效地控制，将给养禽业造成严重的经济损失。

有关鸡细菌混合感染的防治，饲养者通常在雏鸡开食之日起，便在饲料、饮水中添加青霉素、土霉素等抗生素药物，靠该类药物防治禽类细菌性疾病虽对鸡群的成活率有一定的帮助，却直接导致肉禽类食品抗生素残留、激素残留、重金属残留和农药残留大大超过我国自订的绿色无污染标准和国际出口标准；另有部分养殖企业采用中药制剂方式对鸡群进行该类疫病的防治，但由于种种原因，中药制剂禽药的效果不甚理想，其主要原因是禽类对中药药剂的吸收不好，药效在鸡体上得不到较好的体现，因而疫病在鸡群中无法从根本上得到控制。以上几点是我国现行禽类细菌性感染疫病的的主要防治方式，均各有弊端，不利于我国肉禽蛋类产品的质量得到确切有效的提高。长期食用这样的肉食品，将给人们的身体健康带来严重的损害。

近年来许多国家都逐渐在使用包括活菌苗、灭活苗、益生菌等生物制剂来控制细菌性感染禽类疫病，这种生物制剂防治鸡细菌感染的效果多数情况下是单一的，相当于药物预防的水平，对混合感染的疾病无能为力，禽类细菌性传染病发病率与死亡率高达50-100％，疫苗对健康动物传染病的预防是根本，但对临床上一定比例发病群体和混合感染的治疗至今是一个难题。

鸡卵黄抗体(IgY)是来自鸡血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的结构与IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空间构象。研究表明IgY具有高度的稳定性，对热、酸、碱环境中具有优良的耐受性，同时IgY还具有成本低、易于形成规模化生产的优点。

现有技术中未见有通过采用联合沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌作为抗原，免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取的抗—BAIgY和方法的报道。

发明的内容

本发明根据禽兽药类向生物制剂方向发展的趋势进行研究，针对鸡白痢、禽霍乱、禽大肠杆菌等主要靠抗生素药物进行防治的细菌性疫病问题，采用鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌菌体复合抗原接种产蛋鸡后，诱导其体液免疫系统产生高效价免疫球蛋白。通过改良水溶法精提(纯度达到95％以上)的免疫球蛋白。解决了以往生物制剂禽兽类药物杂质含量过高，免疫球蛋白效用不明显，受制条件多，无法真正进行产业化生产的难点，有效提高了免疫球蛋白的纯度，使其直接作用于鸡体，其同源性及效用性均高于其它的生物制剂；同时解决了抗生素药物对肉禽蛋类产品残留物的问题，为有效提高了该类产品的质量提供了有利的保证。

本发明针对以上问题，研制出一种方便、高效、无毒副作用的非抗生素生物禽药，用于因鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌感染所引起的禽类感染疾病的防治。因其制备免疫球蛋白的方法较以往的要简单、快速、易于掌握，提取回收率理想，经济效益可观，适于产业化制作。

本发明通过以沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌菌体为抗原，免疫健康产蛋母鸡，提取活性成分(抗-BAIgY)。为治疗禽混合细菌感染提供一条新思路和新方法，并为进一步制备抗沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌混合感染的免疫生物制剂奠定基础。因此：

本发明所要解决的技术问题之一是：针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有抗体活性的抗沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌的新型复合卵黄抗体(抗—BAIgY)。

本发明所要解决的技术问题之二是：提供上述抗沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌复合卵黄抗体(抗—BAIgY)的制备方法。

本发明所要解决的技术问题之三是：提供上述抗沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌复合卵黄抗体(抗—BAIgY)在制备用于禽类因沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌单一或混合感染引起的鸡白痢、禽霍乱、鸡大肠杆菌病等禽类细菌感染性疾病的预防或治疗的生物药物制剂及其相关产品应用。

本发明解决上述技术问题之一所提供的抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体(抗—BAIgY)，其特征在于：所述抗—BAIgY按YSDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰单一的特异性酶染条带；采用双缩脲生化法测定蛋白浓度；经抗—BAIgY体外拮抗细菌生物活性检测，浓度在200ug/ml时可明显抑制沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌细菌的生长，经奥氏双扩散方法进行抗—BAIgY效价测定抗—BAIgY效价为1∶320-1∶12800。

本发明解决上述技术问题之二是通过采用这样的技术方案实现的，即一种制备抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体(抗—BAIgY)的方法，其特征在于采用如下的步骤完成：

1.制备混合菌体抗原

(1)培养鸡沙门氏杆菌：以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，低温超声波破碎，得菌体抗原。

(2)培养多杀性巴氏杆菌，以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，低温超声波破碎，得菌体抗原。

(3)将大肠杆菌接种于麦康凯琼脂平板上，置37℃培养24小时。得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h。收集菌体，低温超声波破碎，得菌体抗原。

以上抗原按重量比1∶1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得复合菌体抗原，备用。

2.将混合菌体抗原按以下的步骤制备抗体：

(1).对产卵母鸡的免疫：A.基础免疫：选用产卵母鸡(健康)隔离饲养。进行鸡皮下多点注射鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌复合菌体抗原，0.5ml/只。B.强化免疫：基础免疫7天后，进行强化免疫，注射不完全福氏佐剂抗原0.5ml/只。C.超强化免疫：21天后需超强化免疫1-3次。注射量2.5ml/只，以保持抗体滴度。

于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。

(2).卵黄抗体的提取

①.采用水溶法提取卵黄抗体。从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗—BAIgY。

或②采用膜过滤法提取卵黄抗体。分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为150KD和200KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗—BAIgY。

本发明所提供的上述抗—BAIgY产品由鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸡大肠杆菌免疫产卵母鸡而得，具有特异性，对防治禽类因鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌单一和或混合感染引起的消化道传染病具有良好的效果。本发明采用母鸡所产鸡卵为载体，安全无毒，易于产业化。

附图的说明

附图给出了本发明制备方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作进一步的说明：

实施例1：具有抗体活性的鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌复合卵黄抗体的产品，可以通过以下步骤获得：制备鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌复合抗原，将抗原免疫健康母鸡，然后收集其所产卵，再从其所产卵中提取抗—BAIgY。

实施例2：菌体抗原的制备，病原菌菌株，在营养肉汤培养基中扩大培养24h。收集菌体的，超声波破碎，按重量比1∶1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得菌体抗原。

实施例3：采用如下方式分离提取抗—BAIgY：从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗—BAIgY。

实施例4：分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗—BAIgY。

实施例5：取实施例1、3、4中的产品进行IgY纯度检查：用PAGE电泳检测纯化的卵黄抗体的纯度，电泳中只出现一条电泳带，即为提纯的卵黄抗体。

实施例6：取实施例1、3、4中的产品进行IgY浓度检查：将提取的用PBS作5-10倍的稀释，然后用采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。

实施例7：取实施例1、5、6中的产品进行抗—BAIgY效价测定：采用奥氏双扩散方法进行抗—BAIgY效价测定，抗—BAIgY效价为1∶320-1∶12800。

实施例8：采集抗—BAIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至400ml待用，其中含有精提(即指纯度在95％以上的IgY抗—BAIgY)10克。将葡萄糖10克加入50ml水溶解，100℃灭菌30分钟，将处理过的辅料与50ml超滤液混合均匀，冷冻干燥，无菌粉碎包装成袋，每小袋内含0.5克，用于治疗因细菌单一和或混合感染引起的禽类消化道传染病。

实施例9：采集抗—BAIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至400ml待用，其中含有精提(即指纯度在99.5％以上的IgY抗—BAIgY)10克。超滤液按5-10％加入甘露醇，混合均匀，分装0.1克/瓶，冷冻干燥。用于治疗因细菌单一和或混合感染引起的烈性肠道传染病。

实施例10：体外实验：

①.分子量检测：SDS-PAGE电脉，分离胶长度8％，浓缩胶浓度5％，稳流11mA电脉5h，Marker采用低相对分子质量标准蛋白质，取下凝胶用于常规银染色法和转移电泳，测得分子量为180KD。

②.纯度分析：免疫印迹(参照文献进行)，纯度为95％。

③.活性检测：ELISA间接试验，操作方法参照常规ELISA间接法，所用抗原、抗—BAIgY、酶标抗体均按棋盘滴定法确定工作浓度，细菌抗原浓度为100μg/ml，包被板每孔加样100μl，被测抗—BAIgY每孔加样100μl，辣根过氧化物酶标抗兔抗鸡IgG(Sigma公司)工作稀释度为1∶10000，底物为OPD，2ml/浓硫酸终止反应，酶标仪492nm下测定OD值。结果表明抗—BAIgY对三种细菌的滴度范围在1∶320-1∶12800之间。

实施例11：IgY抗体抑制细菌粘附的作用：

抗—BAIgY抗体和沙门氏菌、大肠杆菌、肠上皮细胞一起培养，每ml添加1mg抗体就观察到粘附在肠上皮细胞上的沙门氏菌和大肠杆菌减少。抗体浓度达到10mg/ml时，效果更好。说明抗—BAIgY抗体能抑制大肠杆菌和沙门氏菌粘附在肠上皮细胞上，进而阻断了细菌的繁殖和产生毒素。

实施例12：抗—BAIgY体外抑制细菌生长的生物活性检测：

抗—BAIgY(10μg～200μg/ml)与细菌(10⁵～10⁷ug/ml)在无菌条件下1∶1混合。37℃24h后，取0.1ml上清加入营养琼脂培养中，发现IgY浓度在200μg/ml可明显抑制细菌的生长；其后的系列稀释，其抑制保护活性亦随之减低，至10μg/ml时已无保护活性。

实施例13：口服抗—BAIgY在体生物学活性观察：参照相关文献建立鸡细菌感染的模型，试验分为治疗组〖低剂量(5mg/kg)、中剂量(15mg/kg)、高剂量(35mg/kg)抗—BAIgY〗，对照组；口服治疗3、5、7天后，观察动物的腹泻、存活情况，肠粘膜病理学检查BA细菌检测含量测定等指标。结果发现：中、高剂量组在治疗5天后，腹泻症状减轻，粘膜致病菌数量明显下降，10天后动物的肠粘膜病理学检查指标有明显改善。说明口服抗体(15mg/kg)即可起到改善临床症状，提高生存率的作用。

实施例14：注射抗—BAIgY在体生物学活性观察：参照相关文献建立鸡细菌感染的模型，试验分为治疗组(低剂量(5mg/kg)、中剂量(10mg/kg)、高剂量(20mg/kg)抗—BAIgY)，对照组。治疗3、5、10天后，观察动物腹泻、存活情况，肠粘膜病理学检查，细菌检测含量测定等指标。结果发现：在治疗5天后，三组动物的腹泻情况，肠粘膜病理学改善，细菌数量均有明显下降；中浓度组死亡率5.2％，而对照组为80％。说明抗—BAIgY在10mg/kg应用时，即能显著改善鸡的发病症状，提高存活率。

Claims (3)

1、一种抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体(抗—BAIgY)，其特征在于：所述抗体按SDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰单一的特异性酶染条带；经抗—BAIgY体外拮抗细菌生物活性检测，浓度在200μg/ml时可明显抑制沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌细菌的生长，经奥氏双扩散方法进行抗—BAIgY效价测定：抗—BAIgY效价为1∶320-1∶12800。

2、一种制备抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体，即抗—BAIgY的方法，其特征在于：采用如下的工艺步骤：

(1)制备复合菌体抗原

A、培养鸡沙门氏杆菌：以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，低温超声波破碎，得菌体抗原；

B、培养多杀性巴氏杆菌，以羊血营养琼脂斜面传代，37℃培养24h，得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，低温超声波破碎，得菌体抗原；

C、将大肠杆菌接种于麦康凯琼脂平板上，置37℃培养24小时。得纯菌种后，在营养肉汤培养基中扩大培养24h，收集菌体，低温超声波破碎，得菌体抗原，以上抗原按重量比1∶1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得复合菌体抗原；

(2)将菌体抗原按以下的步骤制备抗体：1).对产卵母鸡的免疫：A.基础免疫；选用产卵母鸡(健康)隔离饲养，进行鸡皮下多点注射鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌复合抗原，0.5ml/只；B.强化免疫：基础免疫7天后，进行强化免疫，注射不完全福氏佐剂抗原0.5ml/只；C.超强化免疫：21天后需超强化免疫1-3次。注射量2.5ml/只，以保持抗体滴度；

2).卵黄抗体的提取

①.采用水溶法提取卵黄抗体；从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗—BAIgY；

或②.采用膜过滤法提取卵黄抗体：分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD—200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗—BAIgY。

3、权利要求1、2所述的抗禽类细菌性疫病的复合卵黄抗体，即抗—BAIgY在制备用于治疗禽类因鸡沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸡大肠杆菌单一和/或混合感染引起的相关疾病的禽类药物或饲料添加剂中的应用。