CN106754703B - 一种til细胞体外扩增培养基组合和培养方法 - Google Patents

一种til细胞体外扩增培养基组合和培养方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种TIL细胞体外扩增培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；所述诱导培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖和枸杞多糖；所述增殖培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、白细胞介素和单克隆抗体；所述活化适应培养基包括：基础培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。通过上述技术方案，利用本公开所提供的TIL细胞体外扩增培养基组合和方法培养获得的TIL细胞数量更多，在临床治疗中也具有更高的靶细胞杀伤活性。

Description

一种TIL细胞体外扩增培养基组合和培养方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种TIL细胞体外扩增培养基组合和培养方法。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是浸润于肿瘤组织中以肿瘤抗原特异性CD4+、CD8+T细胞为主，同时包括B细胞和NK细胞的细胞群。因TIL与肿瘤细胞密切接触，理论上可以对肿瘤细胞产生特异性的杀伤作用。TIL疗法是一种肿瘤特异性的细胞免疫疗法，将体外培养增殖后的TIL回输到体内，其在血液及肿瘤中可以长时间存活并行使杀伤功能。该方法具有高效、特异、副作用小等优点，可应用于实体瘤和各类晚期癌性胸、腹水患者的治疗。目前临床应用的TIL的来源主要有两个方面：1、手术切除的肿瘤组织或淋巴结；2、癌性胸腹水。常规的TIL细胞培养方法受肿瘤大小、肿瘤浸润程度以及胸腹水量等诸多因素的限制，细胞在培养过程中的增殖速度慢、增殖倍率低，培养获得的细胞往往杀伤活性较差从而不能满足临床治疗的要求。此外，由于TIL不仅包含肿瘤杀伤性CD8+T细胞(CTL)，而且还包含抑制CTL抗肿瘤功能的调节型CD4+CD25+T细胞(Treg细胞)和髓系衍生抑制细胞(MDSC)。现有的TIL细胞扩增方法中往往通过使用大量IL-2的方式刺激肿瘤组织或胸腹水中淋巴细胞增殖，然而IL-2用量过高可使培养的TIL中CD4+CD25+Treg细胞数量增加，令其难于有效发挥肿瘤杀伤效应，导致肿瘤免疫逃逸发生。因此有必要开发一种适用于大量扩增有杀伤活性TIL细胞的技术从而为其临床应用提供技术支持。
发明内容
本公开的目的是提供一种适用于大量扩增有杀伤活性TIL细胞的技术。
为了实现上述目的，本公开提供一种TIL细胞体外扩增培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；
所述诱导培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖和枸杞多糖；
所述增殖培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、白细胞介素和单克隆抗体；
所述活化适应培养基包括：基础培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。
可选地，所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15中的至少一种。
可选地，所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15。
可选地，所述单克隆抗体为CD3单克隆抗体、CD134单克隆抗体和PD-1单克隆抗体中的至少一种。
可选地，所述基础培养基为AIM-V培养基和RPMI-1640培养基中的至少一种，所述灭活动物血清为胎牛血清。
可选地，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：
香菇多糖20-50μg/mL、黄芪多糖20-50μg/mL、党参多糖20-50μg/mL、枸杞多糖20-50μg/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1-1.4。
可选地，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：
IL-7 5-15ng/mL、IL-12 5-15ng/mL、IL-15 5-15ng/mL、CD3单克隆抗体10-30ng/mL、CD134单克隆抗体10-30ng/mL、PD-1单克隆抗体10-30ng/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1.2-1.6。
可选地，所述活化适应培养基包括以下含量的各组分：
胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：2-4。
本公开的第二个方面还提供了一种TIL细胞体外扩增培养方法，包括使用本公开第一个方面所述的TIL细胞体外扩增培养基组合，所述方法包括：
诱导培养：将TIL细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞；
增殖培养：将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养7-12天获得增殖培养细胞；
活化适应：将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天。
可选的，所述方法还包括从胸腹水中提取TIL细胞：
收集胸腹水，添加终浓度为12-15U/mL的肝素钠，用Ficoll分离液进行密度梯度离心收集单个核细胞；将所述单个核细胞用基础培养基重悬获得细胞悬液，用免疫磁珠对细胞悬液进行分选收集TIL细胞，再利用所述TIL细胞体外扩增培养基组合进行培养。
可选的，所述诱导培养、增殖培养和活化适应在免疫细胞体外扩增装置中进行，所述装置包括细胞培养袋(1)和承载所述细胞培养袋(1)的承载台(3)，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋(1)中的磁性浮球(2)以及在悬挂于所述细胞培养袋(1)上方并且能够驱动所述磁性浮球(2)在所述细胞培养袋(1)中移动的磁性悬挂驱动器(4)，所述磁性悬挂驱动器(4)包括能够吸引所述磁性浮球(2)的磁体片(41)和能够悬挂且驱动所述磁体片(41)在所述细胞培养袋(1)上方移动的悬挂驱动架(42)；所述细胞培养袋(1)中充有细胞培养液，述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞；所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上；所述磁体片(41)能够在所述细胞培养袋(1)上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球(2)在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球(2)在培养液液面以下的部分能够搅拌培养液。
本公开的发明人对于TIL细胞的体外扩增技术进行的大量的研究，意外的发现与细胞体外扩增培养体系中加入的IL-2相比较，加入IL-7和IL-15可得到与相同扩增倍数和体外功能的TIL。IL-7和IL-15既能够刺激T淋巴细胞的体外增殖，又能够维持中枢记忆CD8+T细胞的干性，促进CD8+T细胞产生IFN-γ，对肿瘤细胞起到直接杀伤作用，并减少CD4+CD25+Treg细胞的数量，发挥了协同增效的作用。故IL-7和IL-15联合使用可代替高剂量IL-2应用于TIL的体外扩增。同时，CD3单克隆抗体作为诱导剂活化和扩增CD8+T细胞；CD134单克隆抗体可刺激TIL中CD8+T细胞亚群的共刺激信号，促进细胞的活化，提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达，增强其杀伤能力；PD-1单克隆抗体可促进CD8+T细胞扩增，加强细胞因子和颗粒酶分泌，提高对肿瘤细胞杀伤能力，并解除Treg细胞的免疫抑制作用。诱导培养过程中利用多糖类中药提取物减弱了MDSC的免疫抑制作用。
通过上述技术方案，本公开所提供的TIL细胞体外扩增培养基不需要使用大量IL-2进行淋巴细胞刺激，进而避免了TIL细胞中含有大量Treg细胞和NK细胞的缺陷，增加了细胞在临床应用中的有效性。而且采用含有不同组分的按照一定的配比方式制备的培养基在细胞生产的特定阶段进行有针对性的培养，可以更好的满足TIL细胞在不同阶段的生长需求，培养基中的各组分发挥协同增效作用可以更有效的扩增和活化TIL细胞，培养获得的TIL细胞数量更多，细胞在临床治疗中也具有更高的活性。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的切向示意图。
图2是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的俯视示意图。
图3是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的部件示意图。
图4是实施例和对比例TIL细胞扩增倍数结果示意图。
图5是实施例和对比例培养的TIL细胞中各类细胞数量百分比示意图；
A是CD3+和CD3+CD8+细胞数量百分比示意图；
B是Treg细胞数量百分比示意图。
图6是实施例和对比例培养的TIL细胞杀伤率结果示意图。
附图标记说明
1 细胞培养袋 2 磁性浮球 3 承载台
4 磁性悬挂驱动器
11 进气口 12 出气口 13 进液口
14 出液口 15 人工瓣膜片
31 恒温托盘 32 底座
41 磁体片 42 悬挂驱动架 43 悬臂
431 限位孔 432 驱动孔 4310 限位杆
4311 支撑架 4320 丝杆 4321 电动机
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一个方面提供了一种TIL细胞体外扩增培养基组合，包括诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；
所述诱导培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖和枸杞多糖；
所述增殖培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、白细胞介素和单克隆抗体；
所述活化适应培养基包括：基础培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。
在本公开的具体实施过程中，根据细胞培养的不同阶段依次先后使用所述诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基。
优选的，所述基础培养基为AIM-V培养基和RPMI-1640培养基中的至少一种，所述灭活动物血清为胎牛血清。
特别优选的，为了进一步提高TIL细胞的增殖数量和活性，所述基础培养基由AIM-V培养基与RPMI-1640培养基组成。
可选的，所述诱导培养基中还可以含有其他来自天然中药物质的提取物，所述天然中药提取物可以为已经证实对TIL细胞的增殖有积极影响的中药提取物种类，例如，所述中药提取物包括但不限于人参多糖、人参皂苷、黄岑素、三七皂苷、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、姜黄素、云芝多糖、沙苑子总黄酮、虫草多糖、三叶青提取物等。本公开对于添加的天然中药提取物的量没有特别的限制，只要能够有效的提高细胞的增殖数量和活性即可。
可选的，所述诱导培养基中还可以含有细胞培养中所常用的添加物，例如，葡萄糖、维生素、氨基酸、无机盐、抗生素等。
在本公开的一种优选的实施方式中，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：香菇多糖20-50μg/mL、黄芪多糖20-50μg/mL、党参多糖20-50μg/mL、枸杞多糖20-50μg/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1-1.4。
更为优选的，为了提高诱导培养效果，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：香菇多糖30-40μg/mL、黄芪多糖30-40μg/mL、党参多糖30-40μg/mL、枸杞多糖30-40μg/mL、体积百分含为8-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1.1-1.3。
所述诱导培养基的作用在于通过合理配比利用具有诱导激活作用的物质，对TIL细胞进行激活，促使其分泌细胞因子等物质进而加快细胞的增殖。TIL细胞可以在所述诱导培养基中诱导培养2-4天获得诱导培养细胞。
可选的，所述增殖培养基中还可以含有细胞培养中所常用的添加物，例如，葡萄糖、维生素、氨基酸、无机盐、抗生素等。
可选的，所述增殖培养基还可以含有其它具有TIL细胞刺激作用的细胞因子组分，例如肿瘤坏死因子、表皮生长因子等；所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15中的至少一种。在本公开的一种特别优选的实施方式中，所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15。
优选的，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：IL-7 5-15ng/mL、IL-125-15ng/mL、IL-15 5-15ng/mL、CD3单克隆抗体10-30ng/mL、CD134单克隆抗体10-30ng/mL、PD-1单克隆抗体10-30ng/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1.2-1.6。
所述增殖培养基的作用在于通过合理配比和利用能够促进TIL细胞增殖的物质实现细胞的大量体外增殖。诱导培养后的细胞可以在所述增殖培养基中增殖培养7-12天获得增殖培养细胞。
所述活化适应培养基还可以含有细胞培养中所常用的添加物，例如，葡萄糖、维生素、氨基酸、无机盐、抗生素等。
优选的，所述活化适应培养基包括以下含量的各组分：胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：2-4。
所述活化适应培养基的作用在于为增殖培养后的TIL细胞提供接近体内条件的营养环境，使得TIL细胞在临床应用时能够更为有效的发挥生物学作用，增殖培养后的细胞可以在所述活化适应培养基中培养0.5-1.5天。
本公开的第二个方面提供一种TIL细胞体外扩增培养方法，包括使用本公开第一个方面所述的TIL细胞体外扩增培养基组合，所述方法包括：
诱导培养：将所述基础培养细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞；
增殖培养：将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养7-12天获得增殖培养细胞；
活化适应：将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天。
在本公开的第二个方面中，每次进行细胞接种的细胞密度为4.5×105个/mL-5.5×105个/mL。
细胞培养的条件包括在5％CO2，37℃的环境下进行。
其中，在所述增殖培养阶段，优选每两天进行一次细胞传代并更换一次新鲜的增殖培养基，传代可以利用本领域常规的TIL细胞传代方法进行。
在本公开的一种可选的实施方式中，所述方法还包括从胸腹水中提取TIL细胞：
收集胸腹水，添加终浓度为12-15U/mL的肝素钠，用Ficoll分离液进行密度梯度离心收集单个核细胞；将所述单个核细胞用基础培养基重悬获得细胞悬液，用免疫磁珠对细胞悬液进行分选收集TIL细胞，再利用所述TIL细胞体外扩增培养基组合进行培养；其中，用于重悬所述单个核细胞的基础培养基中AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：0.5-1。
本公开对于磁珠分选的方法没有特别的限制，可以通过本领域常规的TIL细胞磁珠分选方式进行。
在本公开的一种优选的实施方式中，所述诱导培养阶段、增殖培养阶段和活化适应阶段在免疫细胞体外扩增装置中进行，该装置包括细胞培养袋1和承载所述细胞培养袋1的承载台3，其中，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋1中的磁性浮球2以及在悬挂于所述细胞培养袋1上方并且能够驱动所述磁性浮球2在所述细胞培养袋1中移动的磁性悬挂驱动器4，所述磁性悬挂驱动器4包括能够吸引所述磁性浮球2的磁体片41和能够悬挂且驱动所述磁体片41在所述细胞培养袋1上方移动的悬挂驱动架42；所述细胞培养袋1中充有细胞培养液，述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞；所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上；所述磁体片41能够在所述细胞培养袋1上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球2在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球2在培养液液面以下的部分能够搅拌培养液。
其中，在使用状态下，所述细胞培养袋1中充有细胞培养液，所述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞，其中，所述培养基为本公开所述的诱导培养基、增殖培养基或活化适应培养基。所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上。所述磁体片41能够在所述细胞培养袋1上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球2在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球2在培养液液面以下的部分能够发挥柔和地搅拌培养液的作用，从而在所述细胞培养袋1中模拟体内环境，由此促进待扩增的细胞的生长和增殖。所述磁体片41可以为永磁体或电磁体。所述磁体片41的形状可以设置为弧形，以维持所述磁性浮球2的稳定。
可选地，所述悬挂驱动架42包括固定连接在所述磁体片41上的悬臂43；所述悬臂43上开设有至少一个限位孔431和至少一个设置有内螺纹的驱动孔432；所述悬挂驱动架42还包括至少二个支撑架4311以及限位连接在所述支撑架4311上的限位杆4310和丝杆4320；所述限位杆4310可滑动地穿过所述限位孔431；所述丝杆4320上设置有与所述驱动孔432的内螺纹匹配的外螺纹并螺旋穿过所述驱动孔432，且所述丝杆4320能够通过绕轴线转动驱动所述悬臂43沿所述限位杆4310滑动。
其中，所述悬挂驱动架42可以不限于上述结构，只要能驱动所述磁体片41移动即可。所述悬臂43和所述支撑架4311的高度可以设置为能够按需要调节的结构。所述磁体片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以进行合理地调节，只要能维持所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上且所述磁性浮球2在磁力作用下能够移动即可。所述磁体片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以通过所使用的磁性材料的性能和数量的合理改变而得到合理调节。所述磁体片41的数量可以为一个或多个，所述磁性浮球2的数量也可以为一个或多个。
可选地，该装置还包括能够驱动所述丝杆4320进行轴向转动的电动机4321。所述电动机4321的转速可以通过控制器进行合理地控制，避免磁性浮球2的移动速度过快或过慢。
可选地，在该装置的使用状态下，所述磁性浮球2能够不与所述细胞培养袋1的壁接触。也就是说，所述磁体片41与所述磁性浮球2之间的磁力应当小于所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2脱离培养液液面。同时，所述磁体片41与所述磁性浮球2之间的磁力与所述磁性浮球2的合力应当大于所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2沉底。
可选地，在该装置的使用状态下，以所述磁性浮球2的体积计，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位于所述细胞培养袋1中的细胞培养液液面以上且剩余部分位于液面以下。这样可以使得所述磁性浮球2便于移动，且具有较好的驱动液流的搅拌效果。
可选地，所述磁性浮球2的外壳为具有生物相容性的外壳，且所述磁性浮球2中设置有用于提供浮力的空腔。其中，生物相容性的外壳可以使用细胞培养领域的常规生物相容性材料制成，例如使用聚乳酸塑料、纳米羟基磷灰石材料和聚醚醚酮材料制成。用于提供浮力的空腔可以为一个或多个，空腔中可以填充轻质材料，例如泡沫塑料。所述磁性浮球2中所使用的磁性材料可以为永磁体和/或软磁体。
可选地，所述细胞培养袋1上开设有可封闭的进气口11、出气口12、进液口13和出液口14中的至少一者。其中，所述进气口11可以用于通入新鲜的培养用气体(例如体积百分比分别为95％的空气与5％的二氧化碳的混合气体)。所述出气口12可以实现培养用气体的循环。通入新鲜的培养用气体可以带有高于大气压的压力，所述出气口12可以连接有限压阀。进液口13可以用于向所述细胞培养袋1充入含有培养基以及待扩增的细胞的培养液。所述出液口14可以用于排出旧的培养基或者排出培养扩增后的培养液。
可选地，所述出气口12和/或所述出液口14上设置有能够阻止细胞通过的筛网。例如所述出液口14上可以设置有滤布，在开启所述出液口14时，可以将废旧培养基过滤排出而将细胞过滤留存在所述细胞培养袋1以内。也可以从所述出液口14反向通入新鲜培养基而将滤布上的细胞反向冲洗至细胞培养袋1以内，继续进行培养扩增。
可选地，所述细胞培养袋1的内部还设置有模拟血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述人工瓣膜片15可以适当地模拟生理状态下的血管瓣膜，也可以适当地增加搅拌液流效果。
可选地，所述承载台3包括能够维持细胞培养恒温的恒温托盘31和支撑所述恒温托盘31的底座32。所述恒温托盘31可以在15-40℃的温度内选择一个温度区间保持恒温，从而使得细胞培养扩增能够脱离复杂的培养设备而独立运行。
本公开提供的用于细胞体外扩增的装置所提供的扩增条件优于不进行搅拌的培养扩增条件，也优于其他非悬浮式底部磁性搅拌的培养扩增条件，能够取得更好的扩增效果。
所述免疫细胞体外扩增装置能够在体外模拟TIL细胞的体内增殖环境，实现模拟体内状态的蠕动式非接触搅拌，使得免疫细胞在培养过程中降低团聚并充分吸收本公开所述的培养基中的养分并接受信号分子的刺激，提高扩增的细胞收率以及细胞活性。
以下结合实施例具体说明本公开的技术方案。
实施例1
按照表1中给出的培养基成分配制诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基备用。
无菌条件下，收集临床诊断为肺癌患者的胸腹水1000mL，加入12U/mL的肝素钠；将添加有肝素钠的胸腹水离心收集细胞沉淀，用Ficoll分离液进行密度梯度离心收集分层液界面上的单个核细胞，用AIM-V无血清培养基洗涤2次后用基础培养基重悬(AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：0.8)获得细胞悬液，用免疫磁珠对细胞悬液进行分选，收集TIL细胞。
将TIL细胞调整细胞密度至5×105个/mL，在5％CO2、37℃的环境下于诱导培养基中进行诱导培养3天获得诱导培养细胞。将细胞离心收集起来，调整细胞密度至5×105个/mL，在5％CO2、37℃的环境下进行增殖培养10天(每两天传代换液一次)获得增殖培养细胞。将细胞离心收集起来，调整细胞密度至5×105个/mL，在5％CO2，37℃的环境下，进行活化适应培养1天后收集扩增后细胞并计数B，计算细胞的扩增倍数用B除以A获得的数值即为细胞的扩增倍数。将所述扩增后细胞用PBS洗涤两次，然后调整细胞密度后用流式细胞仪检测TIL细胞群中各类细胞的数量百分比。结果如表5和图4-5所示。
以对数生长期的A549细胞作为靶细胞，按效靶比为20：1的比例，取培养的效应细胞即TIL 1×105约100μL与A549细胞5×103约100μL混合加入96孔板中，同时设效应细胞孔、靶细胞孔，每组均设3个平行孔，每孔终体积为200μl，37℃、5％CO2培养箱中孵育20小时，每孔加入MTT(5mg/ml)20μL，继续培养4小时，之后离心，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡5分钟，待沉淀物完全溶解后用酶联免疫检测仪测波长490nm时的OD值，计算TIL细胞的杀伤率。公式如下：杀伤率(％)＝[OD(靶)+OD(效)-OD(效+靶)]/OD(靶)×100％。结果如表5和图6所示。
本实施例中进行细胞培养的装置为免疫细胞体外扩增装置，所述装置包括细胞培养袋1和承载所述细胞培养袋1的承载台3，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋1中的磁性浮球2以及在悬挂于所述细胞培养袋1上方并且能够驱动所述磁性浮球2在所述细胞培养袋1中移动的磁性悬挂驱动器4，所述磁性悬挂驱动器4包括能够吸引所述磁性浮球2的磁体片41和能够悬挂且驱动所述磁体片41在所述细胞培养袋1上方移动的悬挂驱动架42。所述悬挂驱动架42包括固定连接在所述磁体片41上的悬臂43；所述悬臂43上开设有一个限位孔431和一个设置有内螺纹的驱动孔432；所述悬挂驱动架42还包括二个支撑架4311以及限位连接在所述支撑架4311上的限位杆4310和丝杆4320；所述限位杆4310可滑动地穿过所述限位孔431；所述丝杆4320上设置有与所述驱动孔432的内螺纹匹配的外螺纹并螺旋穿过所述驱动孔432，且所述丝杆4320能够通过绕轴线转动驱动所述悬臂43沿所述限位杆4310滑动。电动机4321驱动所述丝杆4320进行轴向转动。所述细胞培养袋1上开设有可封闭的进气口11、出气口12、进液口13和出液口14。所述出气口12和所述出液口14上设置有能够阻止细胞通过的筛网。所述细胞培养袋1的内部还设置有模拟血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述承载台3包括能够维持细胞培养恒温的恒温托盘31和支撑所述恒温托盘31的底座32。在细胞培养过程中，所述磁性浮球2不与所述细胞培养袋1的壁接触，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位于所述细胞培养袋1中的细胞培养液液面以上且剩余部分位于液面以下。所述磁性浮球2的外壳为具有生物相容性的外壳，且所述磁性浮球2中设置有用于提供浮力的空腔。
所述免疫细胞体外扩增装置的切向示意图如图1所示、俯视示意图如图2所示，悬挂驱动架部件示意图如图3所示。
表1
实施例2
用实施例1的方法进行TIL细胞体外培养，区别仅在于，所使用的各培养基的组成成分如表2所示。检测细胞的扩增倍数、各类细胞数量百分比如表5和图4、5所示，TIL细胞的杀伤率结果如表5和图6所示。
表2
实施例3
用实施例1的方法进行TIL细胞体外培养，区别仅在于，所使用的各培养基的组成成分如表3所示。检测细胞的扩增倍数、各类细胞数量百分比如表5和图4、5所示，TIL细胞的杀伤率结果如表5和图6所示。
表3
实施例4
用实施例1的方法进行TIL细胞体外培养，区别仅在于，增殖培养基中不添加IL-12。检测细胞的扩增倍数、各类细胞数量百分比如表5和图4、5所示，TIL细胞的杀伤率结果如表5和图6所示。
实施例5
用实施例1的方法进行TIL细胞体外培养，区别仅在于，培养不使用本公开所述的免疫细胞体外扩增装置，改为在常规T25细胞培养瓶中进行培养。检测细胞的扩增倍数、纯度结果如表5和图4、5所示，TIL细胞的杀伤率结果如表5和图6所示。
对比例1
按照表4中给出的培养基成分配制培养基。无菌条件下，收集临床诊断为肺癌患者的胸腹水1000mL，加入12U/mL的肝素钠；将添加有肝素钠的胸腹水离心收集细胞沉淀，用Ficoll分离液进行密度梯度离心收集分层液界面上的单个核细胞，用AIM-V无血清培养基洗涤2次后用基础培养基重悬(AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：0.8)获得细胞悬液，用免疫磁珠对细胞悬液进行分选，收集TIL细胞。将TIL细胞调整细胞密度至5×105个/mL，在本公开所述的免疫细胞体外扩增装置中进行细胞培养，在5％CO2，37℃的环境下培养14天，每两天传代换液一次，培养结束后检测细胞的扩增倍数、纯度和杀伤率。检测细胞的扩增倍数、各类细胞数量百分比如表5和图4、5所示，TIL细胞的杀伤率结果如表5和图6所示。
表4
对比例2
用实施例1的方法进行TIL细胞体外培养，区别仅在于，不进行活化适应培养。检测细胞的扩增倍数、纯度和杀伤率。检测细胞的扩增倍数、各类细胞数量百分比如表5和图4、5所示，TIL细胞的杀伤率结果如表5和图6所示。
对比例3
用实施例1的方法进行TIL细胞体外培养，区别仅在于，培养基组合中不添加RPMI-1640培养基，仅使用AIM-V培养基。检测细胞的扩增倍数、纯度和杀伤率。检测细胞的扩增倍数、各类细胞数量百分比如表5和图4、5所示，TIL细胞的杀伤率结果如表5和图6所示。
表5
通过以上实施例可以看出，利用本公开所提供的TIL细胞体外培养基组合和培养方法进行TIL细胞体外培养，扩增倍数可以高达227倍，其中，CD3+细胞的含量可以达到99.63％，CD3+CD8+细胞的含量可以达到79.86％，Treg的含量仅为2.46％。效靶比20:1时杀伤率可以达到76.31％。
并且，优选在本公开所述的免疫细胞体外扩增装置中进行细胞培养时，能获得更高的TIL细胞扩增倍数和杀伤率，扩增的Treg细胞更少。
并且，优选在增殖培养基中添加IL-7、IL-12和IL-15的情况下，能获得更高的TIL细胞扩增倍数和杀伤率，扩增的Treg细胞更少。
并且，优选培养基组合中含有RPMI-1640培养基时能获得更高的TIL细胞扩增倍数和杀伤率，扩增的Treg细胞更少。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (5)

1.一种TIL细胞体外扩增培养方法，其特征在于，包括使用TIL细胞体外扩增培养基组合，所述方法包括：
诱导培养：将TIL细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞；
增殖培养：将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养7-12天获得增殖培养细胞；
活化适应：将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天；
所述诱导培养、增殖培养和活化适应在免疫细胞体外扩增装置中进行，所述装置包括细胞培养袋(1)和承载所述细胞培养袋(1)的承载台(3)，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋(1)中的磁性浮球(2)以及在悬挂于所述细胞培养袋(1)上方并且能够驱动所述磁性浮球(2)在所述细胞培养袋(1)中移动的磁性悬挂驱动器(4)，所述磁性悬挂驱动器(4)包括能够吸引所述磁性浮球(2)的磁体片(41)和能够悬挂且驱动所述磁体片(41)在所述细胞培养袋(1)上方移动的悬挂驱动架(42)；所述细胞培养袋(1)中充有细胞培养液，述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞；所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上；所述磁体片(41)能够在所述细胞培养袋(1)上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球(2)在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球(2)在培养液液面以下的部分能够搅拌培养液；
所述TIL细胞体外扩增培养基组合包括诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；
所述诱导培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖和枸杞多糖；
所述增殖培养基的组成成分包括：基础培养基、灭活动物血清、白细胞介素和单克隆抗体；所述基础培养基为AIM-V培养基和RPMI-1640培养基；所述白细胞介素为IL-7、IL-12和IL-15；所述单克隆抗体为CD3单克隆抗体、CD134单克隆抗体和PD-1单克隆抗体；
所述活化适应培养基包括：基础培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述灭活动物血清为胎牛血清。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其中，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：
香菇多糖20-50μg/mL、黄芪多糖20-50μg/mL、党参多糖20-50μg/mL、枸杞多糖20-50μg/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1-1.4。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其中，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：
IL-7 5-15ng/mL、IL-12 5-15ng/mL、IL-15 5-15ng/mL、CD3单克隆抗体10-30ng/mL、CD134单克隆抗体10-30ng/mL、PD-1单克隆抗体10-30ng/mL、体积百分含量为5-10％的胎牛血清；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：1.2-1.6。
5.根据权利要求1、2和4中任意一项所述的培养方法，其中，所述活化适应培养基包括以下含量的各组分：
胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM；AIM-V培养基与RPMI-1640培养基的体积比为1：2-4。
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