CN106701679B - Nk细胞体外扩增培养基组合和培养方法 - Google Patents

Nk细胞体外扩增培养基组合和培养方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种NK细胞体外扩增培养基组合和培养方法，所述培养基组合，包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；所述基础培养基的组成成分包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、庆大霉素和BSA；所述诱导培养基的组成成分包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培养基的组成成分包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、BSA、白细胞介素；所述活化适应培养基包括：RPMI‑1640培养基、GT‑T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。通过上述技术方案，利用本公开所提供的NK细胞体外扩增培养基组合和方法培养获得的NK细胞数量更多，在临床治疗中也具有更高的活性。

Description

NK细胞体外扩增培养基组合和培养方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种NK细胞体外扩增培养基组合和培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，主要分布于外周血中，能够参与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节的生理过程。现有研究表明，NK细胞是人体内抗癌活性最强的细胞，可以释放穿孔素在靶细胞表面形成穿孔，再通过颗粒酶进入靶细胞诱导靶细胞凋亡，同时可以分泌大量的细胞因子作用于靶细胞，还可以通过进一步激活其他种类免疫细胞攻击靶细胞，并可以表达诱导细胞凋亡的蛋白和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，使靶细胞发生程序性凋亡。
NK细胞免疫治疗在临床上已成为一种重要的治疗手段。但是其在外周血中的数量仅占淋巴细胞总量的5％左右，如何实现NK细胞体外扩增培养从而应用于治疗是关键的技术问题。
现有的NK细胞体外扩增手段主要包括在培养基中添加动物血清、细胞因子或与其它细胞共同培养来刺激NK细胞的生长。但是动物血清成分较复杂，易给细胞培养带来不安全因素；细胞因子的添加不当容易引起NK细胞激活受体和抑制受体表达变化；同时，异体的细胞也往往存在医学上的不安全性和伦理问题。因此，有必要开发一种高效、安全的NK细胞体外扩增方法从而为NK细胞的临床治疗应用提供有力的技术保障。
发明内容
本公开的目的是提供一种NK细胞体外扩增培养基组合及体外扩增方法。
为了实现上述目的，本公开提供一种NK细胞体外扩增培养基组合，包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；
其中，所述基础培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、庆大霉素和BSA；
所述诱导培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；
所述增殖培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA和细胞介素；
所述活化适应培养基包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。
可选地，所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的至少一种。
可选地，所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。
可选地，所述基础培养基包括以下含量的各组分：庆大霉素50-90IU/mL、BSA 100-300μg/mL、RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：0.8-1.2。
可选地，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：BSA 100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、灵芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1-1.4。
可选地，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：BSA 100-300μg/mL、IL-12 5-15ng/mL、IL-15 5-15ng/mL、IL-18 5-15ng/mL和IL-21 5-15ng/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1.2-1.6。
可选地，所述活化适应培养基包括以下含量的各组分：胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：2-4。
本公开的第二个方面还提供了一种NK细胞体外扩增培养方法，包括使用本公开的第一个方面所述的NK细胞体外扩增培养基组合，所述方法包括：
基础培养：将分离的单个核细胞接种于基础培养基中培养1-2天获得基础培养细胞；
诱导培养：将所述基础培养细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞；
增殖培养：将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养4-7天获得增殖培养细胞；
活化适应：将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天。
可选地，所述接种的细胞密度为4.5×105个/mL-5.5×105个/mL。
可选地，所述基础培养阶段、诱导培养阶段、增殖培养阶段和活化适应阶段在免疫细胞体外扩增装置中进行，所述装置包括细胞培养袋1和承载所述细胞培养袋1的承载台3，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋1中的磁性浮球2以及在悬挂于所述细胞培养袋1上方并且能够驱动所述磁性浮球2在所述细胞培养袋1中移动的磁性悬挂驱动器4，所述磁性悬挂驱动器4包括能够吸引所述磁性浮球2的磁体片41和能够悬挂且驱动所述磁体片41在所述细胞培养袋1上方移动的悬挂驱动架42；所述细胞培养袋(1)中充有细胞培养液，述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞；所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上；所述磁体片(41)能够在所述细胞培养袋(1)上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球(2)在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球(2)在培养液液面以下的部分能够搅拌培养液，从而在所述细胞培养袋(1)中模拟血液流动的体内环境。
通过上述技术方案，本公开所提供的NK细胞体外扩增培养基能够避免动物血清成分和异体细胞的添加，增加了细胞在临床应用中的安全性。而且采用含有不同组分的培养基在细胞生产的特定阶段进行有针对性的培养，可以更好的满足NK细胞在不同阶段的生长需求，更有效的扩增和活化NK细胞，培养获得的NK细胞数量更多在临床治疗中也具有更高的活性。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明，
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的切向示意图。
图2是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的俯视示意图。
图3是本公开的免疫细胞体外扩增装置中一种可选的实施方式的部件示意图。
图4是实施例和对比例NK细胞扩增倍数结果示意图。
图5是实施例和对比例培养的NK细胞纯度示意图。
图6是实施例和对比例培养的NK细胞杀伤率结果示意图。
附图标记说明
1 细胞培养袋 2 磁性浮球 3 承载台
4 磁性悬挂驱动器
11 进气口 12 出气口 13 进液口
14 出液口 15 人工瓣膜片
31 恒温托盘 32 底座
41 磁体片 42 悬挂驱动架 43 悬臂
431 限位孔 432 驱动孔 4310 限位杆
4311 支撑架 4320 丝杆 4321 电动机
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一个方面提供了一种NK细胞体外扩增培养基组合，包括基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；
其中，所述基础培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、庆大霉素和BSA；
所述诱导培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；
所述增殖培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA和白细胞介素；
所述活化适应培养基包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。
在本公开的具体实施过程中，根据细胞培养的不同阶段依次先后使用所述基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基。
在本公开的一种优选的实施方式中，所述基础培养基包括以下含量的各组分：庆大霉素50-90IU/mL，BSA 100-300μg/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：0.8-1.2。
所述基础培养基的作用在于使得分离得到的单个核细胞能够在培养的初始阶段更快的适应体外培养环境，从而能够以较好的细胞生理状态进入后续的诱导和增殖过程，获得适用于进一步诱导的基础培养细胞。分离得到的单个核细胞可以在所述基础培养基中预培养1-2天。
可选的，所述诱导培养基中还可以含有其他来自天然中药物质的提取物，所述天然中药提取物可以为已经证实对NK细胞的增殖有积极影响的中药提取物种类，例如，所述中药提取物包括但不限于人参多糖、人参皂苷、黄岑素、三七皂苷、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、姜黄素、云芝多糖、沙苑子总黄酮、虫草多糖、黄芪多糖、枸杞多糖、三叶青提取物等。本公开对于添加的天然中药提取物的量没有特别的限制，只要能够有效的提高细胞的增殖数量和活性即可。
可选的，所述诱导培养基中还可以含有细胞培养中所常用的添加物，例如，葡萄糖、维生素、氨基酸、无机盐、抗生素等。
在本公开的一种优选的实施方式中，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：BSA100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、灵芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1-1.4。
更为优选的，为了提高诱导培养效果，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：BSA 120-260μg/mL、香菇多糖60-70μg/mL、灵芝多糖60-70μg/mL、茶多酚25-35μg/mL、大蒜素25-35μg/mL、紫杉醇25-35μg/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1-1.4。
所述诱导培养基的作用在于通过合理配比利用具有诱导激活作用的物质，对NK细胞进行激活，促使其分泌细胞因子进而加快细胞的增殖。基础培养后的细胞可以在所述诱导培养基中诱导培养2-4天获得诱导培养细胞。
可选的，所述增殖培养基中还可以含有细胞培养中所常用的添加物，例如，葡萄糖、维生素、氨基酸、无机盐、抗生素等。
可选的，所述增殖培养基还可以含有其它具有NK细胞刺激作用的细胞因子组分，例如肿瘤坏死因子、表皮生长因子、卵泡刺激因子等；所述白介素可以为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的一种或多种。在本公开的一种特别优选的实施方式中，所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。
优选的，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：BSA 100-300μg/mL、IL-12 5-15ng/mL、IL-15 5-15ng/mL、IL-18 5-15ng/mL和IL-21 5-15ng/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1.2-1.6。
所述增殖培养基的作用在于通过合理配比和利用能够促进NK细胞增殖的物质实现细胞的大量体外增殖。诱导培养后的细胞可以在所述增殖培养基中增殖培养4-7天获得增殖培养细胞。
所述活化适应培养基还可以含有细胞培养中所常用的添加物，例如，葡萄糖、维生素、氨基酸、无机盐、抗生素等。
优选的，所述活化适应培养基包括以下含量的各组分：胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：2-4。
所述活化适应培养基的作用在于为增殖培养后的NK细胞提供接近体内条件的营养环境，使得NK细胞在临床应用时能够更为有效的发挥生物学作用，增殖培养后的细胞可以在所述活化适应培养基中培养0.5-1.5天。
本公开的第二个方面提供一种NK细胞体外扩增培养方法，包括使用本公开第一个方面所述的NK细胞体外扩增培养基组合，所述方法包括：
基础培养：将分离的单个核细胞接种于基础培养基中培养1-2天获得基础培养细胞；
诱导培养：将所述基础培养细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞；
增殖培养：将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养4-7天获得增殖培养细胞；
活化适应：将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天。
在本公开的第二个方面中，每次进行细胞接种的细胞密度为4.5×105个/mL-5.5×105个/mL。
细胞培养的条件包括在5％CO2，37℃的环境下进行。
其中，在所述增殖培养阶段，优选每两天进行一次细胞传代并更换一次新鲜的增殖培养基，传代可以利用本领域常规的NK细胞传代方法进行。
在本公开的一种可选的实施方式中，所述分离的单个核细胞可以是通过如下方式得到的：
采用人淋巴细胞分离液，利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，可选的，所述淋巴细胞分离液的密度为1.080。
在本公开的一种可选的实施方式中，包括将所述PBMC细胞进行磁珠分选，从而得到NK细胞。本公开对于磁珠分选的方法没有特别的限制，可以通过本领域常规的NK细胞磁珠分选方式进行。
在本公开的一种优选的实施方式中，所述基础培养阶段、诱导培养阶段、增殖培养阶段和活化适应阶段在免疫细胞体外扩增装置中进行，该装置包括细胞培养袋1和承载所述细胞培养袋1的承载台3，其中，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋1中的磁性浮球2以及在悬挂于所述细胞培养袋1上方并且能够驱动所述磁性浮球2在所述细胞培养袋1中移动的磁性悬挂驱动器4，所述磁性悬挂驱动器4包括能够吸引所述磁性浮球2的磁体片41和能够悬挂且驱动所述磁体片41在所述细胞培养袋1上方移动的悬挂驱动架42；所述细胞培养袋1中充有细胞培养液，述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞；所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上；所述磁体片41能够在所述细胞培养袋1上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球2在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球2在培养液液面以下的部分能够搅拌培养液，从而在所述细胞培养袋1中模拟血液流动的体内环境。
其中，在使用状态下，所述细胞培养袋1中充有细胞培养液，所述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞，其中，所述培养基为本公开所述的基础培养基、诱导培养基、增殖培养基或活化适应培养基。所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上。所述磁体片41能够在所述细胞培养袋1上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球2在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球2在培养液液面以下的部分能够发挥柔和地搅拌培养液的作用，从而在所述细胞培养袋1中模拟血液流动的体内环境，由此促进待扩增的细胞的生长和增殖。所述磁体片41可以为永磁体或电磁体。所述磁体片41的形状可以设置为弧形，以维持所述磁性浮球2的稳定。
可选地，所述悬挂驱动架42包括固定连接在所述磁体片41上的悬臂43；所述悬臂43上开设有至少一个限位孔431和至少一个设置有内螺纹的驱动孔432；所述悬挂驱动架42还包括至少二个支撑架4311以及限位连接在所述支撑架4311上的限位杆4310和丝杆4320；所述限位杆4310可滑动地穿过所述限位孔431；所述丝杆4320上设置有与所述驱动孔432的内螺纹匹配的外螺纹并螺旋穿过所述驱动孔432，且所述丝杆4320能够通过绕轴线转动驱动所述悬臂43沿所述限位杆4310滑动。
其中，所述悬挂驱动架42可以不限于上述结构，只要能驱动所述磁体片41移动即可。所述悬臂43和所述支撑架4311的高度可以设置为能够按需要调节的结构。所述磁体片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以进行合理地调节，只要能维持所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上且所述磁性浮球2在磁力作用下能够移动即可。所述磁体片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以通过所使用的磁性材料的性能和数量的合理改变而得到合理调节。所述磁体片41的数量可以为一个或多个，所述磁性浮球2的数量也可以为一个或多个。
可选地，该装置还包括能够驱动所述丝杆4320进行轴向转动的电动机4321。所述电动机4321的转速可以通过控制器进行合理地控制，避免磁性浮球2的移动速度过快或过慢。
可选地，在该装置的使用状态下，所述磁性浮球2能够不与所述细胞培养袋1的壁接触。也就是说，所述磁体片41与所述磁性浮球2之间的磁力应当小于所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2脱离培养液液面。同时，所述磁体片41与所述磁性浮球2之间的磁力与所述磁性浮球2的合力应当大于所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2沉底。
可选地，在该装置的使用状态下，以所述磁性浮球2的体积计，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位于所述细胞培养袋1中的细胞培养液液面以上且剩余部分位于液面以下。这样可以使得所述磁性浮球2便于移动，且具有较好的驱动液流的搅拌效果。
可选地，所述磁性浮球2的外壳为具有生物相容性的外壳，且所述磁性浮球2中设置有用于提供浮力的空腔。其中，生物相容性的外壳可以使用细胞培养领域的常规生物相容性材料制成，例如使用聚乳酸塑料、纳米羟基磷灰石材料和聚醚醚酮材料制成。用于提供浮力的空腔可以为一个或多个，空腔中可以填充轻质材料，例如泡沫塑料。所述磁性浮球2中所使用的磁性材料可以为永磁体和/或软磁体。
可选地，所述细胞培养袋1上开设有可封闭的进气口11、出气口12、进液口13和出液口14中的至少一者。其中，所述进气口11可以用于通入新鲜的培养用气体(例如体积百分比分别为95％的空气与5％的二氧化碳的混合气体)。所述出气口12可以实现培养用气体的循环。通入新鲜的培养用气体可以带有高于大气压的压力，所述出气口12可以连接有限压阀。进液口13可以用于向所述细胞培养袋1充入含有培养基以及待扩增的细胞的培养液。所述出液口14可以用于排出旧的培养基或者排出培养扩增后的培养液。
可选地，所述出气口12和/或所述出液口14上设置有能够阻止细胞通过的筛网。例如所述出液口14上可以设置有滤布，在开启所述出液口14时，可以将废旧培养基过滤排出而将细胞过滤留存在所述细胞培养袋1以内。也可以从所述出液口14反向通入新鲜培养基而将滤布上的细胞反向冲洗至细胞培养袋1以内，继续进行培养扩增。
可选地，所述细胞培养袋1的内部还设置有模拟血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述人工瓣膜片15可以适当地模拟生理状态下的血管瓣膜，也可以适当地增加搅拌液流效果。
可选地，所述承载台3包括能够维持细胞培养恒温的恒温托盘31和支撑所述恒温托盘31的底座32。所述恒温托盘31可以在15-40℃的温度内选择一个温度区间保持恒温，从而使得细胞培养扩增能够脱离复杂的培养设备而独立运行。
本公开提供的用于细胞体外扩增的装置所提供的扩增条件优于不进行搅拌的培养扩增条件，也优于其他非悬浮式底部磁性搅拌的培养扩增条件，能够取得更好的扩增效果。
所述免疫细胞体外扩增装置能够在体外模拟NK细胞的体内增殖环境，实现模拟血管流动状态的蠕动式非接触搅拌，使得免疫细胞在培养过程中降低团聚并充分吸收本公开所述的培养基中的养分并接受信号分子的刺激，提高扩增的细胞收率以及细胞活性。
以下结合实施例具体说明本公开的技术方案。
实施例1
按照表1中给出的培养基成分配制基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基备用。
健康志愿者晨起空腹于肘静脉抽取25mL外周血，加肝素抗凝；利用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集单个核细胞层，用PBS离心洗涤后计数A，用基础培养基对分离的单个核细胞进行重悬，调整细胞密度至5×105个/mL，在本公开所述的免疫细胞体外扩增装置中进行细胞培养，首先在5％CO2，37℃的环境下进行基础培养1.5天获得基础培养细胞。将细胞离心收集起来，调整细胞密度至5×105个/mL，在5％CO2，37℃的环境下进行诱导培养3天获得诱导培养细胞。将细胞离心收集起来，调整细胞密度至5×105个/mL，在5％CO2，37℃的环境下进行增殖培养6天(每两天传代换液一次)获得增殖培养细胞。将细胞离心收集起来，调整细胞密度至5×105个/mL，在5％CO2，37℃的环境下，进行活化适应培养1天后收集活化后细胞并计数B，计算细胞的扩增倍数用B除以A获得的数值即为细胞的扩增倍数。将所述活化后细胞用PBS洗涤两次，然后调整细胞密度后用流式细胞仪检测NK细胞占总细胞的百分数，为细胞纯度结果。结果如表5和图4-5所示。
以对数生长期的A549细胞作为靶细胞，以所述活化后细胞作为效应细胞，按照1：1、10：1、20:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设效应细胞孔、靶细胞孔，每组均设3个平行孔，每孔终体积为200μl，37℃、5％，CO2培养箱中孵育，12h后每孔加入20μl CCK-8溶液，继续孵育4h，用酶标仪检测450nm时的OD值，计算NK细胞的杀伤率。结果如表6和图6所示。
本实施例中进行细胞培养的装置为免疫细胞体外扩增装置，所述装置包括细胞培养袋1和承载所述细胞培养袋1的承载台3，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋1中的磁性浮球2以及在悬挂于所述细胞培养袋1上方并且能够驱动所述磁性浮球2在所述细胞培养袋1中移动的磁性悬挂驱动器4，所述磁性悬挂驱动器4包括能够吸引所述磁性浮球2的磁体片41和能够悬挂且驱动所述磁体片41在所述细胞培养袋1上方移动的悬挂驱动架42。所述悬挂驱动架42包括固定连接在所述磁体片41上的悬臂43；所述悬臂43上开设有一个限位孔431和一个设置有内螺纹的驱动孔432；所述悬挂驱动架42还包括二个支撑架4311以及限位连接在所述支撑架4311上的限位杆4310和丝杆4320；所述限位杆4310可滑动地穿过所述限位孔431；所述丝杆4320上设置有与所述驱动孔432的内螺纹匹配的外螺纹并螺旋穿过所述驱动孔432，且所述丝杆4320能够通过绕轴线转动驱动所述悬臂43沿所述限位杆4310滑动。电动机4321驱动所述丝杆4320进行轴向转动。所述细胞培养袋1上开设有可封闭的进气口11、出气口12、进液口13和出液口14。所述出气口12和所述出液口14上设置有能够阻止细胞通过的筛网。所述细胞培养袋1的内部还设置有模拟血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述承载台3包括能够维持细胞培养恒温的恒温托盘31和支撑所述恒温托盘31的底座32。在细胞培养过程中，所述磁性浮球2不与所述细胞培养袋1的壁接触，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位于所述细胞培养袋1中的细胞培养液液面以上且剩余部分位于液面以下。所述磁性浮球2的外壳为具有生物相容性的外壳，且所述磁性浮球2中设置有用于提供浮力的空腔。
所述免疫细胞体外扩增装置的切向示意图如图1所示、俯视示意图如图2所示，悬挂驱动架部件示意图如图3所示。
表1
实施例2
用实施例1的方法进行NK细胞体外培养，区别仅在于，所使用的各培养基的组成成分如表2所示。检测细胞的扩增倍数、纯度结果如表5和图4、5所示，NK细胞的杀伤率结果如表6和图6所示。
表2
实施例3
用实施例1的方法进行NK细胞体外培养，区别仅在于，所使用的各培养基的组成成分如表3所示。检测细胞的扩增倍数、纯度结果如表5和图4、5所示，NK细胞的杀伤率结果如表6和图6所示。
表3
实施例4
用实施例1的方法进行NK细胞体外培养，区别仅在于，增殖培养基中不添加IL-18。检测细胞的扩增倍数、纯度结果如表5和图4、5所示，NK细胞的杀伤率结果如表6和图6所示。
实施例5
用实施例1的方法进行NK细胞体外培养，区别仅在于，培养不使用本公开所述的免疫细胞体外扩增装置，改为在常规T25细胞培养瓶中进行培养。检测细胞的扩增倍数、纯度结果如表5和图4、5所示，NK细胞的杀伤率结果如表6和图6所示。
对比例1
按照表4中给出的培养基成分配制培养基。健康志愿者晨起空腹于肘静脉抽取25mL外周血，加肝素抗凝；利用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集单个核细胞层，用PBS离心洗涤后计数，用培养基对分离的单个核细胞进行重悬，调整细胞密度至5×105个/mL，在本公开所述的免疫细胞体外扩增装置中进行细胞培养，在5％CO2，37℃的环境下培养12天，每两天传代换液一次，培养结束后检测细胞的扩增倍数、纯度和杀伤率。检测细胞的扩增倍数、纯度结果如表5和图4、5所示，NK细胞的杀伤率结果如表6和图6所示。
表4
对比例2
用实施例1的方法进行NK细胞体外培养，区别仅在于，不进行活化适应培养。检测细胞的扩增倍数、纯度和杀伤率。检测细胞的扩增倍数、纯度结果如表5和图4、5所示，NK细胞的杀伤率结果如表6和图6所示。
对比例3
用实施例1的方法进行NK细胞体外培养，区别仅在于，培养基组合中不添加GT-T551培养基，仅使用RPMI-1640培养基。检测细胞的扩增倍数、纯度和杀伤率。检测细胞的扩增倍数、纯度结果如表5和图4、5所示，NK细胞的杀伤率结果如表6和图6所示。
表5
组别 扩增倍数(倍) 纯度(％)
实施例1 186 93.62
实施例2 172 92.27
实施例3 177 91.85
实施例4 162 90.43
实施例5 166 90.86
对比例1 93 76.21
对比例2 128 78.36
对比例3 136 83.47
表6
通过以上实施例可以看出，利用本公开所提供的NK细胞体外培养基组合和培养方法进行NK细胞体外培养，扩增倍数可以高达186倍，纯度可以达到93.62％，效靶比20:1时杀伤率可以达到93％。
并且，优选在本公开所述的免疫细胞体外扩增装置中进行细胞培养时，能获得更高的NK细胞扩增倍数、纯度和杀伤率。
并且，优选在增殖培养基中添加IL-18的情况下，能获得更高的NK细胞扩增倍数、纯度和杀伤率。
并且，优选培养基组合中含有GT-T551培养基时能获得更高的NK细胞扩增倍数、纯度和杀伤率。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (6)

1.一种NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，包括使用NK细胞体外扩增培养基组合，所述方法包括：
基础培养：将分离的单个核细胞接种于基础培养基中培养1-2天获得基础培养细胞；
诱导培养：将所述基础培养细胞接种于诱导培养基中培养2-4天获得诱导培养细胞；
增殖培养：将所述诱导培养细胞接种于增殖培养基中培养4-7天获得增殖培养细胞；
活化适应：将所述增殖培养细胞接种于活化适应培养基中培养0.5-1.5天；
所述基础培养、诱导培养、增殖培养和活化适应在免疫细胞体外扩增装置中进行，所述装置包括细胞培养袋(1)和承载所述细胞培养袋(1)的承载台(3)，该装置还包括容纳于所述细胞培养袋(1)中的磁性浮球(2)以及在悬挂于所述细胞培养袋(1)上方并且能够驱动所述磁性浮球(2)在所述细胞培养袋(1)中移动的磁性悬挂驱动器(4)，所述磁性悬挂驱动器(4)包括能够吸引所述磁性浮球(2)的磁体片(41)和能够悬挂且驱动所述磁体片(41)在所述细胞培养袋(1)上方移动的悬挂驱动架(42)；所述细胞培养袋(1)中充有细胞培养液，述细胞培养液中含有培养基以及待扩增的细胞；所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培养液液面上；所述磁体片(41)能够在所述细胞培养袋(1)上方往复移动，从而通过磁力的作用，驱动所述磁性浮球(2)在漂浮状态下在培养液液面往复移动，所述磁性浮球(2)在培养液液面以下的部分能够搅拌培养液，从而在所述细胞培养袋(1)中模拟血液流动的体内环境；
所述NK细胞体外扩增培养基组合包括：基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和活化适应培养基；
其中，所述基础培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、庆大霉素和BSA；
所述诱导培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA、香菇多糖、灵芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；
所述增殖培养基的组成成分包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、BSA和白细胞介素；所述白细胞介素为IL-12、IL-15、IL-18和IL-21；
所述活化适应培养基包括：RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、胰岛素、转铁蛋白和谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，接种的细胞密度为4.5×105个/mL-5.5×105个/mL。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述基础培养基包括以下含量的各组分：庆大霉素50-90IU/mL、BSA 100-300μg/mL、RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：0.8-1.2。
4.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述诱导培养基包括以下含量的各组分：BSA 100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、灵芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1-1.4。
5.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述增殖培养基包括以下含量的各组分：BSA 100-300μg/mL、IL-12 5-15ng/mL、IL-15 5-15ng/mL、IL-18 5-15ng/mL和IL-21 5-15ng/mL，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：1.2-1.6。
6.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述活化适应培养基包括以下含量的各组分：胰岛素1.5-3μg/mL、转铁蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM，RPMI-1640培养基与GT-T551培养基的体积比为1：2-4。
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