CN108379287A - 番荔枝多糖aspa80-1对小鼠巨噬细胞和树突状细胞免疫功能的影响及作用机制 - Google Patents

番荔枝多糖aspa80-1对小鼠巨噬细胞和树突状细胞免疫功能的影响及作用机制 Download PDF

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Abstract

本发明涉及ASPA80‑1是从热带水果番荔枝成熟果实中提取的多糖。本论文公开了ASPA80‑1增强免疫细胞免疫调节功能中的应用。本发明的重要之处是ASPA80‑1可增强RAW264.7巨噬细胞和树突状细胞的免疫调节功能。内容包括：(1)ASPA80‑1可促进RAW264.7细胞分化，上调CD11c、CD86和MHC II分子的表达，增强吞噬功能，促进NO的分泌，活化RAW264.7细胞；(2)ASPA80‑1可改变树突状细胞的形态，上调CD86和MHC II分子的表达，降低吞噬功能，促进NO的分泌，促进树突状细胞的成熟。作用机制研究结果显示：ASPA80‑1可上调RAW264.7细胞p‑ERK、p‑JNK、p‑P38及p‑NF‑κB蛋白的表达，促进NF‑κB的入核，活化RAW264.7细胞；ASPA80‑1可上调树突状细胞TLR2、p‑JNK、p‑P38及p‑NF‑κB蛋白的表达，促进NF‑κB的入核，促进树突状细胞的成熟。综上可知：ASPA80‑1具有制备免疫增强剂药物的应用前景。

Description

番荔枝多糖ASPA80-1对小鼠巨噬细胞和树突状细胞免疫功能 的影响及作用机制
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及番荔枝多糖ASPA80-1对小鼠巨噬细胞和树突状细胞免疫功能的影响及作用机制。
背景技术
多糖主要从植物、微生物及动物中分离而得，不仅能为机体提供能源，还是构成细胞的重要成分。多糖来源广，含量高，大多数多糖毒副作用小、安全性高，是比较理想的药物及保健食品基料。大量糖类结构及生物活性的研究揭示了糖类是重要的信息分子，多糖及其衍生物因其复杂多样的化学结构而具有独特的生物学特性，能参与细胞间的相互识别，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等作用，受到了国内外学者的广泛关注。越来越多具有不同活性的多糖被发现或已用于临床，目前国内上市的植物多糖及真菌多糖主要作为免疫增强剂使用。
番荔枝(Annona squamosa)为双子叶植物纲木兰亚纲番荔枝科番荔枝属植物。成熟的番荔枝果实为圆球状或心状圆锥形聚合浆果，直径5-10厘米；果皮呈黄绿色，无毛，表面有白色粉霜。番荔枝果实富含糖类，氨基酸，蛋白质，维生素，矿物质和粗纤维等；果肉呈乳白色，鲜美香甜，口感独特，被誉为“南国珍果”。据《中国中药资源志要》记载，其根、叶、果实及种子皆可入药。番荔枝的根，性味苦、寒，具有清热解毒、解郁、止血的功效，可用于治疗痢疾和精神抑郁；其叶，性味苦、涩、凉，具有收敛、解毒的功效，可用于小儿脱肛及恶疮肿毒；其果实、种子可用于疮毒，杀虫。据《中华本草》记载，番荔枝具有补脾胃，清热解毒，杀虫之功效。现代药理研究中发现番荔枝具有抗肿瘤、杀虫、抑菌、降血糖、抗氧化等药理活性。
巨噬细胞及树突状细胞是机体重要的免疫细胞，不但能对抗原进行加工、处理及呈递、激活淋巴细胞免疫应答、清除病原体，还能识别入侵机体的外源性病原体并加以吞噬或通过产生毒性分子及细胞因子进行消灭，在特异性及非特异性免疫中发挥着重要的作用。因此，可以将巨噬细胞和树突状细胞作为切入点，研究多糖对巨噬细胞和树突状细胞免疫调节功能的影响，进而研究多糖的免疫调节活性。
中医理论认为，脾胃乃后天之本，气血生化之源，胃主受纳，脾主运化，是人体五脏六腑气机运动之枢纽。《灵枢·五邪》记载：“邪在脾胃，则病肌肉痛”，即脾胃虚弱，会导致多种病证，说明机体的体质强弱，与脾胃的功能正常与否关系极大。而且，《内经》记载：“五味人胃，甘先入脾，脾欲甘”，甘有补益、和中、缓急的作用。据《中华本草》中记载，番荔枝功能主治补脾胃，清热解毒，杀虫。因此，我们从番荔枝中提取的多糖，属甘味，具有补益、和中、缓急，增强免疫调节能力，增强体质之功效。
本发明所涉及的ASPA80-1是通过酸提取法从番荔枝果实中提取的多糖，文献调研显示，尚未见番荔枝多糖ASPA80-1增强免疫调节作用的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种番荔枝多糖ASPA80-1在制备免疫增强剂药物中的应用。
本发明是通过如下的技术方案来实现的：通过形态学观察、中性红实验、激光共聚焦、 Griess法研究ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞的活化作用；采用形态学观察、流式细胞术、 Griess法研究ASPA80-1促进树突状细胞成熟；采用Western blotting法研究ASPA80-1对 RAW264.7巨噬细胞及树突状细胞中MAPKs及NF-κB信号通路的影响，探究其作用机制。
本发明相对于现有技术有益效果在于：
(1)首次进行番荔枝多糖ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞免疫调节功能影响的研究，发现ASPA80-1可通过改变RAW264.7巨噬细胞的形态，上调CD11c、CD86和MHC II共刺激分子及抗原提呈分子的表达，增强吞噬功能，促进NO的分泌，活化RAW264.7巨噬细胞，其作用机制可能与上调RAW264.7巨噬细胞p-ERK、p-JNK、p-P38及p-NF-κB蛋白的表达，促进NF-κB的入核有关。
(2)首次进行番荔枝多糖ASPA80-1对树突状细胞成熟影响的研究，发现ASPA80-1可改变树突状细胞的形态，上调CD86和MHC II共刺激分子及抗原提呈分子的表达，降低吞噬功能，促进NO的分泌，促进树突状细胞的成熟，其作用机制可能与上调树突状细胞TLR2、p-JNK、p-P38及p-NF-κB蛋白的表达，促进NF-κB的入核有关。
本发明为番荔枝多糖的开发利用提供理论基础与实验依据，对研制新的免疫增强剂具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞形态的影响。
图2为实施例2中ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞CD11c、CD86及MHC II表达的影响。
图3为实施例3中中性红吞噬实验检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的影响。
图4为实施例4中FITC-dextran吞噬实验检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的影响。
图5为实施例5中Griess法检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响。
图6为实施例6中免疫印迹分析检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞MAPKs信号通路蛋白的影响。
图7为实施例6中免疫印迹分析检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路蛋白的影响。
图8为实施例7中ASPA80-1对树突状细胞形态的影响。
图9为实施例8中MTT法检测ASPA80-1对树突状细胞活力的影响。
图10为实施例9中流式细胞术检测ASPA80-1对树突状细胞CD86及MHC II表达的影响。
图11为实施例10中流式细胞术检测ASPA80-1对树突状细胞吞噬功能的影响。
图12为实施例11中Griess法检测ASPA80-1对树突状细胞分泌NO的影响。
图13为实施例12中免疫印迹分析检测ASPA80-1对树突状细胞MAPKs信号通路的影响。
图14为实施例12中免疫印迹分析检测ASPA80-1对树突状细胞NF-κB信号通路的影响。
图15为实施例12中免疫印迹分析检测ASPA80-1对树突状细胞TLR2及TLR4蛋白的影响。
具体实施方式：
下面结合技术方案和图表详细说明本发明的具体实施例。
以下实验所用的ASPA80-1是由暨南大学中药生物技术研究所提供。
实施例1
ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞形态的影响
1)RAW264.7细胞用高糖DMEM培养基(含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和 10％胎牛血清)置于细胞培养箱中(37℃、5％CO2)静置培养。六孔板每孔铺上约占孔底面积20％的RAW264.7细胞。过夜贴壁后，弃去旧培养基，然后六个孔依次设置为NC、11.11 μg/mLASPA80-1、33.33μg/mL ASPA80-1、100μg/mL ASPA80-1、300μg/mL ASPA80-1及900 μg/mLASPA80-1。将板置于细胞培养箱中(37℃、5％CO2)培养。
2)在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化并拍照。
形态观察结果：倒置显微镜观察番荔枝多糖ASPA80-1(11.11、33.33、100、300及900 μg/mL)作用RAW264.7巨噬细胞24h后的形态变化。如图1所示，阴性对照组的RAW264.7巨噬细胞形态小，少有突起，主要呈圆形，部分呈梭形，维持着RAW264.7巨噬细胞的正常形态。与阴性对照组相比，ASPA80-1处理组细胞形态有明显的变化。RAW264.7巨噬细胞呈树突样分化，细胞周围伸出的树枝状突起增多，体积增大，细胞呈星形或者不规则形态，出现树突状细胞形态的细胞比例随多糖浓度增加而增加。ASPA80-1改变RAW264.7巨噬细胞的形态可能与巨噬细胞的活化有关，活化的巨噬细胞往往伴随着吞噬功能、抗原提呈等免疫调节功能增强。
实施例2
ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞CD11c、CD86及MHC II表达的影响
收集RAW264.7巨噬细胞，小心吹打成单细胞悬液，吸取10μL于细胞计数板上计数，调整细胞密度为3×105cells/mL，接种于12孔板，每孔1mL细胞悬液，置于细胞培养箱中培养，使其贴壁。次日，弃除旧培养基后，分别加入DMEM完全培养基或一系列浓度的番荔枝多糖溶液2mL(终浓度分别为31.25、62.5、125、250及500μg/mL)，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h后，收集细胞，1500rpm离心5min，PBS洗1次。然后分别加入荧光标记的单克隆抗体FITC-CD11c、APC-CD86及PE-MHC II，在4℃下避光孵育30min，PBS 洗3次后，加入400μL PBS重悬细胞，于流式细胞检测仪测定细胞表面分子的表达。
结果显示：通过流式细胞术检测RAW264.7巨噬细胞抗原提呈相关分子CD11c、CD86及MHC II的表达。如图2所示，ASPA80-1(100、300及900μg/mL)处理RAW264.7巨噬细胞48h后，RAW264.7巨噬细胞表面CD11c、CD86及MHC II的表达上调，且具有一定的剂量依赖性。
实施例3
中性红吞噬实验检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的影响
收集RAW264.7巨噬细胞，小心吹打成单细胞悬液，调整RAW264.7巨噬细胞密度为1x105 cells/mL，接种于96孔细胞板，每孔100μL细胞悬液，使其贴壁。次日，弃除旧培养基加入不同浓度的番荔枝多糖溶液200μL，正常组加入等体积的完全培养基，对照组则加入1μg/mL 的LPS，每组分别设置3个复孔。加药后，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养24h。吸出细胞培养液，每孔加入0.1％中性红溶液100μL，于37℃，5％CO2培养箱继续培养20min，弃除中性红溶液，用预温PBS洗涤3次，加入200μL酸乙醇裂解液，裂解1h，于酶标仪540 nm处检测OD值。
结果显示：通过中性红实验考察ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬中的影响。如图3 所示，番荔枝多糖ASPA80-1能增强RAW264.7巨噬细胞吞噬中性红的能力，且随着剂量的增加，吞噬能力也增强。与对照组相比，ASPA80-1在剂量为100-900μg/mL时，可明显增强RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力。
实施例4
FITC-dextran吞噬实验检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的影响
收集RAW264.7巨噬细胞，制备成单细胞悬液，调整细胞密度为1.5×105cells/mL，每孔 200μL细胞悬液接种于激光共聚焦皿的小孔内，加入之前先用培养基进行润湿，置于细胞培养箱中培养，使其贴壁。次日，弃除旧培养基，加入一系列浓度番荔枝多糖溶液200μL(终浓度分别为33.33、100及300μg/mL)和LPS(1μg/mL)，阴性对照组则加入等体积的完全培养基。作用24h后，加入终浓度为1mg/mL FITC-Dextran(40000Da)，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养1h。1h后，PBS洗两遍，加入4％多聚甲醛室温固定20min，PBS再次洗涤三次，DAPI室温标记5min后，PBS洗涤2次，于激光共聚焦上观察细胞吞噬FITC-dextran 荧光颗粒的情况。
结果显示：通过激光共聚焦观察了RAW264.7巨噬细胞对FITC-dextran荧光颗粒的吞噬情况。如图4所示，ASPA80-1刺激RAW264.7巨噬细胞24h后，多糖组的绿色荧光较未处理组强，表明ASPA80-1在33.33-300μg/mL能增强RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力，与吞噬中性红的结果一致。
实施例5
Griess法检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响
收集RAW264.7巨噬细胞，制备成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106cells/mL，均匀的接种在96孔板内，每孔100μL细胞悬液，置于细胞培养箱中培养，使其贴壁。次日，弃除旧培养基后，加入不同浓度的番荔枝多糖溶液200μL(终浓度分别为11.11、33.33、100、300及900μg/mL)或1μg/mL的LPS溶液，正常对照组则加入等体积的完全培养基。于37℃， 5％CO2培养箱中培养24h后，取出96孔板，于操作台内收集细胞的上清液。根据NO试剂盒的说明书测定NO的含量。
结果显示：Griess法检测番荔枝多糖ASPA80-1处理RAW264.7巨噬细胞24h后分泌NO 的情况。如图5所示，ASPA80-1能促进RAW264.7巨噬细胞NO的产生且具有剂量依赖性。与正常对照组相比，ASPA80-1在100-900μg/mL的浓度范围内具有显著性差异。
实施例6
免疫印迹分析检测ASPA80-1对RAW264.7巨噬细胞MAPKs及NF-κB信号通路蛋白的影响
(1)总蛋白的提取
收集RAW264.7巨噬细胞，小心吹打成细胞悬液，吸取10μL于细胞计数板上计数，调整细胞密度为2×106cells/mL，接种于6孔板，每孔1mL细胞悬液，置于培养箱中培养，使其贴壁。次日，弃除旧培养基后，分别加入DMEM完全培养基或一系列浓度的番荔枝多糖溶液2mL(终浓度分别为3.7、11.11、33.33、100及300μg/mL)，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养8h。取出6孔板，弃除旧培养基，预冷的PBS洗1次，每孔加入100μL含1％PMSF 及1％Na2VO3的SDS细胞裂解液，吹打混匀，冰上裂解5min，期间多次吹打混匀。收集细胞裂解液于1.5mL的EP管，超声3次，每次5s，使其裂解完全。然后置于4℃，调整转速为12000rpm，离心10min，吸取上层的液体，即可得到总蛋白。
(2)核蛋白的提取
取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，按2×106 eells/mL的细胞密度接种于六孔板中，培养过夜，加入不同浓度的番荔枝多糖，使其终浓度分别为0、33.33、100及300μg/mL，继续于37℃培养4h，收集细胞，PBS洗一遍，离心，弃净上清，加入200μL添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。涡旋5s，分散细胞，冰浴15min。加入10μL细胞浆蛋白抽提试剂 B，涡旋5s，冰浴1min。涡旋5s，4℃，12000rpm离心5min，小心吸取上清得浆蛋白。对于沉淀，加入50μL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂，涡旋15-30s，每隔1-2min，涡旋15-30s，共30min。4℃，12000rpm离心5min，小心吸取上清得核蛋白。
(3)蛋白定量
按照BCA蛋白定量试剂盒的说明书进行操作，按1∶50的比例将B液和A液混合成BCA工作液，每孔200μL加入到96孔板中。再依次加入蛋白标准品及目的蛋白待测样品，于37℃生化培养箱中反应30min，于酶标仪562nm检测OD值，根据标准曲线调整蛋白样品的浓度，使其一致，加入相应体积的5×buffer，涡旋混匀后，煮沸10min使其变性，于-20℃的条件下保存备用。
(4)电泳：
1)制备凝胶：根据目的蛋白分子量的大小，配制相应浓度的凝胶，配方如下所示。
表1.SDS-PAGE分离胶配方(10mL)
表2.SDS-PAGE浓缩胶配方(4mL)
2)上样、电泳：安装电泳装置，小心的把目的蛋白及预染Marker加入到相应的泳道里，调整电压为60V，开始电泳，当蛋白跑至分离胶时，升高电压至110V，继续电泳，直至样品接近凝胶板的底部。
4)转膜：电泳结束后，准备“三明治”，活化PVDF膜，切取相应的目的蛋白胶体并置于转膜液中。“三明治”制备完毕，置于转膜体系中，接通电源，调整电流为200mA，在冰浴条件下进行转膜。
5)封闭：快速取出PVDF膜，置于盛有5％脱脂奶粉封闭液的皿中，在低转速的摇床上封闭2h。
6)孵育一抗：封闭结束，将PVDF膜放入杂交袋并加入相应的一抗，一抗的稀释比例为 1∶1000，4℃条件下孵育过夜。
7)孵育二抗：取出PVDF膜，使用1×TBST进行洗膜，洗涤5次，每次10min。再次置于杂交袋内，加入相同来源二抗，二抗的稀释比例为1∶2000，在低转速的摇床上室温孵育2h。2h后，取出PVDF膜，用1×TBST洗涤5次，每次10min。
8)显影：根据ECL发光液说明书配制发光液并将其滴加在PVDF膜上，在暗室中，进行压片、显影和定影。
结果显示：
1)ASPA80-1作用RAW264.7巨噬细胞8h后，对MAPKs通路的相关蛋白进行考察。如图6所示，ASPA80-1在3.7-300μg/mL的浓度范围内均能促使MAPKs通路中的ERK、JNK 和P38蛋白发生磷酸化，上调p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表达。结果表明ASPA80增强 RAW264.7巨噬细胞的免疫调节功能可能与MAPKs通路中的ERK、JNK和P38的激活有关。
2)由图7可见，ASPA80-1作用RAW264.7巨噬细胞8h后p-NF-κB蛋白的表达上调，表明ASPA80-1在3.7-300μg/mL的浓度范围内能使NF-κB发生磷酸化，增强其转录活性。通过提取核蛋白，检测细胞核内的NF-κB含量，进一步考察ASPA80-1对NF-κB的影响。结果表明，ASPA80-1作用RAW264.7巨噬细胞4h后，能上调细胞核内NF-κB的表达，说明 ASPA80-1能促进NF-κB的入核，启动转录。综上，ASPA80-1增强RAW264.7巨噬细胞免疫调节功能可能与NF-κB信号通路有关。
实施例7
ASPA80-1对树突状细胞形态的影响
1)树突状细胞的体外诱导培养是根据Inaba等的方法稍微修改后进行的。取4-6周龄 C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死后，置于75％酒精中消毒3min，无菌条件下取出股骨和胫骨，用注射器吸取培养基反复冲洗骨髓腔，过200目细胞钢筛后收集细胞悬液于15mL离心管， 1500rpm离心5min，弃上清，加入1mL Tris-NH4Cl裂解红细胞，PBS洗2遍后，细胞重悬于rm GM-CSF及rm IL-4终浓度均为10ng/mL的RPMI-1640完全培养基中，每孔3mL接种于6孔板，在细胞培养箱中进行培养。第3天进行2/3量换液，吸掉未贴壁的细胞。第5天，再次进行2/3量换液，继续培养至第6天，轻轻吹打收集悬浮及半贴壁细胞，即为体外诱导的树突状细胞，用于下一步实验。
2)继续培养至第6天收集的树突状细胞接种于6孔板，然后加入一系列浓度的番荔枝多糖溶液ASPA80-1，六个浓度依次设置为NC、31.25μg/mL ASPA80-1、62.5μg/mL ASPA80-1、 125μg/mL ASPA80-1、250μg/mL ASPA80-1及500μg/mL ASPA80-1。将板置于细胞培养箱中 (37℃、5％CO2)培养。
3)在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化并拍照。
形态观察结果：ASPA80-1作用树突状细胞24h后，能使树突状细胞的形态发生变化。如图8可见，ASPA80-1均能改变细胞的形态，使细胞膜向外伸展、细胞表面长出毛刺状突起、体积变大，细胞呈星形或不规则形态，呈现典型的成熟树突状细胞形态，表明ASPA80-1可能促进树突状细胞的形态成熟。
实施例8
MTT法检测ASPA80-1对树突状细胞活力的影响
收集培养至第6天的树突状细胞，小心吹打成单细胞悬液，调整细胞密度5×104cells/mL 接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，分别加入不同浓度的番荔枝多糖溶液100μL(终浓度分别为31.25、62.5、125、250及500μg/mL)、RPMI1640完全培养基或LPS(1μg/mL) 溶液，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，每孔加20μL 5mg/mL的MTT溶液，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h。在3000rpm的条件下，离心5min，小心吸除上清，每孔加入150μLDMSO溶解生成的甲瓒结晶，低速振荡10min后，于酶标仪570nm处检测OD值。按照如下公式求取细胞存活率：
细胞存活率(Viability，％)＝(加药组A570nm-调零孔A570nm)/(阴性对照组A570nm-调零孔 A570nm)×100％
结果显示：通过MTT实验检测ASPA80-1(31.25、62.5、125、250及500μg/mL)对树突状细胞活力的影响。如图9所示，ASPA80-1作用树突状细胞24h后能轻微促进树突状细胞的增殖，表明，ASPA80-1在31.25-500μg/mL的浓度范围内对树突状细胞没有细胞毒性。
实施例9
流式细胞术检测ASPA80-1对树突状细胞CD86及MHC II表达的影响
收集培养至第六天的树突状细胞，小心吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105cells/mL 接种于12孔板，每孔1mL细胞悬液，分别加入RPMI 1640完全培养基或一系列浓度的番荔枝多糖溶液1mL(终浓度分别为31.25、62.5、125、250及500μg/mL)。37℃，5％CO2培养箱中继续培养24h后，收集细胞，1500rpm离心5min，PBS洗1次。然后加入荧光标记的单克隆抗体FITC-CD11c和APC-CD86或FITC-CD11c和PE-MHC II进行双染，在4℃下避光孵育30min，PBS洗3次后，加入400μL PBS重悬细胞，通过流式细胞术测定CD86及 MHC II的表达。
结果显示：
通过流式细胞术检测ASPA80-1作用24h后CD11c+树突状细胞中CD86及MHC II的表达情况，从而进一步考察ASPA80-1能否促进DCs的成熟。如图10所示，ASPA80-1在125、250和500μg/mL的浓度下均可促进CD11c+树突状细胞表面CD86及MHC II的表达，与正常对照组相比具有显著性差异，而且具有剂量依赖性。
实施例10
流式细胞术检测ASPA80-1对树突状细胞吞噬功能的影响
收集树突状细胞，小心吹打重悬成单细胞悬液，调整细胞密度为以5×105cells/mL，接种于12孔板，每孔1mL细胞悬液，加入1mL番荔枝多糖溶液(终浓度为250μg/mL)或LPS溶液(终浓度1μg/mL)，阴性对照组则加入等体积的完全培养基。作用24h后，加入 FITC-dextran(40000Da)并使其终浓度为1mg/mL，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养1h。 1h后PBS洗两遍，加入FITC荧光标记的单克隆抗体CD11c，在4℃的条件下孵育30min，注意避光，然后用PBS洗涤3次，加入400μL PBS重悬细胞，通过流式细胞术检测吞噬情况。
结果显示：
通过流式细胞术检测ASPA80-1作用后树突状细胞吞噬功能的情况，如图11所示，经250 μg/mL的ASPA80-1作用24h后，树突状细胞的吞噬能力显著下降，再次证明ASPA80-1能促进树突状细胞的成熟。
实施例11
Griess法检测ASPA80-1对树突状细胞分泌NO的影响
收集培养至第六天的树突状细胞，制备成单细胞悬液，吸取10μL进行计数，调整细胞密度为1×106cells/mL，均匀的接种在96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，同时分别加入 100μL不同浓度的番荔枝多糖溶液(终浓度分别为31.25、62.5、125、250及500μg/mL) 或LPS溶液(终浓度为1μg/mL)，正常对照组则加入等体积的完全培养基。于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，取出96孔板，3000rpm离心5min。离心完成后，于操作台内收集细胞的上清液。根据NO试剂盒的说明书测定NO的含量。
结果显示：检测了不同浓度的ASPA80-1处理树突状细胞24h后其分泌NO的情况。如图12所示，与正常对照组相比，ASPA80-1在浓度为31.25-500μg/mL时，能显著增强树突状细胞产生NO的能力。ASPA80-1能剂量依赖性地促进树突状细胞中NO的分泌，表明 ASPA80-1可促进树突状细胞的成熟，从而发挥免疫调节功能。
实施例12
免疫印迹分析检测ASPA80-1对树突状细胞TLR2、TLR4、MAPKs及NF-κB信号通路的影响
(1)总蛋白的提取
收集树突状细胞，小心吹打成单细胞悬液，吸取10μL于细胞计数板上计数，调整细胞密度为2×106cells/mL，接种于6孔板，每孔1mL细胞悬液。称取番荔枝多糖，加入培养基溶解，过0.22μm膜，得到1mg/mL的多糖母液。吸取母液进行二倍稀释，得到一系列浓度的番荔枝多糖溶液(浓度分别为62.5、125、250、500及1000μg/mL)，每孔加入1mL相应的番荔枝多糖溶液，使得番荔枝多糖溶液的终浓度分别为31.25、62.5、125、250及500μg/mL，加入含细胞因子的完全培养基作为正常对照组。于细胞培养箱中培养30min。收集各组细胞于不同的离心管，预冷的PBS洗1次，4℃，1500rpm的条件下离心5min，弃除上清液，每孔加入100μL含1％PMSF及1％Na2VO3的SDS细胞裂解液，吹打混匀，冰上裂解5min，期间多次吹打混匀，超声3次，每次5s，使其裂解完全。然后12000rpm离心10min，吸取上层的液体，即可得到总蛋白。
(2)核蛋白的提取
收集树突状细胞，小心吹打成单细胞悬液，吸取10μL于细胞计数板上计数，调整细胞密度为2×106cells/mL，接种于6孔板，每孔1mL细胞悬液。称取番荔枝多糖，加入培养基溶解，过0.22μm滤膜，得到1mg/mL的多糖母液。吸取母液进行二倍稀释，得到一系列浓度的番荔枝多糖溶液(浓度分别为250及500μg/mL)，每孔加入1mL相应的番荔枝多糖溶液，使得番荔枝多糖溶液的终浓度分别为125及250μg/mL，加入含细胞因子的完全培养基作为正常对照组。于细胞培养箱中培养4h。收集细胞，PBS洗一遍，离心，弃上清，加入 200μL添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。涡旋5s，分散细胞，冰浴15min后再加入 10μL细胞浆蛋白抽提试剂B，涡旋5s，冰浴1min。涡旋5s，4℃，12000rpm离心5min，小心吸取上清得浆蛋白。对于沉淀，加入50μL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂，涡旋 15-30s，每隔1-2min，涡旋15-30s，共30min。4℃，12000rpm离心5min，小心吸取上清得核蛋白。
(3)蛋白定量
按照BCA蛋白定量试剂盒的说明书进行操作，按1∶50的比例将B液和A液混合成BCA工作液，每孔200μL加入到96孔板中。再依次加入蛋白标准品及目的蛋白待测样品，于37℃生化培养箱中反应30min，于酶标仪562nm检测OD值，根据标准曲线调整蛋白样品的浓度，使其一致，加入相应体积的5×buffer，涡旋混匀后，煮沸10min使其变性，于-20℃的条件下保存备用。
(4)电泳：
1)制备凝胶：根据目的蛋白分子量的大小，配制相应浓度的凝胶，配方表3和表4所示。
表3.SDS-PAGE分离胶配方(10mL)
表4.SDS-PAGE浓缩胶配方(4mL)
2)上样、电泳：安装电泳装置，小心的把目的蛋白及预染Marker加入到相应的泳道里，调整电压为60V，开始电泳，当蛋白跑至分离胶时，升高电压至110V，继续电泳，直至样品接近凝胶板的底部。
4)转膜：电泳结束后，准备“三明治”，活化PVDF膜，切取相应的目的蛋白胶体并置于转膜液中。“三明治”制备完毕，置于转膜体系中，接通电源，调整电流为200mA，在冰浴条件下进行转膜。
5)封闭：快速取出PVDF膜，置于盛有5％脱脂奶粉封闭液的皿中，在低转速的摇床上封闭2h。
6)孵育一抗：封闭结束，将PVDF膜放入杂交袋并加入相应的一抗，一抗的稀释比例为 1∶1000，4℃条件下孵育过夜。
7)孵育二抗：取出PVDF膜，使用1×TBST进行洗膜，洗涤5次，每次10min。再次置于杂交袋内，加入相同来源二抗，二抗的稀释比例为1∶2000，在低转速的摇床上室温孵育2h。2h后，取出PVDF膜，用1×TBST洗涤5次，每次10min。
8)显影：根据ECL发光液说明书配制发光液并将其滴加在PVDF膜上，在暗室中，进行压片、显影和定影。
结果显示：
1)检测不同浓度的ASPA80-1作用树突状细胞30min后，其表面TLR2及TLR4的表达情况。如图13可见，正常对照组的TLR2表达较低，多糖作用后TLR2的表达上调，ASPA80-1 能促进TLR2的表达。而与正常对照组相比，番荔枝多糖对树突状细胞TLR4的表达没有明显的影响，表明番荔枝多糖可能是通过树突状细胞的TLR2来调控树突状细胞的。
2)通过Western blotting法检测了ASPA80-1刺激树突状细胞30min后，p-ERK、ERK、 p-JNK、JNK、p-P38和P38的蛋白表达情况。如图14可见，浓度为31.25-500μg/mL的ASPA80-1 能上调p-JNK和p-P38蛋白的表达，具有剂量依赖性而ASPA80-1对p-ERK蛋白的表达没有明显影响，说明ASPA80-1促进树突状细胞的成熟可能与p-JNK和p-P38的激活有关。
3)如图15所示，浓度为31.25-500μg/mL的ASPA80-1能促进NF-κB磷酸化，增强其启动转录的活性。通过Western blotting法检测细胞核内NF-κB的含量，我们发现125及250 μg/mL的ASPA80-1能促进NF-κB入核。ASPA80-1促使NF-κB发生磷酸化及进入细胞核，说明其促进树突状细胞的成熟可能与激活NF-κB信号通路有关。

Claims (4)

1.番荔枝多糖ASPA80-1对小鼠巨噬细胞和树突状细胞免疫功能的影响及作用机制。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的体外实验所用的细胞株为RAW264.7巨噬细胞及C57BL/6小鼠骨髓衍生树突状细胞(BMDC)。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述ASPA80-1为热带水果番荔枝成熟果实中提取的多糖，来源于暨南大学中药生物技术研究所。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述ASPA80-1作为免疫增强剂在增强免疫细胞免疫调节功能中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112011508A (zh) * 2020-09-04 2020-12-01 东南大学 一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法

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