CN108402472B - 一种女用蚕蛹提取生物蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种女用蚕蛹提取生物蛋白。该蛋白产品含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白60～90%，雌蚕蛾粉5～15%，胶原蛋白肽2～8%，蜂王浆冻干粉2～8%，无水葡萄糖1～9%。该产品经过合理的复配及加工工艺，经实验和应用案例证明，所得产品具有很好的提高免疫力、平衡女性荷尔蒙、调理气血、改善随眠的作用。而且原料均为可食用的食品原料，安全无副作用；经过大量的感官评价，无任何不适异味，口感好，可直接食用，也可溶于水中饮用，溶解度好，还可适用于制备各种具有提高免疫力、平衡女性荷尔蒙、调理气血、改善随眠作用的食品、饮料、保健品或药品等，具有非常好的应用前景。

Description

一种女用蚕蛹提取生物蛋白
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种女用蚕蛹提取生物蛋白。
背景技术
现代人生活节奏快、压力大，而且饮食过于精细化、运动少等不良的生活习惯造成了各种现代病、亚健康普遍，以及疾病年轻化的问题。另外，现代食品安全也存在着诸多的问题，其中激素的使用乱象对人体激素水平起到不良影响，易引起激素紊乱、内分泌失调等问题，对人体有重要的危害。
利用药食同源物质通过食疗的方式控制疾病、维持健康是中国人喜欢且常见的生活方式。市场上充满了大量的具有各种功效的食品、饮料、保健品；但是大多数存在着夸大效果的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术中的缺陷和不足，提供一种天然生物蛋白产品，以雌蚕蛹蛋白、雌蚕蛾粉、胶原蛋白肽、蜂王浆冻干粉和葡萄糖按照合适比例复配，具有很好的提高人体免疫力、平衡女性荷尔蒙、调理气血、改善随眠的作用。
本发明的目的是提供一种能够提高免疫力、平衡女性荷尔蒙、调理气血、改善随眠作用的女用蚕蛹提取生物蛋白。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种女用蚕蛹提取生物蛋白，含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白60～90%，雌蚕蛾粉5～15%，胶原蛋白肽2～8%，蜂王浆冻干粉2～8%，无水葡萄糖1～9%。
优选地，含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白70～80%，雌蚕蛾粉8～12%，胶原蛋白肽4～6%，蜂王浆冻干粉4～6%，无水葡萄糖4～6%。
更优选地，所述女用蚕蛹提取生物蛋白，其特征在于，含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白75%，雌蚕蛾粉10%，胶原蛋白肽5%，蜂王浆冻干粉5%，无水葡萄糖5%。
优选地，所述胶原蛋白肽为鱼皮胶原蛋白肽。
更优选地，所述鱼皮胶原蛋白肽的制备方法如下：
S1：以鱼皮为原料，先加入8-10倍的水中浸泡3-4小时；再用4-6倍原料重的0.04-0.07mol/L NaOH溶液在25-35℃下浸泡5-6h，用清水漂洗至中性；最后利用6-10倍原料重的0.3-0.4mol/L HCl溶液在25-35℃下浸泡2-4h，再用清水漂洗至pH为3.5-5.5后，磨碎得胶原蛋白溶液；
S2：水解、酶解：将胶原蛋白溶液在75-85℃热水下加热30-80min，降温至45-60℃，调整pH至8.0-9.0，再加入原料重量0.5-1.0%的木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶组成的复合酶，在45-65℃下酶解5-8h；再加入原料重量0.1-0.2%的菠萝蛋白酶，在35-45℃下酶解2-3h，得酶解胶原蛋白肽溶液；
S3：胶原蛋白过滤分离：将酶解胶原蛋白肽溶液使用超滤器过滤；使得分子量4000道尔顿以上的大分子胶原蛋白和水解胶原蛋白溶液分离；将蛋白酶和未完全酶解的高分子胶原蛋白截留并添加到步骤S2中继续使用；
S4：灭酶、脱色、脱腥：用75-85℃对超滤获得的滤液加热20-30min进行灭酶，然后再加入溶液重量的0.5-2.0%的活性炭进行脱色脱腥，接着利用离心机去除活性炭；然后利用纳滤膜进行脱盐、浓缩，再利用树脂脱色脱腥；最后经喷雾干燥或冷冻干燥后得到鱼皮胶原蛋白肽。
优选地，所述雌蚕蛹蛋白的制备方法如下：
（1）将新鲜雌蚕蛹用水清洗、除去蛹皮等杂质后，液氮研磨成粗粉，过50-60目筛；
（2）脱脂：以石油醚为溶剂进行重复脱脂处理5-6次；
（3）脱脂处理后的蚕蛹粗粉75-85℃烘干至含水量6-8%，继续粉碎、过110-120目筛，得脱脂蚕蛹粉末；
（5）将上述脱脂蚕蛹粉末均匀分散质量浓度1.5%的氢氧化钠溶液中，55-65℃水浴浸提12-15h，过滤去除滤渣，得滤液；
（6）滤液用1mol/L盐酸调节pH至4.0-4.5后，1-4℃冰水浴中静置沉淀4-6h，离心得沉淀物；
（7）沉淀物进行脱色、除臭处理，得到雌蚕蛹蛋白粉末。
其中，优选地，步骤（1）中所述新鲜雌蚕蛹是指蚕上蔟结茧后变成蛹之后6-8天的新鲜雌蚕蛹。
优选地，所述雌蚕蛾粉的制备方法如下：
S1.取全只新鲜雌蚕蛾烘干，磨粉，收集雌蚕蛾膏；然后置于10-20°米酒中，室温下浸泡3-4天；
S2.将浸泡液上层油状物分离取出，加到质量体积比5-6%玉米淀粉水溶液中，放置1-2小时后，加入雌蚕蛹蛋白粉，进行乳化均质；
S3.将S2的产物过滤，取滤液；
S4.将滤液在55-65℃真空干燥0.5-1.5小时，细微粉碎至60-100目，过筛收集，得雌蚕蛾粉。
其中，优选地，步骤（1）中所述新鲜雌蚕蛾是指由蛹变成蛾后3-5天的新鲜雌蚕蛾。
本发明的女用蚕蛹提取生物蛋白是将各组分原料消毒后、粉碎、混合均匀、卷膜、紫外灭菌、内包、过金检、外包、成品检测、辐照制成。
另外，所述女用蚕蛹提取生物蛋白在制备能够提高免疫力、平衡女性荷尔蒙、调理气血、改善随眠作用的产品方面的应用，以及含有所述女用蚕蛹提取生物蛋白的具有提高免疫力、平衡女性荷尔蒙、调理气血、改善随眠作用的制剂，均应在本发明的保护范围之内。所述制剂可以为食品、饮料、保健品或药品。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种女用蚕蛹提取生物蛋白，经过合理的复配及加工工艺，经实验和应用案例证明，所得产品具有很好的提高免疫力、平衡女性荷尔蒙、调理气血、改善随眠的作用。
而且该产品原料均为可食用的食品原料，安全无副作用；经过大量的感官评价，无任何不适异味，口感好，可直接食用，也可溶于水中饮用，溶解度好，还可适用于制备各种具有提高免疫力、平衡女性荷尔蒙、调理气血、改善随眠作用的食品、饮料、保健品或药品等，具有非常好的应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、一种女用蚕蛹提取生物蛋白，含有如下质量比的组分：含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白75%，雌蚕蛾粉10%，胶原蛋白肽5%，蜂王浆冻干粉5%，无水葡萄糖5%。
制备方法是将各组分原料消毒后、粉碎、混合均匀、卷膜、紫外灭菌、内包、过金检、外包、成品检测、辐照制成。
2、上述配方中，所述胶原蛋白肽为鱼皮胶原蛋白肽，具体制备方法如下：
S1：以鱼皮为原料，先加入8-10倍的水中浸泡3-4小时；再用4-6倍原料重的0.04-0.07mol/L NaOH溶液在25-35℃下浸泡5-6h，用清水漂洗至中性；最后利用6-10倍原料重的0.3-0.4mol/L HCl溶液在25-35℃下浸泡2-4h，再用清水漂洗至pH为3.5-5.5后，磨碎得胶原蛋白溶液；
S2：水解、酶解：将胶原蛋白溶液在75-85℃热水下加热30-80min，降温至45-60℃，调整pH至8.0-9.0，再加入原料重量0.5-1.0%的木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶组成的复合酶，在45-65℃下酶解5-8h；再加入原料重量0.1-0.2%的菠萝蛋白酶，在35-45℃下酶解2-3h，得酶解胶原蛋白肽溶液；
S3：胶原蛋白过滤分离：将酶解胶原蛋白肽溶液使用超滤器过滤；使得分子量4000道尔顿以上的大分子胶原蛋白和水解胶原蛋白溶液分离；将蛋白酶和未完全酶解的高分子胶原蛋白截留并添加到步骤S2中继续使用；
S4：灭酶、脱色、脱腥：用75-85℃对超滤获得的滤液加热20-30min进行灭酶，然后再加入溶液重量的0.5-2.0%的活性炭进行脱色脱腥，接着利用离心机去除活性炭；然后利用纳滤膜进行脱盐、浓缩，再利用树脂脱色脱腥；最后经喷雾干燥或冷冻干燥后得到鱼皮胶原蛋白肽。
所述雌蚕蛹蛋白的制备方法如下：
（1）将蚕上蔟结茧后变成蛹之后6-8天的新鲜雌蚕蛹用水清洗、除去蛹皮等杂质后，液氮研磨成粗粉，过50-60目筛；
（2）脱脂：以石油醚为溶剂进行重复脱脂处理5-6次；
（3）脱脂处理后的蚕蛹粗粉75-85℃烘干至含水量6-8%，继续粉碎、过110-120目筛，得脱脂蚕蛹粉末；
（5）将上述脱脂蚕蛹粉末均匀分散质量浓度1.5%的氢氧化钠溶液中，55-65℃水浴浸提12-15h，过滤去除滤渣，得滤液；
（6）滤液用1mol/L盐酸调节pH至4.0-4.5后，1-4℃冰水浴中静置沉淀4-6h，离心得沉淀物；
（7）沉淀物进行脱色、除臭处理，得到雌蚕蛹蛋白粉末。
所述雌蚕蛾粉的制备方法如下：
S1.取全只由蛹变成蛾后3-5天的新鲜雌蚕蛾烘干，磨粉，收集雌蚕蛾膏；然后置于10-20°米酒中，室温下浸泡3-4天；
S2.将浸泡液上层油状物分离取出，加到质量体积比5-6%玉米淀粉水溶液中，放置1-2小时后，加入雌蚕蛹蛋白粉，进行乳化均质；
S3.将S2的产物过滤，取滤液；
S4.将滤液在55-65℃真空干燥0.5-1.5小时，细微粉碎至60-100目，过筛收集，得雌蚕蛾粉。
实施例2
一种女用蚕蛹提取生物蛋白，含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白80%，雌蚕蛾粉8%，胶原蛋白肽4%，蜂王浆冻干粉4%，无水葡萄糖4%。制备方法同实施例1。
实施例3
一种女用蚕蛹提取生物蛋白，含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白70%，雌蚕蛾粉12%，胶原蛋白肽6%，蜂王浆冻干粉6%，无水葡萄糖6%。制备方法同实施例1。
实施例4
一种女用蚕蛹提取生物蛋白，含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白90%，雌蚕蛾粉5%，胶原蛋白肽2%，蜂王浆冻干粉2%，无水葡萄糖1%。制备方法同实施例1。
实施例5
一种女用蚕蛹提取生物蛋白，含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白60%，雌蚕蛾粉15%，胶原蛋白肽8%，蜂王浆冻干粉8%，无水葡萄糖9%。制备方法同实施例1。
实施例6 产品提高免疫力效果试验
以实施例1的产品为例，实验组每日冲饮两次，研究其对免疫力的影响作用。在药效研究中，根据《保健食品检验与评价技术规范》中的相关要求，设计了系列药效实验，考察了本发明蛋白产品。结果表明本发明药物组合物能显著提高免疫抑制模型小鼠的脾脏指数、胸腺指数、外周血白细胞数、细胞免疫水平、体液免疫水平；表明本发明的蛋白产品对免疫抑制状态下的机体却有提高免疫力的作用。
一、对免疫抑制模型小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响
1、动物及分组：雌性ICR小鼠，体重18～22g，随机分组，每组10只，适应性饲养3天。
（1）正常对照组：灌胃等容量蒸馏水；
（2）模型对照组：灌胃等容量蒸馏水；
（3）实施例1蛋白组：按20g/kg的剂量给药；
（4）脾氨肽组：按1.3g/kg的剂量给药。
2、给药及实验方法：除正常对照组外，其余各组在连续灌胃3周后，以环磷酰胺40mg/ kg，腹腔注射，连续两天，进行免疫抑制。连续灌胃4周后，脱椎处死小鼠，摘取胸腺及脾脏， 用滤纸吸去表面脏污，称重，计算胸腺指数、脾脏指数。
3、结果如表1：
表1 蛋白产品对免疫器官重量的影响(`x+s)(n＝10)
组别 胸腺指数 脾脏指数
正常对照组 0.229±0.325 0.289±0.542
模型对照组 0.102±0.211<sup>▲▲</sup> 0.192±0.351<sup>▲▲</sup>
脾氨肽组 0.262±0.524** 0.331±0.215**
实施例1蛋白组 0.524±0.231**<sup>▲▲△△</sup> 0.492±0.314**<sup>▲▲△</sup>
注：*表示与模型组比较P<0.05，**表示与模型组比较P<0.01；▲表示与正常组比较P<0.05，▲▲表示与正常组比较P<0.01；△表示与脾氨肽组比较P<0.05，△△表示与脾氨肽组比较P<0.01。
结果表明，本发明的蛋白产品能够显著提高免疫抑制模型小鼠的胸腺指数及脾脏指数，能提高免疫抑制模型小鼠免疫器官的比重，对提高免疫抑制状态下机体的免疫力具有明显的作用。而且实验组与脾氨肽组比较具有统计学意义，表明本发明蛋白产品对提高免疫抑制状态下机体的免疫力相较于脾氨肽效果更好。
二、对免疫抑制模型小鼠血液白细胞数的影响
1、动物及分组：雌性ICR小鼠，体重18～22g，随机分组，每组10只，适应性饲养3天。
（1）正常对照组：灌胃等容量蒸馏水；
（2）模型对照组：灌胃等容量蒸馏水；
（3）实施例1蛋白组：按20g/kg的剂量给药；
（4）脾氨肽组：按1.3g/kg的剂量给药。
2、给药及实验方法：除正常对照组外，其余各组在连续灌胃3周后，以环磷酰胺40mg/ kg，腹腔注射，连续两天，进行免疫抑制。连续灌胃4周后，测定血液白细胞数。以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml离心管中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。在24h内以全血细胞分析仪检测白细胞总数和淋巴细胞数。
3、结果如表2：
表2 蛋白产品对外周血白细胞数的影响(`x+s)(n＝10)
组别 白细胞总数10<sup>9</sup>/L 淋巴细胞数10<sup>9</sup>/L
正常对照组 7.69±1.25 4.57±0.641
模型对照组 4.03±2.42<sup>▲▲</sup> 2.61±0.532<sup>▲▲</sup>
脾氨肽组 8.26±2.43** 5.37±1.246**
实施例1蛋白组 13.56±4.51**<sup>▲▲△△</sup> 9.56±2.413**<sup>▲▲△△</sup>
注：*表示与模型组比较P<0.05，**表示与模型组比较P<0.01；▲表示与正常组比较P<0.05，▲▲表示与正常组比较P<0.01；△表示与脾氨肽组比较P<0.05，△△表示与脾氨肽组比较P<0.01。
结果表明，本发明的蛋白产品能显著提高免疫抑制模型小鼠外周血白细胞 数及淋巴细胞数，对免疫抑制状态下的机体确有提高白细胞数量及淋巴细胞数量的功能，对提高机体的免疫力有明显的作用。同时，实验组与脾氨肽组比较具有统计学意义，表明本发明蛋白产品对提高免疫抑制状态下机体的免疫力相较于脾 氨肽效果组更好。
三、对免疫抑制模型小鼠细胞免疫功能的影响
1、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
动物、分组、给药方法同上。脱椎处死小鼠后，无菌取脾，置于盛有适量(3-5ml)无菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，先用眼科剪将脾脏剪成小块后再用毛玻璃片轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2 次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用细胞计数板在显微镜下计数活细胞数(应在95%以上)，调整细胞浓度为3×106个/mL。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μl ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置 5% CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，超声震荡(2秒)或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm 波长测定光密度值。
结果如表3所示：表明本发明蛋白产品能够显著提高免疫抑制模型小鼠淋巴细胞转化率，对免疫抑制状态下的机体确有提高细胞免疫水平的功能，对提高机体的免疫力有明显的作用。且与脾氨肽组比较具有统计学意义，表明其对提高免疫抑制状态下机体的免疫力相较于脾氨肽效果更好。
表3 蛋白产品对脾淋巴细胞转化的影响(`x+s)(n＝10)
组别 OD值
正常对照组 0.068±0.15
模型对照组 0.043±0.24<sup>▲</sup>
脾氨肽组 0.068±0.13*<sup>▲</sup>
实施例1蛋白组 0.164±0.02**<sup>▲▲△△</sup>
注：*表示与模型组比较P<0.05，**表示与模型组比较P<0.01；▲表示与正常组比较P<0.05，▲▲表示与正常组比较P<0.01；△表示与脾氨肽组比较P<0.05，△△表示与脾氨肽组比较P<0.01。
2、迟发型变态反应(DTH)
动物、分组、给药方法同上。连续灌胃4周后，测定各项指标。每鼠腹部皮肤用 8%硫化钡溶液进行脱毛，范围约3cm×3cm、用DNFB溶液50μl均匀涂抹致敏。5天后，用DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，计算两耳之间的重量差值。
结果如表4所示：表明本发明蛋白产品能够显著提高免疫抑制模型小鼠的耳肿胀程度，促进免疫抑制模型小鼠淋巴细胞增殖，对免疫抑制状态下的机体确有提高细胞免疫水平的功能，对提高机体的免疫力有明显的作用。
表4 蛋白产品对DTH的影响(`x+s)(n＝10)
组别 耳肿胀度mg
正常对照组 4.52±0.523
模型对照组 3.18±1.241<sup>▲</sup>
脾氨肽组 6.23±1.324**<sup>▲▲</sup>
实施例1蛋白组 6.92±1.267**<sup>▲▲</sup>
注：*表示与模型组比较P<0.05，**表示与模型组比较P<0.01；▲表示与正常组比较P<0.05，▲▲表示与正常组比较P<0.01。
四、对免疫抑制模型小鼠体液免疫功能的影响
1、动物、分组、给药方法同上。连续灌胃4周后，测定各项指标。取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬 液，每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫。4～5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固 血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释(5倍、10倍、20倍、40倍、80倍、160倍)，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μl，再加入100μl 0.5%(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。血清凝集程度一般分为5级(0－Ⅳ)记录，按下式计算抗体积数。
抗体水平＝(S1+2S2+3S3……nSn)
式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。
0级红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。
Ⅰ级红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。
Ⅱ级凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。
Ⅲ级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。
Ⅳ级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。
2、结果如表5所示
表5 蛋白产品对溶血素抗体含量的影响(`x+s)(n＝10)
组别 抗体指数
正常对照组 186.4±54.23
模型对照组 113.2±23.54<sup>▲</sup>
脾氨肽组 208.6±54.21**
实施例1蛋白组 231.8±35.16**<sup>▲</sup>
注：*表示与模型组比较P<0.05，**表示与模型组比较P<0.01；▲表示与正常组比较P<0.05，▲▲表示与正常组比较P<0.01。
结果表明，本发明蛋白产品能够显著提高免疫抑制模型小鼠抗体积数水平，对免疫抑制状态下的机体确有提高体液免疫水平的功能，对提高机体的免疫力有明显的作用。
综上结果表明，本发明蛋白产品对免疫抑制状态下的机体确有显著提高免疫功能的效果，且与市面同类型产品相比较，效应更好，差异具有统计学意义。
实施例7 产品平衡女性荷尔蒙效果试验
以实施例1的产品为例，实验组每日冲饮两次，研究其对女性荷尔蒙水平、随眠以及调理气血的影响作用。
1、对雌激素水平的影响
（1）方法：将40只大鼠分成两批供做实验，先随机抽取10只作为空白对照组；其余30只大鼠行双侧卵巢切除术，备用。取上述手术后3个月的大鼠，随机分为3组，加上空白对照组大鼠，共4组，分别为空白对照组，摘除卵巢模型组，阳性对照组(摘除卵巢三月后，给己烯雌酚0.02mg/kg+鱼肝油 450u/kg+钙0.5g/kg混合液)，本发明蛋白给药组（剂量5g/kg），分组灌胃给药， 每日一次，共3个月。给药结束后，腹主动脉取血制备血清，用试剂盒测定血清雌二醇，计算各组数据的均值和标准差，进行组间t测验。
（2）结果如表6所示：
表6 本发明蛋白产品对去势大鼠血清雌二醇的影响(X±SD)
组别 动物数（只） 血清雌二醇（pg/ml）
正常对照组 10 66.15±12.51
模型对照组 10 47.91±11.24
阳性对照组 10 105.32±15.32***
实施例1蛋白组 10 116.29±23.52***
注：***表示与模型组比较P＜0.001。
本发明蛋白组及阳性对照组均能显著地升高去势大鼠血清雌二醇值，分别与模型组比较，差异均有非常显著的意义(P＜0.001)，且本发明蛋白产品的效果优于阳性对照。
2、应用案例
经过大量应用案例验证可知，本发明的蛋白产品，能够改善气色，服用一个月后症状即可明显改善，食欲好转、睡眠好、精力充沛、耐疲劳、思维清晰、情绪稳定，两个月后效果显著。另外，经过大量志愿者的试用测试，本发明的蛋白产品无任何食用过敏、皮肤过敏现象。
实施例8 雌蚕蛹发育程度的筛选
1、以实施例1的蛋白产品为基础，以不同发育时间（蚕上蔟结茧后变成蛹之后第2、4、6、8、10、12天，分别记为第1、2、3、4、5、6组）的雌蚕蛹制备的蛋白为单因素变量，按实施例7测试大鼠雌激素水平的方法进行优化筛选。
2、结果如表7所示，以蚕上蔟结茧后变成蛹之后6-8天的新鲜雌蚕蛹所制作的雄蚕蛹蛋白，与其他组分复配出的产品效果最佳。
表7
组别 动物数（只） 血清雌二醇（pg/ml）
正常对照组 10 68.42±11.32
模型对照组 10 49.23±13.21
阳性对照组 10 108.12±16.12***
第1组 10 102.15±26.24***
第2组 10 105.04±33.45***
第3组 10 119.54±12.31***
第4组 10 124.35±32.42***
第5组 10 108.34±27.23***
第6组 10 106.25±22.13***
注：***表示与模型组比较P＜0.001。
实施例9 复配组分的优化筛选
1、按照表8进行复配，然后按实施例7测试大鼠雌激素水平的方法研究各组产品的效果对比。结果如表9所示。
表8
组别 配方（质量比）
组1 雌蚕蛹蛋白：雌蚕蛾粉：胶原蛋白肽：蜂王浆冻干粉：无水葡萄糖=75：10：5：5：5
组2 雌蚕蛹蛋白：雌蚕蛾粉：胶原蛋白肽：蜂王浆冻干粉=75：10：5：5
组3 雌蚕蛹蛋白：雌蚕蛾粉：胶原蛋白肽：无水葡萄糖=75：10：5：5
组4 雌蚕蛹蛋白：雌蚕蛾粉：蜂王浆冻干粉：无水葡萄糖=75：10：5：5
组5 雌蚕蛹蛋白：胶原蛋白肽：蜂王浆冻干粉：无水葡萄糖=75：5：5：5
表9
组别 动物数（只） 血清雌二醇（pg/ml）
正常对照组 10 67.45±13.24
模型对照组 10 48.34±14.35
阳性对照组 10 107.22±16.54***
第1组 10 126.47±56.13***
第2组 10 118.12±22.42***
第3组 10 98.25±35.14<sup>▲</sup>
第4组 10 87.14±51.62<sup>▲▲</sup>
第5组 10 75.64±26.36<sup>▲▲</sup>
注：***表示与模型组比较P＜0.001；▲表示与第1组比较P<0.05，▲▲表示与第1组比较P<0.01。
由实验结果可知，雌蚕蛹蛋白、雌蚕蛾粉、胶原蛋白肽、蜂王浆冻干粉、无水葡萄糖的特定复配合理，发挥了显著的协同增效作用。
实施例10 组分配比对功效的影响
1、首先分别以雌蚕蛹蛋白、雌蚕蛾粉、胶原蛋白肽、蜂王浆冻干粉、无水葡萄糖的用量比为单因素变量，按实施例7测试大鼠雌激素水平的方法进行优化各组分的配比。然后在单因素变量实验基础上，利用正交实验进一步优化。
结果显示，以雌蚕蛹蛋白：雌蚕蛾粉：胶原蛋白肽：蜂王浆冻干粉：无水葡萄糖=60～90：5～15：2～8：2～8：1～9的质量比进行复配，蛋白产品提高雌激素水平的效果最好。进一步地，雌蚕蛹蛋白：雌蚕蛾粉：胶原蛋白肽：蜂王浆冻干粉：无水葡萄糖的质量比优选为70～80：8～12：4～6：4～6：4～6，最佳配比为75：10：5：5：5。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种女用蚕蛹提取生物蛋白组合物，其特征在于，含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白70～80%，雌蚕蛾粉8～12%，胶原蛋白肽4～6%，蜂王浆冻干粉4～6%，无水葡萄糖4～6%；
其中，所述胶原蛋白肽为鱼皮胶原蛋白肽，制备方法如下：
S1：以鱼皮为原料，先加入8-10倍的水中浸泡3-4小时；再用4-6倍原料重的0.04-0.07mol/LNaOH溶液在25-35℃下浸泡5-6h，用清水漂洗至中性；最后利用6-10倍原料重的0.3-0.4mol/LHCl溶液在25-35℃下浸泡2-4h，再用清水漂洗至pH为3.5-5.5后，磨碎得胶原蛋白溶液；
S2：水解、酶解：将胶原蛋白溶液在75-85℃热水下加热30-80min，降温至45-60℃，调整pH至8.0-9.0，再加入原料重量0.5-1.0%的木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶组成的复合酶，在45-65℃下酶解5-8h；再加入原料重量0.1-0.2%的菠萝蛋白酶，在35-45℃下酶解2-3h，得酶解胶原蛋白肽溶液；
S3：胶原蛋白过滤分离：将酶解胶原蛋白肽溶液使用超滤器过滤；使得分子量4000道尔顿以上的大分子胶原蛋白和水解胶原蛋白溶液分离；将蛋白酶和未完全酶解的高分子胶原蛋白截留并添加到步骤S2中继续使用；
S4：灭酶、脱色、脱腥：用75-85℃对超滤获得的滤液加热20-30min进行灭酶，然后再加入溶液重量的0.5-2.0%的活性炭进行脱色脱腥，接着利用离心机去除活性炭；然后利用纳滤膜进行脱盐、浓缩，再利用树脂脱色脱腥；最后经喷雾干燥或冷冻干燥后得到鱼皮胶原蛋白肽；
所述雌蚕蛹蛋白的制备方法如下：
（1）将新鲜雌蚕蛹用水清洗、除去蛹皮等杂质后，液氮研磨成粗粉，过50-60目筛；
（2）脱脂：以石油醚为溶剂进行重复脱脂处理5-6次；
（3）脱脂处理后的蚕蛹粗粉75-85℃烘干至含水量6-8%，继续粉碎、过110-120目筛，得脱脂蚕蛹粉末；
（5）将上述脱脂蚕蛹粉末均匀分散质量浓度1.5%的氢氧化钠溶液中，55-65℃水浴浸提12-15h，过滤去除滤渣，得滤液；
（6）滤液用1mol/L盐酸调节pH至4.0-4.5后，1-4℃冰水浴中静置沉淀4-6h，离心得沉淀物；
（7）沉淀物进行脱色、除臭处理，得到雌蚕蛹蛋白粉末；
所述雌蚕蛾粉的制备方法如下：
S1.取全只新鲜雌蚕蛾烘干，磨粉，收集雌蚕蛾膏；然后置于10-20°米酒中，室温下浸泡3-4天；
S2.将浸泡液上层油状物分离取出，加到质量体积比5-6%玉米淀粉水溶液中，放置1-2小时后，加入雌蚕蛹蛋白粉，进行乳化均质；
S3.将S2的产物过滤，取滤液；
S4.将滤液在55-65℃真空干燥0.5-1.5小时，细微粉碎至60-100目，过筛收集，得雌蚕蛾粉。
2.根据权利要求1所述女用蚕蛹提取生物蛋白组合物，其特征在于，含有如下质量比的组分：雌蚕蛹蛋白75%，雌蚕蛾粉10%，胶原蛋白肽5%，蜂王浆冻干粉5%，无水葡萄糖5%。
3.根据权利要求1所述女用蚕蛹提取生物蛋白组合物，其特征在于，所述新鲜雌蚕蛹是指蚕上蔟结茧后变成蛹之后6-8天的新鲜雌蚕蛹。
4.根据权利要求1所述女用蚕蛹提取生物蛋白组合物，其特征在于，所述新鲜雌蚕蛾是指由蛹变成蛾后3-5天的新鲜雌蚕蛾。
5.一种具有提高免疫力、平衡女性荷尔蒙、调理气血、改善睡眠作用的制剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述女用蚕蛹提取生物蛋白组合物。
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