CN112011508A - 一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法 - Google Patents

一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，包括以下步骤：S1、小鼠骨髓细胞提取：用手术镊将股骨、胫骨保留端夹裂继续冲洗，最大限度获取细胞；S2、树突状细胞细胞培养：培养第三天保留原有培养基及细胞并加入新鲜培养基继续培养；S3、树突状细胞细胞纯化；采用Percoll分层液纯化诱导。本发明通过用手术镊夹裂骨骺端代替剪去骨骺端，将传统第三天离心后丢弃的细胞再次加回培养皿中，同时在第三日换液时加入新鲜培养基的基础上，保留原有培养基，极大地提高了收获的DC数；本发明通过Percoll液纯化筛选，得到DC细胞纯度达90％以上，且与经典磁珠分选的方式比较得率提高21％,且Percoll密度分选法消耗更低的成本。

Description

一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法
技术领域
本发明涉及树细胞培养领域，具体的是一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法。
背景技术
树突状细胞，也称DC细胞，是功能最强的抗原提呈细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC能合成大量的MHCⅡ类分子；具有表达、摄取和转运抗原的特殊膜受体；能有效摄取和处理抗原然后迁移至T细胞区域，具有一个成熟化的过程；能激活初始型T细胞；少量的抗原和少量的DC即足以激活T细胞。由于它在机体的抗感染免疫，抗肿瘤免疫应答及移植免疫中的作用极其重要而备受重视，成为近年来免疫学研究的热点。DC在生物体内分布广泛，但数量较少，因此如何获得大量、纯化的DC就成为进一步研究DC特性及功能的前提。
目前，在研究DC细胞研究过程中，采用小鼠骨髓来源树突状细胞的诱导及纯化方式多种多样，但存在树突状细胞诱导周期长、数量少、纯化成本较高等不足，难以满足基础研究或临床研究的需求，为了改变上述缺点，采用延长诱导时间等，来增加细胞数量或提高纯度，但导致诱导周期延长，也延长了实验周期，增加了诱导成本。另外高纯度树突状细胞是进行其基础实验的前提，而目前经典的纯化技术均磁珠分选或流式分析为基础，仍然需要较高的成本，且操作复杂，不利于掌握。
发明内容
为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供，。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，包括以下步骤：
S1、小鼠骨髓细胞提取：处死小鼠后于无菌培养皿中取出小鼠下肢骨，剪去胫骨远端头和股骨近端头，保留完成胫骨近端头和股骨远端端头，取含有PBS注射器从保留骨骺端刺入进行冲洗骨髓细胞，再用手术镊将股骨、胫骨保留端夹裂继续冲洗，最大限度获取细胞，裂解获得的细胞中的红细胞后，流式检测并计算活细胞数量；
S2、树突状细胞细胞培养：将步骤S1中获得的细胞按比例加入培养基中，再放入恒温培养箱中培养，培养第三天保留原有培养基及细胞并加入新鲜培养基继续培养，培养第五天吸出部分培养基及悬浮细胞离心去上清液，PBS清洗数次后依次加入FCR抗体封闭、CD11c抗体孵育，然后在用PBS清洗数次后进行流式检测；
S3、树突状细胞细胞纯化：培养第六天收集细胞悬液离心洗涤去上清液，PBS清洗3次后加入预冷的PBS充分混匀重悬，然后将细胞混悬液采用Percoll分层液纯化诱导，将分选得到的细胞PBS重悬，取少量细胞悬液依次加入FCR抗体封闭、CD11c抗体孵育后进行流式检测DC细胞纯度，其余细胞悬液加入培养基中继续培养。
优选地，培养基成分包括40ng/mLGM-CSF、40ng/mLIL-4和10％RPMI-1640。
优选地，PBS为磷酸缓冲盐溶液。
优选地，步骤S1中选择4周龄小鼠。
优选地，步骤S1中加入2倍于细胞体积的红细胞裂解液，吹打混匀后静置1分钟，再加5倍于裂解液体积的冷PBS溶液终止裂解。
优选地，步骤S3中Percoll分层液的密度为1.055，采用Percoll分层液纯化诱导时取中间层细胞。
本发明的有益效果：
1本发明方法与传统方法比较，首先，我们通过用手术镊夹裂骨骺端代替剪去骨骺端，收获细胞数目较前增加18％，而选择4周龄小鼠比8周龄小鼠获得细胞数增加15％；其次，传统第三天离心后丢弃的细胞再次加回培养皿中，最终收获的DC增加61％；然后，在第三日换液时加入新鲜培养基的基础上，保留原有培养基(传统方式是吸弃原有陈旧培养基)，使最后收获的DC数增加137％，花费较传统方式平均降低74％-78％。
2、本发明通过Percoll液纯化筛选，采用1.055Percoll密度纯化诱导第6日的DC，与经典磁珠分选的方式比较，DC的纯度均在90％以上，二者无差异；但是Percoll密度分选法得率提高21％,且Percoll密度分选法消耗更低的成本，其平均一次分选费用为4元人民币较磁珠分选648元，成本降低99％。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是本发明不同下肢骨处理方式活细胞比例和组细胞数对比图；
图2是本发明不同统培养方法细胞数量对比图；
图3是本发明不同统培养方法DC细胞纯度对比图；
图4是本发明不同统培养方法成本对比图；
图5是本发明不同周龄小鼠组细胞数对比图；
图6是本发明不同纯化筛选方法DC细胞纯度和得率对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“开孔”、“上”、“下”、“厚度”、“顶”、“中”、“长度”、“内”、“四周”等指示方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的组件或元件必须具有特定的方位，以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1
一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，包括以下步骤：
S1小鼠骨髓细胞的提取：
S101、选择4周龄小鼠处死，放在75％酒精中浸泡并放入超净台中，3-5分钟后，取出放入直径10cm无菌培养皿内；
S102、用无菌镊子小心捏起小鼠髂窝的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，从上至下去除大腿至踝关节的皮肤，在脚踝处及髋关节处剪断，游离出小鼠两条下肢；
S103、剥离膝关节的肌肉，在股骨、胫骨交界处逆向关节弯曲方向掰开，可见胫骨平台；去除股骨远端附属组织，用纱布磨去骨上附着肌肉后，放到装有75％酒精的培养皿中浸泡3分钟；
S104、在PBS培养皿中清洗下肢骨，剪去胫骨远端头和股骨近端头(注意尽可能保留骨骺端)，露出红色的骨髓腔；弯曲针头，用1mL的无菌注射器吸取1mLPBS液，保留完成胫骨近端头和股骨远端端头，从胫骨平台插入胫骨骨髓腔，冲洗骨髓腔至50mL离心管中以获得骨髓，每一端均冲洗3次；同样方法冲洗另外一端时，为最大限度获取细胞，用无菌镊将股骨、胫骨冲洗远端头部夹裂，再继续冲洗，直至骨棒两端成乳白色；
S105、离心：300g、4℃温离心5分钟；
S106、去上清，加入2倍体积红细胞裂解液，吹打混匀后静置1分钟，再加5倍于裂解液体积的冷PBS溶液终止裂解，离心5分钟(300g)，弃上清，用冷PBS洗涤骨髓细胞1次，300g室温离心5分钟，弃上清；
S107、用含40ng/mLGM-CSF、40ng/mLIL-4、10％RPMI-1640培养基稀释10mL，涡旋混匀；
S108、计数活细胞：取100uL细胞悬液，加入冷PBS3mL重悬，300g、4℃温离心5分钟，去上清加入100uLPBS，加入1uLFVS-780，4℃避光15min，加入冷PBS3mL重悬，300g、4℃温离心5分钟，洗三次，加入PBS200uL流式检测并计算活细胞数量；
S2、树突状细胞细胞培养：
S201、根据活细胞数量，加入含40ng/mLGM-CSF、40ng/mLIL-4、10％RPMI-1640培养基，平均每只小鼠提取的细胞混匀与50mL上述培养基中，分别取10mL细胞悬液转入直径10cm培养皿内，放于37℃、含5％CO2培养箱中培养；
S202、培养3天后，保留原有培养基，加入10mL含有40ng/mLGM-CSF、40ng/mLIL-4的10％RPMI-1640，持续观察其生长状态；
S203、培养5天后，吸出全部培养基及悬浮细胞，300g离心5分钟，去上清，PBS洗三次，加入FCR避光4℃封闭15分钟，然后加入CD11c抗体避光4℃封闭30分钟，PBS洗三次后进行流式检测；
S3树突状细胞细胞纯化：
S301、轻轻吹打培养瓶，收集第6日非贴壁细胞悬液至50mL离心管，重悬沉淀细胞进行纯度及数量检测，或percoll密度梯度离心分选；
S302、离心洗涤：300g×5分钟，去上清，加入5mLPBS洗3次；去上清加入每108细胞加入3mL预冷的PBS，充分混匀重悬；
S303取15mL离心管，加入4mL1.055密度的percoll液，倾斜离心管，沿管壁轻轻加入PBS细胞混悬液；
S304、在4℃，400G离心22分钟，缓慢加速和减速，关闭brake键；
S305取中间层细胞，加入PBS重悬，重复(3)(4)步骤一次；
S306、PBS重悬，取少量细胞悬液加入FCR避光4℃封闭15分钟，然后加入CD11c抗体避光4℃封闭30分钟，PBS洗三次后进行流式检测DC纯度；
S307、其余细胞待用或加入10mL含有40ng/mLGM-CSF、40ng/mL IL-4的10％RPMI-1640继续培养。
实施例2
步骤S104中不保留骨骺端，其他步骤同实施例1。
如图1所示，用FVS-780死活染料孵育15分钟，PBS洗脱后进行流式检测，活细胞比例R1占总细胞P2门的90％以上；计数R1门中细胞数并计算细胞总数，保留骨骺端较不保留组细胞数增加18％。
实施例3
传统方法组【Traditional group(T)】：
①第0天，根据骨髓活细胞数量，用含有GM-CSF、IL-4(终浓度均为40ng/mL)、10％RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至4×105个细胞/mL，取10mL细胞悬液转入直径10cm培养皿内(3复孔)，放于37℃、含5％CO2培养箱中培养；
②第3天，完全去除皿中含细胞的旧培养基，加入含①中同样诱导因子的上述新鲜培养液10mL；
③第5天，取培养皿中细胞悬液，300G离心10分钟，PBS洗三次，FCR4℃封闭15分钟，加入CD11c流式抗体4℃孵育30分钟，PBS洗3次后，流式检测细胞数量及纯度，根据稀释倍数计算树突状细胞总量。
实施例4
改进方法组I-40【Improved group(I-40)】：
①第0天，根据骨髓活细胞数量，用含有GM-CSF、IL-4(终浓度均为40ng/mL)、10％RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至4×105个细胞/mL，取10mL细胞悬液转入直径10cm培养皿内(3复孔)，放于37℃、含5％CO2培养箱中培养；
②第3天，保留皿中含细胞的旧培养基，同时继续加入含①中同样诱导因子的上述新鲜培养液10mL；
③第5天，取培养皿中细胞悬液，300G离心10分钟，PBS洗三次，FCR4℃封闭15分钟，加入CD11c流式抗体4℃孵育30分钟，PBS洗3次后，流式检测细胞数量及纯度，根据稀释倍数计算树突状细胞总量。
实施例5
改进方法组I-40+第3日不更换培养基【I-40without fresh medium】：
诱导DC中发现，在第3日时培养基颜色无显著变化，考虑DC可能为低代谢细胞，推测培养基可能对DC的影响不大，故设置本组比较。
①第0天，根据骨髓活细胞数量，用含有GM-CSF、IL-4(终浓度均为40ng/mL)、10％RPMI-1640培养液，调整细胞浓度至4×105个细胞/mL，取10mL细胞悬液转入直径10cm培养皿内(3复孔)，放于37℃、含5％CO2培养箱中培养；
②第3天，保留皿中含细胞的旧培养基，仅加入含①中同样诱导因子(终浓度均为40ng/mL)，不添加新鲜的培养液；
③第5天，取培养皿中细胞悬液，300G离心10分钟，PBS洗三次，FCR4℃封闭15分钟，加入CD11c流式抗体4℃孵育30分钟，PBS洗3次后，流式检测细胞数量及纯度，根据稀释倍数计算树突状细胞总量。
实施例6
改进方法组I-20【Improved group(I-20)】：
①第0天，根据骨髓活细胞数量，用含有GM-CSF、IL-4(终浓度均为20ng/mL)、10％RPMI-1640培养液，调整细胞浓度至4×105个细胞/mL，取10mL细胞悬液转入直径10cm培养皿内(3复孔)，放于37℃、含5％CO2培养箱中培养；
②第3天，保留皿中含细胞的旧培养基，同时继续加入含①中同样诱导因子(终浓度均为20ng/mL)的上述新鲜培养液10mL；
③第5天，取培养皿中细胞悬液，300G离心10分钟，PBS洗三次，FCR4℃封闭15分钟，加入CD11c流式抗体4℃孵育30分钟，PBS洗3次后，流式检测细胞数量及纯度，根据稀释倍数计算树突状细胞总量。
实施例7
传统方法组+第3日细胞返皿【I-40without old medium或(T+cell returned)】：
①第0天，根据骨髓活细胞数量，用含有GM-CSF、IL-4(终浓度均为40ng/mL)、10％RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至4×105个细胞/mL，取10mL细胞悬液转入直径10cm培养皿内(3复孔)，放于37℃、含5％CO2培养箱中培养；
②第3天，将含细胞的旧培养基移入离心管中，300g离心5分钟，去上清，加入含①中同样诱导因子的上述新鲜培养液10mL重悬，加回培养皿中；
③第5天，取培养皿中细胞悬液，300g离心10分钟，PBS洗三次，FCR4℃封闭15分钟，加入CD11c流式抗体4℃孵育30分钟，PBS洗3次后，流式检测细胞数量及纯度，根据稀释倍数计算树突状细胞总量。
如图2所示，在传统培养方法基础上，将第三日原来准备丢弃的细胞返回培养皿，最终的DC数量显著增加(增加61％)；将传统方法中第三日本该丢弃的培养基，继续保留导致最终收获DC数量再次增加(增加137％)；如果第3日不更换培养基，仅增加细胞因子与改进组(I-40)比较，获得DC细胞数量显著下降，同样降低诱导因子浓度，DC细胞数量也显著下降。
如图3所示，与传统方法比较，改进组DC纯度显(I-40)著上升，但是降低诱导因子浓度后改进组DC(I-20)纯度下降显著。
如图4所示，与传统方法比较，改进组I-40、和改进组I-20的价格显著下降，I-40较传统组(含骨垢端保留)较传统组同样细胞数，价格下降74-78％。
实施例8
将步骤S101中4周龄小鼠换为8周龄小鼠，其他步骤同实施例1。
如图5所示，与8周龄小鼠相比，采用改进的骨髓细胞提取方法，4周龄小鼠获得骨髓细胞数显著增加(增加15％)。
实施例9
步骤S3中采用经典磁珠分选法(MACS)对细胞进行分选，其他步骤同实施例1。
如图6所示，与经典磁珠分选法(MACS)比较，percoll分选方法获得DC的纯度亦高于90％，二者无差别；与MACS方法比较，percoll分选方法得率更高，增加21％；且percoll分选方法花费更少，价格降低99％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (6)

1.一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、小鼠骨髓细胞提取：处死小鼠后于无菌培养皿中取出小鼠下肢骨，剪去胫骨远端头和股骨近端头，保留完成胫骨近端头和股骨远端端头，取含有PBS注射器从保留骨骺端刺入进行冲洗骨髓细胞，再用手术镊将股骨、胫骨保留端夹裂继续冲洗，最大限度获取细胞，裂解获得的细胞中的红细胞后，流式检测并计算活细胞数量；
S2、树突状细胞细胞培养：将步骤S1中获得的细胞按比例加入培养基中，再放入恒温培养箱中培养，培养第三天保留原有培养基及细胞并加入新鲜培养基继续培养，培养第五天吸出部分培养基及悬浮细胞离心去上清液，PBS清洗数次后依次加入FCR抗体封闭、CD11c抗体孵育，然后在用PBS清洗数次后进行流式检测；
S3、树突状细胞细胞纯化：培养第六天收集细胞悬液离心洗涤去上清液，PBS清洗3次后加入预冷的PBS充分混匀重悬，然后将细胞混悬液采用Percoll分层液纯化诱导，将分选得到的细胞PBS重悬，取少量细胞悬液依次加入FCR抗体封闭、CD11c抗体孵育后进行流式检测DC细胞纯度，其余细胞悬液加入培养基中继续培养。
2.根据权利要求1所述的小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，其特征在于，所述培养基成分包括40ng/mL GM-CSF、40ng/mL IL-4和10％RPMI-1640。
3.根据权利要求1所述的小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，其特征在于，所述PBS为磷酸缓冲盐溶液。
4.根据权利要求1所述的小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中选择4周龄小鼠。
5.根据权利要求1所述的小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中加入2倍于细胞体积的红细胞裂解液，吹打混匀后静置1分钟，再加5倍于裂解液体积的冷PBS溶液终止裂解。
6.根据权利要求1所述的小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中Percoll分层液的密度为1.055，采用Percoll分层液纯化诱导时取中间层细胞。
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