CN107129970A - 一种树突状细胞的分离提取方法 - Google Patents

一种树突状细胞的分离提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种树突状细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)骨髓单个核细胞悬液制备：取骨，将骨骺剪断，冲洗中间骨获得骨髓液，将骨骺剪碎至成黏状，与前述骨髓液混合，放置于滤网上，冲洗3～4次获得细胞悬液，离心，收集沉淀，加红细胞裂解液，静置，离心，洗涤，得骨髓单个核细胞；(2)imDC细胞培养：将步骤(1)所得骨髓单个核细胞，采用培养基1重悬，接种培养，离心，采用添加了生长因子的培养基2培养，连续培养7天，获得imDC细胞；(3)mDC细胞培养：向imDC细胞加入含有促成熟因子的细胞培养基3继续诱导培养，即可。本发明树突状细胞的分离方法，可以从小鼠骨髓中有效分离树突状细胞，临床应用前景优良。

Description

一种树突状细胞的分离提取方法
技术领域
本发明涉及树突状细胞的分离提取方法。
背景技术
树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前公认的体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞，最大的特点是能有效的刺激静止T细胞，诱发初始免疫应答，点状放大并激活T细胞增殖。DC还可以分泌免疫反应的启动因子和调节因子，能活化T、B淋巴细胞所需的有效刺激因子，是联系天然防御功能和获得性免疫的关键。近年来的研究认为，DC的功能取决于其成熟和激活的状态，DC成熟经历两个阶段，第一阶段，不成熟DC(immature dendritic cell,imDC)，其递呈抗原的能力弱；第二阶段，成熟DC(mature dendritic cell,mDC)，其递呈抗原的能力强。抗原经mDC呈递后，诱导产生抗原特异性T细胞。DC在抗肿瘤免疫方面具有强大功能，是肿瘤细胞免疫治疗的重要成分，大量研究显示DC疫苗安全、易于操作，对于一系列类型的肿瘤均有免疫抑制作用，并在肿瘤的免疫治疗取得了令人鼓舞的初步结果，目前DC治疗适用于恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、各种肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等。
DC的来源主要有三种：外周血来源，骨髓单个核细胞来源和干细胞来源。与人类相关的实验及人体实验中DC多由外周血或脐带血制备，动物实验中DC多来源于骨髓。文献报道常用制备骨髓源性DC的方法主要有淋巴细胞分离法、红细胞裂解法等，但是淋巴细胞分离法在操作过程中单核细胞损失较多，故裂解红细胞法被越来越多的研究者选用。
在体外扩增出大量DC对其生物学特征的研究和临床应用的需要具有重要意义，但是目前骨髓源性DC的分离培养的主要困难在于如何获得大量的高纯度的DC，。杨贺勤，张震宇.大鼠骨髓树突状细胞的分离和培养[J].现代妇产科进展，2009,18,486-489公开了一种DC分离培养方法，它包括如下步骤：(1)用裂解红细胞法收集骨髓单个核细胞；(2)联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-α这3种细胞因子诱导培养DC。该方法最终每只大鼠可获得(1.5～2)×106个DC，该方法获得的DC细胞数量较少，难以满足研究DC特性和功能。
建立一种高产量的DC分离培养方法，对临床大规模应用有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种获得高产量的DC的分离方法。
本发明树突状细胞的分离方法，包括如下步骤：
(1)骨髓单个核细胞悬液制备：取骨，将骨骺剪断，冲洗中间骨获得骨髓液，将骨骺剪碎至成黏状，与前述骨髓液混合，放置于滤网上，冲洗3～4次获得细胞悬液，离心，收集沉淀，加红细胞裂解液，静置，离心，洗涤，得骨髓单个核细胞；
(2)imDC细胞培养：将步骤(1)所得骨髓单个核细胞，采用培养基1重悬，接种培养，离心，采用添加了生长因子的培养基2培养，连续培养7天，获得imDC细胞；
所述培养基1是添加了FCS和青/链霉素的RPMI 1640培养基，其中，FCS的添加量为培养基的10％，青霉素的终浓度是100U/ml，链霉素的终浓度是100ug/ml；
所述培养基2是添加了FCS、IL-4、GM-CSF和青/链霉素的RPMI 1640培养基，其中，FCS的添加量为培养基的10％，IL-4的终浓度为5ng/ml，GM-CSF的终浓度是10ng/ml，青霉素的终浓度是100U/ml，链霉素的终浓度是100ug/ml；
(3)mDC细胞培养：向imDC细胞加入含有促成熟因子的细胞培养基3继续诱导培养2天，获得mDC细胞，即可。
步骤(1)中，所述滤网是70um滤网。
步骤(1)中，所述离心是300g离心10min。
步骤(1)中，冲洗或者洗涤采用培养基，所述培养基是添加了青/链霉素的RPMI1640培养基，其中，青霉素的终浓度是100U/ml，链霉素的终浓度是100ug/ml。
步骤(1)中，所述红细胞裂解液按照如下方法制备：称取8.29g NH4Cl、1g KHCO3、37.2mg EDTA.Na2.2H2O溶于1L水中，过滤除菌，即可。
步骤(2)中，所述骨髓单个核细胞接种浓度是0.5-1x106个/ml。
步骤(2)中，采用培养基1培养的时间为3h。
步骤(2)中，采用培养基2培养时，隔天半量换液。
步骤(3)中，所述促成熟因子是TNF-α。
步骤(3)中，所述促成熟因子的浓度是20ng/ml。
步骤(3)中，所述培养基3是添加了FCS、IL-4、GM-CSF、TNF-α和青/链霉素的RPMI1640培养基，其中，FCS的添加量为培养基的10％，IL-4的终浓度为5ng/ml，GM-CSF的终浓度是10ng/ml，TNF-α的终浓度是20ng/ml，青霉素的终浓度是100U/ml，链霉素的终浓度是100ug/ml
本发明采用骨髓单核细胞体外诱导扩增培养，有效地将树突状细胞从骨髓组织中分离，获得的细胞数量多，分离效率高，获得的细胞的纯度高，临床应用前景优良。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明：
图1为imDC细胞形态特征；
图2为mDC细胞形态特征；
图3为流式细胞仪鉴定DC结果。
具体实施方式：
实施例1本发明DC的分离方法
骨髓单个核细胞悬液制备：6-8周龄的SPF级健康的雄性BABL/c小鼠，分离出股骨、胫骨、肱骨；将骨头骨骺处剪断收集至培养皿中，中间骨部分以培养基(RPMI 1640培养基+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素)冲洗出骨髓液，骨骺部分用剪刀剪碎至成黏状为止，将其与前述骨髓液混合，用70um滤网过滤，冲洗(RPMI 1640培养基+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素)3～4次，收集细胞悬液；
红细胞裂解：将细胞悬液300g、离心10min，弃上清，加入5-10倍沉淀体积的红细胞裂解液(称取8.29g NH4Cl、1g KHCO3、37.2mg EDTA.Na2.2H2O溶于1L ddH2O中，调节pH至7.2-7.4，过滤除菌，4℃避光保存)，充分混匀后室温下静置3min，再加入等体积PBS离心洗涤，弃上清后再洗涤一次，加入培养基(RPMI 1640培养基+10％灭活FCS+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素)重悬细胞沉淀；
细胞计数、接种:细胞计数，按照0.5-1x106/ml的接种数，将细胞接种于6孔板中(每孔总体积1.5ml)；
细胞培养：将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养3h后，轻轻吸出各孔上清于离心管中(离心重悬继续接种于另一孔板)，向孔板中各孔加入1.5ml添加有生长因子的完全培养基(RPMI 1640培养基+10％灭活FCS+10ng/ml GM-CSF+5ng/ml IL-4+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素)，37℃，5％CO2培养箱中培养；细胞隔天半量换液，连续培养7天；
细胞鉴定：收集细胞进行CD11c荧光标记，然后用流式细胞仪进行检测，根据阳性比例确定DC细胞数；
诱导成熟：：向imDC细胞加入含有促成熟因子的细胞培养基(RPMI 1640培养基+10％灭活FCS+10ng/ml GM-CSF+5ng/ml IL-4+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素+20ng/mlTNF-α)，继续诱导培养2天，形态观察。
2、实验结果
如图1所示，本发明方法获得imDC，为典型DC外形，细胞成集落分布生长；
如图2所示，本发明方法获得mDC，细胞均匀分布，疏松贴壁生长，胞体较大，可见明显的“树突状突起”DC细胞形态；
如图3所示，流式细胞仪鉴定DC：CD11c阳性率为82.0％，根据阳性比例确定DC细胞数，每只小鼠可获得3-5x107个DC，纯度为80-90％。
本发明骨髓单核细胞体外诱导扩增培养，可以有效地将树突状细胞从骨髓组织中分离，获得的细胞数量多，分离效率高，获得的细胞的纯度高，临床应用前景优良。

Claims (10)

1.一种树突状细胞的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)骨髓单个核细胞悬液制备：取骨，将骨骺剪断，冲洗中间骨获得骨髓液，将骨骺剪碎至成黏状，与前述骨髓液混合，放置于滤网上，冲洗3～4次获得细胞悬液，离心，收集沉淀，加红细胞裂解液，静置，离心，洗涤，得骨髓单个核细胞；
(2)imDC细胞培养：将步骤(1)所得骨髓单个核细胞，采用培养基1重悬，接种培养，离心，采用添加了生长因子的培养基2培养，连续培养7天，获得imDC细胞；
所述培养基1是添加了FCS和青/链霉素的RPMI 1640培养基，其中，FCS的添加量为培养基的10％，青霉素的终浓度是100U/ml，链霉素的终浓度是100ug/ml；
所述培养基2是添加了FCS、IL-4、GM-CSF和青/链霉素的RPMI 1640培养基，其中，FCS的添加量为培养基的10％，IL-4的终浓度为5ng/ml，GM-CSF的终浓度是10ng/ml，青霉素的终浓度是100U/ml，链霉素的终浓度是100ug/ml；
(3)mDC细胞培养：向imDC细胞加入含有促成熟因子的细胞培养基3继续诱导培养2天，获得mDC细胞，即可。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述滤网是70um滤网。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述离心是300g离心10min。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，冲洗或者洗涤采用培养基，所述培养基是添加了青/链霉素的RPMI 1640培养基，其中，青霉素的终浓度是100U/ml，链霉素的终浓度是100ug/ml。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述红细胞裂解液按照如下方法制备：称取8.29g NH4Cl、1g KHCO3、37.2mg EDTA.Na2.2H2O溶于1L水中，过滤除菌，即可。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述骨髓单个核细胞接种浓度是0.5-1x106个/ml。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，采用培养基1培养的时间为3h。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，采用培养基2培养时，隔天半量换液。
9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(3)中，所述促成熟因子是TNF-α；所述促成熟因子的浓度是20ng/ml。
10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(3)中，所述培养基3是添加了FCS、IL-4、GM-CSF、TNF-α和青/链霉素的RPMI 1640培养基，其中，FCS的添加量为培养基的10％，IL-4的终浓度为5ng/ml，GM-CSF的终浓度是10ng/ml，TNF-α的终浓度是20ng/ml，青霉素的终浓度是100U/ml，链霉素的终浓度是100ug/ml。
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