CN111088228B - 一种鸭树突状细胞分离与培养方法 - Google Patents

一种鸭树突状细胞分离与培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111088228B
CN111088228B CN201911379459.6A CN201911379459A CN111088228B CN 111088228 B CN111088228 B CN 111088228B CN 201911379459 A CN201911379459 A CN 201911379459A CN 111088228 B CN111088228 B CN 111088228B
Authority
CN
China
Prior art keywords
duck
peripheral blood
cells
culturing
dendritic cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911379459.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111088228A (zh
Inventor
温良海
陈瑞爱
李延鹏
张爱国
叶俊贤
杨小云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huanong Zhaoqing Biological Industry Technology Research Institute Co ltd
Original Assignee
Huanong Zhaoqing Biological Industry Technology Research Institute Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huanong Zhaoqing Biological Industry Technology Research Institute Co ltd filed Critical Huanong Zhaoqing Biological Industry Technology Research Institute Co ltd
Priority to CN201911379459.6A priority Critical patent/CN111088228B/zh
Publication of CN111088228A publication Critical patent/CN111088228A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111088228B publication Critical patent/CN111088228B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C12N2501/052—Lipopolysaccharides [LPS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉一种鸭树突状细胞分离与培养方法，取鸭外周血分离得到鸭外周血单核细胞，用RPMI‑1640培养基培养后，再用含有FBS、IL‑4、GM‑CSF、LPS、青霉素和链霉素的RPMI‑1640培养基培养得到鸭单核细胞来源的树突状细胞MoDCs，本发明鸭树突状细胞分离与培养方法可大量有效制备鸭树突状细胞，而且获得的鸭树突状细胞纯度高；操作过程简单明了，耗时短。

Description

一种鸭树突状细胞分离与培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭树突状细胞分离与培养方法。
背景技术
树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前所知的功能最强大的专职抗原递呈细胞，最初由Steinman等人在1973年从小鼠脾组织中分离发现，因其成熟时形成具有树突样或伪足样的突起而将其命名为树突状细胞。DCs具有吞噬递呈抗原、活化T细胞的功能，该类细胞主要有以下特点：
(1)该细胞呈不规则形态，最明显的是细胞向四周伸出长短粗细不一的“伪足”；
(2)该细胞表面高表达MHC分子；
(3)该细胞能强烈引起T细胞聚集和增强T细胞活化与分裂，并且这一过程依赖于该细胞表面的MHC分子(Steinman et al.,1980；Matta et al.,2010)。
DCs可以通过其表面丰富的MHCI和MHCII分子来识别相应的内源性抗原和外源性抗原，其上有各种模式识别受体，如TLRs受体。当DCs上TLRs信号通路激活后，通过分泌炎性因子和其他细胞因子诱导产生炎症反应(Kobayashi et al.,2002；Sepulveda et al.,2009；Shi et al.,2011；Cao et al.,2012)，并且加工提呈抗原给T细胞，同时细胞启动成熟程序，体积增大，伸出“伪足”，迁移至淋巴结或脾脏，激活适应性免疫，在介导机体免疫保护作用和获得性免疫应答方面发挥重要作用(Banchereau et al.,1998；Kim et al.,2004；Matta et al.,2010；Hu et al.,2016)。鉴于DCs在机体免疫系统的重要功能，DCs逐渐成为免疫学研究领域的热点之一，DCs细胞的体外培养技术越来越受到各国研究人员的重视。
目前对哺乳动物DCs进行分离培养的技术已较为成熟，但禽类DCs研究起步较晚，直到2006年，Imre等才从鸡的皮肤黏膜下活体分离并鉴定了鸡DCs(Imre et al.,2006)。近几年，鸡DCs被用于研究禽流感病毒引起的免疫应答、禽类免疫应答的激活、受体与抗原递呈等机制方面的研究(Liang et al.,2013；Rothwell et al.,2012；Vervelde et al.,2013)，而鸭作为禽流感病毒的天然储存库，几乎所有亚型的流感病毒都可以在鸭体内分离到，因此分离培养鸭DCs，用于禽流感病毒引起的免疫应答、受体与抗原递呈等机制方面的研究显得意义重大，但迄今为止，尚未见到鸭DCs分离培养的方法。
所以，本发明要解决的技术问题是：如何有效分离并培养鸭树突状细胞。
发明内容
因此本发明目的在于提供一种鸭树突状细胞分离与培养方法，取鸭外周血分离得到鸭外周血单核细胞，用RPMI-1640培养基培养后，再用含有FBS、IL-4、GM-CSF、LPS、青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基培养得到鸭单核细胞来源的树突状细胞MoDCs，本发明鸭树突状细胞分离与培养方法可大量有效制备鸭树突状细胞，而且获得的鸭树突状细胞纯度高；操作过程简单明了，耗时短。
本发明的技术方案为：
一种鸭树突状细胞分离与培养方法，包括以下步骤：
(1)取鸭外周血并稀释，然后加入到鸭外周血单核细胞分离液中，离心后清洗，得到鸭外周血单核细胞；
(2)用RPMI-1640培养基重悬步骤(1)中的鸭外周血单核细胞，接种于细胞培养板中培养，使细胞贴壁；
(3)弃去步骤(2)中未贴壁细胞，加入含有FBS、IL-4、GM-CSF、LPS、青霉素和链霉素的改良RPMI-1640培养基，继续培养并诱导分化；
(4)第三天和第六天分别用步骤(3)中的改良RPMI-1640培养基半定量换液，第七天得到鸭单核细胞来源的树突状细胞。
进一步地，步骤(1)中取鸭外周血并稀释的具体方法为：翅静脉无菌采集健康鸭的外周血，与抗凝剂充分混匀后得到抗凝血，将抗凝血混匀后用稀释液稀释一倍。
进一步地，步骤(1)中离心的具体方法为：先加入鸭外周血单核细胞分离液至离心管中，然后加入等体积稀释后的鸭外周血，所述鸭稀释后的鸭外周血加入量为400～500g，离心20～30min，然后吸取第二层环状乳白色单核细胞层到另一离心管中。
进一步地，步骤(1)中清洗的具体方法为：在装有环状乳白色单核细胞层的离心管中加入10mL清洗液，混匀细胞，离心10min，弃上清，重复此步骤两次。
进一步地，步骤(2)中的接种密度为1×107/mL。
进一步地，步骤(2)中培养条件为：细胞培养箱中，37℃，5％vt.CO2培养4h。
进一步地，步骤(3)中所述改良RPMI-1640培养基中FBS质量浓度为10％，IL-4浓度为20ng/mL，GM-CSF浓度为40ng/mL，LPS浓度为20ng/mL，青霉素和链霉素浓度均为100ug/mL。
进一步地，步骤(3)中培养条件为：细胞培养箱中，37℃，5％vt.CO2培养。
本发明的有益效果如下：
1、本发明鸭树突状细胞分离与培养方法可大量有效制备鸭树突状细胞，而且获得的鸭树突状细胞纯度高；操作过程简单明了，耗时短。
2、在哺乳动物中，分离树突状细胞的技术已较为成熟，在添加生长因子(GM-CSF和IL-2)条件下，DC前体细胞在7d时大部成熟，具有显著的树突状细胞特征；然而添加的这些生长因子为鼠源生长因子，属于哺乳动物源生长因子，现有的研究表明，在分离鸡树突状细胞时添加鼠源生长因子效果难以达到分离要求，诱导的树突状细胞状态较差，活率很低，无法取得良好的分离培养效果，本发明采用禽源生长因子进行树突状细胞的诱导分化，效率高，得到的鸭树突状细胞形态典型，活率高，纯度高，可进行大量有效制备。
3、现有技术显示，在分离鸡源树突状细胞时，需要加入鸡血清和鸡胚尿囊液才能取得较好的分离培养效果，但这些成分的加入容易引入外源病毒及污染风险，操作繁琐，本发明分离鸭源树突状细胞未加入这些成分，而是加入了LPS进行诱导，不仅无外源病毒引入风险，降低了下被污染的概率，且操作流程更加简单，细胞的分化增殖效果更好，活率更高。
附图说明
附图1为实施例1中鸭单核细胞来源的树突状细胞不同阶段的显微镜观察图，其中(A)为鸭单核细胞来源的树突状细胞分离的观察图；(B)为鸭单核细胞来源的树突状细胞集落形成的观察图；(C)为鸭单核细胞来源的树突状细胞成熟并出现“伪足结构”的观察图；(D)为诱导成熟的鸭单核细胞来源的树突状细胞的典型结构的观察图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
一种鸭树突状细胞分离与培养方法，包括以下步骤：
(1)按照鸭外周血淋巴细胞分离试剂盒的操作方法，用TBDTM实验动物一次性使用负压采血管(含有TBDTM细胞分离专用抗凝剂)，翅静脉无菌采集健康鸭的外周血，与抗凝剂充分混匀后得到抗凝血，将抗凝血混匀后用稀释液稀释一倍；先加入鸭外周血单核细胞分离液KIT至15mL离心管中，然后加入等体积上述稀释后的鸭外周血，所述鸭稀释后的鸭外周血采用离心力400～500g，离心20～30min，然后吸取第二层环状乳白色单核细胞层到另一离心管中；加入10mL清洗液，混匀细胞，离心10min，弃上清，重复此步骤两次，得到鸭外周血单核细胞；
(2)用RPMI-1640培养基重悬步骤(1)中的鸭外周血单核细胞，按照细胞密度为1×107/mL接种于六孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养4h，使细胞贴壁；
(3)弃去步骤(2)中未贴壁细胞，每个孔中加入1.5mL含有质量浓度为10％的FBS、20ng/mL的IL-4、40ng/mL的GM-CSF、20ng/mL的LPS、100ug/mL青霉素和100ug/mL链霉素的改良RPMI-1640培养基，置于细胞培养箱中37℃，5％CO2诱导分化；37℃，5％CO2是指培养环境中的气体含有5％体积分数的二氧化碳。
(4)第三天和第六天分别用步骤(3)中的改良RPMI-1640培养基半定量换液，第七天得到鸭单核细胞来源的树突状细胞MoDCs。
将培养得到的上述鸭单核细胞来源的树突状细胞收获，取适量细胞与抗CD11c的抗体孵育，室温染色30min，洗涤2遍进行流式检测，计算阳性细胞比率。
采用该方法能够准确的筛选出分化的鸭树突状细胞，排除其他杂细胞，获得的鸭树突状细胞纯度高，本方法制备的DCs的阳性率在85％～90％，高于现有方法的70％～80％，具有明显优势。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鸭树突状细胞分离与培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 取鸭外周血并稀释，然后加入到鸭外周血单核细胞分离液中，离心后清洗，得到鸭外周血单核细胞；
(2) 用RPMI-1640培养基重悬步骤(1)中的鸭外周血单核细胞，接种于细胞培养板中培养，使细胞贴壁；
(3)弃去步骤(2)中未贴壁细胞，加入含有FBS、IL-4、GM-CSF、LPS、青霉素和链霉素的改良RPMI-1640培养基，继续培养并诱导分化；
(4) 第三天和第六天分别用步骤(3)中的改良RPMI-1640培养基半定量换液，第七天得到鸭单核细胞来源的树突状细胞；步骤(3)中所述改良RPMI-1640培养基中FBS质量浓度为10％ ，IL-4浓度为20ng/mL ，GM-CSF浓度为 40ng/mL，LPS浓度为20ng/mL，青霉素和链霉素浓度均为100ug/mL。
2.根据权利要求1所述的一种鸭树突状细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤(1) 中取鸭外周血并稀释的具体方法为：翅静脉无菌采集健康鸭的外周血，与抗凝剂充分混匀后得到抗凝血，将抗凝血混匀后用稀释液稀释一倍。
3.根据权利要求1所述的一种鸭树突状细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤(1) 中离心的具体方法为：先加入鸭外周血单核细胞分离液至离心管中，然后加入等体积稀释后的鸭外周血，所述鸭稀释后的鸭外周血采用离心力400～500g，离心20～30min，然后吸取第二层环状乳白色单核细胞层到另一离心管中。
4.根据权利要求1所述的一种鸭树突状细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤(1)中清洗的具体方法为：在装有环状乳白色单核细胞层的离心管中加入10mL清洗液，混匀细胞，离心10min，弃上清，重复此步骤两次。
5.根据权利要求1所述的一种鸭树突状细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤(2) 中的接种密度为1×107/mL。
6.根据权利要求1所述的一种鸭树突状细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤(2) 中培养条件为：细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养4h。
7.根据权利要求1所述的一种鸭树突状细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤(3)中培养条件为：细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养。
CN201911379459.6A 2019-12-27 2019-12-27 一种鸭树突状细胞分离与培养方法 Active CN111088228B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911379459.6A CN111088228B (zh) 2019-12-27 2019-12-27 一种鸭树突状细胞分离与培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911379459.6A CN111088228B (zh) 2019-12-27 2019-12-27 一种鸭树突状细胞分离与培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111088228A CN111088228A (zh) 2020-05-01
CN111088228B true CN111088228B (zh) 2021-02-23

Family

ID=70397446

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911379459.6A Active CN111088228B (zh) 2019-12-27 2019-12-27 一种鸭树突状细胞分离与培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111088228B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109294989B (zh) * 2018-09-18 2021-11-09 华中农业大学 一种草鱼树突状细胞分离与原代培养的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101066990A (zh) * 2007-04-27 2007-11-07 郑州大学 具有人群广谱性的抗肿瘤ctl表位肽
CN107129970A (zh) * 2017-06-27 2017-09-05 四川大学华西医院 一种树突状细胞的分离提取方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001051617A1 (en) * 2000-01-11 2001-07-19 Maxygen, Inc. Monocyte-derived dendritic cell subsets

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101066990A (zh) * 2007-04-27 2007-11-07 郑州大学 具有人群广谱性的抗肿瘤ctl表位肽
CN107129970A (zh) * 2017-06-27 2017-09-05 四川大学华西医院 一种树突状细胞的分离提取方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111088228A (zh) 2020-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112626018B (zh) 一种高纯度的同种异体nk细胞培养基以及体外扩增方法
CN103599528B (zh) 人树突状细胞疫苗的制备方法
CN113832104B (zh) 一种从hiPS分化巨噬细胞的方法
CN111088228B (zh) 一种鸭树突状细胞分离与培养方法
CN101514333B (zh) 一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用培养基
CN116376828B (zh) 一种诱导CD4+T细胞生成Treg细胞的方法及应用
CN105112371A (zh) 脐带血单个核细胞来源的dc-cik细胞制取方法及制剂
CN108251369B (zh) 一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途
CN112680415A (zh) 一种nk培养基及其扩增培养方法
CN109679902A (zh) 一种基于cik免疫细胞的体外诱导扩增方法
CN115044552A (zh) 一种自然杀伤细胞的体外培养方法及试剂盒
CN110607276A (zh) 高效扩增脐带血nk细胞的无血清培养方法
CN105543171A (zh) 调节性t细胞的扩增方法
CN112251407A (zh) 一种脐带血cik细胞的扩增培养方法
CN114149970B (zh) 一种外周血造血干细胞来源致敏树突状细胞的制备方法及应用
CN104232579A (zh) 一种恒河猴外周血单核巨噬细胞的培养方法及其应用
CN108034634B (zh) 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法
CN109486752B (zh) 一种秦川肉牛肌内脂肪细胞分离的方法
CN106701680A (zh) 一种促进树突状细胞成熟的组合因子及培养树突状细胞的方法
CN107641614B (zh) 微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途
WO2021056921A1 (zh) 一种细胞共培养的装置及牛肌细胞与脂肪细胞的共培养方法
CN114480279A (zh) 一种高效的人类血液免疫细胞cd4t分离培养技术
CN109439614B (zh) 一种维持和恢复毛乳头细胞干性的外泌体制剂
CN111500537A (zh) 一种脂肪酸促进树突状细胞成熟及增强其功能方法及应用
CN112725273A (zh) 一种nk细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wen Lianghai

Inventor after: Chen Ruiai

Inventor after: Zhang Aiguo

Inventor after: Li Yanpeng

Inventor after: Ye Junxian

Inventor after: Yang Xiaoyun

Inventor before: Wen Lianghai

Inventor before: Chen Ruiai

Inventor before: Li Yanpeng

Inventor before: Zhang Aiguo

Inventor before: Ye Junxian

Inventor before: Yang Xiaoyun

CB03 Change of inventor or designer information