CN108707580A - 一种肿瘤浸润淋巴细胞til的体外扩增方法 - Google Patents
一种肿瘤浸润淋巴细胞til的体外扩增方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108707580A CN108707580A CN201810639632.0A CN201810639632A CN108707580A CN 108707580 A CN108707580 A CN 108707580A CN 201810639632 A CN201810639632 A CN 201810639632A CN 108707580 A CN108707580 A CN 108707580A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- til
- terpinum
- pbs
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- LKMDGOAASAFWHT-IINYFYTJSA-N CC(C)[C@H](CC1)C(C[C@@](C)(CC2)O)=C2C1=O Chemical compound CC(C)[C@H](CC1)C(C[C@@](C)(CC2)O)=C2C1=O LKMDGOAASAFWHT-IINYFYTJSA-N 0.000 description 1
- KAIIHLMDZDKJOC-UHFFFAOYSA-N CC(C)c1c(C=C(C)C(C2=O)=O)c2c(C)cc1O Chemical compound CC(C)c1c(C=C(C)C(C2=O)=O)c2c(C)cc1O KAIIHLMDZDKJOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKJLRCCCUUCZLY-LLVKDONJSA-N C[C@@](CC1)(CC(CCC2)=C1C2=O)O Chemical compound C[C@@](CC1)(CC(CCC2)=C1C2=O)O NKJLRCCCUUCZLY-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- WSRLWSPFIOAYST-UHFFFAOYSA-N Cc(ccc(C(C)=CO1)c2C1=C(C)C1=O)c2C1=O Chemical compound Cc(ccc(C(C)=CO1)c2C1=C(C)C1=O)c2C1=O WSRLWSPFIOAYST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法,步骤为:步骤S1、TIL细胞分离:取癌旁组织剪碎浸入胶原酶溶液消化,过滤,PBS冲洗,收集滤液,离心,弃上清,加入PBS制成细胞悬液,用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心,离心结束后收取下层界面的淋巴细胞,经PBS清洗后,按1×106/mL的浓度悬浮于含10%人AB型血清和IL‑2的培养基内培养,每3~5d换液一次;步骤S2、培养和扩增:当孔里的淋巴细胞生长至1×107时,将其转入含抗CD3单抗、抗CD28单抗和药物的培养瓶内孵育,24h后加入IL‑2连续培养,每隔2~3d半量更换含同等浓度IL‑2的新鲜培养基培养22~25d。
Description
技术领域
本发明属于生物领域,涉及一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法。
背景技术
免疫治疗是新兴的一种肿瘤治疗方式,已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式,在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。2010年,美国FDA批准世界上第一个细胞免疫治疗产品Provenge上市,充分显示出细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的价值。
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)是存在于肿瘤间质内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体,大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌巢。其主要成分是存在于肿瘤间质内的T淋巴细胞,小部分为MHC非限制性的NK细胞,其共同特征为表达T细胞受体(T cell receptor,TCR)。TIL来自肿瘤组织区域,可特异识别自体肿瘤,具有特异的MHC限制性溶解肿瘤活性。美国NCI的Rosenberg等首次证实,从实体瘤组织分离的TIL在体外经IL-2激活并大量扩增后,可用于晚期黑色素瘤患者的治疗,其治疗效果远远高于之前发展的LAK(lymphokine activatedkiller cells)细胞治疗技术(文献:Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapytrials.J Immunol Methods 1987)。近年发表的多篇临床试验报道显示,TIL细胞免疫治疗可治愈20%~40%晚期黑色素瘤,充分显示出TIL作为细胞免疫治疗手段在肿瘤治疗中的潜力(文献:Anew approach to the adoptive immunotherapy ofcancer withtumor-infiltrating lymphocytes.Science 1986)。
但是,目前体外扩增TIL的方法存在两点不足:
第一,扩增效率不高,限制了肿瘤患者TIL的大量回输使用;
第二,对肿瘤细胞的杀伤力还有待提高,回输肿瘤患者体内后对肿瘤的杀伤力不足。
发明内容
本发明旨在克服现有技术不足,提供一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法,一方面提高TIL细胞的扩增效率,另一方面提高其对肿瘤细胞的杀伤力。
本发明技术方案如下:
一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法,正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的培养基孵育24h。
优选地,具体步骤为:
步骤S1、TIL细胞分离
取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中,剔除周围的血块、脂肪及坏死组织,PBS清洗一遍,剪成1mm3大小,浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中,37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤,用PBS冲洗组织块,收集滤液。细胞滤液在常温下离心,1500r/min×5min。弃上清,加入PBS制成细胞悬液后,用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞,经PBS清洗后,按1×106/mL的浓度悬浮于含10%人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内,接种于12孔板上,3mL/孔,置于37℃、5%CO2培养箱内培养,每3~5d换液一次。
步骤S2、培养和扩增
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时,将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的培养瓶内孵育,孵育24h后加入IL-2,置于37℃、5%CO2培养箱内连续培养,培养过程中每隔2~3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基,培养22~25d后收获体外扩增的TIL。
优选地,步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。
优选地,抗CD3单抗浓度为20ng/mL。
优选地,抗CD28单抗浓度为20ng/mL。
优选地,呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的浓度为20μg/mL。
优选地,步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。
一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基,通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B配制而成。
优选地,还含有20ng/mL的抗CD3单抗。
优选地,还含有20ng/mL的抗CD28单抗。
一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法,正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培养基孵育24h。
优选地,具体步骤为:
步骤S1、TIL细胞分离
取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中,剔除周围的血块、脂肪及坏死组织,PBS清洗一遍,剪成1mm3大小,浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中,37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤,用PBS冲洗组织块,收集滤液。细胞滤液在常温下离心,1500r/min×5min。弃上清,加入PBS制成细胞悬液后,用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞,经PBS清洗后,按1×106/mL的浓度悬浮于含10%人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内,接种于12孔板上,3mL/孔,置于37℃、5%CO2培养箱内培养,每3~5d换液一次。
步骤S2、培养和扩增
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时,将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培养瓶内孵育,孵育24h后加入IL-2,置于37℃、5%CO2培养箱内连续培养,培养过程中每隔2~3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基,培养22~25d后收获体外扩增的TIL。
优选地,步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。
优选地,抗CD3单抗浓度为20ng/mL。
优选地,抗CD28单抗浓度为20ng/mL。
优选地,益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的浓度为20μg/mL。
优选地,步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。
一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基,通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B配制而成。
优选地,还含有20ng/mL的抗CD3单抗。
优选地,还含有20ng/mL的抗CD28单抗。
一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法,正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养基孵育24h。
优选地,具体步骤为:
步骤S1、TIL细胞分离
取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中,剔除周围的血块、脂肪及坏死组织,PBS清洗一遍,剪成1mm3大小,浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中,37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤,用PBS冲洗组织块,收集滤液。细胞滤液在常温下离心,1500r/min×5min。弃上清,加入PBS制成细胞悬液后,用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞,经PBS清洗后,按1×106/mL的浓度悬浮于含10%人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内,接种于12孔板上,3mL/孔,置于37℃、5%CO2培养箱内培养,每3~5d换液一次。
步骤S2、培养和扩增
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时,将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养瓶内孵育,孵育24h后加入IL-2,置于37℃、5%CO2培养箱内连续培养,培养过程中每隔2~3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基,培养22~25d后收获体外扩增的TIL。
优选地,步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。
优选地,抗CD3单抗浓度为20ng/mL。
优选地,抗CD28单抗浓度为20ng/mL。
优选地,曼宋酮C或曼宋酮G的浓度为20μg/mL。
优选地,步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。
一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基,通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的曼宋酮C或曼宋酮G配制而成。
优选地,还含有20ng/mL的抗CD3单抗。
优选地,还含有20ng/mL的抗CD28单抗。
有益效果:
本发明提供的方法通过在培养基中添加少量呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G,不仅可以显著促进TIL细胞的体外增殖,还可以显著提高TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤力。呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G可以用于制备TIL细胞培养液。
附图说明
图1为呋喃天竺葵酮类化合物孵育的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤力;
图2为益智仁萜二醇类化合物孵育的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤力;
图3为曼宋酮类化合物孵育的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤力。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容,但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1:
一、实验材料
X-VIVO-15培养基购自Lonza公司;磷酸缓冲液(PBS)、RPMI 1640培养基、CD3单抗、CD28单抗购自Gibco公司;人AB型血清由淮安市血液中心提供;IL-2购自北京四环生物制药公司;胶原酶IV型购自Sigma公司;淋巴细胞分离液购自天津美德太平洋公司。
人肝癌细胞株HepG2为本公司冻存,复苏后采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基置于37℃、5%CO2培养箱内传代培养。
呋喃天竺葵酮A(CAS号:1143-45-9)、呋喃天竺葵酮B(CAS号:1143-46-0)、益智仁萜二醇A(CAS号:363610-30-4)、益智仁萜二醇B(CAS号:363610-32-6)、曼宋酮C(CAS号:5574-34-5)、曼宋酮F(CAS号:5090-88-0)、曼宋酮G(CAS号:7715-96-0)纯度不低于98%,化学结构式如下。
二、实验方法
1、TIL细胞的分离
取肝癌患者手术切除的新鲜肝癌癌旁组织浸泡于PBS中,剔除周围的血块、脂肪及坏死组织,PBS清洗一遍,剪成1mm3大小,浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶(Sigma-Aldrich)溶液中,37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤,用PBS冲洗组织块,收集滤液。细胞滤液在常温下离心,1500r/min×5min。弃上清,加入PBS制成细胞悬液后,用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞,经PBS清洗后,按1×106/mL的浓度悬浮于含10%人AB型血清和IL-2(2000IU/mL)的X-VIVO-15培养基内,接种于12孔板上,3mL/孔,置于37℃、5%CO2培养箱内培养,每3~5d换液一次。
2、实验分组
组别包括:呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C、曼宋酮F或曼宋酮G孵育组;不添加这些药物的对照组。
3、TIL细胞的培养和扩增方法
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时,将其转入含有20ng/mL的抗CD3单抗、20ng/mL的抗CD28单抗和20μg/mL的呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C、曼宋酮F或曼宋酮G的培养瓶内孵育,孵育24h后加入4000IU/mL的IL-2,置于37℃、5%CO2培养箱内连续培养,培养过程中每隔2~3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基,培养22~25d后收获体外扩增的TIL并对各组TIL细胞进行计数。
4、对肿瘤细胞杀伤力检测
人肝癌细胞株HepG2为本公司冻存,复苏后采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基置于37℃、5%CO2培养箱内传代培养,取对数期进行后续实验。
取各组培养23d的TIL细胞作为效应细胞,以HepG2肝癌细胞为靶细胞,按20:1效靶比分别把效应细胞和靶细胞加入96孔板,另设单独靶细胞和单独效应细胞组,每组设3个复孔,放置37℃、5%CO2孵箱中培养24h后,每孔加MTT(5mg/mL)10μL,继续培养4h,离心弃上清,每孔加二甲基亚砜150μL,振荡溶解10min后,用酶标仪570nm测吸光值A,按如下公式计算各组TIL细胞对肝癌细胞的杀伤活性。
杀伤率(%)=[1-(实验组A值-单独效应细胞A值)/单独靶细胞A值]×100%
5、统计学处理
数据采用均值±标准偏差表示,用SPSS17.0统计软件行t检验,P<0.05具有统计学意义。
三、实验结果
1、各组TIL细胞的体外扩增
结果如表1所示。培养23d时,呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G孵育组的TIL细胞总数显著高于对照组(P<0.05),曼宋酮F孵育组的TIL细胞总数与对照组的差异不明显(P>0.05)。
表1各组TIL细胞总数
可见,呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G可以显著促进TIL细胞的体外增殖。
2、各组TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
培养23d时,呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G孵育组的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤活性显著优于对照组(P<0.05),曼宋酮F孵育组的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤活性与对照组的差异不明显(P>0.05)。
结果如表2和图1-3所示。
表2各组TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
可见,呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G可以显著提高TIL细胞对肝癌细胞的杀伤力。
实施例2:
一种TIL细胞培养基,通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G配制而成。在用于培养TIL细胞时,仅需要再添加适量抗CD3单抗和抗CD28单抗即可,使用便捷。
本发明提供的方法通过在培养基中添加少量呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G,不仅可以显著促进TIL细胞的体外增殖,还可以显著提高TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤力。呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G可以用于制备TIL细胞培养液。
上述实施例旨在具体介绍本发明实质性内容,但本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (10)
1.一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法,其特征在于:正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培养基孵育24h。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,具体步骤为:
步骤S1、TIL细胞分离
取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中,剔除周围的血块、脂肪及坏死组织,PBS清洗一遍,剪成1mm3大小,浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中,37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤,用PBS冲洗组织块,收集滤液。细胞滤液在常温下离心,1500r/min×5min。弃上清,加入PBS制成细胞悬液后,用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞,经PBS清洗后,按1×106/mL的浓度悬浮于含10%人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内,接种于12孔板上,3mL/孔,置于37℃、5%CO2培养箱内培养,每3~5d换液一次。
步骤S2、培养和扩增
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时,将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培养瓶内孵育,孵育24h后加入IL-2,置于37℃、5%CO2培养箱内连续培养,培养过程中每隔2~3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基,培养22~25d后收获体外扩增的TIL。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:抗CD3单抗浓度为20ng/mL。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:抗CD28单抗浓度为20ng/mL。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的浓度为20μg/mL。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。
8.一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基,其特征在于:通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B配制而成。
9.根据权利要求8所述的培养基,其特征在于:还含有20ng/mL的抗CD3单抗。
10.根据权利要求8所述的培养基,其特征在于:还含有20ng/mL的抗CD28单抗。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810639632.0A CN108707580A (zh) | 2018-06-20 | 2018-06-20 | 一种肿瘤浸润淋巴细胞til的体外扩增方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810639632.0A CN108707580A (zh) | 2018-06-20 | 2018-06-20 | 一种肿瘤浸润淋巴细胞til的体外扩增方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108707580A true CN108707580A (zh) | 2018-10-26 |
Family
ID=63871834
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810639632.0A Withdrawn CN108707580A (zh) | 2018-06-20 | 2018-06-20 | 一种肿瘤浸润淋巴细胞til的体外扩增方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108707580A (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103374548A (zh) * | 2012-04-27 | 2013-10-30 | 上海诺昊亚医学诊断技术有限公司 | 一种肿瘤浸润淋巴细胞的高效扩增培养液 |
CN106754703A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 浙江丹晖生物科技有限公司 | 一种til细胞体外扩增培养基组合和培养方法 |
CN107384867A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-24 | 北京世纪劲得生物技术有限公司 | 一种肿瘤组织til细胞制备方法及专用培养基 |
-
2018
- 2018-06-20 CN CN201810639632.0A patent/CN108707580A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103374548A (zh) * | 2012-04-27 | 2013-10-30 | 上海诺昊亚医学诊断技术有限公司 | 一种肿瘤浸润淋巴细胞的高效扩增培养液 |
CN106754703A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 浙江丹晖生物科技有限公司 | 一种til细胞体外扩增培养基组合和培养方法 |
CN107384867A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-24 | 北京世纪劲得生物技术有限公司 | 一种肿瘤组织til细胞制备方法及专用培养基 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
PING CHEN,ET AL.: "Sesquiterpenoids from the Fruits of Alpinia oxyphylla and Their Anti-Acetylcholinesterase Activity", 《HELVETICA CHIMICA ACTA》 * |
侯蕾,等: "中药益智的化学成分研究", 《天然产物研究与开发》 * |
江珊珊,等: "肝癌肿瘤浸润淋巴细胞TIL体外扩增及特性研究", 《中国细胞生物学学报》 * |
皇甫超申,等: "苦参碱对肝癌患者肿瘤浸润淋巴细胞的影响", 《第四军医大学学报》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108753718A (zh) | 肿瘤浸润淋巴细胞til的体外扩增方法 | |
CN103756963B (zh) | 一种体外扩增nk细胞的方法 | |
Sutlu et al. | Clinical-grade, large-scale, feeder-free expansion of highly active human natural killer cells for adoptive immunotherapy using an automated bioreactor | |
CN107083360B (zh) | 一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性t细胞的方法 | |
Niam et al. | Clinical scale expansion of cytokine-induced killer cells is feasible from healthy donors and patients with acute and chronic myeloid leukemia at various stages of therapy | |
CN106754730A (zh) | 一种高效扩增nk细胞的方法 | |
CN107254439A (zh) | 增强自然杀伤细胞增殖和活性的方法 | |
CN106222201A (zh) | 一种制备car‑t细胞的方法以及制得的car‑t细胞及其应用 | |
Mu et al. | A simple method for in vitro preparation of natural killer cells from cord blood | |
Berg et al. | Ex-vivo expansion of NK cells: What is the priority-high yield or high purity? | |
CN107502590A (zh) | 一种人类脐带血造血干细胞高效扩增nk细胞的方法 | |
US10125351B2 (en) | Industrial preparations of natural killer (NK) cells and injections containing NK cells | |
CN104894072B (zh) | 一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用 | |
CN110042080A (zh) | 原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的分离、培养及体外扩增方法 | |
CN110484504B (zh) | 一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群及其制备方法 | |
Ghaffari et al. | Impact of various culture conditions on ex vivo expansion of polyclonal T cells for adoptive immunotherapy | |
CN105176926A (zh) | 一种体外培养扩增nk细胞的方法 | |
CN108753717A (zh) | 一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞til的方法 | |
US20210147803A1 (en) | Method for producing natural killer cells | |
CN109486758A (zh) | 一种外周血nk细胞体外高效扩增试剂及操作说明 | |
CN108823171A (zh) | 一种基因工程细胞及体外高效扩增nk细胞的方法 | |
CN108707580A (zh) | 一种肿瘤浸润淋巴细胞til的体外扩增方法 | |
CN106795493A (zh) | 使用双膦酸盐、抗cd3抗体和il‑2扩增t细胞群体 | |
CN105969731B (zh) | 一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性til细胞的方法 | |
CN101735979A (zh) | 体外扩增造血干细胞和前体细胞的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20181026 |
|
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |