CN107384867A - 一种肿瘤组织til细胞制备方法及专用培养基 - Google Patents

一种肿瘤组织til细胞制备方法及专用培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤组织TIL细胞制备方法及专用培养基，所述方法包括：瘤旁组织获取、细胞消化、细胞原代培养、细胞传代培养和细胞收集步骤，其中，原代培养基为以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20‑45ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1‑5mg/ml的核黄素、70‑90ng/ml的皮质醇、10‑25mg/ml的一水磷酸二氢钠、47‑62ng/ml的重组人白血病抑制因子(LIF)、500‑800U/ml的IL‑2；传代培养基为以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20‑40mmol/L的HEPES、1000‑2000U/ml的IL‑2、0.03‑0.07mmol/L的β‑巯基乙醇、5‑15ng/ml磷酸钠。对现有培养基进行了改良，采用不同的培养基对TIL细胞进行针对性培养，提高TIL细胞的扩增能力，同时减少培养周期，降低培养复杂程度，减少了IL‑2的使用量，从而降低毒性反应。

Description

一种肿瘤组织TIL细胞制备方法及专用培养基
技术领域
本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种肿瘤组织TIL细胞制备方法及专用培养基。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是从肿瘤组织中或肿瘤患者胸腹水分离出来的淋巴细胞，这种细胞在体外经白细胞介素Ⅱ(IL-2)刺激后可大量增殖，这种刺激后增殖的TIL细胞又称之为“肿瘤来源的激活细胞”。TIL治疗除适用于实体瘤患者外，同样适应于各类晚期胸、腹水的癌症患者,因其靶向性高、特异性强、毒性作用小、疗效显著等优势已成为一种有效的新型免疫治疗方法,为过继免疫治疗提供一条更为简便的途径，对晚期癌症患者提供了一种新的治疗手段。
上个世纪八十年代，Rosenberg教授首次分离肿瘤组织中的TIL细胞，并通过白细胞介素2的刺激来解除其免疫抑制状态，体外扩增后，用于回输治疗黑色素瘤患者，并取得了一定的效果。但是，由于使用传统方法，体外诱导TIL的效率太低，操作过程复杂，扩增时间长，且扩增数量有限，增殖倍率低；不同患者间培养出的细胞数存在很大的差异，很多患者的细胞经过培养在短期内无法达到临床治疗要求的细胞数；国内外常用的培养方法需要40～50天，且TIL细胞中CD3+CD8+T细胞的杀伤能力不高，因此往往达不到预期治疗效果，临床应用受到很大限制，真正能用于肿瘤患者临床治疗的可行方案并不多。
科研工作者不断探索培养TIL的新方法，比如在培养中期添加抗CD3单克隆抗体、使用炎性因子等。因此，尽早建立一种高效扩增TIL细胞的方法，已成为国内外学者研究工作的目标。
发明内容
本发明的特征在于在前人研究的基础上，提供了一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，可有效的对肿瘤组织TIL细胞进行体外培养和扩增。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)在无菌条件取得瘤旁组织，用氯化钠注射液进行冲洗,并剪除坏死及结缔组织；
2)将步骤1)所得的瘤旁组织切成1-2mm3碎块，加入0.1％I型胶原酶于4℃条件下过夜，次日再加入0.1mg/ml透明质酸酶I和10ul/ml DNA酶，于35-38℃消化3-5h，得到细胞悬液，然后将所述细胞悬液过滤，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；
3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为1-2×106个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，培养7-10天；
4)然后更换传代培养基，每隔2-5天更换传代培养基，继续培养11-15天，收集细胞，即得所述肿瘤组织TIL细胞。
结合肿瘤组织TIL细胞生长特性，通过大量试验总结出上述肿瘤组织TIL细胞的培养方法及条件，采用步骤2)的消化方法，可以减少对细胞的损伤，增加细胞得率，且获得的细胞纯度高，有利于继续的体外扩增培养。
进一步地，所述原代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-45ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1-5mg/ml的核黄素、70-90ng/ml的皮质醇、10-25mg/ml的一水磷酸二氢钠、47-62ng/ml的重组人白血病抑制因子(LIF)、500-800U/ml的IL-2。
进一步地，所述传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-40mmol/L的HEPES、1000-2000U/ml的IL-2、0.03-0.07mmol/L的β-巯基乙醇、5-15ng/ml磷酸钠。
本发明所提供的肿瘤组织TIL细胞培养基，对现有培养基进行了改良，采用不同的培养基对TIL细胞进行针对性培养，可以提高TIL细胞的扩增能力，大大提高扩增数量，同时减少培养周期，20周内即可完成TIL细胞的体外培养，降低培养复杂程度，采用上述细胞培养基培养肿瘤组织TIL细胞，减少了IL-2的使用量，降低对IL-2的依赖性，从而降低毒性反应，减少白细胞提取的次数。
更进一步地，所述原代培养基还包括18-26μg/ml的苯丙氨酸、300-500μg/ml的硫酸化糖胺聚糖(GAG)。
更进一步地，所述传代培养基还包括18-28μg/ml的硫酸软骨素蛋白聚糖(CS-PG)。
根据不同时期的TIL细胞特性，在原代培养基和传代培养基中加入上述成分，保持肿瘤组织TIL细胞的高活率，进一步激活TIL细胞的杀伤活性，促使TIL细胞加速活化和母细胞化的能力，合理控制肿瘤细胞等杂细胞的增殖，从而提高得到TIL细胞占有率，提高细胞质量，增强治疗效果。
更进一步地，所述步骤3)的培养方法具体为，培养第1天的所述原代培养基中加入浓度为1000U/ml的IFN-r和15ng/ml胰岛素，于培养第2天向培养基的所述原代培养基中加入浓度为100ng/ml的OKT3、1000U/ml的IL-2和21ng/ml的PDGF。
根据TIL细胞培养的不同时间点，在培养基中添加适宜的和适量的其他物质，另TIL细胞扩增倍数增加，大大提高TIL细胞的生长率。
更进一步地，在步骤3)和步骤4)的培养过程中，以48小时为单位，保证细胞浓度为1-3×106个/ml。
进一步地，所述细胞收集的具体方法为：轻轻摇晃培养瓶，将细胞悬液转移至离心管中，1500rpm的速度离心5min，弃上清，然后加入沉淀稀释液将细胞沉淀稀释，混匀，然后以升9降9的方式于1500rpm的速度进行离心，即可收集到所述肿瘤组织TIL细胞。
优选地，所述沉淀稀释液为包含浓度为：80-120mg/ml的D-葡萄糖和22-31mg/ml的青链霉素的0.9％氯化钠注射液。
本发明还提供一种用于培养肿瘤组织TIL细胞的专用培养基，其特征在于，所述培养基包括原代培养基和传代培养基，其中，所述原代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-45ng/ml的bFGF、1-5mg/ml的核黄素、70-90ng/ml的皮质醇、10-25mg/ml的一水磷酸二氢钠、47-62ng/ml的LIF、500-800U/ml的IL-2；所述传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-40mmol/L的HEPES、1000-2000U/ml的IL-2、0.03-0.07mmol/L的β-巯基乙醇、5-15ng/ml磷酸钠。
本发明所提供的肿瘤组织TIL细胞制备方法，方法简单，操作方便，大大缩短TIL细胞体外培养扩增周期；选取合适的消化液，得到纯度高、数量大的TIL单细胞，根据TIL的生长特异性，经过大量试验，得到了专用的培养基，可以提高TIL细胞扩增倍数，提
高TIL细胞杀伤活性，且降低对IL-2的依赖性，减少了IL-2的使
用量，从而降低毒性反应，减少白细胞提取的次数。
附图说明
图1.实施例3TIL细胞流式散点分析图；
图2.对照例16TIL细胞流式散点分析图。
其中，FITC为CD4+，PerCP为CD3+，PE为CD8+。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
实施例1
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，包括如下步骤：
1)在无菌条件取得瘤旁组织，用氯化钠注射液进行冲洗,并剪除坏死及结缔组织；
2)将步骤1)所得的瘤旁组织切成1mm3碎块，加入0.1％I型胶原酶于4℃条件下过夜，次日再加入0.1mg/ml透明质酸酶I和10ul/ml DNA酶，于35℃消化5h，得到细胞悬液，然后将所述细胞悬液过滤，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；
3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为1×106个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，培养10天；
4)然后更换传代培养基，根据细胞生长情况，每隔2-5天更换传代培养基，继续培养15天，收集细胞，即得所述肿瘤组织TIL细胞。
其中，原代培养基为以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、40ng/ml的bFGF、3mg/ml的核黄素、82ng/ml的皮质醇、18mg/ml的一水磷酸二氢钠、50ng/ml的LIF、650U/ml的IL-2。
传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、30mmol/L的HEPES、1470U/ml的IL-2、0.05mmol/L的β-巯基乙醇、10ng/ml磷酸钠。
实施例2
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，包括如下步骤：
1)在无菌条件取得瘤旁组织，用氯化钠注射液进行冲洗,并剪除坏死及结缔组织；
2)将步骤1)所得的瘤旁组织切成2mm3碎块，加入0.1％I型胶原酶于4℃条件下过夜，次日再加入0.1mg/ml透明质酸酶I和10ul/ml DNA酶，于38℃消化3h，得到细胞悬液，然后将所述细胞悬液过滤，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；
3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为2×106个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，并调整细胞浓度为1×106个/ml，培养第1天的所述原代培养基中加入浓度为1000U/ml的IFN-r和15ng/ml胰岛素，于培养第2天向培养基的所述原代培养基中加入浓度为100ng/ml的OKT3、1000U/ml的IL-2和21ng/ml的PDGF，培养8天；
4)然后将原代培养基更换为传代培养基，根据细胞生长情况，每隔2-5天更换传代培养基，并调整细胞浓度为3×106个/ml，继续培养11天，收集细胞，即得所述肿瘤组织TIL细胞。
其中，原代培养基为以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、40ng/ml的bFGF、3mg/ml的核黄素、82ng/ml的皮质醇、18mg/ml的一水磷酸二氢钠、50ng/ml的LIF、650U/ml的IL-2。
传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、30mmol/L的HEPES、1470U/ml的IL-2、0.05mmol/L的β-巯基乙醇、10ng/ml磷酸钠。
实施例3
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，与实施例1的区别在于，
1)在无菌条件取得瘤旁组织，用氯化钠注射液进行冲洗,并剪除坏死及结缔组织；
2)将步骤1)所得的瘤旁组织切成2mm3碎块，加入0.1％I型胶原酶于4℃条件下过夜，次日再加入0.1mg/ml透明质酸酶I和10ul/ml DNA酶，于36℃消化4h，得到细胞悬液，然后将所述细胞悬液过滤，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；
3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为2×106个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，并调整细胞浓度为2×106个/ml，培养第1天的所述原代培养基中加入浓度为1000U/ml的IFN-r和15ng/ml胰岛素，于培养第2天向培养基的所述原代培养基中加入浓度为100ng/ml的OKT3、1000U/ml的IL-2和21ng/ml的PDGF，培养9天；
4)然后将原代培养基更换为传代培养基，根据细胞生长情况，每隔2-5天更换传代培养基，并调整细胞浓度为1×106个/ml，继续培养13天；
5)轻轻摇晃培养瓶，将细胞悬液转移至离心管中，1500rpm的速度离心5min，弃上清，然后加入包含浓度为：80-120mg/ml的D-葡萄糖和22-31mg/ml的青链霉素的0.9％氯化钠注射液将细胞沉淀稀释，混匀，然后以升9降9的方式于1500rpm的速度进行离心，即可收集到所述肿瘤组织TIL细胞。
其中，原代培养基为以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、45ng/ml的bFGF、5mg/ml的核黄素、90ng/ml的皮质醇、25mg/ml的一水磷酸二氢钠、62ng/ml的LIF、800U/ml的IL-2、26μg/ml的苯丙氨酸、500μg/ml的硫酸化糖胺聚糖。
传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、40mmol/L的HEPES、2000U/ml的IL-2、0.07mmol/L的β-巯基乙醇、15ng/ml磷酸钠、18μg/ml的硫酸软骨素蛋白聚糖。
实施例4
一种肿瘤组织TIL细胞的培养方法，与实施例3的区别在于，其中，原代培养基为以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、45ng/ml的bFGF、5mg/ml的核黄素、90ng/ml的皮质醇、25mg/ml的一水磷酸二氢钠、62ng/ml的LIF、800U/ml的IL-2、26μg/ml的苯丙氨酸、500μg/ml的硫酸化糖胺聚糖。
传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、40mmol/L的HEPES、2000U/ml的IL-2、0.07mmol/L的β-巯基乙醇、15ng/ml磷酸钠、28μg/ml的硫酸软骨素蛋白聚糖。
实施例5
一种肿瘤组织TIL细胞的培养方法，与实施例3的区别在于，其中，原代培养基为以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20ng/ml的bFGF、1mg/ml的核黄素、70ng/ml的皮质醇、10mg/ml的一水磷酸二氢钠、47ng/ml的LIF、500U/ml的IL-2、18μg/ml的苯丙氨酸、300μg/ml的硫酸化糖胺聚糖。
传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20mmol/L的HEPES、1000U/ml的IL-2、0.03mmol/L的β-巯基乙醇、5ng/ml磷酸钠、18μg/ml的硫酸软骨素蛋白聚糖。
对照实施例1-8
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，与实施例1的区别在于，所述原代培养基与传代培养基的配方见表1，表中没有提及到的组分与实施例1相同，并且表中各成分的单位与实施例1中的单位相同。
表1对照实施例1-8中原代培养基和传代培养基中各组分含量
对照实施例9
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，与实施例2的区别在于：步骤3)的详细培养方法如下：向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为2×106个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，并调整细胞浓度为1×106个/ml，培养第1-4天的所述原代培养基中均加入浓度为1000U/ml的IFN-r、15ng/ml胰岛素、100ng/ml的OKT 3和21ng/ml的PDGF，培养8天。
对照实施例10
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，与实施例2的区别在于：步骤3)的详细培养方法如下：向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为2×106个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，并调整细胞浓度为1×106个/ml，培养第1天的所述原代培养基中均加入浓度为1000U/ml的IFN-r，于培养第2天向培养基的所述原代培养基中加入浓度为100ng/ml的OKT3、1000U/ml的IL-2和21ng/ml的PDGF，培养8天。
对照实施例11
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，与实施例2的区别在于：步骤3)的详细培养方法如下：向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为2×106个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，并调整细胞浓度为1×106个/ml，培养第1天的所述原代培养基中均加入浓度为1000U/ml的IFN-r，于培养第2和第4天向培养基的所述原代培养基中加入浓度为100ng/ml的OKT 3，培养8天。
对照实施例12
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，与实施例2的区别在于：步骤3)的详细培养方法如下：向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为2×106个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，并调整细胞浓度为1×106个/ml，培养第1-4天的所述原代培养基中均加入浓度为1000U/ml的IFN-r和100ng/ml的OKT 3，培养8天。
对照实施例13-16
一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，与实施例3的区别在于，表中没有提到的组分与实施例3相同，并且单位与实施例3相同，所述原代培养基与传代培养基的配方见表2。
表2对照实施例13-16中原代培养基和传代培养基中各组分含量
试验1：TIL细胞体外增殖情况
按照实施例1、实施例2和对照例1-12的肿瘤组织TIL细胞制备方法对肿瘤TIL细胞进行体外扩增培养，检测细胞数量，计算细胞的扩增倍数，结果见表3。
表3肿瘤组织TIL细胞体外培养扩增细胞数量
组别 扩增倍数 组别 扩增倍数 组别 扩增倍数
实施例1 1080 对照例4 369 对照例9 173
实施例2 1356 对照例5 142 对照例10 369
对照例1 347 对照例6 378 对照例11 498
对照例2 262 对照例7 289 对照例12 402
对照例3 281 对照例8 499
由上述试验结果可知，对照实施例1-8是在本发明所提供的培养基配方的基础上，对配方中的原料组分进行常规增加、删除、替换和组分浓度的改变进行探索，例如对照例1中删除组分bFGF、一水磷酸二氢钠和HEPES；对照例2中人源血清的含量下降到9％，核黄素的含量下降至0.9，LIF下降至46，并将磷酸钠替换为硫酸钠；对照例3核黄素升至6，一水磷酸二氢钠升至25，IL-2升至2100，并将人源血清替换为类似的新生儿脐血清；对照例5增加PHA、EGF和IFN-r，对照例6的原代培养基组分为人源血清和IL-2，对照例7将bFGF替换为EGF，传代培养基增加丙谷二肽，对照例8将核黄素替换为硫铵；对照例9-12在原代培养中向培养基中添加的辅助成分的添加时机和具体成分进行探索。
实施例1和实施例2的扩增倍数分别为1080和1356倍，远高于对照例1-12的173-498倍，相对于实施例1，实施例2的扩增倍数更高，在不同的培养时间段，向培养基中加入IFN-r、胰岛素、OKT 3和PDGF，可以进一步提高TIL细胞的扩增倍数，获得更多的细胞。
本发明所提供的肿瘤组织TIL细胞制备方法，在培养方法的细节上和培养基的选择上，并不是对现有的技术进行简单的常规替换和增加而得来的，对其中的影响因素进行微小的替换，均会导致细胞的培养效果大大降低，且影响因素众多，各个因素共同协同作用，互相配合形成本发明所提供的制备方法，任一单一因素的更替或改变均会对整个制备方法造成较大影响。本发明的肿瘤组织TIL细胞制备方法，通过简单的步骤，降低培养复杂程度，提高TIL细胞的扩增能力，大大提高扩增数量，同时减少培养周期，20周内即可完成TIL细胞的体外培养，采用上述细胞培养基培养肿瘤组织TIL细胞，降低对IL-2的依赖性，减少了IL-2的使用量，从而降低毒性反应，减少白细胞提取的次数，具有显著的进步。
试验2体外增殖收获后TIL细胞纯度和肿瘤细胞杀伤率情况
按照实施例1、实施例3和对照例13-16的肿瘤组织TIL细胞制备方法对肿瘤TIL细胞进行体外扩增培养，检测TIL细胞中CD3+、CD4+、CD8+和CD3+CD8+细胞的占有率，同时按照效靶比30:1，计算TIL细胞的杀伤率，结果见表4，实施例3与对照例16的细胞流式散点分析图见图1和图2。
表4肿瘤组织TIL细胞CD3+CD8+细胞数量百分比和杀伤率比较
在实施例3的基础上，对照例对添加成分进行考察，对照例13原代培养基仅添加苯丙氨酸；对照例14原代培养基仅添加GAG，传代培养基中添加的CS-PG量为30；对照例15原代培养基中添加组氨酸，传代培养基中添加透明质酸；对照例16原代培养基中添加苯丙氨酸的量为27：GAG的量为290：传代培养基中CS-PG量为17。
由上述试验结果可知，相对实施例1，实施例3在原代培养基中添加了苯丙氨酸和GAG，在传代培养基中添加了CS-PG，得到的细胞CD3+CD8+细胞数量百分比高达82.85％，大大提高TIL活性细胞的含量，提高治疗效果；而从对照例的试验结果可知，替换添加成分及含量，CD3+CD8+细胞数量百分比与实施例1相比更少，均没有有效提高TIL活性细胞含量的效果，因此，根据不同时期的TIL细胞特性，在原代培养基和传代培养基中加入优选的活性成分，在提高TIL高活性细胞含量的方面具有意想不到的技术效果。
结论
由上述试验可知，使用本发明所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法及其专用培养基，可以有效的体外培养肿瘤组织TIL细胞，而本发明所提供的肿瘤组织TIL细胞专用培养基对肿瘤组织TIL细胞的扩增培养非常高效，且同时得到的TIL细胞纯度高，治疗效果好。

Claims (10)

1.一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)在无菌条件取得瘤旁组织，用氯化钠注射液进行冲洗,并剪除坏死及结缔组织；
2)将步骤1)所得的瘤旁组织切成1-2mm3碎块，加入0.1％I型胶原酶于4℃条件下过夜，次日再加入0.1mg/ml透明质酸酶I和10ul/ml DNA酶，于35-38℃消化3-5h，得到细胞悬液，然后将所述细胞悬液过滤，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；
3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为1-2×106个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，培养7-10天；
4)然后更换传代培养基，每隔2-5天更换传代培养基，继续培养11-15天，收集细胞，即得所述肿瘤组织TIL细胞。
2.如权利要求1所述肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述原代培养基以RPMI1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-45ng/ml的bFGF、1-5mg/ml的核黄素、70-90ng/ml的皮质醇、10-25mg/ml的一水磷酸二氢钠、47-62ng/ml的LIF、500-800U/ml的IL-2。
3.如权利要求2所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-40mmol/L的HEPES、1000-2000U/ml的IL-2、0.03-0.07mmol/L的β-巯基乙醇、5-15ng/ml磷酸钠。
4.如权利要求2所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述原代培养基还包括18-26μg/ml的苯丙氨酸、300-500μg/ml的硫酸化糖胺聚糖。
5.如权利要求3所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述传代培养基还包括18-28μg/ml的硫酸软骨素蛋白聚糖。
6.如权利要求2-5任一所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述步骤3)的培养方法具体为，培养第1天的所述原代培养基中加入浓度为1000U/ml的IFN-r和15ng/ml胰岛素，于培养第2天向培养基的所述原代培养基中加入浓度为100ng/ml的OKT 3、1000U/ml的IL-2和21ng/ml的PDGF。
7.如权利要求1所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，在步骤3)和步骤4)的培养过程中，以48小时为单位,调整细胞浓度为1-3×106个/ml。
8.如权利要求1所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述细胞收集的具体方法为：轻轻摇晃培养瓶，将细胞悬液转移至离心管中，1500rpm的速度离心5min，弃上清，然后加入沉淀稀释液将细胞沉淀稀释，混匀，然后以1500rpm的速度进行离心，即可收集到所述肿瘤组织TIL细胞。
9.如权利要求8所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述沉淀稀释液为包含浓度为：80-120mg/ml的D-葡萄糖和22-31mg/ml的青链霉素的0.9％氯化钠注射液。
10.一种用于培养肿瘤组织TIL细胞的专用培养基，其特征在于，所述培养基包括原代培养基和传代培养基，其中，所述原代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-45ng/ml的bFGF、1-5mg/ml的核黄素、70-90ng/ml的皮质醇、10-25mg/ml的一水磷酸二氢钠、47-62ng/ml的LIF、500-800U/ml的IL-2；所述传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-40mmol/L的HEPES、1000-2000U/ml的IL-2、0.03-0.07mmol/L的β-巯基乙醇、5-15ng/ml磷酸钠。
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