CN108853491A - 一种疫苗的免疫效果增强剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫技术领域，公开了一种疫苗的免疫效果增强剂及其制备方法和应用。本发明所述免疫效果增强剂包括黄芪提取物、党参提取物、山药提取物和香菜‑鱼腥草混合提取物。本发明通过选择黄芪、党参、山药、香菜以及鱼腥草为植物原材料，通过各植物有效成分的协同作用，共同形成了一种能够提高疫苗诱导的细胞和体液免疫反应强度，同时可以更短的时间产生中和抗体的疫苗免疫效果增强剂，特别适用于针对狂犬病毒疫苗。

Description

一种疫苗的免疫效果增强剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，具体涉及一种疫苗的免疫效果增强剂及其制备方法和应用。
背景技术
疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。
基因工程重组亚单位疫苗、合成肽疫苗与灭活病毒疫苗免疫效果相对较差，该类疫苗无法提供足够的抗体应答，故需添加免疫效果增强剂，免疫效果增强剂是非特异性的，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。
目前常用的免疫效果增强剂按照类型划分主要分为以下几类：
矿物质类主要包括氢氧化铝、磷酸铝等；
油类主要包括弗氏佐剂、白油佐剂、MF-59等；
微生物类主要包括寡脱氧核苷酸、短小棒状杆菌、卡介苗、细菌脂多糖等；
含脂类佐剂主要包括如脂质体、免疫刺激复合体、脂肽等；
中草药类蜂胶、皂苷、多糖等；
分子类：如细胞因子、共刺激分子、免疫刺激调节分子、趋化因子等。
与其他病毒性传染病的预防不同，狂犬病疫苗不仅需要有很高的效价又要使其尽快的产生抗体，才能挽救生命。矿物质类、油类、微球类、脂类免疫效果增强剂虽然能提高狂犬病疫苗后期抗体滴度，却推迟早期抗体的产生，这与铝类为代表的矿物佐剂作用机理吻合，这使其对暴露后狂犬病的防治十分不利。
目前用中药单一种类单一成分的，比如多糖、皂甙作为佐剂的研究较多，但是中药理论的配伍往往发挥综合性协同效果。
因此需要研发一种增强灭活狂犬病毒疫苗快速产生抗体的免疫效果复合增强剂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种疫苗的免疫效果增强剂及其制备方法，使得所述增强剂能够提高疫苗诱导的细胞和体液免疫反应强度，同时可以更短的时间产生中和抗体，特别是针对狂犬病毒疫苗；
本发明的另外一个目的在于提供上述增强剂在制备增强疫苗免疫效果产品中的应用，特别是针对狂犬病毒疫苗。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种疫苗的免疫效果增强剂，包括黄芪提取物、党参提取物、山药提取物和香菜-鱼腥草混合提取物。
黄芪为多年生草本植物，黄芪主要含有多糖、皂苷类、黄酮类、多种氨基酸等。党参为我国常用的传统补益药，效近人参而为较弱。党参化学成分研究结果表明主要含有糖、苷类、甾体类、生物碱及含氮成分、挥发性成分、氨基酸类等。山药主要含有蛋白质、糖类、维生素、脂肪、胆碱和淀粉酶等成分，山药主要药理作用有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖等。
香菜有清热解毒、破血化瘀功效，香菜提取物对小鼠移植性肿瘤U14、Hep、S180具有抑制作用。鱼腥草为三白草科植物，现代研究表明，鱼腥草含有多种化学成分，主要含挥发油黄酮类有机酸生物碱及维生素等其主要活性成分为挥发油和黄酮类化合物。具有解热、抗炎、抗菌等功能。
针对狂犬病毒疫苗需要尽快产生抗体以及需要较高的效价的需求，本发明利用上述几种原料进行提取，组合成一种免疫效果增强剂，可提高疫苗诱导的细胞和体液免疫反应强度，同时可以更短的时间产生中和抗体。
在本发明的具体实施方式中，所述黄芪提取物和党参提取物为各自的水提醇沉提取物，所述山药提取物为山药匀浆上清液的醇沉提取物，所述香菜-鱼腥草混合提取物为匀浆上清液。
其中，所述黄芪提取物浓度为2-10mg/ml，更优选为2mg/ml、6mg/ml或10mg/ml，所述党参提取物浓度为10-50mg/ml，更优选为10mg/ml30mg/ml或50mg/ml，所述山药提取物的浓度为5-10mg/ml，更优选为5mg/ml7.5mg/ml或10mg/ml，所述香菜-鱼腥草混合提取物的体积百分比为3-10％，更优选为3％、4％、6％、7％、8％或10％。
在本发明具体实施方式中，本发明所述免疫效果增强剂可具体选择如下之一：
(1)2mg/ml黄芪提取物、10mg/ml党参提取物、5mg/ml山药提取物及3％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(2)2mg/ml黄芪提取物、30mg/ml党参提取物、7.5mg/ml山药提取物及3％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(3)2mg/ml黄芪提取物、50mg/ml党参提取物、10mg/ml山药提取物及4％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(4)6mg/ml黄芪提取物、10mg/ml党参提取物、7.5mg/ml山药提取物及4％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(5)6mg/ml黄芪提取物、30mg/ml党参提取物、10mg/ml山药提取物及6％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(6)6mg/ml黄芪提取物、50mg/ml党参提取物、5mg/ml山药提取物及6％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(7)10mg/ml黄芪提取物、10mg/ml党参提取物、10mg/ml山药提取物及7％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(8)10mg/ml黄芪提取物、30mg/ml党参提取物、5mg/ml山药提取物及8％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(9)10mg/ml黄芪提取物、50mg/ml党参提取物、7.5mg/ml山药提取物及10％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
实验表明，本发明所述免疫效果增强剂与铝佐剂对照相比较，在提高疫苗诱导的细胞和体液免疫反应强度的同时，可以更短的时间产生中和抗体。基于这个显著的有益效果，本发明提出了所述免疫效果增强剂在制备增强疫苗免疫效果的产品中的应用。作为优选，所述疫苗为狂犬病毒疫苗。
此外，本发明还提供了所述免疫效果增强剂的制备方法，黄芪和党参分别水提醇沉获得黄芪提取物和党参提取物，备用；山药匀浆后加水离心，上清液加入乙醇沉淀，过滤后获得山药提取物，备用；鱼腥草和香菜混合后匀浆，提取上清液获得香菜-鱼腥草混合提取物；
混合黄芪提取物、党参提取物、山药提取物和香菜-鱼腥草混合提取物，获得所述免疫效果增强剂。
其中，黄芪的具体提取工艺为：采用水煮醇沉法，确定10-15倍水量，每次1-1.5小时提取多次，合并提取液加入3-5倍体积95％乙醇，沉淀时间为2-4小时，该工艺主要提取物为黄芪多糖。
党参的具体提取工艺为：采用水煮醇沉法，确定10-15倍水量，每次1.5-2小时提取三次，加入3-5倍体积95％乙醇，沉淀时间为2-4小时，该工艺主要提取物为党参多糖。
山药的具体提取工艺为：将山药去皮，用匀浆机把山药10000-20000rpm，2分钟，匀浆完成，按1：1-3比例加入注射用水，4000rpm离心5min，取出上清，加入3倍体积95％乙醇，沉淀时间为2小时，该工艺主要提取物为山药多糖。
香菜-鱼腥草的提取工艺为：将香菜与鱼腥草按1：3的重量混合，放入匀浆机，10000rpm，5分钟，4000rpm离心30min，取出上清。
由以上技术方案可知，本发明通过选择黄芪、党参、山药、香菜以及鱼腥草为植物原材料，通过各植物有效成分的协同作用，共同形成了一种能够提高疫苗诱导的细胞和体液免疫反应强度，同时可以更短的时间产生中和抗体的疫苗免疫效果增强剂，特别适用于针对狂犬病毒疫苗。
附图说明
图1所示为NIH法检测各处理组的疫苗效力；其中，横坐标各组简写含义见表1；
图2所示为小鼠免疫各组疫苗第3天后的中和抗体效价；其中，横坐标各组简写含义见表1；
图3所示为所示为小鼠免疫各组疫苗第7天后的中和抗体效价；其中，横坐标各组简写含义见表1；
图4所示为所示为小鼠免疫各组疫苗第14天后的中和抗体效价；其中，横坐标各组简写含义见表1。
具体实施方式
本发明公开了一种疫苗的免疫效果增强剂及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述增强剂及其制备方法和应用经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述增强剂及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种疫苗的免疫效果增强剂及其制备方法和应用做进一步说明。
实施例1：制备本发明所述增强剂中各提取物
(1)黄芪提取物的制备以提取物中的多糖为目的物，加水量、提取次数、浸提时间进行正交试验，确定黄芪多糖的提取工艺为，15倍水量，提取3次、每次1.5小时，加入5倍体积95％乙醇，沉淀4小时。取黄芪饮片20g，按以上工艺加入相应体积的水，煮沸1.5小时，合并过滤，90℃减压浓缩至100ml，加入500ml95％乙醇，沉淀4小时，6000rpm离心30min，得到黄芪多糖水提醇沉提取物。
(2)党参提取物的制备以提取物中的多糖为目的物，加水量、提取次数、浸提时间进行正交试验，确定党参多糖的提取工艺为，10倍水量，提取3次、每次2小时，加入5倍体积95％乙醇，沉淀4小时。取黄芪饮片60g，按以上工艺加入相应体积的水，煮沸2小时，合并过滤，90℃减压浓缩至300ml，加入900ml95％乙醇，沉淀4小时，6000rpm离心30min，得到党参多糖水提醇沉提取物。
(3)山药提取物的制备以提取物中的多糖为目的物，取山药200g，山药多糖的提取工艺为将山药去皮，用匀浆机把山药20000rpm，2分钟，匀浆完成，按1：3比例加入注射用水，4000rpm离心30min，取出上清，加入3倍体积95％乙醇，沉淀时间为2小时。按以上工艺将山药去皮，将200g去皮后的山药，匀浆完成，加入600ml的注射用水，4000rpm离心30min，过滤，70℃减压浓缩至300ml，加入900ml95％乙醇，沉淀2小时，6000rpm离心30min，得到山药多糖提取物。
(4)香菜与鱼腥草的混合提取物的制备以提取物中的黄酮与鱼腥草素成分为目的物，将香菜与鱼腥草按1：3的重量混合，放入匀浆机，10000rpm，5分钟，4000rpm离心30min，取出上清。按以上工艺，取香菜50g，鱼腥草150g，放入匀浆机，10000rpm，匀浆5分钟，4000rpm离心30min，取上清备用。
实施例2：本发明所述增强剂
根据实施例1制备的各提取物，按照如下任意一个配方可组成本发明所述免疫效果增强剂；
(1)2mg/ml黄芪提取物、10mg/ml党参提取物、5mg/ml山药提取物及3％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(2)2mg/ml黄芪提取物、30mg/ml党参提取物、7.5mg/ml山药提取物及3％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(3)2mg/ml黄芪提取物、50mg/ml党参提取物、10mg/ml山药提取物及4％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(4)6mg/ml黄芪提取物、10mg/ml党参提取物、7.5mg/ml山药提取物及4％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(5)6mg/ml黄芪提取物、30mg/ml党参提取物、10mg/ml山药提取物及6％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(6)6mg/ml黄芪提取物、50mg/ml党参提取物、5mg/ml山药提取物及6％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(7)10mg/ml黄芪提取物、10mg/ml党参提取物、10mg/ml山药提取物及7％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(8)10mg/ml黄芪提取物、30mg/ml党参提取物、5mg/ml山药提取物及8％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
(9)10mg/ml黄芪提取物、50mg/ml党参提取物、7.5mg/ml山药提取物及10％(v/v)的香菜-鱼腥草混合提取物；
实施例3：本发明所述增强剂对疫苗效力的增强作用
为了测试灭活狂犬病毒抗原复合增强剂的效力结果，采用实施例2配方(1)的免疫效果增强剂，与效价为8IU/ml的狂犬病疫苗半成品等比例混合，采用NIH法进行效力试验，其他对照组参见下表1，各组所采用的相同的原料或试剂均来源相同、品质相同。
表1
将上述各组按NIH法进行检测。具体方法是：用生理盐水将待检疫苗和标准疫苗进行5倍系列稀释，根据预测的疫苗效价取4个稀释度，每个稀释度取0.5ml腹腔接种13～16g昆明鼠16只。7天后，再按同样方式免疫1次，二次接种后7天，分别对每只小鼠脑内攻毒(CVS-24)悬液0.03ml约50LD50，观察和记录小鼠的死亡情况，4天内死亡的小鼠不计算在发病死亡小鼠组中。每组4天内死亡小鼠不应超过2只。对5～14天内死亡和存活的小鼠进行统计，按Spearman-Karber法计算待检疫苗和标准疫苗的半数保护量并推算待检疫苗所含国际单位数。
结果如图1所示，通过NIH法判定，加入本发明免疫效果增强剂与常规铝佐剂对灭活狂犬病毒疫苗效力都有很好的增强作用，但是本发明所述免疫效果增强剂有更加显著的增强效果。将实施例2其他配方增强剂进行相同的试验，结果同样显示本发明免疫效果增强剂与常规铝佐剂对灭活狂犬病毒疫苗效力都有很好的增强作用。
实施例4：本发明所述增强剂对抗体产生的增强作用
将实施例2中配方(1)的免疫效果增强剂，等体积加入灭活狂犬病毒抗原(灭活疫苗)；将30只4-6周龄昆明小鼠，分成5组，50ul/只，后腿内侧肌肉注射，免疫注射后3、7、14天，眼眶采血，分离血清后采用RFFIT检测中和抗体，取平均值，其他处理组参照表1中设置，灭活狂犬病毒抗原各组用量相同；
通过图2-4发现，本发明所述免疫效果增强剂能够促进灭活疫苗在的第三天就能产生高于铝佐剂对照组的中和抗体，说明加快了中和抗体的产生，对暴露后免疫非常有帮助。而且所述免疫效果增强剂还能使小鼠在第七天、第十四天能够持续的产生高滴度的抗体，表明所述免疫效果增强剂具有明显的免疫增强作用，增强作用始终显著优于铝佐剂对照组。将实施例2其他配方增强剂进行相同的试验，结果同样显示本发明免疫效果增强剂与常规铝佐剂相比，增强作用始终显著优于铝佐剂对照组。
实施例5：本发明所述增强剂对细胞免疫的增强作用
BALB/c小鼠随机分成5组，每组5只，于0、7天经腹腔接种实施例2配方(3)增强剂与等体积灭活狂犬病毒抗原混合物，0.5ml/只，于第15天无菌取脾，进行淋巴细胞转化试验。同时以生理盐水作为阴性对照。将免疫小鼠脾磨碎，用200目筛网过滤细胞悬液，洗涤l次。用IMDM培养液调整细胞浓度为1×106个/ml，加入96孔培养板，每孔0.1ml/孔，以0.2ml的IMDM培养液封闭。空白对照组3孔，每孔加入0.1ml培养液。Con A刺激组3孔，每孔加人0.1mlCon A液(10ug/ml)，37℃，5％CO2培养48小时，每孔加入MTT(50mg/ml)，0.01ml，继续培养4h。1000rpm，离心5min。弃上清，再加入二甲基亚砜，0.1ml/孔，缓慢振荡10min。在酶标仪上于570nm处测定A值。
将丝裂原刺激组各自的A平均值，代入下列公式计算出刺激指数(SI)。
表2
组别 淋巴细胞转化试验结果
1 Vac+HSXYD 7.32 6.54 5.85 6.82 5.95
2 Vac 2.87 2.86 2.12 1.93 2.34
3 Vac+Aul 1.99 2.53 2.36 1.91 3.21
4 HSXYD 1.73 1.92 2.11 1.35 1.41
5 Aul 1.96 2.03 1.84 1.45 1.67
结果如表2所示，不同佐剂疫苗淋巴细胞转化试验结果，表明本发明免疫效果增强剂具有增强细胞免疫的作用。更换其他配方的增强剂进行上述实验，淋巴细胞转化实验结果的SI值均高于5.5，与表2中的各对照组相比，具有增强细胞免疫的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种疫苗的免疫效果增强剂，其特征在于，包括黄芪提取物、党参提取物、山药提取物和香菜-鱼腥草混合提取物。
2.根据权利要求1所述免疫效果增强剂，其特征在于，所述黄芪提取物和党参提取物为各自的水提醇沉提取物。
3.根据权利要求1或2所述免疫效果增强剂，其特征在于，所述黄芪提取物浓度为2-10mg/ml，所述党参提取物浓度为10-50mg/ml。
4.根据权利要求1或所述免疫效果增强剂，其特征在于，所述山药提取物为山药匀浆上清液的醇沉提取物。
5.根据权利要求1或4所述免疫效果增强剂，其特征在于，所述山药提取物的浓度为5-10mg/ml。
6.根据权利要求1所述免疫效果增强剂，其特征在于，所述香菜-鱼腥草混合提取物为匀浆上清液。
7.根据权利要求1或6所述免疫效果增强剂，其特征在于，所述香菜-鱼腥草混合提取物的体积百分比为3-10％。
8.权利要求1-7任意一项所述免疫效果增强剂在制备增强疫苗免疫效果的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述疫苗为狂犬病毒疫苗。
10.权利要求1所述免疫效果增强剂的制备方法，其特征在于，黄芪和党参分别水提醇沉获得黄芪提取物和党参提取物；山药匀浆后加水离心，上清液加入乙醇沉淀，过滤后获得山药提取物；鱼腥草和香菜混合后匀浆，提取上清液获得香菜-鱼腥草混合提取物；
混合黄芪提取物、党参提取物、山药提取物和香菜-鱼腥草混合提取物，获得所述免疫效果增强剂。
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