CN107569564A - 一种艾滋病辅助治疗药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医疗药物领域，公开了一种艾滋病辅助治疗药物及其制备方法，包括：黄芩16.3g、金银花16.3g、雷公藤16.3g、虎杖16.3g、大黄3.3g、两面针8.2g、制附子4.9g、当归8.2g、白胡椒3.3g、秦皮6.5g、五倍子7.3g冰片2.5g、甘草6.5g。本发明具有清热解毒、健脾温肾、活血止痛功能，用于HIV/AIDS者，症见乏力，食欲减退，腹泻、头痛、失眠、皮疹、低热、消瘦，口疮、脱发等；有利于提高CD4+细胞数量及CD4+/CD8+比值，延缓疾病进展，提高或稳定免疫功能，改善病人生活质量的作用。本发明可以减少患者的经济压力，降低购置西药的昂贵费用，具有很好的市场前景。

Description

一种艾滋病辅助治疗药物及其制备方法

技术领域

本发明属于医疗药物领域，尤其涉及一种艾滋病辅助治疗药物及其制备方法。

背景技术

艾滋病是感染人免疫缺陷病毒(HIV)所引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，导致被感染者免疫功能的部分或完全丧失，继而发生多系统、多器官、多病原体的复合感染和肿瘤等。联合国艾滋病规划署和世界卫生组织2006年11月21日共同发布的《2006年世界艾滋病报告》显示，2006年全球新增艾滋病病毒感染者430万，使艾滋病病毒感染者总数达3950万，同时全球又有290万人死于艾滋病。我国的艾滋病防治工作也面临严峻形势。根据2006年1月25日卫生部、联合国艾滋病规划署、世界卫生组织联合发布的《2005年中国艾滋病疫情与防治工作进展》，截至2005年年底，我国现有艾滋病病毒感染者65万人，其中艾滋病病人约7.5万。全国艾滋病疫情虽然仍呈低流行状态，但感染率呈上升趋势，局部地区和重点人群已经呈现高流行，疫情正从高危人群向一般人群扩散。现代医学公认的高效抗逆转录病毒治疗(HAART，哈特疗法)，俗称的鸡尾酒疗法，已经取得了比较肯定的临床效果，使艾滋病人病死率降低，机会性感染减少，但其存在的不足是毒副作用、耐药性和停药后病毒反跳等，影响了患者的依从性和临床疗效。中医药是我国传统医学，数千年来，在防病治病中发挥了不可磨灭的作用。通过十多年来的中医药对艾滋病治疗的临床效果观察，已经发挥了一定的作用。因此，探索防治艾滋病的有效方法和药物是临床研究的重要任务。中医药学是我国的伟大宝库，中医药的整体观和辨证论治是其独特的理论体系，在我国人民几千年来和疾病作斗争的历史中功不可没。中医药不但可以治疗一般的常见病和多发病，在疑难杂病方面也有一定的疗效。艾滋病是一种新的传染病，目前尚无根治办法，许多国家一直投入大量人力和资金进行研究。虽然抗病毒化学药物可以达到良好的治疗效果，但是，由于化学药物的一些毒副作用以及耐药性、价钱贵、停药后容易反跳等原因。从1981年发现第一例艾滋病以来，尽管目前艾滋病还不能治愈，但无论西医还是中医都在积极寻找有效的治疗方法，使艾滋病成为一种慢性可控性疾病已经成为可能。西医比较肯定的HAART疗法在国外使用较为普遍，特别是在发达国家。近来我国患者也陆续开始接受该法治疗，但由于其存在一定的局限性(停药后反跳、毒副作用大、价钱昂贵等)，结合我国患者的具体情况(经济能力有限)，该法在国内的长期大面积使用是不现实的。因此，寻找符合我国国情的治疗手段是当务之急。中医中药虽不能完全解决艾滋病的所有问题，但几年来的实践表明，通过辨证论治和固定方相结合，可以增强或稳定机体的免疫功能，改善症状，减轻患者的痛苦，提高生存质量。但随着时代的发展和形势的需要，研究工作应该不断深化和完善，更加规范化、规模化和科学化，应该进入一个高质量、高水平的研究时期，充分挖掘和探索中医药防治艾滋病的优势，解决一些关键性问题。近几年尽管一些科研用药用于艾滋病人的治疗，但目前批准的中药新药只有唐草片，而且是作为辅助用药；还尚未进行规模生产。因此，开发和研制治疗艾滋病的中药新药具有广阔的社会、经济前景。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有抗病毒化学药物存在一些毒副作用以及耐药性、价钱贵、停药后容易反跳等诸多问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种艾滋病辅助治疗药物及其制备方法。

本发明是这样实现的，一种艾滋病辅助治疗药物，所述艾滋病辅助治疗药物由黄芩16.3g、金银花16.3g、雷公藤16.3g、虎杖16.3g、大黄3.3g、两面针8.2g、制附子4.9g、当归8.2g、白胡椒3.3g、秦皮6.5g、五倍子7.3g、冰片2.5g和甘草6.5g组成。

本发明的另一目的在于提供一种所述的艾滋病辅助治疗药物的制备方法，所述艾滋病辅助治疗药物制备方法包括以下步骤：

步骤一，取制附子4.9g先煎2小时后，加入除黄芩、冰片外其余药味，加水煎煮，待沸腾后加入黄芩，煎煮三次，每次加水10倍量，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.28～1.32，50℃的清膏，减压干燥，粉碎成细粉；

步骤二，取倍他环糊精加入20％乙醇3倍量，搅拌调成糊状；

步骤三，取冰片2.5g用10倍量95％乙醇溶解，在搅拌状态下缓缓加入上述倍他环糊精糊状物中，用胶体磨反复研磨30分钟，取研磨后的糊状物，冷风吹至近干，在35℃～40℃的温度下干燥，粉碎制细粉；

步骤四，取冰片-倍他环糊精包合物与上述干膏细粉及适量羧甲淀粉钠，混匀，制成颗粒，60℃以下干燥，40目筛整粒，装入胶囊，制成1000粒。

进一步，倍他环糊精糊状物为：冰片:倍他环糊精＝1:4。

进一步，用胶体磨反复研磨，研磨间隙5μm。

本发明的优点及积极效果为：本发明针对早中期的感染者，在减轻和消除患者某些症状体征、改善免疫功能方面有较好作用；具有清热解毒、健脾温肾、活血止痛功能，用于HIV/AIDS者，症见乏力，食欲减退，腹泻、头痛、失眠、皮疹、低热、消瘦，口疮、脱发等。有利于提高CD4+细胞数量及CD4+/CD8+比值，延缓疾病进展，提高或稳定免疫功能，改善病人生活质量的作用。艾复康胶囊就是根据中医理论对艾滋病基本病机的认识，按照古人治疗疫毒、虚损证的经验方，结合现代文献研究资料和自己积累的临床经验，组成的方剂，通过临床实践证实对HIV/AIDS患者确有一定的临床效果。为了进一步把科研成果转化为生产力，本发明从新药开发角度立题，按照国家食品药品监督管理局制定的艾滋病中药新药评价标准草案中规定的要求进行，并完成了艾复康胶囊相应的基础研究(药学、药效学、毒理学)和临床试验等方面的工作。本发明的特色在于针对目前我国艾滋病流行的严重形势，积极发挥中医整体调节和辩证施治的优势，为艾滋病人提供相应的医疗服务，提高他们的生活质量，降低死亡率。本发明强调艾滋病综合致病因素，阐明艾滋病患者热毒内蕴，瘀阻血脉的主要病机，并在此基础上组方治疗。艾复康胶囊为纯中药制剂，国内市场供给充足，药品的成本不高，价位适中。其组方合理，疗效可靠，工艺先进，质量稳定，药源丰富，适于产业化生产。由于我国的艾滋病病人逐年增多，开发具有我国自主知识产权的艾滋病中药新药，可以减少患者的经济压力，降低购置西药的昂贵费用。西药HAART疗法最佳的组合费用平均每个月为3600元，目前在中国运用的最一般的组合每月500元。此外，运用西药一般的疗程至少一年，停药后容易反跳。运用中药进行治疗费用会大大降低，因此，可以推测，该药的研制成功具有很好的市场前景。

附图说明

图1是本发明实施提供的艾滋病辅助治疗药物制备方法流程图。

图2是本发明实施提供的组间WBC数量比较图。

图3是本发明实施提供的组间淋巴细胞数量比较图。

图4是本发明实施提供的CD4+细胞组间比较图。

图5是本发明实施提供的CD3+细胞组间比较图。

图6是本发明实施提供的低剂量组图。

图7是本发明实施提供的高剂量组图。

图8是本发明实施提供的SIV对照组图。

图9是本发明实施提供的组间病毒载量比较图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的艾滋病辅助治疗药物由黄芩16.3g、金银花16.3g、雷公藤16.3g、虎杖16.3g、大黄3.3g、两面针8.2g、制附子4.9g、当归8.2g、白胡椒3.3g、秦皮6.5g、五倍子7.3g、冰片2.5g和甘草6.5g组成。

如图1所示，本发明实施例提供的艾滋病辅助治疗药物制备方法包括以下步骤：

S101：取制附子先煎2小时后，加入除黄芩、冰片外其余药味，加水煎煮，待沸腾后加入黄芩，煎煮三次，每次加水10倍量，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.28～1.32(50℃)的清膏，减压干燥(60～65℃)，粉碎成细粉；

S102：取倍他环糊精加入20％乙醇3倍量，搅拌调成糊状；

S103：取冰片用10倍量95％乙醇溶解，在搅拌状态下缓缓加入上述倍他环糊精糊状物中(冰片:倍他环糊精＝1:4)，用胶体磨反复研磨(逐渐调整研磨间隙至5μm)30分钟，取研磨后的糊状物，冷风吹至近干，在35℃～40℃的温度下干燥，粉碎制细粉；

S104：取冰片-倍他环糊精包合物与上述干膏细粉及适量羧甲淀粉钠，混匀，制成颗粒，60℃以下干燥，40目筛整粒，装入胶囊，制成1000粒，即得。

下面结合试验及药理学分析对本发明的应用效果作详细的描述。

1、对艾复康胶囊药效、药理、毒理的研究

1.1在细胞培养中抗HIV-1作用

艾复康胶囊对HIV-1IIIB株无抗病毒活性。阳性对照药物AZT对HIV-1IIIB株的IC50值为5.75±1.14nM，治疗指数是17548。

1.2对免疫抑制小鼠免疫功能重建作用的影响

试验结果显示艾复康胶囊高、中、低剂量均能明显提高CsA诱导小鼠CD3+、CD4+细胞在外周血的表达，同时明显提高CD8+细胞数，对免疫受抑动物的免疫功能恢复有较好的药效作用。说明中药能够明显对抗由CsA诱导的免疫抑制逆转免疫抑制状态，具有显著提高试验动物免疫功能和促进免疫调节作用。

1.3对免疫缺陷猴病毒SIV慢性感染模型治疗的影响

试验结果显示，SIV感染后治疗组与SIV对照组比较，病毒载量的变化在统计学上无显著性差异，但治疗8周后到停药8周的这段时间内，仍可看出血中病毒载量下降的一种趋势。

猴淋巴结活检显示，对照组猴随着病程的延长，其淋巴结结构逐渐转坏，符合SIV感染模型的自然病理变化规律；治疗组的低剂量组的效果较好，淋巴结组织结构并未随病程延长而变坏，而是朝着稳定甚至转好的方向发展；高剂量组停药时检查淋巴结，其结构略转差，但是停药后继续观察其淋巴结的变化，发现其结构逐步恢复、转好。提示艾复康胶囊以低剂量组的效果最佳，该药对免疫系统具有一定的保护和重建作用。

1.4急性毒性试验

急性毒性试验选用昆明种小白鼠40只，雌雄各半，体重：20±2g，给药组灌胃给予动物25％艾复康胶囊混悬液(艾复康胶囊干膏粉每克粉含生药1.588克)，每日0.4ml/10g(两次给药间隔6小时)，给药剂量为：31.67克生药/kg，相当于临床给药剂量741倍，对照组给等量蒸馏水。动物给药后，活动减少，安静，3小时后恢复正常，4小时侯后，动物陆续有药便排出。所有动物继续正常饲养二周，动物无一死亡，且对动物进食、活动及体重增长无明显不良影响，说明该药毒性很低，按临床剂量服用安全可靠。

1.5大鼠长期毒性试验

艾复康胶囊大、中、小剂量组分别灌胃给予5.955g生药/kg、2.978g生药/kg和1.489g生药/kg的艾复康胶囊干膏粉，其分别相当于成人临床用量的138.8倍、69.4倍和34.7倍。一个月后一天给药两次，间隔6小时，连续给药六个月。结果显示：

①在不同试验期间，各给药组动物白细胞及白细胞分类、红细胞及红细胞压积、血红蛋白含量、血小板、网质红细胞和全血凝血时间与空白对照组比较均无显著差异，且均在正常范围内，提示艾复康胶囊长期服用对血液系统无明显不良影响。

②给药三个月、六个月及恢复期所有动物血液生化检查均未见明显不良反应。给药大、中、小剂量组动物肝肾功能及糖脂代谢与空白对照组比较也未见不良影响，提示艾复康胶囊对肝肾功能及糖脂代谢无明显不良影响。

③给药三个月时，给药各剂量组动物肝和肾脏器指数较明显高于空白对照组，由于药物主要在肝脏代谢，本试验给药剂量很大，可能刺激肝脏代偿性的生长；大鼠主要脏器的脏器系数与对照组比较无显著差异；对心、主动脉、肺、气管、肝、脾、肾、膀胱、胸腺、肠系膜淋巴结、食管、胃、十二指肠、回肠、结肠、胰腺、唾液腺、垂体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、脑(大脑、小脑、脑干)、脊髓(颈、胸、腰段)、视神经、坐骨神经、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、乳腺等脏器进行病理检查，均未见由药物引起的病理形态学损伤。

结论：艾复康胶囊长期给药对动物外观体征、行为活动、体重增长、进食以及各主要脏器组织等均未见明显不良影响；血液学常规检查及血液生化检查结果显示，该药对血液系统、肝肾功能及糖脂代谢无明显不良影响。

2、处方中药味和适应症相关的药效、毒理学研究文献资料

黄芩:为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。化学成分主要含(1)黄酮类：黄芩苷元，黄芩苷，黄芩素，汉黄芩素等；(2)其它：挥发油，苯乙醇糖苷，葡萄糖，蔗糖，苯甲酸，硒等微量元素。其中黄酮类化合物为黄芩的有效成分。近年来，对黄芩黄酮类成分(黄芩苷、黄芩苷元)抗HIV作用的研究成为国内外研究黄芩抗病毒作用的一大热点，且均已深入到细胞分子水平。国外研究，黄芩苷早期研究发现，黄芩苷在细胞培养中能抑制HIV-1病毒逆转录酶(RT)的活性和细胞病变(CPE)，抑制病毒荧光抗原(FA)，P24抗元和成人T淋巴细胞白血病病毒，抑制HIV-1在H9细胞中生长。试验证明，黄芩苷能显著抑制植物血凝素(PHA)引起的外周血单核细胞(PBMC)中HIV-1的复制，其抑制作用具有浓度依赖性，对无症状的HIV-1携带者PHA引起的PBMC中HIV-1的复制也有抑制作用。且尚未发现细胞毒性和抑制细胞生长现象。亦有研究发现，黄芩苷能抑制由包壳蛋白介导的热带T细胞株X4与感染HIV-1病毒的热带单核细胞株R5的细胞融合，并能在HIV-1病毒感染的早期阶段阻止DNA的复制。近年来，医学工作者从多个方面对黄芩苷抗HIV作用机制进行了深入研究。有研究发现，黄芩苷在20μg/mL的浓度下对体外培养的T细胞株CEM无细胞毒性，而在感染HIV病毒的CEM细胞则表现出明显的细胞毒性，表现为引起细胞DNA发生断裂，对高容量释放HIV病毒的CEM-HIV细胞效应尤其明显。然而，当以低浓度的黄芩苷(0.1、0.3、2mg/L)与CEM-HIV细胞温育24－48h，存活的细胞上升了25％。进一步温育6－8天，只有低HIV释放容量的细胞存活，提示黄芩苷可能选择性地诱导高病毒释放容量的CEM-HIV细胞导致细胞凋亡，而刺激低HIV产生的细胞增殖。从而推测黄芩苷的抗HIV作用可能与诱导CEM-HIV细胞的凋亡有关。通过电化学方法研究黄芩苷与DNA的相互作用发现，黄芩苷通过嵌入的方式与DNA结合，这个特征使其能够识别双链DNA和单链DNA。此外，黄芩苷-锌复合物(BA-Zn)的体外抗HIV-1活性过去已有研究。黄芩苷与BA-Zn的抗HIV-1活性对比研究，体外试验研究显示，与黄芩苷相比，BA-Zn具有较低的细胞毒性和较高的抗HIV-1活性，在抑制重组体RT和HIV-1侵入宿主细胞方面，BA-Zn比黄芩苷更有效。与锌的耦合增强了黄芩苷的抗HIV-1活性。小鼠体内试验，黄芩苷能显著抑制白血病病毒引起的脾肿大和白细胞升高。黄芩苷元体外可抑制HIV-1逆转录酶和在细胞培养中抑制HIV-1，静滴可使AIDS病人P24抗原下降，T4淋巴细胞上升。利用荧光和循环二色性光谱法，在HIV-1整合酶有催化作用的区域的构象方面，研究了其抑制剂-黄芩苷元的作用，研究发现，黄芩苷元能与HIV-1整合酶催化作用核心区域的疏水部位相结合(比例为2:1)，并诱导整合酶的构象发生改变。国内研究发现，黄芩苷及黄芩苷元在细胞培养中均能抑制免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1RT)的活性。黄芩苷及苷元为A环取代的羟基黄酮，为了解A环取代羟基的数目及位置与抗病毒活性的关系，分别遮蔽黄芩苷及苷元的6位羟基，观察其抑制HIV-1RT的活性及细胞毒性。结果证实，黄芩苷及苷元的6位羟基被遮蔽则丧失抑制HIV-1RT活性，说明6位羟基为抑制HIV-1RT活性所必需。且黄芩苷元抑制HIV-1的活性及细胞毒性均强于黄芩苷，两种化合物治疗指数相近。

金银花:为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、红腺忍冬Lonicerahypoglauca Miq.、山银花Lonicera confusa(Sweet)DC.)或毛花柱忍冬Loniceradasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花。化学成分含(1)黄酮类：木犀草素，忍冬苷等；(2)有机酸类：氯原酸，异氯原酸等；(3)挥发油类：芳樟醇，蒎烯，异双花醇，苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，香荆芥酚，丁香油酚等；(4)其它：三萜类成分，铁、锌、锂、铅、钙等无机元素。研究表明，金银花有一定的抗猴免疫缺陷病毒(SIV)的作用，对抗艾滋病病毒(HIV)亦显示中等活性。动物试验表明，金银花水提液能显著促进白细胞的吞噬功能，使受损伤淋巴细胞低下的接受抗原信息功能提高到正常水平，使受损淋巴细胞母细胞化反应恢复正常，还能显著增强IL-2的产生，使受损淋巴细胞抗体产生能力显著增强。金银花具有明显抗炎、解热作用。其水煮液，口服液和注射液对角叉菜胶，三联菌苗致热有不同程度的退热作用，对蛋青，角叉菜胶，二甲苯所致水肿有不同程度的抑制作用。

虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根。化学成分含(1)蒽醌类：大黄素，大黄酚，蒽苷A、B，6-羟基芦荟大黄素等；(2)黄酮类：槲皮素，槲皮素-3-阿拉伯糖苷，木犀草素-7-葡萄糖苷等；(3)其它：白藜芦醇，虎杖苷，迷人醇，糖类成分，微量元素等。研究显示，虎杖提取物白藜芦醇能抑制艾滋病模型小鼠的脾肿大和胸腺萎缩，升高外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群水平，提示白藜芦醇具有一定的体内抗小鼠艾滋病病毒作用。将经虎杖水提取物处理的HIV-1接种于MT4细胞，结果未见细胞变性，而且培养上清液中无逆转录酶(RT)活性和感染力；经荧光抗体法与电子显微镜观察，在培养细胞中未见HIV-1抗原与病毒粒子；以PCR法也未能检出前病毒DNA；由此认为，虎杖的水提取物作用于病毒增殖的早期。对MT4细胞用该提取物处理后，再接种HIV-1，可见HIV-1增殖；将持续感染细胞与非感染细胞混合培养后加入该提取物，能够完全抑制巨细胞的形成；提示该提取物可能作用于病毒的表面，以阻止其吸附于细胞。为进一步证明这种结论，探讨了虎杖的水提取物对gp120，CD4结合的影响，结果表明，该提取物对重组体gp120与CD4的结合有抑制作用。以上结果显示虎杖的水提取物抗HIV-1的作用机理之一是阻止病毒吸附于细胞。

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。化学成分含(1)蒽醌及其苷类：大黄素、大黄酚、芦荟大黄素，大黄酸，大黄素甲醚，番泻苷A、B、C、D、E、F，大黄酸-8-葡萄糖苷，大黄素葡萄糖苷，大黄酚葡萄糖苷，芦荟大黄素葡萄糖苷、大黄素甲醚葡萄糖苷等。(2)其它：没食子酰葡萄糖、没食子酸、d-儿茶素，大黄四聚素等。大黄具有广谱的抗病毒作用，对单纯胞疹病毒、柯萨奇B3病毒、新城疫病毒、艾滋病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)等均有一定的抑制作用。研究显示大黄素等一系列蒽醌对HIV病毒的研究，其中大黄素有较强的抗HIV-1活性。大黄对艾滋病病毒(HIV)的抑制作用可能与下列因素有关:(1)鞣质分子直接参与阻止HIV-gp120结合位点；(2)抑制HIV及转录酶；(3)阻止病毒在细胞上吸附；(4)药物的抗病毒活性与收敛性。大黄还具有抗炎作用。大黄中的大黄素能显著抑制角叉菜胶引起的足趾肿胀及醋酸引起的腹腔毛细血管通透性增高，且随剂量增大抑制作用增强。对炎症早期的渗出、毛细血管通透性增高、白细胞游走等有较好的对抗作用，对急性炎症有明显的对抗作用。近年研究发现，大黄还有抗肿瘤、增强免疫功能等多种作用，其机制与富含多糖有关。从山大黄中分离得到水溶性多糖，并对其抗肿瘤及免疫学作用进行了探讨，结果表明山大黄多糖有抗肿瘤和免疫增强作用。其抗肿瘤作用的机制主要是通过调节机体免疫功能，刺激巨噬细胞、T细胞及NK细胞等的功能，促进干扰素等淋巴因子的产生，活化T细胞，提高机体的防御能力。

两面针为芸香科花椒属两面针Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.的干燥根。化学成分含(1)生物碱类：两面针碱、氧化两面针碱、异崖椒定碱、氯化两面针碱、双氢两面针碱、白屈菜红碱等；(2)木脂素类：左旋芝麻素、左旋丁香树脂酚、左旋细辛素；(3)黄酮类：地奥明，牡荆素；(4)其它：香豆精成分、甾醇、Zn，Cu，Fe，Ca，Mn，Mg等微量元素。从两面针中提出的一种单体(结晶－8)10mg/kg腹腔注射可抑制小鼠扭体反应，8-20m/kg腹腔注射可明显提高大鼠痛阈。两面针提取物N－4，50mg/kg腹腔注射，使小鼠自发活动明显减少；40mg/kg和60mg/kg腹腔注射，与阈下剂量的戊巴比妥钠有协同作用。按临床拟用剂量的10和20倍给犬注射也见镇静作用；40mg/kg腹腔注射，5min后使犬呼吸减弱、减慢，20min后恢复正常。氯化两面针碱20mg/kg腹腔注射，在26h内使小鼠艾氏腹水癌细胞有丝分裂指数下降，肥大细胞比例增加；在48h内能明显阻止癌细胞的增殖并表明细胞被阻滞于G2期。当剂量达40mg/kg时，对S期细胞也有一定杀伤作用。其抗癌机制可能是抑制DNA合成，而对RNA合成的抑制作用较弱。两面针碱有较强的抗癌作用，在剂量为4mg/kg时对小鼠白血病P388和L1210的生命延长率分别为109％和36％。

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。化学成分含(1)糖类：当归多糖，蔗糖，果糖等；(2)氨基酸类：缬氨酸，蛋氨酸等；(3)挥发油类：丁烯基苯酞，苯酚，邻苯二甲酸酐等；(4)其它：花椒毒素，异虎耳草，维生素B12、A，阿魏酸，尿嘧啶，腺嘌呤，钙、铜、锌、磷、钾、铁等无机元素。药理研究显示，当归可促进骨髓和脾细胞造血功能，显著增加血红蛋白和红细胞数。水溶液灌胃可使60Co照射小鼠内源性脾结节数增加、脾脏和胸腺增重，促进骨髓和脾细胞造血功能的恢复，防止胸腺继发性萎缩，提高动物存活率，增加脾脏内源性造血灶形成，提高骨髓有核细胞计数；对溶血性血虚模型小鼠能显著升高外周血红蛋白，促进60Co照射后小鼠骨髓细胞DNA合成，试验证明，抗贫血作用可能与当归多糖有关。近年对当归多糖的大量研究，证实其具有明显的免疫促进作用。注射当归多糖可显著增强小鼠单核吞噬细胞系统的吞噬功能；可明显提高小鼠对牛血清蛋白诱导的迟发型敏感反应性。当归多糖对糖皮质激素引发的免疫抑制也具有一定的保护作用。增强小鼠血液、胸腺中cGMP的含量，降低cAMP的含量，并结合其它免疫指标检测，证实当归多糖具有促进吞噬细胞的吞噬功能、E-玫瑰花环形成、淋巴细胞转化等免疫功能的作用，该促进是作用在T淋巴细胞DNA合成与分化增殖的水平之上的。对脾脏中的cAMP和cGMP含量均有增加作用，当归多糖对B淋巴细胞的功能也有促进和调节作用。当归多糖合成当归多糖铁复合物，是一种理想的新型补铁剂。当归内酯是最近从当归中经化学分离、提取及精制得到的药用有效成分。研究结果表明，当归内酯可剂量依赖性促进正常小鼠及S180荷瘤小鼠混合淋巴细胞培养反应，调节T淋巴细胞亚群，增加L3T4+及Lyt2+细胞数量，增强细胞毒T细胞活性。当归内酯经体外试验，对化学因素如免疫抑制剂及抗肿瘤药物引发的MLR的免疫抑制状态均有明显的恢复作用，提示当归内酯可以使受损的免疫效应细胞功能恢复，并促进其增殖，以产生功能性拮抗作用。

白胡椒为胡椒科植物胡椒Piper nigrum L.的干燥近成熟或成熟果实。化学成分含(1)挥发油类：向日葵素，二氢葛缕素，β-石竹烯等；(2)生物碱类：胡椒碱，胡椒新碱，胡椒脂碱等；(3)其它：3，4-二羟基苯乙醇糖苷，脂聚多糖，微量元素。国外学者多次报道胡椒碱的抗肿瘤作用。在体外培养的C3H10T1/2细胞中，椒碱对TPA(肿瘤促进剂)所引起的3H-胆碱及32Pi掺入增加具有抑制作用；在体内试验中，胡椒碱对TPA诱导的小鼠耳肿胀均有显著的抑制作用，且抑制作用呈剂量依赖性。二阶段皮肤致癌试验结果显示，局部给药或口服，均能降低小鼠皮肤肿瘤出现量，局部用药还可延迟肿瘤发生时间。

秦皮为木犀科植物白蜡树Fraxinus chinensis Roxb.、苦枥白蜡树Fraxinusrhynchophylla Hance、尖叶白蜡树Fraxinus szaboana Lingelsh.或宿柱白蜡树Fraxinusstylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮。化学成分含秦皮乙素，秦皮素葡萄糖苷，七叶苷，七叶素，甘露醇，七叶灵，七叶亭等。有抗炎镇痛作用。秦皮中的秦皮甲素、秦皮乙素和秦皮苷均具有明显的抗炎作用。有研究表明，秦皮具有抗炎镇痛的作用，其有效成分为秦皮甲素和秦皮乙素等香豆素类成分。其水溶液能吸收紫外光，保护皮肤免收伤。秦皮甲素lomg/kg腹腔注射，能抑制大鼠角叉菜胶、右旋糖苷、5－HT、组胺、甲醛性足肿胀及棉球肉芽肿。秦皮乙素100～20Omg/kg腹腔对大鼠蛋清、右旋糖苷肿胀有抑制作用；秦皮苷10mg/kg腹腔注射，对角叉菜胶、右旋糖苷、组胺、甲醛性足肿胀的抑制大于甲素，而甲素对早、中、晚期炎症均有效。

五倍子为漆树科植物盐肤木Rhus chinensis Mill.、青麸杨Rhus potaniniiMaxim.或红麸杨Rhus punjabensis Stew.var.sinica(Diels)Rehd.Et Wils.叶上的虫瘿，主要由五倍子蚜Melaphis chinensis(Bell)Baker寄生而形成。化学成分含(1)鞣质类：五倍子鞣质(单宁酸)，缩合没食子鞣质等；(2)其它：脂肪，树脂，蜡质，鸟氨酸等。有收敛作用；有抗肿瘤作用。近年来五倍子单宁被发现有很强的抑制HIV-Rt活性，很有可能发展成为抗爱滋病药物。五倍子中的鞣质以及没食子酸等成分对蛋白质有沉淀作用。皮肤、黏膜、溃疡与之接触后，组织蛋白质即被凝固，形成一层被膜。同时小血管也被压迫收缩，血液凝结，产生止血功效。鞣酸的收敛作用使腺细胞的蛋白质凝固引起分泌抑制，可使黏膜干燥。神经末梢蛋白质的沉淀可产生微弱的局部麻醉作用。因此，本药应用后可促使创面结痂，保护创面，避免外界刺激，减少疼痛及体液丧失。

冰片：为龙脑科植物龙脑香Dryobalanopa aromatica Gaertner树脂加工品，化学成分含龙脑，异龙脑，樟脑等。有镇静抗炎作用。在对龙脑和异龙脑进行小鼠耳廓肿胀和大足跖肿胀的抑制试验中，表明龙脑和异龙脑均能显著抑制清所致的大鼠足跖肿胀。但异龙脑的抑制效果强于龙脑。龙脑还能显著抑制巴豆油所致的小鼠耳廓肿胀，而龙脑则不明显。冰片可透过血脑屏障，Wistar大鼠灌服冰片21min后即达到最高血清浓度16.4mg/L，脑组织的最高浓度为57.4mg/L。大鼠服冰片5min后，脑内冰片的浓度即达10μg/g，与同时间血清冰片浓度比值为1∶1，说明冰片极易透过血脑屏障。

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhizainflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎。化学成分含(1)皂苷类：甘草酸，甘草甜素，甘草皂苷A3、B2、C2等；(2)黄酮类：甘草素，异甘草素，甘草醇等；(3)生物碱类：5，6，7，8-四氢-2，4-二甲基喹啉等；(4)多糖类：glycyrrizan UC等；(5)其它：香豆素类、乌拉尔新苷，硒、钼等微量元素。甘草的药理作用是多方面的，首先具有广泛的抗病毒及抗菌作用：早在20世纪80年代，日本学者就首次报道了甘草甜素具有抗HIV的作用。后来研究表明，中药甘草抑制HIV病毒活性的主要成分是甘草甜素和甘草次酸，其作用机理包括抑制逆转录酶、蛋白酶活性，以及干扰病毒进入细胞等。甘草甜素具有抗HIV病毒的作用，0.5mg/ml的甘草甜素可使98％以上的HIV病毒增殖受到抑制，具有预防艾滋病毒作用。美国已经申请专利应用于处理输血用的血制品，以预防因输血引起的HIV的传播。试验也证明，甘草甜素可明显抑制HIV增殖，且与已知的艾滋病治疗药物叠氮胸苷(艾滋病防护药)联合应用后，两者疗效可产生相加作用。

甘草有增强机体免疫力作用。用小鼠感染LP-BM5逆转录病毒制成类似艾滋病模型，观察强力新甘草甜素(含0.2％甘草甜素、2％甘氨酸及0.1％半胱氨酸)的治疗效果，发现强力新甘草甜素治疗后的小鼠存活期明显延长，小鼠的脾、淋巴结肿大被明显抑制。而且肝细胞、脾细胞和淋巴细胞进行培养后，小鼠的增殖能力增强。甘草酸可显著抑制抗原提呈细胞对T细胞的过度激活作用，抑制由TNF-α介导的细胞免疫作用，调节T细胞释放细胞因子，使Th1/Th2保持平衡，从而调节免疫反应；在细胞免疫方面，甘草酸可选择性地增强辅助性T淋巴细胞的增殖能力和活性，使CD4细胞增加，CD8细胞减少。另外，甘草甜素对多种细胞因子的生成与分泌具有调节作用:(1)可促进淋巴细胞产生IL-2，IFN，消除Ts细胞活性；(2)与IL-2，IFN协同NK细胞活性增强，因此使免疫细胞的生物学效应放大，从而调节抗体产生细胞活性；(3)还能增加细胞因子的产生，间接诱导IFN-γ的活性，同时抑制IL-4或IL-10的生成，使Th1的功能增强，抑制Th2的功能，调节Th1/Th2失衡。甘草多糖在体外对水泡性口炎病毒、腺病毒Ⅱ型，Ⅰ型单纯性疱疹病毒(HSV-Ⅰ)和牛痘病毒均有明显的抑制作用。

3、质量研究工作及药品标准(草案)综述

依据〈中药质量标准分析方法验证指导原则〉(中国药典2010年版一部附录XⅧA)的有关规定和临床批件中对质量标准部分的要求，对本发明按工艺研究确定制法制备的艾复康胶囊3批样品(批号：20051115、20051116、20051117)进行了质量研究工作；对本发明3批大生产样品(20100601、20100602、20100603)进行了12个月长期试验的稳定性考察，起草了艾复康胶囊药品标准(草案)，今后研究单位将根据实际数据的累积进行修改与完善。

3.1.性状

按艾复康胶囊试验样品的实际性状描述，“本发明为硬胶囊，内容物为黄棕色至棕色的细粒或粉末；味甜、微苦”。

3.2.鉴别

由于本方药味多，相互干扰严重，给薄层鉴别工作带来很大困难。参考文献及中国药典的方法，针对方中的各味药进行了预试验，发现阴性液干扰很严重。通过优化提取方法、展开系统及薄层板类型，最终建立了五倍子、当归、黄芩、秦皮、甘草、白胡椒、大黄等7种药材的薄层色谱鉴别方法。除制附子进行乌头碱限量检查外，方中其它药味因干扰严重，未能建立起有效的薄层色谱鉴别方法，今后将根据实际情况继续予以研究，以补充完善艾复康胶囊药品标准。

结果表明：五倍子、当归、黄芩、秦皮、甘草、白胡椒、大黄7种药材的薄层色谱鉴别方法阴性对照均无干扰，受检样品与对照品或对照药材主要斑点清晰，分离好，专属性强，本发明三批样品(20051115、20051116、20051117)均符合规定。

3.3.检查

3.3.1乌头碱限量 由于艾复康胶囊中含有制附子，因此以乌头碱为对照限量指标，对艾复康胶囊中乌头碱的含量进行了限量检查，制订了TLC法对本发明中乌头碱进行含量限度检查。在本发明临床审评期间补充通知的要求，对乌头碱的含量限度进行了补充研究，由TLC法改为HPLC法，通过20051115样品测定可知，每克胶囊内容物中含乌头碱0.2133ug，即每粒胶囊含乌头碱0.053ug。按处方量折算每粒胶囊相当于制附子药材4.9mg，经计算，相当于每克制附子药材含乌头碱10.9ug。远低于药典规定的0.2mg/g药材。

由于是在检测限附近，受基线噪音等因素的干扰，在不同环境的影响下，会有误差。因此认为应适当放宽，经计算，当峰面积为100时，相当于41ug/g药材，符合药典规定。所以，限度检查应为，在本发明条件下，每粒胶囊中乌头碱的含量不得高于0.2ug。

3.3.2崩解时限 按照中国药典2005年版一部附录IL胶囊剂项下规定，对本发明三批样品的崩解时限进行了检查。结果表明：本发明三批样品(20051115、20051116、20051117)的崩解时限均符合规定。

3.3.3水分 按照中国药典2005年版一部附录IL胶囊剂项下规定，对本发明三批样品的水分进行了检查。结果表明：本发明三批样品(20051115、20051116、20051117)的水分均符合规定。

3.3.4装量差异 按照中国药典2005年版一部附录IL胶囊剂项下规定，对本发明三批样品的装量差异进行了检查。结果表明，本发明三批样品(20051115、20051116、20051117)的装量差异均符合规定。

3.3.5重金属 取本发明，照重金属检查法〈中国药典2005年版一部附录ⅨE第二法〉，依法检查。结果表明：本发明三批样品(20051115、20051116、20051117)的重金属含量均小于10ppm，按规定未列入质量标准中。

3.3.6砷盐取本发明，照砷盐检查法〈中国药典2005年版一部附录ⅨF第一法〉，依法检查。结果表明：本发明三批样品(20051115、20051116、20051117)的砷盐含量均小于2ppm，按规定未列入质量标准中。

3.3.7微生物限度 根据国家药典委员会、中国药品生物制品检定所2005年10月1日下发的“关于执行《中国药典》2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明”(国药典发(2005)98号)，研制单位参考微生物限度检查法(中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC)的有关规定进行了微生物限度检查方法学验证。试验结果表明：艾复康胶囊采用常规法可检验霉菌、酵母菌和控制菌；细菌检查可采用培养基稀释法(1:400)测定。

根据上述试验结果，制定艾复康胶囊微生物限度检查方法如下：

微生物限度 照微生物限度检查法(中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC)，取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml置匀浆罐匀浆(3000转/5min)，制成1:10供试液。取1:10供试液按常规法，测定霉菌和酵母菌数；取1:10供试液按培养基稀释法(0.5ml/皿，即1:400)，测定细菌数；取供试品按常规法，检查控制菌，结果应符合规定。

本发明属不含药材原粉的口服给药固体制剂，微生物限度标准为：细菌数：每1g不得过1000个；霉菌和酵母菌数：每1g不得过1000个；大肠埃希菌：每1g不得检出。

本发明三批样品(20051115、20051116、20051117)的微生物限度检查按上述方法检查均符合规定，故将该项列入质量标准中。

3.3.8含量测定

根据艾复康胶囊的中医方解，方中以黄芩、金银花为君：黄芩苦，寒，入肺、胆、胃、大肠经，金银花甘，寒，入肺、胃、大肠经。上述二药清热解毒，治温病发热，热毒，痈疡，肿毒，瘰疬及肺热咳嗽等。黄芩清热解毒，为本方君药之首，主要活性成分黄芩苷具有抑制艾滋病毒的作用，这与制剂功能主治的内容是一致的。

中国药典2005年版一部黄芩项下采用高效液相色谱法测定黄芩苷的含量，用于控制药材质量。因此，参考上述方法，制订了本发明的含量测定方法，即采用高效液相色谱法对制剂中黄芩苷含量进行测定以控制本发明的质量。并对此进行了方法学验证，对色谱分析条件进行了选择，考察了阴性对照(缺黄芩)对测定的影响、线性关系、回收率、溶液稳定性、进样精密度及重复性试验等有关的方法学研究内容，并测定了本发明3批样品的含量。

试验结果表明：阴性对照(缺黄芩)不干扰测定，线性关系、回收率、溶液稳定性、进样精密度及重复性均良好；本发明3批样品(批号：20051115、20051116、20051117)的黄芩苷含量测定结果表明，本发明含测数据稳定。依据实测数据，暂定本发明内容物每克含黄芩苷(C21H18O11)不得少于2.7mg。即每粒胶囊含黄芩苷不得少于0.6mg。今后研究单位将根据实际数据的累积进行修改和完善含量测定标准。

该方法专一性较强、准确度、稳定性及重现性较高，可用于该制剂的含量控制。试验结果显示：高效液相色谱法能较好的满足本发明黄芩苷含量测定的要求，故将本项列入质量标准中。

3.3.9功能与主治 根据艾复康胶囊的方解、主要药效学试验和临床试验结果，确定本发明的功能与主治为：清热解毒，健脾温肾，活血止痛。用于HIV/AIDS者，症见乏力，食欲减退，腹泻、头痛、失眠、皮疹、低热、消瘦，口疮、脱发等。有明显提高CD4+细胞数量及CD4+/CD8+比值，提高或稳定免疫功能的作用。

3.3.10用法与用量 根据艾复康胶囊的临床试验情况，确定本发明的用法与用量为：“口服，每次4粒，一日3次”。

3.3.11规格 根据艾复康胶囊的工艺研究结果和临床试验使用情况，并考虑用药者的方便性和依从性，确定本发明的规格为：“每粒装0.25g”。

3.3.12贮藏 根据艾复康胶囊三批样品(批号：20051115、20051116、20051117)12个月长期试验稳定性考察结果，结合药品在流通过程中可能遇到的问题综合考虑，建议本发明的贮藏条件为：密封、避光、置阴凉干燥处。

3.3.13有效期 根据艾复康胶囊三批样品(批号：20051115、20051116、20051117)12个月长期试验稳定性考察结果分析，本发明的有效期暂定为24个月，最终按本发明长期试验稳定性考察结束后的试验结果，取长期试验中与0月数据相比无明显改变的最长时间点为有效期。

3.3.14标准附件

根据临床批件的要求，对产于浙江，不同采收季节的共9批雷公藤药材中雷公藤甲素的含量进行了研究，并制订了药材中雷公藤甲素的含量限度，药材的含量限度暂定为每克药材含雷公藤甲素不得低于1.849ug。该方法专一性较强、准确度、稳定性及重现性较高，可用于雷公藤药材的质量控制，因此列入本发明标准附件。

3.4.稳定性试验综述

根据《药品注册管理办法》(局令第28号)：〈中药、天然药物注册分类及申报资料要求〉对中药、天然药物注册分类6.1品种申请临床试验申报资料的要求。依据艾复康胶囊质量标准(草案)及〈原料药与药物制剂稳定性试验指导原则〉(中国药典2010年版二部附录ⅪⅩC)中稳定性考察的有关内容，以及国家食品药品监督管理局发布的《中药、天然药物稳定性研究技术指导原则》(国食药监注678号文)，对本发明三批大生产样品(批号：20100601、20100602、20100603)的初步稳定性进行了考察。

本次试验进行了艾复康胶囊12个月长期试验的稳定性考察，主要目的是考察艾复康胶囊模拟上市包装在长期试验条件下(25℃±2℃，相对湿度60％±10％)的稳定性。考察项目有性状、鉴别、含量测定、乌头碱限量、崩解时限、水分、装量差异与微生物限度检查。

试验结果表明：本发明三批模拟上市包装样品经长期试验12个月的稳定性考察，艾复康胶囊的外观性状、鉴别、含量测定、乌头碱限量、崩解时限、水分、装量差异与微生物限度检查等各项考察指标与0月比较，未发生显著性变化，表明本发明的各项理化指标基本稳定；直接接触药品的包装材料和容器(口服固体药用高密度聚乙烯瓶)对试验样品的各项理化指标无影响，相容性良好，能够保证产品的质量稳定性。本发明的长期稳定性试验考察仍在进行中。

3.4.1贮藏条件的确定：根据艾复康胶囊三批样品(批号：20100601、20100602、20100603)12个月长期试验稳定性考察结果，结合药品在流通过程中可能遇到的问题综合考虑，建议本发明的贮藏条件为：密封、避光、置阴凉干燥处。

3.4.2包装材料/容器的确定：艾复康胶囊直接接触药品的内包装材料和容器选用符合国家药包材标准的口服固体药用高密度聚乙烯瓶，该包装材料和容器密封性好，质地坚硬，使用方便，适合中药品种服药时间长、服用剂量较大的特点；口服固体药用高密度聚乙烯瓶为胶囊剂等固体剂型药品最常用的包装材料，化学性质十分稳定，对药物无不良影响，包装简便，价格低廉，符合药剂学中胶囊剂对包装材料的要求；艾复康胶囊三批样品(批号：20100601、20100602、20100603)12个月长期试验稳定性考察结果表明：该包装材料对试验样品的各项理化指标无影响，相容性良好，能够保证产品的质量稳定性。

口服固体药用高密度聚乙烯瓶质量标准符合药包材YBB00122002标准之规定。

3.4.3有效期的确定：根据艾复康胶囊三批样品(批号：20100601、20100602、20100603)12个月长期试验稳定性考察结果分析，本发明的有效期暂定为24个月，最终按本发明长期试验稳定性考察结束后的试验结果，取长期试验中与0月数据相比无明显改变的最长时间点为有效期，本发明的长期试验稳定性考察仍在进行中。

3.5.综合分析与评价

艾复康胶囊为中药、天然药物注册分类6.1项品种。

通过对艾复康胶囊处方及制备工艺研究，确定了最佳生产工艺。研究结果表明：在研究确定的生产工艺条件下制成的艾复康胶囊样品，理化性质稳定，批间差异小，生产工艺切实可行，各项检测指标符合标准规定，适合于工业化生产。三批中试样品平均黄芩苷转移率为63.30％，工艺稳定性好，产品质量可靠，说明该工艺是切实可行的。

通过对艾复康胶囊样品的性状、鉴别、检查、含量测定及微生物限度检查方法学验证的全面研究。制订了艾复康胶囊药品标准(草案)。其制定的各项质量指标能够满足艾复康胶囊安全性、有效性和质量可控性的基本要求。

艾复康胶囊样品12个月长期试验稳定性考察结果表明：本发明质量稳定。暂定有效期为24个月。

艾复康胶囊使用的原辅材料均为法定标准；直接接触药品的包装符合法定标准，化学、物理性质稳定，对药品无不利影响，能够保证药品在有效期内的质量稳定。

综上所述，艾复康胶囊药学研究资料符合《药品注册管理办法》(局令第28号)：〈中药、天然药物注册分类及申报资料要求〉对中药、天然药物注册分类6.1项品种的要求。单位在全面的生产工艺和质量研究工作基础上，制订了本发明的质量标准草案，进行了12个月长期试验稳定性考察，研究结果表明：艾复康胶囊的生产工艺合理可行、质量可控，适宜于工业化生产；艾复康胶囊的稳定性良好，质量可控。

4.药理毒理研究总结

4.1主要药效学试验

4.1.1体外试验-在细胞培养中抗HIV-1作用

HIV-1病毒对MT-4细胞的TCID50：用CPE法测定HIV-1IIIB株对MT-4细胞的TCID50为10-5。

艾复康胶囊对MT-4细胞半数毒性浓度(TC50)：受试药物的最大无毒浓度为52.8μg/ml，在此浓度下细胞形态与对照细胞相同，计算药物对细胞的半数毒性浓度TC50为395.0μg/ml。阳性对照药物AZT的最大无毒浓度为52.8μΜ，在此浓度下细胞形态与对照细胞相同，计算对MT-4细胞的半数毒性浓度TC50为100.9μΜ。

受试药物对HIV-1IIIB株抗病毒活性：受试药物对HIV-1IIIB株无抗病毒活性。阳性对照药物AZT对HIV-1IIIB株的IC50值为5.75±1.14nM，治疗指数是17548。

4.1.2体内试验

4.1.2.1对免疫抑制小鼠免疫功能重建作用的影响

试验结果显示芩花解毒高、中、低剂量均能明显提高CsA诱导小鼠CD3+、CD4+细胞在外周血的表达，同时明显提高CD8+细胞数，对免疫受抑动物的免疫功能恢复有较好的药效作用。说明中药艾复康胶囊能够明显对抗由CsA诱导的免疫抑制逆转免疫抑制状态，具有显著提高试验动物免疫功能和促进免疫调节作用。

4.1.2.2治疗猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus，SIV)猴试验研究

试验结果显示，SIV感染后治疗组与SIV对照组比较，病毒载量的变化在统计学上无显著性差异，但治疗8周后到停药8周的这段时间内，仍可看出血中病毒载量下降的一种趋势。

猴淋巴结活检显示，对照组猴随着病程的延长，其淋巴结结构逐渐转坏，符合SIV感染模型的自然病理变化规律；治疗组的低剂量组的效果较好，淋巴结组织结构并未随病程延长而变坏，而是朝着稳定甚至转好的方向发展；高剂量组停药时检查淋巴结，其结构略转差，但是停药后继续观察其淋巴结的变化，发现其结构逐步恢复、转好。提示芩花解毒以低剂量组的效果最佳，该药对免疫系统具有一定的保护和重建作用。

综上所述，艾复康胶囊是一种具有显著提高机体免疫功能和免疫调节作用而无毒性的、有较好疗效的中药制剂。

4.2急性毒性试验

急性毒性试验选用昆明种小白鼠40只，雌雄各半，体重：20±2克，给药组灌胃给予动物25％芩花解毒混悬液(芩花解毒干膏粉每克粉含生药1.588克)，每日0.4ml/10g(两次给药间隔6小时)，给药剂量为：31.67克生药/kg，相当于临床给药剂量741倍，对照组给等量蒸馏水。动物给药后，活动减少，安静，3小时后恢复正常，4小时后，动物陆续有药便排出。所有动物继续正常饲养二周，动物无一死亡，且对动物进食、活动及体重增长无明显不良影响，说明该药毒性很低，按临床剂量服用安全可靠。

4.3大鼠长期毒性试验

选用Wistar大鼠160只，雌雄各半，体重100±20克，试验分为四组，每组动物40只，给药剂量及分组情况如下：给药大剂量组25％芩花解毒混悬液1.5ml/100g体重；中剂量组12.5％芩花解毒混悬液1.5ml/100g体重；小剂量组6.25％芩花解毒混悬1.5ml/100g体重，一个月后一天给药两次，给药间隔6小时，空白对照组给等量蒸馏水。给药剂量分别为：大剂量组：5.955g生药/kg、中剂量组：2.978g生药/kg、小剂量组：1.489g生药/kg，分别相当于临床给药剂量的138.8、69.4、34.7倍。均采用灌胃给药方式，连续给药6个月，每周称量动物体重一次，并记录动物进食情况，根据体重变化每周调整给药量，正常对照组给等量蒸馏水。于给药3个月时，每组取动物10只，进行血液学常规检查、血液生化检查及主要器官病理学检查。于给药6个月时，每组取20只动物进行上述同样检查。余下动物不给药，继续正常饲养四周，处死，重复上述检查。试验结果显示：

(1)在不同试验期间，各给药组动物白细胞及白细胞分类、红细胞及红细胞压积、血红蛋白含量、血小板、网质红细胞和全血凝血时间与空白对照组比较均无显著差异，且均在正常范围内，提示艾复康胶囊长期服用对血液系统无明显不良影响。

(2)给药三个月、六个月及恢复期所有动物血液生化检查均未见明显不良反应。给药大、中、小剂量组动物肝肾功能及糖脂代谢与空白对照组比较也未见不良影响，提示艾复康胶囊对肝肾功能及糖脂代谢无明显不良影响。

(3)给药三个月时，给药各剂量组动物肝和肾脏器指数较明显高于空白对照组，由于药物主要在肝脏代谢，本试验给药剂量很大，可能刺激肝脏代偿性的生长；大鼠主要脏器的脏器系数与对照组比较无显著差异；对心、主动脉、肺、气管、肝、脾、肾、膀胱、胸腺、肠系膜淋巴结、食管、胃、十二指肠、回肠、结肠、胰腺、唾液腺、垂体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、脑(大脑、小脑、脑干)、脊髓(颈、胸、腰段)、视神经、坐骨神经、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、乳腺等脏器进行病理检查，均未见由药物引起的病理形态学损伤。

结论：艾复康胶囊长期给药对动物外观体征、行为活动、体重增长、进食以及各主要脏器组织等均未见明显不良影响；血液学常规检查及血液生化检查结果显示，该药对血液系统、肝肾功能及糖脂代谢无明显不良影响.

5、药物稳定性研究的试验

根据《药品注册管理办法》(局令第28号)：〈中药、天然药物注册分类及申报资料要求〉对中药、天然药物注册分类6.1品种申请临床试验申报资料的要求。依据艾复康胶囊质量标准(草案)及〈原料药与药物制剂稳定性试验指导原则〉(中国药典2010年版二部附录ⅪⅩC)中稳定性考察的有关内容，以及国家食品药品监督管理局发布的《中药、天然药物稳定性研究技术指导原则》(国食药监注678号文)，对本发明三批样品的稳定性进行了考察。

根据上述要求，本次试验进行了艾复康胶囊12个月长期试验的稳定性考察，主要目的是考察艾复康胶囊模拟上市包装在长期试验条件下的稳定性。考察项目有性状、鉴别、含量测定、乌头碱限量、崩解时限、水分、装量差异与微生物限度检查。本发明的长期试验考察仍在继续进行中。考察项目测定方法的来源详见申报资料15。

5.1.试验样品的基本情况

品名：艾复康胶囊

规格：每粒装0.25g

剂型：胶囊剂

批号：20100601、20100602、20100603。

批产量：3批样品均为超过130000粒大生产规模，样品具有代表性。

生产者：兰州和盛堂制药有限公司加工生产。

生产日期：2010年5月19日～6月8日

试验开始时间：2010年6月5日

5.2.稳定性试验的条件及样品包装形式

试验条件：在温度25℃±2℃，相对湿度60％±10％条件下试验。

样品包装：艾复康胶囊直接接触药品的包装材料和容器采用乳白色(不透明)口服固体药用高密度聚乙烯瓶密封包装，每瓶48粒装。

5.3.各项检测方法和指标的限度要求

5.3.1检测项目 性状、鉴别、含量测定、乌头碱限量、崩解时限、水分、装量差异与微生物限度检查

5.3.2检测方法和指标的限度要求依据 艾复康胶囊质量标准(草案)及中国药典2010年版一部附录ⅠL

5.4.长期试验

将艾复康胶囊三批模拟上市包装样品(批号：20100601、20100602、20100603)置于温度25℃±2℃，相对湿度60％±10％条件下，分别于0、3、6、9、12个月取样，进行外观性状、鉴别、含量测定、乌头碱限量、崩解时限、水分、装量差异与微生物限度检查。结果见表1、表2、表3。

结果表明，在长期试验(25℃±2℃，相对湿度60％±10％)条件下考察12个月，艾复康胶囊的外观性状、鉴别、含量测定、乌头碱限量、崩解时限、水分、装量差异与微生物限度检查等各项考察指标与0月比较，未发生显著性变化，说明本发明在长期试验条件(温度25℃±2℃，相对湿度60％±10％)下，性质基本稳定。

5.5.稳定性研究结果评价

根据〈原料药与药物制剂稳定性试验指导原则〉(中国药典2010年版二部附录ⅪⅩC)中药物制剂稳定性考察的有关内容，以及国家食品药品监督管理局发布的《中药、天然药物稳定性研究技术指导原则》(国食药监注678号文)，对艾复康胶囊三批模拟上市包装样品(批号：20100601、20100602、20100603)的初步稳定性进行了考察。本发明在长期试验条件(25℃±2℃，相对湿度60％±10％)下12个月的稳定性考察结果表明：

本发明三批模拟上市包装样品经长期试验12个月的稳定性考察，艾复康胶囊的外观性状、鉴别、含量测定、乌头碱限量、崩解时限、水分、装量差异与微生物限度检查等各项考察指标与0月比较，未发生显著性变化，表明本发明的各项理化指标基本稳定；直接接触药品的包装材料和容器(口服固体药用高密度聚乙烯瓶)对试验样品的各项理化指标无影响，相容性良好，能够保证产品的质量稳定性。本发明的长期试验考察仍在进行中。

5.5.1贮藏条件的确定

根据艾复康胶囊三批样品(批号：20100601、20100602、20100603)12个月长期试验稳定性考察结果，结合药品在流通过程中可能遇到的问题综合考虑，建议本发明的贮藏条件为：密封、避光、置阴凉干燥处。

5.5.2包装材料/容器的确定

本发明直接接触药品的包装材料和容器采用口服固体药用高密度聚乙烯瓶，艾复康胶囊三批样品(批号：20100601、20100602、20100603)12个月长期试验稳定性考察结果表明：该包装材料对试验样品的各项理化指标无影响，相容性良好，能够保证产品的质量稳定性。

5.5.3有效期的确定

根据艾复康胶囊三批样品(批号：20100601、20100602、20100603)12个月长期试验稳定性考察结果分析，本发明的有效期暂定为24个月，最终按本发明长期试验稳定性考察结束后的试验结果，取长期试验中与0月数据相比无明显改变的最长时间点为有效期，本发明的长期试验稳定性考察仍在进行中。

6、艾复康胶囊治疗猴免疫缺陷病毒(SIV)猴试验研究

6.1.试验材料

6.1.1药物

艾复康胶囊：棕色粉末，批号：051115，每克粉含生药1.588g，水溶，用细胞培养液配制。齐多夫定(Zidovudine，AZT)抗HIV-1逆转录酶抑制剂：购自SIGMA公司。阳性对照药：贞芪扶正颗粒(吉林通化神源药业有限公司生产，产品批号：040306005)；环孢素A(CsA)(瑞士诺华大药房，产品批号：S00400)。

6.1.2动物

动物恒河猴(Rhesus Macaques):雄性，体重3～5kg。购自中国医学科学院昆明动物所。经血清学检查证实无猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV)、猴T淋巴细胞I型病毒(STLV-I)感染抗体阴性，结核菌素阴性，痢疾菌阴性。

昆明种小鼠：雄性，SPF级，体重18～20g，购自中国药品生物制品鉴定所试验动物中心，许可证编号：SCXK(京)2005-0004)。

6.1.3细胞

MT-4细胞：传代人T淋巴细胞系。

6.1.4病毒

试验室传代HIV-1ⅢB病毒株:由美国引进。毒株SIVmac251：由美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士惠赠。

6.1.5试剂

MTT，购自SIGMA公司。DMSO(二甲基亚砜)，购自SIGMA公司。细胞培养液：RPMI1640+10％胎牛血清。CD3+单克隆抗体(PE标记)CD4+单克隆抗体(FITC标记)购自BD公司。抗小鼠CD3、CD4、CD8、和CD19单克隆荧光抗体(美国eB公司生产，深圳达科微生物技术有限公司经销)。抗猴IgG荧光抗体(购自美国EYLABORATORIES，INC.)

6.1.6仪器

ZS-2板式酶标仪：北京市新风机电技术公司。96孔细胞培养板。CO2培养箱。瑞典AC920EO全自动分析仪。Couter EPI CS XL型流式细胞仪(美国库尔特公司生产)。

6.2.试验方法和结果

6.2.1体外试验

6.2.1.1 CPE法测定病毒对细胞的感染性滴度(TCID50)

将MT-4细胞接种于96孔板，每板100μl，细胞浓度为5×104个/ml(终浓度)，将病毒原液用培养液依次10倍稀释共8个浓度加至细胞孔内，每浓度4孔，37℃，5％CO2温箱培养。每天用倒置显微镜观察细胞病变程度(CPE)，记录细胞病变程度，用Reed-Muench法计算病毒的感染性滴度(TCID50)。

结果显示：HIV-1IIIB株对MT-4细胞的TCID 50为10-5。

6.2.1.2 MTT法测定艾复康胶囊对细胞的半数毒性浓度(TC50)

(1)艾复康胶囊对MT-4细胞的半数毒性浓度(TCID50)

将MT-4细胞接种于96孔板，每板100μl，细胞浓度为5×104个/ml(终浓度)。分别加入330、66、13.2、2.64、0.528、0.1056、0.02112、0.004224mg/ml受试药物100ml，每浓度4孔；阳性对照药AZT的浓度为1000、200、40、8、1.6、0.32、0.064、0.0128mM，每孔100μl，每浓度4孔，培养3天后加5mg/ml MTT染色4小时，吸弃上清加DMSO100ml溶解约0.5小时，用ZS-2酶联检测仪测定OD570mm吸收值，用Reed-Muench法计算TC50。

结果显示：艾复康胶囊的最大无毒浓度为52.8mg/ml，在此浓度下细胞形态与对照细胞相同。计算药物对细胞的半数毒性浓度TC50为395.0mg/ml。阳性对照药AZT对细胞的半数毒性浓度TC50100.9mM。

6.2.1.2测定送检药物的抗病毒活性

(1)CPE法测定送检药物的抗病毒活性

将MT-4细胞接种于96孔板，每板50μl，细胞浓度为1×105个/ml(终浓度)。在不同分别加入330、165、82.5、41.25、20.625、10.3125mg/ml受试药物50ml，然后每孔加100μlHIV-1病毒(100TCID50)。设阳性对照(细胞+AZT+病毒)、病毒对照(细胞+病毒+培养液)、细胞对照(细胞+培养液)、药物对照(药物+细胞+培养液)。试验重复2次，用Reed-Muench法计算药物对病毒的半数抑制浓度IC50。

结果显示：艾复康胶囊对HIV-1IIIB株无抗病毒活性。阳性对照药物AZT对HIV-1IIIB株的IC50值为5.75nM，治疗指数是17548。

6.2.2体内试验

6.2.2.1对免疫抑制小鼠免疫功能重建作用的影响

(1)建立免疫抑制小鼠动物模型

昆明种小鼠在本所二级动物试验室(试验动物使用许可证：SYXK(京)2005-0024，有效期至2010年7月29日)内饲养3天后，按每公斤体重25毫克用量给小鼠腹腔注射环孢素A(正常对照组除外)，隔日注射一次，共注射3次。于第三次注射后次日开始灌胃给药。每次每只为0.5ml，每日一次，连续灌胃15天。根据成人每公斤体重用药量(2.25g/60kg)，芩花小鼠用药量分别设立5倍组、10倍组、20倍组三个试验观察组。阳性药对照组：以成人每公斤体重(30g/60kg)的10倍量为贞芪扶正颗粒用药量。

给药时间到，动物眼眶放血，肝素抗凝，取200ml抗凝血，分别加入抗鼠单克隆抗体CD3FITC-CD4PE、CD8PECY5和CD3FITC-CD19PE各10ml；冰箱4℃孵育30分钟；用溶血剂溶去红细胞；磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，恢复1ml体积；流式细胞仪(FACS)测定荧光标记阳性细胞百分率。检测结果统计分析，采用统计软件SPSS12.0中重复测量的方差分析法对试验数据进行分析。

(2)结果：芩花高、中、低剂量均能明显提高CSA诱导小鼠CD3+、CD4+细胞在外周血的表达，同时明显提高CD8+细胞数，对免疫受抑动物的免疫功能恢复有较好的药效作用。

表1 芩花对免疫受抑小鼠淋巴细胞亚群影响(X±S，％)

注：与正常组比较△P<0.05^△△P<0.01

与模型组比较*P<0.05**P<0.01

(3)结论

中药芩花高、中、低剂量均能提高环孢素A(CsA)诱导免疫抑制小小鼠CD₃ ⁺、CD₄ ⁺细胞在外周血(PBMC)表达，并能够明显提升CD₈ ⁺细胞数，该药在短时间内调节和逆转受抑动物的免疫抑制状态，使其免疫功能可逐渐恢复，接近并达到正常组水平。试验证明，中药芩花具有较好的提高和调节免疫功能的作用。

6.2.2.2艾复康胶囊对免疫缺陷猴病毒慢性感染模型治疗的影响

(1)模型建立、分组及给药方式：恒河猴12只，随机分为高剂量组、低剂量组和模型对照组，每组4只，药物治疗组按药物研制单位所提供的给药方法和剂量换算为猴给药量。高剂量组每日药量1.10克/猴，低剂量组每日药量0.35克/猴，配成水溶液混悬剂15ml，每日1次给药。连续给药8周，中间不间断。模型对照组为不治疗组。所有观察指标试验组与对照组相同。停药后观察8周，观测指标项目和采样点(见表2)。

表2 治疗SIV慢性感染猴的指标项目和采样点

注：“√”即为采样点。治疗前即感染SIV215后70天，治疗后8周即126天，治疗后16周(停药后8周)即182天。

(2)检查方法

血常规：用瑞典AC920^EO全自动分析仪测定。由广东省灵长类试验中心，广东省药品非临床安全性研究中心肇庆分部检查。

CD₃ ⁺、CD₄ ⁺淋巴细胞亚群：CD₃ ⁺单克隆抗体(PE标记)CD₄ ⁺单克隆抗体(FITC标记)购自BD公司，操作步骤按说明书进行，流式细胞分析仪测定CD₃ ⁺、CD₄ ⁺淋巴细胞比例并结合血常规淋巴细胞计数计算CD₃ ⁺、CD₄ ⁺绝对值。

血浆病毒载量：动物感染SIV后按采样点要求采血，EDTA抗凝，离心取血浆冻存。由法国巴黎第五大学肿瘤学和病毒学试验室卢葳教授合作试验室测定。

IgG抗体测定：血浆标本作系列2～4倍稀释，滴加于自制的SIV感染的CEMx174细胞涂片上，常规操作，再滴加抗猴IgG荧光抗体(购自美国EYLABORATORIES，INC.)荧光显微镜下观察结果，以最高稀释度血浆出现阳性为该标本的抗体滴度。

淋巴结活检：感染后83天无菌手术取一侧腹股沟淋巴结，治疗结束及观察8周后再取另一侧腹股沟及一侧腋下淋巴结，固定于10％中性甲醛液，石蜡包埋，H.E染色后光镜观察病理形态学。

(3)试验结果

①一般情况

试验猴采用SIVmac251感染83天的恒河猴，血浆病毒载量已降至调定点(setpoint)，即平台期。虽然由于存在个体差异，各试验动物到达平台期的病毒载量水平并不相同，但在此后较长的一段时间，各猴的病毒载量水平均维持于一个相对稳定的水平，其对数(log10)的波动范围一般<0.5。试验过程中SIV感染后各猴的一般情况尚好，精神好，食欲尚佳，在试验方案设定的观察时间内治疗前后各动物体重变化差异无显著意义(见表3)。

表3 治疗前后体重变化(Kg)

②血液学检查

治疗前后血液学检查，各组间淋巴细胞数量变化见表4、5和图2、3。各动物在感染SIVmac25183天(治疗前)时检测淋巴细胞数量均有所下降(216猴上升)，但经给药治疗后均有回升，其中高剂量组在治疗后4周淋巴细胞上升明显，以后各组均维持于高于治疗前的水平。治疗组与对照组的淋巴细胞数量的变化曲线基本相似。治疗前后白细胞数量的变化与淋巴细胞数量变化基本相似。

表4 WBC数量变化(个/μl)

表5 淋巴细胞数量(个/ul)变化

③免疫学检查

治疗组和对照组在治疗前(病毒感染83天)CD4+细胞数量出现下降。但经过8周(感染后139天)及16周(感染后195天)后，采血检测CD4+细胞数量有所恢复，两组比较差异无显著意义，(表6～7，图4)。治疗前后CD3+细胞数量变化：病毒感染83天，感染139天(治疗8周)，感染195天(停药后8周)(详见表8～9，图5)。

表6 CD₄ ⁺比率变化(％)

表7 CD₄ ⁺细胞数量变化(/μl)

表8 CD₃ ⁺比率变化(％)

表9 CD₃ ⁺细胞数量变化

④血浆荧光抗体测定

结果见表10，检测各猴治疗前(感染后83天)的血浆标本，均有不同程度的血浆抗体出现。给药4周(感染111天)，治疗组猴的抗体水平低剂量组223猴下降了2倍；高剂量组226猴下降了4倍；其余各猴则持平与治疗前或上升了2～4倍不等；SIV对照组4猴有2～4倍的上升。给药8周(感染139天)，所有动物较给药4周比较基本上都下降2～4倍。给药16周后(感染195天，停药8周)时，高剂量组226猴的荧光抗体水平较给药8周上升了2倍，但仍比治疗前低2倍；其余11只动物的荧光抗体水平均下降到整个试验过程的低值。但组间的差异无显著意义。

表10 治疗前后荧光抗体变化

⑤病毒学检查

病毒载量结果见表11～12，病毒载量变化曲线图见图6～9。

表11 治疗前后血浆病毒载量(copies/ml)

表12 治疗前后血浆病毒载量(log10copies/ml)

⑥淋巴结活检

1)治疗前(感染后83天)

低剂量组(0.35克/猴)：

#216淋巴结缩小，淋巴滤泡轻度减少，生发中心缩小，免疫母细胞固缩、凋亡，皮质减少，髓质增加。属于退变型。

#217淋巴滤泡略增加，生发中心缩小，免疫母细胞形态不一，成分裂状。属于增生—退变型，以退变为主。

#222皮质增厚，淋巴滤泡增生、增大明显，生发中心增大，免疫母细胞活跃，属于分裂状。属于增生型。

#223皮质略增加，淋巴滤泡略减少、缩小，生发中心略增大，免疫母细胞活跃。属于增生-退变型。

高剂量组(1.10克/猴)：

#224皮质略增加，淋巴滤泡减少、缩小，生发中心减少，免疫母细胞部分固缩。属于增生—退变型，以退变为主。

#225皮质略增加，淋巴滤泡增生、增大，生发中心增大，免疫母细胞活跃，属于分裂状，形态各异。属于增生型。

#226皮质增厚，淋巴滤泡增加、增大，生发中心增大，免疫母细胞活跃，属于分裂状。属于增生型。

#227皮质增厚，淋巴滤泡增大，增加，生发中心增大，免疫母细胞活跃，部分区域纤维增生，属于增生型。

SIV对照组：

#218皮质略增加，淋巴滤泡略增加，生发中心略增大，免疫母细胞活跃。属于增生型。

#219皮质减少，淋巴滤泡减少，生发中心缩小，免疫母细胞固缩、凋亡。属于退变型。

#220皮质略减少，淋巴滤泡减少、缩小。生发中心缩小，免疫母细胞活跃。属于增生——退变型。

#221皮质增厚，淋巴滤泡增加、增大，生发中心增大，免疫母细胞活跃，属于分裂状。属于增生型。

2)服药8周后(感染后139天)

低剂量组：(0.35克/猴)：

#216淋巴结略缩小，皮质增厚，淋巴滤泡增加，生发中心增大，免疫母细胞大部分活跃。属于增生—退变型。

#217皮质增厚，淋巴滤泡增加、增大，生发中心增大明显，免疫母细胞活跃。属于增生型。

#222皮质增厚，淋巴滤泡略增加、增大，生发中心增大，免疫母细胞活跃，属于分裂状。属于增生型。

#223皮质减少，淋巴滤泡减少、缩小。生发中心缩小、消失。属于退变型。

高剂量组(1.10克/猴)：

#224皮质减少，淋巴滤泡减少、缩小，生发中心缩小明显，免疫母细胞大部分固缩、凋亡。属于退变型。

#225淋巴滤泡略减少，生发中心略缩小，局部免疫母细胞活跃。属于增生—退变型。

#226皮质减少，淋巴滤泡减少、缩小，生发中心缩小明显，免疫母细胞大部分固缩、凋亡。属于退变型。

#227皮质增厚，淋巴滤泡略增加、增大，生发中心增大，免疫母细胞活跃。属于增生型。

SIV对照组：

#218皮质增厚，淋巴滤泡略减少、增大，生发中心增大，免疫母细胞活跃，属于分裂状。属于增生—退变型。

#219淋巴滤泡略缩小减少，生发中心略缩小，免疫母细胞活跃。属于增生—退变型。

#220皮质增厚，淋巴滤泡数目略减少、缩小、消失，生发中心略缩小。属于增生—退变型。以退变为主

#221皮质增厚，淋巴滤泡增加、增大，生发中心增大。属于增生型

3)停药8周后(感染后195天)

低剂量组(0.35克/猴)：

#216皮质略减少，淋巴滤泡略减少、缩少，生发中心略减少，小部分免疫母细胞固缩。属于增生—退变型。

#217皮质减少，淋巴滤泡数目减少，部分缩小，生发中心减少，略缩小。属于增生退变型。

#222皮质略减少，淋巴滤泡略增加、增大，生发中心增大，部分免疫母细胞活跃，部分免疫母细胞固缩、凋亡。属于增生型。

#223淋巴结缩小，淋巴滤泡缩小、减少，生发中心缩小，免疫母细胞固缩、凋亡。属于退变型。

高剂量组(1.10克/猴)：

#224皮质略减少，淋巴滤泡略缩小减少，生发中心略缩小，免疫母细胞活跃。属于增生—退变型。

#225淋巴滤泡略增加、增大，生发中心略增大，免疫母细胞活跃。属于增生型。

#226皮质略增加，淋巴滤泡略缩小减少，生发中心略缩小，免疫母细胞活跃。属于增生—退变型。

#227皮质增厚，淋巴滤泡增多，增大，生发中心增大，免疫母细胞活跃。属于增生型。

SIV对照组：

#218淋巴滤泡略缩小减少，生发中心略增大，免疫母细胞活跃。属于增生—退变型。

#219淋巴滤泡数目减少明显、缩小、消失，生发中心缩小，免疫母细胞大固缩、凋亡。属于退变型。

#220淋巴结缩小，皮质明显减少，淋巴滤泡略缩小减少，生发中心略缩小，免疫母细胞部分固缩、凋亡。属于退变型。

#221皮质略减少，淋巴滤泡缩小减少，生发中心缩小，部分免疫纤维增生。免疫母细胞固缩凋亡。属于退变型。

有关淋巴结SIV病变分型的涵义：

增生型：淋巴结受SIV病毒攻击后，淋巴滤泡和生发中心均属于增生和扩大。其内淋巴细胞和生发中心免疫母细胞活跃，付皮质增厚，髓窦网状细胞增加。有些药物也能激活上述细胞，使之增生。这是淋巴结接受抗原的早期反应。

退变型：淋巴结经过增生阶段，SIV病毒对淋巴细胞造成损害，淋巴细胞，特别是CD4+T淋巴细胞减少，滤泡变小，生发中心缩小，甚至消失，付皮质变薄。或有滤泡旁纤维组织增加，构成淋巴组织退化的改变。显示淋巴组织向不良方向转变。

耗竭型：淋巴结内淋巴滤泡和生发中心大部分消失，代以淋巴细胞或纤维化，甚者整个淋巴结的淋巴组织结构全部消失，称淋巴组织耗竭。组织形态学上显示机体已处于严重免疫缺损。

而增生—退变型、退变—耗竭型分别介于三者之间。

通过对3个组每例猴的淋巴结活检的病理检查，各组猴例的病理检查综合见表13。

表13 芩花治疗SIV感染猴淋巴结病变比较表

服“芩花”胶囊8周后，感染猴淋巴结变化：低剂量组有2只猴的淋巴结好转，1只持平，1只转坏；同期的病毒对照组，4只猴的淋巴结分别为2只持平，1只转好，1只转坏；而高剂量组有2只猴的淋巴结变化不大，为持平，另2只猴为转坏。停药后继续观察8周，对照组的猴淋巴结结构，4只均朝退变方向发展；低剂量组4只与停药时无明显变化，均为持平；高剂量组则3只转好，1只持平。治疗前后淋巴结结构变化的总体评价：对照组4只猴中除1只变化不大，为持平外，其余3只均逐渐转坏；低剂量组有1只猴转好，另1只猴转坏，余2只均为持平；高剂量组1只猴转坏，余3只猴均为持平。

6.2.2.3结论

①本次试验造模成功：(1)12只猴SIV感染后均能检测出病毒载量，于感染14天病毒载量出现高峰值，感染83天病毒载量逐渐下降，至调定点的平台期，然后处于较稳定的平台期，符合SIV感染的自然变化规律。(2)病毒感染后猴白细胞、淋巴细胞、CD4+细胞、CD3+细胞、荧光抗体均发生变化，说明SIV感染后猴体内发生一系列变化。

②试验结果显示，SIV感染后治疗组与SIV对照组比较，病毒载量的变化在统计学上无显著性差异。提示芩花对SIV感染猴模型的抗病毒作用不太显著。

③猴淋巴结活检显示：对照组猴随着病程的延长，其淋巴结结构逐渐转坏，符合SIV感染模型的自然病理变化规律；治疗组的低剂量组的效果较好，淋巴结组织结构并未随病程延长而变坏，而是朝着稳定甚至转好的方向发展；高剂量组停药时检查淋巴结，其结构略转差，但是停药后继续观察其淋巴结的变化，发现其结构逐步恢复、转好。提示芩花以低剂量组的效果最佳，该药对免疫系统具有一定的保护和重建作用。

④根据猴淋巴结的变化，可以认为芩花的低剂量组对SIV感染猴模型的免疫系统有一定的保护和重建作用，但是，从血液中CD4+细胞的变化来看，未能完全反映出该药的最大作用强度，这可能与试验观察的时间不够有关；由于整个试验周期为半年左右，SIV感染的猴子其病理变化尚未进入完全衰竭阶段，因此CD4+细胞变化不大，同样药物的作用也可能未得到充分的体现和发挥。

⑤本次试验提示：SIV感染猴对芩花低剂量组耐受良好，同时该剂量组具有一定的免疫保护和重建作用，值得进一步研究和探索。

7、急性毒性试验资料

7.1.试验材料

动物：昆明种小白鼠40只，雌雄各半，体重：20±2克。中国科学院遗传与发育生物学研究所试验动物中心SCXK2000-0006。

药品：芩花干膏粉(051115)，每克粉含生药1.588克，兰州和盛堂制药有限公司生产。艾复康胶囊临床用药剂量为3克生药/人/日。

7.2.试验方法及结果

选用上述动物40只，按体重、性别均分为给药组及空白对照组，试验前全部动物禁食不禁水12小时，试验当日，给药组动物灌胃给予25％芩花混悬液0.4ml/10g，对照组给予等量蒸馏水，6小时后按上述剂量重复给药一次，恢复动物正常进食。动物给药后即刻观察动物表现，可见给药组动物表现安静少动，但呼吸情况未见明显改变，约3小时后恢复正常，4小时后给药组动物大便较稀软，颜色加深，有明显药物排泄。动物继续正常饲养二周，无一死亡，进食、活动及体重增长正常，第三天排便也恢复正常，动物毛发色泽等外观也未见明显变化。试验前及试验期间称量动物体重。由表14可见，由于给药剂量过大，给药组动物体重较对照组略低，其中一周时雌性动物体重有较明显差异(主要是9号动物体重很低)，二周后恢复正常。

表14 动物体重增长情况(克)

与对照组比较:*P<0.05

动物给药剂量按如下公式换算：

0.4ml/10g×2×0.25×1.588×100g＝31.76g生药/kg

31.76g/kg÷3g/70kg＝741(倍)

7.3.结论：以上试验结果显示，给予小鼠艾复康胶囊31.67克生药/kg，相当于临床给药剂量的741倍，动物无一死亡，且对动物进食、活动及体重增长无明显不良影响，说明该药毒性很低，按临床剂量服用安全度很大。

8、长期毒性试验

8.1.试验材料

药品：芩花干膏粉(051115)，每克粉含生药1.588克，兰州和盛堂制药有限公司制造。生产。临床用药剂量为3克生药/人日。

试剂：转肽酶(GGT)、氯离子浓度(Cl-)、钠离子浓度(Na+)、钾离子浓度(K+)、硷性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、

总胆红素(BIT)试剂盒，均由中生北控生物科技股份有限公司提供。

动物：Wistar大白鼠160只，雌雄各半，体重100±20克，北京维通利华试验动物技术有限公司SCXK(京)2002-0003。二级动物室正常饮食饲养。

8.2.主要试验仪器：

OLYMPUS 640自动生化分析仪(日本)；

Sysmex SE9000血液球仪(日本)；

OLYMPUS BH2光学显微镜(日本)。

8.3.试验方法

取大白鼠160只，雌雄各半，体重100±20克，试验分为四组，每组动物40只，给药剂量及分组情况如下：给药大剂量组：25％芩花混悬液1.5ml/100g体重；中剂量组：12.5％芩花混悬液1.5ml/100g体重；小剂量组：6.25％芩花混悬1.5ml/100g体重，一个月后一天给药两次，给药间隔6小时，空白对照组给等量蒸馏水。给药剂量分别为：大剂量组：5.955g生药/kg、中剂量组：2.978g生药/kg、小剂量组：1.489g生药/kg，分别相当于临床给药剂量的药8.8、69.4、34.7倍。均采用灌胃给药方式，连续给药6个月，每周称量动物体重一次，并记录动物进食情况，根据体重变化每周调整给药量，正常对照组给等量蒸馏水。于给药3个月时，每组取动物10只，进行血液学常规检查、血液生化检查及主要器官病理学检查。于给药6个月时，每组取20只动物进行上述同样检查。余下动物不给药，继续正常饲养四周，处死，重复上述检查。

所有数据均采用SPSS统计软件进行多组T检验统计。

8.4.试验结果

8.4.1艾复康胶囊对动物生长及进食的影响

试验期间动物健康存活(个别动物因给药不慎导致死亡除外)，给药组动物可见明显药物排泄，其它动物外观及活动未见明显改变。试验期间每周称量动物体重一次，并记录动物进食情况，结果见表15～表28。

表15 艾复康胶囊对雄性大鼠体重的影响(g)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表16 艾复康胶囊对雄性大鼠体重的影响(g)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表17 艾复康胶囊对雄性大鼠体重的影响(g)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表18 艾复康胶囊对雄性大鼠体重的影响(g)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表19 艾复康胶囊对雌性大鼠体重的影响(g)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表20 艾复康胶囊对雌性大鼠体重的影响(g)(续1)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表21 艾复康胶囊对雌性大鼠体重的影响(g)(续2)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表22 艾复康胶囊对雌性大鼠体重的影响(g)(续3)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表23 艾复康胶囊对雄性大鼠进食的影响(克/只日)

表24 艾复康胶囊对雄性大鼠进食的影响(克/只日)(续1)

表25 艾复康胶囊对雄性大鼠进食的影响(克/只日)(续2)

表26 艾复康胶囊对雌性大鼠进食的影响(克/只日)

表27 艾复康胶囊对雌性大鼠进食的影响(克/只日)(续1)

表28 艾复康胶囊对雌性大鼠进食的影响(克/只日)(续2)

试验期间动物均健康存活(个别动物因给药不慎导致死亡除外)，给药组动物大便较稀软，可见明显药物排泄，其它动物外观及活动未见明显改变。由表1～4可见，在试验期间，各给药组动物每日进食量较空白对照组无明显差异。各给药组动物体重正常增长，与空白对照组比较无显著性差异，说明艾复康胶囊长期应用对动物进食及正常生长发育无明显影响。

8.4.2艾复康胶囊对大鼠血液学的影响

于给药3个月时，每组取动物10只，给药6个月时，每组取20只动物，余下动物不给药，继续正常饲养1个月后，处死，取静脉血进行血液学常规检查，检查项目：白血球计数(WBC)、中性粒细胞比率(NEUT％)、淋巴细胞比率(LYMPH％)、单核细胞比率(MONO％)、嗜酸细胞比率(EO％)、嗜硷细胞比率(BASO％)、中性粒细胞计数(NEUT)、淋巴细胞计数(LYMPH)、单核细胞计数(MONO)、中性粒细胞计数(NEUT)、嗜酸细胞计数(EO)、嗜硷细胞计数(BASO)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白量浓度g/L、血小板计数(PLT)、网织红细胞计数(RET)、凝血时间。

表29 艾复康胶囊对大鼠血液学的影响(3个月)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表30 艾复康胶囊对大鼠血液学的影响(3个月)(续)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表31 艾复康胶囊对大鼠血液学的影响(6个月)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表32 艾复康胶囊对大鼠血液学的影响(6个月)(续)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表33 艾复康胶囊对大鼠血液学的影响(恢复期)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表34 艾复康胶囊对大鼠血液学的影响(恢复期)(续)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

在不同试验期间，各给药组动物白细胞及白细胞分类、红细胞及红细胞压积、血红蛋白含量、血小板、网质红细胞和全血凝血时间与空白对照组比较均无显著差异，且均在正常范围内，提示艾复康胶囊长期服用对血液系统无明显不良影响。

8.4.3艾复康胶囊对大鼠血液生化学的影响

于给药45天时，每组取动物10只，给药90天时，每组取20只动物，余下动物不给药，继续正常饲养两周后处死，取静脉血进行血液生化学检查，检查项目：转肽酶(GGT)、氯离子浓度(Cl^-)、钠离子浓度(Na⁺)、钾离子浓度(K⁺)、硷性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、总胆红素(BIT)。

表35 艾复康胶囊对大鼠血液生化学的影响(3个月)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01(以下同)

表36 艾复康胶囊对大鼠血液生化学的影响(3个月)(续)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表37 艾复康胶囊对大鼠血液生化学的影响(6个月)

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表38 艾复康胶囊对大鼠血液生化学的影响(6个月)(续)

与对照组比较:*P<0.05**P<0.01

表39 艾复康胶囊对大鼠血液生化学的影响(恢复期)

与对照组比较:*P<0.05**P<0.01

表40 艾复康胶囊对大鼠血液生化学的影响(恢复期)(续)

与对照组比较:*P<0.05**P<0.01

给药三个月、六个月及恢复期所有动物血液生化检查均未见明显不良反应。给药大、中、小剂量组动物肝肾功能及糖脂代谢与空白对照组比较也未见不良影响，提示艾复康胶囊对肝肾功能及糖脂代谢无明显不良影响。

8.4.4艾复康胶囊对大鼠主要脏器的影响

于给药3个月时，每组取动物10只，给药6个月时，每组取20只动物，余下动物不给药，继续正常饲养4周后，处死，取心、肺、肝、脾、肾上腺、肾、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢、胸腺、垂体、脑、消化道等主要器官进行病理检查，主要器官脏器系数结果见表11、12、药。

表41 艾复康胶囊对大鼠主要器官脏器系数的影响(g/kg)(3个月)

与对照组比较:*P<0.05**P<0.01

表42 艾复康胶囊对大鼠主要器官脏器系数的影响(g/kg)(3个月)(续)

与对照组比较:*P<0.05**P<0.01

表43 艾复康胶囊对大鼠主要器官脏器系数的影响(g/kg)(6个月)

与对照组比较:*P<0.05**P<0.01

表44 艾复康胶囊对大鼠主要器官脏器系数的影响(g/kg)(6个月)(续)

与对照组比较:*P<0.05**P<0.01

表45 药 艾复康胶囊对大鼠主要器官脏器系数的影响(g/kg)(恢复期)

与对照组比较:*P<0.05**P<0.01

表46 艾复康胶囊对大鼠主要器官脏器系数的影响(g/kg)(恢复期)(续)

与对照组比较:*P<0.05**P<0.01

给药三个月时，给药各剂量组动物肝和肾脏器指数较明显高于空白对照组，由于药物主要在肝脏代谢，本试验给药剂量很大，可能刺激肝脏代偿性的生长；其它器官指数与对照组比较无明显差异。

肉眼观察结果：

所有试验动物解剖时可见：心未见明显异常；肝表面光滑，硬度、色泽均未见异常，切开断面无明显异常；肺大小、色泽正常，未见瘀血、出血点；脾色泽正常，未见增大，未见异常；胃未见明显异常；肾表面光滑，大小、硬度、色泽均未见异常；动物睾丸大小、硬度正常；子宫及卵巢位置、大小、形状未见异常；其余脏器如脑、十二指肠及各腺体等均未见明显异常。

以上各脏器组织用10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，根据《中药天然药物长期毒性研究技术指导原则》，先对大剂量组和对照组的器官和组织进行病理学检查。光镜下观察结果如下(主要脏器病理观察结果及病理照片见附件一、二)：

①各期大剂量组大鼠各脏器形态学所见与对照组相似；

②未见由中毒导致的实质脏器组织变质性改变及炎性反应；

③免疫系统形态学正常。

综合以上结果艾复康胶囊长期应用对主要器官无明显不良影响。

8.5.小结

艾复康胶囊主要由黄芩、金银花、两面针、雷公藤、秦皮、虎杖等药味中药组成，临床用于治疗艾滋病。本试验主要考察芩花长期应用对大鼠主要器官、血液及血液生化的影响。给药剂量如下：大剂量组：5.955g生药/kg；中剂量组：2.978g生药/kg；小剂量组：1.489g生药/kg，分别相当于临床给药剂量的药8.8、69.4、34.7倍，正常对照组给等量蒸馏水。采用灌胃给药方式。综合以上试验结果如下：

①试验期间动物均健康存活(个别动物因给药不慎导致死亡除外)，给药组动物大便较稀软，可见明显药物排泄，其它动物外观及活动未见明显改变；

②试验期间动物进食基本正常，体重增长正常，说明该药长期应用对动物正常生长发育无明显影响；

③血液学常规检查及血液生化检查结果显示，该药对血液系统、肝肾功能及糖脂代谢无明显不良影响；

④主要脏器病理学检查结果可见对照组及给药组大鼠主要脏器形态学所见相似，各脏器未见由中毒导致的变质性病理变化及中毒性炎性反应；免疫系统形态学正常。

综合上述试验结果，艾复康胶囊长期应用无明显毒副作用，按临床剂量服用安全可靠。

9、临床试验资料综述

9.1研究方案

1)试验目的：评价“艾复康胶囊”增强HIV感染者机体免疫功能的作用和临床使用的安全性。

2)观察指标：疗效指标：CD4+细胞计数、HIV病毒载量(对数)、临床症状总评分、患者报告的临床结局评价、中医辨证、体重。安全性指标：一般项目检查、血尿常规、肝功能、肾功能及不良事件记录。

3)试验总体设计：采用随机双盲、安慰剂对照、多中心研究方法。试验期为24周。计划观察198例。艾复康胶囊组与安慰剂对照组的比例为2:1。

4)试验人群：年龄在18到60岁之间、经临床确诊为HIV感染且愿意参加临床试验者，入选为本发明的受试者。统计学上采用全分析集FAS、PP数据集和安全性分析数据集进行人群分析。

5)诊断标准

按照我国卫生部2005年国家《艾滋病诊疗指南》的诊断标准，参考《中医药治疗艾滋病临床技术方案(试行)》、1993年美国疾病控制中心修订的HIV感染分类和AIDS诊断标准，将艾滋病的全过程分为急性期、无症状期和艾滋病期。艾滋病诊断标准如下：

(一)急性期

诊断标准：病人近期内有流行病学史和临床表现，结合试验室HIV抗体由阴性转为阳性即可诊断，或仅试验室检查HIV抗体由阴性转为阳性即可诊断。

(二)无症状期

诊断标准：有流行病学史，结合HIV抗体阳性即可诊断，或仅试验室检查HIV抗体阳性即可诊断。

(三)艾滋病期

(1)原因不明的持续不规则发热38℃以上，＞1个月；

(2)慢性腹泻次数多于3次/日，＞1个月；

(3)6个月之内体重下降10％以上；

(4)反复发作的口腔白念珠菌感染；

(5)反复发作的单纯疱疹病毒感染或带状疱疹病毒感染；

(6)肺孢子虫肺炎(PCP)；

(7)反复发生的细菌性肺炎；

(8)活动性结核或非结核分支杆菌病；

(9)深部真菌感染；

(10)中枢神经系统占位性病变；

中青年人出现痴呆；

活动性巨细胞病毒感染；

弓形虫脑病；

青霉菌感染；

反复发生的败血症；

皮肤粘膜或内脏的卡波氏肉瘤、淋巴瘤。

诊断标准：有流行病学史、试验室检查HIV抗体阳性，加上述各项中的任何一项，即可诊为艾滋病。或者HIV抗体阳性，而CD4+T淋巴细胞数＜200/mm3，也可诊断为艾滋病。

6)入选标准

(1)有艾滋病流行病史，并经AIDS确证试验(W.B)确诊或持有相关医疗证；

(2)年龄≥18岁，≤60岁，男女均可；

(3)CD4+≥250cells/μl，≤500cells/μl；

(4)HIV病毒载量≥2000copys/ml；

(5)试验治疗前6月内未经其他抗艾滋病药物治疗；

(6)自愿签署知情同意书并接受本试验药物治疗的患者。

7)排除标准

(1)急性感染期的患者；

(2)有严重的机会性感染和机会性肿瘤患者；

(3)以前接受过抗HIV治疗(西药)，停药未超过6个月的患者或正接受其它抗HIV药物治疗的患者；

(4)进入本发明前3个月内曾参加其它药物临床试验者；

(5)转氨酶≥正常值上限4倍、总胆红素≥正常值上限1.5倍、肌酐＞正常值者；

(6)患有严重的精神及神经疾病；

(7)过敏体质者；

(8)孕妇或哺乳期妇女；

(9)有酗酒史，不能终止酗酒者；

(10)研究者认为不适合参加本发明者。

(11)现吸毒或既往有吸毒史者

8)评价指标：

疗效指标：治疗24周的CD4+细胞、HIV病毒载量(对数)、临床症状评分、患者报告的临床结局(PRO)评分、体重的变化。

安全性指标：临床安全性评估(不良事件情况评价)、试验室安全性评估(血尿常规、肝肾功能、心电图、胸部X片、腹部B超检查)。

9)统计分析方法：

所有的统计检验均采用双侧检验，P值小于或等于0.05将被认为所检验的差别有统计学意义。

不同艾复康胶囊组各次就诊的计量资料将采用均数±标准差进行统计描述。与筛选期基础值进行比较，采用配对t检验比较组内前后差异。两组治疗前后的变化采用方差分析(ANOVA)和Wilcoxon秩和检验进行比较。

不同艾复康胶囊组各次就诊的计数资料采用频数(构成比)进行统计描述。两组治疗前后的变化采用χ2检验或非参数检验。

脱落分析：两组总脱落率和由于不良事件而脱落的比较将采用χ2检验。

基础值的均衡性分析：采用方差分析或χ2检验来比较人口学资料和其它基础值指标，以衡量两组均衡性如何。

有效性分析：

主要疗效指标：对有效率进行统计描述，计算例数和百分数，在α＝0.05检验水准下，采用按中心分层的CMH-χ2检验对两组进行比较。计算试验组和对照组有效率差值的95％可信区间，并根据可信区间进行优效性判断。描述每次访视(4周、12周、24周)CD4+细胞数量，计算例数、均数、标准差、中位数、最小值、最大值。采用以基线为协变量、考虑中心和分组作用的协方差分析模型对两组进行比较。以此模型为基础，还将分别计算两组治疗前后变化值及其差值的95％可信区间。

次要疗效指标：HIV病毒载量对数值变化的有效率分析并采用按中心分层的CMH-χ2分析方法对两组进行有效性比较，并计算两组率差的95％可信区间。

临床症状得分、HIV病毒载量对数变换值、PRO量表得分的分析，采用与一般计量资料统计方法进行分析。

安全性分析：χ2检验采用比较两组不良事件发生率，并列表描述本次试验所发生的不良事件；试验室检验结果在试验前后正常/异常的变化情况以及发生异常改变时与试验药物的关系。

10)给药方案：

艾复康胶囊组：艾复康胶囊，口服，每次4粒，每日3次。

对照组：艾复康胶囊模拟剂(1/10剂量的艾复康胶囊及9/10剂量淀粉)，口服，每次4粒，每日3次。

9.2研究结果

1)病例分布

本发明共入组患者198例，其中对照组66例、试验组132例。根据数据审核会议讨论决定，对研究人群进行划分，198例受试者均使用了研究药物并进行了至少一次有效性评价，进入FAS人群，两组分别为132和66例；

根据数据盲态审核会议决定，177例受试者进入PPS人群，艾复康胶囊组118例，脱落/剔除14例，安慰剂对照组59例，脱落/剔除7例。

基线时两组受试者的年龄、性别、身高、体重、常规体检、治疗药物及其它治疗手段、药物过敏史、目前患有疾病、HIV感染病程，经检验P值大于0.05，两组之间没有明显差异，两组收缩压具有统计学差异，但没有生物学意义。既往治疗情况在两组间有统计学差异，但基本上与本次试验用药无关，说明两组人口学情况具有可比性。

2)基线可比性结果分析

两组受试者在人口学特征、病史等方面的差异无统计学意义，基线时的两组间主要疗效、次要疗效指标比较差异均无统计学意义。两组受试者基线情况具有可比性。

各组治疗结果

表47 不同治疗方式下各疗效状态评分现状(±S)

变量

满分

服抗病毒药

单服艾复康

同时服用

间断服用艾复康

F

P

艾复康疗效评价

4

3.42±0.65

3.88±0.33

3.62±0.64

3.77±0.42

3.073

0.029

对肝肾功能影响

3

2.00±0.35

1.94±0.24

2.03±0.34

2.00±0.34

0.385

0.764

是否还想继续服用艾复康

3

3.00±0.00

3.00±0.00

3.00±0.00

3.00±0.00

-

-

现在身体状态

4

2.16±0.90

3.41±0.71

2.85±0.89

3.00±1.00

11.593

<0.05

生活质量

4

3.18±1.19

3.00±0.79

3.40±0.92

3.00±1.15

1.411

0.241

对以后生活的信心

3

2.96±0.18

3.94±0.24

3.86±0.56

3.89±0.45

58.015

<0.05

有效性结果

主要疗效指标

FAS人群中，24周时CD4+细胞计数艾复康胶囊组较基线上升107.3cells/μl，安慰剂组较基线下降8.18cells/μl，经t检验有统计学意义(P＜0.001)。两组前后变化率比较采用Wilcoxon秩和检验与t检验结果一致。PPS与FAS结果一致。24周时两组的免疫功能有效率艾复康胶囊组80.30％，安慰剂对照组24.24％，艾复康胶囊组的有效率明显优于安慰剂对照组(P＜0.001)，PPS与FAS结果一致。结果表明艾复康胶囊能明显提高受试者的免疫功能。

次要疗效指标

24周时临床症状方面，FAS人群中，艾复康胶囊组可明显改善受试者的临床症状，而安慰剂对照组对受试者症状的改善作用不明显，两组比较有明显差异。结果表明艾复康胶囊能明显改善受试者的临床症状。PPS与FAS结果一致。24周时受试者的体重，艾复康胶囊组比安慰剂组有明显增加，两组差异有统计学意义，PPS与FAS结果一致。结果表明艾复康胶囊对HIV感染者的体质有改善作用，能明显增加受试者体重。24周时病毒载量的有效率，FAS人群中，艾复康胶囊组的有效率为14.63％，安慰剂对照组的有效率为16.13％，两组差异无统计学意义，PPS与FAS结果一致。结果表明艾复康胶囊对HIV病毒复制无抑制作用。24周时PRO量表，艾复康胶囊组与基线相比有统计学意义，安慰剂对照组与基线比较无统计学意义，情志、能力组间比较无明显差异，身体组间比较差异显著。PPS与FAS结果一致。结果表明艾复康胶囊对HIV感染者临床上有明显的改善作用。结合中医辩证及症状和pro量表评分，从艾复康胶囊组和安慰剂组24周症状比较，疲劳不适、食欲减退、皮疹、头痛、失眠五个症状艾复康胶囊组与安慰剂组积分下降相比较都有显著差异(P＜0.001)；舌象、脉象好转，舌苔由厚到薄，腻苔从有到无，均提示病情减轻。芩花解毒功能主治：清热解毒，健脾温肾，活血止痛；主治以热毒内蕴，瘀阻血脉为主的艾滋病患者，从试验结果看，芩花解毒临床定位准确，能缓解或消除患者的上述主要症状，提高生存质量。

安全性结果

整个临床试验过程中未发现本试验药品对受试者存在有明显的安全性问题和不良反应。试验室检查在治疗前后无明显变化。

9.3.综合分析与评价

艾复康胶囊是6.1类中药新药，2009年获得国家准予临床试验的批件，本药物功能定位为清热解毒，健脾温肾，活血止痛，主治以热毒内蕴，瘀阻血脉为主的艾滋病患者。艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起，其传染性强，病死率高，全球每年新增HIV感染者高达270万，给病人带来巨大身心伤害、加重社会经济负担并加剧社会不稳定性。由于目前西药治疗艾滋病副作用较大，成为艾复康胶囊研发并开展临床试验的出发点。艾滋病的传播方式、流行情况、发病特点及临床表现等与中医病症如“瘟疫”、“虚劳”、“伏气温病”等有相似之处，而这种相关性恰为中医药治疗艾滋病提供了理论依据和诊治经验。中药对艾滋病的治疗主要通过阶段性地提高和稳定艾滋病患者的免疫功能，改善症状体征，提高生存质量的途径增强患者自身的抗HIV能力，但目前艾滋病治疗的疗效评价标准均根据西药的作用特点而制定，主要评价标准包括：1、病毒学指标：对于应用HAART方案治疗的患者，大多数患者血浆中病毒载量的水平4周内应下降1个log以上，在治疗后的3-6个月，病毒载量应检测不到；2、免疫学指标：经HAART治疗3个月后，CD4+T淋巴细胞计数与治疗前相比增加了30％，即提示治疗有效，或在治疗第一年后CD4+T淋巴细胞计数增长100个/mm3，提示治疗有效；3、临床症状：当治疗有效时，临床症状能够缓解，机会性感染的发病率和艾滋病的死亡率可以大大降低。由于中药治疗艾滋病目前尚无公认的评价标准，因此本试验的评价标准主要根据目前已上市的中药“唐草片”的临床试验设计方案而制定，主要疗效指标为观察受试者免疫功能改善情况，次要疗效指标为观察受试者HIV载量、症状、体质等的改善情况，主要疗效指标评价标准为CD4+T细胞计数上升幅度≥30％或数量上升≥50/ul为有效；CD4+T细胞计数上升幅度＜30％或数量上升＜50/ul为无效，次要疗效指标HIV载量的评价标准为HIV RNA拷贝数上升≥0.5log/ml为“有效”，HIV RNA拷贝数上升＜0.5log10/ml为“无效”。

9.3.1质量可控性

本试验整个过程严格按照GCP和研究方案的要求开展，试验开始前制定了严格的时间计划及人员职责分工，试验过程中建立了每例受试者的随访档案，按照预计时间提前通知受试者。申办者、研究中心、统计中心及监查公司均按照职责的分工严格参与到试验的相应步骤。为了进一步控制试验质量，申办者与北京地坛医院试验室签订了相关协议，委托北京地坛医院试验室对本试验初筛合格的受试者及完成24周访视的受试者的血浆标本进行HARRT药物血药浓度的检测。对检测结果中含有HARRT药物成分的受试者不予以入组及在盲态审核会上予以剔除。从而进一步保证了受试者的依从性及本发明数据的真实、客观性。

由于整个试验严格的质量控制与管理，受试者依从性良好，试验过程中因各种原因脱落的受试者仅13例，脱落率仅6.6％(13/198)，多数脱落原因(6/13＝46％)为中途受试者搬迁或路途不便而非药物原因。后期经药物浓度检测查出试验中服用西药的受试者仅7例，因合并用药中有违禁药物的受试者仅1例，并在数据审核会上讨论予以剔除，剔除率仅4.0％(8/198)。绝大多数的受试者在访视窗内严格按照医生要求完成随访，并带回剩余试验药物，超过访视窗的情况仅39例次，仅占总访视例次的6.6％(39/198*3＝6.6％)，且超窗时间均较短，服药依从性均在80％～120％之间。所有进行回访的受试者相应访视点的随访问诊、化验检查、标本留取均完成，无缺漏情况发生，受试者回访过程无任何安全事故发生。

9.3.2有效性

试验结果显示，有效性的几项观察指标(共5项：CD4+、HIV载量、症状评分、体质量表评分、体重)，除HIV载量外艾复康胶囊组均明显优于安慰剂组，其中主要疗效指标CD4+细胞计数，有效率及上升个数或百分比各次访视均呈明显上升趋势，第24周较基线平均上升107.3cells/μl，有效率达80.30％，而安慰剂组呈下降趋势，第24周较基线平均下降8.18cells/μl，有效率为24.24％。参照艾滋病抗病毒治疗指导原则结合受试者的个人意愿，本试验要求入组受试者的CD4+为250～500cells/μl之间，两组受试者入组时CD4+平均值分别为352cells/μl和362cells/μl，最大值最小值区间均为250～495cells/μl之间，而治疗24周后，按照目前以CD4+超过500cells/μl为HIV/AIDS抗病毒的一个分界线(《HIV/AIDs抗病毒治疗手册》第三版)，比较两组CD4+值治疗后>500cells/μl的人数，安慰剂组为7.58％，而艾复康胶囊组达到43.18％，艾复康胶囊组明显优于安慰剂组。

临床症状总分变化，两组受试者各时间点和基线相比均下降且都有统计学意义，24周艾复康胶囊组对疲劳不适、食欲减退、腹泻、头痛、皮疹、失眠症状的改善作用均明显优于安慰剂组。从PRO量表分析来看，艾复康胶囊组受试者体质的改善也明显优于安慰剂组。

HIV载量有效性随着用药时间的延长两组均逐渐提高，艾复康胶囊组12周的有效率为8.66％，24周有效率为14.63％，安慰剂对照组12周的有效率为15.87％，24周有效率为16.13％；但两组内及组间的差异均无统计学意义。说明艾复康胶囊对HIV载量的抑制作用不明显。

体重变化，两组受试者治疗过程中，自身前后对比，安慰剂组无明显变化而艾复康胶囊组体重变化逐渐增加，第24周时艾复康胶囊组体重较基线平均增加1.89kg，安慰剂组仅增加0.96kg，艾复康胶囊组体重较安慰剂组增加明显。

另外，艾复康胶囊作为中药复方，定位为清热解毒，健脾温肾，活血止痛，主治以热毒内蕴，瘀阻血脉为主的艾滋病患者，临床研究需要从中医的角度进行试验结果的分析。由于我国目前有艾滋病专业的药物研究机构多为西医医院，而本试验的三家研究中心均为西医医院，为了配合中药新药的研究，各研究中心均安排了专门的中医医生在每次受试者回访时进行的中医问诊和辨证。中医认为艾滋病是艾滋病是由于感受疫毒之邪引起的温疫和全身慢性进行性虚损性病变，病机“一方面是热毒浊瘀、邪阻三焦；另一方面是疫毒导致气阴两伤、命元虚损甚至衰竭。”治疗应从扶正固本祛邪入手。感染瘟疫之邪，日久耗气伤阴，首先表现为脾气虚弱，逐渐发展为脾肾两虚，出现神疲乏力、疲劳不适、食少纳呆等艾滋病常见症状；痰浊湿毒贯穿疾病始终，上蒙清窍则见头痛，外发肌肤则见皮疹等。通过治疗前后患者症状评分、体质评分、舌象、脉象的变化情况分析，艾复康胶囊组较安慰剂组疲劳不适，食欲差，头痛等情况明显改善，舌象、脉象好转，舌苔由厚到薄，腻苔从有到无，均提示病情减轻，可见芩花解毒功能主治“清热解毒，健脾温肾，活血止痛”的定位是准确的。由于艾滋病常见中医辨证的证型较多，且情况比较复杂，从统计角度难于分析，因此本试验主要对治疗前与治疗24周后两组受试者不同证型的有效率(CD4+较基线上升>30％或>50个/ul的人数比率)进行了比较，结果艾复康胶囊组对于艾滋病病人所涉及到的多数证型均疗效显著，而安慰剂组对于相应证型则疗效不明显，可见芩花解毒主治以热毒内蕴，瘀阻血脉为主的艾滋病患者的定位准确。

9.3.3安全性

艾复康胶囊由黄芩、金银花、雷公藤、两面针、秦皮、虎杖、制附子、当归、大黄、冰片、甘草等十三味中药组成，其中雷公藤、制附子在处方中虽然含量很少，但均为《中华人民共和国药典》2010年版收载的“有毒”中药，虽然已经过炮制，并通过中药复方的君臣佐使配伍关系，可以减弱相关毒性，但试验过程中仍然特别注意观察了药物的安全性，未见受试者有与药物相关的临床不适发生，根据试验安全性结果，艾复康胶囊组不良事件总发生率为34.09％，其中相关不良事件发生率仅为0.76％，无严重不良事件发生，安慰剂对照组不良事件发生率为40.91％，其中相关不良事件发生率为1.52％，两组均无导致脱落的不良事件发生。艾复康胶囊组的不良事件发生率低于安慰剂组。治疗前后对受试者进行肝功能、肾功能、血常规、心电图等检查，发现艾复康胶囊对心、肝、肾功能无明显影响。表明艾复康胶囊临床试验具有很好的安全性。

9.3.4初步结论

艾复康胶囊治疗HIV/AIDS者总疗程24周后统计结果显示，能明显提高受试者CD4+细胞数量及CD4+/CD8+的比值，稳定病情，阻止疾病进展，显著提高免疫力；能明显改善病人乏力、食欲减退、腹泻、头痛、皮疹、失眠等不适症状，增强病人体质，增加病人体重，改善病人生活质量；中医方面，该药功用“清热解毒，健脾温肾，活血止痛”及主治以热毒内蕴，瘀阻血脉为主的艾滋病患者定位准确。该药物服用方便，服用后受试者不良反应少，依从性良好，受试者服药后偶见轻度胃肠道反应，一般不需要停药可自行缓解，未见其他明显不良反应，具有较好的安全性。

10、综合结论与评价

总结以上研究工作，艾复康胶囊具有清热解毒，健脾温肾，活血止痛。用于HIV/AIDS者，症见乏力，食欲减退，腹泻、头痛、失眠、皮疹、低热、消瘦，口疮、脱发等。有明显提高CD4+细胞数量及CD4+/CD8+比值，提高或稳定免疫功能的作用。艾复康胶囊是以传统的中医药学理论和经验为依据，并经现代药学试验证明制备工艺成熟，质量标准可行，制剂稳定，长期口服无毒。通过临床试验证明能明显提高受试者CD4+细胞数量及CD4+/CD8+的比值，稳定病情，阻止疾病进展，显著提高免疫力；能明显改善病人乏力、食欲减退、腹泻、头痛、皮疹、失眠等不适症状，增强病人体质，增加病人体重，改善病人生活质量；中医方面，该药功用“清热解毒，健脾温肾，活血止痛”及主治以热毒内蕴，瘀阻血脉为主的艾滋病患者定位准确。该药物服用方便，服用后受试者不良反应少，依从性良好，受试者服药后偶见轻度胃肠道反应，一般不需要停药可自行缓解，未见其他明显不良反应，具有较好的安全性。

上述工作符合《药品注册管理办法》(局令第28号)：〈中药、天然药物注册分类及申报资料要求〉对中药、天然药物注册分类6.1项品种申请新药证书和药品批准文号的注册要求。因此，特向国家食品药品监督管理局申请艾复康胶囊新药证书和药品批准文号。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种艾滋病辅助治疗药物，其特征在于，所述艾滋病辅助治疗药物由黄芩16.3g、金银花16.3g、雷公藤16.3g、虎杖16.3g、大黄3.3g、两面针8.2g、制附子4.9g、当归8.2g、白胡椒3.3g、秦皮6.5g、五倍子7.3g、冰片2.5g和甘草6.5g组成。

2.一种如权利要求1所述的艾滋病辅助治疗药物的制备方法，其特征在于，所述艾滋病辅助治疗药物制备方法包括以下步骤：

步骤一，取制附子4.9g先煎2小时后，加入除黄芩、冰片外其余药味，加水煎煮，待沸腾后加入黄芩，煎煮三次，每次加水10倍量，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.28～1.32，50℃的清膏，减压干燥，粉碎成细粉；

步骤二，取倍他环糊精加入20％乙醇3倍量，搅拌调成糊状；

步骤三，取冰片2.5g用10倍量95％乙醇溶解，在搅拌状态下缓缓加入上述倍他环糊精糊状物中，用胶体磨反复研磨30分钟，取研磨后的糊状物，冷风吹至近干，在35℃～40℃的温度下干燥，粉碎制细粉；

步骤四，取冰片-倍他环糊精包合物与上述干膏细粉及适量羧甲淀粉钠，混匀，制成颗粒，60℃以下干燥，40目筛整粒，装入胶囊，制成1000粒。

3.如权利要求2所述的艾滋病辅助治疗药物制备方法，其特征在于，倍他环糊精糊状物为：冰片:倍他环糊精＝1:4。

4.如权利要求2所述的艾滋病辅助治疗药物制备方法，其特征在于，用胶体磨反复研磨，研磨间隙5μm。