CN104349784A - 动物饲料组合物及使用其的方法 - Google Patents

Abstract

动物的免疫功能可以通过施用包含β葡聚糖的组合物进行调节。该β葡聚糖可以来源于眼虫，其提供与其他生物体不同形式的β葡聚糖，该β葡聚糖主要是无支链的β-(1,3)-葡聚糖。β葡聚糖还可以与金属，如锌络合，和/或可以与动物饲料成分结合以形成动物饲料组合物。使用此类组合物可以改善动物的健康，并且可以在某些情况下增强甚至取代抗生素的使用。

Description

动物饲料组合物及使用其的方法

相关申请的引用

本申请要求2012年2月22日提交的美国临时专利申请号61/601,891的权益。通过引用将以上申请的全部公开内容并入到本申请中。

技术领域

本技术涉及β葡聚糖、微量金属和β葡聚糖与微量金属的络合物，以及它们用于调节免疫功能的用途，包括提供这样的组合物作为口服补充剂或与动物饲料混合。

背景技术

本部分提供涉及不一定是现有技术的本公开内容的背景信息。

动物暴露于在他们的生活中的很多应激，已被证实会影响动物的健康、生长、死亡率、免疫系统健康和整体健康。目前，抗生素和其它治疗被用于增强动物抵抗疾病的能力并作为疾病的治疗手段。在现代农业和人类健康中对抗生素的过度依赖导致了广泛的抗生素耐药性，并引发了对更自然的促进健康免疫功能的方式的愿望。

抗生素的天然替代品可用于治疗感染性病。目前，感染性疾病在世界范围内是死亡的一个主要原因。在美国，只有癌症和心脏疾病导致的人类死亡人数多于传染性疾病。抗生素用于治疗人类和动物的感染性疾病通常是必要的。然而，当抗生素被连续使用时，耐药细菌菌株可以进化。此类抗生素耐药性是一个严重的人类健康问题，并已促使由耐抗生素细菌菌株如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)导致的死亡人数的增加。例如，在美国，细菌的抗生素耐药菌株现已列为超过HIV/AIDS致死人数的病因。

尽管需要保持抗生素对于人类应用的完整性，抗生素在动物应用的使用仍占美国总使用抗生素的80％以上。从1985年到2003年，在动物饲料应用中抗生素的亚治疗使用(sub-therapeutic usage)增长了10倍。开发促进免疫系统健康的非抗生素饲料成分，有助于减少对人体同样有害的抗生素耐药细菌菌株的患病率。这样的成分被使用在无抗生素的家畜生长条件下时，可以是更有利的。一些美国之外的其他国家不允许在动物饲料中进行抗生素的亚治疗使用，甚至可能禁止来自美国的成长过程中使用抗生素的肉类产品的进口。为了在商业上是有效的，这样的成分必须是符合成本效益、可靠的、安全的，并且能够被纳入现有的水或饲料基础设施。

一个用来激发免疫系统活性的化合物的例子是β葡聚糖。β葡聚糖是由β糖苷键连接的多糖，可以在各种生物，如酵母、蘑菇、真菌、谷物和其他生物中被发现。β葡聚糖被用作膳食补充剂，并且使用其的多种有益效果是多种临床试验的课题。β葡聚糖产品目前主要来自酵母，它们被使用各种工艺从酵母细胞壁中提取而得。这些产品和工艺的实例在美国专利号5,082,936、5,633,369、6,444,448、7,981,447和美国专利公布第2008/0108114号和第2004/0082539号中被描述。还存在其他β葡聚糖产品，包括来自蘑菇、燕麦、大麦和海带的那些。虽然这些产品在一些情况下表现出有益的作用，这些β葡聚糖产品一般被认为对大部分动物饲料应用来说太昂贵。例如，使用这些手段生产的最有效的β葡聚糖，2011年的商业估价约50至100美元之间每公斤β葡聚糖，该价格对于大多数人与动物食物的生产商来说是令人望而却步的。

高成本的其中一个原因，是这些产品中的β葡聚糖源自于生物体的细胞壁。因此，用于制备β葡聚糖的总生物量产生的β葡聚糖含量一般小于百分之十到十五。此外，包含在一个有机体的细胞壁中的β葡聚糖通常必须经受昂贵的、多级萃取工艺，以将β葡聚糖从其他细胞物质分离。

β葡聚糖结构也复杂。分支结构、分子量、源生物体，以及生产和提取方法的不同，都会影响不同的β葡聚糖产品的有效性和适用性。例如，酵母衍生的β-1,3；1,6-葡聚糖包括了被用来促进免疫系统活性的商业β葡聚糖产品的主体。来自燕麦的β-1,3；1,4-葡聚糖已被证明在降低胆固醇方面是非常有用的，并且根据美国食物和药物管理局(FDA)法规也只有这些类型的β葡聚糖可被标注如此功效。许多生物体产生不同的β葡聚糖结构，并且所有的β葡聚糖不是同样有效的。虽然存在关于源自于酵母(例如，美国专利号6,939,864)、蘑菇、或燕麦(例如，美国专利公布号2011/0123677)的β葡聚糖的有用性或疗效研究，但是关于源自藻类或原生动物衍生源(protist-derived)的β葡聚糖的研究比较少。此外，藻类和原生动物都没有生产到有利于它们的β葡聚糖含量的商业化的数量。

当通过不同的生物体产生的，以及不同技术提取的β葡聚糖作为动物饲料组合物的成分饲喂给动物的时候可具有非常不同的效果，这也可能会影响到β葡聚糖的剂量。文献记载，“Effects of beta-glucan extracted fromSaccharomyces cerevisiae on growth performance,and immunological andsomatotropic responses of pigs challenged with Escherichia colilipopolysaccharide”，Lee等，发表于《动物科学杂志》(Journal of AnimalScience)，指出，“目前的研究结果表明，对断奶仔猪饲料添加β-葡聚糖能够在生长表现和脂多糖激发的免疫应答方面提供一些益处。然而，通过不同制备方法制备的β-葡聚糖对断奶仔猪的生长表现和免疫功能可具有不同的影响。通过不同的方法生产的β-葡聚糖来源可以改变它们的结构或化学组成，或两者皆可，这可能影响其活性，以及其为获得生长反应应加入的量。因此，进一步的研究是必要的，以便更好地识别通过不同方法生产的β-葡聚糖被添加到猪饲料时的性能和免疫应答”。

虽然由藻类(algae)或原生生物如眼虫(眼虫属，眼虫藻，裸藻，Euglena)产生的β葡聚糖可类似于其它来源的β葡聚糖，这些β葡聚糖在几个方面仍是独特的。例如，藻类和原生生物拥有较之于真菌、植物、或细菌不一样的进化史，导致他们产生数百种独特的化合物，其中的一些可能充当了β葡聚糖的尚未确定的辅助因子。利用藻类或原生生物衍生源的β葡聚糖作为营养食品和饲料补充剂，可提供成本更低的和潜在的高纯度免疫调节补充剂，用于人类和动物的食物补充剂应用。另外，以藻类或原生动物粉末或补充剂的形式存在的β葡聚糖内含物，可以省去对可能有害的或昂贵的溶剂型萃取过程的需要，例如，用于从酵母或蘑菇的细胞壁中提取β葡聚糖的流程，并且可以允许由藻类或原生生物提供的附加辅因子和营养成分的内含物，如维生素E、锌、ω-3脂肪酸，以及其它已知或未知的营养有益分子。

除了与β-葡聚糖相关的有益的免疫学方面，动物饲料中足量的某些微量金属元素的存在，并处于生物可利用形式，对于保持动物健康很重要。因为人体必需的微量金属在商品饲料原料中往往不足，这些营养素的补充量往往被添加入饲料。

微量金属元素也已显示出对总体免疫系统性能的作用。无机盐如氧化锌和硫酸锌通常作为微量矿物质补充剂。然而，这些无机来源的可以被不完全吸收。微量金属的未被吸收的部分很可能通过动物的消化道进入粪便，在那里它可能积聚。例如，充满非常高浓度锌的动物粪便可被认为是有毒的，如果上述动物粪便作为肥料资源过度播撒在土地上，正如一种常见的做法，由于微量金属元素的积累可引起对环境的破坏。

现存许多商业产品中的微量元素的生物利用度较之于无机来源的相同金属元素增加了。增加的生物利用度可能是由于某种有机分子的缔合，其可以是蛋白质、氨基酸、或多糖，其中有机分子通常称为配体。关于为什么有机结合的微量金属元素具有增加了的生物利用度有不同的解释。一种解释是，结合至有机分子提供了在肠道中的更大的稳定性，从而降低了能够阻止其被吸收到体内的更强的受体激动剂结合至微量金属的概率。另一种解释是，该有机金属络合物(有机金属配合物、有机金属复合物，organic metal complexes)是通过肠内壁被一起吸收的。表1汇总了微量金属与配体的产品分类的一些例子。

表1.有机金属络合物的实例

图1提供了这些各种有机金属络合物的可视化表示形式。不同类型的含有与有机配体关联的微量元素的产品，可以进一步基于制造产品所用的配体被分为为不同的组。

理想的是设法改善动物免疫系统的有效性以对抗传染病而不依赖于抗生素。

发明内容

本发明技术包括有关通过向动物施用β葡聚糖以调节其免疫系统功能的系统、方法、制造的物品，以及组合物。例如，β葡聚糖可以源自眼虫(眼虫属，裸藻，Euglena)，可以与微量金属络合，和/或可以是动物饲料的一部分。动物的健康可以通过施用β葡聚糖得以改善，其中“健康”包括在以下一个或多个方面得到加强：体重增加、食物转化为活重(liveweight)的效率、行为、抗病性(抗病能力，disease resistance)、应激耐受性(stress tolerance)、降低的死亡率，以及改善的免疫功能。β葡聚糖的来源可以是无毒的、非致病性藻类或眼虫属的原生生物。

在某些方面，提供了一种调节动物的免疫功能的方法，其中该方法包括给动物施用含有β葡聚糖的组合物，该β葡聚糖包含直链的、无支链的β-(1,3)-葡聚糖。β葡聚糖可以源自眼虫，并且可以源自异养生长眼虫。β葡聚糖也可以基本上由无支链的β-(1,3)-葡聚糖组成，并且可以具有约200kDa～500kDa的平均分子量。β葡聚糖还可以具有约大于90％的无支链的β-(1,3)-葡聚糖。β葡聚糖可以是天然形式的副淀粉(paramylon)，其是一种不溶于水的颗粒，或可以是水溶性的。组合物可包括藻类粉(海藻粉，algae meal)，其中藻类粉包含β葡聚糖。组合物还可以包含金属元素，如铁、镁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰、硒、碘、以及它们的组合。β葡聚糖和金属能形成一种络合物，且在某个特定的实施方式中包括锌β葡聚糖络合物。组合物的施用可以包括将组合物加入动物食物或饮水。组合物还可以含有一种动物饲料成分。

在各方面，提供了一种动物饲料组合物，其包括直链的、无支链的β-(1,3)-葡聚糖和动物饲料成分。

在某些方面，提供了一种动物饲料组合物，其包括金属和β葡聚糖的络合物。

本发明技术表明，β葡聚糖可以以较低的成本通过使用藻类或原生生物如眼虫属(Euglena sp.)，通过受控的生长方法制备。这些β葡聚糖的结构与使用其他的生物体制备的β葡聚糖不同。一个主要区别在于，较之其他生物产生结合到其细胞壁的β葡聚糖，被称为眼虫的原生生物属能产生β葡聚糖，包括称为副淀粉的颗粒形式的β葡聚糖，其不结合到细胞壁结构。相反，眼虫将β葡聚糖作为不溶性于水的颗粒积累在细胞质中，并利用这种形式的β葡聚糖作为碳水化合物能量储存的形式。

在优化的生长条件下，能够获得β葡聚糖的浓度，其中净β葡聚糖的重量大于生物质的总干重比例的20％至80％。实现这些生产效率水平可能因这一事实变得复杂，即眼虫的生长在可以补偿可与眼虫竞争同一碳源的酵母、真菌和其它微生物更快的生长率的选择性条件下实现。本发明技术提供的方法最大化眼虫的生长，同时减少竞争性微生物的生长。由眼虫产生的β葡聚糖化合物与使用酵母等微生物产生的其它产品是不一样的，但来自眼虫的β葡聚糖对于改善免疫功能是有效的。进一步的好处是，β葡聚糖生产成本可以小于那些使用酵母产生的β葡聚糖的制造成本的1/2至1/5。

在其他实施方式中，本发明技术包括含有由藻类或原生生物如眼虫产生的有效量的β葡聚糖的组合物，其中组合物被用于改善动物健康。利用藻类所制备的成本较低的β葡聚糖饲料添加剂，因而提供了用于动物的可负担得起的和自然替代抗生素和其它免疫促进药物，能够有益于畜牧业、养殖业，甚至是人类健康应用。

依据本文所提供的描述，进一步的应用领域将变得显而易见。在发明内容中的描述和具体实例仅意在说明目的，而并非意在限制本发明的范围。

附图说明

本文所描述的附图仅用于选中的实施例、而不是所有可能的实施例的说明的目的，而且并非意在限制本发明的范围。

图1示出的各种有机金属络合物的表示形式。

图2示出β-1,3葡聚糖链与其他分支位置表示。副淀粉，来自眼虫的一种β葡聚糖形式，它的独特在于几乎全是直链的，β-1,3-支链。

图3示出了酵母细胞壁含有的β葡聚糖是被嵌入到细胞壁的。不像小眼虫(Euglena gracilis)中的，提取和分离过程是必要的，以使来自酵母的β-1,3；1,6-葡聚糖被免疫细胞受体充分生物利用。

图4示出基于β葡聚糖来源的β葡聚糖分支结构之间的键连差异。眼虫产生β-1,3-葡聚糖即所谓的“副淀粉”。酵母产生的产品包括β-1,3；1,6-支链，其提取自酵母细胞壁。β-1,3；1,4-葡聚糖更通常来自于燕麦或大麦，并已被证实可降低胆固醇。

图5是根据本发明技术的发酵工艺的一个实施方式的示意图。

图6是根据本发明技术的发酵工艺的另一个实施方式的示意图。

图7用图解示出生长在对照培养基和具有补充碳处理的培养基中的眼虫和β葡聚糖的质量(干重每升)。

图8用图解示出生长在对照培养基和具有补充碳处理的培养基中的β葡聚糖干重占眼虫干重的百分比。

图9用图解示出被喂食异养生长副淀粉48小时后小鼠外周血样品中嗜中性粒细胞的吞噬功能指数。商业酵母β葡聚糖产品，即Fibosel(TrouwNutrition,Highland,IL)和Macrogard(Orffa Inc.,Henderson,NV)，与干燥的异养生产眼虫细胞(WBG50)和提取自所述细胞的副淀粉进行了比较。条形图代表均值(±标准差)(±SE)，(n＝3只小鼠)。

图10用图解示出被喂食异养生长副淀粉48小时后的采集的脾细胞中的自然杀伤(natural killer，NK)细胞的活性。商业酵母β葡聚糖产品(Fibosel,Macrogard)与干燥的异养生产眼虫细胞(WBG50)和提取自细胞的副淀粉进行了比较。条形图代表均值(±SE)，(n＝3只小鼠)。

图11用图解示出被喂食异养生长副淀粉在48小时后小鼠中白细胞介素-2(IL-2)(细胞因子)的形成(采用ELISA)。商业酵母β葡聚糖产品(Fibosel,Macrogard)与干燥的异养生产眼虫细胞(WBG50)和提取自所述细胞的副淀粉进行了比较。条形图代表均值(±SE)，(n＝3只小鼠)。

图12用图解示出卵清蛋白注射和异养生长副淀粉每日剂量后的抗体形成。商业酵母β葡聚糖产品(Fibosel,Macrogard)与干燥的异养生产眼虫细胞(WBG50)和提取自所述细胞的副淀粉进行了比较。条形图代表均值(±SE)，(n＝3，小鼠)。

图13用图解示出小鼠注射大肠杆菌后第0天的存活率。大肠杆菌注射前2天(第-2天)起，将藻类粉、纯化藻类β葡聚糖、以及Macrogard酵母β葡聚糖提取物以相当于每天饲料定量的0.01％剂量口服饲喂灌胃5天。PBS对照组仅给予PBS灌胃，而抗生素治疗组从第0天到第4天给予口服氨苄青霉素13毫克/公斤体重。(n＝10只小鼠每个治疗组)。

图14用图解示出卵白蛋白注射(第3天和第16天)和每天服用β葡聚糖治疗23天后的抗体形成。条形图代表均值(±SE)，n＝3只小鼠每个治疗组。

图15用图解示出第14天采集的脾细胞中的自然杀伤(natural killer，NK)细胞的活性。条形图代表均值±标准差，n＝3只小鼠每个治疗组。

图16用图解示出第14天从外周血采集的小鼠中性粒细胞吞噬功能指数。条形图代表均值±标准差，n＝3只小鼠每个治疗组。

具体实施方式

以下关于本主题、制造和使用的一个或多个发明的技术说明本质上仅仅是示例性的，并且并不意在限制在本申请中声明优先权的任何具体发明、或者可以在此类其他申请中对本申请提交优先权的、或由此发布的专利的范围、应用、或者用途。关于所公开的方法，步骤出现的顺序是示例性的，并且因此，这些步骤的顺序可以在各种实施例中不同。除了在实施例中，或另有明确说明，在本说明书中表示材料的量、或反应的条件、和/或使用的所有数值量应被理解为被词语“约”修饰的，是在描述该技术的广泛范围。

本发明技术涉及β葡聚糖，包括来自眼虫衍生的β葡聚糖，及其用途。含有源自眼虫的直链β-1,3-葡聚糖的组合物可口服给药，以促进免疫系统健康、防止疾病、降低死亡率、降低应激影响、提高生长速度、或提高动物的饲料转化效率。各种商业上饲养的动物，如哺乳动物、鱼类、鸟类和甲壳类动物，都可以使用。剂量或饲料添加比例可以根据施用β葡聚糖的动物种类不同而不同。在某些实施方式中，β-1,3-葡聚糖可占总饲料的小于1％。动物也可在生命的任何阶段被施用，虽然用于育种目的喂养的动物通常被认为是更有价值的，因此，对这些动物施用可以被认为是更经济的。本发明技术意在包括如本文的提升动物健康的组合物、组合物的用途，以及各种方法。用于制备这类组合物的方法也包括在本发明技术中。

碳水化合物分支结构

参考图2、图3和图4，示出了各种来源的不同β葡聚糖的各方面。由眼虫(Euglenoids)产生的β葡聚糖在其物理特性上是独特的，且常常称为“副淀粉”。副淀粉包含直链聚合物，几乎完全是含有极少数侧分支的β-1,3-葡聚糖。该结构与已被深入研究并商业化的免疫支持应用的酵母来源β葡聚糖显著不同。酵母β葡聚糖每10-30个葡萄糖单位中包含一个被β-1,6侧链(2-3个葡萄糖单元长)取代的β-1,3-葡聚糖主链。考虑到其在免疫支持应用的用途，副淀粉的无支链的性质，是相比其他来源的β葡聚糖的重要区别。

来自整个眼虫细胞中的副淀粉被分离后，进行键连分析，以确定葡萄糖单体之间每个类型的键的相对量。对于糖链的分析，将样品全甲基化、解聚、还原和乙酰化；将得到的部分甲基化的糖醇乙酸酯(PMAA)通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析，如York等，(1985)Methods Enzymol.118:3-40。最初，干燥样品悬浮在约300μl二甲亚砜中并置于磁力搅拌器上1-2周。然后将样品通过Ciukanu和Kerek的方法全甲基化(1984)，Carbohydr.Res.131:209-217，(用氢氧化钠和甲基碘在干燥二甲亚砜中处理)。该样品加入氢氧化钠碱10分钟，然后加入碘甲烷溶液，放置40分钟。然后再加入氢氧化钠碱10分钟，最后加入更多碘甲烷40分钟。这些更多的碘甲烷和氢氧化钠碱的添加是为确保聚合物的完全甲基化。下述示例处理，将全甲基化材料使用2M三氟乙酸水解(在121℃的密封管2小时)，使用NaBD₄还原，并使用乙酸酐/三氟乙酸进行乙酰化。由此产生的PMAA在接口到7890A MSD的Hewlett Packard 5975C GC中分析(质量选择检测器，电子轰击电离模式)；在30m Supelco 2330键合相的熔融石英毛细管柱中进行分离。

表2.提取自小眼虫(Euglena gracilis)的2份副淀粉样品的键连分析。

糖基	样品1	样品2
			末端链接吡喃葡萄糖残基(t-glc)	0.34	0.3
3-连接吡喃葡萄糖残基(3-glc)	93.03	94.1
			4-连接吡喃葡萄糖残基(4-glc)	2.25	2.4
2,3-连接吡喃葡萄糖残基(2,3-glc)	3.47	2.3
			3,6-连接吡喃葡萄糖残基(3,6-glc)	0.36	0.8
2,3,4-连接吡喃葡萄糖残基(2,3,4-glc)	0.55	0.1
			合计	100.0	100.0

上述键连分析表明，这两个副淀粉样品的主要成分由3-连接吡喃葡萄糖残基(3-linked glucopyranosyl residues)组成。例如，该β葡聚糖可以大于约90％是无支链β-(1,3)-葡聚糖，并且在某些情况下可以大于约93％是无支链β-(1,3)-葡聚糖或大于约94％是无支链β-(1,3)-葡聚糖。还可发现较小量的4-连接和2,3-连接吡喃葡萄糖残基，以及可忽略的量的3,6-连接、末端连接和2,3,4-连接吡喃葡萄糖残基。这些数据证实，副淀粉主要是由直链、无支链β-(1,3)-葡聚糖组成。根据一些研究，β-(1,3)-葡聚糖是β葡聚糖实际上结合到免疫系统细胞表面的受体的形式，如树状-1(Dectin-1)(免疫系统细胞如巨噬细胞的主要受体)和补体受体3。继颗粒状副淀粉和其由巨噬细胞消化的更小片段被摄取，副淀粉中高比例的β-(1,3)-葡聚糖相对于源自酵母的β葡聚糖可能会引起免疫系统调节的改善。例如，递增剂量副淀粉可以增强免疫系统活化，而较高剂量的基于酵母的β葡聚糖效力可能会减弱，这可能是由于β-1,6-侧链的存在在空间几何上彼此干扰并阻碍其进入到树状-1受体。

三维结构

β-1,3-葡聚糖的三维结构和折叠(folding)可影响其在免疫刺激应用的生物利用度、表面积和整体效能。在直链β-1,3-葡聚糖中，该结构是由糖苷键模式约束的。由于吡喃葡萄糖的椅形环(chair-form ring)相当紧密(坚固的，rigid)，大部分的葡聚糖链的弹性源自围绕糖苷键的键的旋转。X射线结晶学和光谱学技术表明，直链葡聚糖在固体状态下具有三螺旋主链。眼虫产生的副淀粉被认为是一种最简单结构的β葡聚糖，只有少量的糖基侧链。这是与具有朝向螺旋结构外侧露出的1,4或1,6-连接侧链的昆布多糖(laminaran)、香菇多糖(lentinan)、硬葡聚糖(scleroglucan)、裂褶多糖(schizopylann)和源自酵母的β葡聚糖直接对比的。

直链β-1,3-葡聚糖的三螺旋结构由三种类型的氢键稳定化：

1.在相同的x-y平面内的不同链之间形成的分子间氢键；

2.在同一条链的相邻氧原子之间形成的分子内氢键；以及

3.在不同的x-y平面上的不同链之间形成的分子间氢键。

三螺旋结构在中性pH值中稳定在一个宽的温度范围内，从而导致聚合物是不溶于水的。然而，该氢键可通过各种方式变得不稳定，从而改变副淀粉聚合物的构象。例如，副淀粉在强离液剂(如，尿素)存在下可溶于碱性溶液中(通常0.2M或更强的氢氧化钠)、非质子极性溶剂如DMSO中，或通过增加温度超过三螺旋熔融温度(～135℃)。相关的β-1,3-葡聚糖的构象，它是天然状态、变性的、或变性又复性的，可以获得不同的免疫学效果。β-1,3-葡聚糖处于这三种构象的任意一种都可以作为附加反应的构建模块以添加或增进其功能。在本文中讨论产生官能化的β-1,3-葡聚糖的这些修饰中的几个以及它们各自的应用。β葡聚糖的构象及其产生的溶解度也可能会影响它被如何施用；例如，水溶性β-1,3-葡聚糖可直接注射而微粒β葡聚糖则更适于口服给药。

粒径、分子量和表面积

粒径、分子量，以及表面都是影响β-1,3-葡聚糖粒子的功能和生物利用度的因素。在一般情况下，优选具有0.2至5微米之间的直径与高表面积的β-1,3-葡聚糖粒子以最大化与免疫细胞的相互作用。在被肠相关淋巴组织(gut associated lymphoid tissue)(GALT)吸收或在注射后，β-1,3-葡聚糖粒子由巨噬细胞摄取和裂解。巨噬细胞的大小在种类之间变化。例如，仓鼠和大鼠肺泡巨噬细胞直径平均值分别为约13.6和13.1微米，来自猴的巨噬细胞平均15.3微米，而来自人类的巨噬细胞平均21.2微米。β-1,3-葡聚糖分子的粒径应为适当的大小，以在GALT最大化摄取，同时也可进入巨噬细胞。理想的粒径可因种类之间有所不同。巨噬细胞的大小可在不同生物体之间有所不同，这可以解释最优β-1,3-葡聚糖粒径之间的变异性的一部分。

已知β-葡聚糖物质的分子量会影响化合物的免疫刺激应用的有效性。通过眼虫(Euglenoids)产生的β-1,3-葡聚糖通常可具有约200～500kDa的分子量。

表3.β葡聚糖的来源、结构和近似分子量。

β-1,3-葡聚糖的纯度水平

β葡聚糖化合物的纯度水平已被确定会对药效产生影响，可能因其他抑制了β葡聚糖和免疫细胞之间的相互作用的物质存在而受遏制。使用本文中所述的方法，副淀粉可以很容易地以颗粒的形式从眼虫细胞分离。其结果是，相对于来自酵母和其它微生物的β葡聚糖常见制剂，副淀粉的纯度非常高。使用本文中所述的方法，可以得到大于98％的纯度水平(由检测β葡聚糖的酶测定法测量，Megazyme)。相比较而言，最高等级的源自酵母的β葡聚糖很少能达到大于90％的纯度，而在动物饲料工业中指定的几个商业产品只有约35％～60％纯度。此外，由于在眼虫中缺乏细胞壁导致分离容易，并且副淀粉颗粒容易回收，获取高纯度的β-1,3-葡聚糖可以比源自酵母的葡聚糖更具成本效益。最后，由于回收副淀粉颗粒不需要刺激性化学品(例如，强酸和强碱)，β葡聚糖可以其天然形式回收，而无需修改其化学组成和结构。在某些情况下，使用纯的、未改性的副淀粉，相比于从其他生物体得到的在提取过程中被改性的可溶化、改性的副淀粉或β葡聚糖，可以是有利的。

小眼虫(Euglena gracilis)中副淀粉的制造方法

眼虫属(Euglena sp.)可以生长在受控环境中，以使得眼虫将保持为在环境中占主导地位的微生物。这是不容易实现的，因为其他生物体通常能够竞争相同的生物资源(例如，营养素、微量营养素、矿物质、有机能量，和/或光)。许多这些微生物通常具有较快的生长速度，并有能力进行竞争使眼虫缺乏几个有利于眼虫的受控制的生长机制。这些生长机制可以包括一个或多个方法，例如：使用有利于眼虫的生长培养基，在有利于眼虫的温度下操作，加入有利于眼虫的酸和碱，加入对眼虫以外的竞争生物体是有毒的化合物，选择性的眼虫过滤或分离，以及加入控制不是眼虫种群的生物体的微敌害(micro-predators)或病毒。所有这些方法都影响生长速率和眼虫将能量转换成β葡聚糖的能力。

为了获得藻类或原生生物的足够数量，生物体也可被培养在那些类似于用于培养酵母的容器的有氧发酵容器。在一些实施方式中，这些容器可以是用于赖氨酸，或其它使用酵母属、大肠杆菌或其他微生物的氨基酸或蛋白的商业生产的非药物级容器。

能量到生物可利用的β葡聚糖的转换可以通过加入眼虫生长培养基的有机碳源，通过选择性地添加光，或者通过二者，来增强。同样，这些方面影响眼虫与其他生物竞争的能力。在一般情况下，生长在非受控环境的眼虫将不会显示出那些以一种更可控的生长环境生产的眼虫会显示的高β葡聚糖浓度、快速生长速率、以及β葡聚糖的高效生产等相同的有益特性。

含高浓度β-葡聚糖的眼虫的生长在几个方面降低β葡聚糖生产成本，其中包括以下几点。第一，含有β葡聚糖的化合物不包含在生物体的细胞壁，并且不需要复杂的和/或昂贵的分级分离法或提取过程。第二，眼虫生物是相对较大的，并且可以从水相对迅速地通过采用离心、过滤或其它分离设备分离。第三，个体眼虫细胞相较于其他生物由比例较大的β葡聚糖(占总细胞质量的百分比)组成，这将导致有机糖到β葡聚糖转换的比例很高及β葡聚糖更容易回收。第四，眼虫能够异养和光合代谢，并因此可以将自由能，以光的形式，转化为有价值的β葡聚糖。第五，由眼虫产生的β葡聚糖不完全等同于其他的β葡聚糖。然而，在一些实施方式中原子眼虫的β葡聚糖可以与其它的β葡聚糖(例如，源自酵母的β葡聚糖)的组合来使用，以提供免疫调节特性。

来自眼虫的β葡聚糖尚未被研究得像来自酵母的那些一样深入。源自眼虫的β葡聚糖调节免疫系统的程度可以与源自酵母的β葡聚糖进行比较。比较源自眼虫的β葡聚糖和源自酵母的β葡聚糖的实验在本文所包含的实施例进行说明。

在其天然状态，源自酵母的葡聚糖存在于低纯度的组合物，并且也结合到细胞壁中其他可能也具有刺激或抑制效应的分子。源自酵母的β葡聚糖也包含在源自眼虫的葡聚糖中不存在的1,3；1,6支链中。因为源自酵母的β葡聚糖需要提取，很有可能是该提取可以导致对β葡聚糖三维结构的额外修改，如通过切割(cleaving)β葡聚糖的一部分，或通过缠绕(winding)或解绕(unwinding)螺旋管(helical coils)或其他结构。

来自不同来源的β葡聚糖可以在主链结构、支链键连、频率和长度、分子量，以及其他特征方面有所不同。在美国国家癌症学会年会(NationalCancer Institute Conference)上报告的研究证明，即使是这些特性的轻微变化可以影响生物活性(在线文档可查看于：www.immunehealthbasics.com/GlucanstructureNR.html)。例如，在一项体内的抗肿瘤研究中，来自三个独立来源的具有类似的一级结构的β-(1,3；1,6)-葡聚糖被结合在一个淋巴瘤模型的单克隆抗体。

市售的β-葡聚糖的一种形式是wellMune^TM(Biothera公司，依根，明尼苏达州)，它是从酵母得到的。同样用酵母生产的β-葡聚糖的另一种形式来自BioTec Pharmacon(挪威)，被Immunocorp(挪威)作为Macrogard推向市场。

来自小眼虫(Euglena gracilis)的β-葡聚糖的提取

β葡聚糖可以通过固液分离、物理分离方法或其他方法从藻类或原生生物细胞提取。所得纯化的β葡聚糖化合物可以经历另外的反应，以提高结合亲和性，或以改变用于特定目的的结合亲和性。例如，硫酸化的多糖已证明用于治疗HIV是有效的(Damonte,Elsa B,Matulewicz,Maria C,Cerezo,Alberto S；Current Medial Chemistry；2004)。从藻类或原生生物来源的硫酸化的β葡聚糖可以表现出类似的效果。可用于改变β葡聚糖化合物结构，以提高或改变免疫系统刺激功效的额外过程，是磷酸化、乙酰化和胺化。

口服给药方法

来自眼虫的β葡聚糖从眼虫细胞分离出之后也可以加入到动物的饮食。用以裂解(lyse)眼虫细胞并浓缩β葡聚糖的简单步骤可以获得超过75％纯度的β葡聚糖产物。此分离出的产物具有可更浓缩，含有较低的蛋白质含量以减少过敏反应的益处，并且还允许较长的保质期。此分离出的产物可掺入动物饮食中以达到目标的β葡聚糖剂量，或在不同的水产养殖的应用的情况下，β葡聚糖可以以颗粒或饲料丸粒的形式直接添加到水中，在其中由目标的水产养殖种类摄取。

在一些实施方式中，本发明技术可以使用源自眼虫的β葡聚糖刺激巨噬细胞应答。已知该巨噬细胞应答的刺激作用是活化了促进强化的整体免疫系统活性的细胞因子通路。这样的应答可能被预防感染、治疗肿瘤和癌症、或支持受损的(compromised)免疫系统所需要，如免疫缺陷综合征、接受手术或化疗的患者，或者严重烧伤的患者中所期望的。β葡聚糖可以通过口服、注射、使用喷鼻剂，或作为外用软膏或霜剂给药。β葡聚糖可以连续的或在免疫系统可能被激发的特定时间内给药，例如，当有一个机体是幼小的、受压力的，或即将经受手术或其它治疗。当转移到一个新的环境，融入一个较大的或新的种群生物，或者当一个有机体即将经历可能会危及其免疫系统的事物的过程中，可能会出现一段应激期。

饲料组合物：

饲料组合物通常在物种之间变化。不同的饲料组合物也可因不同目的和不同的生命阶段提供给同一物种。

剂量：

作为饲料添加剂被添加的β葡聚糖用量范围可为饲料总质量的0.001％至2％之间，如通过干重量分析测定的。

表4.β葡聚糖(BG)剂量百分比的实例

	低	优选	高
				占饲料百分比(BG占每日饲料的百分比)	0.01％	0.10％	1％
每日食消耗，占体重质量的百分比	0.50％	2.00％	5％
				每日BG消耗，占体重质量的百分比	0.00005％	0.00200％	0.0500％

在动物食物组合物中的藻类或原生生物来源的β葡聚糖的确切给药水平可以取决于β葡聚糖的百分比和功效、生物体和给药方案。

动物饲料应用的一个实施例是用源自眼虫的β-葡聚糖喂食猪。在这个实施例中，小眼虫可以异养生长在受控环境中(通过碳源、营养水平、pH、温度以及其它因素的处理)，离心或过滤以从水中将其取出，并干燥。生长的确切条件，以及附加因素，如照明以及添加或去除分子能影响最终β葡聚糖的组合物、结构和相对丰度(以质量计)。所得藻类粉可直接混合到用来喂养猪的动物食物组合物中。β葡聚糖补充剂可以掺入饲料组合物，并每天多次的、每天一次、或较低频率地喂食猪。

如所描述的，异养生长的小眼虫可以添加到用于猪的饲料组合物。当剂量适当并按照适当的时间表喂食，其可能对动物的总体健康有益，这可以通过增加的存活率、增加的生长速率、增加的饲料转化效率来衡量。另外，对免疫系统的影响可以直接通过测定指示因子来衡量，如ADG、ADFI、G:F、淋巴细胞增殖指数(lymphocyte proliferation index)、细胞因子水平(cytokine level)、皮质醇水平(Cortisol level)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-alpha)或IL-10。在对照实验中，添加含有活性β-(1,3)-葡聚糖的藻类或原生生物粉末可以在对照组或实验组之间显示出一个或多个的这些因子的统计学显著差异。实验示出这样的测量结果在本文提供的实施例中被发现。以正确的剂量水平添加入动物饲料成分的小眼虫会影响这些生化指标，并提供了有关生物体健康的有益影响。

其他应用包括，将源自眼虫的β葡聚糖添加到用于喂养家禽、牛、鱼、虾、马、狗、猫、爬行动物、鸟类和其他动物，包括喂养在动物园或水族馆中的宝贵的或外来动物的饲料组合物中。

对于选定应用的成分组合的实例

当组合到动物饲料中时，源自眼虫的β葡聚糖可以以一定范围的剂量水平被组合，但一般这个水平可以是在1：10,000和1：500之间(干重)。特定成分的组合可因生物体、成长阶段，以及预期结果之间的差异而不同。此外，源自眼虫的β葡聚糖可以与其他免疫刺激成分结合起来以提供最大的免疫刺激益处。家禽、猪和犬应用的示例成分组合如下所列。藻类或原生生物来源的β葡聚糖可与这些成分的任意组合(但不限于)进行组合以制成动物饲料产品。

有许多动物饲料的成分也可从与β葡聚糖的组合中获益。常见动物饲料成分，例如，可以包含一种或多个以下成分：玉米粉、去壳大豆粉、小麦粗粉、石灰石、磷酸二氢钙-磷酸二钙(monocalcium-dicalciumphosphate)、盐、氧化锰、硫酸锰、氧化锌、硫酸亚铁、硫酸铜、碳酸钴、碘酸钙、亚硒酸钠、维生素A、维生素D、维生素E、甲萘醌硫酸氢钠复合物(维生素K复合物源)、核黄素补充剂、烟酸补充剂、泛酸钙、维生素B12、d-生物素、硝酸硫胺、盐酸吡哆醇(维生素B6，pyridoxinehydrochloride)、叶酸、蛋氨酸、大豆油、矿物油、氨基酸、鸡肉、钙、磷、软骨素、葡糖胺、ω-3和ω-6、甜菜浆、DHA(来自鱼油)、β胡萝卜素、鱼粉、维生素混合物、亚麻酸、氨基酸、花生四烯酸、抗坏血酸、牛肉、生物素、啤酒酵母(干燥)、碳酸钙、纤维素、螯合矿物质、硫酸软骨素、钴、铜、玉米粉、玉米油、磷酸二钙、DL-蛋氨酸、十二碳六烯酸、干燥蛋产品、硬粒小麦面粉、乙氧喹啉、脂肪、碳水化合物、硫酸亚铁、纤维、鱼粉、鱼油、亚麻粉、叶酸、低聚果糖、明胶、葡糖胺盐酸盐、甘油、大麦粉、碎玉米、碎高粱、瓜耳胶、肌醇、碘、铁、袋鼠(Kangaroo)、羊肉、1-肉碱、亚油酸、叶黄素、镁、氧化镁、氧化锰、金盏花提取物、甘露寡糖、矿物质、混合生育酚、磷酸一钠、烟酸、金盏花提取物、蓝莓、干燥海带、磷、钾、氯化钾、碘化钾、山梨酸钾、蛋白质、盐酸吡哆醇、核黄素、大米、米粉、迷迭香、迷迭香提取物、木薯淀粉、牛磺酸、硝酸硫胺、二氧化钛、维生素A、维生素B-1、维生素B12、维生素B-2、维生素B-6、维生素C、维生素D3(胆钙化醇)、维生素E、维生素K、水、小麦、小麦谷蛋白、黄原胶、锌、氧化锌、硫酸锌，目前由美国饲料管制协会(Association of American Feed Control Officials)列出的任何成分，及其组合。

用于增强免疫系统活性的添加成分

下列成分都与增强的免疫系统性能有关，并可以与源自眼虫的β葡聚糖或粉末组合以获得增强的免疫系统活性的效果：维生素C、苜蓿、亚麻种子、香菜、小红莓、螺旋藻、小球藻、维生素A、维生素E、铜、锌、铬、铁、精氨酸、烷基甘油、辅酶Q10、二甲基甘氨酸、植物营养素、胡萝卜素、香精油、鱼油、香料及其衍生物，以及它们的组合。

以上各成分可用于各种应用和喂养各种生物。例如，本文中所列的成分作为动物饲料成分，也可以与藻类或原生生物来源的β葡聚糖结合使用，作为狗、猫、家禽、水产养殖和其它饲料的应用。除了源自眼虫的β葡聚糖的免疫刺激益处，另外的藻类生物质能(生物质、生物量，biomass)可以被引入。特别是，小眼虫或其他物种可以生长以使得相对高浓度的有价值的DHA，ω-3脂肪酸，ω-6脂肪酸和生育酚也被添加到饲料组合物。

另外的组合物

尽管包含有一种或多种饲料组分时β葡聚糖可以是有益的，当β葡聚糖被与一种或多种另外的物质组合供给，可以有一定的协同作用。例如，β葡聚糖可结合益生菌(probiotics)如地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌被喂食，以提供协同作用。在本实施例中，免疫系统的上调可帮助身体自然对抗入侵病原体，而益生菌保持健康的肠道菌群对破坏更稳定。β葡聚糖结合其他类型的非消化性纤维(例如，益生元)喂食也表现出了协同作用。可以与β葡聚糖有益地结合的益生元的实例包括但不限于：低聚果糖(FOS)，乳果糖和甘露聚糖(MOS)。结合β葡聚糖的益生元可以源自酵母、微型藻类(micro-algae)、谷类、昆布(kelp)、其它陆生植物和其他来源。与β葡聚糖组合可以有益的的其他物质，包括维生素C、维生素E(特别是RRR的α生育酚)、类胡萝卜素(虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质)、DHA或EPA脂肪酸、微量金属(铁、镁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰、硒、碘)，哈喹诺、ME Detoxzyme、维生素D3、抗坏血酸，和膳食矿物质(钙、磷、钾、硫、钠、氯、镁、硼、铬)。β葡聚糖也可以与其它酶组合被喂食，其可提高饲料中一种或多种营养源的生物利用度或消化率。在一些情况下，β葡聚糖酶可以被提供做为饲料中的酶，以将β葡聚糖切割为更小、更易消化的片段或从金属β葡聚糖络合物中释放出金属元素。在一些实施方式中，这些另外物质的一种或多种可包含在剩余的藻类粉中，将其培养(cultivated)意在增加协同物质的浓度。

另外的成分可以与β葡聚糖进行组合，并且这些各种β葡聚糖的组合物如本文所述。这些包括选自由以下各项组成的组中的另外的免疫调节、应激降低、或其他刺激物成分：α生育酚、维生素D3(胆钙化醇)、锌、铬、硒、精氨酸、抗坏血酸、烷基甘油、咖啡因、卡法椒(kava kava)、姜黄、螺旋藻、D-葡糖二酸钙、辅酶Q10、肽、二甲甘氨酸(dimethglycine)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid)、二十碳五烯酸(ecosapentaenoicacid)、α-亚麻酸、虾青素、β胡萝卜素、叶黄素、乳酸菌益生菌、双歧杆菌益生菌、甘露寡糖、低聚果糖、黄芪、紫锥花、施保利通(Esberitox)、大蒜、谷胱甘肽、昆布、L-精氨酸、L-鸟氨酸、卵磷脂颗粒、来自舞茸(灰树花，maiitake)、灵芝(蕈类草药，reishi)或蕈形香菇(shiitake mushrooms)的提取物、锰、槲皮素、菠萝蛋白酶、橄榄叶、接骨木(Sambucus)、Umcka、泛酸、槲皮素、α硫辛酸、芳香油(精油，essential oil)、鱼油、香料及其衍生物、紫檀芪，以及它们的组合。

与微量金属元素络合

在一些实施方式中，β葡聚糖可以与微量金属络合以创造络合物，可以同步用来改善微量金属的生物利用度，同时促进整体免疫系统活性。微量金属元素包括铜、锌、铁、钴、镁、钼、锰，以及它们的组合。β葡聚糖和微量金属的络合物可以是可溶性、无机微量金属盐与β葡聚糖在溶液中络合的产物。

β葡聚糖的多糖可以包括，β葡聚糖的生物可利用的形式，如干的或湿的整个细胞藻类悬浮液中存在的副淀粉颗粒或者干的或湿的整个细胞酵母中存在的β葡聚糖，或者是从藻类、酵母、或其他生物提取的β葡聚糖源。多糖可以由在一个或多个无菌生物反应器中异养已生长的小眼虫的悬浮液或糊剂组成。眼虫也可以以最佳的方式生长，使得藻类产品的β葡聚糖部分包括大于20％的藻类生物质能，以干重为基础测得。用于生长和制造这样的产品的方法的实例示于图5和图6。

参考图5，示出一个发酵过程的实施方式。藻类生物质在发酵罐(1)中按照无菌条件在化学限定培养基中产生。经过在发酵罐(1)中达到所需量的时间后，在发酵液(fermenter broth)被转移到离心分离机(2)以脱水该发酵液，生产两种工艺流：包含约75％水分的湿藻类粉；以及用过的培养基。湿藻类粉包含整个藻类细胞、藻类细胞碎片和多糖颗粒的混合物。湿藻类粉可以是含有50％以上干燥重量的β葡聚糖和一种不可消化多糖的多糖溶液。湿藻类粉被转移到混合器(3)，如混合罐或任何能够混合的设备(例如，螺带式混合机)。可选地，多糖溶液的pH值可通过加入酸或碱(A)调节。

一种可溶性金属盐(B)的浓缩液，如ZnSO₄-H₂O，可被加入到混合器(3)中，与多糖溶液剧烈混合1-120分钟。任何水溶性的金属盐(B)都可被使用。例如，金属盐(B)可以与β葡聚糖进行混合，以使最终产物可以是铜多糖络合物、锌多糖络合物、铁多糖络合物、钴多糖络合物、镁多糖络合物、锰多糖络合物，以及它们的组合。可溶性金属盐(B)溶液的制备可包括在水中加热并混合金属盐(B)的混合物。可选地，混合器(3)可被加热或冷却。可选地，混合器(3)可被加热至使材料巴氏灭菌并使酶的活性失活所需要的温度。当多糖溶液与金属盐(B)溶液混合，金属离子与存在于湿藻类粉的多糖之间将发生一定量的络合反应，使得最终产物可被认为是金属多糖络合物。

混合至所需量后，将混合物转移到脱水器(4)，其可以使能够干燥材料的任何装置。例如，该脱水器(4)可以是盘式脱水器、带式脱水器、转筒脱水器等。一旦材料含有水分小于10％，将其转移到研磨机(5)，在其中其颗粒尺寸减小到小于500μm。更优选地，其颗粒尺寸减小到小于250μm。一旦材料已被磨碎，它被包装(6)入合适大小的容器中并被标记。可选地，加入湿藻类粉中的金属盐(B)溶液可以省略，而所得到的产物将是藻类粉。

参考图6，示出另一种发酵过程的实施例。藻类生物质在发酵罐(7)中按照无菌条件在化学限定培养基中被产生。可任选地，藻类生物质能可以在生长罐中，在非无菌条件下，使用任何仅包含饲料级材料并不含有害物质(例如，重金属、毒素、危险化学品)的培养基中生产。经过在发酵罐或生长罐(7)中达到所需量的时间后，发酵液被转移到混合器(8)，如混合罐或任何能够混合的设备(例如，螺带式混合机)。发酵液包含整个藻类细胞、藻类细胞碎片和多糖颗粒的混合物。在非无菌生长罐的情况下，低水平的非藻类生物量也可以存在。可选地，发酵液的pH值通过加入酸或碱的化学物质(C)到混合器(8)来调整以裂解细胞，从而从细胞内释放大部分多糖颗粒。这可以通过加入碱(如氢氧化钠)到发酵液来完成。可选地，发酵液，也可以通过高压均化器或超声波细胞破碎仪机械地进行处理以裂解细胞。可选地，发酵液可以调整到碱性pH值，然后在离心之前进行中和。经过足够长的时间后，大多数(如果不是所有的)细胞被裂解溶解，将所得的混合物转移至离心机(9)以脱水发酵液，产生两种工艺流：粗多糖溶液(D)；和其他生物质材料的混合物(E)。

粗多糖溶液(D)被转移到混合器(10)，如混合罐或任何能够提供混合的设备(例如，螺条混合机)中。粗多糖溶液(D)可以任选地用水或合适的醇(乙醇、异丙醇)洗涤，以除去非多糖材料。另外的洗涤可以用任何适于除去非多糖材料的化学品进行。粗多糖溶液(D)的pH可任选地用酸或碱(F)调节。

可溶性金属盐(G)的浓缩液，如ZnSO₄-H₂O，可被加入到混合器(10)中，与多糖溶液剧烈混合1-120分钟。任何水溶性的金属盐都可以被使用，以使得最终产品可以是，例如，铜多糖络合物，锌多糖络合物，铁多糖络合物，钴多糖络合物，镁多糖络合物，或锰多糖络合物。可溶性金属盐溶液的制备可包括在水中加热并混合金属盐的混合物。可选地，混合器(10)可被加热或冷却。可选地，混合器(10)可被加热至使材料巴氏灭菌并使酶的活性失活所需要的温度。当多糖溶液与金属盐溶液混合，金属离子与存在的多糖之间将发生一定量的络合反应，使得最终产物可被认为是金属多糖络合物。

混合至所需量后，将混合物转移到脱水器(11)，其可以使能够干燥材料的任何装置。例如，该脱水器(11)可以是盘式脱水器、带式脱水器、转筒脱水器等。一旦材料含有水分小于10％，将其转移到研磨机(12)，在其中其颗粒尺寸减小到小于500μm。更优选地，其颗粒尺寸减小到小于250μm。一旦材料已被磨碎，它被包装(13)入合适大小的容器中并被标记。

非多糖材料(E)包含部分水解的蛋白质和氨基酸，并转移到混合器(14)，如搅拌罐或任何能够提供混合的设备(例如，螺条混合器)中。非多糖材料(E)的pH值可任选地用酸或碱(H)调节。一种可溶性金属盐(I)的浓缩液，如ZnSO₄-H₂O，可被加入到混合器(14)中，与富含氨基酸的材料剧烈混合1-120分钟。任何水溶性的金属盐都可以被使用，以使得最终产品可以是，例如，铜蛋白盐，锌蛋白盐，铁蛋白盐，钴蛋白盐，镁蛋白盐，锰蛋白盐，以及它们的组合。可溶性金属盐溶液的制备可涉及在水中加热并混合金属盐的混合物。可选地，混合器(14)可被加热或冷却。可选地，混合器(14)可被加热至使材料巴氏灭菌并使酶的活性失活所需要的温度。当非多糖溶液与金属盐溶液混合，金属离子与存在的部分水解的蛋白质和氨基酸之间将发生一定量的络合反应，使得最终产物可被认为是金属蛋白盐。

混合至所需量后，将混合物转移到脱水器(15)，其可以使能够干燥材料的任何装置。例如，该脱水器(15)可以是盘式脱水器、带式脱水器、转筒脱水器等。一旦材料含有水分小于10％，将其转移到研磨机(16)，在其中其颗粒尺寸减小到小于500μm。更优选地，其颗粒尺寸减小到小于250μm。一旦材料已被磨碎，它被包装(17)入合适大小的容器中并被标记。可选地，添加到各工艺流的金属盐溶液(D、E)可被省略，而所得到的产品将是一种比较纯的多糖和部分水解的蛋白粉。

络合微量金属和β葡聚糖的优点包括与β葡聚糖免疫系统调节的各方面相结合的微量金属生物利用度的增加。例如，β葡聚糖在肠道中是难消化的，并且可以在微量金属被释放到肠道内之前，屏蔽其结合一种激动剂。此外，因为某些微量元素，如锌，在饮食中通常被需要，以获得最佳的免疫系统的功能，其与一种免疫增强化合物如β葡聚糖的组合，在某些用于结合到动物饲料或维生素预混物共混的情况下，比相同微量金属与另一个源(如也可以作为单独产品的氨基酸或蛋白质)的结合是更优选的。本发明方法表明源自眼虫的β葡聚糖结合或吸收足够高浓度的锌和其他微量金属的能力，以在动物的饮食中提供显著浓度的微量金属。

金属β葡聚糖络合物的一些实施方式，包括选自由铜β葡聚糖络合物、锌β葡聚糖络合物、铁β葡聚糖络合物、钴β葡聚糖络合物、镁β葡聚糖络合物、钼β葡聚糖络合物、锰β葡聚糖络合物，以及它们的组合所组成的组中的成员。

虽然可以使用含有无机盐的任何微量矿物质，盐的一些实例包括那些已经商业化用作饲料原料的商品。此类无机盐的实例包括但不限于：金属硫酸盐、金属氧化物、金属氯化物、水合金属盐、金属乙酸盐、金属溴化物、金属碘化物、金属磷酸盐、金属亚硒酸盐，和它们的组合；其中盐类的一部分可包含铁、镁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰、硒、钨、碘，以及它们的组合。

在一些实施方式中，所得金属多糖络合物包含按重量计3％至25％的金属和按重量计至少25％的β葡聚糖。在某些情况下，产品的多糖部分可由按重量计至少50％的β葡聚糖组成。硫酸锌或氧化锌可被用作含有微量矿物的盐，以制备锌β葡聚糖络合物，其中锌β葡聚糖络合物可以包含按重量计至少1％的锌(基于干重)，可以以小于在动物饮食中总夹杂物(inclusion)重量的3％被施用。

测量β葡聚糖的效果

本文所述的动物饲料组合物被预期为总体调节免疫系统。最终，这样的好处可以转化为提高动物的总体健康和卫生，提高畜牧业生产的经济性，特别是在在水或动物饲料中不采取抗生素的亚治疗应用的畜牧业生产方式中。评估在动物饲料中的本发明组合物作用的方法包括：测量抗体滴定(抗体效价，antibody titer)的增加；测量免疫系统细胞活性的增强(如，吞噬作用和自然杀伤细胞细胞毒性的等级)；测量饲料转化效率的改善；测量应激的降低；测量体重减轻或体重增加的改善；测量饲料消耗的改善；测量平均日增益的提高；实施激发研究(challenge studies)，其中至少一个治疗组被施用如本文的组合物；测量动物种群死亡率的降低；测量白细胞介素或其他细胞因子水平的改变，其已知可能与免疫功能相关；测量对肿瘤坏死因子α的影响，荧光标记本文所述的组合物的组分并观察其在各个细胞、血液或组织样品中的存在或代谢；对被喂食本文组合物的动物实施一般组织学分析；称量被喂食本文所述组合物的器官或动物；或者，当喂食本文所述的一种或多种组合物时表明对动物的显著效果的任何其他分析。

动物饲料代乳品(Milk Replacer)

本发明的动物饲料组合物可配制成一种代乳品，代乳品是作为一种补充剂被喂食到一个年幼哺乳动物的或替代天然母乳的产品。代乳品的产品存在于范围较广的哺乳动物，包括但不限于，牛、山羊、羔羊、绵羊、松鼠、人类，甚至动物园的异国动物。一些哺乳动物，如牛，有一种反刍类的消化系统。然而，幼小的反刍动物不具备发育完全的或有功能的消化系统——出生时产生消化酶的器官都还不具备完整的功能。这些幼小的反刍动物会受饮食变化的影响，而且特别容易受到感染和应激。含有粗蛋白、粗脂肪、乳清及其它物质的代乳品往往被提供给幼牛用以减少其饮食的变化，也还因为喂它们代乳品并销售母乳可以是更经济的。

代乳品通常含有下列物质组分的一些组合：乳清蛋白、脂肪、粗蛋白、乳化剂、流平剂、磷酸二钙、赖氨酸、维生素、微量矿物质、碳酸钙、胆碱、香味化合物(flavor compound)、灰分、钙及磷酸盐。脂肪和蛋白质的来源可以是动物或植物性的。不同的脂肪组合物，如通过烃链长度测定的，以及蛋白质组合物，如通过氨基酸组分测定的，在饲料转化率、体重的增加、生长率、死亡率和整体抗感染方面已经显示得到不同的结果。

本发明技术包括配制为代乳品的动物饲料组合物，其中代乳品可以包含蛋白质、脂肪和β葡聚糖，以提供实质性的热量，提高哺乳动物的健康。还包括一种刺激体重增加，以及通过喂食包含蛋白质、脂肪和β葡聚糖的代乳品产品，提高年幼哺乳动物健康的方法。

实施例

β葡聚糖支链分析

一项支链分析(支化分析，branching analysis)被实施于从生长于异养、无菌发酵方法的小眼虫中提取的β葡聚糖。

采用如下方法

细胞培养和β葡聚糖的测量。两组眼虫的培养物分别生长于含主要和次要必需营养物质(包括氮、磷)，微量矿物质和维生素(B1和B12)的培养基中，其是这个物种的生长常用的。该200毫升培养物在250毫升锥形瓶中通入空气，以提供氧、二氧化碳和培养物的混合。初始眼虫密度为0.7g L^-1。两组培养物都暴露于150μmol photon m²s^-1的光水平，并给予一组培养物4克/升的固定碳作为补充碳处理。两天后，测定样品的总悬浮固体，以确定生物质的干重。通过裂解细胞并离心β葡聚糖结晶来测定β葡聚糖含量。约1份眼虫生物质(基于干重)被悬浮于5份水和10份(10g/L的十二烷基硫酸钠)。此溶液剧烈混合，然后加热至100℃30分钟。然后将溶液冷却，并在大于500g下离心5分钟。弃去上清液并将沉淀(滤饼，pellet)重新悬浮在10份水中洗涤，剧烈混合，并在大于500g下离心5分钟。洗涤过程用10份70％～95％的乙醇重复2次以上，以到达纯化的β葡聚糖沉淀。沉淀可在65℃真空下进一步干燥，成为白色/褐色粉末。图7示出在对照培养基和具有该补充碳处理的培养基中生长的眼虫和β葡聚糖的质量(干重/升)。图8示出在对照培养基和具有该补充碳处理培养基中生长的眼虫(干重)中β葡聚糖的百分比。

全O甲基化作用(Per-O-methylation)和键连分析。为了糖链(glycosyllinkage)的分析，对用上述方法提取的两种β葡聚糖样品进行全甲基化、解聚、还原和乙酰化；将得到的部分甲基化的糖醇乙酸酯(PMAA)通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析，如York等，(1985)Methods Enzymol，118:3-40所描述的。

最初，干燥样品悬浮在约300μl二甲亚砜中并置于磁力搅拌器上1-2周。然后将样品通过Ciukanu和Kerek(1984)Carbohydr.Res.131:209-217的方法全甲基化，(用氢氧化钠和甲基碘在干燥二甲亚砜中处理)。该样品经受氢氧化钠碱10分钟，然后加入甲基碘溶液，放置40分钟。然后再加入氢氧化钠碱10分钟，最后加入更多碘甲烷溶液40分钟。这些更多的甲基碘和氢氧化钠碱的添加是为确保聚合物的完全甲基化。下述示例处理，将全甲基化材料使用2M三氟乙酸水解(在121℃的密封管2小时)，使用NaBD₄还原，并使用乙酸酐/三氟乙酸乙酰化。由此产生的PMAA是在接口到7890A MSD的Hewlett Packard 5975CGC中分析(质谱检测器，电子轰击电离模式)；在30m Supelco2330键合相熔融石英毛细管柱中进行分离。

表5.2份提取的β葡聚糖样品的全O甲基化作用和键连分析结果。

上述键连分析表明，这两个样品主要由3-连接吡喃葡萄糖残基(3-linked glucopyranosyl residues)组成。还可发现较小量的4-连接和2,3-连接Glc残基，以及可忽略的量的3,6-连接、末端连接和2,3,4-连接Glc残基。

小鼠免疫应答参数

一项研究是与路易斯维尔大学病理学系(Department of Pathology atthe University of Louisville)的Vaclav Vetvicka博士合作进行的，以确定当作为饲料原料被提供时，副淀粉在哺乳动物中是否是有效的免疫刺激剂。目标包括：

1.确定口服给药时副淀粉是否刺激小鼠的免疫系统；

2.在不同剂量水平比较动物饲料添加剂所使用的副淀粉与其他β葡聚糖产品的效应；以及

3.评价完整细胞副淀粉与提取和纯化副淀粉的有效性。

采用下述方法。

使用如本文的发酵工艺培养含有β葡聚糖藻类生物质。两种不同的完整细胞产品(WBG50A和WBG50B)和一种纯化的β葡聚糖提取物在本小鼠研究中进行了测试。WBG50A样品从生长于葡萄糖作为有机碳源的细胞产生，而WBG50B样品从生长于乙醇中的细胞产生。两种完整细胞制品都含有约50wt.％的β-1,3-葡聚糖，并被离心然后干燥，不再经任何进一步处理。分馏该WBG50A生物质以分离β葡聚糖，然后反复洗涤该β葡聚糖馏分以除去非β葡聚糖的细胞成分制备的“提取物”样品。提取物含有约93wt.％的β-1,3-葡聚糖。

完整细胞生物质样品、β葡聚糖提取物、和其他β葡聚糖产物都被干燥并研磨至小于500微米的粒径。然后这些干燥的粉末与PBS缓冲液混合，并且在被通过管饲法喂食给小鼠前稀释到适当的浓度。三只BALB/c小鼠被分配到每个治疗组，并在实验第1天根据其总饮食基础重量百分比给予不同水平的β葡聚糖，范围是小于小鼠饮食配给的0.001％至0.25％。只有来自0.005％和0.05％剂量水平的数据在本文阐述。

血液取自每只小鼠以评估非特异性免疫系统的活性。下述参数被评估：吞噬活性(巨噬细胞摄取外来颗粒的能力)，自然杀伤细胞(NK)细胞活性(自然杀伤细胞破坏外来的或受感染的细胞的能力)，以及细胞因子浓度(IL-2)。为了评估特异性免疫应答的能力，响应于卵清蛋白的抗体形成通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行评估，使用弗氏佐剂(Freundadjuvant)作为阳性对照以及PBS作为阴性对照。

获得以下结果

吞噬作用是免疫系统捕获和破坏可能有害的颗粒(例如细菌)的一种应答。吞噬能力指数通过嗜中性粒细胞积极捕获和吞噬被标记的颗粒的百分比来测定。只被给予PBS对照的小鼠具有30％的吞噬指数(参见图9)。被喂食0.05％剂量WBG50B的小鼠所观察到被记录的最高指数为45％，这比对照治疗高50％。总体而言，两个剂量水平的WBG50B治疗的每一个都具有所有治疗中最高的吞噬指数，并且与所有的以最低剂量水平(饮食的0.005％)的治疗比较是特别有效的。

NK细胞活性是脾脏分离的NK细胞在4小时温育阶段杀死靶细胞(例如，来自T淋巴瘤细胞系的YAC-1细胞)的能力的指数。在饲喂PBS对照小鼠显示12％的细胞毒性指标，而饲喂0.05％剂量WBG50B的小鼠的细胞毒性指数比高出三倍(38.5％，参见图10)。无论是WBG50B还是提取物治疗组基本上在两个剂量水平的表现都优于其他β葡聚糖产品(Fibosel,Biomatrix)，并且在某些情况下，在0.05％和0.005％的剂量水平，较之于由Fibosel所反映的细胞毒性，WBG50B治疗显示出接近两倍的NK细胞活性应答。

白细胞介素-2(IL-2)是一种重要的细胞因子信使分子，有助于调节微生物感染的免疫应答。IL-2的产生通过经过一段温育期收获的脾细胞产生的IL-2的量来测定，IL-2应答是一种比NK细胞活性、吞噬作用和抗体形成更普遍的免疫应答。因此，许多不同类型的外来的化合物，不仅是β葡聚糖，可引起IL-2产生的增加。饲喂PBS对照的小鼠没有观察到IL-2的产生的增加，而所有的β葡聚糖产品处置引起了非常强的IL-2应答，并在更高的剂量率下明显地增加(参见图11)。提取物治疗导致最高的IL-2产生，接下来是其他β葡聚糖产品(Fibosel、Biomatrix)，然后是WBG50。

抗体形成表明β葡聚糖可以用作疫苗的佐剂(强化剂)。小鼠被每日喂食各种β葡聚糖产品共21天，同时在第0天和第14天被注射卵白蛋白(卵清蛋白、模型抗原)。在第21天，测量血清中的卵清蛋白抗体的数量。弗氏佐剂(灭活细菌细胞的乳状液)被用作阳性对照，因为它被认为是用于诱导抗体形成的工业标准。然而，由于它的强烈毒性效应，弗氏佐剂在包括人类在内的多种动物中不能使用。如预期的，弗氏佐剂产生了非常高水平的抗体形成(见图12)。在0.05％的剂量率，两者完整细胞的样品与竞争产品各引出类似于约20％弗氏佐剂水平的抗体形成。在0.05％的剂量率，提取物产生了强得多的抗体应答，达到接近弗氏佐剂所产生水平的55％。

这些实验中建立了关于本发明技术的下述规律：

1.与对照相比，每种包含眼虫β葡聚糖的产品(WBG50A、WBG50B、提取物)都诱导出每个测量的免疫应答(吞噬作用、NK细胞活性、IL-2产生，抗体产生)的显著增加。

2.对于免疫应答的每种测量，眼虫β葡聚糖制品表现良好，而且在许多情况下，比其它β葡聚糖制品Fibosel和Biomatrix更好。特别是，WBG50B(生长于乙醇作为碳源的完整细胞生物质)，在吞噬细胞和NK细胞活性方面表现出最高的测量水平。

3.所提取的眼虫β葡聚糖产品引起很强的抗体应答，即超出弗氏佐剂诱导水平的50％，表明其作为佐剂应用的潜力。

4.除抗体的产生，对于完整细胞生物质的免疫应答为高，即使不能更高，也比提取的单独的眼虫β葡聚糖高。这表明，藻类细胞的其它组分(例如，ω-3脂肪酸、维生素E、微量金属)可以具有一种与β葡聚糖的协同效应以诱导更强的免疫应答。

5.在所有情况下，该剂量水平(0.005％和0.05％)的免疫应答不是线性的(即，10倍以上)而在产品之间存在差异，这表明眼虫β葡聚糖产品的最佳剂量率有可能比最高剂量水平(0.05％)大大降低。值得注意的是，对于最低剂量的WBG50B，在NK细胞活性和吞噬作用方面的免疫应答比最高的剂量水平的Fibosel和Biomatrix更高，这表明降低眼虫β葡聚糖剂量需求的可能性。此外，剂量率可以对吞噬应答，其是抵御病原体的第一道防线，进行优化。

使用异养发酵小眼虫的β葡聚糖的有效生产

为了确定使用小眼虫的β葡聚糖及其他协同联合产品(synergisticco-products)的最优生产，对宽范围的不同的生长培养基的制剂、pH值、温度控制、照明条件、以及眼虫的遗传品系进行测试。出乎意料的是，可以确定在光合条件下生长时，小眼虫产生更大量的有价值的蛋白质和抗氧化剂的脂质。然而，异养生长在黑暗、无菌发酵容器中的眼虫产生更大量的β-1,3-葡聚糖。喂食源自无菌发酵容器的干燥小眼虫的小鼠表现出的免疫系统性能，超过来自源自酵母的β葡聚糖，或来自含有较少量的β葡聚糖的眼虫。

不同于描述使用光合生长藻类的维生素E和其它抗氧化剂的生产的其他报道，异养生长的小眼虫似乎产生更适合作为动物饲料应用的β葡聚糖。

此外，在本发明实验中确定快速干燥藻类作为制造过程的一部分是重要的，以防止有价值的类胡萝卜素和其它抗氧化剂的分解。应当指出的是，在一些情况下，干燥之前将湿藻类浆液存储一段延长的时间可以是经济上有益的。在一个实施方式中，新鲜离心分离的藻类可通过在玻璃罐或蒸煮袋(retort pouch)加热该材料保存，类似于食物材料为了长期存放在室温下如何被罐装。这个信息被用来制定本文中所描述的并示于图5和图6的制造过程。

表6.眼虫样品中化合物浓度的实例(基于干重)

	室温保存2天的湿样品中的浓度	离心后立即干燥的样品中的浓度
			叶黄素	80ppm	145.7ppm
玉米黄质	17.2ppm	2.9ppm
			虾青素	7.4ppm	7.6ppm
β-胡萝卜素	9.4ppm	59.3ppm
			DHA	无数据	0.33％
EPA	无数据	0.33％
			α-生育酚	126IU/kg	34IU/kg

小鼠的大肠杆菌激发

该实施例的目标包括：

1.确定口服剂量的眼虫藻类粉和纯化的β葡聚糖产品是否增加对抗致死剂量的细菌大肠杆菌(E.coli)的存活率；

2.通过抗体产生、NK杀伤细胞的细胞毒性和吞噬活性的测定，确定眼虫藻类粉和β葡聚糖制品是否特异性刺激小鼠的免疫系统；以及

3.在不同剂量水平，比较眼虫藻类粉和纯化的β葡聚糖产品与来源于酵母的其他β葡聚糖产品的效应。

采用以下方法。

眼虫细胞在无菌发酵罐生长。一旦达到发酵罐中生物质的目标密度，将细胞离心，将所得的糊状物于-20℃冷冻贮存。为了产生藻类粉样品，将冷冻的糊状物解冻后，在65℃下干燥，直至其形成干燥的薄片，然后研磨成小于250微米的粒径。纯化的藻类β葡聚糖样品通过分馏眼虫细胞并通过专有纯化过程分离出β葡聚糖，以产生具有>90％的β葡聚糖和小于250微米粒径的提取物来制备。提取的源自酵母的β葡聚糖产品，Macrogard，其确保>60％的β葡聚糖，是从商业的分销商采购，并没有进一步修改的“原样”使用。在通过管饲法以规定的剂量水平施用给小鼠之前，每个干燥产品都与磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合并稀释到合适的浓度。

所有的动物工作是路易斯维尔大学病理学系(Department of Pathologyat the University of Louisville)Vaclav Vetvicka博士的实验室中进行。Vetvicka博士因其对β葡聚糖的生理作用的研究而闻名，并且在他的实验室里已经进行了众多的β葡聚糖产品并排比较，以确定其潜在的效益。

大肠杆菌激发。10只BALB/c小鼠被分配到每个治疗组，并在第0天通过肌内注射接受了标称致死量的大肠杆菌(3×107)。自注射前2天(-2日)开始，至注射后2天(+2日)，β葡聚糖产物(日饲料定量重量的0.01％)每日用管饲法口服给药至小鼠。在第0天、第1天、第2天、第3天和第4天，对照组仅接受PBS灌胃，而抗生素治疗组给予口服剂量的氨苄西林(13毫克/千克)，每日对小鼠进行评价直至第10天。

抗体滴定。三只BALB/c小鼠被分配到每个治疗组，起始于第0天，接受每日口服剂量β葡聚糖制品，重量相当于他们日饲料定量的0.002％、0.005％、0.010％和0.020％。抗原(卵清蛋白)是在第3天和第16天通过腹膜内注射输入，而抗体滴定的产生在第23天使用ELISA法测定，用弗氏佐剂作为阳性对照应用PBS作为阴性对照。

NK细胞细胞毒性及吞噬作用活性。9只BALB/c小鼠被分配到每个治疗组，并按照如上抗体滴度实验相同的方法喂食β葡聚糖产品，以测定自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性(NK细胞破坏外来的或受感染的细胞的能力)和吞噬作用活性(巨噬细胞摄取外来颗粒的能力)。在第1天、第7天和第14天，每个治疗组的三只小鼠被处死，以获取材料进行分析。NK细胞的细胞活性(测量为细胞毒性)是脾脏分离的NK细胞相似4小时温育过程中杀死靶细胞(例如，来自T淋巴瘤细胞系的YAC-1细胞)的能力的指数。吞噬指数是通过中性粒细胞在规定的时间积极捕捉并吞噬标记颗粒的百分比来测量。

这些实验产生了以下结果。

大肠杆菌细菌激发(参见图13)。对照组中所有小鼠，其仅接受PBS，在大肠杆菌注入后七天内死亡。与此相反，所有治疗组的死亡率在第10天至少下降40％。值得注意的是，接收到纯化藻类β葡聚糖产物的小鼠有70％在大肠杆菌注射后10天存活下来。此治疗组和接受氨苄青霉素的那个组随着时间的推移显示出非常相似的存活率，这表明源自眼虫的β葡聚糖的治疗促进了与氨苄青霉素相似的抗菌活性。接收含有约50％β葡聚糖的藻类粉的小鼠，较对照组也显示出死亡率的显著下降。在该治疗组中，50％的小鼠在大肠杆菌注射10天后存活，相比较下喂食来自酵母的β葡聚糖提取产物(Macrogard)的那个组有40％存活。

抗体滴定(参见图14)。抗体滴定的显著增加表明一种产品比如β葡聚糖作为疫苗的佐剂(增强子)的潜力。正如预期的那样，阳性对照组(弗氏佐剂，灭活细菌细胞的乳液)对卵清蛋白产生了非常高水平的抗体。然而，弗氏佐剂是有毒的，并且没有作为佐剂实际使用在动物或人类身上。所有的β葡聚糖治疗组都诱发了抗体产生的增加，并也随着剂量率增加。在每个治疗剂量水平，纯化的藻类β葡聚糖治疗组产生了最多的抗体，紧随其后的是藻类粉治疗组。该Macrogard酵母β葡聚糖提取物治疗组在中等剂量水平(0.005％和0.010％)表现出比纯化藻类β葡聚糖和藻类粉治疗组低得多(低了15％至50％之间)的抗体滴定，但在最高剂量率时与藻类粉治疗组持平。

自然杀伤细胞的细胞毒性(参见图15)。自然杀伤细胞的细胞毒性是由自然杀伤细胞引发的，以杀死潜在的病原微生物的非特异性免疫应答的指标。饲喂PBS对照的小鼠显示出12％的细胞毒性指标，与此同时，不论用低至0.005％剂量的藻类粉还是纯化藻类β葡聚糖饲喂的小鼠表现出超过3倍的毒性指数(36％至50％)。在0.005％及更高的剂量，无论是藻类粉还是纯化藻类β葡聚糖处置都诱发了较Macrogard酵母β葡聚糖提取物治疗更强的毒性应答。

吞噬作用活性(参见图16)。吞噬作用是另一种吞噬潜在的病原微生物的非特异性免疫应答。仅服用PBS对照的小鼠具有30％的吞噬指数，而喂食最高剂量的纯化藻类β葡聚糖的小鼠表现出近两倍的吞噬活性(59％)。如在NK细胞的细胞毒作用和抗体滴定所看到的，纯化的藻类β葡聚糖治疗组在每个剂量水平都显示出最佳的表现。海藻粉和Macrogard酵母β葡聚糖提取物治疗组在两个最低剂量水平表现出类似的吞噬作用活性，但喂食Macrogard酵母β葡聚糖提取物的小鼠在两个最高剂量水平有略高的吞噬作用活性。

因此，来自这些实验的数据表明了以下：

1.每个β葡聚糖产品(藻类粉、纯化的藻类β葡聚糖、Macrogard酵母β葡聚糖提取物)都增加了暴露于致死剂量的大肠杆菌的小鼠的存活率。特别是，藻类粉治疗在第10天的存活率，从对照组的0％上达至50％。纯化的藻类β葡聚糖治疗将存活率提高到70％，这是与抗生素治疗(氨苄西林)相同的应答。这些数据表明，源自眼虫的β葡聚糖刺激免疫系统，以提供有效的抗菌活性，而没有被提取和纯化的藻类粉内的β葡聚糖，是易于生物利用的。

2.对于饲喂任何β葡聚糖产品的治疗组，特异性免疫应答(即，抗体产生)和非特异性免疫应答(即NK细胞的细胞毒性和吞噬作用活性)二者均显著增加。对于所有的免疫指标，纯化的藻类β葡聚糖治疗组在所有治疗水平诱发出最强的免疫应答。

3.藻类粉和纯化藻类β葡聚糖产品二者都诱发了非常强烈的抗体应答，超出弗氏佐剂诱导水平的50％，预示这些产品作为佐剂的效用。

4.藻类粉产品在几乎所有的治疗水平，在抗体产生和NK细胞的细胞毒性试验两方面的表现，即使不能更好，都较Macrogard酵母β葡聚糖提取物产品一样好。在大多数情况下，藻类粉产品只需四分之一到二分之一的剂量水平，即可诱导相对于Macrogard相同或更好的应答。

5.Macrogard酵母β葡聚糖提取物诱发比纯化藻类β葡聚糖产品低的吞噬作用应答，但表现相同甚至优于藻类粉产品。在一般情况下，所有的β葡聚糖制品对吞噬作用的总体影响比对NK细胞的细胞毒性和抗体产生的影响更加强。

6.这些结果证实了早期的、持续更短时间的(3天)研究，其发现相对于对照组和其它酵母β葡聚糖产品，如Fibosel酵母β葡聚糖提取物和其他普通酵母β葡聚糖产品而言，藻类粉和纯化的藻类β葡聚糖产品诱导出增强的免疫应答。

提供示例性实施方式以使得本公开内容将是彻底的，并且将充分地向本技术领域技术人员表达其范围。陈述了大量具体细节，如具体成分、设备和方法的示例，以提供对本公开内容的实施方式的彻底理解。对于本领域技术人员，具体细节须不被采用将是显而易见的，示例性实施方式可以体现为许多不同的形式，并且也不应被理解为限制本公开内容的范围。在一些示例性实施方式中，众所周知的方法、众所周知的设备结构和众所周知的技术没有进行详细说明。一些实施方式、材料、组合物和方法的等效变化、修改和变型，可以在本技术的范围内进行，具有基本上类似的结果。

Claims (44)

1.一种调节动物的免疫功能的方法，所述方法包括：

向动物施用包含β葡聚糖的组合物，所述β葡聚糖包含无支链的β-(1,3)-葡聚糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述β葡聚糖来源于眼虫。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述β葡聚糖来源于异养生长的眼虫。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述β葡聚糖基本上由无支链的β-(1,3)-葡聚糖组成。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述β葡聚糖具有约200kDa至约500kDa的平均分子量。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述β葡聚糖包含大于约90％的无支链的β-(1,3)-葡聚糖。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述β葡聚糖包含副淀粉。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述β葡聚糖是可溶的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物包含藻类粉，所述藻类粉包含所述β葡聚糖。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物还包含金属。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述金属包括选自由铁、镁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰、硒、碘以及它们的组合所组成的组中的成员。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述β葡聚糖与所述金属形成络合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述络合物包含锌β葡聚糖络合物。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用包括将所述组合物添加至动物的饮食中。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物还包含动物饲料成分。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述组合物被配制为代乳品，并且所述动物饲料成分包含蛋白质和脂肪。

17.一种动物饲料组合物，包含无支链的β-(1,3)-葡聚糖和动物饲料成分。

18.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，所述无支链的β-(1,3)-葡聚糖来源于眼虫。

19.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，所述无支链的β-(1,3)-葡聚糖来源于异养生长的眼虫。

20.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，所述无支链的β-(1,3)-葡聚糖平均分子量为约200kDa至约500kDa。

21.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，所述β葡聚糖包含副淀粉。

22.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，所述β葡聚糖是可溶的。

23.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，所述动物饲料组合物包含藻类粉，所述藻类粉包含所述β葡聚糖。

24.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，所述组合物还包含金属。

25.根据权利要求24所述的动物饲料组合物，其中，所述金属包括锌，并且所述无支链的β-(1,3)-葡聚糖与所述锌形成络合物。

26.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，所述动物饲料成分包含选自由虾青素、叶黄素、β-胡萝卜素、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、α生育酚以及它们的组合所组成的组中的成员。

27.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，在所述动物饲料中所述无支链的β-(1,3)-葡聚糖为约10ppm至约10,000ppm。

28.根据权利要求17所述的动物饲料组合物，其中，所述动物饲料组合物被配制为代乳品，并且所述动物饲料成分包含蛋白质和脂肪。

29.一种包含金属和β葡聚糖的络合物的组合物。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述β葡聚糖来源于眼虫。

31.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述β葡聚糖来源于异养生长的眼虫。

32.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述β葡聚糖基本上由无支链的β-(1,3)-葡聚糖组成。

33.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述β葡聚糖的平均分子量为约200kDa至约500kDa。

34.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述β葡聚糖包含大于约90％的无支链的β-(1,3)-葡聚糖。

35.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述β葡聚糖包含副淀粉。

36.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述β葡聚糖是可溶的。

37.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述组合物包含藻类粉，所述藻类粉包含所述β葡聚糖。

38.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述金属包括选自由铁、镁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰、硒、碘以及它们的组合组成的组中的成员。

39.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述络合物包含锌和β葡聚糖。

40.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述组合物包含选自由以下各项组成的组中的另外的免疫调节、应激降低、或其他刺激物成分：α生育酚、维生素D3、锌、铬、硒、精氨酸、抗坏血酸、烷基甘油、咖啡因、卡法椒、姜黄、螺旋藻、D-葡萄糖二酸钙、辅酶Q10、肽、二甲甘氨酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、α-亚麻酸、虾青素、β胡萝卜素、叶黄素、乳酸菌益生菌、双歧杆菌益生菌、甘露寡糖、低聚果糖、黄芪、紫锥花、施保利通、大蒜、谷胱甘肽、昆布、L-精氨酸、L-鸟氨酸、卵磷脂颗粒、来自舞茸、灵芝或蕈形香菇的提取物、锰、槲皮素、菠萝蛋白酶、橄榄叶、接骨木、Umcka、泛酸、槲皮素、α硫辛酸、芳香油、鱼油、香料及其衍生物、紫檀芪，以及它们的组合。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中，所述组合物悬浮于液体溶液。

42.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述组合物包含选自由以下各项组成的组中的另外的免疫调节、应激降低、或其他刺激物成分：α生育酚、维生素D3、锌、铬、硒、精氨酸、抗坏血酸、烷基甘油、咖啡因、卡法椒、姜黄、螺旋藻、D-葡萄糖二酸钙、辅酶Q10、肽、二甲甘氨酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、α-亚麻酸、虾青素、β胡萝卜素、叶黄素、乳酸菌益生菌、双歧杆菌益生菌、甘露寡糖、低聚果糖、黄芪、紫锥花、施保利通、大蒜、谷胱甘肽、昆布、L-精氨酸、L-鸟氨酸、卵磷脂颗粒、来自舞茸、灵芝或蕈形香菇的提取物、锰、槲皮素、菠萝蛋白酶、橄榄叶、接骨木、Umcka、泛酸、槲皮素、α硫辛酸、芳香油、鱼油、香料及其衍生物、紫檀芪，以及它们的组合。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中，所述组合物悬浮于液体溶液。

44.根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物是人类。