CN101384270A - 用灭活的或非感染性的细菌制备物控制肠道炎症综合征 - Google Patents

用灭活的或非感染性的细菌制备物控制肠道炎症综合征 Download PDF

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Abstract

本发明涉及灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌例如革兰氏阳性的兼性胞内菌例如分枝杆菌用于治疗肠道炎症综合征例如克隆病或溃疡性结肠炎的用途。

Description

用灭活的或非感染性的细菌制备物控制肠道炎症综合征
技术领域
本发明涉及灭活的或非感染性的革兰氏阳性菌例如革兰氏阳性的兼性胞内菌如分枝杆菌的制备物用于治疗肠道炎症综合征的用途。
背景技术
克隆病是一种见于儿童、青少年和成人的疾病，其可以是严重的疾病并且需要特殊的长期治疗，其发病率逐年增加。溃疡性结肠炎也是一种炎性肠病(IBD)，它是一种未知病因的、影响年轻对象的致残性疾病。这两种病的累计发病率为每10万人10到200人，不同国家有所不同。这些病变的发生可能涉及到近期的饮食改变和细菌菌群失调，但是没有报道准确的结果。对于克隆病而言，鸟型分枝杆菌属的类结核菌亚种(Mycobacterium avium sub.sp.paratuberculosis)的细菌已经被认为是克隆病的病因，其部分原因在于克隆病与Johne病相似，Johne病是一种影响牛的疾病，其在最初感染的数年后发病。最近，还提出了大肠杆菌黏附素(adhesin)、鞭毛蛋白或菌毛也涉及到疾病的病理过程。
特发性炎性肠病(IBD)包括一组未知病因的胃肠道疾病，表现为肠道炎症和与局部和全身并发症相关的慢性复发性病程。
IBD的发病机制仍不清楚，但是已经发现病变和症状与促炎性细胞因子的过量产生相关。IBD包括两大类：溃疡性结肠炎(UC)和克隆病以及这些疾病的中间变体，即表现出两种主要形式的重叠特征的未定型结肠炎。
这些炎性肠病都涉及到免疫应答。表现为连续进展以及长期缓解的临床谱提出了自身免疫机制参与其中的可能性，但是还不知道这是疾病的病因还是结果？特别是抗TNF-α带来的积极治疗也强调了涉及这些疾病的广义上的免疫学机制，尽管仍然没有提供任何准确的启动机制。
不同的小鼠试验模型部分再现了人类疾病。显示出菌群参与了疾病。与具有常规菌群的小鼠不同的是，维持在无菌饲喂条件下的小鼠没有发生炎性综合征。一些大鼠或小鼠的炎性肠病(IBD)模型涉及局部地沉积于结肠内的酚衍生物(TNBS)或数日摄入饮用水中的葡聚糖硫酸钠(DSS)所引起的局部致敏作用。调节性T淋巴细胞已经被认为是在IBD模型中发挥着作用。
炎性肠病综合征是致残性的慢性病变，其可以是致命性的，因为它们可能带来肠梗阻和需要反复手术处理。这些炎性综合征的药物治疗主要依据于使用强的抗炎性药、糖皮质激素、抗有丝分裂药和最近的抗TNF剂。任何造成所施用的抗炎性药剂量的降低或者可以取代这些抗炎性药的治疗都是重要的。
在分析可能控制小鼠的试验性哮喘机制的过程中，发现产生了CD4+CD25+调节细胞。所分泌的IL-10反过来保证了抗炎症活性的重要部分。在给那些经深度冻干(Extended Freeze Drying，EFD)灭活的牛分枝杆菌BCG处理过的动物的肺部施用过敏原后，炎性细胞数目的出现大量减少，这促使本发明人去确定EFD在其他已知其中具有免疫过敏或自身免疫现象的综合征中的最终活性。在再现类风湿关节炎的模型中，也报道了CD4+T淋巴细胞参与其中，CD4+CD25+T淋巴细胞的存在或转移可以终止疾病。
发明内容
本发明的目的是提供肠道炎性综合征例如炎性肠病(IBD)的治疗方法。
本发明的另一个目的是提供不需要抗炎药物的或减少所需的抗炎药物剂量的IBD治疗方法。因此，本发明提供了革兰氏阳性菌制备物用于预防和治疗肠道炎性综合征的用途，所述制备物的特点是革兰氏阳性细菌是灭活的或非感染性的，并且含有50％以上，优选地是90％以上的天然结构的细菌蛋白组分。
本发明还提供了用于预防或治疗因Th1/Th2失衡引起的疾病的方法，所述方法包括步骤：
a.提供灭活的或非感染性的革兰氏阳性菌制备物或其保留了抑制肠道炎性综合征的能力的部分；和
b.给患有所述疾病的患者施用有效量的灭活的革兰氏阳性细菌制备物或其部分。
本发明仍提供了用于预防或治疗肠道炎性综合征的方法，所述方法包括给患者施用革兰氏阳性细菌制备物的步骤，由此刺激产生白细胞调节细胞。
本发明还提供了用于治疗和/或预防肠道炎性肠病的组合物，其包含经以下步骤制备的革兰氏阳性细菌组合物：
a)收集活细菌细胞的培养物；
b)在水中或盐例如硼酸盐的水溶液中洗涤细菌细胞；
c)冷冻水中或盐例如硼酸盐的水溶液中的细菌细胞；
d)通过在冻干机中将所述细菌细胞干燥来灭活冷冻的细菌细胞，干燥的时间足以去除至少98.5％的水，优选地去除至少99％，更优选地去除至少99.5％的水；和
e)收集深度冻干的细菌细胞。
附图说明
图1显示了在向饮用水中加入2.5％DSS7天后(C57B1/6雄性小鼠)体重和肛门炎症的变化。
图2显示了在接受含DSS的饮用水的小鼠和对照(非DSS饲喂)的小鼠之间的结肠长度的差异。试验模型：接受含2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水7天的C57B1/6雄性小鼠。在开始DSS饲喂后第10天收集结肠。
图3显示了在经EFD处理过的和未处理过的小鼠之间的结肠长度的差异。小鼠在7天内接受含DSS的饮用水。一组小鼠经过EFD处理：在饲喂DSS前第21天皮下给予100μg；或者在饲喂DSS之前第21、20、17和16天口服1mg。在开始DSS饲喂后的第10天收集结肠。
图4显示了对照组(无EFD处理和无DSS饲喂)、EFD处理小鼠(DSS饲喂)和未处理小鼠(DSS饲喂)之间的结肠长度的差异。EFD处理过的小鼠的结肠与那些对照小鼠的结肠相似。测量盲肠与肛门之间的结肠长度。
图5显示了EFD处理对炎性肠病的预防作用。EFD处理小鼠的结肠与对照小鼠(无EFD和无DSS处理)的结肠相似(***表示经ANOVA统计学检验p<0.001)。在第8天或第10天，即在结束DSS饲喂后的第1或3天，测量结肠的长度。
图6显示了EFD处理对炎性肠病的预防作用。EFD处理小鼠没有发生严重的腹泻或没有腹泻，而对照组(DSS处理过的小鼠)则发生了。
图7显示了对照(无DSS饲喂和无EFD处理)小鼠的结肠的组织学切片。
图8显示了图7的照片的一部分的放大图。
图9显示了经DSS饲喂的小鼠的结肠的组织学切片。
图10显示了图9的照片的一部分的放大图。
图11显示了在DSS饲喂前经EFD处理过的小鼠的结肠的组织学切片。
图12显示了图11的照片的一部分的放大图。
图13a显示了对照小鼠的结肠的组织学切片。
图13b显示了经DSS饲喂过的小鼠的结肠的组织学切片。
图13c显示了在DSS之前经EFD处理过的小鼠的结肠的组织学切片。
图14a、b和c分别是图13a、b和c的放大图。
图15显示了TNBS的初步试验。在第-5和0天，C57B1/6雄性小鼠在结肠部位局部接受TNBS(1mg溶于100μl 50％乙醇)两次或未接受TNBS。观察它们的大便10天。在第10天，称量小鼠。一组小鼠在第一次施用TNBS前5天(即第-10天)时接受皮下注射的100μg EFD 5天。第二组接受PBS。对照组没有接受TNBS，也没有接受EFD。图中显示出了以克为单位的体重(y轴)。
图16显示了EFD在10天观察期内对方案2小鼠中的DSS诱导的IBD的作用：a)体重和b)肛门炎症和大便。根据方案2，C57B1/6雄性小鼠在5天内接受或未接受含葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水。一组在开始DSS饲喂前第21天接受皮下注射100μg EFD。一组接受PBS。最后一组即对照组没有饮用DSS。这个方案与图6以及下面的图17到24中的方案相同。x轴中的第0天对应于DSS饲喂的第1天。EFD的预处理减轻了IBD症状。
图17显示了EFD预处理对方案2的DSS饲喂小鼠的作用，用结肠和盲肠长度进行评价。在开始DSS饲喂后第10天时测量结肠和盲肠长度。DSS饲喂引起的严重的炎症反应造成了PBS处理小鼠的肠壁增厚和结肠长度缩短，但是结肠重量未发生改变。EFD处理小鼠的结肠和盲肠与对照组相似(***表示ANOVA统计检验的p<0.001)。
图18显示了在开始DSS饲喂后第10天对肠系膜淋巴结细胞数目的作用。收集肠系膜淋巴结，将其分离，并测定它们的细胞含量。观察到了细胞数目的增加(x2.5)。当小鼠先前已经接受过EFD处理时，所述细胞数目的增加是临界的(***表示ANOVA统计检验的p<0.001)。
图19显示了EFD对结肠组织(a)中的细胞因子和淋巴因子的作用。在开始DSS饲喂后第10天，收集结肠组织样本，称重，并在蛋白酶抑制剂中将其分离。测定出其中不同的细胞因子和淋巴因子的含量。在PBS和EFD处理小鼠之间没有观察到IL-12p40和RANTES的统计学显著性差异。
图20显示了EFD对结肠组织(b)中的细胞因子和淋巴因子的作用。对于参与炎症过程的IL-1β、TNF-α和MIP-1α而言，在PBS和EFD处理小鼠之间观察到了统计学显著性差异，因此EFD处理预防了DSS饲喂诱导的炎症。
图21显示了EFD对结肠组织(c)中的细胞因子和淋巴因子的作用。活化T细胞产生的IL-17刺激不同的细胞系产生炎症和造血相关的细胞因子。在EFD处理之后观察到了更少的活化T细胞(根据测定到的IFN-γ的量)和更少的IL-17产生。
图22显示了EFD对结肠组织(d)中的细胞因子和淋巴因子的作用。KC(IL-8的鼠等价物)、IL-6和IL-1α都是“炎性”细胞因子或者都参与了NFκB信号传导途径。在EFD处理后减少了它们的产生。
图23显示了EFD对结肠组织(e)中的细胞因子和淋巴因子的作用。如先前显示减少了IL-17产生的结果所示，EFD处理后减少了造血细胞因子IL-3、GM-CSF和G-CSF的产生。
图24显示了EFD处理预防了饮用添加有DSS的水的小鼠脾脏中GATA-3蛋白水平增加。在EFD处理30天后，脾脏中产生了大量的T-bet蛋白。加工处理了来自DSS饲喂小鼠中的两个样品a和b。
图25显示了接受含葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水3次的EFD处理和未处理小鼠在EFD处理后数天时的体重差异。这个模型探讨了EFD对慢性IBD的预防性处理。小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受含1.5％DSS的饮用水7天、普通自来水8天、含1.5％DSS的饮用水5天、自来水10天、含1.5％DSS的饮用水5天、之后饮用自来水。一组小鼠接受过EFD处理：在DSS饲喂第一天前第21天皮下给予100μg；或者在第一次DSS饲喂前第23、22和21天口服1mg。它们没有接受过更多的EFD处理。每周5天都要每天检查每只小鼠的体重。在第52天结束试验。
图26显示了在预防性测试(图25)所含的小鼠中进行的结肠炎评分。根据以下标准进行评分：
- 0：大便无变化
- 1：肛门炎症
- 2：肛门炎症加软便
- 3：肛门炎症加腹泻
- 4：肛门炎症加血性腹泻
图27上方显示了预防性测试(图25)中的小鼠在第52天时的结肠长度的差异，测量盲肠与肛门之间的结肠长度。EFD处理小鼠的结肠与从未饲喂过DSS的纯真小鼠(naive mice)的结肠相似(**表示ANOVA统计学检验的p<0.01，***表示p<0.001)。
图27下方显示了所收集到的预防性测试(图25)中的小鼠在第52天时的肠系膜淋巴结中的细胞数目。EFD处理小鼠的淋巴结比PBS处理小鼠的淋巴结有着更少的细胞数目(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图28显示了预防性测试(图25)中的小鼠在第52天时的脾脏重量和脾细胞数目。差异没有显著性。
图29显示了在第52天时从预防性测试(图25)中的小鼠中收集到的脾细胞自发释放出一些炎症细胞因子。将2 x 105个细胞在0.2ml组织培养基中37℃下孵育96h，收集上清液并用Multiplex BioRad检测法测定出IFN-γ、IL-6和IL-17的浓度。观察到了在PBS和EFD处理之后所有细胞因子浓度都有着极为显著的差异，但是IL-17最为显著。
图30上方显示了转录因子NFκ-B的浓度。按照产品说明书，用Active Motif出售的试剂盒测定NFκ-B。测定第52天时从预防性测试(图25)中的小鼠收集到的脾细胞的5μg核提取物的光密度作为所述转录因子。在PBS和EFD处理之后观察到的差异是非常显著的(**表示ANOVA统计学检验的p<0.01)或极为显著的(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图30下方显示了转录因子PPARγ的浓度。按照产品说明书，用Active Motif出售的试剂盒测定PPARγ。测定第52天时从预防性测试(图25)中的小鼠收集到的脾细胞的5μg核提取物的光密度作为所述转录因子。在PBS和EFD处理之后观察到的差异是非常显著的(**表示ANOVA统计学检验的p<0.01)或极为显著的(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图31显示了已经接受含葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水5天的经EFD处理和未处理的小鼠的体重的差异。这个模型探讨了EFD对急性IBD的治疗性处理。小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受了含2.5％DSS的饮用水5天，随后饮用自来水。一组小鼠接受EFD处理：在DSS饲喂末日后24小时即第6天皮下给予100μg；或者在DSS饲喂第一天后的第6、7、和8天口服1mg。此后它们不再接受更多的EFD处理。每周5天每天都检查每只小鼠的体重。试验在第34天结束。在EFD处理之后，在第13和15天观察到了轻微的、具有显著意义的治疗作用(*p<0.05)，以及更快的体重恢复。
图32显示了对治疗性测试(图31)中的小鼠进行的结肠炎评分。根据先前的描述(图26)进行评分。EFD处理小鼠的临床症状缓解得更快。
图33上方显示了治疗性测试(图31)中的小鼠在第34天时的结肠长度的差异，测量盲肠与肛门之间的结肠长度。EFD处理小鼠的结肠与从未饲喂过DSS的纯真小鼠的结肠相似(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图33下方显示了所收集到的治疗性测试(图31)中的小鼠在第34天时的肠系膜淋巴结中的细胞数目。EFD处理小鼠的淋巴结比PBS处理小鼠的淋巴结有着更少的细胞数目，差异是统计学显著的。
图34显示了治疗性测试(图31)中的小鼠在第34天时的脾脏重量(上)和脾细胞数目(下)。差异没有显著性差异。
图35显示了在第34天时从治疗性测试(图31)中的小鼠中收集到的脾细胞自发释放出一些炎症细胞因子。将2 x 105个细胞在0.2ml组织培养基中37℃下孵育96h，收集上清液并用Multiplex BioRad检测法测定出IFN-γ、IL-6和IL-17的浓度。观察到了在PBS和EFD处理之后IL-17有着极为显著的差异(p<0.001)，而IFN-γ和IL-6没有显著性差异。
图36上方显示了转录因子NFκ-B的浓度，测定第34天时从治疗性测试(图31)中的小鼠收集到的脾细胞的5μg核提取物的光密度作为所述转录因子的浓度。在PBS和EFD处理之后观察到的差异是极为显著的(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图36下方显示了转录因子PPARγ的浓度，测定第34天时从治疗性测试(图31)中的小鼠收集到的脾细胞的5μg核提取物的光密度作为所述转录因子的浓度。在PBS和EFD处理之后观察到的差异是极为显著的(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图37显示了接受含葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水三次数日以及在第一系列DSS处理之后接受了EFD处理的EFD处理小鼠和未处理小鼠之间的体重差异。这个模型探讨了EFD在慢性IBD中的治疗性和预防性处理的作用。小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受含1.5％DSS的饮用水7天、普通自来水8天、含1.5％DSS的饮用水5天、自来水10天、1.5％DSS 5天，随后饮用自来水。一组小鼠接受EFD处理：在第一次DSS饲喂后第9天皮下给予100μg；或者在DSS饲喂第一天后的第9、10、和11天口服1mg。此后它们不再接受更多的EFD处理。每周5天每天都检查每只小鼠的体重。试验在第52天结束。在EFD处理之后，在第13和15天观察到了轻微的、具有显著意义的治疗作用，以及更快的和稳定的体重恢复。
图38显示了对治疗性和预防性测试(图37)中的小鼠进行的结肠炎评分。根据先前的描述(图26)进行评分。经皮下EFD处理过的小鼠的临床症状得到了缓解。
图39上方显示了治疗性和预防性测试(图37)中的小鼠在第52天时的结肠长度的差异，测量盲肠与肛门之间的结肠长度。EFD处理小鼠的结肠与PBS小鼠的结肠基本相似。
图39下方显示了所收集到的治疗性和预防性测试(图37)中的小鼠在第52天时的肠系膜淋巴结中的细胞数目。只有经皮下EFD处理过的小鼠的淋巴结的细胞数目得到了减少(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图40显示了治疗性和预防性测试(图37)中的小鼠在第52天时的脾脏重量(上)和脾细胞数目(下)。只有经皮下EFD处理过的小鼠的脾脏重量和脾细胞数目得到了减少(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图41显示了在第52天时从治疗性和预防性测试(图37)中的小鼠中收集到的脾细胞自发释放出一些炎症细胞因子。将2 x 105个细胞在0.2ml组织培养基中37℃下孵育96h，收集上清液并用Multiplex BioRad检测法测定出IFN-γ、IL-6和IL-17的浓度。观察到了在PBS和EFD处理之后所有细胞因子浓度都有着极为显著的差异，但是IL-17最为显著。
图42上方显示了转录因子NFκ-B的浓度，测定第52天时从治疗性和预防性测试(图37)中的小鼠收集到的脾细胞的5μg核提取物的光密度作为所述转录因子的浓度。在PBS和EFD处理之后观察到的差异是极为显著的(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图42下方显示了转录因子PPARγ的浓度，测定第52天时从治疗性和预防性测试(图37)中的小鼠收集到的脾细胞的5μg核提取物的光密度作为所述转录因子的浓度。在PBS和EFD处理之后观察到的差异是极为显著的(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图43显示了接受含葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水三次数日以及在末次DSS处理之后接受了EFD处理的EFD处理小鼠和未处理小鼠之间的体重差异。这个模型探讨了EFD在慢性IBD中的治疗性处理作用。小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受含1.5％DSS的饮用水7天、普通自来水8天、含1.5％DSS的饮用水5天、自来水10天、含1.5％DSS的饮用水5天，随后饮用自来水。一组小鼠接受EFD处理：在末次DSS饲喂后第7天皮下给予100μg；或者在首次DSS饲喂后的第42、43、和45天口服1mg。每周5天每天都检查每只小鼠的体重。试验在第54天结束。在皮下EFD处理之后，在第54天观察到了轻微的治疗作用，以及体重恢复。
图44显示了对慢性IBD的治疗性测试(图43)中的小鼠进行的结肠炎评分。根据先前的描述(图26)进行评分。经皮下EFD处理过的小鼠的临床症状得到了缓解。
图45上方显示了慢性IBD的治疗性测试(图43)中的小鼠在第54天时的结肠长度的差异，测量盲肠与肛门之间的结肠长度。EFD处理小鼠的结肠与PBS小鼠的结肠基本相似(*表示ANOVA统计学检验的p<0.05)。
图45下方显示了所收集到的慢性IBD的治疗性测试(图43)中的小鼠在第54天时的肠系膜淋巴结中的细胞数目。只有经皮下EFD处理过的小鼠的淋巴结的细胞数目得到了减少(***表示ANOVA统计学检验的p<0.001)。
图46显示了慢性IBD的治疗性测试(图43)中的小鼠在第54天时的脾脏重量(上)和脾细胞数目(下)。只有经皮下EFD处理过的小鼠的脾脏重量和脾细胞数目得到了减少(*表示ANOVA统计学检验的p<0.05，**表示p<0.01)。
图47显示了在第54天时从慢性IBD的治疗性测试(图43)中的小鼠中收集到的脾细胞自发释放出一些炎症细胞因子。将2 x 105个细胞在0.2ml组织培养基中37℃下孵育96h，收集上清液并用Multiplex BioRad检测法测定出IFN-γ、IL-6和IL-17的浓度。观察到了在PBS和EFD处理之后所有细胞因子浓度都有着极为显著的差异(p<0.001)，但是IL-17最为显著。
图48上方显示了转录因子NFκ-B的浓度，测定第54天时从慢性IBD的治疗性测试(图43)中的小鼠收集到的脾细胞的5μg核提取物的光密度作为所述转录因子的浓度。在PBS和EFD处理之后观察到的差异是极为显著的(*表示ANOVA统计学检验的p<0.05，***表示p<0.001)。
图48下方显示了转录因子PPARγ的浓度，测定第54天时从慢性IBD的治疗性测试(图43)中的小鼠收集到的脾细胞的5μg核提取物的光密度作为所述转录因子的浓度。在PBS和EFD处理之后观察到的差异是非常或极为显著的(**表示ANOVA统计学检验的p<0.01，***表示p<0.001)。
发明详述
定义
本发明中的表述“灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物”在此指的是如WO03049752所述的灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌的制备物。该革兰氏阳性细菌制备物含有灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌，所述制剂是通过不会变性所含分子的结构特别是所含蛋白的结构的方法获得的。有利地，革兰氏阳性细菌制备物含有深度冻干灭活的细菌以及小于1.5％的残余水，优选地小于1％，更优选地小于0.5％。通过收集活的细菌细胞、在水中或盐例如硼酸盐的水溶液中洗涤细菌细胞、冷冻水中或盐例如硼酸盐的水溶液中的细菌细胞、在冻干机中干燥细菌细胞一段足以去除至少98.5％的水分，优选地至少99％的水分，更优选地至少99.5％的水分的时间以灭活冷冻的细菌细胞、以及收集深度冻干灭活的细菌细胞来制备出这些深度冻干灭活的细菌。
本发明的表述“革兰氏阳性细菌制备物”也覆盖了这种深度冻干灭活的细菌制备物的一部分。所述部分选自以下一组：由所述灭活细菌制备物的有机溶剂提取物组成的部分、由所述灭活细菌制备物的糖苷酶处理的提取物组成的部分、由所述灭活细菌制备物的DNA酶和/或RNA酶消化过的提取物组成的部分、以及由经有机溶剂、糖苷酶、DNA酶和/或RNA酶以及最后的蛋白酶连续处理过的所述灭活细菌制备物组成的部分。
本发明中的表述“肠道炎症综合征”在此表示任何炎性肠病，包括两大类疾病即克隆病和溃疡性结肠炎以及这些疾病的中间变体，即中间型结肠炎，其表现出了先前提及的两种疾病的重叠的特点。
革兰氏阳性细菌制备物的用途
本发明也涉及革兰氏阳性细菌制备物用于预防和治疗肠道炎症综合征的用途，所述制备物的特点是其中革兰氏阳性细菌是灭活的或非感染性的，以及含有超过50％以及优选地超过90％的天然结构的细菌蛋白组分。本发明的革兰氏阳性细菌制备物也可以用于制备用于预防和/或治疗肠道炎症综合征的药物。
在本发明的优选的实施方式中，革兰氏阳性细菌制备物是革兰氏阳性的兼性胞内菌。革兰氏阳性的兼性胞内菌表示该革兰氏阳性细菌能够在合成培养基体外生长，并能够体内感染来自哺乳动物或非哺乳动物的真核细胞并在这些细胞例如巨噬细胞中增殖。
在另一个优选的实施方式中，细菌制备物含有选自由李斯特菌属、棒杆菌属、和包括分枝杆菌、奴卡菌和红球菌的放线菌组成的组中的革兰氏阳性的兼性胞内菌。
更优选地，细菌制备物含有牛型分枝杆菌(Mycobacterium bovis)，以及甚至更优选地含有牛型分枝杆菌BCG。
本发明也涉及灭活的或非感染性的细菌制备物或其部分用于制备用于治疗和/或预防包括免疫失调例如Th1/Th2失衡的疾病的药物的用途。在本发明的优选的实施方式中，所述疾病是克隆病或溃疡性结肠炎。
灭活细菌制备物或其部分可以与可药用载体和/或免疫刺激剂、和/或佐剂和/或下面所定义的任何传统的添加剂相连接。可以通过口服、舌下、肠外或鼻内途径施用本发明的革兰氏阳性细菌制备物和/或药物。
药物组合物
如上面所提及的那样，本发明涉及灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物用于制备用于预防和/或治疗肠道炎性疾病的药物组合物的用途。
在本发明的一个实施方式中，所述组合物是通过以下步骤获得的：
a)收集活细菌细胞的培养物；
b)在水中或盐例如硼酸盐的水溶液中洗涤细菌细胞；
c)冷冻水中或盐例如硼酸盐的水溶液中的细菌细胞；
d)通过在冻干机中干燥细菌细胞来灭活冷冻的细菌细胞，干燥的时间足以去除至少98.5％的水分，优选地至少99％的水分，更优选地至少99.5％的水分；和
e)收集深度冻干灭活的细菌细胞。
本发明的组合物优选地是适用于口服施用的形式。例如，组合物可以是用于口服施用的片剂、普通胶囊、凝胶胶囊或糖浆的形式。这些凝胶胶囊、普通胶囊和片剂形式都可以含有常用于药物组合物中的赋形剂例如佐剂或结合剂如淀粉、树胶和凝胶；佐剂如磷酸钙；崩解剂例如玉米淀粉或海藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；湿化剂或芳香剂。通过添加药物兼容的溶剂可以在水性或非水性介质中制备出溶液或悬浮液。这些溶剂包括乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚乙二醇醚、DMSO和乙醇。
在本发明的另一个优选的实施方式中，本发明的组合物优选地是适用于肠外施用例如皮下注射的形式。对于肠外施用例如皮下注射，载体优选地包括水、盐缓冲液、乳糖、谷氨酸盐、脂肪或石蜡。对于口服施用，可以采用任一上面的载体或固体载体例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、多糖钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。可生物降解的微球(例如polylactic galactide)也可以用于本发明的药物组合物。例如在美国专利4,897,268和5,075,109中阐述了合适的可生物降解的微球。
本发明的组合物还可以含有添加剂和/或免疫刺激剂和/或佐剂例如含本发明的细菌细胞或其部分的脂质体。用于制备本发明的药物组合物的添加剂可以选自抗聚集剂、抗氧化剂、染料、香味增强剂、或光滑剂、组装剂或分离剂，可以选自任一常用于药物工业中的赋形剂。
任何一种佐剂都可以用于本发明的组合物，以便增强免疫应答。大多数佐剂都含有被设计用于保护抗原被快速代谢或产生可控的炎性反应的物质，例如氢氧化铝或矿物油以及免疫应答的非特异性刺激物如脂质A、百日咳毒素。合适的佐剂也是商品化可获得的，例如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂，其不能被用于人体注射。其他可以用于人体的合适佐剂包括氢氧化铝、可生物降解的微球、单磷酰脂A(monophospheryl A)和Quil A。
预防或治疗的方法
在本发明的一个实施方式中，灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物被用于预防和治疗选自由克隆病和溃疡性结肠炎组成的肠道炎性疾病。本发明的方法包括给患者施用足以刺激产生白细胞的调节细胞例如CD4+CD25+T细胞、B细胞和/或树突状细胞的有效量的灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物。
在本发明的另一个实施方式中，提供了用于预防或治疗因Th1/Th2失衡引起的疾病的方法。方法包括步骤a)提供本发明的灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物或其保留了抑制肠道炎症综合征的能力的部分或本发明的药物组合物；和b)给患有所述疾病的患者施用有效量的革兰氏阳性细菌制备物。
如上提及的那样，肠道炎症综合征可以是克隆病或溃疡性结肠炎。
本发明组合物中的革兰氏阳性细菌制备物的量优选地是治疗有效量。治疗有效量的革兰氏阳性细菌制备物是使得革兰氏阳性细菌制备物实现其抑制肠道炎症综合征的作用且不引起被施用组合物的宿主体内的过多的负面作用所必需的量。所用的革兰氏阳性细菌制备物和所施用的组合物的实际量可以有所不同，取决于下面的因素例如所治疗的肠道炎症综合征的类型、施用方式以及组合物中的其他组分。优选地，组合物是由从约10μg到约10mg以及更优选地从约100μg到约1mg灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物组成的。“约”在此表示所述的灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物的量(μg或mg)可以在特定的范围内有所不同，这取决于用于评价所述量的方法的误差范围。
例如，在口服施用本发明的组合物期间，被治疗的宿主在连续3天内每天接受1个剂量的约10μg到约10mg的灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物。可以在1周后重复治疗1次。
对于肠外施用例如皮下注射，被治疗的宿主可每个月或每6个月接受1个剂量的约10μg到约10mg以及更优选地从约100μg到约1mg的灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物。
革兰氏阳性细菌制备物的制备方法
例如，可以用“软方法”灭活本发明的革兰氏阳性细菌，所述“软方法”不会变性来自细菌细胞的分子，因此当它们被施用给患有免疫失调的对象时，它们能够体内刺激白细胞调节细胞(CD4+CD25+T细胞和/或B细胞和/或树突状细胞)。因此，本发明的革兰氏阳性细菌制备物可以包括热灭活的分枝杆菌制备物。在本发明的优选的实施方式中，通过冻干法灭活革兰氏阳性细菌。被称作软方法的这些方法包括但不限于使用破坏细菌细胞膜同时保留其大分子组分的结构的物理方式。这些方法包括但不限于深度冻干、在硅珠(silica bead)或锆珠中的碾磨、使用所谓的“法国压(French press)”、超声或伽玛射线照射。可以用于获得如上定义的灭活细菌制备物的其他方法是本领域普通技术人员已知的。
不会变性来自细菌细胞的分子的结构的方法表示不会造成分子构象的过多变性的方法。优选地，这种方法保留了来自细菌细胞的微分子例如蛋白、多糖和脂质的三维结构。
实施例
一般信息
为了检验EFD减轻IBD的炎症反应的能力，研究了两种IBD的小鼠模型：
- 继发于TNBS局部致敏的IBD；
- 继发于DSS饲喂的IBD。
继发于TNBS局部致敏的IBD
TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸)是一种含有酚衍生物的化学物，其产生了“纯的”T淋巴细胞依赖性的致敏作用。通过经插入肛管内的小管向结肠内局部输送TNBS溶液进行致敏。数天后，同一化学物的局部输送产生了具有由局部T细胞应答产生的溃疡性的炎性病变。
这个模型的优点是能够研究T细胞依赖性炎症反应。
这个模型的缺点如下：
- 每只小鼠都必须被麻醉两次，要小心的操作以便将细管插入到肛门内；
- TNBS是人体的强致敏剂。致敏实验室工作人员的危险很高，已知等效的酚衍生物在我们所处的环境中常见。必须要非常谨慎的进行操作。
继发于DSS饲喂的IBD
DSS(葡聚糖硫酸钠)是一种当摄入后能够在小鼠内产生局部的肠道病变的化学物。其经饮用水的输送是便利的。它是比TNBS更弱的致敏剂，对实验室工作人员的危险更小。已经了解了其部分致病机制，无细菌小鼠(germ-free mice)缺少DSS诱导的病变排除了直接的、单一的、免疫学机制。在人体的克隆病中也观察到了存在肠道细菌的必要性，一些学者提出了DSS模型比TNBS模型更接近于人类疾病。
实施例I：DSS诱导的IBD的预防模型(短期作用)
方案
方案1
6到7周大的C57B1/6小鼠被分成4组，每组10只小鼠：
- 第1组的小鼠没有接受任何处理，它们作为对照组；
- 第2组的小鼠接受了100μl等张盐水的皮下注射。在21天后，用2.5％DSS水溶液取代它们的饮用水共7天；
- 在第1和2天用1mg EFD饲喂第3组的小鼠，以及在第8和9天再次用1mg EFD饲喂小鼠。在第21天起用DSS溶液取代它们的饮用水共7天；
- 第4组的小鼠在第1天接受含100μg EFD的100μl盐溶液的皮下注射。在第21天起用DSS溶液取代它们的饮用水共7天。
在第8天(5只小鼠)或第10天(5只小鼠)处死全部小鼠，以便分析早期的病理学改变：结肠长度、组织学表现。
方案2
这个方案与方案1相似。C57B1/6雄性小鼠(每组10只小鼠)接受或未接受含葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水5天。这个方案比方案1稍轻，给予DSS5天而不是7天。一组小鼠在DSS饲喂前第21天接受100μg EFD皮下注射。一组接受PBS而不是EFD。最后一组对照组没有接受DSS也没有接受EFD。
Figure A200680053234D00201
在开始摄入DSS后8天或10天内进行每日称重和动物观察。建立总结了所观察到的征象的强度的临床评分：
- 0：正常小鼠；
- 1：肛门炎症
- 2：肛门炎症和软便
- 3：肛门炎症和腹泻
- 4：肛门炎症和血性腹泻
在开始摄入DSS后的第8天，处死每组中的4只动物，收集并测量它们的结肠(肛门和盲肠之间的长度)，将其放入Tissue-Tek O.C.T.(SakuraFinetek)内并冷冻用于组织学检查。在第10天处死幸存的小鼠。
在第10天收集结肠组织的样品，以便用Multiplex试剂盒(BioRad)测定出它们的不同的细胞因子/淋巴因子的含量。
结果
1.小鼠的体重曲线和临床表现
接受葡聚糖硫酸钠溶液作为饮用水的未经EFD处理过的小鼠(第2组)出现体重的快速下降(图1左侧)。小鼠的活泼度在摄入DSS的第6天或第7天出现明显下降；在停止DSS输入后的24小时或72小时根本没有恢复或者没有恢复得很好。3只小鼠在第8天死亡。
来自组3和4的经口服或皮下EFD处理过的小鼠显露出病态，但是不严重；它们仍然是活泼的并且是容易恢复的。这些组中没有死亡。
经方案2的EFD处理过的小鼠组显示出与对照小鼠组相似的重量曲线(图16a)，说明EFD预处理减轻了IBD症状。
2.临床评分
未经EFD处理过的小鼠在摄入DSS 4天或5天后出现临床评分的升高(炎症和腹泻)。该评分在7到8天后快速升高(图1右侧)。
当进行相互比较时，发现经EFD处理过的小鼠在开始DSS摄入后的第4和5天表现出相同的临床评分，所述评分比在未处理过的动物中观察到的评分升高的更少。然后所述评分逐渐恢复到正常。已经EFD处理过的小鼠在第7天和第8天没有表现出肛门炎症和腹泻(图6)。方案2中已经EFD处理过的小鼠表现出与对照小鼠相似的临床评分(图16b)。
3.结肠的炎症
a)大体检查
在开始摄入DSS后第8或10天，即在停止所述摄入后第1或3天处死动物。没有观察到依赖于尸解日期的差异。对照动物的结肠含有很多粪便，随着它们向肛门的移动逐渐变得更硬。结肠的平均长度是6.7cm(图5)。接受了DSS的动物的结肠长度减少到了约3.8cm(图2和5)。在DSS处理过的小鼠中，粪便是软的，且结肠常常是出血性的。
已经EFD处理过的动物的结肠含有多少有点硬的粪便，其性状与对照小鼠的粪便相同(图4)。结肠的平均长度为5.8cm(图5)。在不同施用模式的EFD处理的作用之间没有观察到显著差异(图5)。
经方案2的EFD处理过的小鼠显示出与从未饲喂过DSS的对照小鼠相似的结肠和盲肠的长度(图17)。
b)显微镜下检查
对施用DSS后的病变的显微镜下检查显示出肠道黏膜水平的强烈的炎症应答、与肠壁增厚相关的肠系膜插入水平的严重的黏膜下水肿。肠绒毛是分离的和部分无结构的(图9和10相对于作为对照的图7和8、图13和14)。
在摄入DSS之前经EFD处理过的动物中，病变明显没有这么严重(图11和12相对于作为对照的图7和8)。肠绒毛具有与对照动物接近的形态(图13和14)。
c)结肠组织和脾脏中的炎症调节物
IL-12p40、IL-12p70、RANTES、IL-1β、TNFα、MIP-1α、IL-17、IFNγ、IL-10、KC、IL-6、IL-1α、IL-3、GM-CSF、和G-CSF的量。
根据产家推荐(Bio-Rad)，用Bioplex方法测定出所有的细胞因子和淋巴因子。
脾脏中T-bet和GATA-3蛋白的量。
将从脾脏细胞中提取出的总蛋白溶解于7.5％ SDS-PAGE中，然后用E.Schmitt和C.Richter(Institute of Immunology，Mainz，Germany)惠赠的多克隆的兔抗小鼠FOXP3IgG抗体和小鼠单克隆抗T-bet抗体、小鼠单克隆的抗GATA-3抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)或小鼠单克隆的抗β-actin抗体(Ac-15 Abcam，Cambridge，UK)探测被转移到硝基纤维素膜上的蛋白条带。用HRP标记的多克隆的山羊抗兔抗体(DakoCytomation，Denmark)作为二抗。用增强化学发光检测系统(Amersham，France)检测出免疫复合物。
在从饮用含DSS的饮用水的小鼠收集到的结肠样品中存在着高浓度的炎症细胞因子和淋巴因子。这些分子是小鼠中所观察到的严重的病理学改变的起因或结果。在摄入DSS之前经EFD皮下处理过的动物中，这些分子的浓度是在接受没有DSS的自来水的对照动物中所观察到的浓度的范围内。
d)肠系膜淋巴结细胞数目
肠系膜淋巴结大小的增加常与结肠疾病相关，特别是与炎性肠病相关。
在开始DSS饲喂后的第10天，收集方案2中的小鼠的肠系膜淋巴结，并将其在细胞过滤器(Falcon)中压碎。用加有5％ FCS的AIM V培养基(Gibco)洗涤分离的细胞，离心并将沉淀的细胞重悬于0.5或1ml培养基中。在马拉色盒(Malassez cell)中，用台盼兰(0.1％PBS溶液)将细胞稀释10倍，并在显微镜下计数。与对照小鼠相比较，在经PBS处理的和DSS饲喂的小鼠中观察到了细胞数目的增加(x2.5)。EFD预防性处理容许将所述细胞数目显著地减少到了对照小鼠的数值(图18)。
实施例II：DSS诱导的慢性IBD的预防模型(长期作用)
这个模型研究了EFD在慢性IBD中的预防性处理的作用。
方案
6到7周大的C57B1/6小鼠被分成4组，每组10只小鼠。
小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受含1.5％DSS的饮用水7天、普通自来水8天、含1.5％DSS的饮用水5天、自来水10天、1.5％DSS 5天，随后接受自来水。一组小鼠接受EFD处理：在DSS饲喂首日前第21天皮下注射100μg或在DSS饲喂首日之前的第23、22和21天口服1mg。它们不再接受EFD治疗。试验在第52天结束。
Figure A200680053234D00231
结果
体重曲线
经口服或皮下EFD处理的小鼠表现出与未经EFD处理和经DSS饲喂的小鼠相似的体重下降以及体重再次恢复，但在三个系列的DSS摄入后第50天试验结束时，预防性处理使得小鼠具有与对照小鼠非常接近的体重(图25)。
临床评分
在图26中，在试验结束时(第50天)，未经EFD处理过的小鼠在DSS饲喂结束后表现出临床评分的持续增加。EFD预处理容许小鼠在试验结束时具有正常的临床评分，而未经EFD处理过的小鼠在三次IBD刺激之后表现出其临床评分的持续增加。
结肠的炎症
在试验结束时(第52天)，EFD处理过的小鼠的结肠与从未饲喂过DSS的纯真小鼠的结肠相似(图27上)。
淋巴结和脾脏
在试验结束时(第52天)，EFD处理过的小鼠的淋巴结中的细胞数目要比PBS处理过的小鼠更少，预计其可以逐步恢复到从未饲喂过DSS的对照小鼠的细胞数目(图27下)。
如图28所示，本预防性测试所含的小鼠在第52天时的脾脏重量和脾细胞数目的差异都不是统计学显著性的差异。
脾脏释放的炎症调节物
研究了在试验结束时(第52天)收集到的脾细胞自发释放一些炎症细胞因子的情况。对于所有的细胞因子(IFNγ、IL-6和IL-17)而言，观察到了PBS和EFD预处理之后的差异是极为显著的，但是IL-17的差异则更为明显。慢性IBD后的EFD预处理容许保持与从未饲喂过DSS的纯真小鼠相似的细胞因子水平(图29)。
已知核因子κB(NF-κB)在炎性肠病中受到了活化，并上调了炎症细胞因子。如图30上所示，EFD预处理显著地降低了反复DSS处理引发的高浓度的NF-κB。
过氧化物酶体增生物激活受体-γ(PPAR-γ)是一种主要表达于脂肪组织、肾上腺和脾脏的配体依赖性转录因子的核受体超家族的成员，其涉及调节多种炎症应答，特别涉及肠道炎症。已经提出PPAR-γ通过弱化核因子κB(NF-κB)的活性起到作为结肠炎的关键抑制剂的作用。如图30下所示，脾脏的PPAR-γ水平在慢性炎症期是降低的。EFD对小鼠的预防性处理容许增加慢性IBD模型中的PPAR-γ水平达到并超过纯真小鼠(没有慢性IBD)的水平。
实施例III：DSS诱导的IBD的治疗性模型(长期作用)
本模型研究了EFD在急性IBD中的治疗性处理的作用。
方案
6到7周大的C57B1/6小鼠被分成4组，每组10只小鼠。
小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受含2.5％ DSS的饮用水5天，之后饮用自来水。一组小鼠接受EFD处理：在DSS饲喂末日后第24小时(即第6天)皮下给予100μg或者在DSS饲喂首日后的第6、7和8天口服1mg。它们不再接受更多的EFD处理。试验在第34天结束。
结果
体重曲线
在这个急性DSS诱导的IBD的治疗性处理的模型中，从DSS饲喂的第1天开始到之后的第35天，每周5天，每天都检查每只小鼠的体重。在用EFD治疗之后，在第13和15天观察到轻微的、具有显著意义的治疗性作用以及体重下降的快速恢复(图31)。
临床评分
根据先前的描述检查评分(见实施例1)。EFD处理小鼠中的临床症状的减轻比PBS处理小鼠来得更快(图32)。
结肠的炎症
在试验结束时(第34天)，EFD处理小鼠的结肠与从未饲喂过DSS的纯真小鼠的结肠相似(图33上)。
淋巴结和脾脏
在试验结束时(第34天)，与PBS处理小鼠的淋巴结的细胞数目相比较，EFD处理小鼠的淋巴结的细胞数目明显减少，差异是统计学显著性的差异(图33下)。如图34所示，第34天时的脾脏重量和脾细胞数目的差异都不是统计学显著性的差异。
脾脏释放的炎症调节物
研究了在试验结束时(第34天)收集到的脾细胞自发释放一些炎症细胞因子的情况。对于IL-17而言，在PBS和EFD处理之间观察到的差异是极为显著的，但是对于IFN-γ和IL-6并非如此(图35)。
如图36上所示，在DSS摄入结束后1个月，PBS处理小鼠的脾脏都保持着高浓度的NF-κB。同时，EFD处理容许具有比未经EFD处理显著更低的NF-κB浓度，所述浓度与从未饲喂过DSS的纯真小鼠的浓度相似。
在试验结束时，如图36下所示，在PBS和EFD处理小鼠中观察到的PPAR-γ水平是极为不同的。
实施例IV：DSS诱导的慢性IBD的治疗性和预防性模型(长期作用)(图37-42)
这个模型研究了EFD在慢性IBD中的治疗性和预防性处理的作用。
方案
6到7周大的C57B1/6小鼠被分成4组，每组10只小鼠。
小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受含1.5％DSS的饮用水7天、普通自来水8天、含1.5％DSS的饮用水5天、自来水10天、1.5％DSS 5天，随后饮用自来水。一组小鼠接受EFD处理：在DSS饲喂首日后第9天皮下注射100μg或在首次饲喂DSS后的第9、10和11天口服1mg。它们不再接受EFD治疗。试验在第52天结束。
结果
重量曲线
在这个慢性DSS诱导的IBD的治疗性/预防性处理的模型中，从DSS摄入的第1天开始到之后的第52天内，每周5天，每天都检查每只小鼠的体重。在用EFD治疗之后，在第13和15天观察到轻微的、具有显著意义的治疗性作用以及体重下降的快速和稳定的恢复(图37)。
临床评分
根据先前的描述检查评分(见实施例1)。经皮下EFD处理的小鼠中的临床症状的减轻比PBS处理小鼠来得更快(图38)。
结肠炎症
在试验结束时(第52天)，EFD处理小鼠的结肠与PBS处理小鼠的结肠大体相似(图39上)。
淋巴结和脾脏
在试验结束时(第52天)，只有经皮下EFD处理小鼠的淋巴结的细胞数目得到了减少，与PBS处理小鼠之间的差异是极为显著的(图39下)。同样，只有经皮下EFD处理小鼠的脾脏重量和脾细胞数目得到了减少(图40)。
脾脏释放的炎症调节物
研究了在试验结束时(第52天)收集到的脾细胞自发释放一些炎症细胞因子的情况。对于所有细胞因子而言，在PBS和EFD处理之间观察到的差异都是极为显著的，但是IL-17更为明显(图41)。
如图42上方所示，在慢性IBD之后，PBS处理小鼠的脾脏中看到了高浓度的NF-κB。EFD处理小鼠的脾脏中的NF-κB浓度要低于PBS处理小鼠的脾脏，两者之间的差异是极为显著的。
在慢性IBD之后，PBS和EFD处理小鼠的脾脏中观察到的PPAR-γ水平是非常不同的，差异极为显著(图42下)。
实施例V：DSS诱导的慢性IBD的治疗性模型(短期作用)(图43-48)
这个模型研究了EFD在慢性IBD中的治疗性作用。
方案
6到7周大的C57B1/6小鼠被分成4组，每组10只小鼠。
小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受含1.5％ DSS的饮用水7天、普通自来水8天、含1.5％DSS的饮用水5天、自来水10天、1.5％ DSS5天，随后饮用自来水。一组小鼠接受EFD处理：在末次DSS饲喂后第7天皮下注射100μg或在首次饲喂DSS后的第42、43和44天口服1mg。它们不再接受EFD治疗。试验在第54天结束。
Figure A200680053234D00281
结果
重量曲线
在这个慢性DSS诱导的IBD的治疗性处理的模型中，从DSS摄入的第1天开始到之后的第54天内，每周5天，每天都检查每只小鼠的体重。在皮下EFD处理之后，在第54天观察到轻微的治疗性作用以及体重下降的恢复(图43)。
临床评分
根据先前的描述检查评分(见实施例1)。只有在皮下EFD处理组中，临床症状得到了减轻并接近于正常水平(图44)。
结肠炎症
在试验结束时(第54天)，EFD处理小鼠的结肠与PBS处理小鼠的结肠大体相似(图45上)。
淋巴结和脾脏
在试验结束时(第54天)，只有经皮下EFD处理小鼠的淋巴结的细胞数目得到了减少，在EFD处理小鼠和PBS处理小鼠之间的差异是极为显著的(图45下)。同样，只有经皮下EFD处理小鼠的脾脏重量和脾细胞数目得到了减少(图46)。
脾脏释放的炎症调节物
研究了在试验结束时(第54天)收集到的脾细胞自发释放一些炎症细胞因子的情况。对于所有细胞因子而言，在PBS和EFD处理之间观察到的差异都是极为显著的，但是IL-17更为明显(图47)。
如图48上方所示，在慢性IBD之后，EFD处理小鼠的脾脏中的NF-κB浓度要低于PBS处理小鼠的脾脏，两者之间的差异是非常显著的(皮下处理)和极为显著的(口服处理)。
在慢性IBD之后，在PBS和EFD处理小鼠的脾脏中观察到的PPAR-γ水平显示出了极为显著的差异(图48下)。无论哪种施用方式的EFD处理都容许小鼠具有比纯真小鼠相似的或稍高的PPAR-γ浓度。
实施例VI：TNBS诱导的IBD的预防性模型(短期作用)
方案
C57B1/6雄性小鼠在第-5和0天其结肠局部接受或未接受100μl TNBS(1mg 2，4，6-三硝基苯磺酸)50％乙醇溶液两次。观察小鼠的粪便10天。在第10天，给小鼠称重。一组小鼠在第一次TNBS输送前第5天(即第-10天)接受了皮下100μg EFD处理。第二组接受PBS。对照组没有接受TNBS和EFD。
Figure A200680053234D00291
结果
在开始TNBS处理后的第0天和第10天给动物称重。接受过TNBS的小鼠体重下降了近2克，而未经TNBS处理过的小鼠的体重增加了1克以上，而在TNBS之前接受过EFD的小鼠具有与试验开始时相同的体重(图15)。
实施例总结
DSS模型
预防性模型：在急性模型(饲喂DSS 5或7天-实施例I)和慢性模型(饲喂DSS 5天，共三次，期间间隔5天-实施例II)中，在DSS饲喂之前第21天给予EFD(皮下或口服)。在临床症状(体重、粪便情况)、组织病理学检查、结肠组织和脾脏中的细胞因子/淋巴因子浓度、脾脏中的转录因子NFκB和PPARγ水平等方面都观察到了保护性作用。
治疗性急性模型：在饲喂DSS 5天后第24小时给予EFD(皮下或口服)(实施例III)。在试验结束时(1个月后)，与PBS处理小鼠组相比较，EFD处理组小鼠的体重恢复的更快、症状更轻、生物学标记物更接近于正常值。
治疗性和预防性慢性模型：在DSS饲喂7天后第48小时给予EFD(皮下或口服)，在第52天试验结束前进行了共2个系列的5天DSS饲喂(实施例IV)。EFD处理组中的生物学标记物比PBS处理小鼠组更接近于正常值，存在EFD对临床表现的作用，但并不显著。
治疗性慢性模型：在一系列DSS饲喂(包括DSS饲喂7天和2个系列的5天DSS饲喂)后第48小时给予EFD(皮下或口服)(实施例V)。在第54天试验结束时，EFD处理组中的生物学标记物要比PBS处理小鼠组更接近于正常值。
TNBS模型
用TNBS进行的试验包括少数小鼠的有限研究。在EFD处理后观察到的炎症反应的减轻说明EFD能够减轻纯的T淋巴细胞依赖性免疫应答。
所有这些结果都说明EFD在不同的DSS诱导的IBD模型中都具有强大抗炎症活性。在预防性处理中，EFD作用于临床症状和生物学参数。在治疗性处理中，它主要作用于生物学参数。存在着EFD对临床症状的影响，但是在这些严重的慢性IBD模型中并不突出，不过要注意到处理和试验结束(当进行测量时)之间的间隔是短短的12到19天。
在TNBS诱导的IBD模型中也观察到了EFD疗效(实施例VI)，说明其在纯的T淋巴细胞依赖的获得性免疫应答中也具有抗炎症作用。
通过这些实施例，本领域技术人员可以明白本发明人已经确认了本发明的革兰氏阳性细菌制备物可以用于相关炎症综合征的预防和治疗。事实上，本发明人已经测定了涉及炎症应答的多个细胞因子(即IFNγ、IL-6和IL-17)以及两种转录因子(NFκB和PPARγ)。实施例部分所示的结果表明本发明的革兰氏阳性细菌制备物不仅具有作用于Th1信号传导途径(TNF-α、IL-12、IFN-γ和T-bet与此途径相关)的性能，还具有作用于Th2信号传导途径(IL-4、IL-13和GATA-3与此途径相关)以及新的信号传导途径(IL-17和PPARγ似乎与此途径相关)的性能(Young Y.CurrentGastroenterolo Rep 2006 Dec；8(6)：470-7)。

Claims (35)

1.革兰氏阳性细菌制备物用于预防和治疗肠道炎症综合征的用途，所述制备物的特征在于，所述革兰氏阳性细菌是灭活的或非感染性的，并含有超过50％、且优选地超过90％的天然结构的细菌蛋白组分。
2.权利要求1的革兰氏阳性细菌制备物的用途，其中所述灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物是通过利用不会变性细菌所含分子的结构的方法获得的。
3.权利要求1或2的用途，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是革兰氏阳性的兼性胞内菌。
4.权利要求3的用途，其特征在于所述革兰氏阳性的兼性胞内菌是牛型分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG。
5.权利要求1到4中任一项的用途，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是通过冻干法灭活的。
6.权利要求1到5中任一项的用途，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是被深度冻干灭活的。
7.权利要求1到6中任一项的用途，其特征在于所述肠道炎症综合征是选自由克隆病和溃疡性结肠炎组成的组中的炎性肠病。
8.用于预防或治疗因Th1/Th2失衡引起的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物或其保留了抑制肠道炎症综合征的能力的部分；和
b)给患有所述疾病的患者施用有效量的所述灭活的革兰氏阳性细菌制备物或其部分。
9.权利要求8的方法，其特征在于所述疾病是选自由克隆病和溃疡性结肠炎组成的组中的炎性肠病。
10.权利要求8或9的方法，其特征在于革兰氏阳性细菌是革兰氏阳性的兼性胞内菌。
11.权利要求10的方法，其特征在于革兰氏阳性的兼性胞内菌是牛型分枝杆菌BCG。
12.用于预防或治疗肠道炎症综合征的方法，所述方法的步骤包括给患者施用有效量的灭活的革兰氏阳性细菌制备物，由此刺激产生白细胞的调节细胞。
13.权利要求12的方法，其特征在于所述肠道炎症综合征是克隆病或溃疡性结肠炎。
14.权利要求12或13的方法，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是通过冻干法灭活的。
15.权利要求12或13的方法，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是深度冻干灭活的。
16.权利要求12到15中任一项的方法，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是革兰氏阳性的兼性胞内菌。
17.权利要求16的方法，其特征在于所述革兰氏阳性的兼性胞内菌是牛型分枝杆菌BCG。
18.权利要求12到17中任一项的方法，其特征在于所述白细胞的调节细胞是CD4+CD25+T细胞、B细胞和/或树突状细胞。
19.用于治疗和/或预防肠道的炎性肠病的组合物，其含有通过以下步骤制备的革兰氏阳性细菌组合物：
a.收集活细菌细胞的培养物；
b.在水中或在盐如硼酸盐的水溶液中洗涤所述细菌细胞；
c.将所述细菌细胞冷冻于水中或盐例如硼酸盐的水溶液中；
d.通过在冻干机中干燥一段足以去除至少98.5％的水、优选地至少99％的水、更优选地至少99.5％的水的时间来灭活所述冷冻的细菌细胞；和
e.收集深度冻干的细菌细胞。
20.革兰氏阳性细菌制备物在生产用于预防或治疗肠道的炎性肠病的药物中的用途，其中在所述革兰氏阳性细菌制备物中，革兰氏阳性细菌是灭活的或非感染性的，并含有超过50％、且优选地超过90％的天然结构的细菌蛋白组分。
21.权利要求20的用途，其中所述灭活的或非感染性的革兰氏阳性细菌制备物是通过利用不会变性细菌所含分子的结构的方法获得的。
22.权利要求20的用途，其中如权利要求19所述制备革兰氏阳性细菌制备物。
23.权利要求20到22中任一项的用途，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是革兰氏阳性的兼性胞内菌。
24.权利要求23的用途，其特征在于所述革兰氏阳性的兼性胞内菌是牛型分枝杆菌BCG。
25.权利要求20到24中任一项的用途，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是通过冻干法灭活的。
26.权利要求20到25中任一项的用途，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是深度冻干灭活的。
27.权利要求20到26中任一项的用途，其特征在于所述炎性肠病选自由克隆病和溃疡性结肠炎组成的组。
28.革兰氏阳性细菌制备物用于预防或治疗因Th1/Th2失衡引起的疾病的用途，所述制备物的特征在于所述革兰氏阳性细菌是灭活的或非感染性的，并含有超过50％、且优选地超过90％的天然结构的细菌蛋白组分。
29.权利要求28的用途，其特征在于所述疾病是选自由克隆病和溃疡性结肠炎组成的组中的炎性肠病。
30.权利要求28或29中的用途，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是革兰氏阳性的兼性胞内菌。
31.权利要求30的用途，其特征在于所述革兰氏阳性的兼性胞内菌是牛型分枝杆菌BCG。
32.革兰氏阳性细菌制备物在生产用于预防或治疗因Th1/Th2失衡引起的疾病的药物中的用途，所述制备物的特征在于所述革兰氏阳性细菌是灭活的或非感染性的，并含有超过50％、且优选地超过90％的天然结构的细菌蛋白组分。
33.权利要求32的用途，其特征在于所述疾病是选自由克隆病和溃疡性结肠炎组成的组中的炎性肠病。
34.权利要求32或33中的用途，其特征在于所述革兰氏阳性细菌是革兰氏阳性的兼性胞内菌。
35.权利要求34的用途，其特征在于所述革兰氏阳性的兼性胞内菌是牛型分枝杆菌BCG。
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