KR20080092384A - 사멸 또는 비감염성 박테리아 제제를 사용한염증성장증후군의 조절 - Google Patents

Abstract

본 발명은 예를 들면 마이코박테리아 등의 그람 양성 통성 세포내 박테리아와 같은 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제를 크론병 또는 궤양성 대장염과 같은 장 염증 증후군의 치료에 사용하는 것에 관한 것이다.

사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아, 크론병, 궤양성 대장염

Description

사멸 또는 비감염성 박테리아 제제를 사용한 염증성장증후군의 조절{Control of intestinal inflammatory syndromes with a preparation of killed or noninfectious bacteria}

본 발명은 예를 들어 마이코박테리아와 같은 그람 양성 통성 세포내 박테리아(Gram positive facultative intracellular bacteria)와 같은 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제를 염증성장증후군의 치료에 사용하는 것에 관한 것이다.

크론병은 어린이, 청소년 및 성인에 발병하는 상당히 심각한 질환으로서, 그 발병율은 증가 추세에 있으며, 전문적이고 장기적인 주의를 요구하는 질환이다. 궤양성 대장염 또한 원인 미상의 염증성장질환(IBD)으로서, 젊은 개체에 주로 발병하는 무력성 질환이다. 이들 두 질환의 누적적 유병율은 나라에 따라 다르지만, 약 100000명당 10 내지 200명 정도이다. 최근의 식사 습관의 변화 및 박테리아 세균총의 불균형이 이들 질환의 원인과 관련되는 것으로 추정되고 있으나, 정확한 결과는 아직 보고된 바 없다. 크론병의 경우, 초기 감염 이후 수년 이내에 발병하는 가축 감염 질환인 요네병(Johne's disease)과의 유사성 때문에, 마이코박테리움 아비움 (아종) 파라투베르쿨로시스( Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis)가 이 질환의 부분적인 원인으로 제안되었다. 최근 E. coli 아드헤진(adhesins), 플라젤린(flagellin) 또는 섬모(fimbriae)가 이 질환의 병리에 관련되는 것으로 추정되고 있다.

특발성 염증성장질환(IBD)은 원인 불명의 위장관 질환을 총칭하는 것으로서, 장염증 및 국소 및 전신 합병증을 동반하는 만성적인 재발을 보이는 특징이 있다.

IBD의 원인 또한 미상이나, 그 병변과 증상은 전-염증성 사이토킨의 과잉-생성과 관련되는 것으로 알려져 있다. IBD는 궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD)의 두 질환 및 이들 질환의 중간적인 변형 질환으로서 상기 두 질환이 중첩되는 특징을 나타내는 불확정 대장염(indeterminate colitis)을 포함한다.

이들 염증성 장 질환은 면역반응과 관련되어 있다. 완화 주기의 연장과 함께 계속적인 진전에 의해 임상 시험은 자가면역 기전의 관련을 환기하였다:그러나 이러한 자가면역 기전이 이들 질환의 원인인가 아니면 결과인가는 아직 미지수이다. 특히 항-TNF-α를 사용한 적극적인 치료는 넓은 의미에서 이들 질환이 면역 기전과 관련되어있음을 강조하지만, 초기 기전의 정확한 징후에 대해서는 아무것도 제공하지 못하고 않다.

쥐를 사용한 여러 실험 모델은 부분적으로 인간 질환을 재현한다. 세균총이 이들 질환과 관련됨을 보여주었다. 세균이 없는 상태에서 사육되는 쥐들은 통상적인 세균총을 나타내는 쥐들에 비하여 염증성 증후군을 나타내지 않았다. 이러한 쥐 나 마우스를 이용한 염증성장질환(IBD) 모델에서, 페놀성 유도체(TNBS)를 창자에 국소적으로 투여하거나 또는 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)을 음용수에 넣어 투여하여 국소적인 감작을 유발하였다. 조절 T 림포사이트가 IBD 모델에서 중요한 작용을 하는 것으로 기술되었다.

염증성장증후군은 심각한 신체장애를 유발하며, 장협착을 일으키고 외과적 수술을 반복해야하는 경우가 많기 때문에 치사에 이르기도 하는 만성적인 병적 상태이다. 이들 염증성 증후군에 대한 의학적 치료는 본질적으로 강력한 항염증제, 코티코이드제, 항유사분열제의 사용에 기초하고 있으며, 최근에는 항-TNF제를 사용하고 있다. 투여될 항-염증제의 용량을 감소시키거나 이들 항-염증제를 대체할 수 있는 치료법의 개발이 요망된다.

쥐에서 천식을 조절하는 기전을 분석하는 실험을 수행하는 과정에서, CD4+ CD25+ 조절 세포가 생성되는 것이 발견되었다. 잇따라 분비되는 IL-10은 상기 항염증활성의 중요한 부분을 보증한다. 연장동결건조(Extended Freeze Drying (EFD))에 의해 사멸된 마이코박테리아 보비스(Mycobacteria bovis ) BCG로 처리한 동물의 폐에서 항원을 투여한 후 존재하는 염증성 세포수의 현격한 감소는 본 발명자들로 하여금 면역알레르기 또는 자가면역 현상이 기술되었던 다른 증후군에 있어 EFD의 종국적인 활성을 측정해보도록 이끌었다. 류마티스성 관절염을 재현하는 모델에서, CD4+ T 림포사이트가 관여하는 것이 보고되었으며, CD4+CD25+ T 림포사이트의 존재 또는 이동이 이 질환을 멈추게 할 수 있다.

본 발명의 일 목적은 염증성장질환(IBD)과 같은 염증성장증후군의 치료를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항-염증제를 사용하지 않거나, 그 용량을 감소하여 시행할 수 있는 IBD 치료를 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 염증성장증후군의 예방 또는 치료에 그람 양성 박테리아 제제를 사용하는 것을 제공하며, 상기 제제는 그람 양성 박테리아가 사멸되거나 비감염성이며, 자연구조(native structure)로 존재하는 박테리아 단백질 성분을 50% 이상, 바람직하게는 90% 이상 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 Th1/Th2 불균형에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며,

a. 염증성장증후군 억제능을 보유하는 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제 또는 그 일부를 제공하는 단계, 및

b. 유효량의 상기 사멸 그람 양성 박테리아 제제 또는 그 일부를 상기 질환을 앓고 있는 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 염증성장증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 그람 양성 박테리아 제제를 환자에 투여함으로써 류코사이트 조절 세포의 생성을 자극하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 하기 단계에 의해 제조되는 그람 양성 박테리아 조성물을 포함하는 염증성장질환의 치료 및/또는 예방용 조성물을 제공한다:

a) 살아있는 박테리아 세포 배양물을 수확하는 단계,

b) 상기 박테리아 세포를 물 또는 보레이트(borate)와 같은 염의 수성 용액(aqueous solution)에 세척하는 단계,

c) 상기 물 또는 보레이트와 같은 염의 수성 용액 내 박테리아 세포를 동결하는 단계,

d) 동결건조기에서 98.5% 이상의 물, 바람직하게는 99% 이상의 물, 더욱 바람직하게는 99.5% 이상의 물을 제거하는데 충분한 시간 동안 건조함으로써, 상기 동결된 박테리아 세포를 사멸하는 단계, 및

e) 연장된 동결 건조 박테리아 세포를 수거하는 단계.

정의

본 명세서에서 "사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제"는 국제특허 WO03049752호에 개시된 바와 같은 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아의 제제를 지칭한다. 상기 그람 양성 박테리아 제제는 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아를 포함하는 것으로서, 그 속에 함유된 분자, 특히 그 속에 함유된 단백질의 구조를 변성시키지 않는 공정에 의해 수득 되는 것이다. 바람직하게 상기 그람 양성 박테리아 제제는 연장 동결 건조된 사멸 박테리아(extended-freeze-dried killed bacteria)를 포함하고, 1.5 중량%이하, 바람직하게는 1 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 중량% 이하의 잔여수(residual water)를 포함한다. 이러한 연장 동결 건조된 사멸 박테리아는 살아있는 박테리아 세포의 배양물을 수확하는 단계, 상기 박테리아 세포를 물 또는 보레이트와 같은 염의 수성 용액에 세척하는 단계, 상기 물 또는 보레이트와 같은 염의 수성 용액내 박테리아 세포를 동결하는 단계, 동결건조기에서 98.5% 이상의 물, 바람직하게는 99% 이상의 물, 더욱 바람직하게는 99.5% 이상의 물을 제거하는데 충분한 시간 동안 건조함으로써, 상기 동결된 박테리아 세포를 사멸하는 단계, 및 상기 연장된 동결 건조 박테리아 세포를 수거하는 단계에 통해 제조된다.

상기 연장 동결 건조된 사멸 박테리아 제제의 분획은 본 발명의 "그람 양성 박테리아 제제"에 포함된다. 이 분획은 상기 사멸 박테리아 제제의 유기 용매 추출물로 구성되는 분획, 상기 사멸 박테리아 제제의 글리코시다제-처리 추출물로 구성된 분획, 상기 사멸 박테리아 제제의 DNAse 및/또는 RNase-소화 추출물로 구성된 분획, 및 유기 용매, 글리코시다제, DNAse 및/또는 RNase, 및 프로테아제로 연속하여 처리한 상기 사멸 박테리아 제제로 구성되는 분획으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 명세서에서 "염증성장증후군"은 크론병 및 궤양성 대장염의 두 질환 및 이들 질환들의 중간 변형질환인 상기 두 질환의 특징을 중첩하여 나타내는 불특정 대장염을 포함하는 모든 염증성 장 질환을 지칭한다.

그람 양성 박테리아 제제의 사용

본 발명은 염증성장증후군의 예방 및 치료에 그람 양성 박테리아 제제를 사용하는 것에 관한 것으로, 상기 제제는 그람 양성 박테리아가 사멸 또는 비감염성이고, 자연 구조인 박테리아 단백질 성분을 50 중량% 이상, 바람직하게는 90 중량% 이상 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 그람 양성 박테리아 제제는 염증성장증후군의 예방 및/또는 치료용 의약품의 제조에 유용하다.

바람직한 본 발명의 일 실시형태에 따르면 상기 그람 양성 박테리아 제제는 그람 양성 통성 세포내 박테리아(Gram positive facultative intracellular bacteria)이다. 그람 양성 통성 세포내 박테리아는 합성 매질내에서 인 비트로 성장할 수 있을 뿐 아니라 포유류 또는 비포유류 숙주에서 유래된 감염 진핵세포에서 인 비보 성장할 수 있고, 예를 들면 마크로파지와 같은 세포 내에서 증식할 수 있는 그람 양성 박테리아를 지칭한다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 박테리아 제제는 리스테리아( Listeria sp .), 코리노박테리움 ( Corynobacterium sp .) 및 마이코박테리 아( Mycobacteria sp ), 노카디아 ( Nocardia sp .) 및 로도코코스(Rhodococcus sp)를 포함하는 방선균(Actinomycetes)으로 구성된 군에서 선택되는 그람 양성 통성 세포내 박테리아를 함유한다.

더욱 바람직하게 박테리아 제제는 마이코박테리움 보비스 및 더욱 바람직하게는 마이코박테리움 보비스 BCG를 함유한다.

본 발명은 또한 상기 사멸 또는 비감염성 박테리아 제제 또는 그 분획을 Th1/Th2 불균형과 같은 면역조절부전을 포함하는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하는 의약품의 제조에 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 일 실시형태에 따르면, 상기 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염이다.

사멸된 박테리아 제제 또는 그 분획은 약학적으로 허용가능한 담체, 및/또는 면역증강제, 및/또는 어드쥬번트(adjuvant) 및/또는 하기 정의된 어떠한 통상 사용되는 첨가제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 그람 양성 박테리아 제제 및/또는 의약품은 경구, 설하, 정맥 또는 비내(intranasal) 루트로 투여될 수 있다.

약학적 조성물

전술한 바와 같이 본 발명은 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제를 염증성장질환의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하는 것이 관한 것이다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 이러한 조성물은

a) 살아있는 박테리아 세포 배양물을 수확하는 단계,

b) 상기 박테리아 세포를 물 또는 보레이트와 같은 염의 수성 용액에 세척하는 단계,

c) 상기 물 또는 보레이트와 같은 염의 수성 용액내 박테리아 세포를 동결하는 단계,

d) 동결건조기에서 98.5% 이상의 물, 바람직하게는 99% 이상의 물, 더욱 바람직하게는 99.5% 이상의 물을 제거하는데 충분한 시간 동안 건조함으로써, 상기 동결된 박테리아 세포를 사멸하는 단계, 및

e) 연장된 동결 건조 박테리아 세포를 수거하는 단계에 의해 수득된다.

본 발명의 조성물은 바람직하게 경구 투여에 적합한 제형이다. 예를 들면 상기 조성물은 정제, 통사의 캡슐제, 젤라틴 캡슐 또는 경구투여용 시럽제의 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 젤라틴 캡슐, 통상의 캡슐 및 정제 형태는 약학적 제형에서 통상으로 사용되는 어드쥬번트와 같은 부형제 또는 전분, 검 및 젤라틴과 같은 결합제, 칼슘 포스페이트와 같은 어드쥬번트, 옥수수 전분 또는 알젠산과 같은 붕해제, 마그네슘스테아레이트와 같은 윤활제, 감미제 또는 향미제 등을 포함할 수 있다. 용액 또는 현탁액은 약학적으로 적합한 용매를 첨가하여 수성 또는 비수성 매질내 제조할 수 있다. 이들은 글리콜, 폴리글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리글리콜에테르, DMSO 및 에탄올을 포함한다.

다른 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 조성물은 바람직하게 피하주사와 같은 비경구투여에 적합한 형태로 된다. 피하주사와 같은 비경구투여를 위해 담체는 바람직하게 물, 식염수, 락토스, 글루타메이트, 지방 또는 왁스를 포함한다. 경구투여를 위하여, 전술한 담체이외에 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘스테아레이트, 소듐사카린, 탈쿰, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스, 및 마그네슘카보네이트와 같은 고형 담체가 사용될 수 있다. 생체분해성 마이크로스피어(예, 폴리락틱갈락타이드) 또한 본 발명의 약학적 조성물에 대한 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 생체분해성 마이크로스피어는 예를 들면 미국특허 4,897,268호 및 5,075,109호에 개시된 것들을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 부가적으로 첨가제 및/또는 면역증강제 및/또는 본 발명의 박테리아 세포 또는 그 분획을 함유하는 리포좀과 같은 어드쥬번트를 함유할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 제조하는데 사용되는 첨가제는 항-응집제, 항산화제, 염료, 향미증강제, 또는 평탄화제, 조합제 또는 분리제 등과 제약산업에서 통상적으로 사용되는 부형제들이 사용될 수 있다.

면역 반응을 증강시키기 위하여 다양한 어드쥬번트가 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 대부분의 어드쥬번트는 항원이 급격하게 이화 되는 것을 보호하기 위하여, 또는 조절된 염증 반응을 만들기 위하여 디자인된 물질을 함유하며, 예를 들면 알루미늄하이드록사이드나 미네랄 오일, 및 지질 A, 보더텔라퍼투시스 톡신(Bordetella pertussis toxin)과 같은 면역 반응의 비특이적 자극자 등을 들 수 있다. 적합한 어드쥬번트는 상업적으로 입수할 수 있으며, 예를 들면 프로인트 불완전어드쥬번트 및 사람에의 주사에는 사용될 수 없는 프로인트 완전 어드쥬번트를 들 수 있다. 인간에 사용될 수 있는 다른 적합한 어드쥬번트는 알루미늄 하이드록사이드, 생분해성 마이크로스피어, 모노포스페릴 A(monophospheryl A) 및 쿠일 A(Quil A)을 포함한다.

예방 또는 치료 방법

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 본 발명의 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제는 크론병 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택되는 염증성 장질환의 예방 및 치료에 사용된다. 본 발명의 방법은 유효량의 상기 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제를 환자에 투여하여 CD4+, CD25+, T 세포, B 세포 및/또는 수지상 세포와 같은 류코사이트 조절 세포의 생산을 자극하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시형태에 따르면 Th1/Th2 불균형에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 상기 방법은 a) 염증성장증후군 억제능을 보유하는 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제 또는 그 일부 또는 본 발명의 약학적 조성물을 제공하는 단계, 및 b) 유효량의 상기 사멸 그람 양성 박테리아 제제를 상기 질환을 앓고 있는 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

전술한 바와 같이 염증성장증후군은 크론병 또는 궤양성 대장염일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 그람 양성 박테리아 제제의 양은 바람직하게 치료학적 유효량이다. 그람 양성 박테리아 제제의 치료학적 유효량은 조성물이 투여되는 숙주에서 명백히 부작용을 나타내지 않고 염증성장증후군을 억제하는데 필요한 양을 의미한다. 사용된 그람 양성 박테리아 제제 및 투여될 조성물의 정확한 양은 치료될 염증성장증후군의 형태, 투여 모드, 조성물내 다른 성분과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게 조성물은 약 10 ㎍ 내지 10 mg, 더욱 바람직하게는 약 100 ㎍ 내지 1 mg의 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제로 구성된다. 이 때, "약"은 상기 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제의 양(㎍ 내지 mg)은 양을 평가하는 방법의 오차 한계에 따라 일정 범위내에서 변경될 수 있음을 의미한다.

예를 들면 본 발명의 조성물을 경구 투여하는 중, 치료될 숙주는 약 10 ㎍ 내지 약 10 mg의 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제를 하루에 1번 3일 연속하여 투여하는 스케쥴을 시행한다. 상기 치료는 1주 후 한번 더 반복될 수 있다.

피하주사와 같은 비경구투여에서, 치료될 숙주는 약 10 ㎍ 내지 10 mg, 더욱 바람직하게는 약 100 ㎍ 내지 약 1 mg의 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제를 한 달에 한번 또는 6개월에 한번 투여하는 스케쥴을 시행한다.

그람 양성 박테리아 제제의 제조 방법.

본 발명의 그람 양성 박테리아는 예를 들면, 박테리아 세포에서의 분자를 변성시키지 않는 "소프트법(soft methods)" 에 의해 사멸되어, 면역 부전을 겪고 있는 개체에 투여될 때 류코사이트 조절 세포(CD4+, CD25+, T 세포 및/또는 B 세포 및/또는 수지상 세포)를 인 비보 자극할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 그람 양성 박테리아 제제는 열-사멸 마이코박테리아 제제로 구성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시형태에 따르면, 그람 양성 박테리아는 동결건조에 의해 사멸된다. 소프트 공정으로 지칭되는 이들 공정은 그 매크로분자 성분의 구조를 보존하면서 박테리아 세포막을 파괴할 수 있는 물리적 수단의 사용을 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 이들 공정들은 비제한적으로 연장 동결 건조, 실리카 또는 지르코늄 비드 존재하에서의 그라인딩, 소위 "프렌치 프레스(French press)"의 사용, 초음파 및 감마선 조사를 포함한다. 전술한 바와 같이 정의된 사멸 박테리아 제제를 수득하는 기타 다른 공정들은 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다.

박테리아 세포에서의 분자 구조를 변성시키지 않는 공정은 분자 구조의 광범위한 변성을 초래하지 않는 공정을 의미한다. 바람직하게, 이러한 공정은 박테리아 세포에서의 마이크로분자, 예를 들면 단백질, 폴리사카라이드 및 지질의 3차원적 구조를 보존한다.

도 1은 음용수에 2.5% DSS을 첨가하여 7일간 섭취시킨 후 체중 및 항문 염증의 변화를 도시한 것이다(C57Bl/6 male mice).

도 2는 음용수에 DSS를 투여한 쥐와 대조 쥐(DSS 공급 없음) 사이에 결장의 길이 차이를 도시한 것으로, 실험 모델로서 7일간 음용수에 2.5% 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)를 섭취시킨 C57Bl/6 수컷 쥐를 사용하였으며, 결장은 DSS 공급을 시작한후 10일째 되는 날에 수거하였다.

도 3은 EFD 처치를 한 쥐와 미처치쥐간의 결장의 길이 차이를 도시한 것으로, 쥐는 2.5% DSS를 넣은 음용수를 7일간 공급받았다. EFD 처치는 DSS를 공급하기 21일 전에 100㎍을 피하 투여하거나; 또는 DSS 공급하기 21일, 20일, 17일, 16일 전에 1mg을 경구투여함으로써 시행되었고, DSS 공급 시작 후 10일째 되는 날에 결장을 수거하였다.

도 4는 대조군(EFD 처치 및 DSS 공급 모두 없음)과 EFD 처치 쥐(DSS 공급) 및 EFD 미처치 쥐(DSS 공급) 간의 결장 길이 차이를 도시한 것이다. EFD를 처치한 쥐의 결장은 대조쥐의 결장과 유사하였다. 결장길이는 맹장과 항문 간의 길이를 측정함으로써 이루어졌다.

도 5는 EFD 처치에 의한 염증성장질환의 예방을 도시한 것이다. EFD 처치 쥐의 결장은 대조쥐(EFD 처치 및 DSS 공급 모두 없음)의 결장과 유사하였다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다). 8일 또는 10일째 되는 날, 즉 DSS 공급이 끝난 후 1 또는 3 일째 되는 날 측정하였다.

도 6은 EFD 처치에 의한 염증성장질환의 예방을 도시한 것이다. EFD 처치쥐는 설사를 일으키지 않거나 심각한 설사는 일으키지 않았지만, 대조쥐(DSS 처치)는 심각한 설사를 일으켰다.

도 7은 대조쥐(EFD 처치 및 DSS 공급 모두 없음)의 결장의 조직학적 표본을 나타낸 것이다.

도 8은 도 7 사진의 일부를 확대한 것이다.

도 9는 DSS를 공급한 쥐 결장의 조직학적 표본을 나타낸 것이다.

도 10은 도 9 사진의 일부를 확대한 것이다.

도 11은 DSS 공급 전에 EFD 처치한 쥐의 결장의 조직학적 표본을 나타낸 것이다.

도 12는 도 11 사진의 일부를 확대한 것이다.

도 13a는 대조 쥐 결장의 조직학적 표본을 나타낸 것이다.

도 13b는 DSS를 공급한 쥐의 결장의 조직학적 표본을 나타낸 것이다.

도 13c는 DSS 공급 전에 EFD 처치한 쥐의 결장의 조직학적 표본을 나타낸 것이다.

도 14a, 14b, 및 14c는 각각 도 13a, 13b, 및 13c를 확대한 것이다.

도 15는 TNBS를 사용한 예비실험을 도시한 것이다. C57Bl/6 수컷 마우스에 -5일 및 0일에 TNBS (50% 에틸알콜 100㎕내 1 mg)을 결장에 국소적으로 두 번 투여하였다. 10일 동안 대변을 관찰하였다. 10일째 되는 날 마우스의 체중을 측정하였다. 한 그룹은 TNBS을 처음 투여하기 5일 전에(즉 -10일)에 EFD 100㎍을 피하주사하였다. 두번째 그룹에는 PBS를 투여하였다. 대조그룹에는 TNBS도 EFD도 투여하지 않았다. 측정된 체중(g)을 도의 y축에 표시하였다.

도 16은 프로토콜 2의 마우스에 DSS 유도 IBD에 대한 EFD의 효과를 a) 체중 b) 항문 염증 및 대변을 10일간 관찰하여 나타낸 것이다. 프로토콜 2에 따라 C57Bl/6 수컷 마우스에 2.5% 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)를 음용수에 넣어 5일간 공급하였다. 한 그룹은 DSS 투여 21일전에 EFD 100㎍을 피하투여하였다. 한 그룹에는 PBS를 투여하였다. 마지막 그룹인 대조그룹에는 DSS를 투여하지 않았다. 이러한 처치 프로토콜은 그대로 하기 도 17 내지 24에 사용되었다. x축에서 0는 DSS 공급 첫날에 해당한다. EFD를 전처치 함으로써 IBD 증상이 감소하였다.

도 17은 프로토콜 2의 DSS 공급된 마우스에 EFD를 전처치한 효과를 결장 및 맹장 길이에 의해 분석한 것이다. 결장 및 맹장 길이는 DSS 공급 시작 후 10일째 되는 날에 측정하였다. DSS 공급에 따른 염증 반응에 의해 장벽이 두꺼워졌으며, PBS 처치된 마우스는 결장 길이가 감소하고, 결장의 중량은 변동이 없었다. EFD 처치된 마우스의 결장 및 맹장은 대조 마우스의 결장 및 맹장과 유사하였다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다).

도 18은 DSS 투여 시작 10일 후 장간막 림프절 세포 수에 대한 효과를 도시한 것이다. 장간 막림프절을 수거하고, 해리한 후 그 세포 함량을 측정하였다. 세포 수의 증가(2.5배)가 관찰되었다. EFD를 전 처리한 쥐의 경우 그다지 증가하지 않았다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001을 의미한다).

도 19는 결장 조직에 존재하는 사이토킨 및 림포카인에 대한 EFD 효과를 도시한 것이다(a). DSS 공급이 시작된 지 10일 후, 결장 조직 샘플을 수거하고, 칭량 한 후 프로테아제 저해제 존재하에서 해리하였다. 상이한 사이토킨 및 림포카인의 함량을 측정하였다. IL-12p40 및 RANTES에 대해서는 PBS 처치 마우스와 EFD 처치 마우스간에 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

도 20은 결장 조직에 존재하는 사이토킨 및 림포카인에 대한 EFD 효과를 도시한 것이다(b). 염증 과정에 관련되어 있는 IL-1β, TNF-α 및 MIP-1α에 대하여, PBS 처치 마우스와 EFD 처치 마우스 간에 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았으며, 이로써 EFD 처치는 DSS 공급에 의해 유발되는 염증을 예방할 수 있음을 확인할 수 있다.

도 21은 결장 조직에 존재하는 사이토킨 및 림포카인에 대한 EFD 효과를 도시한 것이다(c). 활성화된 T-세포에서 생산되는 IL-17은 상이한 계통세포들을 자극하여 염증성 및 조혈성 사이토킨을 생성한다. EFD 처치후 T-세포의 활성화가 덜 일어났으며(IFN-γ측정량에 따라), IL-17 형성도 덜 일어난 것을 확인할 수 있다.

도 22는 결장 조직에 존재하는 사이토킨 및 림포카인에 대한 EFD 효과를 도시한 것이다(d). IL-8의 쥐 동등체인 KC, IL-6 및 IL-1은 "염증성" 사이토킨이거나 또는 NFκB 신호 전달에 관여한다. EFD 처치 후 이들의 생성도 감소하였다.

도 23은 결장 조직에 존재하는 사이토킨 및 림포카인에 대한 EFD 효과를 도시한 것이다(e). 조혈성 사이토킨인 IL-3, GM-CSF 및 G-CSF는 앞서 IL-17 생성의 감소를 보여주는 결과에서 제안된 바와 같이 EFD 처치 후 적게 생성되었다.

도 24는 EFD 처치에 의해 DSS 보충수를 음용한 마우스의 비장에서의 GATA-3 단백질 수준의 증가가 예방된다는 것을 보여준다. EFD 처치 후 30일에 T-bet 단백 질은 고도로 생성되었다. DSS 공급한 마우스로부터 두 개의 샘플 a, b를 채취하여 이를 평가하였다.

도 25는 EFD 처치한 마우스 및 EFD를 처치하지 않은 마우스에 대해, EFD 처치 후 음용수에 넣은 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)를 며칠 동안 세 번 공급하고, 상기 마우스간에 체중 차이를 도시한 것이다. 이 모델은 만성 IBD에서 EFD의 예방적 치료효과를 알아본 것이다. 마우스(C57Bl/6 수컷 마우스)들은 음용수에 1.5% DSS을 7일간 공급받고, 8일간 통상의 수도물을 공급받고, 음용수에 1.5% DSS을 5일간 공급받고, 10일간 수도물을 공급받고, 그 후 음용수에 1.5% DSS을 5일간 공급받고, 수도물을 공급받았다. 한 그룹의 마우스들에는 EFD를 처치하였다: DSS 공급 첫날의 21일 전에 100㎍ 피하주사; 또는 DSS 공급 첫날의 23일, 22일 및 21일 전에 1mg을 경구 투여. 더 이상은 EFD를 처치하지 않았다. 각 마우스의 체중을 날마다 주 5일간 체크 하였다. 52일째 되는 날 실험을 종결하였다.

도 26은 예방 분석(도 25)에 포함된 마우스들에 수행된 결장 점수를 도시한 것이다. 점수는 하기와 같은 기준으로 매겨졌다:

- 0 : 대변 변화 없음

- 1: 항문 염증

- 2: 항문 염증과 연변

- 3: 항문 염증과 설사

- 4: 항문 염증과 혈변

도 27 상단은 상기 예방 분석(도 25)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날, 맹장 및 항문 간에 측정된 결장의 길이 차이를 도시한 것이다. EFD 처치된 마우스들의 결장은 DSS를 투여하지 않은 마우스의 결장과 유사하였다(**는 아노바 통계 테스트에서 p<0.01를 의미하고, ***는 p<0.001를 의미한다).

도 27의 하단은 상기 예방분석(도 25)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날 수거된 장간막 림프절에서 발견되는 세포 수를 나타낸 것이다. EFD 처치된 마우스의 림프절에서는 세포수가 PBS 처치된 마우스에 비하여 감소되었다(***는 아노바 통계 시험에서 p<0.001를 의미한다).

도 28은 상기 예방분석(도 25)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날 비장 중량 및 비장 세포 수를 도시한 것이다. 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

도 29는 상기 예방분석(도 25)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날 수거된 비장 세포에 의한 염증성 사이토킨들의 자발적인 방출을 도시한 것이다. 2x10⁵ 세포를 0.2 ml의 세포 배양 매질 내에 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션하고, 상등액을 수거하고 IFN-γ, IL-6 및 IL-17의 농도를 멀티플렉스 바이오라드 어세이에 의해 측정하였다. 모든 사이토킨에 대하여, 특히 IL-17에 있어서, PBS 처치와 EFD 처치간에 매우 큰 차이가 관찰되었다.

도 30 상단은 NFκB 전사 인자의 농도를 나타낸 것이다. NFκB 는 액티브 모티브사에 의해 판매되는 키트를 사용하여 제조자 프로토콜에 따라 측정하였다. 이 전사인자는 상기 예방분석(도 25)에 포함된 마우스들에서 52일째 되는 날 수거된 비장 세포의 핵 추출물 5 ㎍을 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. PBS 처치 후와 EFD 처치 후에 상당히 유의성 있는 차이(**는 아노바 통계 테스트에서 p<0.01를 의미) 또는 매우 유의성 있는 차이(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다)가 관찰되었다.

도 30 하단은 전사 인자 PPARγ의 농도를 나타낸 것이다. PPARγ는 액티브 모티브사에 의해 판매되는 키트를 제조자 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다. 이 전사인자는 상기 예방분석(도 25)에 포함된 마우스들에서 52일째 되는 날 수거된 비장 세포의 핵 추출물 5 ㎍을 사용하여 광학밀도를 측정하였다. PBS 처치 후와 EFD 처치 후는 상당히 유의성 있는 차이(**는 아노바 통계 테스트에서 p<0.01를 의미) 또는 매우 유의성 있는 차이(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다)가 관찰되었다.

도 31은 음용수에 5일간 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)를 공급한 후 EFD를 처치한 마우스 및 EFD를 처치하지 않은 마우스 간의 체중차이를 도시한 것이다. 이 모델은 급성 IBD에서 EFD의 치료적 처치 효과를 알아본 것이다. 마우스(C57Bl/6 수컷 마우스)들은 음용수에 2.5% DSS을 5일간 공급받고, 그 후 수도물을 공급받았다. 한 그룹의 마우스들에는 EFD를 처치하였다: DSS 공급 마지막날 24시간 후 즉 6일 째에 100㎍ 피하주사; 또는 DSS 공급 첫날 후 6일, 7일, 및 8일째 되는 날에 1mg을 경구 투여. 더 이상은 EFD를 처치하지 않았다. 각 마우스의 체중을 날마다 주 5일간 체크하였다. 34일째 되는 날 실험을 종결하였다. EFD 처치후, 13일째 되는 날에 약간의 유의성 있는 치료적 효과가 관찰되었으며, 15일째 되는 날 보다 신속한 체 중 감소의 회복이 관찰되었다(* p<0.05).

도 32는 상기 치료 분석(도 31)에 포함된 마우스들에 수행된 결장 점수를 도시한 것이다. 점수는 전술한 바와 같이 표시되었다(도 26). 임상 증상은 EFD를 처치한 마우스들에서 더욱 신속하게 감소하였다.

도 33 상단은 상기 치료 분석(도 31)에 포함된 마우스들에 대해 34일째 되는 날, 맹장 및 항문 간에 측정된 결장의 길이 차이를 도시한 것이다. EFD 처치된 마우스들의 결장은 DSS를 투여하지 않은 마우스의 결장과 유사하였다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다).

도 33의 하단은 상기 치료 분석(도 31)에 포함된 마우스들에 대해 34일째 되는 날 수거된 장간막 림프절에서 발견되는 세포 수를 나타낸 것이다. EFD 처치된 마우스의 림프절에서는 세포 수가 PBS 처치된 마우스에 비하여 감소하였으며, 이러한 차이는 통계적으로 유의하였다.

도 34는 상기 치료 분석(도 31)에 포함된 마우스들에 대해 34일째 되는 날 비장 중량(상단) 및 비장 세포 수(하단)를 도시한 것이다. 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

도 35는 상기 치료 분석(도 31)에 포함된 마우스들에 대해 34일째 되는 날 수거된 비장 세포에 의한 염증성 사이토킨들의 자발적인 방출을 도시한 것이다. 2x10⁵ 세포를 0.2 ml의 세포 배양 매질내에 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션하고, 상등액을 수거하고 IFN-γ, IL-6 및 IL-17의 농도를 멀티플렉스 바이오라드 어세이 에 의해 측정하였다. IL-17에 있어서, PBS 처치와 EFD 처치 간에 매우 큰 차이가 관찰되었으나(p<0.001), IFN-γ 및 IL-6에 대해서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

도 36 상단은 상기 치료 분석(도 31)에 포함된 마우스들에 대해 34일째 되는 날 수거된 비장 세포의 핵 추출물 5 ㎍에 대해 측정된 NFκB 전사 인자의 농도를 광학밀도로 나타낸 것이다. PBS 처치 후와 EFD 처치 후는 매우 유의성 있는 차이가 관찰되었다(***는 아노바 통계 테스트에서 p< 0.001를 의미한다).

도 36 하단은 상기 치료 분석(도 31)에 포함된 마우스들에 대해 34일째 되는 날 수거된 비장 세포의 핵 추출물 5 ㎍에 대해 측정된 전사 인자 PPARγ의 농도를 광학밀도로 나타낸 것이다. PBS 처치 후와 EFD 처치 후는 매우 유의성 있는 차이가 관찰되었다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다).

도 37은 음용수에 넣은 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)를 며칠 동안 세 번 공급하고, DSS 첫 시리즈 후 EFD 처치한 후, EFD 처치한 마우스 및 EFD를 처치하지 않은 마우스간의 체중 차이를 도시한 것이다. 이 모델은 만성 IBD에서 EFD의 치료 및 예방적 처치 효과를 알아보기 위한 것이다. 마우스(C57Bl/6 수컷 마우스)들은 음용수에 1.5% DSS을 7일간 공급받고, 8일간 통상의 수도물을 공급받고, 음용수에 1.5% DSS을 5일간 공급받고, 10일간 수도물을 공급받고, 그 후 음용수에 1.5% DSS을 5일간 공급받고, 수도물을 공급받았다. 한 그룹의 마우스들에는 EFD를 처치하였다: 첫 DSS 공급 후 9일째 되는 날 100㎍ 피하주사; 또는 첫 DSS 공급 후 9일, 10일 및 11일 후에 1mg을 경구 투여. 더 이상은 EFD를 처치하지 않았다. 각 마우스의 체중을 날마다 주 5일간 체크하였다. 52일째 되는 날 실험을 종결하였다. EFD 처치 후, 13일째 되는 날에 약간의 유의성 있는 치료적 효과가 관찰되었으며, 15일째 되는 날 보다 신속하고 안정적인 체중 감소의 회복이 관찰되었다.

도 38은 상기 치료 및 예방 분석(도 37)에 포함된 마우스들에 수행된 결장 점수를 도시한 것이다. 점수는 전술한 바와 같이 표시되었다(도 26). 임상 증상은 EFD를 처치한 마우스들에서 더욱 신속하게 감소하였다.

도 39 상단은 상기 치료 및 예방 분석(도 37)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날, 맹장 및 항문 간에 측정된 결장의 길이 차이를 도시한 것이다. EFD 처치된 마우스들의 결장은 PBS 마우스의 결장과 거의 유사하였다.

도 39 하단은 상기 및 예방 분석(도 37)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날 수거된 장간막 림프절에서 발견되는 세포 수를 나타낸 것이다. 세포 수는 EFD가 피하로 처치된 마우스의 림프절에서만 감소되었다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다).

도 40은 상기 치료 및 예방 분석(도 37)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날 비장 중량(상단) 및 비장 세포 수(하단)를 도시한 것이다. 비장 중량과 비장 세포수는 EFD가 피하로 처치된 마우스의 림프절에서만 감소되었다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다).

도 41은 상기 치료 및 예방 분석(도 37)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날 수거된 비장 세포에 의한 염증성 사이토킨들의 자발적인 방출을 도시한 것 이다. 2x10⁵ 세포를 0.2 ml의 세포 배양 매질내에 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션하고, 상등액을 수거하고 IFN-γ, IL-6 및 IL-17의 농도를 멀티플렉스 바이오라드 어세이에 의해 측정하였다. 모든 사이토킨에 대하여 특히 IL-17에 대하여, PBS 처치와 EFD 처치 후에 매우 큰 차이가 관찰되었다(p<0.001).

도 42 상단은 상기 치료 및 예방 분석(도 37)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날 수거된 비장 세포의 핵 추출물 5 ㎍에 대해 측정된 NFκB 전사 인자의 농도를 광학 밀도로 나타낸 것이다. PBS 처치 후와 EFD 처치 후는 매우 유의성 있는 차이를 나타내었다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다).

도 42 하단은 상기 치료 및 예방 분석(도 37)에 포함된 마우스들에 대해 52일째 되는 날 수거된 비장 세포의 핵 추출물 5 ㎍에 대해 측정된 전사 인자 PPARγ의 농도를 광학 밀도로 나타낸 것이다. PBS 처치 후와 EFD 처치 후에 매우 유의성 있는 차이가 관찰되었다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다).

도 43은 음용수에 넣은 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)를 며칠 동안 세 번 공급하고, DSS 마지막 시리즈 후 EFD 처치한 후, EFD 처치한 마우스 및 EFD를 처치하지 않은 마우스간의 체중 차이를 도시한 것이다. 이 모델은 만성 IBD에서 EFD의 치료적 처치 효과를 알아보기 위한 것이다. 마우스(C57Bl/6 수컷 마우스)들은 음용수에 1.5% DSS을 7일간 공급받고, 8일간 통상의 수도물을 공급받고, 음용수에 1.5% DSS을 5일간 공급받고, 10일간 수도물을 공급받고, 그 후 음용수에 1.5% DSS을 5일간 공급받고, 수도물을 공급받았다. 한 그룹의 마우스들에는 EFD를 처치하였다: 마 지막 DSS 공급후 7일째 100㎍ 피하주사; 또는 첫 DSS 공급 후 42, 43 및 45일 후에 1mg을 경구 투여. 각 마우스의 체중을 날마다 주 5일간 체크하였다. 54일째 되는 날 실험을 종결하였다. EFD 피하 처치 후 54일째 되는 날에 체중 감소의 회복과 약간의 치료적 효과가 관찰되었다.

도 44는 상기 만성 IBD에 대한 치료 분석(도 43)에 포함된 마우스들에 수행된 결장 점수를 도시한 것이다. 점수는 전술한 바와 같이 표시되었다(도 26). 임상 증상은 피하로 EFD를 처치한 마우스들에서 감소하였다.

도 45 상단은 상기 만성 IBD에 대한 치료 분석(도 43)에 포함된 마우스들에 대해 54일째 되는 날, 맹장 및 항문 간에 측정된 결장의 길이 차이를 도시한 것이다. EFD 처치된 마우스들의 결장은 PBS 마우스의 결장과 거의 유사하였다(*는 아노바 통계 테스트에서 p<0.05를 의미한다).

도 45 하단은 상기 만성 IBD에 대한 치료 분석(도 43)에 포함된 마우스들에 대해 54일째 되는 날 수거된 장간막 림프절에서 발견되는 세포 수를 나타낸 것이다. 세포수는 EFD가 피하로 처치된 마우스의 림프절에서만 감소되었다(***는 아노바 통계 테스트에서 p<0.001를 의미한다).

도 46은 상기 만성 IBD에 대한 치료 분석(도 43)에 포함된 마우스들에 대해 54일째 되는 날 비장 중량(상단) 및 비장 세포 수(하단)를 도시한 것이다. 비장 중량과 비장 세포수는 EFD가 피하로 처치된 마우스의 림프절에서만 감소하였다(*는 아노바 통계 테스트에서 p<0.05를 의미하고, **는 아노바 통계 테스트에서 p<0.01를 의미한다).

도 47은 상기 만성 IBD에 대한 치료 분석(도 43)에 포함된 마우스들에 대해 54일째 되는 날 수거된 비장 세포에 의한 염증성 사이토킨들의 자발적인 방출을 도시한 것이다. 2x10⁵ 세포를 0.2 ml의 세포 배양 매질 내에 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션하고, 상등액을 수거하고 IFN-γ, IL-6 및 IL-17의 농도를 멀티플렉스 바이오라드 어세이에 의해 측정하였다. 모든 사이토킨에 대하여 특히 IL-17에 대하여, PBS 처치와 EFD 처치간에 매우 큰 차이가 관찰되었다(p<0.001).

도 48 상단은 상기 만성 IBD에 대한 치료 분석(도 43)에 포함된 마우스들에 대해 54일째 되는 날 수거된 비장 세포의 핵 추출물 5 ㎍에 대해 측정된 NFκB 전사 인자의 농도를 광학 밀도로 나타낸 것이다. PBS 처치 후와 EFD 처치 후는 상당히 또는 매우 유의성 있는 차이(*는 아노바 통계 테스트에서 p<0.05를 의미하고, ***는 p<0.001를 의미한다)가 관찰되었다.

도 48 하단은 상기 만성 IBD에 대한 치료 분석(도 43)에 포함된 마우스들에 대해 54일째 되는 날 수거된 비장 세포의 핵 추출물 5 ㎍에 대해 측정된 전사 인자 PPARγ의 농도를 광학 밀도로 나타낸 것이다. PBS 처치 후와 EFD 처치 후는 상당히 또는 매우 유의성 있는 차이가 관찰되었다(**는 아노바 통계 테스트에서 p<0.01을 의미하고, ***는 p<0.001를 의미한다).

일반적 정보

EFD의 IBD에서의 염증 반응을 억제하는 능력을 테스트하기 위하여, 두개의 IBD 마우스 모델을 탐구하였다:

- TNBS 국소 감작에 부수되는 IBD

- DSS 식이 공급에 부수되는 IBD.

TNBS 국소 감작에 부수되는 IBD

TNBS (2,4,6-트리니트로벤젠설폰산)은 "순수한" T-림포사이트 의존성 감작을 일으키는 페놀 유도체를 포함하는 화합물이다. 이 감작은 항문관으로 삽입된 소관을 통해 TNBS 용액을 결장내로 국소 전달함으로써 수행된다. 며칠 후 동일한 화합물을 국소 전달하여 국소 T-림포사이트 반응을 통한 궤양을 갖는 국소 염증 손상부위를 만들었다.

이 모델의 이점은 T-림포사이트 의존성 염증반응을 고찰하는 데 있다.

이 모델의 단점은 하기와 같다:

- 각 마우스들은 두번 마취된 후 조심스럽게 항문내 소관을 삽입하여야 한다.

- TNBS은 인간에게는 너무 강력한 감작제이다. 실험실 작업자를 감작시킬 위험이 크며, 동등한 페놀 유도체가 우리 환경에 빈번히 존재한다. 매우 빠르게 조작되어야 한다.

DSS 식이 공급에 부수되는 IBD

DSS (덱스트란 소듐 설페이트)는 섭취시 마우스에 국소 장 손상을 일으키는 화합물이다. 음용수를 통해 전달하기 쉽다. TNBS보다 덜 강력한 감작제이므로, 실험 작업자에게 위험도가 낮다. 손상 기전은 부분적으로 알려져 있으며, 무-세균 마우스에서 DSS-유발 병변이 존재하지 않는 것은 직접적이고 단일한 면역학적 기전을 배제한다. 인간에서의 크론병에 있어서 장내 박테리아는 반드시 존재하여야 하는 것으로 관찰되며, 어떤 연구자들은 DSS 모델이 인간 질환에 대해 TNBS 모델보다 더 근접하는 것으로 제안하고 있다.

실시예 1. DSS 유도 IBD 예방 모델(단기 효과)

프로토콜

프로토콜 1

6 내지 7주령의 C57Bl/6 마우스를 각 군당 10 마리의 마우스로 이루어지는 4그룹으로 분포시켰다:

- 1그룹의 마우스에는 어떤 것도 주지 않았다: 대조군을 구성한다.

- 2그룹의 마우스에는 100㎕의 등장식염수를 피하로 투여하였다. 음용수는 21일 후 물 내 2.5% DSS 용액으로 대체하여 7일간 투여하였다.

- 3그룹의 마우스에는 1일과 2일에는 1 mg의 EFD를 섭취시키고, 8일과 9일에 재차 1 mg의 EFD를 섭취시켰다. 음용수는 21일 후 DSS 용액으로 대체하여 7일간 투여하였다.

- 4그룹의 마우스에는 첫날 꼬리 끝에 100㎕의 등장식염수내 100㎍ EFD를 피하로 투여하였다. 음용수는 21일 후 DSS 용액으로 대체하여 7일간 투여하였다.

초기 병리학적 변화를 분석하기 위해 모든 마우스들은 8일(5마리의 마우스) 또는 10일(5마리 마우스)에 치사시켰다: 결장 길이, 조직학적 검사.

프로토콜 2

이 프로토콜은 프로토콜 1과 유사하다. C57Bl/6 마우스(각군당 10 마리의 마우스)는 음용수에 2.5% 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)를 5일간 공급받거나 공급받지 않았다. 이 프로토콜은 7일 대신 5일간 DSS를 공급받기 때문에, 프로토콜 1보다 약간 가볍다. DSS 투여 21일 전 EFD 100㎍을 피하로 투여받았다. 한 그룹은 EFD 대신 PBS를 공급하였다. 마지막 그룹인 대조군은 DSS도 EFD도 공급하지 않았다.

DSS를 섭취시킨 후 8일 또는 10일간 매일 체중을 조사하고, 동물 변화를 관 찰하였다. 관찰된 사인의 강도를 하기와 같이 수립된 임상 점수로 요약하였다:

- 0, 정상 마우스

- 1, 항문의 염증

- 2, 항문의 염증 및 연변

- 3, 항문 염증 및 설사

- 4, 항문 염증 및 혈변

DSS를 섭취시킨 후 8일째 되는 날, 각 그룹에서 4마리의 마우스를 치사하고, 그 결장을 수거하여 측정하고(항문 및 맹장 사이의 길이), 티슈-텍 O.C.T. (사쿠라 파인텍)에 위치시키고, 조직 검사를 위해 동결시켰다. 잔존 마우스는 10일째 되는 날 치사시켰다.

결장 조직 샘플들을 10일째 되는 날 수거하여 멀티플렉스 키트(바이오라드)를 사용하여 상이한 사이토킨/림포킨의 함량을 각각 측정하였다.

결과

1. 마우스의 체중 커브 및 임상적 변화

EFD 처치 없이 덱스트란 소듐 설페이트를 음용수로 투여받은 그룹 2의 마우스들은 급격히 체중이 감소하였다(도 1 좌측). 섭취 후 6일 또는 7일째, 동물들의 활발성이 급격히 감소하였다: DSS 섭취를 중단한 지 24시간 또는 72시간 후에도 전혀 또는 양호하게 회복되지 않았다. 3마리의 마우스들은 8일째 되는 날 치사하였다.

그룹 3 및 4의 EFD를 경구 또는 피하로 처치 받은 마우스들은 약간 아픈 듯 보였으나, 심각하지 않았다: 활발하게 활동하였으며, 회복되는 것으로 나타났다. 이들 그룹에서는 어떤 마우스도 죽지않았다.

프로토콜 2에 따라 EFD를 처치 받은 그룹의 마우스들은 대조 마우스들과 유사한 체중 커브를 나타내었으며(도 16a), 이로써 EFD를 전처리함으로써 IBD증후군을 감소시킬 수 있음이 입증되었다.

2. 임상 점수

EFD를 처치하지 않은 마우스들은 DSS 섭취 후 4일 또는 5일 후 상승된 임상 점수를 나타내었다(염증 및 설사). 이들 점수는 7 내지 8일 후 더욱 상승하였다(도 1의 우측).

EFD를 처치한 마우스들은 DSS 섭취 후 4일 또는 5일 후, 서로 동일한 점수를 보였으나, 처치하지 않은 마우스에서 관찰되는 값보다 훨씬 낮은 값을 나타내었다. 이 점수들은 회귀분석 후 정규화되었다. EFD를 처치한 마우스는 7일 및 8일에 항문염증도 설사도 나타내지 않았다(도 6). 프로토콜 2에 따라 EFD를 처치 받은 마우스들은 대조 마우스와 유사한 임상 점수를 나타내었다(도 16b).

3. 결장 염증

a) 육안 검사

섭취 중단 1일 또는 3일 후, DSS 섭취후 8일 또는 10일째 되는 날 동물들을 치사시켰다. 부검일에 따른 차이는 관찰되지 않았다. 대조 동물의 결장 내에는 항문으로 갈수록 딱딱한 다량의 변을 포함하고 있다. 결장의 평균 길이는 6.7cm였다(도 5). DSS를 섭취한 동물의 결장 길이는 약 3.8 cm로 감소하였다(도 2 및 5). DSS를 섭취한 마우스는 변이 묽었고, 결장에는 출혈이 많았다.

EFD를 처치한 동물의 결장은 다소 딱딱한 대조 동물의 변과 동일한 성상의 변을 포함하였다(도 4). 결장의 평균길이는 5.8cm였다(도 5). 투여 모드에 따른 EFD 처치 효과의 차이는 관찰되지 않았다(도 5).

프로토콜 2에 따라 EFD를 처치한 마우스의 경우 DSS를 전혀 공급하지 않은 대조 마우스와 유사한 결장 및 맹장 길이를 나타내었다(도 17).

b) 현미경 검사

DSS 투여후 손상부위를 현미경 검사한 결과, 장내 점막 수준에서 심각한 염증 반응, 장간막 삽입 수준에서 중요한 점막하 부종이 장벽의 비후와 함께 관찰되었다. 장 융모은 분열되고 부분적으로 비구조화되었다(대조에 대한 도 7 및 8 대 도 9 및 10, 도 13 및 14).

DSS 섭취 전 EFD로 처치한 동물에서 손상은 그다지 심각하지 않았다(대조에 대한 도 7 및 8 대 도 11 및 12). 장 융모 또한 대조 동물에서 관찰되는 것과 조직적으로 유사하였다(도 13 및 14).

c) 결장 조직 및 비장 내 존재하는 염증성 조절자.

IL-12p40, IL-12p70, RANTES, IL-1 beta, TNF alpha, MIP-1 alpha, IL-17, IFN gamma, IL-10, KC, IL-6, IL-1 alpha, IL-3, GM-CSF, 및 G-CSF의 용량. 모든 사이토킨과 림포킨은 제조자 지시에 따라 바이오플렉스법을 사용하여 측정하였다(바이오라드).

비장내 T-bet 및 GATA-3 단백질의 양

비장 세포에서 추출된 모든 단백질을 7.5% SDS-PAGE에 용해시킨 후, 니트로셀룰로스 시트에 이송한 단백질 밴드를 다클론 래빗 항-마우스 FOXP3 IgG(독일, 마인쯔, 면역학 연구소, E. Schmitt 및 C. Richter로부터 제공받음)와 마우스 단클론 항-T-bet, 마우스 단클론 항-GATA-3 (CA, 산타크루즈, 산타크루즈 바이오테크놀로지) 또는 β-액틴 마우스 단클론 Ab (영국, 캠브리지, Ac-15 아브캄)으로 탐침하였다. 2차 Ab로서 HRP-라벨된 다클론 고우트 항 래빗(덴마크, Dako Cytomation)을 사용하였다. 상기 면역 복합체는 증강된 화학발광 검출시스템으로 측정하였다(프랑스, Amersham, France).

염증성 사이토킨 및 림포킨은 음용수에 DSS를 넣어 섭취한 마우스에서 수거된 결장 샘플 내에 고농도로 존재하였다. 이들 분자는 마우스에서 관찰한 중요한 병리학적 변화의 기원 또는 결과이다. DSS를 섭취하기 전에 EFD를 피하로 처치 받은 동물에서 이들 분자들의 농도는 DSS 없는 수도물을 섭취한 대조 동물에서 관찰된 농도 범위 내로 관찰되었다(도 19-24).

d) 장간막 림프절 세포 수

장간막 림프절의 크기 증가는 대장 질환 특히 염증성장질환에서 자주 수반되는 것이다.

DSS 공급 시작 10일 후, 프로토콜 2의 마우스의 장간막 림프절을 수거하고, 세포-스트레이터(Falcon)에서 분쇄하였다. 분리된 세포를 5% FCS 보충한 AIM V 매질(Gibco)에서 세척하고, 세포 펠렛을 0.5 또는 1 ml의 매질 내에 재 부유시켰다. 세포들을 10배 트립판블루(PBS 내 0.1%)내 희석하고, 말라세쯔 셀내에서 현미경하 에서 계수하였다. 대조 마우스에 비하여 DSS 공급 및 PBS-처치 마우스의 경우 세포수가 증가(x 2.5)되었다. EFD를 예방적으로 처치함으로써 이 값을 대조 마우스의 값으로 상당히 감소시킬 수 있었다(도 18).

실시예 2. DSS 유도 만성 IBD 의 예방적 모델(장기 효과)

이 모델은 만성 IBD에서의 EFD의 예방적 처치를 고찰하기 위한 것이다.

프로토콜

6 내지 7주령의 C57Bl/6 마우스를 각군당 10 마리의 마우스로 이루어지는 4그룹으로 분포시켰다. 마우스(C57Bl/6 수컷 마우스)에 7일간 음용수에 1.5%DSS를 넣어 공급하고, 8일간 통상의 수도물, 5일간 음용수에 1.5%DSS를 넣어 공급하고, 10일간 수도물, 5일간 음용수에 1.5%DSS를 넣어 공급하고, 그후 수도물을 공급하였다. 한 그룹의 마우스에는 EFD를 처리하였다: DSS 공급 첫날의 21일전에 100㎍을 피하주사; 또는 DSS 공급 첫날의 23일, 22일, 및 21일 전에 경구로 1mg 공급. 더이상의 EFD는 처치하지 않았다. 실험은 52일째 되는 날 종결되었다.

결과

체중 커브

EFD를 경구 또는 피하로 처치한 마우스들은 체중이 다소 감소하는 것으로 나타났으나, EFF 처치 없이 DSS를 공급한 마우스와 달리 세 시리즈의 DSS 섭취 후 실험이 끝나갈 즈음(50일) 다시 체중이 증가하였으며, 예방적 처리시 대조 마우스와유사한 체중을 가질 수 있었다(도 25).

임상적 점수

도 26에 따르면, 실험 종말에(50일), EFD를 처치하지 않은 마우스들은 DSS 공급이 끝난 후 계속하여 임상 점수가 상승하였다. EFD를 전처치한 경우의 마우스들은 실험이 끝날 즈음에 정상화된 임상 점수를 나타내었지만, EFD를 처치하지 않은 마우스는 세 번의 IBD 자극이 끝난 후에도 계속하여 임상 점수가 상승하였다.

결장 염증

실험이 끝날 때(52일), EFD 처치한 마우스의 결장은 DSS를 공급하지 않은 마우스의 결장과 유사한 것으로 관찰되었다(도 27 상단).

림프절 및 비장

실험이 끝날 때(52일), EFD 처치한 마우스의 림프절에서의 세포수는 PBS 처치한 마우스에 비해 감소하였으며, DSS를 전혀 공급하지 않은 대조 마우스의 세포수로 점진적으로 복귀되었다(도 27 하단).

도 28에 도시한 바와 같이, 본 예방 분석에 포함된 마우스들의 52일째 되는 날의 비장 중량 및 비장 세포 수의 차이는 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다.

비장에서의 염증성 조절자의 방출

실험이 끝날 때(52일) 수거된 비장 세포에 의한 염증성 사이토킨의 자발적 방출이 연구되었다. PBS 투여후, EFD 전처리시 관찰된 차이는 모든 사이토킨에서 매우 유의미한 차이를 나타내었으며(IFN gamma, IL-6 및 IL-17), 특히 IL-17의 경우 현저한 차이를 나타내었다. 만성 IBD 후 EFD를 전처리함으로써 DSS를 전혀 공급받지 않은 대조 마우스와 유사한 정도의 사이토킨 방출을 유지할 수 있었다(도 29).

핵인자-kappaB (NF-κB)는 염증성 장질환에서 활성화되고 염증성 사이토킨을 상향-조절하는 것으로 알려져 있다. 도 30 상단에 도시한 바와 같이, DSS의 마우스에 대한 반복적 투여에 의해 유발된 NF-κB의 고농도는 EFD 전처치에 의해 상당히 감소된다.

퍼옥시좀 증식자-활성 리셉터-γ(PPAR-γ)은 지방 조직, 부신, 및 비장에서 주로 발현되는 리간드-의존적 전사 인자의 핵성 리셉터 슈퍼패밀리중 하나로서, 많은 염증성 반응, 특히 장 염증의 조절에 관련되어 있다. 이는 핵 인자 kappaB (NF-κB) 활성의 경감을 통한 대장염의 핵심 저해자로 제안되어 왔다. 비장에서의 PPAR-γ 수준은 도 30 하단에 도시된 바와 같이 만성 염증 시 경감된다. EFD의 예방적 처치는 만성 IBD 모델의 PPAR-γ 수준을 아무것도 처치하지 않은 마우스(만성 IBD가 없는)이상의 수준으로 상승시킨다.

실시예 3 . DSS 유발 IBD 의 치료적 모델(장기효과)

본 모델은 급성 IBD에서의 EFD의 치료적 처치 효과를 고찰한 것이다.

프로토콜

6 내지 7주령의 C57Bl/6 마우스를 각군당 10 마리의 마우스로 이루어지는 4그룹으로 분포시켰다. 마우스(C57Bl/6 수컷 마우스)에 5일간 음용수에 2.5%DSS를 넣어 공급하고, 그 후 수도물을 공급하였다. 한 그룹의 마우스에는 EFD를 처리하였다: DSS 공급 마지막날의 24시간 후(즉 6일째 되는 날)에 100㎍을 피하주사; 또는 DSS 공급 첫날의 6일, 7일, 및 8일 후에 경구로 1mg 공급. 더이상의 EFD는 처치하지 않았다. 실험은 34일째 되는 날 종결되었다.

결과

체중 커브

본 급성 DSS-유발 IBD에서의 치료적 처치 모델에서, 각 마우스의 체중은 DSS 섭취 첫날부터 1주에 5일간 그 후 35일까지 체크하였다. EFD 처치후, 13일째 되는 날에 약간의 유의성 있는 치료적 효과가 관찰되었으며, 15일째 되는 날 보다 신속한 체중 감소의 회복이 관찰되었다(도 31).

임상적 점수

점수는 전술한 바와 같은 기준으로 매겨졌다(실시예 1). 임상적 증상은 PBS 처치된 마우스에 비하여 EFD 처치된 마우스에서 더 빨리 경감되었다(도 32).

결장 염증

실험이 끝날 때(34일), EFD 처치된 마우스의 결장은 DSS를 전혀 공급하지 않은 미처치 마우스의 것과 유사한 것으로 관찰되었다(도 33 상단).

림프절 및 비장

실험이 끝날 때(34일), EFD 처치한 마우스의 림프절에서의 세포수는 PBS 처치한 마우스에 비해 감소하였으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(도 33 하단). 도 34에 도시한 바와 같이 34일째 되는 날의 비장 중량 및 비장 세포 수의 차이는 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다.

비장에서의 염증성 조절자의 방출

실험이 끝날 때(34일) 수거된 비장 세포에 의한 염증성 사이토킨의 자발적 방출이 연구되었다. PBS 투여 후와 EFD 전처리시 관찰된 차이는 IL-17의 경우 현저한 차이를 나타내었지만, IFN γ 및 IL-6의 경우 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 35).

도 36의 상단에 도시한 바와 같이, PBS 처리한 마우스의 비장에서는 DSS 섭취가 끝난지 한달 후에도 고농도의 NF-κB가 유지되었다. 동일하게 EFD 처치는 EFD를 처치하지 않은 것에 비하여 NF-κB의 농도를 상당히 감소시키고, DSS를 전혀 공급받지 않은 미처치 마우스와 유사한 정도를 나타내었다.

도 36의 하단에 도시한 바와 같이 실험이 끝나갈 때, PBS 처리된 마우스의 비장에서의 PPAR-γ의 농도와 EFD 처치된 마우스의 비장에서의 농도는 현저히 상이하였다.

실시예 4. DSS 유발 만성 IBD 의 치료적 및 예방적 모델(장기 효과)(도 37-42)

본 모델은 만성 IBD에서 EFD의 치료적 및 예방적 처치 효과를 고찰한 것이다.

프로토콜

6 내지 7주령의 C57Bl/6 마우스를 각군당 10 마리의 마우스로 이루어지는 4그룹으로 분포시켰다. 마우스(C57Bl/6 수컷 마우스)에 7일간 음용수에 1.5% DSS를 넣어 공급하고, 8일간 통상의 수돗물, 5일간 음용수에 1.5% DSS를 넣어 공급하고, 10일간 통상의 수돗물, 5일간 음용수에 1.5% DSS를 넣어 공급하고, 그 후 수도물을 공급하였다. 한 그룹의 마우스에는 EFD를 처리하였다: DSS 공급 첫날의 9일후에 100㎍을 피하주사; 또는 DSS 공급 첫날의 9일, 10일, 및 11일 후에 경구로 1mg 공급. 더 이상의 EFD는 처치하지 않았다. 실험은 52일째 되는 날 종결되었다.

결과

체중 커브

본 만성 DSS-유발 IBD에서의 치료/예방적 처치 모델에서, 각 마우스의 체중은 DSS 섭취 첫날부터 1주에 5일간 그 후 52일까지 체크하였다. EFD 처치후, 13일 째 되는 날에 약간의 유의성 있는 치료적 효과가 관찰되었으며, 15일째 되는 날 보다 신속한 체중 감소의 회복이 관찰되었다(도 37).

임상적 점수

점수는 전술한 바와 같은 기준으로 매겨졌다(실시예 1). 임상적 증상은 PBS 처치된 마우스에 비하여 EFD 처치된 마우스에서 더 빨리 경감되었다(도 38).

결장 염증

실험이 끝날 때(52일), EFD 처치된 마우스의 결장은 PBS 처치한 마우스의 것과 유사한 것으로 관찰되었다(도 39 상단).

림프절 및 비장

실험이 끝날 때(52일), EFD를 피하 주사 처치한 마우스의 림프절에서의 세포수만 감소되었으며, PBS 처치된 마우스와의 차이는 통계적으로 매우 유의하였다(도 39 하단). 유사하게, 비장 중량 및 비장 세포 수는 EFD를 피하 주사 처치한 마우스에서만 감소하였다(도 40).

비장에서의 염증성 조절자의 방출

실험이 끝날 때(52일) 수거된 비장 세포에 의한 염증성 사이토킨의 자발적 방출이 연구되었다. PBS 투여후와 EFD 전처리시 관찰된 차이는 모든 사이토킨에서 상당한 차이가 발견되었으며, 특히 IL-17의 경우 현저한 차이를 나타내었다(도 41).

도 42의 상단에 도시한 바와 같이, PBS 처리한 마우스의 비장에서는 만성적인 IBD 고농도 NF-κB가 관찰되었다. EFD 처치한 마우스의 비장내 NF-κB의 농도는 PBS 처치된 마우스의 비장내 농도보다 더 낮았으며, 매우 유의한 차이를 나타내었다.

만성 IBD 후, PBS 및 EFD 처리된 마우스의 비장에서 관찰된 PPAR-γ의 수준은 매우 달랐으며, 매우 유의한 차이를 나타내었다(도 42 하단).

실시예 5. DSS 유발 만성 IBD 의 치료적 모델(단기 효과)(도 43-48)

본 모델은 만성 IBD에서의 EFD의 치료적 처치 효과를 고찰한 것이다.

프로토콜

6 내지 7주령의 C57Bl/6 마우스를 각군당 10 마리의 마우스로 이루어지는 4그룹으로 분포시켰다. 마우스(C57Bl/6 수컷 마우스)에 7일간 음용수에 1.5% DSS를 넣어 공급하고, 8일간 통상의 수돗물, 5일간 음용수에 1.5% DSS를 넣어 공급하고, 10일간 통상의 수돗물, 5일간 음용수에 1.5% DSS를 넣어 공급하고, 그 후 수도물을 공급하였다. 한 그룹의 마우스에는 EFD를 처리하였다: DSS 공급 마지막날의 7일후에 100㎍을 피하주사; 또는 DSS 공급 첫날의 42일, 43일, 및 45일 후에 경구로 1mg 공급. 실험은 54일째 되는 날 종결되었다.

결과

체중 커브

본 만성 DSS-유발 IBD에서의 치료적 처치 모델에서, 각 마우스의 체중은 DSS 섭취 첫날부터 1주에 5일간 그 후 54일까지 조사하였다. EFD 처치후, 54일째 되는 날 체중 감소의 회복과 함께 약간의 치료적 효과가 관찰되었다(도 43).

임상적 점수

점수는 전술한 바와 같은 기준으로 매겨졌다(실시예 1). 피하주사로 EFD를 처치한 경우에서만, 임상적 증상이 감소하였으며, 정상과 유사하였다(도 44).

결장 염증

실험이 끝날 때(54일), EFD 처치된 마우스의 결장은 PBS 처치한 마우스의 것과 유사한 것으로 관찰되었다(도 45 상단).

림프절 및 비장

실험이 끝날 때(54일), EFD를 피하 주사 처치한 마우스의 림프절에서의 세포수만 감소되었으며, PBS 처치된 마우스와 EFD 처치된 마우스간에는 통계적으로 매우 유의한 차이가 관찰되었다(도 45 하단). 유사하게, 비장 중량 및 비장 세포수는 EFD를 피하 주사 처치한 마우스에서만 감소되었다(도 46).

비장에서의 염증성 조절자의 방출

실험이 끝날 때(54일) 수거된 비장 세포에 의한 염증성 사이토킨의 자발적 방출이 연구되었다. PBS 투여 후와 EFD 전처리시 관찰된 차이는 모든 사이토킨에서 상당한 차이가 발견되었으며, 특히 IL-17의 경우 현저한 차이를 나타내었다(도 47).

도 48의 상단에 도시한 바와 같이, EFD 처치한 마우스의 비장내 만성적 IBD NF-κB의 농도는 PBS 처치된 마우스의 비장내 농도보다 더 낮았으며, 상당히 유의한(피하 투여) 또는 매우 유의한(경구 투여) 차이를 나타내었다.

만성 IBD 후, PBS 및 EFD 처리된 마우스의 비장에서 관찰된 PPAR-γ의 수준은 매우 달랐으며, 매우 유의한 차이를 나타내었다(도 48 하단). EFD 투여는 그 투여 모드에 관계없이 어떤 화합물도 처리하지 않은 미처리 마우스와 유사하거나 약간 높은 PPAR-γ 수준을 나타내게 한다.

실시예 6 . TNBS 유발 IBD 의 예방적 모델(단기 효과)

프로토콜

C57Bl/6 수컷 마우스에 TNBS(100㎕의 50% 에틸알코올내 1 mg의 2, 4, 6-트리니트로벤젠설폰산)을 5일 및 0일에 결장내 국소적으로 두번 투여하거나, 투여하지 않았다. 10일간 변을 관찰하였다. 10일째 되는 날, 마우스의 체중을 측정하였다. 한 그룹의 마우스에는 TNBS를 처치한 첫날의 5일 전(즉 -10일에) EFD 100㎍을 피하주사하였다. 두 번째 그룹은 PBS를 투여하였다. 대조군은 TNBS도 EFD도 처치하지 않았다.

결과

TNBS 처치가 시작된 0일 및 10일에 동물들의 체중을 측정하였다. TNBS를 투여받은 마우스들은 약 2 그람이 감소한 반면, TNBS를 처치하지 않은 미처치 마우스는 1 그람이 증기하였으며, TNBS 투여전에 EFD를 처치한 마우스는 실험시와 동일한 체중을 나타내었다(도 15)

실시예의 결론

DSS 모델

예방적 모델: EFD는 급성 모델(5일 또는 7일 동안 DSS 투여-실시예 1) 및 만성 모델에서(DSS는 5일간 투여하고, 5일 간격으로 3회 투여-실시예 2) DSS를 투여하기 21일 전에 피하주사 또는 경구로 투여되었다. 임상적 증상(체중, 변 상태), 조직병리학적 검사, 결장 조직 및 비장에서의 사이토킨/림포킨 농도, 비장에서의 전사인자 NFκB 및 PPARγ수준에서 예방적 효과가 관찰되었다.

치료적 급성 모델: EFD는 DSS를 5일간 투여하고 24시간 후 피하주사 또는 경구로 투여되었다(실시예 3). EFD 처치 그룹은 한달 후 실험이 끝날 즈음, PBS 처치 그룹보다 더 빠른 체중 회복을 나타내었으며, 그 증상도 덜 심각하였고, 생물학적 표지자도 정상치에 가까운 것으로 관찰되었다.

치료적 및 예방적 만성 모델: EFD는 DSS를 7일간 공급하고 24시간 후 피하 또는 경구로 처치되었으며, 52일째 되는 날까지 2 시리즈의 5일간의 DSS 공급을 시행하였다(실시예 4).한달 후 실험이 끝날 즈음, EFD 처치 그룹은 PBS 처치 그룹보다 생물학적 표시자가 정상치에 가까운 것으로 관찰되었으며, 임상적 증상에 대한 효과도 나타내었지만 현저하지는 않았다.

치료적 만성 모델: EFD는 일련의 DSS 공급후(7일간 DSS 공급 및 2 시리즈의 5일간의 DSS 공급) 48시간 후 피하주사 또는 경구 처치되었다(실시예 5).한달 후 실험이 끝날 즈음, EFD 처치 그룹은 PBS 처치 그룹보다 생물학적 표시자가 정상치에 가까운 것으로 관찰되었다.

TNBS 모델

이 실험은 TNBS에 대해 제한된 마우스를 대상으로 시행되었다. EFD 처치후 염증 반응의 감소가 관찰되었으며, EFD가 순수한 T-림포사이트 의존성 면역 반응을 감소할 수 있다는 것을 보여준다.

이러한 모든 결과는 EFD가 상이한 DSS 유발 IBD 모델에서 강력한 항-염증 활성을 갖는 것을 보여준다. 예방적 치료로서, EFD는 임상적 증상 및 생물학적 파라메터에 작용한다. 치료적 처치로 EFD는 본질적으로 생물학적 파라메터에 작용한다. 임상적 효과에 대한 효과도 존재하나 본 경우와 같은 근원적인 만성 IBD에서는 현 저하지는 않았으며, 치료와 실험의 종말(측정이 이루어진)의 간격이 12 내지 19일로 짧았기 때문으로 사료된다.

EFD는 TNBS 유발 IBD 모델(실시예 6)에서도 그 효과가 관찰되었으며, 이는 순수한 T-림포사이트 의존성 획득 면역 반응에서도 항-염증 효능을 나타낸다는 것을 보여준다.

이러한 실시예를 통해, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명에 따른 그람 양성 박테리아 제제가 염증성장증후군의 예방 및 치료에 유용하다는 것을 확인할 수 있다. 실제, 많은 사이토킨(즉 IFN 감마, IL-6 및 IL-17) 뿐 아니라 염증 반응에 관련된 두개의 전사 인자(NF카파B 및 PPAR감마)들도 분석되었다. 실시예에서 보인 결과들은 본 발명에 따른 그람 양성 박테리아가 TNF-알파, IL-12, IFN-감마 및 T-bet가 관련된 Th1 시그널 경로뿐 아니라, IL-4, IL-13 및 GATA-3이 관여하며, IL-17 및 PPAR-감마가 수반되는 것으로 보이는 새로운 시그널 경로인 Th2 시그널 경로(Young Y. Current Gastroenterolo Rep 2006 Dec; 8 (6) : 470-7)에까지 작용하는 원천적인 성질을 갖는 것을 보여준다.

Claims (35)

1. 그람 양성 박테리아 제제를 염증성장증후군의 예방 및 치료에 사용하는 용도로서, 상기 제제는 그람 양성 박테리아가 사멸 또는 비감염성이고, 자연 구조의 박테리아 단백질 성분을 50 중량% 이상, 바람직하게는 90 중량% 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
2. 제1항에 있어서, 상기 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제는 박테리아 내에 함유된 분자의 구조를 변성시키지 않는 공정을 사용하여 수득 되는 것인 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 그람 양성 통성 세포내 박테리아인 것을 특징으로 하는 용도.
4. 제3항에 있어서, 상기 그람 양성 통성 세포내 박테리아는 마이코박테리움 보비스 BCG인 것을 특징으로 하는 용도.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 동결건조에 의해 사멸되는 것을 특징으로 하는 용도.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 연장동결-건조 사멸된 것인 용도.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성장증후군은 크론병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택되는 염증성장질환인 것을 특징으로 하는 용도.
8. a) 염증성장증후군 억제능을 보유하는 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제 또는 그 일부를 제공하는 단계, 및

   b) 유효량의 상기 사멸 그람 양성 박테리아 제제 또는 그 일부를 질환을 앓고 있는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, Th1/Th2 불균형에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 질환은 크론병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택되는 염증성장질환인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 그람 양성 통성 세포내 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 그람 양성 통성 세포내 박테리아는 마이코박테리움 보비스 BCG인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 유효량의 사멸된 그람 양성 박테리아제제를 환자에게 투여하여, 류코사이트 조절 세포를 자극하는 단계를 포함하는 염증성장증후군의 예방 또는 치료 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 염증성장증후군은 크론병 또는 궤양성 대장염인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아 세포는 동결건조에 의해 사멸된 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 연장 동결-건조 사멸된 것인 방법.
16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 방법에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아 세포는 그람 양성 통성 세포내 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 그람 양성 통성 세포내 박테리아는 마이코박테리움 보비스 BCG인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 류코사이트 조절 세포는 CD4+, CD25+, T 세포, B 세포 및/또는 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
19. a) 살아있는 박테리아 세포 배양물을 수확하는 단계,

    b) 상기 박테리아 세포를 물 또는 보레이트와 같은 염의 수성 용액에 세척하는 단계,

    c) 물 또는 보레이트와 같은 염의 수성 용액 내 상기 박테리아 세포를 동결하는 단계,

    d) 동결건조기에서 98.5% 이상의 물, 바람직하게는 99% 이상의 물, 더욱 바람직하게는 99.5% 이상의 물을 제거하는데 충분한 시간 동안 건조함으로써, 상기 동결된 박테리아 세포를 사멸하는 단계, 및

    e) 상기 연장 동결 건조된 박테리아 세포를 수거하는 단계로 제조되는 그람 양성 박테리아 조성물을 포함하는 염증성장질환 치료 및/또는 예방용 조성물.
20. 그람 양성 박테리아 제제를 염증성장질환의 예방 또는 치료를 위한 의약품 제조에 사용하는 용도로서, 상기 그람 양성 박테리아 제제에서 그람 양성 박테리아는 사멸 또는 비감염성이고, 자연 구조의 박테리아 단백질 성분을 50 중량% 이상, 바람직하게는 90 중량% 이상 함유하는 것인 용도.
21. 제20항에 있어서, 상기 사멸 또는 비감염성 그람 양성 박테리아 제제는 박테 리아내 함유된 분자의 구조를 변성시키지 않는 공정을 사용하여 수득되는 것인 용도.
22. 제20항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 상기 제19항에 따라 제조되는 것인 용도.
23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 그람 양성 통성 세포내 박테리아인 것을 특징으로 하는 용도.
24. 제23항에 있어서, 상기 그람 양성 통성 세포내 박테리아는 마이코박테리움 보비스 BCG인 것을 특징으로 하는 용도.
25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 동결건조에 의해 사멸되는 것을 특징으로 하는 용도.
26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 연장 동결-건조로 사멸된 것인 용도.
27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성장질환은 크론병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
28. 그람 양성 박테리아 제제를 Th1/Th2 불균형에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 사용하는 용도로서, 상기 제제는 그람 양성 박테리아가 사멸 또는 비감염성이고, 자연 구조의 박테리아 단백질 성분을 50 중량%, 바람직하게는 90 중량%이상 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
29. 제28항에 있어서, 상기 질환은 크론병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택되는 염증성장질환인 것을 특징으로 하는 용도.
30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 그람 양성 통성 세포내 박테리아인 것을 특징으로 하는 용도.
31. 제30항에 있어서, 상기 그람 양성 통성 세포내 박테리아는 마이코박테리움 보비스 BCG인 것을 특징으로 하는 용도.
32. 그람 양성 박테리아 제제를 Th1/Th2 불균형에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 의약품의 제조에 사용하는 용도로서, 상기 제제는 그람 양성 박테리아가 사멸 또는 비감염성이고, 자연 구조의 박테리아 단백질 성분을 50 중량% 이상, 바람직하게는 90 중량% 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
33. 제32항에 있어서, 상기 질환은 크론병 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택되는 염증성장질환인 것을 특징으로 하는 용도.
34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아는 그람 양성 통성 세포내 박테리아인 것을 특징으로 하는 용도.
35. 제34항에 있어서, 상기 그람 양성 통성 세포내 박테리아는 마이코박테리움 보비스 BCG인 것을 특징으로 하는 용도.

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