FI120136B - Mycobacterium vaccae immuunijärjestelmän Th2-aktiivisuuden hillitsemiseksi - Google Patents

Description

Mycobacterium vaccae immuunijärjestelmän Th2-aktiivisuuden hillitsemisek si- Mycobacterium vaccae för nedsättning av immunsystemets Th2-aktivitet Tämä keksintö koskee tautien, joille on luonteenomaista immuunijärjestelmän ak-5 tiivisuuden siirtyminen Thl-aktiivisuudesta Th2-aktiivisuuteen, hoitamista. Se perustuu siihen yllättävään havaintoon, että Mycobacterium vaccae-valmisteet kykenevät saamaan aikaan epäspesifisen systeemisen Thl-poikkeaman, erityisesti hillitsemällä Th2-aktiivisuutta voimistamatta samanaikaisesti Thl-aktiivisuutta. Tauteja, joihin tätä keksintöä voidaan soveltaa, ovat krooninen väsymysoireyhtymä, Persian-10 lahden sota-oireyhtymä ja yleistynyt allergiaoireyhtymä.

Potilailla, jotka sairastavat kroonista väsymysoireyhtymää (CFS) (Tumberg et ai.), saattaa esiintyä enemmän allergiaa, kaksi kertaa enemmän allergisia ihoreaktioita ja matalaa NK-soluaktii visuutta ja vähäisempää IFNy- ja IL-2-tuotantoa (Straus, 1996). Joillakin esiintyy korkeita EB-viruksen vasta-ainetasoja, mikä sekin on eräs piirre 15 henkilöissä, joilla on alentunut Thl-aktiivisuus. Heillä esiintyy myös mielialan muutoksia ja masennusta. Kaikki nämä piirteet ovat yhteensopivia sytokiiniprofulis-sa tapahtuneen Thl :stä Th2:teen siirtymän kanssa. Tämä siirtymä saattaa olla seurausta nykyaikaisesta elämäntavasta, joka ei altista väestöä riittävästi Thl:tä indusoiville ärsykkeille ja pyrkii pikemminkin altistamaan sen Th2:ta indusoiville immuni-20 säätiöille ja allergeeneille.

Tämän keksinnön tekijät uskovat, että Persianlahden sota -oireyhtymä on eräs CFS:n erikoistapaus, jossa voidaan tunnistaa TH2:ta indusoivia ärsykkeitä, koska Persianlahden sotaan osallistuneille annettiin monia Th2:ta indusoivia rokotuksia. Rokotuksilla ja infektioilla voi olla systeeminen vaikutus ja ne saattavat epäspesifisesti 25 lisätä tai vähentää muita asiaan liittymättömiä antigeenejä kohtaan heränneen vasteen Thl/Th2-sytokiinitasapainoa (Shaheen et ai., 1996, Shirakawa et ai., 1996) ja vaikuttaa (positiivisesti tai negatiivisesti) selviämiseen asiaan liittymättömistä taudeista (Aaby, 1996, Aaby et ai, 1995). Keksijöiden uskoa, että nämä Persianlahdella käytetyt rokotukset saivat aikaan systeemisen Th2-siirtymän, tukevat neljä roko-30 tusohjelman kohtaa: (i) Pertussista käytettiin adjuvanttina Persianlahden brittijoukoissa ja sen adju-vanttisuus on voimakkaasti Th2:ta indusoiva (Mu & Sewell, 1993, Ramiya et ai, 1996, Smit et ai, 1996).

2 (ii) Persianlahden sotajoukoille annettiin Th2:ta indusoivia immunogeenejä ruttoa, pemaruttoa, lavantautia, jäykkäkouristusta ja koleraa vastaan. Lisäksi näin suuri an-tigeenikuormitus pyrkii käynnistämään vastetta Th2:n suuntaan (Aaby, 1995, Bret-scher et ai, 1992, Hemandez-Pando & Rook, 1994).

5 (iii) Rokotukset annettiin sen jälkeen, kun joukot oli sijoitettu sota-alueelle tai juuri ennen kuin joukot matkustivat sinne, ajankohtana, jolloin stressitasot lienevät olleet korkeita. Immunisointi kohonneiden glukokortikoiditasojen (i.e. kortisolin) aikana käynnistää vasteen Th2:n suuntaan (Bemton et ai, 1995, Brinkmann & Kristofic, 1995, Ramirez et ai, 1996).

10 (iv) Joukot altistuivat myös karbamaattia ja orgaanista fosforia sisältäville hyön teismyrkyille ja ne estävät IL-2:n käynnistämiä ilmiöitä, jotka ovat olennaisia normaalin Thl-toiminnan kannalta (Casale et ai, 1993). Tämän komponentin merkitys on epävarmaa. On kuitenkin huhuttu, että hyönteismyrkyt saatiin usein paikallisista lähteistä Persianlahdella, joten niiden puhtaus ei ollut tiedossa, ja niitäkin myrkylli-15 sempiä kontaminantteja on saattanut olla läsnä.

Monet näissä olosuhteissa annetut rokotukset ovat näin voineet aiheuttaa pitkäkestoisen systeemisen sytokiiniepätasapainon. Sama vaikutus esiintyy satunnaisesti normaaliväestössä rokotuksien tai muiden Th2:ta indusoivien ympäristöärsykkeiden ja infektioiden vaikutuksesta ja sen lukuun voidaan panna kroonisen väsymysoireyh-20 tymän laaja esiintyvyys.

Näitä seikkoja selitetään yksityiskohtaisemmin tuonnempana.

Tämän keksinnön tekijät ovat tehneet yllättävän havainnon, että (tapettua) Mycobacterium vaccaeta sisältävät valmisteet kykenevät tehokkaasti korjaamaan epäspesifisesi i systeemisen Thl-»Th2 -muutoksen. Vaikutus ilmenee immuunijärjestelmän 25 aktiivisuuden kääntämisenä pois Th2:sta tavalla, joka synnyttää immuunivasteen antigeenejä kohtaan, joita ei ole läsnä annetuissa M vaccae-valmisteissa.

Tämä on osoitettu kokeellisesti sekä eläinmallissa että ihmisessä. Edustavia kokeita kuvataan yksityiskohtaisesti tuonnempana. Ne osoittavat erityisesti ja yllättävästi Th2-aktiivisuuden heikentymisen, johon ei kytkeydykään Thl-aktiivisuuden voimis-30 tumista.

Lyhyesti, koe-eläimissä epäspesifinen systeeminen muutos pois Th2-aktiivisuudesta M. vaccaeta annettaessa voidaan todeta IL-4:stä (Th2) riippuvaisen vasta-ainevasteen ovalbumiinia (allergeeni, joka ei liity M. vaccaehen itseensä) kohtaan 3 titterin laskuna hiirissä, jotka on esi-immunisoitu Th2-vasteen selvittämiseksi. Yksi ainoa M. vaccae -ruiske pystyy saamaan aikaan tämän vaikutuksen ja lisäinjektiot voivat voimistaa sitä. Vaikutus on epäspesifinen, koska se ei vaadi minkään oval-bumiinikomponentin läsnäoloa injisoidussa valmisteessa.

5 Ihmisissä (syöpäpotilaissa) vaikutus on osoitettu lymfosyyttien, jotka erittävät spontaanisti IL-2:ta (luonteenomainen Thl-sytokiini), ilmestymisenä ääreisverenkiertoon ja IL-4:ää (luonteenomainen TH2-sytokiini) erittävien T-solujen vähenemisenä for-bolimyristaattiasetaatilla ja kalsiumionoforilla stimuloinnin jälkeen. Lymfosyyttien, jotka osoittavat tämän aktivoituneen Thl-fenotyypin, prosenttiosuus kasvaa vähitel-10 Ien kunkin peräkkäisen M. vaccae -ruiskeen jälkeen saavuttaen tasannevaiheen monissa henkilöissä 3-5 109 organismia sisältävän ruiskeen jälkeen (päivinä 0, 15, 30 ja sitten kuukausittain).

Lisäksi tuonnempana esitetään raportteja kroonista väsymysoireyhtymää sairastavista henkilöistä, joille on annettu M. vaccae -valmisteita suotuisin vaikutuksin.

15 Tämän keksinnön tekijät ovat aikaisemmin kuvanneet M. vaccaen käyttöä tuberkuloosin (GB-A-2156673), syövän (ZA 95/2644), HIV:n (WO94/06466) ja kroonisen tulehduksen (GB-B-2252044) hoidossa. Julkaisussa WO92/08488 (myös tämän keksinnön tekijöiden) kuvataan sen käyttöä adjuvanttina kysymyksessä olevan antigeenin annossa ja siinä huomautetaan antigeeniä kohtaan esiintyvän vasteen T-20 solukomponentin konversiosta Th2-kuviosta Thl-kuvioon. WO92/08488:ssa ei esitetä M. vaccaen voivan saada aikaan epäspesifistä Th2/Thl-muutosta immuunijärjestelmän aktiivisuudessa, toisin sanoen mitään muuta muutosta kuin vasteessa, joka on varta vasten nostatettu M. vaccaen kanssa annettua antigeeniä kohtaan. Lisäksi ei WO92/08488:ssa eikä missään muuallakaan myöskään esitetä, että se voi hillitä 25 Th2-aktiivisuutta samanaikaisesti Thl-aktiivisuutta voimistamatta.

M. vaccaeta Thl-adjuvanttina koskevia katsauksia ovat Abou-Zeid et ai. (1997), Skinner et ai. (1997a) ja Skinner et ai. (1997b). Katso myös Mosman ja Sad (1996), jossa esitetään katsaus Thl-sytokiinin hillitsemisestä, millä on estävä vaikutus Th2-solujen proliferaatioon.

30 Tämä keksintö liittyy yleisesti henkilön immuunijärjestelmän Th2-aktiivisuuden hillitsemiseen Thl-aktiivisuutta voimistamatta, erityisesti hoidettaessa jotakin tautia, jolle on ominaista immuunijärjestelmässä tapahtuva siirtyminen Thl-aktiivisuudesta Th2-aktiivisuuteen, erityisesti silloin, kun Th2-aktiivisuuden hillitseminen samalla Thl-aktiivisuutta voimistamatta on hyödyllistä.

4

Esillä oleva keksintö koskee erään aspektinsa mukaan henkilön hoitomenetelmää, jossa henkilölle annetaan Mycobacterium vaccaeta sisältävää antigeenistä ja/tai immuunijärjestelmää säätelevää ainetta.

Erään toisen aspektinsa mukaan tämä keksintö koskee antigeenisen ja/tai immuuni-5 järjestelmää säätelevän Mycobacterium vaccae -aineen käyttöä henkilön hoitamiseen tarkoitetun lääkkeen valmistuksessa.

Erään toisen aspektinsa mukaan tämä keksintö koskee jonkin henkilön hoitamiseen tarkoitettua ainetta tai koostumusta, joka sisältää antigeenistä ja/tai immuuni-järjestelmää säätelevää Mycobacterium vaccae -ainetta.

10 M. vaccae -valmiste ei edullisesti sisällä mitään ulkopuolista ("vierasta") antigeeniä, immunogeeni ja allergeeni mukaan lukien.

Hoidettaville taudeille voi olla ominaista potilaan immuunijärjestelmän yleinen, epäspesifinen siirtyminen Thl-aktiivisuudesta Th2-aktiivisuuteen. Tämä voidaan määrittää tai diagnosoida alentuneella IL-2-tuotannolla tai lisääntyneellä IL-4- tai IL-15 5-tuotannolla henkilössä tai osoittamalla IL-13 edustavana TH2-sytokiinina ja gamma-interferoni (IFNy) edustavana Thl-sytokiinina. Muutkin Thl/Th2-sytokiinit voivat tulla kysymykseen. Immuunijärjestelmän epäspesifisen muuttumisen Thl-aktiivisuudesta Th2-aktiivisuuteen syyksi tai aiheuttajaksi ei voida katsoa henkilön altistumista jollekin erityiselle antigeenille tai hänen infektoitumistaan jollakin eri-20 tyisellä patogeenillä. Hoidettavat henkilöt eivät voi sairastaa tuberkuloosia tai muuta mykobakteerien aiheuttamaa infektiota. Erityistauteja, joita tämän keksinnön mukaisesti voidaan hoitaa, ovat krooninen väsymysoireyhtymä, Persianlahden sota -oireyhtymä ja yleistynyt allergiaoireyhtymä (Straus, 1996). Tämän keksinnön mukaisesti voidaan hoitaa muitakin tauteja, joissa Th2-aktiivisuuden hillitseminen Thl-25 aktiivisuutta voimistamatta on hyödyllistä.

Krooninen väsymysoireyhtymä voidaan operatiivisesti määrittää esimerkiksi käyttämällä niin kutsuttuja 1994 CDC kriteerejä (Fukuda et ai) tai niin kutsuttuja Oxfordin kriteerejä (Sharpe et ai). Tämänhetkinen tietämys kroonisesta väsymysoireyhtymästä on koottu yhteen ja käsitelty julkaisussa Tumberg et ai. (julkaistu loka-30 kuussa 1996).

Mycobacterium vaccae -aine voi olla tai sisältää tapettuja M. vaccae -soluja. Nämä solut voidaan tappaa esimerkiksi käyttämällä säteilytystä, esimerkiksi 60koboltti-lähteestä annoksella 2,5 megaradia, kemiallisesti tai millä tahansa muulla tavalla, vaikkakin autoklaavaus on suositeltavinta, esimerkiksi 69 kPa:n paineella 5 10 minuuttia 115 - 125°C:n lämpötilassa. Autoklaavauksella voidaan saada tehokkaampi valmiste kuin säteilyttämällä.

Ennen tappamista M. vaccae -soluja voidaan kasvattaa jossakin sopivassa kiinteässä kasvatusalustassa. Muunnettu Sautonin nestemäinen kasvatusalusta saattaa olla 5 edullinen (Boyden et ai) agarnla, mieluiten 1,3-prosenttisella agarilla jähmetettynä. Aerobisen inkuboinnin, joka suoritetaan yleensä 32°C:ssa 10 vuorokauden ajan, organismi voidaan korjata talteen, sitten punnita ja liettää laimenteeseen, valmiiksi antoa varten. Varastointi, mikäli sitä tarvitaan ennen käyttöä, voidaan suorittaa 4°C:ssa.

10 Solujen kiinteässä kasvatusalustassa kasvattamisen sijaan voidaan käyttää jotakin nestemäistä kasvatusalustaa, kuten esimerkiksi muunnettua Sautonin kasvatus-alustaa (Boyden et ai.), esimerkiksi fermentorissa.

Laimenne voi olla pyrogeenitonta puskuroimatonta keittosuolaliuosta. Laimenne on mieluiten boraattipuskuroitua ja se sisältää edullisesti jotakin pinta-aktiivista ainetta, 15 kuten Tween 80®:tä. Eräs sopiva boraattipuskuri on: Na2B4O7.10H2O - 3,63 g, H3BO3 - 5,25 g, NaCl - 6,19 g, Tween 80® 0,0005 %, tislattua vettä 1 litraan saakka. Nämä laimenteet ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä.

Edellä mainitut ihmisillä saadut tulokset saatiin antamalla M. vaccaeta hyvän lääkkeen valmistustavan (GMP) mukaisena valmisteena, SRL172:na, jota on saatavilla 20 ihmiskäyttöön usean tutkijan uutena ei vielä käyttöön hyväksyttävänä lääkkeenä (IND) USA:n lääkintöhallitukselta (FDA) ja kliinisistä kokeista vapauttamistodis-tukset (GTX) ovat saatavilla Yhdistyneiden kuningaskuntien lääkevalvontalaitoksel-ta Medicines Control Agencyltä. Hyvän laboratoriokäytännön mukaisen (GLP) akuuttia toksisuutta koskevan tutkimuksen on suorittanut Huntingdon Research. 25 Faasin 1 ja Faasin 2 turvallisuusmateriaali on saatu USA:ssa ja talletettu lääkintöhallitukseen (FDA). SRL172 on Faasin 3 kokeissa tuberkuloosin immunoterapiassa. SRL172 saattaa olla suositeltavin esillä olevassa keksinnössä.

SRL172 on M. vaccae -formulaatio, joka on johdettu kannasta R877R, joka on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti kokoelmaan National Collection of Type 30 Cultures (NCTC), Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London NW9 5HT, Yhdistynyt Kuningaskunta, 13. helmikuuta 1984 numerolla NCTC 11659. R877R eristettiin alunperin liejunäytteistä, jotka olivat peräisin Langon alueelta Keski-Ugandasta (Stanford ja Paul).

6 SRL172:n sijasta voidaan käyttää muita M. vaccae -kantoja. Organismi voidaan tunnistaa kuuluvaksi M. vaccae -lajiin biokemiallisin ja antigeenisin kriteerein (Bonicke et ai.).

Tässä keksinnössä on suositeltavaa, että M. vaccae -aine annetaan sellaisena, että se 5 ei sisällä tai olennaisesti sisällä mitään ei-M vaccaeta olevaa antigeenistä tai immuunijärjestelmää säätelevää ainetta. Toisin sanoen annettava lääke tai koostumus voi sisältää tai voi muodostua olennaisesti M. vaccaeta olevasta antigeenisestä ja/tai immuunijärjestelmää säätelevästä aineesta, kuten tapetuista soluista, niiden uutteesta tai johdoksesta ja jostakin farmaseuttisesti hyväksyttävästä laimenteesta.

10 Anto tapahtuu edullisesti "terapeuttisesti tehokkaana määränä", mikä on riittävä osoittautuakseen olevan hyödyksi potilaalle. Tällainen hyöty voi olla vähintään ainakin yhden oireen parantuminen. Kysymykseen tuleva määrä, annon tahti ja ajanjakso riippuvat hoidettavan taudin luonteesta ja vakavuudesta. Hoidon määrääminen, esimerkiksi annostelua koskevat päätökset jne., ovat yleislääkärien ja muiden 15 hoitavien lääkäreiden vastuulla.

Yksi annos (kun on määrä antaa tapettuja soluja) sisältää yleensä 107 - 1010 tapettua M. vaccae -mikro-organismia. Potilaille voidaan antaa yksi annos 108 - 109 tapettua M. vaccaeta, vaikkakin annos voidaan toistaa tarpeen vaatiessa esimerkiksi 2 viikon - 6 kuukauden väliajoin.

20 Koostumus voidaan antaa yksinään tai muihin hoitoihin yhdistettynä, joko samanaikaisesti tai peräjälkeen hoidettavasta tilasta riippuen.

Tämän keksinnön mukaiset farmaseuttiset koostumukset, jotka ovat tarkoitetut käytettäviksi tämän keksinnön mukaisesti, voivat sisältää aktiivisen aineosan lisäksi jotakin farmaseuttisesti hyväksyttävää täyteainetta, kantajaa, puskuria, stabilaattoria 25 tai muita alan ammattilaisten tuntemia aineita. Sellaisten aineiden tulisi olla myrkyttömiä eivätkä ne saisi sotkea aktiivisen aineosan tehoa. Kantajan ja muiden aineiden täsmällinen laatu riippuu antotavasta, joka on edullisesti ruiske, esimerkiksi kutaa-ninen, subkutaaninen tai intradermaalinen.

Ruisketta varten aktiivinen aineosa on parenteraalisesti hyväksyttävän vesiliuoksen 30 muodossa, joka on pyrogeeniton ja jolla on sopiva pH, isotonisuus ja stabiilius. Sopivia laimenteita, jotka ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä ja jotka saattavat olla parhaita, käsiteltiin jo edellä.

7

Voidaan käyttää suun kautta antoa, jolloin farmaseuttinen koostumus on tabletin, kapselin, jauheen tai nesteen muodossa. Tabletti voi sisältää jonkin kiinteän kantajan, kuten gelatiinia tai jotakin adjuvanttia. Nestemäiset farmaseuttiset koostumukset sisältävät yleensä jotakin nestemäistä kantajaa, kuten vettä, kiviöljyä, eläin- tai 5 kasviöljyjä, mineraaliöljyä tai synteettistä öljyä. Fysiologista keittosuolaliuosta, dekstroosia tai muuta sakkaridiliuosta tai glykoleja, kuten eteeniglykolia, propee-niglykolia tai polyeteeniglykolia, voidaan sisällyttää mukaan.

M. vaccae voidaan antaa aerosolina hengitystiehyeisiin käyttämällä sopivaa formu-laaiioia, esimerkiksi sisällyttämällä siihen sen kokoisia hiukkasia, että ne kulkeutu-10 vat hengitystiehyeiden asianmukaisiin osiin. Se voi olla mieluummin kuivattua jauhetta kuin vesisuspensiota.

Tapettujen solujen sijasta voidaan käyttää M. vaccaesta johdettua ainetta, erityisesti uutetta tai synteettistä molekyyliä, jolla on vaadittu aktiivisuus.

Kuten edellä lyhyesti käsiteltiin, monet rokotukset, stressi ja muut tekijät ovat saat-15 taneet saada aikaan pitkäkestoisen systeemisen sytokiiniepätasapainon Persianlahden sodan veteraaneilla. Samanlainen vaikutus saattaa sporadisesti esiintyä väestössä yleensä, johtuen rokotuksista ja muista Th2:ta indusoivista ympäristöärsykkeistä ja infektioista ja se voidaan panna myös kroonisen väsymysoireyhtymän laajan esiintyvyyden syyksi.

20 Voimakkailla immunogeeneillä voi olla systeemisiä pitkäkestoisia epäspesifisiä vaikutuksia immuunivasteen laatuun asiaanliittymättömiä antigeenejä kohtaan. Esimerkiksi tuhkarokkotartunta vähentää atopian ja pölypunkin aiheuttamien allergisten reaktioiden esiintyvyyttä (Shaheen et ai., 1996). Samoin japanilaiset lapset, jotka ovat ihotesteissä tuberkuliinipositiivisia, ovat vähemmän todennäköisesti atooppisia 25 kuin tuberkuliininegatiiviset lapset ja Thl/Th2-sytokiinien määrä verenkierrossa on heillä suurempi. Lisäksi toistettujen BCG-ruiskeiden jälkeen niillä, joissa esiintyy tuberkuliinikonversio, pääsevät suuremmalla todennäköisyydellä atooppisista oireistaan (Shirakawa et ai., 1996).

Tuhkarokkorokotus on toinen esimerkki. Kun tätä rokotetta käytettiin standardi-30 annoksena, se vähensi kuolleisuutta huomattavasti enemmän kuin voitiin odottaa tuhkarokon esiintyvyyden perusteella rokottamattomassa väestössä. Kurkkumätä-, jäykkäkouristus-ja hinkuyskärokotteilla (Th2:ta indusoivia) ei ole tätä epäspesifistä suojaavaa vaikutusta (Aaby et ai., 1995). Kuitenkin kun käytettiin korkeampititteris-tä tuhkarokkorokotetta, kuolleisuus lisääntyi, vaikka suoja tuhkarokkoa itseään vas- 8 taan säilyi (Aaby, 1995, Aaby et ah, 1995). Näyttöä on olemassa siitä, että tähän kuolleisuuden nousuun liittyi muutos Th2-aktiivisuutta kohti, ja annokseen liittyviä nousuja Th2-komponentin indusoitumisessa on todistettu useiden muiden immuno-geenien kohdalla (Bretscher et ah, 1992, Hemandez-Pando & Rook, 1994). Persian-5 lahdella käytetyt rokotteet olivat Th2:ta indusoivia (rutto, pemarutto, lavantauti, jäykkäkouristus, kolera) ja ne muodostivat kasaantuessaan suuren antigeenikuor-man, joka edelleen suosi Th2:n aktivoitumista. Lisäksi tätä tendenssiä lienee lisännyt pertussiksen käyttö adjuvanttina, koska se on voimakas Th2:n induuseri (Mu & Sewell, 1993, Ramiya et ah, 1996, Smit et ah, 1996). Tämä pertussiksen ominaisuus 10 on äskettäin johtanut keskusteluun mahdollisuudesta, että sen käyttö lapsilla omalta osaltaan lisää nykyistä atopian kasvanutta yleisyyttä (Nilsson et ah, 1996, Odent et ah, 1994).

Näiden rokotteiden luontaista pyrkimystä saada aikaan systeeminen Th2-vaste lienevät kovasti edistäneet endokriinitekijät, jotka olivat toisarvoisia stressiin nähden, 15 jolle Persianlahden sotaan osallistuneet altistuivat rokotusten aikaan.

Useat steroidihormonit muuttavat T-soluvasteita. Dehydroepiandrosteroni (DHEA) tai DHEA:n tuntemattomat metaboliitit pyrkivät edistämään Thl-kuviota. DHEA pystyykin palauttamaan immuunitoimintoja ikääntyneissä hiirissä ja korjaamaan epäsäännöllistynyttä sytokiinin vapautumista, jota todetaan vanhoissa eläimissä 20 (Daynes et ah, 1993, Garg & Bondada, 1993). Sitä on testattu ikääntyneissä ihmisissä samankaltaisten ominaisuuksien toteamiseksi (Morales et ah, 1994). Se edistää Thl-sytokiinien, kuten IL-2:n ja IFNy:n tuotantoa (Daynes & Areneo, 1989, Daynes et ah, 1990, Daynes et ah, 1995, Daynes et ai., 1991). DHEA edistää myös IL-2:n erittymistä ihmisen ääreisverenkierron T-soluista (Suzuki et ah, 1991).

25 Nämä DHEA:n vaikutukset ovat päinvastaiset kuin glukokortikoidien, kuten kortisolin, joka edistää Th2-aktiivisuutta ja on synergeettinen Th2-sytokiinien kanssa (Fischer & Konig, 1991, Guida et ah, 1994, Padgett et ah, 1995, Wu et ah, 1991). Mikäli "naivien" T-lymfosyyttien proliferaatio on käynnistynyt jonkin epäspesifisen ärsykkeen läsnäollessa (Brinkmann & Kristific, 1995) tai jonkin antigeenin vaiku-30 tuksesta (kuten tapahtuu rokotuksen jälkeen), kehittyy T-lymfosyyttejä, joilla on Th2-sytoki iniprofiili. Tämä on osoitettu jokseenkin selvästi pernasoluilla, jotka ovat peräisin "puhtaista" laboratoriojyrsijöistä, joilla on muutamia muistisoluja, normaaleissa olosuhteissa (Ramirez et ah, 1996).

Kaiken kaikkiaan "peruslinja" on se, että kortisoli suosii Th2-sytokiiniprofiilin kehit-35 tyrnistä naiveista soluista (Brinkmann & Kristofic, 1995). Tätä seikkaa ei tule se- 9 koittaa tosiasiaan, että kortisoli estää helposti vanhojen Th2-solujen sytokiinien eri-tysaktiivisuutta. Niinpä kortisolianalogien käyttö Th2-välitteisten tautien, kuten ek-seemien, astman ja heinänuhan, konventionaalisiin hoitoihin saattaa toimia anti-inflammatoristen vaikutusten kautta ja vähentämällä Th2-solujen sytokiinituotantoa 5 (Corrigan et ai., 1995), ja kuitenkin samanaikaisesti kortisolin käyttö edistää taustal la olevan ongelman säilymistä edelleen ajamalla vasta rekrytoituja T-soluja Th2-aktiivisuuteen.

Psyykkinen ja fyysinen stressi aktivoi hypotalamus-aivolisäke-lisämunuaisakselia ja johtaa siten monenlaisiin muutoksiin, joihin kuuluu lisääntynyt kortisolin tuotanto. 10 Ylenmääräinen liikunta ja ruoan ja unen puute johti DHEA:n suhteen alenemiseen kortisoliin nähden (DHEA/kortisolisuhde). Tämä korreloi suoraan viivästyneeseen yliherkkyys(DHT)reaktiivisuuteen (eräs Thl-markkeri) ja samanaikaisesti esiintyi seerumin IgE-tasojen nousua. IgE on täysin riippuvainen Th2-sytokiinituotannosta (Bemton et ah, 1995). Tämä on odotettavissa DHEA:n ja kortisolin edellä hahmotel-15 tujen tunnettujen vaikutusten valossa.

Eräs toinen esimerkki stressin aikaansaamasta Thl-»Th2 muutosvaikutuksesta on vasta-ainetason nousu EB-virusta kohtaan opiskelijoissa, jotka reagoivat stressaantuneesi! tentteihinsä. Tätä virusta säätelevät tavallisesti Thl-vaste ja sytotoksiset T-solut ja säätelyn puuttuminen johtaa viruksen replikoitumiseen ja vasta-ainetason 20 nousuun (Zwilling, 1992). Samoin lääketieteen opiskelijoista tenttikaudella otetuissa perifeerisen veren leukosyyteissä esiintyi vähemmän mRNA:ta IFNy:n, erään Thl-sytokiinin, osalta (Glaser et ai., 1993).

Samankaltaisia seikkoja voidaan osoittaa kontrolloidummin eläimillä. Tungoksesta tai pakottamisesta johtuva stressi voi lisätä mykobakteerien kasvua tuberkuloottisis-25 sa hiirissä (Brown et ai., 1993, Tobach & Bloch, 1956). Tämä on malli, joka on erittäin herkkä jopa vähäisen Th2-komponentin läsnäololle (Rook & Hernandez-Pando, 1996). Muitakin esimerkkejä on käsitelty (Moynihan, 1994).

Merkittävää näyttöä on siitä, että masennukseen liittyy runsaasti kortisolivälitteisiä vaikutuksia aivoissa [katsaus esitetty (Raven et ai., 1996)] ja stressi voi johtaa ma-30 sennukseen. Depressioon (kuten on nähty CFS:ssä ja GWS:ssä) pyrkiikin liittymään Th2-välitteisiä häiriöitä, kuten astmaa, ekseemia, ja eräät umpirauhastoiminnan muutokset ovat yhteisiä Th2-häiriöille ja masennukselle (Holsboer et ai., 1984, Rupprecht et ai., 1995).

10

Tuberkuloosissa esiintyy systeeminen Th2-suuntaus (Rook & Hemandez-Pando, 1996) ja virtsaan erittyy epätavallinen adrenaalisteroidien metaboliittikuvio (Rook et ai., 1996). Kortisolin metaboliitteja esiintyykin enemmän kuin kortisonin metaboliit-teja. Taudin hoitaminen palauttaa Thl -dominanssin ja korjaa steroidimetaboliittien 5 kuvion niin, että kortisonimetaboliitit lisääntyvät kortisolimetaboliitteihin verrattuna (Rook et ai, 1996). Masennuksen hoitaminen metyraponilääkkeellä saa aikaan saman muutoksen steroidimetaboliiteissa (esimerkiksi kortisonimetaboliittien lisääntymisen kortisolimetaboliitteihin verrattuna) (Raven et ai, 1995). M. vaccae -valmiste SRL172 on tehokas tuberkuloosin immunoterapiassa.

10 Kuten edellä selitettiin, rokotukset voivat saada aikaan systeemisiä epäspesifisiä muutoksia Thl/Th2-tasapainossa samoin kuin antigeenispesifisen immunisaation, johon tavallisesti pyritään. CFS:n hoitaminen saattaa vaatia systeemisen epäspesifisen Thl-suuntauksen normaaleille terveille henkilöille luonteenomaisen Thl-dominanssin palauttamiseksi Th2:teen nähden. Tämä on päinvastainen suuntauk-15 seen nähden, jonka rokotukset ovat saattaneet aiheuttaa Persianlahden sotaan osal listuneille.

Tässä esitetty kokeellinen näyttö osoittaa nyt yllättävästi, että Mycobacterium vaccae -valmisteet voivat vähentää haitallista Thl-»Th2 -suuntausta, jollainen voidaan todeta Persianlahden sodan veteraaneilla.

20 Esillä olevaa keksintöä havainnollistetaan seuraavassa sitä rajoittamatta kokeellisilla esimerkeillä ja seuraavilla kuvioilla:

Kuvio 1 esittää muutosta kokonaisseerumin IgE:ssä (ng/ml ± SD) hiirissä eri päivinä ensimmäisen ovalbumiinilla suoritetun immunisoinnin jälkeen laskettuna päivän 46 arvoon nähden. Suljetut ympyrät tarkoittavat M. vaccaen saajia; avoimet neliöt tar-25 koittavat keittosuolaverrokkeja. Mukavuussyistä kuviossa on esitetty ovalbumiinilla immunisointipäivät ja M. vaccaen tai keittosuolaliuoksen antopäivät.

Kuvio 2 esittää ovalbumiinia saaneista hiiristä otetuista pernasoluista in vivo vapautuneen lL-5:n mittauksia (pg/ml (keskihajonta). Pienin pitoisuus, joka käytetyssä kokeessa osoitettiin, oli 15,6 pg/ml.

30 Kuvio 3 esittää subkutaanisesti annetuilla keittosuolaliuosruiskeilla (®) tapahtuvan hoidon vaikutusta kokonaisseerumin IgEihen (ng/ml) verrattuna 107 M. vaccae -valmisteilla (o) tapahtuvaan hoitoon BALB/c hiirissä, jotka on etukäteen immunisoitu OVA:lla. (Kuvio 3A) 10 muuntamatonta M. vaccaeta (Mv), (kuvio 3B) OVA-konjugoitu M. vaccae (Mv-OVA) tai (kuvio 3C) NaCl-pesty ja periodaatilla käsitelty 35 verrokki-M vaccae (NaCl.Mv). Tulokset on ilmoitettu muutoksina verrattuna lu- 11 kerniin, jotka saatiin päivänä 46 otetuilla näytteillä, ± keskihajonta. Kuvioissa on osoitettu immunisointi- ja hoito-ohjelmat. (OVA: immunisointi 50pg:lla OVA:a IFA:ssa).

Kuvio 4 esittää subkutaanisesti annetuilla keittosuolaliuosruiskeilla (·) tapahtuvan 5 hoidon vaikutusta OVA-spesifiseen IgE:hen verrattuna 107 M vaccae -valmisteilla (o) tapahtuvaan hoitoon BALB/c hiirissä, jotka oli etukäteen immunisoitu OVA.lla. (Kuvio 4A) 10 muuntamatonta M. vaccaeta (Mv) (optinen tiheys 405 nm), (kuvio 4B) OVA-konjugoitu M. vaccae (MvOVA) (optinen tiheys 405 nm) tai (kuvio 4C) NaCl-pesty ja periodaatilla käsitelty verrokki-M vaccae (NaCl-Mv) (ng/ml). Tulok-10 set on ilmoitettu muutoksina verrattuna lukemiin, jotka saatiin päivänä 46 otetuilla näytteillä, ± keskihajonta. Kuvioissa on osoitettu immunisointi- ja hoito-ohjelmat. Kuvio 5 esittää OVA:n kanssa viljeltyjen pernasolujen IL-2-tuotantoa. Pernat saatiin päivänä 109 hiiristä, jotka oli immunisoitu OVA: 11a päivinä 0 ja 24 ja käsitelty päi- n vinä 53 ja 81 keittosuolaliuoksella, 10 :llä muuntamatonta M. vaccaeta (Mv), 15 M. vaccaehen konjugoidulla OVA :11a (Mv-OVA) tai vastaavalla verrokilla, jona oli NaCl-pesty ja periodaatilla käsitelty verrokki M. vaccae (NaCl-Mv). Viljelyn super-natantteja koottiin IL-2:n määrittämistä varten 24 tunnin kuluttua. Tulokset on ilmoitettu sytokiinin keskitasoina ± keskihajonta (pg/ml).

Kuvio 6 esittää OVA:n kanssa viljeltyjen pernasolujen IL-5-tuotantoa. Pernat saatiin 20 päivänä 109 hiiristä, jotka oli immunisoitu OVA:lla päivinä 0 ja 24 ja käsitelty päivinä 53 ja 81 keittosuolaliuoksella, 107:lla muuntamatonta M. vaccaeta (Mv), OVA-konjugoidulla M. vaccaella (Mv-OVA) tai vastaavalla verrokilla, jona oli NaCl-pesty ja periodaatilla käsitelty verrokki-M vaccae (NaCl-Mv). Viljelyn supematant-teja koottiin IL-5:n määrittämistä varten 48 tunnin kuluttua. Tulokset on ilmoitettu 25 IL-5:n keskitasoina + keskihajonta (pg/ml).

Kuvio 7 esittää hoidon, joka suoritettiin yksillä subkutaanisilla ruiskeilla, joissa käytettiin eri annoksia M. vaccaeta, vaikutusta seerumin IgE-tasoihin keittosuolahoi-toon verrattuna BALB/c-hiirissä, jotka oli etukäteen immunisoitu OVA:lla. Seerumin IgE on ilmoitettu muutoksena (ng/ml) suhteessa lukemiin, jotka saatiin päivänä 30 32 otetuista näytteistä, ennen M vaccaella tai keittosuolaliuoksella suoritettuja hoi toja (keskiarvo ± keskihajonta). Hoidon jälkeiset seeruminäytteet koottiin päivinä 52 ja 70 (s.o. 10 päivää ja 28 päivää keittosuolaliuoksella tai M vaccaella päivänä 42 suoritetun hoidon jälkeen). Immunisointi- ja hoito-ohjelmat on esitetty koemenetelmien yhteydessä. Eri ryhmien vertailu suoritettiin Mann in-Whitneyn U-testillä.

35 Kuvio 8 esittää OVA: 11a käsiteltyjen pernasolujen IL-2 (kuvio 8A) ja IL-4-tuotantoa (kuvio 8B). BALB/c-hiirille annettiin OVA:a kaksi kertaa ennen eri annoksia M vaccaeta: 10,10 tai 10 (pg/ml). Pernasolut koottiin ja viljeltiin OVA:n kanssa 12 päivänä 82. Immunisointi- ja hoito-ohjelmat on esitetty koemenetelmien yhteydessä. Viljelyn supematantteja koottiin IL-4:n määritystä varten 40 tunnin ja IL-2:n määritystä varten 24 tunnin kuluttua. Tulokset on esitetty sytokiinin keskitasoina ± keskihajonta. Eri ryhmien vertailu suoritettiin Studentin t-testillä. (Keittosuola: immuni-5 sointi kahdesti OVA:lla ennen keittosuolahoitoa; 10Λ7 Mv: immunisointi kahdesti OVA: 11a ennen 107 M. vaccae -hoitoa).

Kuvio 9 esittää kahdella subkutaanisella ruiskeella (päivinä 53 ja 81) 107 M vaccae-ta (o) suoritetun hoidon vaikutusta kokonaisseerumin IgE:hen (kuvio 9A) ja OVA-spesifiseen IgE:hen (kuvio 9B) verrattuna keittosuolaliuoksella (®) annettuun hoi-10 toon. Immunisointi- ja hoito-ohjelmat on esitetty kuviossa. Seerumin IgE on ilmoitettu muutoksena ± keskihajonta suhteessa lukemiin, jotka saatiin päivänä 46 otetuista näytteistä (ng/ml). Vertailu eri ryhmien välillä suoritettiin Mannin-Whitneyn U-testillä. (OVA: ovalbuniini-immunisointi; Mv: M. vaccae -immunisointi).

Kuvio 10 esittää OVA:n kanssa viljeltyjen pernasolujen IL-5:n (kuvio 10A), IL-2:n 15 (kuvio 10B) ja lFM-y:n (kuvio 10C) tuotantoa (pg/ml). Pernasolut kerättiin ja viljeltiin OVA:n kanssa päivänä 109. Immunisointi-ja hoito-ohjelmat on esitetty kuviossa 9. Viljelyn supernatantit koottiin IL-5:n määritystä varten 48 tunnin ja IFN-y:n ja IL-2:n määritystä varten 24 tunnin kuluttua. Tulokset on esitetty sytokiinin keskitasoina ± keskihajonta. Vertailu eri ryhmien välillä tehtiin Studentin t-testillä. (Keittosuola- y 20 liuos: immunisointi kahdesti OVA:lla ennen keittosuolaliuoshoitoa kahdesti; 10 n

Mv: immunisointi kahdesti OVA:lla ennen 10 M vaccae -hoitoa kahdesti).

Kaikki tässä mainitut julkaisut sisällytetään tähän viitejulkaisuina.

Esimerkki 1 M vaccaen anto koe-eläimille ja tuloksena olevan immuunijärjestelmän Th2-25 aktiivisuuden epäspesifisen heikkenemisen osoittaminen

Balb/c-hiiriä, jotka olivat 6-8 viikon ikäisiä, immunisoitiin 50 pg:lla öljyyn emul-goitua ovalbumiinia (epätäydellinen Freundin adjuvantti) päivinä 0 ja 24. Tämän tiedetään herättävän voimakkaan Th2-vastekuvion, jota seuraa IgE:n tuotanto ja signaalin anto kahden Th2-sytokiinin, IL-4:n ja IL-5:n, vapautumiseen.

30 Sitten eläimet saivat keittosuolaliuosta tai 107 autoklavoitua M. vaccaeta päivinä 53 ja 81 (subkutaanisena ruiskeena).

Seeruminäytteitä otettiin päivänä 46 (s.o. ennen hoitoa keittosuolaliuoksella tai M. vaccaella) ja päivinä 67, 91 ja 109.

13

Pernasoluja koottiin sitten ovalbumiinille altistamista varten in vitro -viljely-systeemissä. Viljelmien supematantteja koottiin 48 tunnin kohdalla sytokiinien määrittämiseksi ELISA:lla.

Käytettiin sieppauskokeita Pharmingenilta peräisin olevilla vasta-ainepareilla.

5 IL-5 nro 1805ID sieppaus; nro 18062D (biotinyloitu) detektio. Detektiovasta- aineen sitoutuminen osoitettiin streptavidiini-piparjuuriperoksidaasikonjugaatilla (DAKO P0397) ja kromogeenina oli ABTS (Sigma A-l 888).

IgE nro 0211 ID sieppaus; nro 02122D (biotinyloitu) detektio. Detektio vasta-aineen sitoutuminen osoitettiin avidiini-alkalinen fosfataasikonjugaatilla (Sigma E-10 2636) ja kromogeenina oli pNPP (Sigma N-2770).

IgE-tasoja koskevat tulokset ilmoitetaan muutoksena ng/ml -arvossa verrattuna seerumin pitoisuuteen päivänä 46 (viimeinen arvo ennen hoitoa). Päivän 46 arvo vähennetään siis kussakin seuraavassa verikokeessa saadusta arvosta.

Tulokset 15 M. vaccae -ruiskeet vähensivät ovalbumiinilla immunisoinnin aiheuttamaa IgE-tasojen nousua. M. vaccae-hoidon aikaansaama lasku oli merkittävä jokaisena testattuna ajankohtana. Tulokset on esitetty kuviossa 1.

Samoin immunisoiduista eläimistä otetut pernasolut eivät vapauttaneet IL-5:ttä in vitro vasteena ovalbumiinille, mikäli luovuttajaeläimet oli hoidettu M. vaccaella, 20 kun sen sijaan keittosuolaliuoksella käsitellyistä immunisoiduista eläimistä otetut pernasolut vapauttivat suuria määriä IL-5:ttä vasteena ovalbumiiniin. Tulokset on esitetty kuviossa 2. lL-5:ttä ei osoitettu vertailukai voissa, joita viljeltiin ilman oval-bumiinia (tuloksia ei ole esitetty).

Johtopäätökset 25 M vaccae heikentää Th2-vastekuviota, vieläpä silloinkin, kun se annetaan: (i) jollakin voimakkaalla allergeenilla (tässä tapauksessa ovalbumiinilla) immunisoinnin jälkeen Ja (ii) ilman Th2:ta indusoivan molekyylin epitooppeja.

Tapahtuu siis epäspesifinen systeeminen Th2-vastekuvion vaimentuminen, joka ei 30 ole riippuvainen suorasta adjuvanttivaikutuksesta allergeeniin itseensä.

14

Esimerkki 2

Eri M. vaccae-valmisteiden vaikutus seerumin IgE:hen

Lisäkokeesssa, jonka tarkoituksena oli määrittää konjugoidun M. vaccae-OVA:n vaikutus seerumin IgE-titteriin, BALB/c-hiiriä immunisoitiin OVA:lla IFA:ssa kaksi 5 kertaa IgE-vasteiden herättämiseksi, sitten ne käsiteltiin kaksi kertaa keittosuolaliuoksella, muuntamattomalla M. vaccaella, konjugoidulla M. vaccae-OVA:lla tai vastaavalla ei-OVA:a sisältävällä "vale"-konjugoidulla valmisteella, NaCklla pestyllä periodaatilla käsitellyllä M. vaccaella (NaCl-Mv). Päivänä 46 OVA:lla immunisoiduilla hiirillä oli 112,9+10 (keskihajonta) ng/ml IgE:tä, verrattuna 55,4+1 10 (keskihajonta) ng:aan/ml immunisoimattomilla eläimillä (p<0,01). Kullakin hiirellä päivän 46 arvoa käytettiin tulosten normalisoimiseksi lähtöarvoon 0 (s.o. päivänä 46) ja se vähennettiin kustakin seuraavasta arvosta. Käyrällä olevat arvot ovat siten muutoksia ng/ml -arvossa suhteessa päivään 46.

Kokonaisseerumin IgE kasvoi verrokkihiirissä (keittosuolaliuoksella käsitellyissä) 15 vakaasti kokeen kestoajan (kuvio 3A-C). Kokonaisseerumin IgE tyrehtyi hiirillä, jotka käsiteltiin muuntamattomalla M. vaccaella (kuvio 3A). Sitä vastoin NaCl-pestyt periodaattikäsitellyt valmisteet eivät kyenneet estämään IgE:tä, olivatpa ne sitten konjugoidut OVA:aan (kuvio 3B) tai konjugoitumattomia (kuvio 3C), vaikkakin yksi annos verrokki-NaCl-Mv:tä esti ohimenevästi kokonaisseerumin IgE:n 20 (p<0,05) (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittivat, että NaCl-pesu tai konjugointimenet- tely kumosi kyvyn hillitä IgE-eritystä.

Sitä vastoin muuntamaton M. vaccae ja verrokkina ollut NaCl-Mv eivät kumpikaan hillinneet OVA-spesifistä IgE:tä (kuviot 4A ja 4C). Lisäksi konjugoidulla Mv-OVA:lla käsittely itse asiassa voimisti OVA-spesifistä IgE-vastetta (kuvio 4B).

25 Esimerkki 3

Eri M. vaccae-valmisteiden vaikutus pernasolujen IL-2-tuotantoon

Pernasoluja koottiin OVA:lla imuunisoiduista hiiristä päivänä 109 ja viljeltiin OVA:n kanssa in vitro. Pernasolut, jotka olivat peräisin OVA:lla herkistetyistä hiiristä, jotka saivat keittosuolahoidon, eivät onnistuneet tuottamaan IL-2:ta vasteena 30 C)VA:lle in vitro. Immunisoiduista, M vaccae -valmisteella, joka ei sisältänyt OVA-komponentteja, käsitellyistä hiiristä peräisin olevat pernasolut tuottivat osoitettavia tasoja IL-2:ta vaastena OVA:lle, mutta nousu ei ollut merkittävä. Sitä vastoin konjugoidulla OVA:a sisältävällä M. vaccae -valmisteella käsitellyistä hiiristä peräisin olevat pernasolut vapauttivat suuria määriä IL-2:ta vasteena OVA:lle (p<0,05 verrat- 15 tuna keittosuolaliuosta saaneisiin) (kuvio 5). Nämä tulokset paljastivat, että OVA:n konjugoiminen M. vaccaehen lisäsi IL-2 -tuotantoa vasteena OVA:lle.

Thl-vaste ovalbumiinille ei siis voimistu merkittävästi, jollei ovalbumiini sisälly M. vaccaehen (ole konjugoitu siihen). Lisäksi, kuten todettiin, vaikka ovalbumiinin 5 ollessa mukana Thl-vasteesta tulee erittäin merkittävä, Th2:n hillintä ei parane ja saattaa jopa huonontua (katso muut tässä esitellyt kokeet).

Esimerkki 4

Eri M. vaccae-valmisteiden vaikutus pernasolujen IL-5-tuotantoon OVA-herkistetyistä hiiristä peräisin olevat pernasolut tuottivat korkeita IL-5-tasoja 10 vasteena OVA:lle (kuvio 6). Kuitenkin solut, jotka otettiin OVA-immunisoiduista hiiristä, jotka oli käsitelty M. vaccaella, joko muuntamattomalla, NaCl-pestyllä verrokilla tai OVA-konjugoidulla, vapauttivat kaikki merkittävästi vähemmän IL-5:ttä vasteena OVA:lle. Niinpä päinvastoin kuin tuloksissa, jotka saatiin IgE:tä mitattaessa, sen enempää konjugointimenettelyllä itsellään kuin M. vaccaehen konjugoidun 15 OVA:n läsnäolollakaan ei ollut mitään vaikutusta IL-5:n vapautumisen vaimentamiseen. Jos yleensä mitään vaikutusta oli, niin allergeenin konjugointi M. vaccaehen vähensi kykyä pysäyttää IL-5:n vapautuminen, koska relevantti verrokki Mv-OVA:lle oli NaCl-Mv (valekonjugoitu).

Esimerkki 5 20 M. vaccaen eri annosten vaikutus seerumin IgE. hen eläimillä M. vaccaen eri annosten vaikutuksen kokonaisseerumin IgE:hen määrittämiseksi BALB/c-hiiriä immunisoitiin OVA:lla IFA:ssa kahdesti (päivinä 0 ja 21) IgE-vasteiden herättämiseksi. Niistä otettiin verinäytteet päivänä 32 ja sitten ne käsitel-tiin keittosuolaliuoksella tai annoksilla 10,10 tai 10 M. vaccaeta päivänä 42.

25 Päivänä 32 OVA-immunisoiduilla hiirillä oli 117,09+35,81 (keskihajonta) ng/ml IgE:tä verrattuna 69,27±6,09 (keskihajonta) ng:aan/ml immunisoimattomilla eläimillä (p<0,001). Kullakin hiirellä päivän 32 arvoa käytettiin tulosten normalisoimiseen lähtöarvoon 0 (s.o. päivä 32) ja se vähennettiin kustakin seuraavasta arvosta. Käyrän arvot ovat siis muutoksia ng:ssa/ml verrattuna päivään 32.

30 IgE-vaste oli voimistunut verrokkihiirissä (keittosuolaliuoksella käsitellyissä) edelleen päiviin 52 ja 70 mennessä, jolloin otettiin lisää näytteitä (s.o. 10 ja 28 vuorokautta päivänä 42 suoritetun käsittelyn jälkeen) (kuvio 7). Sitä vastoin IgE-tason suurentuminen tyrehtyi hiirissä, jotka hoidettiin M. vaccaella annoksin 10 , 10 tai 16 109 (kuvio 7). Kaikki p-arvot ovat pienemmät kuin 0,01 keittosuolaliuoksella käsiteltyjen ja eri M. vaccae -annoksilla käsiteltyjen hiirien välillä.

Esimerkki 6 M. vaccae -hoidon vaikutus pernasolujen sytokiinituotantoon 5 BALB/c-hiirille suoritettiin sama ohjelma, jota käytettiin esimerkissä 5. Sitten päivänä 82 niiden pernasoluja koottiin ja viljeltiin OVA:n, M. vaccaen ja ConA:n kanssa in vitro. Keittosuolaliuoksella käsitellyn ryhmän pernasolut tuottivat IL-4:ää, mutta eivät IL-2:ta, vasteena OVA:lle (kuviot 8A/B). OVA-immunisoitujen hiirien, jotka oli käsitelty annoksella 107 autoklavoitua M. vaccaeta, pernasoluissa tapahtui 10 IL-2-synteesiä ja IL-4-tuotanto väheni vasteena OVA:lle. Vasteena OVA:lle tapahtunutta 1L-2 -synteesiä todettiin myös käytettäessä pernasoluja, jotka olivat annoksilla 108 tai 109 M. vaccaeta hoidetuista hiiristä.

Huomattakoon, että IL-2:n tuotannon lisääntyminen M. vaccae -hoidetuissa hiirissä ei ollut merkittävä (keskihajonta oli suurempi kuin vasteet), koskien ainoastaan 15 muutamia ryhmän hiiristä. Useimmat käsitellyistä hiiristä eivät tuottaneet lainkaan IL-2:ta.

Esimerkki 7

Kahden M. vaccae -annoksen vaikutus seerumin IgE. hen n

Koska annoksen 10 M vaccaeta oli aikaisemmin osoitettu olevan optimaalinen 20 Thl-vasteiden herättämiseksi sen omia antigeenejä kohtaan ja koska se oli tehokkain annos pilottikokeissa (kuvio 7), tämä annos valittiin lisätutkimuksiin. BALB/e-hiiriä immunisoitiin OVA:lla kahdesti päivinä 0 ja 24 IgE-vasteiden herättämiseksi ja näytteet otettiin päivänä 46, ja sitten hiiret käsiteltiin keittosuolaliuoksella tai an- n . , noksella 10 M. vaccaeta kahdesti päivinä 53 ja 81. Päivänä 46 OVA-immum-25 soiduilla hiirillä oli 112,9+10 (keskihajonta) ng/ml IgE:tä verrattuna 55,4+1,7 (keskihajonta) ng:aan/ml immunisoimattomilla eläimillä (p<0,01). Kullakin hiirellä päivän 46 arvoa käytettiin tulosten normalisointiin lähtöarvoksi 0 (s.o. päivä 46) ja se vähennettiin kustakin seuraavasta arvosta. Käyrän arvot ovat siten muutoksia ng:ssa/ml suhteessa päivään 46.

30 Verrokkihiirissä (keittosuolaliuoksella käsitellyissä) kokonaisseerumin lgE-vaste kasvoi vakaasti kokeen kestoajan. Sitä vastoin IgE-tason suureneminen tyrehtyi hii-rissä, jotka käsiteltiin annoksella 10 autoklavoitua M. vaccaeta (kuvio 9A). M. vaccae -hoito ei kuitenkaan merkittävästi tyrehdyttänyt anti-OVA IgE:tä tässä kokeessa (kuvio 9B). Lisäkokeet kuitenkin osoittavat, että OVA-herkistetyillä BALB/c- 17 hiirillä, jotka saivat M. vaccaeta 4 kertaa, oli merkittävästi matalammat OVA-spesifiset IgE-titterit.

IgGl-ja IgG2-vasta-aineisiin OVA:a kohtaan M. vaccae -hoito ei vaikuttanut. Esimerkki 8 5 M. vaccae -hoidon vaikutus pernasolujen IFN-γ-, IL-2- ja IL-5-tuotantoon BALB/c-hiirille suoritettiin sama ohjelma, jota käytettiin esimerkissä 7. Sitten päivänä 109 niiden pernasoluja koottiin ja viljeltiin OVA:n kanssa in vitro. Keittosuo-laliuoshoitoa saaneesta ryhmästä otetut pernasolut tuottivat suuria IL-5-tasoja, mutta eivät IL-2:ta, vasteena OVA:lle. OVA-immunisoitujen hiirien, jotka oli hoidettu 10 kaksi kertaa annoksella 107 autoklavoitua M. vaccaeta, solut eivät vapauttaneet IL-5:ttä vasteena OVA:lle (kuvio 10A). Hiirien, jotka olivat saaneet 2 annosta 107 M. vaccaeta, pernasolujen IL-4-tuotanto vasteena OVA:lle osoittautui vähentyneeksi, mutta tämän sytokiinin tasot olivat liian lähellä immuunikokeen osoitusrajaa ollakseen luotettavia. Kuten edellä osoitettiin (kuvio 8A), OVA:n herättämä IL-2-15 tuotanto oli jälleen osoitettavissa supematanteissa, jotka olivat peräisin eräistä M vaccaella hoidetuista hiriistä (kuvio 10B), vaikkakin tilastollisesti merkityksettömänä. Alentunutta Th2:ta oli havaittavissa eläimissä, joissa ei esiintynyt 11-2:n lisääntynyttä vapautumista. Eri ryhmien hiirten pernasolujen OVA:n herättämässä IFN-γ-synteesissä ei ollut eroja (kuvio 10C).

20 Pohdinta BALB/c-hiiret, jotka immunisoitiin kahdesti OVA:lla IFA:ssa, kehittivät tyypillisen Th2-tyypin vasteen. Todettiin suurentuvia seerumin IgE-tasoja ja näistä hiiristä peräisin olevat pernasolut vapauttivat IL-5:ttä, mutta eivät IL-2:ta, vasteena OVA:lle in vitro. Hämmästyttävin havainto on, että tämä käynnissä oleva allergeenispesifinen 25 vaste BALB/c-hiirissä vaimentui, kun niitä hoidettiin pienellä annoksella tapettua M vaccaeta ilman että M. vaccae -valmisteessa tarvittiin OVA:a tai OVA-epi-tooppeja.

Samaten kokeemme paljastivat, että OVA:n indusoimat seerumin IgE:n suuret tasot loppuivat laajalla annosalueella M. vaccaeta. Tämä on odottamatonta, koska aikai-30 semmat annosvastetutkimuksel hiirillä tunnistivat annoksen 10 optimaaliseksi Thl-vasteen indusoimiseksi mykobakteeriantigeeneille, joita M. vaccae sisälsi, ilman osoitettavissa olevaa Th2-komponenttia, kun taas 109 herättää Thl+Th2-seka-vasteen. Kaikista näistä syistä on todennäköistä, että M. vaccaen vaikutukset tässä 18 mallissa eivät toimisikaan Thl-sytokiinien suppress!ivisten vaikutusten kautta. IgE-tasojen säätelyn seuraava taso voitaneen lukea IgE:tä sitovien tekijöiden tiliin.

Thl-vaste ovalbumiinille ei merkittävästi voimistu, jollei ovalbumiinia sisälly M. vaccaehen (tai ole konjugoitu siihen), ja kun se sisältyy siihen, Th2-hillintä ei 5 parane ja saattaa jopa huonontua, vaikka Th 1 -vaste muuttuu erittäin merkittäväksi.

Esimerkki 9

Th2- ja Thl -sytokiiniprofiilien mittaus

Sytokiiniprofiileista on jonkin verran tietoa CFS:ssä ja Persianlahden sota -oireyhtymässä, mutta nämä tiedot ovat ristiriitaisia ja niissä on käytetty menetelmiä, jot-10 ka eivät ole luotettavia, vaikka kliininen kuva kaiken kaikkiaan johtaakin ajattelemaan kasvanutta Th2/Thl -suhdetta kuten edellä kuvattiin (Straus, 1996).

Optimaalinen menetelmä tämän osoittamiseksi on virtaussytometria perifeerisen veren T-solujen, jotka erittävät spontaanisti IL-2:ta (Thl) tai IL-4:ää tai IL-5:ttä (molemmat Th2) tai jotka voidaan indusoida erittämään näitä sytokiineja in vitro 15 kalsiumionoforilla ja forbolimyristaattiasetaatilla (PMA) stimuloinnin jälkeen, tar kan lukumäärän ja prosenttiosuuksien laskemiseksi. [Sekreetio estetään itse asiassa eräällä inhibiittorilla (monensiinilla), niin että sytokiini kasaantuu soluun, josta se osoitetaan (kiinnittämisen ja permeabilisaation jälkeen) jollakin sopivalla fluo-rikromilla leimatulla monoklonaalisella vasta-aineella], 20 Tätä menetelmää käytettäessä Th2-solut ovat äärimmäisen harvinaisia normaalien luovuttajien perifeerisessä veressä, mutta ne voivat yleistyä kroonista infektiota tai syöpää sairastavien potilaiden verenkierrossa (julkaisemattomia havaintoja).

Eräs toinen menetelmä on sytokiinitasojen suora mittaaminen plasmasta tai seerumista. Interleukiini 13 (IL-13) voidaan osoittaa Th2-sytokiinien edustajana ja gam-25 ma-interferoni (IFNy) edustavana Th 1 -sytokiinina.

Persianlahden sodan veteraanien sytokiiniprofiilit tutkitaan käyttämällä jompaa kumpaa näistä menetelmistä. Thl~»Th2-muutoksen määrittäminen osoittaa M. vac-caen annon soveltuvuuden oireiden parantamiseksi.

Esimerkki 1® 30 M. vaccae -valmiste antoa varten M. vaccae kasvatetaan kiinteällä alustalla, joka sisältää muunnettua Sautonin alustaa (Boyden et ai.), joka on jähmetetty 1,3-prosenttisella agarilla. Mikro-organismit siir- 19 rostetaan alustalle ja niitä inkuboidaan aerobisesti 10 päivää 32°C:ssa, jotta mikro-organismi pääsee kasvamaan. Sitten mikro-organismit kootaan ja punnitaan ja liete-tään laimenteeseen siten, että saadaan 100 mg mikro-organismia/ml laimenneita. Sitten liete laimennetaan edelleen puskuroidulla keittosuolaliuoksella, jolloin saa-5 daan liete, joka sisältää märkäpainona 10 mg (noin 1010 solua) mikro-organismia/ml laimennetta, ja se jaetaan 5 ml moniannospulloihin. Elävän mikro-organismin sisältävät pullot autoklavoidaan sitten (115-125°C) 10 minuuttia 69 kPa:n paineessa mikro-organismien tappamiseksi. Näin valmistettu terapeuttinen aine varastoidaan 4°C:seen ennen käyttöä.

10 Esimerkki 11 M. vaccaen käyttö taudin, jolle on luonteenomaista Thl/Th2-sytokiinisiirtymä, hoidossa 0,1 ml lietettä, joka on valmistettu esimerkin 3 mukaisesti ja joka sisältää märkäpainona mitattuna 1 mg (noin 109 solua) M. vaccaeta, ravistellaan voimakkaasti ja an-15 netaan sitten välittömästi intradermaalisena ruiskeena vasemman hartialihaksen yläpuolelle.

Thl- ja Th2-sytokiinitasot voidaan mitata potilaalta aika ajoin siirtymän Thl->Th2 varmistamiseksi, erityisesti Th2-aktiivisuuden hillitsemisen varmistamiseksi, samalla kun tarkkaillaan potilaan oireiden paranemista.

20 Esimerkki 12

Kroonista väsymysoireyhtymää (CFS) sairastavien potilaiden hoito M. vaccaeta käyttämällä (1) 70-vuotias potilas, jota hoidettiin SRL172:11a hänen levyepiteelikeuhkosyöpän-sä takia ja jolla oli samanaikaisesti diagnosoitu krooninen väsymysoireyhtymä, ker-25 toi innostuneena viimeksi mainitun taudin oireiden hävinneen kahden SRL172-ruiskeen jälkeen. Hän voi paljon paremmin ja "hänen kärsimyksensä oli päättynyt". Urkujensoiton opettajana hän oli ottanut useita uusia oppilaita - mikä osoitti hänen vointinsa parantuneen. Tätä potilasta on hoidettu SRL172:11a yli vuoden ajan ja hän kertoo hyvän vointinsa jatkuvan.

30 (2) Potilas oli sairastanut CFS:ää 7-8 vuotta oirein, joihin kuuluivat väsymys, migreenikohtaukset, masennus, ruoka-aineallergioita ja imusolmuketauti. Kahden SRL172-ruiskeen jälkeen hän kertoi olonsa parantuneen. Hänen kipeä kurkkunsa ja turvonnet rauhasensa ja ruoka-aineallergiansa olivat paljon paremmassa jamassa ja 20 hän tarvitsi pienemmän annoksen tyroksiinia. Hän jutteli paljon pirteämmin ja sanoi olevansa vähemmän masentunut.

(3) Potilaan oireet esiintyivät päänsärkyinä, masennuksena ja monina ruoka-aineallergioina. Ennen SRL172-hoitoa häneen oli kokeiltu monia muita hoitomuoto-5 ja vaikutuksetta. Hänen oireitaan pyrittiin helpottamaan antamalla hänelle säännöllisesti suuria määriä Nalcronia (80 kapselia Nalcronia 100 mg ennen ja jälkeen yhden aterian päivittäin). Kun hän oli saanut SRL172:ta 2 kuukauden väliajoin, hänen CFS-oireensa samoin kuin hänen ruoka-aineallergiansa ovat parantuneet huomattavasti ja potilas uskoo voivansa oikein hyvin niin kauan kuin säännönmukaisia ruis-10 keitä jatketaan.

21

Viitejulkaisut

Aaby, P. (1995) Soc. Sei. Med. 41: 673-86.

Aaby et al, (1995) Brit. Med. J. 311: 481-5.

Abou-Zeic et al, (1997) Infect. Immun. 65: 1856-1862.

5 Bernton et al., (1995) Ann. NY Acad. Sci. 774:217-231.

Bonicke et al, (1964) Zentr albl. Bakteriol. Parasitenkd. Infection skr. Hyg. Abt. 1, Orig., 192: 133.

Boyden et al., (1955) J. Immunol. 75: 15.

Bretscher et al, (1992) Science 257: 539-542.

10 Brinkmann et al., (1995) J. Immunol. 155: 3322-8.

Brown et al, (1993) Infect. Immun. 61: 4793-4800.

Casale et al, (1993) Immunopharmacol Immunotoxicol 15: 199-215.

Corrigan et al, (1995) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 12: 567-78.

Daynes et al, (1989) Eur. J. Immunol. 19* 2319-2325.

Γ)«'/πρς pf nl (1 QQOt T Fvn Med 171'97Q-QQf>

Daynes et al, (1993) J. Immunol. 150: 5219-5230.

Daynes etal, (1995) J. Invest. Dermatol. 105: 14S-19S.

Daynes et al, (1991) Res. Immunol. 142: 40-45.

Fischer et al, (1991) Immunology 74: 228-233.

20 Fukuda et al, (1994) Ann. Int. Med. 121: 953-9.

Garg et al, (1993) Infect. Immun. 61: 2238-224!.

Glaser et al,(\ 993) Behav. Neurosci. 107: 525-9.

Guida et al, (1994) Blood 84: 2733-40, 22

Hemandez-Pando et ai, (1994) Immunology 82: 591-595.

Holsboer et ai., (1984) New Eng. J. Med. 311: 1127-.

Morales et ai, (1994) J. Clin. Endocrinol. Metab. 78: 1360-1367.

Moynihan, J. (1994) Adavances: Mind Body Health 10: 23-28.

5 Mu et ai., (1993) Infect Immun. 61: 2834-2840.

Nilsson et ai, (1996) JAMA 275: 760.

Odent et ai, (1994) JAMA 272: 592-593.

Padgett et ai, Ann. NY Acad. Sei. 774: 323-325.

Ramirez et ai, (1996) J. Immunol. 156: 2406-2412.

10 Ramiya et ai, (1996) J. Autoimmun. 9: 349-356.

Raven et ai., (1995) Clin. Endocrinol. 43: 637-644.

Raven et ai, (1996) Psychoneuroendocrinology 21: 277-286.

Rook et ai, (1996) Annu. Rev. Microbiol. 50: 259-284.

Rook et ai, (1996) Q. J. Med. 89: 333-341.

15 Rupprecht et al.,{ 1995) Psychoneuroendocrinology 20: 543-551.

Shaheen et ai, (1996) Lancet 347: 1792-6.

Skinner et ai, (1997a) Vaccines beyond 2000, July 6-9, Queensland, Australia, Abstract

Skinner et al.,{\997b) Infect. Immun., 65: 4525-4530.

20 Standford ja Paul, (1973) Ann. Soc. Beige Med. Tro. 53: 141-389.

Sharp et ai, (1991) J R. Soc. Med. 84:118-21.

Shirakawa et ai, (1996) Science In press.

Smit etal.,{\996) Transplant Proc. 28: 665-666.

23

Straus, S. (1996) NIH Publication No. 90: 3059: 1-5.

Suzuki etal., (1991) Clin. Immunol. Immunopathol. 61: 202-211.

Tobach etal, (1956) Am. J. Physiol. 187: 399-402.

Tumberg el ah, (1996) Report of a joint working group of the Royal Colleges of 5 Physicians, Psychiatrists and General Practitioners. London: Royal College of Physicians 58: vol. 1.

Wu etal, (1991) J. Clin. Invest. 87: 870-877.

Zwilling, B.S. (1992) ASM News 58: 23-25.

Claims (3)

1. Antigeenisen ja/tai immuunijärjestelmää säätelevän aineen, joka on johdettu Mycobacterium vaccaesta, käyttö lääkkeen valmistuksessa, joka lääke ei sisällä mitään ei-M vaccae -antigeeniä, -immunogeeniä tai -allergeenia ja joka on tarkoitettu 5 häiriön hoitamiseksi yksilössä, jolla on diagnosoitu immuunijärjestelmän Th2-aktii-visuuden voimistaminen, jolloin hoito hillitsee Th2-aktiivisuutta ei-M.vaccae -antigeenejä kohtaan voimistamatta henkilön immuunijärjestelmän Thl-aktiivisuutta ei -M.vaccae -antigeenejä kohtaan, ja jolloin häiriö on on krooninen väsymysoireyhtymä, Persianlahden sota -oireyhtymä, yleistynyt allergia -oireyhtymä, astma, hei-10 nänuha tai ekseema.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa antigeeninen ja/tai immuunijärjestelmää säätelevä M. vaccaesta johdettu aine käsittää tapettuja M. vaccae -soluja.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö, jossa solut on tapettu autoklavoimalla.