KR100533818B1 - 면역계의 ｔｈ2 활성의 하향 조절을 위한 마이코박테리움 박케 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이코박테리움 박케(Mycobacterium vaccae)로부터 유도된 항원성 물질 및/또는 면역원성 물질을 사용하여, Th1 활성을 상향 조절하지 않고 면역계의 Th2 활성을 하향 조절한다. 또한, 만성 피로 증후군, 걸프전 증후군 및 토탈 알러지 증후군과 같은 질환을 치료할 수 있다. 상기 물질은 바람직하게는 비-마이코박테리움 박케 항원, 면역원 또는 알러지원을 함유하지 않는 조성물 중에 마이코박테리움 박케 사세포를 포함한다.

Description

면역계의 ＴＨ2 활성의 하향 조절을 위한 마이코박테리움 박케{MYCOBACTERIUM VACCAE FOR DOWN-REGULATION OF THE TH2 ACTIVITY OF THE IMMUNE SYSTEM}

본 발명은 면역계 활성이 Th1 활성에서 Th2 활성으로 이동된 것을 특징으로 하는 질환의 치료에 관한 것이다. 본 발명은 마이코박테리움 박케(Mycobacterium vaccae) 제제가, 특히 Th1 활성의 상향 조절을 수반하지 않고 Th2 활성을 하향 조절함으로써 비특이적인 전신 Th1 편중(systemic Th1 bias)이 일어날 수 있게 한다는 놀라운 발견에 기초한 것이다. 본 발명이 적용될 수 있는 질환으로는 만성 피로 증후군(Chronic Fatigue Syndrome), 걸프전 증후군(Gulf War Syndrome) 및 토탈 알러지 증후군(Total Allergy Syndrome)을 들 수 있다.

만성 피로 증후군(CFS)(Turnberg 등) 환자는 알러지 현상 발생률이 더 높고, 알러지 피부 반응수가 정상인의 2배이며, NK 세포의 활성이 낮고, IFNγ및 IL-2 생성이 적다(Straus, 1996). 이러한 환자 중 일부는 EB 바이러스에 대한 항체 농도가 높은데, 이 역시 Th1 활성이 감소된 개체의 특징이다. 이들에서는 감정 변화와 우울증이 나타나기도 한다. 이러한 특징들은 모두 사이토카인 프로필에 있어서의 Th1에서 Th2로의 전환과 양립한다. 이러한 편중 현상은, 개체군이 충분한 Th1 유도성 자극에는 노출되지 않으면서 Th2 유도성 면역화 및 알러지원에 노출되는 경향이 있는 현대의 생활 양식의 결과로 볼 수 있다.

본 발명자들은 걸프전 증후군이 Th2 유도 자극을 확인할 수 있는 CFS의 특수한 예가 된다고 생각하는데, 왜냐하면 걸프전 참전군에게 Th2 유도 백신을 수회 접종하였기 때문이다. 백신 접종 또는 감염은 전신 효과를 나타낼 수 있고, 무관한 다른 항원에 대한 반응의 Th1/Th2 사이토카인 균형을 비특이적으로 증가 또는 감소시키며(Shaheen 등, 1996, Shirakawa 등, 1996), 무관한 질환으로부터의 생존율에 (긍정적 또는 부정적으로) 영향을 미친다(Aaby, 1996, Aaby 등, 1995). 걸프전에서 사용된 이러한 백신 접종이 전신적 Th2 전환을 유도하였다는 본 발명자들의 생각은 하기의 백신 접종 프로토콜의 4 가지 특징에 의해 지지된다.

(i) 백일해는 걸프전에서 영국군의 면역 보강제로서 사용되었고, 이의 면역 보강 활성은 Th2를 강화시킨다(Mu 및 Sewell, 1993, Ramiya 등, 1996, Smit 등, 1996).

(ii) 걸프전 참전군에게 페스트, 탄저병, 장티푸스, 파상풍 및 콜레라에 대한 Th2 유도 면역원을 접종하였다. 또한, 이러한 다량의 항원은 반응을 Th2쪽으로 유도하는 경향이 있다(Aaby, 1995, Bretscher 등, 1992, Hernandez-Pando & Rook, 1994).

(iii) 전쟁 지역에 군대를 배치한 후, 또는 그 지역으로 이동하기 바로 직전에, 스트레스 정도가 높은 시기에 백신을 접종하였다. 글루코코르티코이드(예, 코르티솔) 농도를 높여서 접종하면 반응을 Th2쪽으로 유도한다(Bernton 등, 1995, Brinkmann & Kristofic, 1995, Ramirez 등, 1996).

(iv) 참전군은 카바메이트 및 유기인 살충제에도 노출되었는데, 이들 살충제는 정상적인 Th1 기능에 필수적인 IL-2 유도 현상을 억제한다(Casale 등, 1993). 이 성분의 중요성은 확실하지 않다. 그러나, 살충제는 걸프전에서 그 지역의 공급원으로부터 입수하는 일이 종종 있었기 때문에 순도가 불명확하며, 심지어 살충제에 독성 오염물이 함유되어 있을지도 모른다고 보고되었다.

따라서, 이러한 환경에서 투여된 수회의 백신 접종은 장기간 지속되는 전신 사이토카인 불균형을 초래할 수 있었다. 백신 접종 또는 기타의 Th2 유도 환경적 자극 및 감염에 의해 일반 집단에서도 동일한 효과가 산발적으로 발생할 수 있으며, 이것을 만성 피로 증후군의 발병이 만연된 원인으로 볼 수 있다.

이러한 점들은 아래에서 더 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 (사멸된) 마이코박테리움 박케 제제가 전신적 Th1 →Th2 편중을 비특이적 방식으로 교정할 수 있다는 놀라운 관찰 결과를 얻었다. 이 효과는 주사된 마이코박테리움 박케 제제 내에 존재하지 않는 항원에 대한 면역 반응을 포함하는 방식으로 면역계 활성이 Th2에 편중되는 것으로부터 벗어나게 하는 것이다.

상기 효과는 동물 모델과 인간 둘 다에서 실험적으로 입증된 바 있다. 대표적인 실험은 아래에 상세히 기술한다. 특히, 이들 실험에서는 놀라울 정도로 Th2 활성의 하향 조절이 확인되었으며, 이는 Th1 활성의 상향 조절과는 연관되지 않을 수 있다.

요약하면, 실험 동물에서 마이코박테리움 박케의 투여시 Th2 활성으로의 편중으로부터 벗어난 비특이적인 전신적 편중은, Th2 반응을 나타내도록 예비 면역화된 마우스에서 난알부민(마이코박테리움 박케 자체와는 무관한 알러지원)에 대한 IL-4(Th2) 의존 항체 반응의 역가 감소로서 관찰될 수 있다. 마이코박테리움 박케의 1회 주사로 이러한 효과를 유발할 수 있으며, 추가 주사로 이를 강화시킬 수 있다. 이 효과는 주사된 제제 내에 어떠한 난알부민 성분의 함유도 요하지 않기 때문에 비특이적이다.

인간의 경우(암 환자) 이 효과는 포볼 미리스테이트 아세테이트 및 칼슘 이오노포어로 자극한 후 IL-4(특징적인 Th2 사이토카인)를 분비하는 T 세포가 감소된 것과, 말초 혈액 중에 자발적으로 IL-2(특징적인 Th1 사이토카인)를 분비하는 림프구가 나타난 것으로 입증되었다. 이러한 활성화된 Th1 표현형을 나타내는 림프구의 비율(%)은 마이코박테리움 박케를 연속적으로 매회 주사한 후에 점차적으로 증가하며, 10⁹의 마이코박테리움 박케를 3∼5회(0일, 15일, 30일, 이 후에는 매월) 주사한 후에는 다수의 개체에서 안정 상태에 도달한다.

또한, 만성 피로 증후군을 앓고 있는 인간 피험체에게 마이코박테리움 박케 제제를 투여하여 얻은 이로운 효과에 관한 보고서들을 아래에 기재하였다.

본 발명자들은 마이코박테리움 박케가 결핵(GB-A-2156673), 암(ZA 95/2644), HIV(WO 94/06466) 및 만성 염증(GB-B-2252044)의 치료에 유용함을 이미 밝힌 바 있다. WO 92/08488(역시 본 발명자들의 출원)은 소정의 항원과 함께 투여하기 위한 면역 보강제로서의 마이코박테리움 박케의 용도를 개시하고 있으며, 이에 의해 항원에 대한 반응의 T 세포 성분이 Th2 패턴에서 Th1 패턴으로 전환됨을 언급하고 있다. 그러나, WO 92/08488에는 마이코박테리움 박케가 면역계의 활성에서 비특이적인 Th2/Th1 이동, 즉 마이코박테리움 박케와 함께 투여된 항원에 대해 특이적으로 유발된 반응 이외의 반응에서는 어떠한 이동도 유발할 수 있다는 제시는 없다. 또한, WO 92/08488뿐 아니라 다른 어떠한 문헌에도 Th1 활성의 상향 조절을 수반하지 않고 Th2 활성을 하향 조절할 수 있다는 암시는 없다.

Th1 면역 보강제로서 마이코박테리움 박케를 검토한 문헌으로는 Abou-Zeid 등(1997), Skinner 등(1997a) 및 Skinner 등(1997b)의 문헌이 있다. Th2 세포 증식에 대한 억제 효과를 갖는 Th1 사이토카인의 상향 조절을 검토한 Mosmann 및 Sad의 문헌(1996)도 참조할 수 있다.

이하에서는 본 발명을 실험적 실시예 및 하기 도면을 참조로 하여 예시하며, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니다.

도 1은 난알부민으로 1차 면역화한 후 46일째 값에 대해 계산한, 여러 시점(일)에서의 마우스의 총 혈청 IgE(ng/㎖ ±표준 편차)의 변화를 보여준다. ○는 마이코박테리움 박케를 접종한 것에 대한 것이며, □는 염수 대조군에 대한 것이다. 편의를 위해, 난알부민으로 면역화하고 마이코박테리움 박케 또는 염수를 투여한 날이 표시되어 있다.

도 2는 난알부민을 투여한 마우스로부터 취한 비장 세포로부터 시험관내 방출된 IL-5의 측정값(pg/㎖ ±표준 편차)을 보여준다. 사용된 분석에 의해 검출된 최소 농도는 15.6 pg/㎖이었다.

도 3은 OVA로 미리 면역화한 BALB/c 마우스에서 10⁷의 마이코박테리움 박케 제제(○)와 염수(●)의 피하 주사 처리가 총 혈청 IgE(ng/㎖)에 미치는 효과를 비교한 도면이다. (도 3A) 10⁷의 비변형 마이코박테리움 박케(Mv), (도 3B) OVA에 접합된 마이코박테리움 박케(Mv-OVA) 또는 (도 3C) NaCl 세척 및 페리오데이트 처리된 대조군 마이코박테리움 박케(NaCl-Mv). 데이터는 46일째에 취한 샘플로부터 얻은 판독값에 대한 변화율 ±표준 편차로서 표시되어 있다. 면역화 및 처리 계획은 도면에 제시되어 있다(OVA: IFA 중 OVA 50 ㎍으로 면역화).

도 4는 OVA로 미리 면역화한 BALB/c 마우스에서 10⁷의 마이코박테리움 박케 제제(○)와 염수(●)의 피하 주사 처리가 OVA 특이적 IgE에 미치는 효과를 비교한 도면이다. (도 4A) 비변형 마이코박테리움 박케(Mv)(O.D. 405 nm), (도 4B) OVA에 접합된 마이코박테리움 박케(Mv-OVA)(O.D. 405 nm) 또는 (도 4C) NaCl 세척 및 페리오데이트 처리된 대조군 마이코박테리움 박케(NaCl-Mv)(ng/㎖). 데이터는 46일째에 취한 샘플로부터 얻은 판독값에 대한 변화율 ±표준 편차로서 표시되어 있다. 면역화 및 처리 계획은 도면에 제시되어 있다.

도 5는 OVA와 함께 배양된 비장 세포에 의한 IL-2의 생성을 도시한다. 비장은 0일 및 24일에 OVA로 면역화하고, 53일 및 81일에 염수, 10⁷의 비변형 마이코박테리움 박케(Mv), OVA에 접합된 마이코박테리움 박케(Mv-OVA) 또는 해당 대조군인 NaCl 세척 및 페리오데이트 처리된 마이코박테리움 박케(NaCl-Mv)로 처리한 마우스로부터 109일째에 얻었다. IL-2 평가를 위해 24 시간 후에 배양 상청액을 수거하였다. 데이터는 사이토카인의 평균 농도 ±표준 편차(pg/㎖)로 제시되어 있다.

도 6은 OVA와 함께 배양된 비장 세포에 의한 IL-5의 생성을 도시한다. 비장은 0일 및 24일에 OVA로 면역화하고, 53일 및 81일에 염수, 10⁷의 비변형 마이코박테리움 박케(Mv), OVA에 접합된 마이코박테리움 박케(Mv-OVA) 또는 해당 대조군인 NaCl 세척 및 페리오데이트 처리된 마이코박테리움 박케(NaCl-Mv)로 처리한 마우스로부터 109일째에 얻었다. IL-5 평가를 위해 48 시간 후에 배양 상청액을 수거하였다. 데이터는 IL-5의 평균 농도 ±표준 편차(pg/㎖)로 제시되어 있다.

도 7은 OVA로 미리 면역화한 BALB/c 마우스의 혈청 IgE 농도에 대한 상이한 용량의 마이코박테리움 박케의 단일 피하 주사 처리의 효과를 염수 처리시 효과와 비교한 도면이다. 혈청 IgE는 마이코박테리움 박케 또는 염수로 처리하기 전 32일째에 취한 샘플을 이용하여 얻은 판독값에 대한 상대적인 변화량(ng/㎖)(평균 ±SE)으로서 표시되어 있다. 처리 후 52일 및 70일(즉, 염수 또는 마이코박테리움 박케로 42일째에 처리한 지 10일 및 28일 후)에 혈청 샘플을 수거하였다. 면역화 및 처리 계획은 실험 방법에 제시되어 있다. 서로 다른 군 사이의 비교는 만-휘트니 U(Mann-Whitney U) 검정으로 수행하였다.

도 8은 OVA를 이용하여 비장 세포에 의한 IL-2(도 8A) 및 IL-4(도 8B)의 생성을 도시한다. BALB/c 마우스에 OVA를 2회 투여한 후 상이한 용량, 즉 10⁷, 10⁸ 또는 10⁹(pg/㎖)의 마이코박테리움 박케를 처리하였다. 비장 세포를 수거하여 82일째 OVA와 함께 배양한다. 면역화 및 처리 계획은 실험 방법에 제시되어 있다. 배양 상청액은 IL-4 평가를 위해서는 48 시간 후에, IL-2 평가를 위해서는 24 시간 후에 수거하였다. 데이터는 사이토카인의 평균 농도 ±표준 편차로서 제시되어 있다. 서로 다른 군 사이의 비교는 스튜던트 t(Student's t) 검정으로 수행하였다. (염수: 염수 처리 전에 OVA로 2회 면역화; 10＾7 Nv: 10⁷의 마이코박테리움 박케 처리 전에 OVA로 2회 면역화).

도 9는 10⁷의 마이코박테리움 박케(○)와 염수(●)의 2회 피하 주사(53일 및 81일) 처리가 총 혈청 IgE(도 9A) 및 OVA 특이적 IgE(도 9B)에 미치는 효과를 비교한 도면이다. 면역화 및 처리 계획은 도면에 제시되어 있다. 혈청 IgE는 46일째 취한 샘플을 사용하여 얻은 판독값에 대한 변화량 ±표준 편차(ng/㎖)로서 표시되어 있다. 서로 다른 군 사이의 비교는 만-휘트니 U-검정으로 수행하였다. (OVA: 난알부민 면역화; Mv: 마이코박테리움 박케 면역화).

도 10은 OVA(pg/㎖)와 함께 배양된 비장 세포에 의한 IL-5(도 10A), IL-2(도 10B) 및 IFN-γ(도 10C)의 생성을 도시한다. 비장 세포를 수거하고 109일째 OVA와 함께 배양하였다. 면역화 및 처리 계획은 도 9에 제시되어 있다. 배양 상청액은 IL-5 평가를 위해서는 48 시간 후에, IFN-γ및 IL-2 평가를 위해서는 24 시간 후에 수거하였다. 데이터는 사이토카인의 평균 농도 ±표준 편차로서 제시되어 있다. 서로 다른 군 사이의 비교는 스튜던트 t 검정으로 수행하였다. (염수: 염수로 2회 처리 전에 OVA로 2회 면역화; 10⁷ Mv: 10⁷의 마이코박테리움 박케로 2회 처리 전에 OVA로 2회 면역화).

상기한 모든 문헌은 본 명세서에서 참고 문헌으로 포함한다.

본 발명은 일반적으로, 특히 면역계 활성이 Th1 활성에서 Th2 활성으로 이동된 것을 특징으로 하는 질환의 치료시, 더욱 구체적으로 Th2 활성의 하향 조절이 Th1 활성의 상향 조절을 수반하지 않는 것이 유리한 경우, Th1 활성의 상향 조절 없이 개체의 면역계에서 Th2 활성을 하향 조절하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 제1 양태는 마이코박테리움 박케의 면역 조절성 물질 및/또는 항원성 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하여 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제2 양태는 개체의 치료용 약제의 제조시 마이코박테리움 박케의 면역 조절성 물질 및/또는 항원성 물질의 용도를 제공한다.

본 발명의 제3 양태는 개체의 치료에 사용하기 위한 물질 또는 조성물을 제공하는데, 상기 물질 또는 조성물은 마이코박테리움 박케의 항원성 물질 및/또는 면역 조절성 물질을 포함한다.

마이코박테리움 박케 제제는 외인성("외래") 항원, 면역원 또는 알러지원이 포함되지 않은 상태로 제공되는 것이 좋다.

치료하고자 하는 질환은 환자의 면역계가 Th1 활성에서 Th2 활성으로 전반적이고 비특이적으로 편중된 것을 특징으로 할 수 있다. 이들 질환의 진단 또는 평가는 개체 내에서 IL-2 생성 감소나 IL-4 또는 IL-5 생성 증가를 기준으로, 또는 대표적인 Th2 사이토카인인 IL-13과 대표적인 Th1 사이토카인인 인터페론 감마(IFNγ)의 검출에 의해 실시할 수 있다. 다른 Th1/Th2 사이토카인도 질환의 진단/평가에 고려될 수 있다. 면역계의 Th1 활성에서 Th2 활성으로의 비특이적 이동은 개체가 특정 항원에 노출되는 것 또는 특정 병원체에 의한 감염에 의해 유발된 것이 아닐 수도 있다. 치료하고자 하는 개체는 결핵 또는 기타 마이코박테리아에 감염된 환자가 아닐 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 특정 질환으로는 만성 피로 증후군, 걸프전 증후군 및 토탈 알러지 증후군(Straus, 1996)을 들 수 있다. Th1을 상향 조절하지 않고 Th2 활성을 하향 조절하는 것이 이로운 그 밖의 질환도 본 발명에 따라 치료할 수 있다.

만성 피로 증후군은, 예를 들어 이른바 1994 CDC 기준(Fukuda 등) 또는 이른바 옥스포드 기준(Sharpe 등)을 이용하여 조직적으로 규정할 수 있다. 만성 피로 증후군에 대해서 현재 알려진 지식은 Turnberg 등의 문헌(1996년 10월 출판)에 요약 및 고찰되어 있다.

마이코박테리움 박케 물질은 마이코박테리움 박케의 사세포이거나 또는 이를 함유할 수 있다. 이러한 세포는, 예를 들어 방사선 조사(예, 2.5 메가래드의 선량에서 ⁶⁰Co로부터)에 의해, 화학적으로 또는 임의의 기타 수단에 의해 사멸시킬 수 있으나, 오토클레이브 처리(예, 115∼125℃에서 69 kPa로 10분간)가 바람직하다. 오토클레이브 처리는 방사선 조사보다 더욱 효과적인 제제를 생성할 수 있다.

사멸 전에, 마이코박테리움 박케 세포를 적절한 고체 배지에서 증식시킬 수 있다. 아가, 바람직하게는 1.3% 아가로 고화시킨 변형된 사우톤 액체 배지가 좋다(Boyden 등). 일반적으로 32℃에서 10일간의 호기성 배양 후에, 유기체를 수거하여 칭량하고 희석제에 현탁시켜 투여할 준비를 한다. 필요에 따라 사용 전에 4℃에 저장할 수 있다.

고체 배지에서 세포를 증식시키는 대신에, 변형 사우톤 배지(Boyden 등)와 같은 액체 배지를, 예를 들어 발효기 내에서 사용할 수 있다.

희석제는 발열원이 없는 비완충 염수일 수 있다. 희석제는 붕산염 완충 희석제, 바람직하게는 Tween 80(등록상표)과 같은 계면활성제를 함유하는 것이 좋다. 적절한 붕산염 완충액은 Na₂B₄O₇10H₂O 3.63 g , H₃BO₃ 5.25 g, NaCl 6.19 g, Tween 80(등록상표) 0.0005%를 포함하고 증류수로 1 리터를 채워 만든 것이다. 이들 희석제는 약학적으로 허용되는 것이다.

전술한 인간 실험 결과는 GMP 제제인 SRL172로서 마이코박테리움 박케를 투여하여 얻었으며, 상기 제제는 일부 연구진에 의해, 영국 의약품 관리국(Medicines Control Agency)의 CTX, 미연방 의약국의 IND(임상시험용 신약)로 인간 투여용으로 사용될 수 있다. Huntingdon 연구진에 의해 GLP 급성 독성 연구가 수행되었다. 1기 및 2기 안전성 데이터는 미국에서 입수하였으며, FDA에 제출하였다. SRL172는 결핵의 면역 치료를 위해 3기에서 시도한다. SRL172는 본 발명에 사용하기에 바람직할 수 있다.

SRL172는 부다페스트 조약 하에 1984년 2월 13일에 영국 런던 NW9 5HT 콜린데일 애비뉴 소재의 국립 모식균 배양 수집소(National Collection of Type Cultures; NCTC) 중앙 공중 보건 실험실에 NCTC 11659로 기탁된 R877R 균주로부터 유래된 마이코박테리움 박케 제제이다. R877R은 본래 중앙 우간다의 랑고 지역에서 채취한 진흙 샘플로부터 분리된 것이다(Stanford 및 Paul).

SRL172 대신에 다른 마이코박테리움 박케 균주를 사용할 수 있다. 생화학적 및 항원성 기준에 의해 마이코박테리움 박케에 속하는 유기체를 동정할 수도 있다(Bonicke 등).

본 발명에서는, 마이코박테리움 박케 물질을 비-마이코박테리움 박케 항원성 물질 또는 면역 조절성 물질이 없거나 거의 없는 상태로 투여하는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 투여할 약제 또는 조성물은 마이코박테리움 박케 항원성 물질 및/또는 면역 조절성 물질, 예를 들어 사세포, 이의 추출물이나 유도체를 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하거나, 이를 주성분으로 할 수 있다.

"치료적 유효량"으로 투여되는 것이 바람직하며, 치료적 유효량이란 환자에게 이로움을 주기에 충분한 양을 말한다. 이로움을 제공한다는 것은 1 가지 이상의 증상을 최소한 호전시킬 수 있다는 것을 의미한다. 실제 투여량과 투여 속도 및 투여 과정은 치료하고자 하는 증상의 성질 및 경중에 따라 달라진다. 치료 처방, 예를 들어 투여량 결정 등은 일반 개업의 또는 기타 의사에 의해 이루어진다.

1회 투여량(사세포 투여의 경우)은 일반적으로 10⁷∼10¹⁰의 사멸된 마이코박테리움 박케 미생물을 함유한다. 환자에게 10⁸∼10⁹의 사멸된 마이코박테리움 박케의 1회 투여량을 투여할 수 있지만, 예를 들어 2주 내지 6개월 간격으로 필요에 따라 투여를 반복할 수 있다.

조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께, 치료하고자 하는 증상에 따라 동시에 또는 연속 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물과 본 발명에 따른 용도에 사용하기 위한 약학 조성물은 활성 성분 이외에 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충액, 안정제 또는 당 분야에 공지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 저해해서는 안된다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 따라 달라지며, 주사, 예를 들어 피내, 피하 또는 진피내로 주사하는 것이 좋다.

주사의 경우, 활성 성분은 발열원이 없고, 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적 허용 수용액의 형태로 존재한다. 약학적으로 허용되고 바람직한 적절한 희석제에 대해서는 전술하였다.

경구 투여가 이용될 수 있으며, 이 경우 약학 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체의 형태일 수 있다. 정제는 면역 보강제 또는 젤라틴과 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 액체 약학 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어 물, 석유, 동물유, 식물유, 광유, 또는 합성유를 포함한다. 생리적 염수 용액, 덱스트로스 또는 기타 당류 용액이나 글리콜, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수 있다.

마이코박테리움 박케는, 예를 들어 기도의 특정 부분으로 이동할 수 있는 크기의 입자를 포함하는 적절한 제형을 사용하여 기도에 에어로졸로 투여될 수 있다. 이는 수성 현탁액보다는 건조 분말일 수 있다.

사세포 대신에, 마이코박테리움 박케로부터 유도된 물질, 특히 필수 활성이 있는 추출물이나 합성 분자를 사용할 수 있다.

앞서 간단히 설명한 바와 같이, 걸프전 퇴역 군인의 경우 수 회의 백신 접종, 스트레스 및 기타 인자에 의해 장기간 지속되는 전신 사이토카인 불균형이 일어날 수 있었다. 백신 접종 또는 Th2를 유도하는 기타의 환경적 자극 및 감염에 의해 일반 집단에게도 동일한 효과가 산발적으로 나타날 수 있으며, 이것을 만성 피로 증후군의 발병이 만연된 원인으로 볼 수 있다.

유효 면역원은 무관한 항원에 대한 면역 반응의 성질에 대해 전신의 장기간 지속되는 비특이적 효과를 나타낼 수 있다. 예를 들어 홍역 감염은 아토피 및 집먼지 진드기에 대한 알러지 반응 발병율을 감소시킨다(Shaheen 등, 1996). 유사하게, 투베르쿨린 피부 테스트에서 양성인 일본 어린이들은 음성인 어린이보다 아토피가 덜 나타나며, 순환하는 Th1/Th2 사이토카인의 비율이 더 높다. 더우기, BCG를 반복 주사한 후에 투베르쿨린 전환이 발생한 어린이는 아토피 증상이 소실될 가능성이 증가된다(Shirakawa 등, 1996).

또 다른 예로는 홍역 백신 접종이 있다. 이 백신은 표준 용량으로 사용될 때 백신 비접종 집단에서의 홍역 발생률에 의해 설명될 수 있는 것보다 훨씬 더 많이 사망률을 감소시켰다. 디프테리아, 파상풍 및 백일해 백신(Th2 유도성)은 이러한 비특이적인 보호 효과를 나타내지 않는다(Aaby 등, 1995). 그러나, 고 역가 홍역 백신이 사용된 경우, 홍역 자체로부터의 보호능은 유지되었지만 사망률은 증가하였다(Aaby 등, 1995, Aaby 등, 1995). 이러한 사망률 증가에 Th2쪽으로의 전환이 수반되었다는 증거가 있으며, Th2 성분의 유도에 있어서 용량과 관련된 증가는 몇몇 기타 면역원에 대해서 잘 정립되어 있다(Bretscher 등, 1992, Hernandez-Pando & Rook, 1994). 걸프전에서 사용된 백신은 Th2 유도성이었고(페스트, 탄저병, 장티푸스, 파상풍, 콜레라), 항원성이면서 Th2를 촉진하는 다량의 물질이 축적되어 있었다. 더구나, 이러한 경향은 면역 보강제로서 백일해를 사용하면 증가되는데, 그 이유는 백일해가 Th2의 강력한 유도 물질이기 때문이다(Mu 및 Sewell, 1993, Ramiya 등, 1996, Smit 등, 1996). 이러한 백일해의 특성으로 인해 이를 소아에게 사용하는 것이 현대에 만연된 아토피 증가의 원인이 될 수 있다는 논의가 최근에 있었다(Nilsson 등, 1996, Odent 등, 1994).

이들 백신이 전신적 Th2 반응을 유도하는 고유한 경향은, 걸프전 참전군이 백신 접종 시기에 받게 되는 스트레스에 대한 2차적인 내분비 인자에 의해 크게 증가된다.

일부 스테로이드 호르몬은 T 세포 반응을 조절한다. 데히드로에피안드로스테론(DHEA) 또는 DHEA의 미지의 대사물질은 Th1 패턴을 촉진시키는 경향이 있다. 따라서, DHEA는 고령 쥐에서 면역 기능을 회복시킬 수 있고, 고령의 동물에서 관찰되는 사이토카인 방출 조절 이상을 교정할 수 있다(Daynes 등, 1993, Garg 및 Bondada, 1993). 노인을 대상으로 유사한 특성에 대해 테스트하였다(Morales 등, 1994). 이는 IL-2 및 IFNγ와 같은 Th1 사이토카인의 생성을 증가시킨다(Daynes 및 Araneo, 1989, Daynes 등, 1990, Daynes 등, 1995, Daynes 등, 1991). DHEA는 또한 인간의 말초 혈액 T 세포로부터 IL-2 분비를 증가시킨다(Suzuki 등, 1991).

DHEA의 이러한 효과는 Th2 활성을 증가시키고 Th2 사이토카인과 상승 작용을 하는 코르티솔과 같은 글루코코르티코이드의 효과와는 반대된다(Fischer 및 Konig, 1991, Guida 등, 1994, Padgett 등, 1995, Wu 등, 1991). "미성숙(naive)" T 림프구의 증식이 비특이적 자극(Brinkmann 및 Kristofic, 1995) 또는 항원(백신 접종에 따른)에 의해 유도되는 경우, Th2 사이토카인 프로필을 가지는 T 림프구가 발달한다. 이는 정상적인 환경 하에서 기억 세포가 거의 없는 "깨끗한(clean)" 실험실 설치류로부터 얻은 비장 세포에서 어느 정도 확실하게 관찰되었다(Ramirez 등 1996).

전반적으로 "핵심"은 코르티솔이 미성숙 세포로부터 Th2 사이토카인 프로필의 발달을 촉진한다는 것이다(Brinkmann 및 Kristofic, 1995). 이 핵심을 기존의 Th2 세포의 사이토카인 분비 활성은 코르티솔에 의해 쉽게 억제된다는 사실과 혼동하여서는 안된다. 따라서, Th2 매개 질환, 예를 들어 습진, 천식 및 고초열에 대한 종래의 치료법에 사용되는 코르티솔 유사체를 사용하면 소염 효과를 통해 Th2 세포에 의한 사이토카인 생성을 감소시킬 수 있지만(Corrigan 등, 1995), 동시에 코르티솔의 사용은 새롭게 보충된 T 세포가 Th2를 지향하도록 유도하여 근원적인 문제가 계속 남게 된다.

생리적 및 물리적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신 축을 활성화시키고, 이로써 코르티솔의 생성 증가를 비롯한 각종 변화를 유발한다. 과도한 운동과 섭식 및 수면 부족은 코르티솔에 대한 DHEA의 비율(DHEA/코르티솔의 비)을 감소시킨다. 이는 지연형 과민증(DTH) 반응성(Th1 마커)의 저하와 직접적인 관련이 있으며, 혈청 IgE 농도가 동시에 상승되었다. IgE는 전적으로 Th2 사이토카인 생성에 의존한다(Bernton 등, 1995). 이는 전술한 DHEA 및 코르티솔의 공지된 효과적 측면에서 예상할 수 있는 일이다.

스트레스로 인한 Th1 →Th2 전환 효과의 또 다른 예로는 학생이 시험에 대해 스트레스로 반응하여 EB 바이러스에 대한 항체를 증가시키는 것을 들 수 있다. EB 바이러스는 일반적으로 Th1 반응 및 세포독성 T 세포에 의해 제어되고, 제어 상실은 바이러스 복제 및 항체 증가를 초래한다(Zwilling, 1992). 유사하게, 의대생들의 경우 시험 기간 동안 말초 혈액 백혈구에서 Th1 사이토카인인 IFNγ의 mRNA가 낮게 나타났다(Glaser 등, 1993).

이와 유사한 현상은 동물에서 더욱 제어된 방식으로 입증될 수 있다. 혼잡 또는 감금으로 인한 스트레스는 결핵 마우스에서 마이코박테리아의 증식을 증가시킬 수 있다(Brown 등, 1993, Tobach 및 Bloch, 1956). 이는 소량의 Th2 성분의 존재에 대해서도 매우 민감한 모델이다(Rook 및 Hernandez-Pando, 1996). 기타 예가 문헌(Moynihan, 1994)에 논의되어 있다.

우울증은 뇌의 과도한 코르티솔 매개 효과와 관련이 있을 수 있으며(Raven 등의 문헌(1996)에 논의), 스트레스가 우울증을 유발할 수 있다는 증거가 상당수 존재한다. 따라서, 우울증(CFS 및 GWS에서 나타나는 바와 같이)은 Th2 매개 질환, 예를 들어 천식, 습진과 연관되는 경향이 있으며, 일부 내분비 변화는 Th2 질환 및 우울증에 있어서 공통되는 현상이다(Holsboer 등, 1984, Rupprecht 등, 1995).

결핵에서는 전신적 Th2 이동이 나타나며(Rook 및 Hernandez-Pando, 1996), 비정상적인 패턴의 아드레날 스테로이드의 대사물질이 뇨로 분비된다(Rook 등, 1996). 따라서 코르티손의 대사물질에 비해 코르티솔의 대사물질이 증가된다. 결핵을 치료하면 Th1 우세를 회복하고 스테로이드 대사물질의 패턴이 보정되어 코르티손의 대사물질이 코르티솔의 대사물질에 비하여 증가된다(Rook 등 1996). 메티라폰 약물로 우울증을 치료하면 스테로이드 대사물질에 동일한 변화가 나타난다(예, 코르티솔의 대사물질에 비해 코르티손의 대사물질 증가)(Raven 등, 1995). 마이코박테리움 박케 제제 SRL172는 결핵의 면역 치료에 효과적이다.

전술한 바와 같이, 백신 접종은 Th1/Th2 균형의 전신 비특이적인 변화뿐 아니라 일반적으로 요구되는 항원 특이적 면역화를 유도할 수 있다. CFS의 치료는 건강한 정상 개체의 특성인 Th2에 대한 Th1의 우세를 회복할 수 있도록 전신 비특이적 Th1 편중의 유도를 필요로 할 수 있다. 이는 걸프전 군인에게 접종한 백신에 의해 유도될 수 있었던 편중과는 반대되는 것이다.

하기의 실험적 증거는 마이코박테리움 박케 제제가 걸프전 퇴역 군인에게서 관찰될 수 있는 유해한 Th1 →Th2 편중을 감소시킬 수 있다는 놀라운 결과를 입증한다.

실시예 1

실험 동물에 대한 마이코박테리움 박케 투여 및 이로 인한 면역계 Th2 활성의 비특이적인 감소 입증

6∼8 주령 Balb/c 마우스를 0일 및 24일째 오일(불완전 프로인트 보조제)에 유화시킨 난알부민 50 ㎍으로 면역화하였다. 이는 강력한 Th2 패턴 반응을 유발하는 것으로 알려져 있으며, IgE 생성을 수반하고, 2 가지 Th2 사이토카인, 즉 IL-4 및 IL-5 방출에 대해 초회 항원 자극을 제공한다.

그 후 마우스에게 염수 또는 10⁷의 오토클레이브 처리한 마이코박테리움 박케를 53일 및 81일째 피하 주사로 투여하였다.

혈청 샘플은 46일(즉, 염수 또는 마이코박테리움 박케 처리 전)과 67일, 91일 및 109일째 취하였다.

이어서, 시험관내 배양기에서 난알부민 항원 투여를 위해 비장 세포를 수거하였다. ELISA에 의한 사이토카인 분석을 위해 48 시간째 배양 상청액을 수거하였다.

파밍엔으로부터 입수한 한 쌍의 항체를 사용하여 포집 분석을 실시하였다.

IL-5 #18051D 포집; #18062D(비오틴화) 검출. 검출 항체의 결합은 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 접합체(다코 P0397)로 밝혔으며, 색소원은 ABTS(시그마 A-1888)였다.

IgE #02111D 포집; #02122D(비오틴화) 검출. 검출 항체의 결합은 아비딘-알칼라인 포스파타제 접합체(시그마 E-2636)로 밝혔으며, 색소원은 pNPP(시그마 N-2770)였다.

IgE 농도의 결과는 46일째의 혈청 농도(처리전 최종 값)와 비교한 변화량(ng/㎖)으로서 표시된다. 따라서 매 후속 채혈시의 값에서 46일째의 값을 감한다.

결과

마이코박테리움 박케를 주사하면 난알부민으로 면역화하여 유발되는 IgE 농도 상승이 감소되었다. 마이코박테리움 박케로 처리하여 유발되는 감소는 시험한 모든 시점에서 유의적인 수준이었다. 결과는 도 1에 나타나 있다.

유사하게, 면역화된 동물로부터 얻은 비장 세포는 공여 동물이 마이코박테리움 박케로 처리되는 경우 난알부민에 반응하여 시험관내에서 IL-5를 방출하지 못했지만, 염수로 처리한 면역화된 동물로부터 얻은 비장 세포는 난알부민에 반응하여 IL-5를 다량 방출하였다. 그 결과는 도 2에 제시되어 있다. IL-5는 난알부민 없이 배양된 대조군 웰에서는 검출되지 않았다(도시되지 않음).

결론

마이코박테리움 박케는

(i) 유효 알러지원(이 경우 난알부민)으로 면역화한 후,

(ii) Th2 유도성 분자의 에피토프 없이 투여되는 경우에도 Th2 패턴의 반응을 감소시킨다.

따라서, Th2 패턴 반응은 알러지원 자체에 대한 직접적인 면역 보강 효과에 좌우되지 않고 비특이적으로 전신 하향 조절된다.

실시예 2

상이한 마이코박테리움 박케 제제가 혈청 IgE에 미치는 효과

혈청 IgE 역가에 대한 접합된 마이코박테리움 박케-OVA의 효과를 측정하기 위한 후속 실험에서는 BALB/c 마우스를 IFA 중 OVA로 2회 면역화하여 IgE 반응을 유도한 후, 염수, 비변형 마이코박테리움 박케, 접합된 마이코박테리움 박케-OVA 또는 해당 비-OVA 함유 "모의(mock)"-접합 제제, NaCl 세척 및 페리오데이트 처리된 마이코박테리움 박케(NaCl-Mv)로 2회 처리하였다. 46일째에 OVA로 면역화된 마우스의 IgE는 112.9 ±10(S.E.) ng/㎖였으며, 이와 비교하여 비면역화 동물의 IgE는 55.4 ±1.7(S.E.) ng/㎖였다(p<0.01). 각 마우스에 대해 46일째 값을 출발(즉, 46일) 값 0으로 하여 데이터를 표준화하여, 이후의 각 값에서 이를 감하였다. 따라서, 작도한 값은 46일째 값에 대한 변화량(ng/㎖)이다.

대조군 마우스(염수 처리)의 총 혈청 IgE는 실험 기간 동안 지속적으로 증가하였다(도 3A∼3C). 비변형 마이코박테리움 박케로 처리된 마우스에서는 총 IgE가 억제되었다(도 3A). 이와는 대조적으로, NaCl 세척 및 페리오데이트 처리 제제는 OVA에 접합되었는지(도 3B) 또는 접합되지 않았는지(도 3C) 여부와 관계 없이 IgE 억제 효과를 나타내지 않았지만, 대조군 NaCl-Mv의 1회 투여는 총 혈청 IgE의 일시적인 억제를 나타내었다(p<0.05)(도 3C). 이들 결과는 IgE를 하향 조절하는 능력이 NaCl 세척 또는 접합 과정에 의해 제거되었음을 시사한다.

대조적으로, 비변형 마이코박테리움 박케와 대조군 NaCl-Mv는 모두 OVA 특이적 IgE를 하향 조절하지 못하였다(도 4A 및 도 4C). 더구나, OVA 특이적 IgE 반응은 접합된 Mv-OVA로 처리하면 사실상 증가하였다(도 4B).

실시예 3

상이한 마이코박테리움 박케 제제가 비장 세포에 의한 IL-2 생성에 미치는 효과

OVA로 면역화된 마우스로부터 비장 세포를 109일째 수거하고 시험관내에서 OVA와 함께 배양하였다. 염수 처리된 OVA 감작된 마우스로부터 얻은 비장 세포는 시험관내에서 OVA에 반응하여 IL-2를 생성하지 못하였다. OVA 성분 비함유 마이코박테리움 박케 제제로 처리된 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 세포는 OVA에 반응하여 검출 가능한 수준의 IL-2를 생성하였으나, 그 증가는 유의적인 수준은 아니었다. 대조적으로, 접합된 OVA 함유 마이코박테리움 박케 제제로 처리된 마우스로부터 얻은 비장 세포는 OVA에 반응하여 다량의 IL-2를 방출하였다(염수 수용체에 비하여 p < 0.05)(도 5). 상기 결과는 마이코박테리움 박케에 OVA를 접합시킨 것이 OVA에 반응하여 IL-2의 생성을 증가시켰음을 보여주었다.

따라서, 마이코박테리움 박케를 함유하지 않는다면(마이코박테리움 박케에 접합되지 않는다면) 난알부민에 대한 Th1 반응의 증가는 유의적인 수준이 아니다. 게다가, 전술한 바와 같이 난알부민이 함유된 경우 Th1 반응은 매우 유의적인 수준이 되지만, Th2 억제는 개선되지 않으며 감소될 수도 있다(본원의 기타 실험 참조).

실시예 4

상이한 마이코박테리움 박케 제제가 비장 세포의 의한 IL-5 생성에 미치는 효과

OVA 감작된 마우스로부터 얻은 비장 세포는 OVA에 반응하여 다량의 IL-5를 생성하였다(도 6). 그러나, 비변형 마이코박테리움 박케, NaCl 세척된 대조군 또는 OVA 접합된 마이코박테리움 박케로 처리된 OVA 면역화된 마우스로부터 얻은 세포는, 모두 OVA에 반응하여 IL-5를 상당히 적게 방출하였다. 따라서, IgE가 측정될 때 관찰되는 결과와는 대조적으로, 접합 과정 자체와 마이코박테리움 박케에 접합된 OVA의 존재는 모두 IL-5 방출의 하향 조절에 영향을 주지 않았다. 오히려, Mv-OVA에 대한 관련 대조군은 NaCl-Mv(모의 접합)였으므로 IL-5를 감소시키는 능력은 마이코박테리움 박케에 알러지원을 접합시킨 것에 의해 감소되었다.

실시예 5

상이한 용량의 마이코박테리움 박케가 동물의 혈청 IgE에 미치는 효과

상이한 용량의 마이코박테리움 박케가 총 혈청 IgE에 미치는 효과를 측정하기 위해서, BALB/c 마우스를 IFA 중 OVA로 2회 면역화하여(0일 및 21일) IgE 반응을 유도하였다. 32일째 채혈하였고, 그 후 42일째 10⁷, 10⁸ 또는 10⁹의 마이코박테리움 박케 또는 염수로 처리하였다.

32일째 OVA로 면역화된 마우스의 IgE는 117.09 ±35.81(S.D.) ng/㎖였으며, 이와 비교하여 비면역화 동물의 IgE는 69.27 ±6.09(S.D.) ng/㎖였다(p<0.001). 각 마우스에 대해 32일째의 값을 출발(즉, 32일) 값 0으로 하여 데이터를 표준화하고, 이후의 각 값에서 이를 감하였다. 따라서, 작도한 값은 32일째 값에 대한 변화량(ng/㎖)이다.

대조군 마우스(염수 처리)에서 IgE 반응은 추가 샘플을 취한 52일 및 70일(즉, 42일째 처리한 지 10일 및 28일 후)에 더 증가되었다(도 7). 대조적으로, IgE 수준의 증가는 10⁷, 10⁸ 또는 10⁹의 마이코박테리움 박케로 처리한 마우스에서 억제되었다(도 7). 모든 p 값은 염수로 처리한 마우스와 상이한 용량의 마이코박테리움 박케로 처리한 마우스 사이에서 0.01 미만이다.

실시예 6

마이코박테리움 박케가 비장 세포에 의한 사이토카인 생성에 미치는 효과

BALB/c 마우스에게 실시예 5에서 사용된 것과 동일한 프로토콜을 적용하였다. 그 후 82일째 비장 세포를 수거하고, OVA, 마이코박테리움 박케 및 ConA와 함께 시험관내에서 배양하였다. 염수 처리 군에서 얻은 비장 세포는 OVA에 반응하여 IL-4를 생성하나 IL-2는 생성하지 않았다(도 8A/B). 오토클레이브 처리된 10⁷의 마이코박테리움 박케로 처리된 OVA로 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 세포는 OVA에 반응하여 IL-2를 합성하였으며, IL-4 생성은 감소시켰다. 10⁸ 또는 10⁹의 마이코박테리움 박케로 처리된 마우스 유래의 비장 세포를 사용한 경우에도 OVA에 반응하는 IL-2 합성이 관찰되었다.

마이코박테리움 박케 처리된 마우스에서 IL-2 생성 증가는 유의적인 수준은 아니며(표준 편차가 반응보다 크다), 단지 이 군의 일부 마우스에서만 나타난다는 것에 주목해야 한다. 처리된 마우스의 대부분은 IL-2를 전혀 생성하지 않았다.

실시예 7

2 가지 용량의 마이코박테리움 박케가 혈청 IgE에 미치는 효과

10⁷의 마이코박테리움 박케는 자체 항원에 대해 Th1 반응을 유발하기 위한 최적 용량인 것으로 이미 제시되어 있고, 예비 실험에서 가장 효과적인 용량이었기 때문에(도 7), 추가 연구를 위해 이 용량을 선택하였다. BALB/c 마우스는 0일 및 24일에 OVA로 2회 면역화하여 IgE 반응을 유도하고 46일째 채혈하였고, 그 후 53일 및 81일째에 염수로 처리하거나 또는 10⁷의 마이코박테리움 박케로 2회 처리하였다. 46일째 OVA로 면역화된 마우스의 IgE는 112.9 ±10(S.E.) ng/㎖였으며, 이와 비교하여 비면역화 동물의 IgE는 55.4 ±1.7(S.E.) ng/㎖였다(p<0.01). 각 마우스에 대해 46일째의 값을 출발(즉, 46일) 값 0으로 하여 데이터를 표준화하고, 이후의 각 값에서 이를 감하였다. 따라서, 작도한 값은 46일째 값에 대한 변화량(ng/㎖)이다.

대조군 마우스(염수 처리)의 총 혈청 IgE 반응은 실험 기간 동안 지속적으로 증가하였다. 이와는 대조적으로, 오토클레이브 처리한 10⁷의 마이코박테리움 박케로 처리된 마우스에서 IgE 증가는 억제되었다(도 9A). 반면, 마이코박테리움 박케의 처리에 의한 항-OVA IgE의 억제는 이 분석에서는 유의적인 수준은 아니었다(도 9B). 그러나, 후속 실험 결과 마이코박테리움 박케를 4회 투여받은 OVA 감작된 BALB/c 마우스는 상당히 낮은 OVA 특이적 IgE 역가를 나타낸다는 것이 확인되었다.

OVA에 대한 IgG1 및 IgG2a 항체는 마이코박테리움 박케 처리에 의해 영향을 받지 않았다.

실시예 8

마이코박테리움 박케 처리가 비장에 의한 IFV-γ, IL-2 및 IL-5 생성에 미치는 효과

BALB/c 마우스에게 실시예 7에서 사용된 것과 동일한 프로토콜을 적용하였다. 그 후 109일째 비장 세포를 수거하고 시험관내에서 OVA와 함께 배양하였다. 염수 처리된 군에서 얻은 비장 세포는 OVA에 반응하여 다량의 IL-5를 생성하였으나, IL-2는 생성하지 않았다. 그러나, 오토클레이브 처리한 10⁷의 마이코박테리움 박케로 2회 처리된 OVA 면역화된 마우스로부터 얻은 세포는 OVA에 반응하는 IL-5를 방출하지 못하였다(도 10A). 10⁷ 용량의 마이코박테리움 박케를 2회 투여받은 마우스 유래의 비장 세포에 의한 OVA에 반응하는 IL-4 생성은 감소된 것으로 보이지만, 이러한 사이토카인의 수준은 신뢰할 수 있는 면역 분석법의 검출 한계에 너무 근접하여 있었다. 전술한 바와 같이(도 8A), OVA에 의해 유도된 IL-2 생성은 마이코박테리움 박케로 처리된 일부 마우스의 비장 세포 유래의 상청액에서도 검출되었지만(도 10B), 통계학적으로 유의적인 수준은 아니었다. IL-2의 증가를 나타내지 않은 동물에서는 Th2 감소가 관찰되었다. 상이한 군으로부터의 비장 세포에 의한 OVA에 의해 유도된 IFN-γ합성에는 차이가 없었다(도 10C).

고찰

IFA 중 OVA로 2회 면역화된 BALB/c 마우스는 전형적인 Th2 유형 반응을 발달시켰다. 혈청 IgE의 농도가 상승하였고, 이들 마우스로부터 얻은 비장 세포는 시험관내에서 OVA에 반응하여 IL-5를 방출하였으나 IL-2는 방출하지 못하였다. 가장 놀라운 발견은 BALB/c 마우스에서 진행중인 알러지원 특이적 반응이 마이코박테리움 박케 제제 중의 OVA 또는 OVA 에피토프를 요하지 않고 저용량의 사멸 마이코박테리움 박케 처리에 의해 하향 조절되었다는 것이다.

유사하게, OVA에 의해 유도된 다량의 혈청 IgE는 광범위한 용량의 마이코박테리움 박케에 의해 억제된다는 것이 실험 결과 밝혀졌다. 이는 예상하지 못했던 것이다. 왜냐하면 마우스에서의 이전의 용량 반응 연구에서는, Th2 성분이 검출되지 않게 하면서 마이코박테리움 박케 내에 함유된 마이코박테리아 항원에 대한 Th1 반응을 유도하기 위한 최적의 농도가 10⁷인 것으로 확인되었고, 반면 10⁹의 농도는 Th1+Th2 혼합형 반응을 유발하였기 때문이다. 이러한 모든 이유로, 이 모델에서 마이코박테리움 박케의 효과는 Th1 사이토카인의 억제 효과를 통해 작용하지 않는 것 같다. IgE 농도의 추가 조절은 IgE 결합 인자의 유도가 그 원인일 수 있다.

난알부민이 마이코박테리움 박케를 함유하지 않는다면(또는 마이코박테리움 박케에 접합되어 있지 않는다면) 난알부민에 대한 Th1 반응 증가는 유의적인 수준이 되지 못하며, 이를 함유한 경우 Th1 반응은 상당히 유의적으로 되지만 Th2 억제는 개선되지 않으며, 감소될 수도 있다.

실시예 9

Th2 및 Th1 사이토카인 프로필의 측정

CFS 및 걸프전 증후군의 사이토카인 프로필에 대한 몇 가지 데이터가 있긴 하지만, 이들은 서로 모순되며 용법이 믿을 만하지 못하다. 다만 전반적인 임상적 특징은 전술한 바와 같이 Th2/Th1 비의 증가를 제시한다(Straus, 1996).

이를 입증하기 위한 최적 기법은 IL-2(Th1) 또는 IL-4나 IL-5(둘 다 Th2)를 자발적으로 분비하거나, 칼슘 이오노포어 및 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)로 시험관내 자극 후에 이들 사이토카인을 분비하도록 유도될 수 있는 말초 혈액으로부터 얻은 T 세포의 비율(%) 및 정확한 수를 계산하는 유세포 계측법이다. (분비는 실제로 억제제(모넨신)에 의해 차단되어 사이토카인은 세포 내에 축적되며, 적절한 플루오로크롬 표지된 모노클로날 항체에 의해 검출된다(고정 및 투과화시킨 후)).

이 기법을 이용하면, Th2 세포가 정상적인 공여자의 말초 혈액에서는 극히 희박하지만, 만성 감염 또는 암 환자의 순환계에는 흔한 것으로 관찰된다(비공개 관찰 결과).

제2 기법은 혈장 또는 혈청 중 사이토카인 농도를 직접 측정하는 것이다. 인터루킨 13(IL-13)은 대표적인 Th2 사이토카인으로서, 인터페론 감마(IFNγ)는 대표적인 Th1 사이토카인으로서 검출될 수 있다.

걸프전 퇴역 군인들의 사이토카인 프로필은 상기한 기법 중 하나로 조사한다. Th1→Th2의 편중 측정 결과는 증상 호전을 위해 마이코박테리움 박케 투여를 적용할지 여부의 지표가 된다.

실시예 10

투여용 마이코박테리움 박케 제제

마이코박테리움 박케를 1.3% 아가로 고화시킨 변형 사우톤 배지(Boyden 등)를 포함하는 고체 배지에서 증식시킨다. 배지에 미생물을 접종하고, 32℃에서 10일 동안 호기성 배양하여 미생물을 증식시킨다. 그 후 미생물을 수거하고 칭량한 후 희석제 1 ㎖당 미생물 100 ㎎이 되도록 희석제에 현탁시킨다. 그 후 현탁액을 완충 염수로 추가 희석하여 희석제 1 ㎖당 10 ㎎(습윤 중량)의 미생물(약 10¹⁰ 세포)을 함유하는 현탁액을 만들고, 5 ㎖의 다용량 바이알 내로 분배한다. 그 후 생미생물을 함유하는 바이알을 69 kPa에서 10분 동안 오토클레이브 처리(115∼125℃)하여 미생물을 사멸시킨다. 이렇게 제조된 치료제를 사용 전까지 4℃에 보관한다.

실시예 11

Th1/Th2 사이토카인 이동이 특징인 질환의 치료에 있어서의 마이코박테리움 박케의 용도

마이코박테리움 박케 1 ㎎(습윤 중량)(약 10⁹ 세포)을 함유하는, 실시예 3에서 제조된 현탁액 0.1 ㎖를 세게 진탕한 직후에 좌측 삼각근에 피내 주사로 투여한다.

환자의 Th1 및 Th2 사이토카인 농도를 주기적으로 측정하여 환자의 증상 호전을 관찰하면서 Th2에서 Th1로의 이동, 특히 Th2 활성의 하향 조절을 확인할 수 있다.

실시예 12

마이코박테리움 박케를 사용한 만성 피로 증후군 환자의 치료

(1) 편평 세포 폐암에 대해 SRL-172로 치료 중이고 만성 피로 증후군 진단을 동시에 받은 70세 환자는 SRL-172 2회 주사한 후에 만성 피로 증후군 증상이 개선되었다고 흥분하여 보고하였다. 이 환자는 증상이 한결 개선되었으며, "고통이 없어졌다"고 느끼게 되었다. 오르간 선생님인 이 환자는 몇몇 학생을 더 가르칠 수 있게 되었는데, 이는 이 환자의 증상이 개선되었음을 의미한다. 이 환자는 1년 이상 SRL172로 치료하였고, 계속 호전되고 있는 것으로 보고되고 있다.

(2) 한 환자는 7∼8년의 CFS 병력이 있는 환자로 전신위화, 편두통, 우울증, 음식물 알러지 및 림프종을 비롯한 증상이 있었다. 이 환자에게 SRL172을 2회 주사한 후 이 환자는 증상이 개선된 것으로 보고하였다. 인후통 및 선(腺) 부종 및 음식물 알러지가 훨씬 개선되어, 소량의 티록신만이 필요하게 되었다. 사람들은 이 환자가 더 긍정적인 방식으로 말하며, 덜 우울해한다고 하였다.

(3) 환자의 증상은 두통, 우울증 및 다수의 음식물 알러지였다. SRL172로 치료하기 전에 여러 가지 다른 형태의 치료를 시도하였으나 효과가 없었다. 이 환자의 증상을 억제하기 위한 시도로서 다량의 날크론(Nalcron)을 규칙적으로 복용하게 하였다(매일 매 식사 전후에 100 ㎎ 용량의 80 캡슐 복용). 이 환자에게 2달 간격으로 SRL172를 주사한 이래로, CFS 및 음식물 알러지 증상이 상당히 개선되었으며, 이 환자는 규칙적으로 계속 주사를 맞는 한 매우 좋아질 것이라고 믿고 있다.

참조 문헌

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Claims (21)

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4. 면역계의 Th2 활성이 상향 조절된 것으로 진단된 개체에서 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 마이코박테리움 박케(Mycobacterium vaccae)로부터 유도된 항원성 또는 면역 조절성 물질을 포함하며 어떠한 비-마이코박테리움 박케 항원, 면역원 또는 알러지원도 포함하지 않는 조성물로서,

   상기 치료는 비-마이코박테리움 박케 항원에 대하여 개체 면역계의 Th1 활성을 상향 조절하지 않으면서 비-마이코박테리움 박케 항원에 대하여 Th2 활성을 하향 조절하며,

   상기 질환은 만성 피로 증후군, 걸프전 증후군, 토탈 알러지 증후군(Total Allergy Syndrome), 천식, 고초열 또는 습진인 조성물.
5. 제4항에 있어서, 마이코박테리움 박케로부터 유도된 항원성 또는 면역 조절성 물질은 마이코박테리움 박케의 사세포를 포함하는 것인 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 오토클레이브 처리에 의해 사멸시킨 것인 조성물.
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