KR101275227B1 - 중증근무력증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B세포 매개 면역질환인 중증근무력증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 미생물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 조절 수지상 세포(regulatory dedritic cell)를 생성시키고, 아세틸콜린수용체-반응성 림프구 증식을 억제하며, 혈중 항-아세틸콜린수용체 면역글로불린 G(IgG) 및/또는 염증성 사이토카인 레벨을 감소시킴으로써 B세포 매개 면역질환인 중증근무력증을 치료한다.
본 발명의 조성물은 인체에 무해한 미생물 균주를 이용하기 때문에, 안전한 의약 또는 식품을 제공할 수 있다.

Description

중증근무력증 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing, Improving or Treating Myasthenia Gravis}

본 발명은 중증근무력증 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 프로바이오틱(probiotics)를 유효성분으로 포함하는 중증근무력증 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

프로바이오틱(Probiotic)이란 숙주에 유익한 효능을 제공하는 살아있는 미생물로 정의된다(Schrezenmeir and de Vrese, 2001). 상기 미생물은 잠재적인 병원균과 경쟁하고 박테리오신(bacteriocin)으로 알려진 항생물질을 생산함으로써 숙주의 건강을 개선시킬 수 있다(Itoh et al., 1995). 또한 프로바이오틱의 건강 증진 효과는 면역 반응 조절과 관계된다. 예컨대, 장내에서 병원균에 대항하는 분비 IgA는 프로바이오틱 처리 중에 증가된다(Perdigon et al., 1995). 최근 다수의 연구에 의하면 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 몇몇 프로바이오틱 균주들이 류마티스 관절염 및 염증성 장질환과 같은 Th1 매개 염증 및 자가면역 질환 및 아토피성 피부염과 같은 Th2 매개 자가면역 질환에 치료효과를 가짐이 입증되었다(Isolauri et al., 2000; Isolauri et al., 2002; Kalliomaki et al., 2001; Kim et al., 2007; So et al., 2008; Viljanen et al., 2005a). 프로바이오틱 단일 균주 또는 여러종의 프로바이오틱 혼합물은 염증성 질병에 있어서 면역 시스템의 항상성을 유지하는데에 효과적이다(Kuhbacher et al., 2006; Mimura et al., 2004).

중증근무력증(Myasthenia gravis, MG)은 신경근접합부(NMJ) 내 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AChR)에 특이적인 자가항체에 의해 야기되는 B세포 매개 면역 질환으로서 AChR에의 항체 결합은 NMJ 부전을 야기한다. 병리학적 기전을 밝히기 위하여 MG 및 그의 동물모델, 즉 실험자가면역 중증근무력증(EAMG)에 대한 연구가 널리 이루어졌다. MG 환자로부터 유래한 혈장 또는 EMAG로부터 유래한 항-AChR 항체는 이를 설치류에 이전시켰을 때 MG 증상을 일으켰다(Toyka et al., 1975). 항-AChR 항체의 제거는 MG 증상의 심각성을 감소시켰다(Newsom-Davis et al., 1978; Pinching and Peters, 1976). 중증근무력증(MG)는 T세포 의존적이며, B세포에 의해 매개되는 면역 질환이다. MG 환자는 다량의 항-AChR 항체 특이적 T 헬퍼 세포를 갖는데, 이는 주로 혈액 내에서 다수의 AChR 에피토프를 인식하는 IL-2, INF-γ 및 TNF-α와 같은 호-염증성 사이토카인을 생산하며, MG는 또한 B세포에 의해 매개되는 것으로 알려졌다(Conti-Fine et al., 2006; Hohlfeld et al., 1984; Pachner, 1987). 또한 최근 다른 연구 그룹은 Th17 세포 및 그들의 사이토카인이 EAMG의 발병에 관계한다고 보고하였다(Mu et al., 2009; Wang et al., 2007).

중증근무력증의 예방법은 아직 알려지지 않았으며 치료법으로는 약물치료가 가장 일반적이고 종류로는 아세틸콜린 분해억제약물(메스티논, 네오스티그민), 부신피질 호르몬약물(프레드니손), 면역억제약물(이뮤란, 싸이톡산, 싸이클로스포린) 등이 있다. 그 외에 증상부위에 바로 하는 외과적 수술(흉선부위를 제거흉선절제술)과 혈장분리반출법(채혈한 혈액에서 혈장을 분리하고 세포성분은 구연산을 가한 식염수나 적당한 용액에 섞어 재주입하는 방법; Plasmapheresis) 등이 있다. 지금까지 MG 발병원인에 대한 다수의 사실이 밝혀졌음에도 불구하고 아직까지 부작용을 수반하지 않으면서 MG를 효과적으로 치료할 수 있는 적절한 요법은 아직 개발되지 않은 상태이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 중증근무력증과 같은 B세포 매개 근육성 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 프로바이오틱을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 특정의 혼합균주가 조절 수지상 세포(regulatory dedritic cell) 생성 기전을 통해 아세틸콜린수용체-반응성 림프구 증식을 억제하고, 혈중 항-아세틸콜린수용체 면역글로불린 G(IgG) 및 염증성 사이토카인 레벨을 감소시켜 B세포 매개 면역 질환인 중증근무력증에 대한 우수한 치료 효능을 발휘함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 특정 프로바이오틱을 유효성분으로 포함하는 중증근무력증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)을 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 중증근무력증을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)을 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 중증근무력증을 예방 또는 개선하기 위한 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)을 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 중증근무력증을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

프로바이오틱의 섭취는 주로 Th1 세포에 의해 매개되는 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병 및 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)과 같은 자가면역 질병을 조절할 수 있으며, 또한 Th2형 사이토카인이 중대한 발병적 역할을 하는 아토피성 피부염을 완화시켰다(Calcinaro et al., 2005; Kato et al., 1998; Maassen et al., 1998; So et al., 2008; Viljanen et al., 2005a; Viljanen et al., 2005b). 그러나 지금까지 T세포 의존적 B세포 매개 면역 질환인 중증근무력증(MG) 또는 EAMG에 대한 프로바이오틱의 효능은 보고된 바 없었다.

IRT5 프로바이오틱이 상기 Th1 또는 Th2 세포 매개 자가면역 질병들에 대한 예방적 효능을 보였다 하더라도, 그것이 또한 B세포 매개 면역 질환인 중증근무력증(MG) 또는 진행중인 EAMG에 보호적 효능을 행사하는지 여부에 대해서는 쉽게 예측할 수 없었으며 추가적인 시험이 필요하였다.

본 발명자들은 실험을 통하여 개선된 중증 근무력증 임상 기록 및 NMJ에서 보체가 관찰되지 않음을 확인하여 프로바이오틱 처리가 EAMG에 대하여 보호적 효능을 가짐을 증명하였다. 프로바이오틱의 구강 투여는 항-AChR IgG 및 그의 서브-이소타입, 호-염증성 사이토카인 및 AChR-반응성 림프구 증식을 감소시켜 EAMG 발전을 억제할 수 있다. 또한 본 발명자들은 이와 같은 EAMG 발전에 대한 IRT5의 보호적 효능은 근무력증 림프구를 억제하는 면역관용성 수지상 세포의 발생에 의해 획득된다는 사실 또한 추가적으로 알아내었다.

본 발명에서, 조절 수지상 세포(regulatory dedritic cell)를 생성시키고, 아세틸콜린수용체-반응성 림프구 증식을 억제하며, 혈중 항-아세틸콜린수용체 면역글로불린 G(IgG) 및/또는 염증성 사이토카인 레벨을 감소시키는 본 발명의 혼합균주는 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 비피도박테리움( Bifidobacterium)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 스트렙토코커스 써머필러스( Streptococcus thermophilus , ST), 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri , LR), 비피도박테리움 비피듐( Bifidobacterium bifidium, BB), 락토바실러스 아시도필루스(lactobacillus acidophilus, LA) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, LC)을 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 중증근무력증의 예방 또는 개선용 조성물은 식품조성물로 제조될 수 있다.

또한 본 발명의 중증근무력증의 예방 또는 개선용 조성물은 기능성 식품조성물로 제조될 수 있는데, 여기에서 기능성 식품조성물이란 식품의약품안전청에서 개별인정을 통하여 약리 효과가 인정되는 식품 조성물을 의미한다.

본 발명의 식품조성물 또는 기능성 식품조성물은 본 발명의 유효성분인 특정 혼합균주를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품조성물 또는 기능성 식품조성물은 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 과립, 정제, 캡슐 또는 드링크제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 또한, 보존이나 취급을 용이하게 하기 위하여 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 통상 제제화에 사용되는 캐리어, 그 밖의 임의의 조제를 부가하여도 좋다. 또한, 식품에 통상적으로 첨가되는 보조적인 원료 또는 첨가물로는 특히 제한되지 않으나, 예컨대, 포도당, 과당, 자당, 말토오스, 솔비톨, 스테비오사이드, 롭소사이드, 콘시럽, 유당, 구연산, 주석산, 사과산, 호박산, 유산, L-아스코르빈산, d1-α-토코페롤, 엘리솔빈산 나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 글리세린지방산 에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 자당지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, 아라비아껌, 칼라기난, 카제인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B류, 니코틴산 아미드, 팬트텐산 칼슘, 아미노산류, 칼슘염류, 색소, 향료, 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 식품조성물 또는 기능성 식품조성물에 있어 상기 혼합균주의 첨가량은, 식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위로 첨가될 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 과립, 정제 또는 캡슐형태의 식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량%, 바람직하게는 5 내지 100 중량%의 범위에서 첨가될 수 있다.

본 발명의 중증근무력증을 예방 또는 개선하기 위한 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 상기 성분들 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-2000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 중증근무력증을 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “중증근무력증”은 근육의 힘이 비정상적으로 약해지거나 피로해지는 질환을 말한다. 중증근무력증은 B세포 매개성 자가면역질환으로서, 통증이 없는 것이 특징이고, 같은 근육을 계속 수축시키면 정상인보다 훨씬 빨리 근력이 약해지며, 휴식을 취하면 회복되는 증상이 특징적이다.

중증근무력증은 예컨대, 안근형 중증근무력증, 구형 중증근무력증, 전신형 중증근무력증, 신생아 일과성형 중증근무력증, 선천성 지속성 중증근무력증 및 가족성 영아형 중증근무력증 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 “안근형 중증근무력증”이란 임상증상이 안근육에만 국한되어 나타나는 것을 말하며, 눈꺼풀이 자꾸 내려오고 올리기 힘들어진다. 안근형 중증근무력증의 임상증상으로 안구운동장애가 생기면 물체가 두개로 보이는 복시현상이 나타난다. 또한 안검하수가 나타나기도 하는데 이는 보통 한쪽에 오는 경우가 많지만 양쪽으로도 온다. 고도의 안검하수로 인하여 동공이 절반 이상 가려져 있는 경우에는 시력 저하를 일으킨다.

용어 “구형 중증근무력증”이란 구근(bulbar)에 임상증상이 나타나는 것을 말하며, 말을 할 때 발음이 이상하고 음식을 삼키기가 어렵고 가래를 뱉기 어려워진다. 일반적으로 전신형의 증상과 함께 나타난다.

용어 “전신형 중증근무력증”이란 증상이 사지근, 호흡근, 연하근 등을 포함한 전신에 나타나는 것을 말한다. 전신의 골격근이 침범되어 근력 저하가 나타난다. 첫 증상으로는 쉽게 피로해지며 가벼운 근력 저하가 나타난다. 증상이 가벼운 경우에는 계단을 오르거나, 장시간 걷거나, 달리거나, 글씨를 쓴다든가 한 후 쉽게 피로를 느낀다. 증상이 계속되면 근위축도 볼 수 있다. 늑간 근육에 장애를 받으면 호흡 마비를 일으키는데 이를 근무력성 위기(crisis)라고 한다.

용어 “신생아 일과성형 중증근무력증(NEONATAL transient form)”이란 중증 근무력증을 가진 어머니에서 태어난 신생아에서 어머니의 태반을 통해 전달된 항 Ach R 항체에 의하여 발생하는 근무력증을 말하며, 대부분은 일과성이다. 어머니가 중증 근무력증인 경우 발병률은 12%정도다. 증상은 근긴장 저하, 포유력 감소, 약한 울음소리와 호흡 장애 등이다.

용어 “선천성 지속형 근무력증(congenital persistent form)”이란 중증 근무력증이 없는 어머니로부터 출생하였지만 신생아기부터 발병하는 것을 말하며, 증상은 안 증상뿐만 아니라 전신형의 증상이 있으며. 항 ChE제에는 잘 반응하지 않으며 후유증이 남는 경우가 많다.

용어 “가족성 영아형 중증근무력증”이란 중증 근무력증이 없는 어머니로부터 출생하였지만 형제 중에 발생이 있는 경우를 말하고, 출생 시부터 호흡 억제를 볼 수 있고 생후 2년간은 근력 저하와 무호흡(apnea)이 출현하는 경우 돌연사를 일으키는 것을 그 특징으로 한다.

본 발명의 특정 프로바이오틱 혼합균주를 포함하는 조성물은 조절 수지상 세포(regulatory dedritic cell)를 생성시키고, 아세틸콜린수용체-반응성 림프구 증식을 억제하며, 혈중 항-아세틸콜린수용체 면역글로불린 G(IgG) 및/또는 염증성 사이토카인 레벨을 감소시키는 기전으로 T세포 의존적 B세포 매개 자가면역질환인 근무력증을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 조성물은 미생물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱로서, B세포 매개 면역질환인 중증근무력증을 치료하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 조절 수지상 세포(regulatory dedritic cell)를 생성시키고, 아세틸콜린수용체-반응성 림프구 증식을 억제하며, 혈중 항-아세틸콜린수용체 면역글로불린 G(IgG) 및/또는 염증성 사이토카인 레벨을 감소시킴으로써 B세포 매개 면역질환인 중증근무력증을 치료한다.

(ⅲ) 본 발명의 조성물은 인체에 무해한 미생물 균주를 이용하기 때문에, 안전한 의약 또는 식품을 제공할 수 있다.

도 1. IRT5 구강투여는 EAMG에 대한 보호효과가 있다.
래트를 토페도 AChR로 면역시키기 전부터 실험 종료(EAMG 유도 후 6주)까지 IRT5 및 PBS(대조군)을 투여하였다. (A) IRT5 및 PBS 처리군은 주당 5회씩 구강투여하고 격일로 관찰하였다. (B) 평균 임상 기록을 표준 임상 기록 척도에 따라 평가하였다. 점 및 막대는 각각 평균 및 표준편차를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험을 대표한다. * p < 0.05
(C) 각 군의 보체축척 및 체중 변화(표 2)를 분석하였다. IRT5 및 PBS 처리군의 NMJ에서 AChR 및 보체 존재를 평가하기 위하여 10-15 근육 박편을 분석하였다(AChR: 적색 형광, 보체 C3c: 청색 형광). 표시한 결과는 하나의 대표적인 박편이다. 나이브 루이스 래트는 오직 AChR으로만 염색되었고 C3c에 대해서는 음성을 나타내었다.
도 2. IRT5 투여는 AChR-반응성 림프구 증식을 억제한다.
(A) 혼합된 림프구 및 (B) 배수 림프절 CD4⁺ T세포를 단독 또는 TAChR 존재 하 배양하였다. 혼합된 림프구 및 CD4⁺ T세포의 증식은 72시간의 배양기간 중 마지막 18시간 동안 [³H]-티미딘 혼입을 분석하여 세포의 증식 상태를 평가하여 결정하였다. 상기 결과는 CPM으로 표시된다. *p < 0.05
도 3. IRT5 처리는 호-염증성 사이토카인 발현을 하향조절한다.
배양 전 및 배양기간 동안 IRT5으로 처리된 dLN으로 부터의 혼합된 (A) 림프구 및 (B) CD4⁺ T세포를 토페도 AChR 존재 하 40시간 동안 배양하고, 총 mRNA를 분리하였다. 사이토카인 mRNA 발현 수준은 실시간 PCR를 사용하여 측정하였고, 그 결과는 PBS 처리군과 비교한 프로바이오틱 처리군의 상대값으로 나타내었다. mRNA 발현은 L-32으로 평준화하였다. 특이적인 프라이머 세트는 표 1에 표시하였다. 데이터 값은 세 개의 독립적 실험을 대표한다. *p < 0.05, **p < 0.01
도 4. IRT5 프로바이오틱은 AChR 특이적 IgG 이소타입을 하향조절한다.
EAMG 래트에 IRT5의 구강 투여는 IgG, IgG1, IgG2a 및 2b를 포함하는 모든 IgG 이소타입을 하향 조절하였다. 항-Ha1-205 IgG 이소타입 레벨은 실험재료 및 방법 내 기술된 바와 같이 ELISA로 측정하였다. *p < 0.05, **p < 0.01
도 5. IRT5에 의해 생성된 면역관용 DC는 EAMG CD4+ T세포를 억제하고 조절 T세포를 증가시킨다.
IRT5 및 PBS 처리 군으로부터 분리한 MLN DC의 면역조절 성질을 평가하였다. (A) MLN DC로 처리된 IRT5은 면역관용분자를 생성시켜 면역관용적 성질을 나타내었다. (B) IRT5 처리에 의한 면역관용 DC는 7일간 공동-배양시 EAMG CD4⁺ T세포 증식을 억제하였다. (C) IRT5 처리군 DC와 CD4⁺ T세포의 공동-배양 후 EAMG CD4⁺ T세포의 호-염증성 사이토카인은 감소되었다. (D) CD4⁺ Foxp3⁺ T세포는 IRT5 처리군 DC와 EAMG CD4⁺ T세포의 공동-배양 후 2배 증가하였다. 데이터 값은 세 개 독립적 실험을 대표한다. *p < 0.05

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

실험동물

6-8주 연령의 자성 루이스 래트(160g-180g)(중앙실험동물)를 취득하고 GIST(Gwang-Ju institute of science and technology) 동물관리센터에서 보존하였다. 본 발명의 모든 연구는 동물관리기관의 지침에 따라 수행하였다.

EAMG 유도 및 임상적 평가

종전 문헌(Yi et al., 2008)에 기술된 바에 따라 친화성 크로마토그래피로 캘리포니아 전기메기(Torpedo)의 전기 기관(Aquatic Research Consultant)으로부터 토페도 아세틸콜린 수용체를 취득하고, 이것으로 자성 루이스 래트를 면역시켜 EAMG를 유도하였다. 간단히 말해, CFA(complete Freund’s Adjuvant, Difco)에 유화시킨 정제된 토페도 AChR(20-40㎍/rat)을 꼬리 기저부에 일회 주입하여 래트를 면역시켰다. EAMG의 중량 변화는 일주일 당 3회 관찰하였고 EAMG의 임상적 증상은 운동 전후 관찰에 근거하여 0 등급 내지 4 등급으로 분류하였다. 등급 0은 정상 자세의 래트로서, 근육 강도는 EAMG 증상이 없는 상태이다; 등급 1은 휴식 시에는 정상, 운동 후에는 웅크린 자세 및 활동성과 악력의 감소를 나타내는 상태이다; 등급 2는 휴식 시 웅크린 자세, 허약, 체중 손실 및 떨림을 나타낸다; 등급 3은 심각한 허약, 심하게 감소된 체중 및 빈사상태를 나타내고; 등급 4는 사망상태에 이른다. 임상 기록은 토페도 AChR 면역화 후 6주간 이중 맹검(double blind evaluation) 방법으로 산정하였다. 모든 실험군은 8-9마리 래트로 구성되었다.

프로바이오틱 혼합물의 제조 및 상기 프로바이오틱 혼합물의 구강 투여

락토바실러스 카제이, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 류테리, 비피도박테리움 비피듐 및 스트렙토코커스 써머필러스로 구성된 각각의 균주 1 X 10¹¹ cfu/g를 포함하는 IRT5 프로바이오틱 파우더는 셀 바이오테크사(Cell Biotech)로부터 취득하였다. 프로바이오틱의 경구 투여는 토페도 AChR 면역화 2주전부터 시작하여 면역화 후 6-8주까지 계속되었고, 주당 5회씩 투여하였다. 래트 당 프로바이오틱의 양은 1 ㎖ PBS 내 2 X 10⁹ cfu/균주로 하였다.

세포 배양 및 세포 자극

CD4⁺ T세포는 제조사(miltenyi biotech) 지시에 따라 CD4 특이적 면역자기 비드를 사용하여 배수 림프절로부터 정제하였다. 분리한 CD4⁺ T세포는 10% 우태아혈청(Hyclone), 3 mM L-글루타민(Sigma), 10 mM HEPE(Sigma), 100 U/㎖ 페니실린(Sigma) 및 100 U/㎖ 스트렙토마이신(Sigma), 그리고 0.05 mM 2-베타-머캅토에탄올(Sigma)로 보충한 RPMI를 포함하는 T세포 배지 내에서 배양하였다. 사이토카인 분석을 위하여 혼합 림프구 및 CD4⁺ T세포를 PMA(20 nM) 및 이노마이신(2 μM)을 이용하여 다클론성으로 자극하고 토페도 AChR를 이용하여 항원 특이적으로 자극하였다.

항-AChR 항체 및 AChR-특이적 IgG 이소타이핑(isotyping)

마지막 급식 24시간 후, EAMG 처리된 래트의 혈청을 역-안구 출혈에 의하여 채취하였다. 항-래트 AChR 항체 레벨은 ELISA에 의하여 다음과 같이 측정하였다: 96-웰 마이크로플레이트를 인간 세포외 AChR 서브유닛(100 ㎖; 20 mg/㎖)에 상응하는 재조합 박편인 H1-205로 코팅하고, 적절히 희석시킨(총 IgG에 대하여 1/10000, IgG1에 대하여 1:500, IgG2a 및 IgG2b에 대하여 1:1000) 시험 대상 혈청 샘플 100 ㎖과 반응시켰다. 래트 IgG 이소타입(총 IgG에 대하여 1/50,000, IgG1에 대하여 1/60,000, IgG2a 및 IgG2b에 대하여 1/20,000)에 대한 호스래디쉬 페록시다제 접합 마우스 mAbs를 상온에서 2시간동안 첨가하고, 페록시다제 활성으로 결합된 항체를 측정하였다. 항체 레벨은 405 nm에서 OD를 측량하여 측정하였다.

CD4 ⁺ T세포, 혼합된 림프구 증식 분석

IRT5 및 PBS 처리 EAMG 래트로부터 배수 림프절 세포(dLNC)를 수집하고, 단독 또는 토페도 AChR의 존재 하 T세포 배지에서 배양하였다. IRT5 및 PBS 처리 EAMG 래트 배수 림프절로부터 유래한 CD4⁺ T세포는 단독 또는 TAChR 존재 하에서 미토마이신 C을 처리한 타생성 래트 비장림프구와 공동-배양시켰다. 72 시간의 배양 기간 중 마지막 18시간 동안의 [³H] 티미딘(0.5 mCi/웰) 혼입을 측정하여 증식을 평가하였다. 상기 결과는 자극된 dLNC로부터 비자극 배양 배경을 공제한 후 Δcpm으로 표시하였다.

정량적 실시간 PCR 을 이용한 사이토카인 발현 측정

각각의 시험군 내, 대표적 평균 임상 기록을 가진 3마리 래트를 희생시켰다. 상기 그룹으로부터 분리한 dLNCs 및 CD4⁺T세포를 자극제로서 토페도 AChR의 존재 하 40시간 동안 배양하고 수확하였다. 제조사 프로토콜에 따라 TRIzol 시약(Molecular Research Center)을 사용하여 총 RNA를 추출하고 M-MLV 역전사효소(Promega, Madison,WI)로 역전사하여 cDNA를 준비하였다. SyBr Premix Ex 태그(Takara, Japan)를 구비한 Chromo-4(Biorad)를 사용하여 상기 준비한 cDNA에 대해 정량적 실시간-PCR을 실시하였다. 사용한 프라이머 쌍은 하기 표 1에 나타내었다. 다른 유전자 발현 레벨을 계산하면서 L-32 발현으로 데이터를 평균화하였으며, 대조군과 비교한 실험군 유전자 각각에 대한 상대적 발현 레벨로서 상기 결과를 기술하였다.

세포 내 분자의 유세포 측정 분석( flow cytometric analysis )

항원 특이적으로 자극된 dLNC 및 CD4⁺ T세포에 있어서, 세포 내 TNF-α 단백질의 발현 레벨을 앞서 기술한 바와 같이 FACS로 분석하였다. 간단히 말해, dLNC로부터의 혼합 림프구를 토페도 AChR의 존재 하 배양하였다. CD4⁺ T세포를 자극 48시간 후 분리하고, 배양 종료 14시간 전에 Bredfeldin A(Sigma) 1 ug/㎖을 첨가하였다. 차가운 PBS로 세포를 세척하고 4% 포름알데하이드로 상온에서 20분 동안 고정시켰다. 0.5% 사포닌(Sigma) 및 1% BSA(Sigma)를 포함하는 투과화 완충액으로 30분 동안 2회 세척 후, 세포 내 사이토카인 염색을 위하여 세포를 PE(phycoerythrin)-표지된 항-TNF-알파(BD pharmigen, USA 559503)와 함께 배양하였다. 4℃ 암실에서 30분간 항체로 염색한 후 세포를 세척하고 PBS에 재현탁하였고, EPICS XL^TM 및 EXPO32^TM 소프트웨어(BECKMAN COULTER, CA, USA)를 사용하여 적어도 10,000개의 세포의 실험결과를 측정하였다.

MLN DC 분리 및 T세포 분화

장간막 림프절 수지세포를 항-OX-62 자석 비드(Milteny)를 사용하여 IRT5 및 PBS 처리된 래트로부터 분리하였다. 사이토카인 및 면역조절분자 프로파일을 결정하기 위하여, 상기 정제한 MLN DC를 PMA 및 이노신으로 자극하였다. MLN DC를 토페도 AChR 존재 하 EAMG CD4⁺ T세포와 함께 2일간 공동배양하였다. 공동 배양 후, 총 RNA를 추출하고 사이토카인 프로파일을 결정하기 위하여 cDNA를 합성하였다. 근무력증 증식 특성을 CSFE 표지 실험으로 평가하였다. EAMG로부터의 CD4⁺ T세포를 제조자 지시에 따라 CSFE로 표지하고 상기 표지된 CD4⁺ T세포를 항원 존재 하 IRT5 또는 PBS 처리된 래트로부터 유래한 MLN 수지상 세포와 함께 공동배양하였다. 7일 공동-배양 후, CD4⁺ T세포의 증식을 유세포 분석기로 분석하였다. Foxp3⁺ CD4⁺ T세포 발생 또한 공동-배양 실험 후 분석하였다.

NMJ 연구(면역조직화학에 의한 NMJ 에서의 AChR 및 보체 분석)

WT 또는 IRT5 또는 PBS으로 처리된 EAGM 래트 대퇴골 근육 조직을 추출 및 조직-Tek OCT 화합물 내 포매하고, Jung Frigout 2800E Kryostat(Leica)를 사용하여 횡단 방향 10 ㎛로 절개하였다. 각각의 실험군에 대해 본 발명자들은 10-15 근육 박편을 분석하였다. 본 발명자들은 근육 박편을 차가운 아세톤으로 10분 동안 고정시키고 PBS로 5분간 3회 세척하였다, 본 발명자들은 상기 박편을 2% PBSA(PBS 내 우혈청 알부민)으로 1시간 30분 동안 상온에서 차단하였다. 그 다음 PBS로 15분간 3회 세척하였다. 본 발명자들은 상기 단면들을 상온에서 1시간 동안 텍사스 레드-표지된 α-BTX(Molecular Probes) 및 FITC-표지된 염소 항-래트 C3 Ab(Nordic Immunological Laboratories)으로 염색하였다. 그 다음 PBS로 15분간 3회 세척하고 커버 슬립에 Dako 용액을 탑재하였다.

통계분석

통계분석을 위해, 이중-테일 스튜던트 t-테스트를 사용하였다. P값이 < 0.05 미만인 경우 차이점을 통계적으로 유의하게 고려하였다.

실험결과

IRT5 는 EAMG 발전을 억제한다

본 연구의 주된 목적은 IRT5라 불리는 프로바이오틱 혼합물이 EAMG 발전에 보호적인 효능을 갖는 지 여부를 평가하고 IRT5의 내재된 면역조절 기전을 밝히는데에 있다. 그러므로 인간 MG를 모사하기 위하여, 본 발명자들은 IRT5 및 PBS 처리 후 루이스 래트를 토페도 AChR(TAChR)로 면역화시켜 EAMG를 유도하였다. 본 발명자들은 EAMG 유도 2주전부터 실험 종료할 때까지 계속적으로 IRT5 및 PBS을 래트에 구강투여하였다. 본 발명자들은 EAMG 유도 후 6주간의 기간 동안 PBS 처리군과 비교하여 IRT5 처리 군의 임상 기록 및 체중 변화를 측정하는 방법으로 질병의 진행을 관찰하였다. IRT5 또는 PBS는 주당 5회식 투여하였고, 체중 및 임상 기록은 격일로 관찰하였다(도 1A). 도 1B에서 볼 수 있듯이 IRT5로 처리한 래트에서 EAMG 발전에 대한 보호효과가 관찰되었다. EAMG 유도 4 주 후, PBS 처리군은 악력 약화, 굽은 자세 및 떨림과 같은 심각한 질병 진행을 보인 반면, IRT5 처리군은 모든 시점에서 PBS 처리군보다 낮은 임상적 증상 및 가벼운 EAMG 증상을 보였다. 체중 손실이 EAMG의 전형적 증상 중 하나이기 때문에, 본 발명자들은 또한 IRT5 처리군 및 PBS 처리군 간 체중 변화를 비교하였다(표 2).

IRT5를 투여한 래트는 PBS 처리군과 비교하여 체중 증가를 보였다. IRT5 처리군의 평균 임상기록 또한 PBS 처리군보다 가벼운 증상을 나타내었다(도 1B). 본 발명자들은 또한 특정 형광 항체, 항-C3c 및 항-분가로톡신을 각각 사용하여 NMJ에서 보체 및 아세틸콜린 수용체의 존재를 조사하였다. NMJ에서의 보체 존재는 EAMG 개시 및 발전의 주요한 병리학적 인자 중 하나이다(Lennon et al., 1978; Sahashi et al., 1980). 본 발명자들은 EAMG 유도 6주 후, PBS 및 IRT5 처리 래트로부터의 근육 박편을 조사하였다. 음성적 대조군으로는 나이브 래트를 사용하였다. PBS 처리군은 NMJ에 보체 요소 C3c를 가졌다(도 1C). 그러나, IRT5 처리군은 보체 존재가 관찰되지 않았다. IRT5 처리군 및 나이브 래트는 NMJ에서 AChR 존재를 나타내었지만 보체는 관찰되지 않았다. 상기 결과들은 IRT5의 구강 투여가 EAMG의 발전에 대하여 보호적 효능을 가짐을 나타낸다.

IRT5 에 의한 AChR -반응성 림프구 반응의 억제

IRT5의 보호적 효능이 림프구 AChR에 대한 저-반응성과 관련 있는지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 각 군의 배수림프절(dLNs)로부터 유래한 림프구의 증식 분석을 수행하였다. EAMG 유도 6주 후, 본 발명자들은 혼합 림프구 및 CD4⁺ T세포를 dLN로부터 분리하고 단독 또는 TAChR 존재 하에서 3일 간 배양하였다. CD4⁺ T세포 증식을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 dLN로부터 분리한 상기 CD4⁺ T세포를 AChR 존재 또는 부존재하에서 미토마이신 C로 처리한 정상 래트 비장림프구와 공동-배양시켰다. 림프구 증식을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 티미딘 혼입 분석을 수행하였다. IRT5 처리한 래트로부터 분리한 림프구들은 PBS 처리군과 비교하여 저-증식을 보였다(도 2A). CD4⁺ T세포 또한 AChR에 반응하여 저-증식을 나타내었다(도 2B). 상기 결과들은 IRT5가 EAMG에 있어서 항원 특이적 방식에 대한 세포 내 반응을 전체적으로 하향 조절함을 나타낸다.

IRT5 의 경구 투여는 호-염증성 사이토카인을 하향 조절한다

EAMG 발전에 대한 IRT5의 보호적 효과를 알아보기 위해, 본 발명자들은 IRT5 및 PBS 군 래트의 dLN에서 유래한 림프구 및 CD4⁺ T세포 발현 패턴을 측정하였다. 축적된 증거들에 따르면 IFN-γ 및 TNF-α와 같은 호-염증성 사이토카인은 EAMG의 발병 및 발전과 관련이 있다(Balasa et al., 1998; Goluszko et al., 2002; Im et al., 2001; Karachunski et al., 2000; Ostlie et al., 2003; Wang et al., 2000). 사이토카인 발현 레벨을 시험하기 위해 IRT5 또는 PBS를 투여한 래트를 EAMG 유도 6주 후에 희생시키고 dLN로부터 수집한 혼합 림프구 및 CD4⁺ T세포를 TAChR 또는 다클론성 자극제(PMA/inomycin) 존재 하에서 2일간 배양하였다. 사이토카인의 상대적인 mRNA 발현 레벨을 실시간 PCR로 측정하고 L32로 표준화하였다. IRT5 경구 투여는 IL-2, IFN-γ, TNF-α, 림프구 및 CD4⁺ T세포 혼합 내 IL-6 및 Th17 세포 사이토카인인 IL-17 와 같은 호-염증성 사이토카인 발현을 억제한 반면, IL-10 및 TGF-β와 같은 조절 사이토카인의 레벨은 변경시키지 않았다(도 3A). 본 발명자들은 또한 림프구 및 CD4⁺ T세포 혼합 내 TNF-α의 단백질 레벨을 측정하였다. IRT5의 경구 투여는 TNF-α를 하향 조절한 반면(도 3B), IL-10 발현은 IRT5 및 PBS 처리 군 간 유사하였다.

IRT5 는 AChR -특이적 항- IgG 이소타입을 억제한다

항-AChR 특이적 항체는 NMJ에 보체를 보급하고 아세틸콜린의 아세틸콜린 수용체에 대한 결합을 기능적으로 차단하여 MG 발병에 있어 중요한 역할을 한다(Gomez and Richman, 1983; Lennon et al., 1978). AChR 항체의실험 동물로의 외인성 전달은 근무력증 증상을 야기하였다. IRT5가 EAMG 발전에 어떻게 억제적 효능을 갖는지 조사하기 위하여, EAMG 래트 내 항-AChR 특이적 IgG 이소타입 생산에 대한 IRT5의 효능을 시험하였다. 이를 위해 IRT5 또는 PBS로 처리된 래트로부터 역-안구 출혈로 혈청을 수집하였다. 이렇게 수집한 혈청은 AChR에 특이적인 ELISA로 분석하였다. IRT5를 투여한 래트 내 항-AChR 특이적 IgG, IgG1, IgG2a 및 IgG2b의 레벨은 PBS 처리군보다 훨씬 낮았다. 상기 결과들은 IRT5의 경구투여가 EAMG 발전에 있어서 IRT5의 보호적 효과를 매개하는 AChR 특이적 IgG 및 그의 이소타입의 발현을 억제한다는 사실을 제시한다.

IRT5 은 장간막 림프절 내 면역관용성 수지상 세포 발생을 유도한다

장간막 림프절(MLN)은 수지상 세포(DC) 또는 대식세포와 같은 점막 항원 제시 세포에 영향을 미치는 방식으로 프로바이오틱이 작용하는 장소이다. IRT5의 내재된 EAMG 억제 작용 메카니즘을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 MLN 내 사이토카인 및 DC의 면역억제분자를 분석하였다. MLN 내 사이토카인 및 DC의 면역억제분자의 생산을 산정하기 위하여, OX-62 표지된 MACS 비드를 사용하여 IRT5 또는 PBS 처리 래트로부터 MLN 내 DC를 분리하였다. 정제된 DC는 다클론성 자극을 위해 PMA/이노마이신으로 자극하였고, 총 RNA를 추출하고 사이토카인 및 면역조절분자의 상대적 발현 레벨을 실시간 PCR로 분석하였다. IL-10, TGF-beta, arginase1, CD274 (PDL-1) 및 aldh1a2와 같은 면역조절 사이토카인 및 분자의 발현 레벨은 PBS 처리군과 비교하여 IRT5 군에서 상향조절되었다(도 5A). IRT5 처리 래트로부터의 DC가 말초 림프 절 내 근무력증 CD4⁺ T세포 증식을 억제할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, IRT5 또는 PBS 처리군으로부터의 DC를 TAChR 존재 하에서 EAMG CD4⁺ T세포와 공동 배양하였다. 상기 T세포를 IRT5 처리군으로부터의 DC와 공동배양한 경우 PBS 처리 DC와 비교하여 EAMG CD4⁺ T세포 증식 억제가 관찰되었다(도 5B). 본 발명자는 또한 EAMG CD4⁺ T세포로부터의 사이토카인 생산을 시험하였는데, 여기에서 상기 T세포는 IRT5 처리군 및 PBS 처리군으로부터 유래한 DC와 공동배양되었다. EAMG CD4⁺ T세포를 IRT5 처리 DC와 공동 배양한 경우 PBS 처리 DC와 비교하여 IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-17와 같은 호염증성 사이토카인이 하향조절되었다(도 5C). 본 발명자들은 또한 IRT5 처리 래트로부터의 DC가 조절 T세포 발생과 관련있는지 여부를 조사하였다. 그러므로, 본 발명자는 IRT5 처리 또는 PBS 처리군으로부터의 DC와 공동배양되는 CD4⁺ T세포 내 Foxp3⁺ 수를 조사하였다. IRT 처리군으로부터의 DC와 공동배양한 경우 PBS 처리군과 비교하여 Foxp3⁺ 조절 T세포가 2배 이상 증가하였다(도 5D). 상기 결과들은 IRT5의 구강투여가 장내 면역관용 환경을 발생시켰고, 이는 조절 DC를 발생시킬 수 있으며, 이러한 면역관용 DC는 발병적인 EAMG CD4⁺ T cells 증식 및 호-염증성 사이토카인을 억제하고 Foxp3+ 조절 T세포를 발생시킬 수 있음을 나타낸다.

추가논의

최근에 프로바이오틱이 다양한 기전으로 숙주 건강에 유익한 효능을 제공한다는 사실이 알려짐에 따라 대중적 관심을 받게 되었다. 프로바이오틱에 의한 건강적 잇점으로는 미소식물기능 개선, 혈청 콜레스테롤 레벨 감소 및 암활성억제 등이 있다(Akalin et al., 1997; Alander et al., 1999; de Roos and Katan, 2000; Reddy, 1999).

프로바이오틱은 장으로부터 병원균 제거 또는 장 상피세포 및 면역 세포에 미치는 영향을 통하여 점막 면역계를 조절한다. 예컨대, 프로바이오틱은 점막 경계 내 병원균의 군집화를 억제한다(Parvez et al., 2006). 다수의 축적된 연구 결과는 프로바이오틱의 투여가 염증성장질환(IBD)에 효과적임을 보였다. 프로바이오틱의 처리는 궤양성 대장염(UC) 진정에 유익한 효과가 있었고, UC 환자 회장 염증 재발을 억제하였다. 프로바이오틱의 소진은 조절 T세포를 증가시켰고 염증성장질환(IBD) 환자의 말단 혈액 내 대식세포 및 DC를 생산하면서 TNF-α 및 IL-12를 감소시켰다(Gionchetti et al., 2000; Lorea Baroja et al., 2007; Zocco et al., 2006). 프로바이오틱의 섭취는 주로 Th1 세포에 의해 매개되는 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병 및 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)과 같은 자가면역 질병을 조절할 수 있었다. 게다가 프로바이오틱은 Th2형 사이토카인이 중대한 발병적 역할을 하는 아토피성 피부염을 완화시켰다(Calcinaro et al., 2005; Kato et al., 1998; Maassen et al., 1998; So et al., 2008; Viljanen et al., 2005a; Viljanen et al., 2005b). 그러나 지금까지 T세포 의존적 B세포 매개 면역 질환인 중증근무력증(MG) 또는 EAMG에 대한 프로바이오틱의 효능은 보고된 바 없다.

본 발명의 연구에서, 본 발명자들은 프로바이오틱 혼합물(IRT5으로 지시됨)이 EAMG 발전에 보호적 효능을 가짐을 기술하였다. IRT5의 경구투여는 EAMG 증상을 의미심장하게 호전시켰고, PBS과 비교하여 체중 증가 및 웅크린 자세 및 떨림과 같은 질병 증상 감소를 발생시켰다(도 1B 및 표 2). PBS 처리군은 NMJ에서 보체 요소를 가졌다. 그러나 IRT5 처리군은 보체 요소를 나타내지 않았다(도 1C). EAMG에 있어서 IRT5 처리는 더 나아가 dLN 혼합 림프구 및 CD4⁺ T세포의 저반응성, dLN 혼합 림프구 및 CD4⁺ T세포의 IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-17를 포함하는 호-염증성 사이토카인 발현의 하향 조절 및 AChR 특이적 IgG 이소타입 항체(IgG, IgG1, 2a 및 2b)의 감소에 의해 달성되는 세포성 및 체액성 AChR 특이적 반응을 억제하였다. 최근 다른 연구 그룹은 또한 Th17 세포 및 그들의 사이토카인이 EAMG의 발병에 관계한다고 보고하였다(Mu et al., 2009; Wang et al., 2007). 그러므로 IRT5 처리에 따른 이러한 사이토카인 발현의 억제는 EAMG에 대한 IRT5의 보호적 효능을 강하게 뒷받침한다. IRT5의 구강투여는 IgG1, 2a 및 2b와 같은 혈청 IgG 이소타입을 감소시켰다. IgG 이소타입은 T 헬퍼 세포 및 보체 관여와 관련이 있다. 도 4에서 모든 IgG 이소타입은 PBS 처리군과 비교하여 IRT5 처리군에서 하향 조절되었다. 상기 결과들은 IRT5의 구강투여가 모든 IgG 이소타입 생산 감소를 일으키는 T 헬퍼 세포 기능을 억제함을 암시한다. 본 발명의 연구에서, Th1 사이토카인으로부터 Th2/3 사이토카인으로의 쉬프트는 관찰되지 않았다. 다만, dLN 혼합된 림프구 및 CD4+ T세포로부터의 호-염증성 사이토카인의 하향 조절 및 IL-10 및 TGF-β와 같은 항-염증성 사이토카인의 상향 조절만이 관찰되었다. EAMG 유도 전의 IRT5 처리는 항원-특이적 림프구 발생을 차단 또는 억제할 수도 있다. 그러므로 dLN 림프구 및 CD4+ T세포에 대한 저반응성, dLN 림프구 및 CD4+ T세포로부터의 호-염증성 사이토카인의 하향 조절 및 IgG 이소타입의 감소는 EAMG 상태에 IRT를 처리한 결과이다. 상기 결과들은 EAMG의 시작 또는 초기 진행에 대한 IRT5의 억제적 효능을 나타낸다. 그 다음으로 본 발명자들은 프로바이오틱이 근육 관련 자가면역 질환에 얼마나 보호적 효능을 갖는지 의문을 가졌다. 첫째로, 본 발명자들은 어떠한 세포가 주로 이와 같은 사건에 관여하는지 조사하였다. 구강투여 경로를 통해 위장관에 들어온 프로바이오틱은 장 상피세포 밑의 면역세포를 조절하거나 이에 영향을 미칠 수 있다. 프로바이오틱은 또한 수지상 돌기를 사용하여 프로바이오틱을 포획할 수 있는 수지상 세포(DC)를 경우하여 장 상피세포를 직접적으로 통과할 수 있다(Rescigno et al., 2001). 장 루멘을 가로지르는 프로바이오틱은 항원제시세포, 특히 대식세포 또는 수지상 세포를 자극하여 IL-12, IL-10 및 TGF-β와 같은 사이토카인을 생산하게 한다(Pochard et al., 2002; Shida et al., 1998). 프로바이오틱 투여는 국지적(위장 및 대장) 효능 뿐만 아니라 다양한 질병 상태에 대하여 전체적인 효능 또한 갖는다(Foligne et al., 2005; Sheil et al., 2004). 상기 이론을 근거로, 본 발명자들은 IRT5 처리 후 장간막 림프절 수지상 세포 기능을 분석하였다. 림프성 기관 또는 대장과 연관있는 위장 내 수지상 세포가 직접적 또는 간접적으로(장 상피세포에 의하여) 프로바이오틱에 의해 영향을 받는 사실이 잘 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 MLN로부터 수지상 세포를 분리한 후 IL-10, TGF-β, arginase1, PDL-1 및 aldh1a2(Morelli and Thomson, 2007)와 같은 면역관용 수지상 세포 마커를 분석하였다. IRT5 처리는 PBS 처리군과 비교하여 MLN DC로 부터의 이러한 분자를 증가시켰다(도 5A). IRT5에 의한 DC의 변경은 EAMG 유도에 대한 보호적 효능을 반영한다. IRT5에 의해 발생한 면역관용 DC가 근무력증 CD4⁺ T세포 증식 및 호-염증성 사이토카인 생산을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 IRT5 또는 PBS 처리군으로부터의 DC를 EAMG로부터의 CD4⁺ T세포와 공동 배양하였다. IRT5로부터의 DC와 EAMG CD4⁺ T세포를 공동배양한 경우 PBS 처리군과 비교하여 근무력증 CD4⁺ T세포는 덜 증식하였고 호-염증성 사이토카인의 더 적은 생산을 나타냄을 관찰하였다. 또한 IRT5로부터의 DC와 근무력증 CD4⁺ T세포의 공동 배양이 Foxp3 발현을 상향 조절하는 것이 관찰되었다. 상기 결과들은 IRT5 처리가 조절 T세포 발생을 이끄는 면역관용 DC를 발생시킬 수 있음을 강하게 제안한다. 비록 면역관용 DC의 MLN으로부터 dLN으로의 직접적 이동이 관찰되지는 않았지만, 조절 T세포는 작동체 영역으로 이동할 수 있다. 본 발명자는 AD 조건에서 IRT5 처리군으로부터의 면역관용 DC에 의하여 조절 T세포가 염증 부위를 이동시켜고 작동체 면역 세포를 억제할 수 있음을 보고한 바 있다(Kwon et al.).

많은 연구결과는 프로바이오틱이 염증, 알레르기, 암 및 자가면역 질병을 포함하는 다양한 질병 치료에 사용될 수 있음을 보고하였다. 프로바이오틱의 다양한 질병에 대한 치료적 또는 예방적 효능은 균주, 투여 경로, 투여량 및 투여 당시 질병 상태에 의존한다(Besselink et al., 2008). 본 발명의 연구에서, 락토바실러스, 비피도박테리움 및 스트렙토코커스와 같은 다른 균주의 조합을 사용하였다. 이들 각각은 류마티스관절염, 염증성 장염 및 아토피성 피부염에 효과가 있는 것으로 이미 보고되었다. 종전 연구에서 본 연구실은 서로 다른 균주의 혼합물(IRT5)이 류마티스관절염, 염증성 장염 및 아토피성 피부염에 치료적 효능을 나타냄을 증명한 바 있다(Kwon et al.). 비록 본 발명자들이 상기 질병들에 대한 IRT5 프로바이오틱의 예방적 효능을 보였다 하더라도, 그것이 또한 진행중인 EAMG에 보호적 효능을 행사하는지 여부에 대해서는 쉽게 예측할 수 없었으며 추가적인 시험이 필요하였다.

결론적으로 본 발명자들은 개선된 임상 기록 및 NMJ에서 보체가 관찰되지 않음을 확인하여 프로바이오틱 처리가 EAMG에 대하여 보호적 효능을 가짐을 증명하였다. 프로바이오틱의 구강 투여는 항-AChR IgG 및 그의 서브-이소타입, 호-염증성 사이토카인 및 AChR-반응성 림프구 증식을 감소시켜 EAMG 발전을 억제할 수 있다. 이와 같은 EAMG 발전에 대한 IRT5의 보호적 효능은 근무력증 림프구를 억제하는 면역관용성 수지상 세포의 발생에 의해 획득된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (11)

1. 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus, ST), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri, LR), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium, BB), 락토바실러스 아시도필루스(lactobacillus acidophilus, LA) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, LC)를 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 중증근무력증을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물로서 상기 혼합균주는 아세틸콜린수용체-반응성 림프구 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
2. 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus, ST), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri, LR), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium, BB), 락토바실러스 아시도필루스(lactobacillus acidophilus, LA) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, LC)를 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 중증근무력증을 예방 또는 개선하기 위한 기능성 식품 조성물로서 상기 혼합균주는 아세틸콜린수용체-반응성 림프구 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus, ST), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri, LR), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidium, BB), 락토바실러스 아시도필루스(lactobacillus acidophilus, LA) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, LC)를 포함하는 혼합균주를 유효성분으로 포함하며 중증근무력증을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물로서 상기 혼합균주는 아세틸콜린수용체-반응성 림프구 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중증근무력증은 안근형 중증근무력증, 구형 중증근무력증, 전신형 중증근무력증, 신생아 일과성형 중증근무력증, 선천성 지속성 중증근무력증 및 가족성 영아형 중증근무력증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 중증근무력증은 전신형 중증근무력증인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 삭제
8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합균주는 혈중 항-아세틸콜린수용체 면역글로불린 G(IgG) 및/또는 염증성 사이토카인 레벨을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-감마(IFN-γ), TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha), 인터루킨-6(IL-6) 및 인터루킨-17(IL-17)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합균주는 조절 수지상 세포(regulatory dedritic cell)를 생성시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 대상체(subject)에 구강 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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