EP1476461A2 - Immunmodulierendes peptid aus s. aureus enterotoxin b - Google Patents

Immunmodulierendes peptid aus s. aureus enterotoxin b

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EP1476461A2
EP1476461A2 EP03704622A EP03704622A EP1476461A2 EP 1476461 A2 EP1476461 A2 EP 1476461A2 EP 03704622 A EP03704622 A EP 03704622A EP 03704622 A EP03704622 A EP 03704622A EP 1476461 A2 EP1476461 A2 EP 1476461A2
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EP
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polypeptide
seq
sequence
production
ige
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EP03704622A
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Karsten Neuber
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AgeLab Pharma GmbH
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Definitions

  • the invention relates in particular to peptides which are capable of specifically binding IgE antibodies and which are obtainable, for example, from the naturally occurring S. aureus enterotoxin B (SEB). Their immunomodulatory properties differ significantly from those of the bacterial SEB. In contrast to SEB, the peptides according to the invention surprisingly do not induce proliferation of T cells.
  • SEB S. aureus enterotoxin B
  • the peptides are suitable for the therapy of diseases which are characterized by an increased serum IgE level and / or an increased production of interferon-gamma, and for the therapy of diseases which are characterized by an imbalance of Thl and Th2 immune response are characterized, such as atopic eczema, lupus ery- thematodes, Crohn's disease, multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis.
  • Staphylococcus aureus is a widespread pathogenic microorganism that can trigger a variety of serious infectious diseases.
  • S. aureus produces enterotoxins (enterotoxin A, B, C, D, E and TSST-1) and endotoxins (coagulase, staphylokinase, lipase, hyaluronidase, DNAse). Due to the development of multiple resistance to various antibiotics, S. aureus has become very important in recent years as a causative agent of hospital infections.
  • the enterotoxins (SE) produced by S. aureus can be Trigger food poisoning and septic shock [Marrack, P. & Kappler, J. (1990), Science 248, 705].
  • SEA staphylococcal enterotoxin A
  • SEE staphylococcal enterotoxin E
  • T- Cell repertoire can be stimulated in vivo by bacterial superantigens [Choi, Y. (1990), ". Exp. Med. 172, 981].
  • These T- Cell stimulation induces an abundance of complex pathophysiological mechanisms that have not yet been fully elucidated.
  • intoxication with superantigens leads to sy- stemmic reactions, which can range from fever to cardiovascular shock [Fleischer, B. (1991), Immun. Infection. 19, 8].
  • Table 1 shows the immunological reactions induced by S. aureus enterotoxins. These reactions are likely to be triggered by complex immunological processes.
  • CLA cutaneous lymphocyte-associated antigen
  • Tab. 1 Immunological reactions induced by S. aureus enterotoxins. After this hyperactive phase, the superantigen-stimulated T cells change into an anergic state, so that massive immunosuppression can occur. On the other hand, autoreactive but anergic T cells can be activated, which then trigger autoimmune diseases. With multiple sclerosis [Hafler, DA (1988), J. Exp. Med. 167, 1313] and rheumatoid arthritis [Palliard, X. (1991), Science 253, 325], an oligoclonal selection of certain V E chains has already been made detected, which indicates a superantigen-mediated pathomechanism of these diseases.
  • SEB increases the IgE synthesis and the production of interleukin-4 in patients with atopic eczema [Neuber, K, (1993), dermatologist 44, 135; Ring, J. et al. (1992) Allexgy 47, 265; Neuber, K. et al. (1995), Int. Arch. Allergy Im unol. 107, 179].
  • an eczema-inducing effect for SEB was demonstrated in the patch test [Hofer, M.F. (1999), J. Invest. Dermatol. 112, 171].
  • atopic eczema is one of the diseases in which pathologically increased IgE synthesis occurs. So far, these diseases can only be treated symptomatically, ie the suppression of IgE synthesis takes place unspecifically through the suppression of the T lymphocytes involved in the synthesis.
  • the most common systemically used drugs are cortisone or cyclosporin A. These substances often cause very serious systemic side effects (skin atrophy, diabetes, hypertension, kidney and hepatotoxicity, etc.). Such specific side effects would be avoided by a specific modulation of the excessive IgE synthesis. The same also applies to diseases which are accompanied by an increased interferon-gamma synthesis of the lymphocytes.
  • a good example of such a condition is psoriasis vulgaris. reduce T-cells more interferon-gamma and thereby induce the hyperproliferation of the epidermis.
  • Immunosuppressants such as cortisone or cyclosporin A are also used to treat psoriasis. In this case, the selective inhibition of cytokine production would also significantly reduce the rate of side effects.
  • Thl or a weakened Th2 reaction has been causally proven or is being discussed in a number of diseases (see also Table 2). Experimental animal findings suggest that these.
  • Organ-specific autoimmune diseases such as multiple sclerosis are to be mentioned here [Shevach, EM et al. (1999), Springer Semin. Immunopathol. 21, 249-262; Leonard, JP et al. (1997), Grit. Rev. Immunol. 17, 545-553], autoimmune uveitis [Singh, VK et al. (1999), Immunol. Res. 20, 147-161; Sun, B. et al. (1999), Int. Immunol. 11, 1307-1312; Egwuagu, CE et al. (1999), J. Immunol.
  • the object of the present invention is therefore to provide a new active ingredient which is suitable for the treatment of diseases which are characterized by an increased IgE level and / or an increased interferon gamma production and which do not have the disadvantages known in the prior art ,
  • peptides can be isolated from the naturally occurring S. aureus enterotoxin B (SEB) which achieve the above-mentioned objects.
  • SEB S. aureus enterotoxin B
  • a peptide can be isolated which is capable of specifically binding IgE antibodies.
  • its immunomodulatory properties differ considerably from those of the bacterial SEB.
  • the peptide according to the invention the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 10, surprisingly does not induce proliferation of T cells, but on the other hand inhibits the interferon-gamma synthesis of stimulated T lymphocytes.
  • the peptide is suitable for the therapy of diseases which are characterized by increased serum IgE levels and / or increased production of interferon gamma.
  • the diseases are preferably allergic rhinoconjunctivitis, allergic bronchial asthma and psoriasis vulgaris.
  • peptides according to the invention were produced which have the same or essentially the same biological and / or immunological properties. Because of their special properties, ie binding of IgE antibodies and inhibition of interferon gamma Synthesis without induction of T cell proliferation, the peptides according to the invention are particularly suitable for the treatment of diseases which are associated with increased IgE synthesis and increased interferon-gamma synthesis, as is the case, for example, with atopic eczema (neurodermatitis) , This condition has been described in the chronic course of atopic eczema. Interferon gamma-producing T lymphocytes are found in the skin and there are increased serum IgE values.
  • the therapeutic effect of the peptides could either be achieved directly by an inactivating binding to the IgE, or indirectly by modulating the cytokine production of the T lymphocytes.
  • inhibition of other cytokines such as IL-4 and IL-13 are also considered, which are known to stimulate IgE synthesis.
  • the present invention therefore relates to a polypeptide which has the N-terminal amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 15 and which can be obtained by trypsin cleavage of S. aureus enterotoxin B as a 12 kD cleavage fragment.
  • the invention relates to a polypeptide (hereinafter referred to as peptide P1) which has the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 10 and which inhibits the synthesis of interferon-gamma by stimulated T lymphocytes in vitro.
  • the present invention further includes homologs and derivatives of the aforementioned polypeptides that bind to IgE.
  • the homologous polypeptides are substances which, however, differ from the aforementioned amino acid sequences, in particular from the sequence according to SEQ ID NO: 10, as a result of the exchange of one or more amino acids or by insertion or deletion of one or more amino acids, wherein they have a sequence homology of about 50 to 99%, preferably at least about 75%.
  • a sequence homolo gie of at least 85% is particularly preferred.
  • a derivative is understood to mean those polypeptides in which one or more amino acids of the aforementioned sequences, in particular the sequence according to SEQ ID NO: 10, are replaced by a stereoisomer (ie replacement of one or more L-amino acids by D-amino acids) or a corresponding one , modified amino acid are exchanged.
  • Modified amino acids are understood to mean those amino acids whose side chains are chemically changed compared to naturally occurring amino acids, for example by glycosylation,
  • the homologs and derivatives which bind IgE have the same or essentially the same properties as the aforementioned peptide according to SEQ ID NO: 10, i.e. they inhibit the synthesis of interferon-gamma stimulated T lymphocytes in vitro and / or they do not induce the proliferation of T lymphocytes.
  • the homolog (hereinafter referred to as peptide P2) has the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 11.
  • the invention also includes polypeptides with a length of more than 9 amino acids which contain the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 10 or 11 and which inhibit the synthesis of interferon-gamma by stimulated T-lymphocytes in vitro.
  • the invention further relates to a nucleic acid molecule which contains a nucleic acid sequence coding for a aforementioned polypeptide. It preferably has the nucleic acid sequence given in SEQ ID NO: 9.
  • the nucleic acid molecule can be used to convert the sequence into an expression vector to clone in and to produce the peptide according to the invention recombinantly. These methods are well known to those skilled in the art.
  • the peptides according to the invention are able to influence the ratio between Thl and Th2 cells and thus also the ratio of the corresponding cytokines.
  • Tab. 2 Diseases with an imbalance in the TH1 / TH2 ratio, which are suitable for therapy with the peptides.
  • these are particularly suitable for the production of a pharmaceutical composition for inducing or enhancing a Thl or Th2 immune response by increasing the Th2 or lowering the Thl response and vice versa, in particular for producing a pharmaceutical composition for the treatment of diseases associated with a (predominant) Th2 or Thl immune response.
  • diseases selected from the group consisting of multiple sclerosis, autoimmune uveitis, diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, Behcet ⁇ s syndrome, helicobacter pylori infection, inflammatory bowel diseases (Crohn's -and- -Crohn) - akuter- Organ transplant rejection and spontaneous recurrent abortions.
  • the invention furthermore relates to the use of a polypeptide which has or contains the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 10 for the production of a pharmaceutical composition for immunomodulation and for inhibiting the cytokine production of lymphocytes, in particular T-lymphocytes. Also included is the use of such a polypeptide for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of diseases associated with an increased production of cytokines (such as interferon-gamma) and / or an increased level of IgE antibodies.
  • the diseases are, in particular, atopic eczema (especially in the chronic form), bronchial asthma, allergic rhinoconjunctivitis, psoriasis, rheumatoid arthritis or multiple sclerosis.
  • the cytokine is interferon-gamma, interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-10 (IL-10), interleukin-12 (IL- 12) and / or interleukin-13 (IL-13).
  • IL-4 interleukin-4
  • IL-5 interleukin-5
  • IL-10 interleukin-10
  • IL-12 interleukin-12
  • IL-13 interleukin-13
  • the present invention includes the use of a polypeptide described above which has an amino acid sequence homologous to or derived from SEQ ID NO: 10.
  • a polypeptide described above which has an amino acid sequence homologous to or derived from SEQ ID NO: 10.
  • the homologous or sequences derived therefrom reference is made to the above definition of the "homologues” and “derivatives”, including in particular those IgE-binding polypeptides which do not induce the proliferation of T lymphocytes and / or in vitro the synthesis of Inhibit interferon gamma by stimulated T lymphocytes.
  • the polypeptide used has the sequence according to SEQ ID NO: 11.
  • polypeptides which contain the sequence according to SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or sequences homologous therefrom or derived therefrom. with “the same or essentially the same biological or immunological properties as part of a longer amino acid sequence, polypeptides with a length of up to 30 amino acids, in particular with a length of up to 15 amino acids, are preferred.
  • polypeptides according to the invention are suitable for in vitro inhibition of interferon gamma production in lymphocytes, in particular in human, peripheral T-lymphocytes of the blood.
  • the peptides according to the invention modulate both the stimulated and the spontaneous cytokine production of TH1 and TH2 lymphocyte subpopulations.
  • the endogenous activation status of the lymphocytes seems to play an important role in the direction of the peptide-induced effects.
  • an inhibition of the endogenously increased synthesis of all cytokines by the peptide P1 according to the invention is observed.
  • an increased IFN ⁇ production is observed especially in the chronic inpatient form.
  • the peptide P1 according to the invention in particular is able not only to inhibit the TH2 cytokine synthesis of the lymphocytes of these patients, but also the IFN ⁇ production, which is of considerable therapeutic relevance, for example by alleviating the symptoms until healing.
  • IL-10 can have a beneficial effect on the clinical appearance of psoriasis.
  • the targeted effect of the peptides according to the invention on the IL-10 production of the lymphocytes of psoriasis is of particular therapeutic importance in the interaction with the effects on the other cytokines, e.g. by alleviating the symptoms until healing.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition which contains one or more polypeptides according to the invention as an active ingredient and optionally also one or more pharmaceutically acceptable auxiliaries and / or carriers.
  • the peptide isolated from SEB can be obtained by digesting enterotoxin B from S. aureus with trypsin and then isolating the 12 kD fragment from the reaction mixture.
  • genetic engineering methods of production are of course also possible by introducing the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 into an expression vector, introducing this into suitable host cells, cultivating the host cells under conditions which lead to protein expression. are suitable and the expressed polypeptide is isolated, which is encoded by the nucleic acid sequence.
  • Example 1 Immunoblot for the detection of specific IgE antibodies against SEB.
  • the gel electrophoretic separation of proteins was carried out according to the method of Lughtenberg et al. [Lughtenberg, B. (1975), FEBS Lett. 58, 254]. 12.5% polyacrylamide release gels were used. Standard protein mixtures (Biorad, MW standard, 203 kD - 7.5 kD) were separated in parallel to determine the molecular weights. The proteins were stained with Coomassie-Blue G-250. 10 bags were available in the collection gel for sample collection, the amount of protein used being between 10 and 100 ⁇ g. The protein solution to be separated (20 ⁇ l) was mixed with 20 ⁇ l sample buffer, filled into the collecting egg pockets and then covered with an electrode buffer.
  • the electrophoresis was carried out in electrode buffer and with a constant current flow of 20 mA.
  • the electrophoresis was stopped.
  • the protein mixtures to be examined were separated by gel electophoresis (SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose (pore size 0.45 ⁇ m) using the Western blot method.
  • the transfer took place with cooling in an electro-blot chamber (BioRad, Kunststoff) immediately after the gel electrophoresis for 18-20 h at a constant current of 0.2-0.3 A.
  • the nitrocellulose blots were incubated with human serum for 4 h on a swivel table at RT (Dianova, Hamburg).
  • the blots were then washed five times and then again incubated for 4 h at RT with a secondary antibody against human IgE (anti-human IgE antibody, from Serva, Heidelberg) and the binding was visualized by an enzymatic color reaction.
  • human IgE anti-human IgE antibody, from Serva, Heidelberg
  • Peroxidase-labeled antibodies were used in the immunoblots. It should be noted that the result of the blot (in scanned form) shown in FIG. 1 does not correspond to the actual color gradations that can be seen with the naked eye. The bands to be recognized as shadows on the original blot are so weak compared to the bands incubated with atopic sera that they have to be considered as non-specific reactions.
  • SEB 100 ⁇ g / 100 ⁇ l was digested enzymatically with 10 ⁇ l trypsin (4 mg / ml aqua dest.) At 37 ° C. for 18 h. The solution was then applied to SDS gels and the corresponding cleavage products separated. The conditions for the gel electrophoresis corresponded to the conditions given in Example 1. The cleavage products were incubated in the immunoblot with sera from the patients with atopic eczema mentioned in Example 1. Serum from healthy control persons served as a control. The result of the trypsin digestion is shown in Figure 2.
  • the cleavage product, identified as IgE binding, with a molecular weight of approximately -12 kD was eluted from the gel and then mechanically according to the method of P. Edman [Edman, P. (1950), Acta Chem. Scand , 4, 283], the N-terminal sequence KVTAQELDYL being determined.
  • the sequence analysis thus revealed a sequence that begins at position 181 (from the N-terminal end) of the SEB molecule.
  • Figure 3 shows the result of the sequence analysis.
  • the two peptides according to the invention can bind IgE antibodies from the serum of patients with atopic eczema.
  • the sera from 5 different patients with atopic eczema were first pre-cleaned using protein G columns (1 ml, Pharmacia). The sera were prefiltered through 0.8 ⁇ m syringe heads. The column was then coupled with 10 ml of binding buffer (20 mM PBS, pH 7.0) “drop to drop” and washed at a flow rate of 1 ml / min.
  • PBMC Peripheral blood lymphocytes
  • PBMC Peripheral blood lymphocytes
  • SEB (1 ⁇ g / 10 6 cells) and the peptide (5 ⁇ g / 10 6 cells) were used as stimuli.
  • the proliferation of the cells and the intracellular production of interferon-gamma and interleukin-4 were measured by flow cytometry after 2 days of incubation at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the peripheral blood lymphocytes were isolated by a Ficoll-Paque gradient centrifugation, the cell number was adjusted to 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the cells were taken up in 15 ml conical polypropylene tubes and then incubated in the incubator for 2 days.
  • the PBMC were incubated with 60 ⁇ M bromodeoxyuridine (BrdU) in the last 5 h of the incubation period.
  • PrdU bromodeoxyuridine
  • the proliferation was determined by the incorporation of BrdU in lymphocytes on the flow cytometer.
  • the incubation of the lymphocytes with different concentrations of the peptides P1 and P2 according to the invention showed no significant effects of the peptides on the proliferation (FIG. 6A).
  • the SEB-induced proliferation was neither significantly modified by the peptides alone (FIG. 6A) nor by the costimulation with SEB + peptide PI (FIG. 6B).
  • the SEB-induced lymphocyte proliferation was inhibited only in high concentrations (FIG. 6B).
  • the intracellular IFN ⁇ (FIG. 7) and IL-4 production after stimulation with SEB and the peptides P1 and P2 according to the invention were examined (FIG. 7).
  • Example 7 Effect of the peptides on secretory cytokine production
  • Peripheral blood lymphocytes from healthy voluntary donors were isolated using a Ficoll gradient and taken up in a concentration of 10 s cells / ml in RPMI 1640 medium + 10% FCS (fetal calf serum). The cells were seeded in 24-well plates and with the beiden- - incubating peptides (200 ⁇ ug / 10 6 cells.) For 2 days in an incubator (37 ° C, 5% C0 2). The supernatants were then collected and first frozen at -20 ° C.
  • the human TH1 cytokines IL-2, IFN ⁇ and TNF ⁇ as well as the TH2 cytokines IL-4, IL-5 and IL-10 were in the cell culture supernatant with the "Cytometric Bead Array (CBA)" ⁇ from the company B&D (Heidelberg) The test was carried out exactly according to the manufacturer's instructions.
  • CBA Cytometric Bead Array
  • Pl mainly inhibits the spontaneous production of the TH1 cytokines IL-2 and IFN ⁇ , while P2 inhibits TNF ⁇ more strongly.
  • Peptide 2 induces the synthesis of TH2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-10) in healthy volunteers, while PI also completely inhibits the synthesis of IL-4 and IL-5.

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Abstract

Die Erfindung betrifft insbesondere Peptide, die spezifisch IgE-Antikörper zu binden vermögen und die beispielsweise aus dem natürlich vorkommenden S. aureus Enterotoxin B (SEB) er­hältlich sind. Ihre immunmodulatorischen Eigenschaften unter­scheiden sich erheblich von denen des bakteriellen SEB. Die erfindungsgemässen Peptide induzieren im Gegensatz zu SEB überraschenderweise keine Proliferation von T-Zellen. Aufgrund ih­rer Eigenschaften sind die Peptide für die Therapie von Er­krankungen geeignet, die durch einen erhöhte Serum-IgE-Spiegel und/oder eine vermehrte Produktion von Interferon-gamma cha­rakterisiert sind, sowie für die Therapie von Erkrankungen, die durch ein Ungleichgewicht von Th1- und Th2-Immunantwort charakterisiert sind, wie z.B. Atopisches Ekzem, Lupus ery­thematodes, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, Psoriasis, rheu­matoide Arthritis.

Description

Immunmodulierendes Peptid aus S. aureus Enterotoxin B
Die Erfindung betrifft insbesondere Peptide, die spezifisch IgE-Antikörper zu binden vermögen und die beispielsweise aus dem natürlich vorkommenden S. aureus Enterotoxin B (SEB) erhältlich sind. Ihre immunmodulatorischen Eigenschaften unterscheiden sich erheblich von denen des bakteriellen SEB. Die erfindungsgemäßen Peptide induzieren im Gegensatz zu SEB überraschenderweise keine Proliferation von T-Zellen. Aufgrund ihrer Eigenschaften sind die Peptide für die Therapie von Erkrankungen geeignet, die durch einen erhöhte Serum-IgE-Spiegel und/oder eine vermehrte Produktion von Interferon-gamma charakterisiert sind, sowie für die Therapie von Erkrankungen, die durch ein Ungleichgewicht von Thl- und Th2-Immunantwort charakterisiert sind, wie z.B. Atopisches Ekzem, Lupus ery- thematodes, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, Psoriasis, .rheumatoide Arthritis.
Staphylococcus aureus ist ein weit verbreiteter pathogener Mikroorganismus, der eine Vielzahl von schweren Infektionskrankheiten auslösen kann. S. aureus produziert Enterotoxine (Enterotoxin A, B, C, D, E und TSST-1) und Endotoxine (Koagu- lase, Staphylokinase, Lipase, Hyaluronidase, DNAse) . Aufgrund der Entwicklung multipler Resistenzen gegenüber verschiedenen Antibiotika hat S. aureus in den letzten Jahren eine große Bedeutung al_s_ Erreger von Krankenhausinfektionen erlangt,.
Die von S. aureus produzierten Enterotoxine (SE) können beim Menschen u.a. Lebensmittelvergiftungen und einen septischen Schock auslösen [Marrack, P. & Kappler, J. (1990) , Science 248, 705] .
Es handelt sich um mittelgroße Proteine (20-30 kD) , die sich hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenzen sehr ähnlich sind. So beträgt die Übereinstimmung zwischen Staphylokokken-Entero- toxin A (SEA) und Staphylokokken-Enterotoxin E (SEE) über 90 % [Marrack, P. & Kappler, J. (1990), Science 248, 705].
Das Interesse an den immunologischen Eigenschaften dieser To- xine stieg beträchtlich, nachdem entdeckt wurde, daß sie bereits in Konzentrationen von 10r13 M - 10"16 M zu den stärksten Induktoren einer Lymphozytenproliferation zählen und sich diese Proliferation auf die T-Zellen beschränkt [Fleischer, B. & Schrezenmeier, H. (1988), J. Exp. Med. 167, 1697].
Die Aufklärung der genauen Stimulationsmechansimen begann mit der Beobachtung, daß SEs hochgereinigte T-Zellen nicht stimulieren, sondern daß die toxininduzierte Proliferation von der Anwesenheit akzessorischer Zellen, Monozyten oder B-Lympho- zyten, abhängig ist. Im Gegensatz zu gewöhnlichen Antigenen werden die Enterotoxine jedoch nicht prozessiert und in der Antigen-Bindungsstelle des MHC-II-Moleküls präsentiert, sondern sie kreuzvernetzen den MHC-II-Komplex auf Monozyten oder B-Zellen mit dem T-Zell- Rezeptor [Herrmann, T. et al. (1992), Eur. J. I munol . 22, 1935] .
Die Bindungsaffinität der Enterotoxine zu verschiedenen MHC- II-Proteinen des Menschen ist unterschiedlich. Die meisten SEs -binden bevorzugt^ an- HLA=DR,- weniger stark an DQ und praktisch überhaupt nicht an DP [Fleischer, B. (1991) , Jmmun. Infekt . 19, 8] . Der Grund für die massive, im Gegensatz zu Lektinen wie Concanavalin A jedoch limitierte T-Zell-Stimulation ist die spezifische Bindung der SEs an die Außenseite der Vß-Kette des T-Zell-Rezeptors (TZR) . Die anderen Komponenten des T- Zell-Rezeptors, die sog. Vg- , J- oder D-Segmente, sind keine Bindungsstellen für SEs. Da nur T-Lymphozyten mit einer bestimmten Vg-Kette des TZR durch bestimmte SEs stimuliert werden, bezeichnet man die Toxine als Antigene und nicht als Mi- togene .
Da jedoch die Zahl der zirkulierenden T-Zellen, die durch ein bestimmtes Toxin stimuliert werden können, deutlich größer ist als die Zahl der T-Lymphozyten, die für ein konventionelles Antigen spezifisch sind, werden SEs als „Superantigene" bezeichnet [Marrack, P. & Kappler, J. (1990) , Science 248, 705] .
Je nach Häufigkeit der Vß-Populationen können in vivo 5 - 30% des zirkulierenden T-Zell-Repertoires durch bakterielle Superantigene stimuliert werden [Choi, Y. (1990), ". Exp. Med. 172, 981] . Diese T-Zell-Stimulation induziert eine Fülle komplexer pathophysiologischer Mechanismen, die zur Zeit noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Im Tiermodell, aber auch beim Menschen, führt die Intoxikation mit Superantigenen zu sy- stemischen Reaktionen, die von Fieber bis zum kardiovaskulären Schock reichen können [Fleischer, B. (1991) , Immun. Infekt . 19, 8] . Tabelle 1 zeigt die durch Enterotoxine von S. aureus induzierten immunologischen Reaktionen. Diese Reaktionen werden wahrscheinlich durch komplexe immunologische Vorgänge ausgelöst. Die Bindung der Toxine an den MHC-II-Komplex und den TZR führt zur Proliferation, Freisetzung von Zytokinen und anderen Mediatoren und zur Antikörperproduktion (Tabelle 1) . Au- sserdem wird das "cutaneous lymphocyte-associated antigen" (CLA) , das die Rezirkulation von T-Zellen in die Haut steuert, verstärkt -exprimiert [Zöllner, - T.M.- (1996), Immunol.. Letters- 49, 111] .
Tabelle 1:
Toxin Immunologischer Effekt
SEB Aktivierung von Suppressor-Zellen
SEA-SEE Antikörpe roduktion
SEA, SEB, TSST-1 Zytotoxizität und Antitumor- Wirkung
Zytokinsynthese:
SEB, TSST-1 IL-1
SEA, SEB, SEC, TSST-1 IL-2
SEA, SEB IL-4
SEA, SEB, TSST-1 IFNγ
SEA,SEB,SEC1,TSST-1 TNF
SEA, SEB Stimulation von NK-Zellen
SEA, SEB, SED T-Zell-Anergie
SEB Apoptosis
Tab. 1: Durch S. aureus Enterotoxine induzierte immunologische Reaktionen. Nach dieser hyper eaktiven Phase gehen die Superantigen- stimulierten T-Zellen in einen anergischen Zustand über, so daß es zu einer massiven Immunsuppression kommen kann. Andererseits können autoreaktive, aber anerge T-Zellen aktiviert werden, die dann Autoimmunkrankheiten auslösen. Bei der multiplen Sklerose [Hafler, D.A. (1988), J. Exp. Med. 167, 1313] und der rheumatoiden Arthritis [Palliard, X. (1991) , Science 253, 325] wurde bereits eine oligoklonale Selektion bestimmter VE-Ketten nachgewiesen, die auf einen Superantigen-vermittelten Pathomechanismus dieser Erkrankungen hindeutet.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß SEB die IgE-Synthese und die Produktion von Interleukin-4 bei Patienten mit atopi- schem Ekzem verstärkt [Neuber, K, (1993), Hautarzt 44, 135; Ring, J. et al. (1992), Allexgy 47, 265; Neuber, K. et al. (1995), Int . Arch. Allergy Im unol . 107, 179]. Ausserdem konnte eine ekzemauslösende Wirkung für SEB im Epikutantest nachgewiesen werden [Hofer, M.F. (1999), J. Invest . Dermatol . 112, 171] .
Das atopische Ekzem gehört wie die allergische Rhinokonjunkti- vitis und das allergische Asthma bronchiale zu den Erkrankungen, bei denen eine pathologisch verstärkte IgE-Synthese auftritt. Diese Erkrankungen sind bisher nur symptomatisch zu behandeln, d.h. die Unterdrückung der IgE-Synthese erfolgt unspezifisch durch die Suppression der an der Synthese beteiligten T-Lymphozyten. Die am häufigsten systemisch eingesetzten Medikamente sind dabei Cortison oder Cyclosporin A. Diese Substanzen bewirken häufig sehr schwere systemische Nebenwirkungen (Hautatrophie, Diabetes, Hypertonie, Nieren- und Hepatoto- xizität u.a.). Durch eine spezifische Modulation der überhöhten IgE-Synthese würden sich derart schwere Nebenwirkungen vermeiden lassen. Das gleiche gilt auch für Erkrankungen, die mit einer vermehrten Interferon-gamma-Synthese der Lymphozyten einhergeht . Ein gutes Beispiel für einen solchen Zustand stellt die Psoriasis vulgaris dar. Bei dieser Erkrankung pro- duzieren T-Zellen vermehrt Interferon-gamma und induzieren dadurch die Hyperproliferation der Epidermis. Zur Therapie der Psoriasis werden ebenfalls Immunsuppressiva wie Cortison oder Cyclosporin A zur Therapie verwendet. Die selektive Hemmung der Zytokinproduktion würde in diesem Fall ebenfalls die Nebenwirkungsrate deutlich verringern.
Bei einer Reihe von Erkrankungen ist ursächlich eine pathologische Thl- oder eine abgeschwächte Th2-Reaktion nachgewiesen worden oder wird diskutiert (vergleiche auch Tabelle 2) . Tierexperimentelle— Befunde -lassen vermuten,— dass — bei diesen.
Erkrankungen eine Umstimmung der Immunantwort in Richtung Th2 protektiv wirkt. Zu nennen sind hier organspezifische Autoimmunkrankheiten wie Multiple Sklerose [Shevach, E.M. et al. (1999), Springer Semin. Immunopathol. 21, 249-262; Leonard, J.P. et al. (1997), Grit. Rev. Immunol . 17, 545-553], autoimmune Uveitis [Singh, V.K. et al. (1999), Immunol . Res. 20, 147-161; Sun, B. et al. (1999), Int . Immunol . 11, 1307-1312; Egwuagu, C.E. et al. (1999), J. Immunol . 162, 510-517], Insulinpflichtiger Diabetes mellitus [Rabinovitch, A. et al. (1998), Biochem. Phar acol . 55, 1139-1149] , rheumatoide Arthritis [Muller, B. et al. (1998), Springer Semin. Immunopathol . 20, 181-196], Behcet's Syndrom [Frassanito, M.A. et al. (1999) , Arthritis Rheum. 42, 1967-1974] weiterhin die Helicobacter pylori-Infektion (die Ursache u.a. von Magenulcus und atrophischer Gastritis) [Smythies, L.E. et al. (2000), J. Immunol . 165, 1022-1029; Fox, J.G. et al. (2000), Nat . Med. 6, 536-542; Mattapallil, J.J. et al. (2000), Gastroenterology 118, 307-315], entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und andere [Romagnani, P. et al. (1997), Curr. Opin. Immunol . 9, 793-799; MacDonald, T.T. (1999), Curr. Top. Microbiol . Immunol . 236, 113-135], die akute Organtransplantat-Abstoßungsreaktion [Morelli, A.E. et al. (2000), Transplantation 69, 2647-2657] und spontane rekurrente Aborte [Jenkins, C. et al. (2000), Fertil . Steril . 73, 1206-1208]. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines neuen Wirkstoffs, der sich zur Behandlung von Erkrankungen eignet, die durch einen erhöhten IgE-Spiegel und/oder eine verstärkte Interferon-gamma-Produktion charakterisiert sind und der die im Stand der Technik bekannten Nachteile nicht aufweist. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, Wirkstoffe bereitszustellen, die sich zur Therapie von Erkrankungen eignen, die durch ein Ungleichgewicht des Verhältnisses von Thl- und Th2-Immunantwort charakterisiert sind.
Im- -Rahmen- der vorliegenden—Erfindung—wurde -nunmehr - überraschenderweise festgestellt, daß sich aus dem natürlich vorkommenden S. aureus Enterotoxin B (SEB) Peptide isolieren lassen, die die oben genannten Aufgaben lösen.
Insbesondere läßt sich ein Peptid isolieren, welches in der Lage ist, spezifisch IgE-Antikörper zu binden. Dabei unterscheiden sich seine immunmodulatorischen Eigenschaften überraschenderweise erheblich von denen des bakteriellen SEB. Das erfindungsgemäße Peptid, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 10 dargestellt ist, induziert im Gegensatz zu SEB überraschenderweise keine Proliferation von T-Zellen und hemmt aber andererseits die Interferon-gamma-Synthese stimulierter T- Lymphozyten. Aufgrund seiner Eigenschaften ist das Peptid für die Therapie von Erkrankungen geeignet, die durch erhöhte Serum-IgE-Spiegel und/oder vermehrte Produktion von Interferon- gamma charakterisiert sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den Erkrankungen um die allergische Rhinokonjunktivitis, das allergische Asthma bronchiale sowie die Psoriasis vulgaris.
Neben dem erfindungsgemäßen Peptid wurden weitere erfindungsgemäße Peptide hergestellt, die dieselben oder im wesentlichen dieselben biologischen und/oder immunologischen Eigenschaften aufweisen. Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften, d.h. Bindung von IgE-Antikörpern und Hemmung der Interferon-gamma- Synthese ohne Induktion der T-Zell-Proliferation, sind die erfindungsgemäßen Peptide besonders zur Behandlung von Erkrankungen geeignet, die mit einer erhöhten IgE-Synthese und vermehrter Interferon-gamma-Synthese einhergehen, wie es zum Beispiel beim atopischen Ekzem (Neurodermitis) der Fall ist. Dieser Zustand ist bei der chronischen Verlaufsform des atopischen Ekzems beschrieben worden. Dabei finden sich vermehrt Interferon-gamma-produzierende T-Lymphozyten in der Haut und erhöhte Serum-IgE-Werte. Die therapeutische Wirkung der Peptide könnte entweder direkt durch eine inaktivierende Bindung an das IgE -erfolgen- oder aber indirekt- durch_die- Modulierung der Zytokinproduktion der T-Lymphozyten. In diesem Zusammenhang kommt auch die Hemmung weiterer Zytokine wie IL-4 und IL-13 in Betracht, von denen bekannt ist, daß sie die IgE-Synthese stimulieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Polypep- tid, das die N-terminale Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 aufweist und durch Trypsin-Spaltung von S. aureus Enterotoxin B als 12 kD-Spaltfragment erhältlich ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Polypeptid (im folgenden als Peptid Pl bezeichnet), das die in SEQ ID NO: 10 angegebene Aminosäuresequenz aufweist und das in vi tro die Synthese von Interferon-gamma durch stimulierte T-Lymphozyten hemmt.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung Homologe und Derivate der vorgenannten Polypeptide, die an IgE binden. Bei den homologen Polypeptiden handelt es sich um solche Substanzen, die sich aber von den vorgenannten Aminosäuresequenzen, insbesondere von der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10, infolge des Aus- tauschs einer oder mehrerer Aminosäuren oder durch Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden, wobei sie eine Sequenzhomologie von etwa 50 bis 99 %, vorzugsweise von mindestens etwa 75 % aufweisen. Eine Sequenzhomolo- gie von mindestens 85 % ist besonders bevorzugt. Unter einem Derivat werden erfindungsgemäß solche Polypeptide verstanden, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren der vorgenannten Sequenzen, insbesondere der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10, durch ein Stereoisomer (d.h. Austausch von einer oder mehreren L- Aminosäuren durch D-Aminosäuren) oder eine entsprechende, modifizierte Aminosäure ausgetauscht sind. Unter modifizierten Aminosäuren werden solche Aminosäuren verstanden, deren Seitenketten im Vergleich zu natürlich vorkommenden Aminosäuren chemisch verändert sind, beispielsweise durch Glykosylierung,
Phosphorylierung,—-Methylierung- -usw—. -Derartige Modifikationen sind dem Fachmann wohlbekannt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Homologen und Derivate, die IgE binden, die selben oder im wesentlichen die selben Eigenschaften auf wie das vorgenannte Peptid gemäß SEQ ID NO: 10, d.h. sie hemmen in vitro die Synthese von Interferon-gamma stimulierter T-Lymphozyten und/oder sie induzieren nicht die Proliferation von T-Lymphozyten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das Homologe (im folgenden als Peptid P2 bezeichnet) die in SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz auf.
Die Erfindung schließt auch Polypeptide mit einer Länge von mehr als 9 Aminosäuren ein, die die in SEQ ID NO: 10 oder 11 angegebene Aminosäuresequenz enthalten und in vitro die Synthese von Interferon-gamma durch stimulierte T-Lymphozyten hemmen.
Ferner betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das eine für ein vorgenanntes Polypeptid kodierende Nukleinsäurese- quenz enthält. Vorzugsweise weist es die in SEQ ID NO: 9 angegebene Nukleinsäuresequenz auf . Das Nukleinsäuremolekül kann verwendet werden, um die Sequenz in einen Expressionsvektor einzuklonieren und das erfindungsgemäße Peptid rekombinant herzustellen. Diese Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Peptide, insbesondere Pl und P2, in der Lage sind, das Verhältnis zwischen Thl- und Th2-Zellen und damit auch das Verhältnis der entsprechenden Zytokine zu beeinflussen.
.Tabelle_2-:
TH1-Übergewicht TH2-Übergewicht Psoriasis vulgäris Atopisches Ekzem
Autoimmune Uveitis Allergisches Asthma
Allergisches Kontaktekzem Allergische Rhinokonjunktivitis
Behcet's Syndrom Colitis ulcerosa
Diabetes mellitus Morbus Basedow
Hashimoto Thyreoiditis Multiple Sklerose (Myelinreak¬
Heliobacter pylori-Infektion tive Autoantikörper)
Lupus erythematodes Mycosis fungoides
Morbus Crohn
Multiple Sklerose (Aktivierung von Astrozyten)
Organtransplantat-Abstoßungs- reaktion
Psoriasis arthropathica
Rheumatoide Arthritis
Spontane, rekurrente Aborte
Tab. 2: Erkrankungen mit einem Ungleichgewicht des TH1-/ TH2-Ver- hältnisses, die für eine Therapie mit den Peptiden geeignet sind.
Aufgrund der immunologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Proteine und Polypeptide eignen sich diese in besonderem Maße zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion oder Verstärkung einer Thl- oder Th2-Immunantwort durch Verstärkung der Th2- bzw. Senkung der Thl-Antwort und umgekehrt, insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer (überwiegenden) Th2- oder Thl-Immunantwort einhergehen. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Erkrankungen um Erkrankungen aus der Gruppe bestehend aus Multipler Sklerose, autoimmuner Uveitis, Diabetes mellitus, rheumatoider Arthritis, Behcetλs Syndrom, Helicobacter pylori-Infektion, entzündlichen Darmerkrankungen (-insbesondere- Morbus -Crohn) ,- akuter—Organtransplantat-Abstos- sungsreaktion und spontanen rekurrenten Aborten.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung eines Poly- peptids, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10 aufweist oder enthält, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation und zur Hemmung der Zytokinproduk- tion von Lymphozyten, insbesondere T-Lymphozyten. Eingeschlossen ist ferner die Verwendung eines solchen Polypeptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer verstärkten Produktion von Zytokinen (wie z.B. Interferon-gamma) und/oder einem erhöhten Spiegel von IgE-Antikörpern einhergehen. Bei den Ekran- kungen handelt es sich insbesondere um Atopisches Ekzem (insbesondere in der chronischen Verlaufsform) , Asthma bronchiale, Rhinokonjunktivitis allergica, Psoriasis, Rheumatoide Arthritis oder Multiple Sklerose. Weitere Erkrankungen sind in Tabelle 2 genannt. Gemäß einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Zytokin um Interferon-gamma, Interleukin- 4 (IL-4) , Interleukin-5 (IL-5) , Interleukin-10 (IL-10) , Inter- leukin-12 (IL-12) und/oder Interleukin-13 (IL-13) .
Die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung eines oben beschriebenen Polypeptids ein, das eine zu SEQ ID NO: 10 homologe oder davon abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist. Hin- sichtlich der homologen oder davon abgeleiteten Sequenzen wird auf die obige Definion der „Homologen" und „Derivate" Bezug genommen, wobei insbesondere solche IgE-bindenden Polypeptide eingeschlossen sind, die die Proliferation von T-Lymphozyten nicht induzieren und/oder in vitro die Synthese von Interferon-gamma durch stimulierte T-Lymphozyten hemmen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist das verwendete Polypeptid die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 11 auf. Soweit die Erfindung die Verwendung von Polypeptiden betrifft, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 11 oder dazu homologe—oder_davon -abgeleitete -Sequenzen. mit, den„selben_oder_im_we- sentlichen den selben biologischen oder immunologischen Eigenschaften als Teil einer längeren Aminosäuresequenz enthalten, sind Polypeptide mit einer Länge von bis zu 30 Aminosäuren, insbesondere mit einer Länge von bis zu 15 Aminosäuren, bevorzugt.
Aufgrund seiner besonderen biologischen Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Polypeptide zur in vitro-Hemmung der Interferon-gamma-Produktion in Lymphozyten, insbesondere in humanen, periphären T-Lymphozyten des Blutes.
Die erfindungsgemäßen Peptide modulieren sowohl die stimulierte als auch die spontane Zytokinproduktion von TH1- und TH2-Lymphozytensubpopulationen. Für die Richtung der Peptid- induzierten Effekte scheint der endogene Aktivierungsstatus der Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Bei Patienten mit atopischem Ekzem wird eine Hemmung der endogen gesteigerten Synthese aller Zytokine durch das erfindungsgemäße Peptid Pl beobachtet. Mittlerweile ist bekannt, daß nicht nur die TH2-Zytokine bei diesen Patienten erhöht sind, sondern daß gerade bei der chronisch-stationären Verlaufsform eine gesteigerte IFNγ-Produktion beobachtet wird. Besonders das erfindungsgemäße Peptid Pl ist in der Lage, nicht nur die TH2- Zytokinsynthese der Lymphozyten dieser Patienten zu hemmen, sondern auch die IFNγ-Produktion, was von erheblicher therapeutischer Relevanz ist, z.B. durch Abschwächung der Symptome bis zur Heilung.
Bei Psoriatikern ist die Induktion einer massiv gesteigerten IL-10-Ausschüttung durch die erfindungsgemäßen Peptide von besonderem Interesse. Es gibt verschiedene Hinweise, daß IL-10 das klinische Erscheinungsbild der Psoriasis günstig beein- flußen kann. Der gezielte Effekt der erfindungsgemäßen Peptide auf die IL-10-Produktion der Lymphozyten von Psoriatikern ist hier in—der- Interaktion-mit- den Effekten-auf—die -anderen Zytokine von besonderer therapeutischer Bedeutung, z.B. durch Abschwächung der Symptome bis zur Heilung.
Die differenzierten Effekte der erfindungsgemäßen Peptide auf die spontane bzw. endogene Zytokinsynthese bei verschiedenen pathologischen Aktivierungszuständen des Immunsystems zeigen, daß die Peptide immunmodulatorische Wirkung auch gegenüber anderen durch Veränderungen des TH1-/TH2-Gleichgewichts bedingte Erkrankungen (Tabelle 2) zeigen.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein oder mehrere erfindungsgemäße Polypeptide und gegebenenfalls ferner einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält.
Das aus SEB isolierte Peptid ist dadurch erhältlich, daß man Enterotoxin B aus S. aureus mit Trypsin verdaut und man anschließend das 12 kD-Fragment aus dem Reaktionsansatz isoliert. Alternativ sind selbstverständlich auch gentechnische Methoden der Herstellung möglich, indem man die in SEQ ID NO: 9 gezeigte Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor einbringt, man diesen in geeignete Wirtszellen einführt, man die Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die zur Proteinex- pression geeignet sind und man das exprimierte Polypeptid isoliert, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen, einem Sequenzprotokoll und Figuren veranschaulicht .
BEISPIELE
Beispiel 1; Immunoblot zum Nachweis spezifischer IgE-Anti- körper gegen-SEB.
Die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen (SDS-PAGE) wurde nach der Methode von Lughtenberg et al. [Lughtenberg, B. (1975), FEBS Lett . 58, 254] durchgeführt. Es wurden 12,5 % Polyacrylamid-Trenngele verwendet. Zur Bestimmung der Molekulargewichte wurden Standardproteingemische (Fa. Biorad, MW- Standard, 203 kD - 7,5 kD) parallel aufgetrennt. Die Färbung der Proteine erfolgte mit Coomassie-Blue G-250. Im Sammelgel standen 10 Taschen zur Probenaufnahme bereit, wobei die eingesetzte Proteinmenge zwischen 10 und 100 μg lag. Die aufzutrennende Proteinlösung (20 μl) wurde mit 20 μl Probenpuffer gemischt, in die Sammeigeltaschen gefüllt und anschließend mit Elektrodenpuffer überschichtet. Die Elektrophorese wurde in Elektrodenpuffer und bei einem konstanten Stromfluß von 20 mA durchgeführt. Wenn die Bromphenolblau-Bande das Ende des Trenngels erreicht hatte (Laufzeit bis zu 2 h) , wurde die Elektrophorese beendet . Die zu untersuchenden Proteingemische wurden gelelektophoretisch (SDS-PAGE) aufgetrennt und im We- stern-Blot-Verfahren auf Nitrozellulose (Porengröße 0,45 μm) transferiert. Der Transfer erfolgte unter Kühlung in einer Elektro-Blot-Kammer (BioRad, München) unmittelbar nach der Gelelektrophorese für 18-20 h bei einer konstanten Stromstärke von 0,2-0,3 A. Die Nitrozellulose-Blots wurden mit humanem Serum für 4 h auf einem Schwenktisch bei RT inkubiert (Dianova, Hamburg) . Anschließend wurden die Blots fünfmal gewaschen und dann erneut für 4 h bei RT mit einem sekundären Antikörper gegen humanes IgE (anti-human-IgE-Antikörper, Fa. Serva, Heidelberg) inkubiert und die Bindung durch eine enzymatische Farbreaktion sichtbar gemacht.
Das Ergebnis des Immunoblots ist in Figur 1 dargestellt. Mit Hilfe des Immunoblots konnten in Seren von Patienten mit ato- pischem Ekzem„spezifische IgE-Antikörper gegen SEB nachgewie- sen werden.
In den Immunoblots wurden Peroxidase-markierte Antikörper verwendet. Es ist darauf hinzuweisen, daß das in Figur 1 dargestellte Ergebnis des Blots (in eingescannter Form) nicht den tatsächlichen, mit bloßem Auge erkennbaren Farbabstufungen entspricht. Die als Schatten zu erkennenden Banden sind auf dem Originalblot so schwach gegenüber den mit Atopikerseren inkubierten Banden, daß sie als unspezifische Reaktionen gewertet werden müssen.
Beispiel 2; Spaltung von SEB mit Trypsin
SEB (100 μg/100 μl) wurde mit 10 μl Trypsin (4 mg/ml Aqua dest.) über 18 h bei 37° C enzymatisch verdaut. Die Lösung wurde anschließend auf SDS-Gele aufgetragen und die entsprechenden Spaltprodukte getrennt. Die Bedingungen für die Gel- elektrophorese entsprachen den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen. Die Spaltprodukte wurden im Immunoblot mit Seren der in Beispiel 1 genannten Patienten mit atopischem Ekzem inkubiert. Als Kontrolle diente Serum von gesunden Kontrollpersonen. Das Ergebnis des Trypsinverdaus ist in Figur 2 dargestellt. Nach Trypsinspaltung fand sich ein ca. 12 kD großes Spaltprodukt mit dem das IgE aus dem Serum der Patienten mit atopi- schem Ekzem eine im Immunoblot nachweisbare Bindung einging (Figur 2) . Der Nachweis erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben mit dem anti-human-IgE-Antikörper (Fa. Serva, Heidelberg) .
Beispiel 3: Sequenzierung des IgE-bindenden Spaltproduktes
Das als IgE-bindend identifizierte Spaltprodukt mit einem Molekulargewicht -von ca. —12 kD wurde aus- dem-Gel—eluiert—und—anschließend maschinell nach der Methode von P. Edman [Edman, P. (1950) , Acta Chem. Scand. 4, 283] sequenziert, wobei die N- terminale Sequenz KVTAQELDYL ermittelt wurde. Die Sequenz- analyse ergab somit eine Sequenz, die an Position 181 (vom N- terminalen Ende) des SEB-Moleküls beginnt. Figur 3 zeigt das Ergebnis der Sequenzanalyse.
Beispiel 4; Synthese kurzer Peptide
Ausgehend von der ansequenzierten Sequenz des 12 kD-Spaltproduktes wurden mehrere Peptide mit überlappenden Sequenzen vor und nach dem ansequenzierten Bereich hergestellt:
(a) H N G N Q L D K Y R S I T V R V F E (SEQ ID NO: 1)
(b) V R V F E D G K N L L S F D V Q T N K (SEQ ID NO: 2)
(c) V Q T N K K K V T A Q E L D Y L T R H (SEQ ID NO: 3)
(d) Y L T R H Y L V K N K K L Y E F N N S (SEQ ID NO: 4)
(e) E F N N S P Y E T G Y I K F I E N E N (SEQ ID NO: 5)
(f) I E N E N S F W Y D M M P A P G D K F D (SEQ ID NO: 6)
(g) G D K F D Q S K Y L M M Y N D N K M V D (SEQ ID NO : 7) (h) N K M V D S K D V K I E V Y L T T K K K (SEQ ID NO: 8) [Anmerkung: die verwendete "SEQ ID NO:" entspricht der Sequenzkennzahl <400> gemäß WIPO-Standard ST.25.]
Die Peptide mit den Sequenzen (a) bis (h) wurden dann wie in Beispiel 2 beschrieben getestet. Das Peptid (c) zeigte neben dem 12 kD-Spaltprodukt als einziges eine IgE-Bindung.
Die sequenzierte Aminosäuresequenz des Peptids (c) wurde mit Hilfe einer Datenbank (SwissProt) auf mögliche Homologien mit anderen bekannten Molekülen verglichen. Dabei stellte sich heraus,- daß zwischen—jder_„IgE-bindenden Sequenz Peptids und einer Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne des humanen niedrig-affinen IgE-Rezeptors (CD23) eine Homologie von 89 % besteht (vgl. Figur 4) . Mit Hilfe des Smith-Waterman- Algorithmus konnte die Homologie zwischen SEB und CD23 als signifikant (p =0.03) errechnet werden.
Daraufhin wurden zwei weitere Peptide synthetisiert, die die Sequenz QELDYLTRH (Pl; SEQ ID NO: 10) und QEEDFLTLH (P2; SEQ ID NO: 11; entsprechend dem homologen Sequenzabschnitt aus dem CD23-Molekül) aufwiesen.
Diese beiden Peptide wurden dann in den weiteren Experimenten zur Stimulation der Lymphozyten eingesetzt (vgl. Beispiele 6 und 7) .
Beispiel 5; Dotblot zum Nachweis der Bindung von Serum-IσE an die Peptide
Mit Hilfe eines Dotblots konnte gezeigt werden, daß die beiden erfindungsgemäßen Peptide IgE-Antikörper aus dem Serum von Patienten mit atopischem Ekzem binden können. Dazu wurden die Seren von 5 verschiedenen Patienten mit atopischem Ekzem zunächst über Protein G-Säulen vorgereinigt (1 ml, Pharmacia) . Die Seren wurden über 0,8 μm-Spritzenvorsätze vorfiltriert. Anschließend wurde die Säule mit 10 ml Bindungspuffer (20 mM PBS, pH 7,0) „drop to drop" gekoppelt und bei einer Durchflußrate von 1 ml/min gewaschen. Dann wurde jeweils 1 ml Serum filtriert und das Filtrat aufgefangen, sobald es eine leicht gelbliche Farbe angenommen hatte. Es wurde mit 5 ml PBS gewaschen und das Restfiltrat solange gesammelt, bis es klar wurde. Das filtrierte Serum wurde 1:2 in 20 mM PBS verdünnt.
Für die Durchführung des Dotblots wurden jeweils 20 μg der Peptide-Pl -und-P-2 -sowie-1—μg SEB auf eine Membran-gegeben—und- über Nacht getrocknet. Die Membran wurde mit 5 % Magermilch / PBS Tween blockiert. Dann wurden die Seren und eine Positivkontrolle (Sheep anti-SEB-IgG, 10 μl/ml, SERVA) eingesetzt und für 1 h bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Membranen dreimal gewaschen. Zum Nachweis der Serum-IgE-Antikörper wurde Biotin-markiertes Anti-human-IgE (Pharmingen) in einer Konzentration von 4 μg/5 ml für 1 h bei RT inkubiert und die Membran anschließend dreimal gewaschen. Nach einer weiteren Inkubation für 1 h bei RT mit dem Streptavidin-markierten zweitem Antikörper und dreimaligen Waschen wurde die Farbreaktion mit BCIP und NBT als Substrat ausgelöst. Die Ergebnisse des Dotblots sind in Figur 5 dargestellt. Es zeigt sich, daß beide erfindungsgemäßen Peptide mit den Seren 4, 5 und 6 eine schwache, aber eindeutig nachweisbare IgE-Bindung zeigen. Alle Seren zeigten eine IgE-Bindung an SEB.
Beispiel 6; Immunmodulatorische Eigenschaften der Peptide
Periphere Blutlymphozyten (PBMC) von gesunden freiwilligen Spendern wurden über einen Ficollgradienten isoliert und in einer Konzentration von 106 Zellen/ml in RPMI 1640-Medium + 10% FCS (Fötales Kälberserum) kultiviert. Als Stimuli wurden SEB (1 μg/106 Zellen) und das Peptid (5 μg/106 Zellen) verwendet. Die Proliferation der Zellen und die intrazelluläre Produktion von Interferon-gamma und Interleukin-4 wurde durchflußzytome- trisch nach 2 Tagen Inkubation bei 37°C und 5% C02 gemessen. Nachdem die peripheren Blutlymphozyten über eine Ficoll-Paque- Gradientenzentrifugation isoliert wurden, wurde die Zellzahl auf 2 x 106 Zellen/ml eingestellt. Die Zellen wurden in konischen 15 ml-Polypropylengefäßen aufgenommen und dann im Brutschrank für 2 Tage inkubiert. Für die Proliferation wurden die PBMC in den letzten 5 h der Inkubationszeit mit 60 μM Bromo- deoxyuridin (BrdU) inkubiert. Für die Messung der intrazellu- - lären—Zytokine—urde—für—die—letzten _5- h-Brefeidin-A__(.BFA.,_20_ μl/ 1 ml PBMC) hinzugegeben. Dann wurden 20 mM EDTA (100 μl/l ml PBMC) hinzugegeben und danach 10 ml kaltes PBS. Nach Zen- trifugation wurden 3 ml „FACS Lysing Solution" (BD Bioscience, Heidelberg) zu den Zellen gegeben und nach einem Waschschritt die „FACS Permeabilisierungslösung" (BD Bioscience, Heidelberg) . Anschließend wurden zum Zellpellet Anti-BrdU-FITC-Anti- körper mit DNase (Proliferation) oder anti-Zytokin-Antikörper (intrazelluläre Zytokinbestimmung) hinzugegeben und für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und mit 200 μl 1% Paraformaldehyd fixiert. Die Fluoreszenz wurde am Durchflußzytometer (FACScan, BD Bioscience) gemessen und ausgewertet .
Die Proliferation wurde durch den Einbau von BrdU in Lymphozyten am Durchflußzytometer bestimmt. Die Inkubation der Lymphozyten mit unterschiedlichen Konzentrationen der erfindungs- gemäßen- Peptide Pl und P2 zeigte keine signifikanten Effekte der Peptide auf die Proliferation (Fig. 6A) . Die SEB-induzierte Proliferation wurde weder durch die Peptide alleine (Fig. 6A) noch die Kostimulation mit SEB + Peptid Pl (Fig. 6B) wesentlich modifiziert. Lediglich in hohen Konzentrationen zeigte sich eine Hemmung der SEB-induzierten Lymphozytenpro- liferation (Fig. 6B) . Im nächsten Schritt wurde die intrazelluläre IFNγ- (Fig. 7) und IL-4-Produktion nach Stimulation mit SEB und den erfindungsgemäßen Peptiden Pl und P2 untersucht (Fig. 7) . Dabei zeigte sich, daß Pl stärker als P2 die Produktion von IFNγ, einem Zytokin, das eine Vielzahl von immunologischen Funktionen vermittelt, dosisabhängig supprimiert (Fig. 7A) , und daß IL-4 (Fig. 7B) dosisabhängig stimuliert wird. Die in diesen Experimenten untersuchten Lymphozyten stammten von gesunden Probanden. Dementsprechend wurde das Verhältnis zwischen IFNγ und II- 4 durch die Peptide dosisabhängig zu Gunsten der IL-4- produzierenden TH2-Lymphozyten verändert (Fig. 7C) .
Beispiel 7: Effekt der Peptide auf die sekretorische Zytokin- produktion
Periphere Blutlymphozyten von gesunden freiwilligen Spendern wurden über einen Ficollgradienten isoliert und in einer Konzentration von 10s Zellen/ml in RPMI 1640-Medium + 10% FCS (Fötales Kälberserum) aufgenommen. Die Zellen wurden in 24- Loch-Platten ausgebracht und mit den beiden- - Peptiden (200.^ μg/106 Zellen) für 2 Tage im Brutschrank (37°C, 5% C02) inkubiert . Danach wurden die Überstände gesammelt und zunächst bei -20°C eingefroren. Die humanen TH1-Zytokine IL-2, IFNγ und TNFα sowie die TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 wurden im Zell- kulturüberstand mit dem „Cytometric Bead Array (CBA) "~ der Firma B&D (Heidelberg) gemessen. Der Test wurde exakt nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
In einer ersten Serie von Experimenten wurden die Effekte der erfindungsgemäßen Peptide Pl und P2 auf die spontane Zytokin- sekretion peripherer Blutlymphozyten gesunder Probanden (n=3) untersucht. Figur 8 zeigt die Effekte auf die THl-Zytokine (IL-2, IFNγ, TNFα) und auf die TH2-Zytokine (IL-4, IL-5, IL- 10) .
Es zeigte sich, daß Pl vor allem die spontane Produktion der TH1-Zytokine IL-2 und IFNγ hemmt, während P2 stärker TNFα inhibiert. Peptid 2 induziert bei gesunden Probanden die Synthese von TH2-Zytokinen (IL-4, IL-5, IL-10) , während Pl auch die Synthese von IL-4 und IL-5 vollständig hemmt.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, daß Pl und P2 das Verhältnis von TH1- und TH2-Zytokmen beeinflüßen.
Deshalb wurde im nächsten Schritt dasselbe Experiment mit pe- ripheren Blutlymphozyten von Patienten mit einem schweren ato- pischen Ekzem (TH2 > TH1) bzw. einer schweren Psoriasis vulga- ris (TH1 > TH2) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Figuren 9 und 10 dargestellt.
Es zeigte sich, daß bei Patienten mit atopischem Ekzem bzw. mit Psoriasis vulgaris z.T. gegenläufige Effekte auf die bereits endogen veränderte spontane Zytokinsekretion auftre^ ten. Bei Patienten mit atopischem Ekzem (Fig. 9) war die spontane Produktion aller Zytokine, d.h. sowohl der TH1- als auch der TH2-Zytokine deutlich erhöht. Pl hemmt bei diesen Patienten die erhöhte Zytokinproduktion aller TH-Populationen, besonders aber auch hier die- IFNγ-Synthese, die bei chronischem atopischem Ekzem erhöht ist.
Bei den Patienten- mit Psoriasis vulgaris zeigte sich eine-mas- sive Stimulation der IL-10- und der IL-5-Synthese durch Pl (Fig. 10) .

Claims

Patentansprüche;
1. Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 10 angegebenen Aminosäuresequenz .
2. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die N- terminale Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 aufweist und durch Trypsin-Spaltung von S. aureus Enterotoxin B als 12 kD-Spaltfragment erhältlich ist.
3. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Homologes oder ein Derivat des Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 ist, das an IgE bindet.
4. Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Derivat ein oder mehrere L-Aminosäuren durch D- Aminosäuren ausgetauscht sind.
5. Polypeptid nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß es die Proliferation von T-Lymphozyten nicht induziert.
6. Polypeptid nach den Ansprüchen 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in vitro die Synthese von Interferon- gamma stimulierter T-Lymphozyten hemmt.
7. Polypeptid nach. den Ansprüchen 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in vi tro sowohl die stimulierte als auch die spontane Zytokinproduktion von Thl- und Th2-Lympho- zytensubpopulationen moduliert .
8. Polypeptid nach den Ansprüchen 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz aufweist .
9. Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine für ein Polypeptid nach den Ansprüchen 1 bis 8 kodierende Nukleinsäuresequenz aufweist.
10. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO: 9 angegebene Nukleinsäuresequenz aufweist .
11. Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ -I-D NO: 10, eine- dazu homologe oder -davon- abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation.
12. Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation.
13. Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung der Zytokinproduktion von Lymphozyten.
14. Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung der Zytokinproduktion von Lymphozyten.
15. Verwendung nach Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphozyten T-Lymphozyten sind.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin Interferon-gamma, Interleukin-4 (IL-4) , In- terleukin-5 (IL-5) , Interleukin-10 (IL-10) , Interleukin- 12 (IL-12) und/oder Interleukin-13 (IL-13) ist.
17. Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer verstärkten Produktion von Zytokinen und/oder einem erhöhten Spiegel von IgE-Antikörpern einhergehen.
18. Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer verstärkten Produktion von Zytokinen und/oder einem erhöhten Spiegel von IgE-Antikörpern einhergehen.
19. Verwendung nach Anspruch 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin Interferon-gamma, Interleukin-4 (IL- 4) , Interleukin-5 (IL-5) , Interleukin-10 (IL-10) , Inter- leukin-12 (IL-12) und/oder Interleukin-13 (IL-13) ist.
20. Verwendung nach Anspruch 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung Atopisches Ekzem, Asthma bronchiale, Rhinokonjunktivitis allergica, Psoriasis, Rheuma- toide Arthritis oder Multiple Sklerose ist.
21. Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion oder Verstärkung einer Thl- oder Th2-Immunantwort .
22. Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion oder Verstärkung einer Thl- oder Th2-Immunantwort
23. Verwendung nach den Ansprüchen 21 und 22 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer Thl- oder Th2-Immunantwort einhergehen.
-24.—Verwendung—nach den- Ansprüchen -21 - bis -23-,--dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung Psoriasis vulgaris, autoimmune Uveitis, Allergisches Kontaktekzem, Behcet"s Syn- drom, Diabetes mellitus, Hashimoto Thyreoiditis, Helio- bacter pylori-Infektion, Lupus erythematodes, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, Organtransplantat-Abstoßungs- reaktion, Psoriasis arthropathica, Rheumatoide Arthritis und spontane, rekurrente Aborte.
25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet ,daß die entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn ist.
26. Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur in vitro-Hemmung der Interferon-gamma-Produktion in humanen, periphären T-Lymphozyten des Blutes.
27. Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur in vitro-Hemmung der Interferon-gamma-Produktion in humanen, periphären T-Lymphozyten des Blutes.
28. Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur in vitro-Modulation der stimulierten und der spontanen Zytokinproduktion von Thl- und Th2-Lymphozytensubpopula- tionen.
29. Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur in vi ro-Modulation der stimulierten und der spontanen Zytokinproduktion von Thl- und Th2-Lymphozyten- subpopulationen.
30. Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 29, dadurch gekennzeichnet,—daß—das- Polypeptid -ein-Polypeptid—mit-einer- von SEQ ID NO: 10 abgeleiteten Sequenz ist, bei der ein oder mehrere L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren ausgetauscht sind.
31. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Polypeptid nach den Ansprüchen 1 bis 8 enthält.
32. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält.
33. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß man die in SEQ ID NO: 9 gezeigte Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor einbringt, man diesen in geeignete Wirtszellen einführt, man die Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die zur Proteinexpression geeignet sind und man das exprimierte Polypeptid, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird, isoliert.
34. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch
2, dadurch gekennzeichnet, daß man Enterotoxin B aus S. aureus mit Trypsin verdaut und man anschließend das 12 kD-Fragment aus dem Reaktionsansatz isoliert.
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