DE69433115T2

DE69433115T2 - Verfahren zur isolierung von cda-präsentierten antigenen, cd1-präsentierte antigeneenthaltende impfstoffe und in besagten verfahren verwendbare zelllinien

Info

Publication number: DE69433115T2
Application number: DE69433115T
Authority: DE
Inventors: Steven A. Porcelli; Michael B. Brenner; Evan Beckman
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 1993-06-21
Filing date: 1994-06-21
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2014-06-22
Also published as: DK0751780T3; DE69433115D1; EP0751780B1; WO1995000163A1; JPH08511939A; EP0751780A4; JP2006104206A; CA2165786A1; ATE248602T1; ES2201078T3; EP0751780A1

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung ist eine Teilfortsetzung von U.S. Patent 5.679.347 (U.S. Nr. 08/080.072, eingereicht am 21. Juni 1993), das eine Teilfortsetzung von U.S. Nr. 07/989.790 ist, eingereicht am 10. Dezember 1992, und nun zurückgezogen ist.
Erfindungsgebiet
Die hier offengelegte Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines CD1-präsentierten Antigens in einer Probe, Verfahren zur Isolierung CD1-präsentierter Antigene aus einer Probe, Impfstoffe, die CD1-präsentierte Antigene, und Zelllinien, die für die Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung von CD1-präsentierten Antigenen zweckdienlich sind. Die CD1-präsentierten Antigene der Erfindung stimulieren wie MHC-präsentierte Antigene α:β TCR T-Zellen, eine proliferative Antwort zu entwickeln. Allerdings sind anders als MHC-präsentierte Antigene CD1-präsentierte Antigene nichtpolypeptidartige hydrophobe Antigene. Insbesondere umfasst ein von Mycobakterien-Species isoliertes CD1b-präsentiertes Antigen eine Mycolsäure.
Beschreibung der Grundlagen der Technik
Das Immunsystem und die T-Zellen
Tiere besitzen eine komplexe Phalanx molekularer und zellulärer Abwehrsysteme, die insgesamt als Immunsystem bezeichnet sind und potentiell gesundheitsschädliche fremde oder endogene aber abnormale Zellen (dies können jeweils z. B. Pathogene wie beispielsweise Bakterien oder Viren, und kanzeröse oder Pathogen-infizierte Zellen sein) erkennen und attackieren, aber endogene normale Zellen tolerieren. Wenn das Immunsystem von fremden oder abnormalen Biomolekülen stimuliert worden ist, unternimmt es verschiedene Aktivitäten, um die Pathogene oder kanzeröse oder Pathogen-infizierte Zellen zu neutralisieren und zu zerstören, mit denen die fremden oder abnormalen Biomoleküle assoziiert sind. Diese Aktivitäten, zusammen als Immunantwort bekannt, können aus einer Zellvermittelten Immunantwort, einer humoralen (Antikörper-vermittelten) Immunantwort oder aus einer Immunantwort bestehen, die Elemente der Zell-vermittelten und humoralen Antwort beinhaltet.
Humorale Immunantworten sind durch Antikörper vermittelt, das sind Glycoproteine, die fremde oder abnormale Biomoleküle spezifisch binden. Antikörper sind Immunglobulin (Ig) Moleküle, die von B-Zellen gebildet werden, das sind Lymphocyten, deren Ursprung in der Bursa des Vogels oder im Knochenmark des Säugers liegt, aber in andere Organe, insbesondere die Milz, migrieren und dort reifen. Robertson, M., Nature 301 : 114 (1983). Zell-vermittelte Immunantworten sind die Folge der Aktivität von T-Zellen, das sind Lymphocyten, deren Reifung im Thymus des Tieres erfolgt. Tizard, I. R., Immunology: An Introduction, 2. Ausgabe, Saunders, Philadelphia (künftig kurz als "Tizard" bezeichnet), Seite 16.3, 1988. Sowohl T- als auch B-Zellen migrieren zwischen verschiedenen Organen und/oder Geweben im Tierkörper. Lydyard, P., und Grossi, C., Kapitel 3 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989.
T-Zellen vermitteln mindestens zwei allgemeine Arten von Immunfunktionen; Effektor- und Regulationsfunktion, was die Tatsache widerspiegelt, dass die T-Zellaktivitäten unter den verschiedenen T-Zell-Subpopulationen in einem Tier beträchtlich variieren. Rook, G., Kapitel 9 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Effektorfunktionen beinhalten eine verzögerte Hypersensitivität, Allotransplantat-Abstoßung, Tumorimmunität sowie Transplantat-versus-Wirt Reaktivität. Effektorfunktionen spiegeln die Fähigkeit mancher T-Zellen, als Lymphokine bezeichnete Proteine zu sezernieren, und die Fähigkeit anderer T-Zellen („cytotoxische" oder T-„Killer"-Zellen) wider, andere Zellen abzutöten. Die Regulationsfunktionen von T-Zellen sind durch die Fähigkeit von T-„Helfer"-Zellen repräsentiert. Helfer T-Zellen treten in Wechselwirkung mit Biomolekülen und produzieren Biomoleküle, die das Verhalten sowohl von B-Zellen als auch von cytotoxischen T-Zellen beeinflussen, um die Antikörperproduktion beziehungsweise cytotoxische Aktivitäten zu fördern und zu steuern. Mosier, D. E., Science 158: 1573–1575 (1967). Es gibt ebenfalls weitere T-Zellklassen, einschließlich Suppressor T-Zellen und T- Gedächtnis-Zellen. Miedema, F., und Melief C. J. M., Immunol. Today 6: 258–259 (1983); Tizard, Seiten 225–228.
Die T-Zellklassen sind auf Grund der Tatsache, dass unterschiedliche T-Zellen CD-Proteine auf ihrer unterschiedliche Oberfläche zeigen, zu einem gewissen Grad unterscheidbar. Unreife T-Zellen zeigen sowohl CD4 als auch CD8 Proteine (d. h. unreife T-Zellen sind CD4⁺8⁺), reife T- Helferzellen sind CD4⁺8⁺ (d. h. zeigen CD4 Protein aber kein CD8 Protein) und reife cytotoxische T-Zellen sind CD4⁺8⁺ (d. h. zeigen CD8 Protein aber kein CD4 Protein). Smith, L., Nature 326: 798–800 (1987); Weisman, I. L., und Cooper, M. D., Sci. American 269: 65–71 (1993).
Antigen-Erkennung
Um gut zu funktionieren, müssen die B- und T-Zellen des Immunsystems eines Tieres eine riesige Zahl von Molekülzusammensetzungen genau und zuverlässig identifizieren, die von fremden („nicht-selbst") oder endogenen („selbst"), aber abnormal exprimierten Zusammensetzungen abstammen, die angetroffen werden. Die Erkennung und Identifizierung durch das Immunsystem erfolgt auf molekularer Ebene. Ein Antigen, eine Molekül-Zusammensetzung mit dem Potenzial der Generierung einer Immunantwort ist aus einem oder mehreren Molekül-großen identifizierenden Merkmalen, auch Epitop genannt, zusammengesetzt. Ein Polypeptid-Antigen, das eine Aminosäure-Sequenz besitzt, die z. B. einhundert Aminosäuren umfasst, kann Dutzende Epitope umfassen, worin jedes Epitop durch einen Teil des Polypeptids definiert ist, der etwa 3 bis etwa 25 Aminosäuren umfasst. Die Anzahl an Epitopen, die ausschließlich von Polypeptiden abstammen können, wird auf rund 10 Millionen geschätzt. Tizard, Seite 25.
Ein Antigen, das von einer T- oder B-Zelle eines Tiers angetroffen wird, muss entweder als eines identifiziert werden, das mit normalen endogenen (d. h. selbst) Antigenen, auf die eine Immunantwort für das Tier schädlich wäre, oder mit fremden oder abnormalen (d. h. nicht-selbst), gegen die eine Immunantwort gerichtet sein sollte, assoziiert ist. Als Teil der Mittel des Immunsystems zur Identifizierung von Antigenen bilden einzelne T- und B-Zellen Antigenrezeptoren, die auf der T- oder B-Zelloberfläche gezeigt sind und die Antigene spezifisch binden. Turner, M., Kapitel 5 3 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. B-Zellen bilden und zeigen Antigenrezeptoren, die Ig-Moleküle mit einzigartigen Antigen-bindenden Bereichen auf Grund einzigartigen Aminosäuren-Sequenzen in den variablen Regionen beider Antikörper-Untereinheiten umfassen, die auch als Ig schwere und Ig leichte Kette bekannt sind. Jede B-Zellmembran umfasst 20.000 bis 200.000 identische Ig-Moleküle. Tizard, Seiten 78-80 und 202.
Die T-Zellantigenrezeptoren (TCRs), die von einzelnen T-Zellen gebildet und gezeigt sind, umfassen schwere (TCRβ) und leichte (TCRα) Ketten (Polypeptid-Untereinheiten), die über eine Disulfidbindung auf der T-Zelloberfläche gebunden sind. Jede TCRα- und β-Untereinheit besitzt Carboxy-terminal eine konstante Region, deren Aminosäure-Sequenz sich nicht von T-Zelle zu T-Zelle ändert, und Amino-terminal eine variable Region, deren Aminosäure-Sequenz sich von T-Zelle zu T-Zelle ändert. Wenn TCRα- und TCRβ-Untereinheiten sich miteinander verknüpfen, kombinieren die variablen Regionen der TCRα- und TCRβ-Polypeptid-Untereinheiten und bilden den einzigartigen Antigen-bindenden Teil eines α:β TCR. Es ist ein zweiter Typ eines TCR-Heterodimers, γ:δ, beschrieben worden, aber seine Funktion, wenn es überhaupt eine besitzt, ist unbekannt. Davis, M. M., und Bjorkman, P. J., Nature 334: 395–404 (1988). Obwohl mindestens ein gemischtes TCR-Heterodimer unbekannter Funktion, β:δ TCR, beschrieben worden ist, überwiegen zahlenmäßig α:β TCR-Moleküle in ausgewachsenen Tieren. Hochstenbach, F., und Brenner, M. B., Nature 340: 562–565 (1989).
Obwohl jede einzelne T- oder B-Zelle identische Antigenrezeptoren zeigt, variiert der gezeigte Rezeptor von Zelle zu Zelle; folglich ist die Kollektion verschiedener Antigenrezeptoren eines Tieres sehr divers. Die. genetische Basis dieser Diversität begründet sich folgendermaßen. Die variable Region einer Ig schweren Kette oder die einer TCRβ Kette ist von drei Gensegmenten, den variablen (V), Diversitäts- (D) und verknüpfenden (J) Segmenten, codiert. Die. variable Region einer Ig leichten Kette oder die einer TCRα-Kette ist von V- und J-Gensegmenten codiert. Multiple DNA-Sequenzen, die viele verschiedene V-, D- und J-Gensegmente codieren, sind als nichtexprimierte Kopien in der Keimbahn-DNA vorhanden; eine analoge aber unterschiedliche Kollektion variabler Gensegmente für TCR-Untereinheiten ist ebenfalls vorhanden. Während der Tierentwicklung werden Gene, die diverse variable Regionen codieren, in den einzelnen Zellen des Immunsystem durch zufälliges Verknüpfen von V-, D- und J- oder V- und J-Gensegmenten erzeugt. Der Vorgang von DNA-Rearrangements, der eine zufällig zusammengefügte variable Region einer Ig schweren oder TCRβ-Untereinheit erzeugt, ist als V-D-J-Verknüpfung bezeichnet; der analoge Vorgang, der eine rearrangierte variable Region einer Ig leichten oder TCRα-Untereinheit erzeugt, ist als V-J-Verknüpfung bezeichnet. Sakano, H., et al., Nature 280: 288–294 (1979); Early, P., et al., Cell 19: 981–992 (1980); Alt, F. W., et al., Science 238: 1079–1087 (1987); Harlow, E., und Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Seiten 10–18, 1988; Davies, M. M., und Bjorkman, P. J., Nature 334: 395–404 (1988).
Ein funktional rearrangiertes Gen von Ig oder der TCR-Untereinheit ist ein Gen, in dem die DNA-Rearrangements der V-D-J- oder V-J-Verknüpfung nicht zu einem Leserahmen geführt hat, der auf Grund der Einführung von Stop-Codons oder Leserasterverschiebungsmutationen vorzeitig beendet ist. Weil jede T- oder B-Zelle des Immunsystems Gene exprimiert, die ihre jeweiligen Antigenrezeptoren codieren, wo eine einzigartige funktional rearrangierte variable Region vorliegt, werden viele verschiedene T- oder B-Zellen erzeugt, wobei jede einen Rezeptor bildet, der eine einzigartige Antigenerkennungsregion besitzt. Hay, F., Kapitel 6 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Der gesamte Katalog verschiedener Antigenrezeptoren, die auf T-Zellen eines Tiers gezeigt werden, wird als das TCR-Repertoire des Tieres bezeichnet. Bevan, M. J., et al., Science 264: 796–797 (1994).
Bei reifen T- oder B-Zellen aktiviert das Binden eines Antigens an den Antigenrezeptor die Zelle, d. h. stimuliert die Zelle zu Aktivitäten, die mit einer Generierung einer Zell-vermittelten oder humoralen Immunantwort verbunden sind. Typischerweise proliferieren aktivierte T- oder B-Zellen als Antwort auf ein Antigen. Im Gegensatz dazu führt bei unreifen T- oder B-Zellen ein Binden eines Antigens an einen gezeigten TCR oder beziehungsweise B-Zellantigenrezeptor zur Elimination der Zelle durch einen als negative Selektion oder klonale Deletion bezeichneten Vorgang. Eine klonale Deletion erfolgt während der normalen Entwicklung eines gesunden Wildtyp-Tieres und ist ein Mechanismus, durch den das Immunsystem lernt, die normalen endogenen (selbst) Antigene des Tieres zu tolerieren, d. h. Selbst-Antigene des Tieres als nicht immunogene Antigene zu behandeln. Ein Versagen des Immunsystems, eine Toleranz für Selbst-Antigene zu erreichen oder aufrecht zu erhalten, kann zu Autoimmunantworten führen (d. h. Autoimmunantworten auf Selbst-Antigene), die in Autoimmunkrankheiten bei Tier und Mensch gipfeln können. Eine Autoimmunkrankheit kann vorkommen, wenn eine geeignete Immunantwort auf ein nicht Selbst-Antigen zur Produktion von Immuneffektor-Biomolekülen (z. B. Autoantikörpern) oder Zellen führt, die mit Selbst-Antigenen kreuzreagieren. Humane Autoimmunkrankheiten umfassen solche Lähmungszustände wie Multiple Sklerose (MS) und Systemischen Lupus Erythematodes (SLE). Roitt, I., Kapitel 23 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989; Steinman, L., Sci. American 269: 107–114 (1993).
Antigenpräsentation
Obwohl die Antigenrezeptoren von B-Zellen lösliches Antigen direkt binden können, antworten typischerweise T-Zellen auf ein Antigen nur, wenn dieses auf bestimmten Klassen anderer Zellen, die allgemein als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) bekannt sind, gezeigt ist. Feldman, M., und Male, D., Kapitel 8 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. APCs, z. B. Makrophagen und dendritische Zellen, präsentieren Antigene, die von Polypeptiden abstammen, über Glycoproteine, die als MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Proteine bekannt sind und auf der Oberfläche der APCs gezeigt sind. Bevan, M. J., et al., Science 264: 796–797 (1994). Die Nomenklatur der MHC-Genprodukte variiert von Species zu Species. Zum Beispiel sind humane MHC-Proteine auch als humane Lymphocyten-Antigene (HLA) bezeichnet, marine MHC-Proteine auch als H-2 Antigene bezeichnet und MHC-Proteine der Ratte sind auch als RT1-Antigene bezeichnet. Tizard, Seite 181. Insbesondere binden MHC-Proteine eine ausgewählte Klasse Antigene, die die Spezifität begrenzen. Im Wesentlichen sind die Spezifitätsdeterminanten in einem TCR : Ag : MHC Komplex (1) die einzigartigen Polypeptid-Sequenzen des variablen Teils des TCR und (2) die einzigartigen Polypeptid-Sequenzen vom Antigen. Allerdings sind bis zu einem gewissen Grad MHC-präsentierte Oligopeptid-Antigene in einem MHC-Molekül eingebettet und eine TCR-Erkennung des Antigens erfolgt nur innerhalb des Kontexts einer geeigneten Klasse vom MHC-Molekül. Janaway, C. A., Sci. American 269: 73–79 (1993). Dieses als MHC-Restriktion bezeichnete Phänomen ist von fundamentaler Bedeutung für die T-Zell-Antigenerkennung und Physiologie. Zinkernagel, R. M., Doherty, P. C., Nature 248: 701–702 (1974).
Bei einer MHC-vermittelten Präsentation von Antigenen erkennt der α:β T-Zellantigenrezeptor Peptid-Antigene zusammen mit Produkten von MHC-Genen. Im Falle löslicher Antigene erfolgt die Erkennung zusammen mit Klasse II Molekülen. Bei viralen Antigenen erfolgt die Erkennung zusammen mit Klasse I Molekülen. Außerdem werden große lösliche Antigene von Polypeptiden von einer geeigneten akzessorischen Zelle wie beispielsweise einem Makrophagen oder einer dendritische Zelle prozessiert.
Die allgemeine Reihenfolge der bei T-Zellerkennung von Polypeptid-Antigenen beteiligten Ereignisse ist bei MHC-Restriktion ist folgendermaßen. Ein Polypeptid wird von einer Antigen-präsentierenden Zelle phagocytiert, internalisiert, prozessiert und dann wird ein von dem Polypeptid abstammendes Peptid auf der Zelloberfläche zusammen mit Klasse I oder Klasse II MHC-Molekülen gezeigt. Um ein Antigen zu präsentieren, benötigen MHC Klasse I Moleküle ein zusätzliches Protein, β₂-Mikroglobulin. Tizard, Seiten 181–183. Ein T-Zellantigenrezeptor α:β Heterodimer erkennt dann das Peptid-Antigen plus das MHC-Genprodukt. Eine Erkennung nur des Peptid-Antigens oder nur des MHC-Genprodukts ist für die T-Zellaktivierung kein hinreichendes Signal. Nur der MHC : Ag Komplex kann von einem TCR-Molekül angemessen erkannt werden. Steward, M., Kapitel l in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989.
Die MHC-Proteine codierenden Gene sind verschiedenartig; allerdings anders als Ig und TCR-Moleküle, die von Zelle zu Zelle innerhalb eines einzelnen Tieres variieren, variieren MHC-Antigene von Einzeltier zu Einzeltier oder von einer Gruppe verwandter Einzeltiere zu einer anderen Gruppe. Mitglieder von Familiengruppen, die bei Mäusen von Mäuse-Inzuchtstämmen repräsentiert sind, besitzen untereinander ähnliche MHC-Antigene, aber nicht mit Individuen anderer Mäusestämme. Snell, G. D., Science 213: 172–178 (1981); Owen, M., Kapitel 4 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Weil verschiedene MHC-Moleküle in der Lage sind, unterschiedliche Antigene zu binden, die Antigene, die die T-Zellen erkennen können (d. h. im MHC-Kontext spezifisch binden) und darauf antworten, variieren unter verschiedenen Mäusestämmen. Cooke, A., Kapitel 11 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Beim Menschen sind besonders MHC (HLA) Moleküle codierende Gen-Allele vermehrt mit Autoimmunkrankheiten assoziiert, vermutlich weil diese MHC-Moleküle beim Binden (und folglich beim Präsentieren für T-Zellen) von Selbstantigenen kompetenter sind. Vaughan, in Immunological Diseases, 3. Ausgabe, Vol. II, Samter, M. ed., Seiten 1029–1037 (1978); Steinman, L., Sci. American 269: 107–114 (1993).
Doppelt negative T-Zellen Im Allgemeinen erkennen CD8⁺ T-Lymphocyten MHC Klasse I Komplexe, während CD4⁺ Zellen MHC Klasse Π Komplexe auf Antigen-präsentierenden Zellen erkennen. Die Beteiligung von CD8 und CD4 bei der Antigenerkennung durch α:β TCRs ist signifikant. CD4 und CD8 Moleküle steigern die Affinität der TCR Wechselwirkung mit Ag : MHC Komplexen und sind manchmal als Co-Rezeptoren bezeichnet (Bierer, B. E. et al., Ann. Rev. Immunol. 7: 579–599 (1989); Steward, M., Kapitel l in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989). Auf Grund der Bedeutung von CD4 und CD8 bei der Antigenerkennung im MHC-Kontext, sind CD4^–8^– (doppelt negativ; DN) T- Zellen früher als unreife Thymuszellen-Vorläufer betrachtet worden. Lydyard, L., und Grossi, C., Kapitel l und 14 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989; Smith, L., Nature 326: 798-800 (1987); Strominger, J. L., et al., Int. J. Cancer Suppl. 4: 43–47 1989); Shirai, T., et al., J. Immunology 144: 3756–3761 (1990); Weisman, I. L., und Cooper, M. D., Sci. American 269: 65–71 (1993).
Die DN Subpopulation von T-Zellen unterscheidet sich bezüglich den TCRs, die sie zeigen. Der Großteil der aus peripherem Blut isolierten humanen DN T-Zellen expriemiert δ:γ TCRs. Porcelli, S., et al., Immunological Reviews 120: 137–183 (1991). Ein großer Teil (ungefähr 60%) muriner DN α:β TCR T-Zellen exprimiert Vβ8 Genprodukte (Fowlkes, B. J., et al., Nature 329: 251–254 (1987); Bix, M., et al., J. Exp. Med. 178: 901–908 (1993)). Mehrere Analysen in Mäusen weisen auf einen beeindruckenden Mangel an (V-J oder V-D-J) Verknüpfungsdiversität und eingeschränkte Verwendung von Keimbahn V- und J-Genelementen, besonders für TCRα-Untereinheiten. Koseki, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5248–5252 (1990); Kubota, H., et al., J. Immunol. 149: 1143–1150 (1992). Eine Überprüfung frischer DN α:β TCR T-Zellen in Menschen zeigte ein beeindruckendes Vorherrschen eines Invarianten (kanonischen) Vα24-JαQ Rearrangements, dem N-Region-Additionen fehlten. Porcelli, S., et al., J. Exp. Med. 178: 1–16 (1993). Insgesamt lassen diese Beobachtungen vermuten, dass DN α:β TCR T-Zellen eine entwicklungsmäßig unterschiedliche Subpopulation an T-Lymphocyten darstellen können, deren begrenztes Rezeptor-Repertoire das Erkennen eines eingeschränkten Sets von Antigenen und/oder Antigen-präsentierenden Molekülen widerspiegelt.
CD1-Proteine
Polypeptid-Moleküle, die von den Genen des CD1-Locus codiert sind, werden von selektierten CD4^–8^– T-Zellklonen erkannt, die entweder α:β oder γ:δ TCRs exprimieren (Porcelli, S., et al., Nature 341: 447–450 (1989); Faure, F., et al., Eur. J. Immun. 20: 703–706 (1990)). Auf Grund der Strukturähnlichkeit von CD1-Molekülen, die von Genen auf dem humanen Chromosom 1 codiert sind, mit MHC-Molekülen, die von Genen auf dem humanen Chromosom 6 codiert sind (Calabi, F. und Milstein, C., Nature 323: 540–543 (1986); Balk, S. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 252-256 (1989)) ist vermutet worden, dass CD1 eine andere Familie Antigen-präsentierender Moleküle darstellen könnte, als diejenige, die von den MHC-Genen codiert ist. Porcelli, S., et al., Nature 341: 447–450 (1989); Strominger, J. L., Cell 57: 895–898 (1989); Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137–183 (1991).
Die fünf CD1-Gene zeigen Exon- und Domänenstruktur (α1, α2, α3), die denjenigen der MHC Klasse I Gene ähnlich ist, dennoch sind die Proteine bezüglich der Sequenz nur entfernt verwandt. Alle CD1-Familienmitglieder haben eine α3 Domäne gemeinsam; allerdings zeigt sogar diese Domäne nur 32% Homologie in der Aminosäure-Sequenz mit Konsensus-Resten von Klasse I MHC α3 Domänen und es gibt keine nachweisbare Homologie mit al Domänen. Ein Hauptunterschied zwischen MHC und CD1-Molekülen ist der Polymorphismus. Humane MHC-Gene sind extrem polymorph: multiple Allele sind von jedem bekannten MHC-Locus beschrieben worden. Im Gegensatz dazu sind CD1-Gene offensichtlich nicht polymorph. Trotz dieser Unterschiede sind die CD1-Gene wie MHC Klasse I Moleküle als große Untereinheiten (schwere Ketten) exprimiert und nicht kovalent mit β₂-Mikroglobulin verbunden. Van Agthoven, A., und Terhorst, C., J. Immunol. 128: 426–432 (1982); Terhorst, C., et al., Cell 23: 771–780 (1981)).
Fünf CD1-Gene sind im Menschen bislang identifiziert worden: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d und CD1e. Vier der fünf CD1-Genprodukte sind serologisch definiert und als CD1a, CD1b, CD1c und CD1d bezeichnet worden und sind durch einzigartige schwere Ketten mit ungefähren Molekulargewichten von 49 kDa, 45 kDa, 43 kDa beziehungsweise 48 kDa zu unterscheiden (Amiot, M., et al., J. Immunol. 136: 1752–1758 (1986);. Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137–183 (1991); Bleicher, P. A., et al., Science 250: 679–682 (1990)). CD1-Proteine sind auf zahlreichen APCs gezeigt, einschließlich Langerhans Zellen (die den Großteil der dendritischen Antigen-präsentierenden Zellen in der Haut ausmachen), aktivierter B-Zellen, dendritischer Zellen in Lymphknoten und auf aktivierten Blut-Monocyten (Porcelli, S., et al., Nature 360: 593–597 (1992); Leukocyte Typing N, Knapp, W., ed., Oxford University Press Oxford, U. K., Seiten 251–269, 1989; Tissue Antigens, Kissmeyer-Nielsen, F., ed., Munksgard, Kopenhagen, Dänemark, Seiten 65–72, 1989.
Eine frühere Arbeit hat gezeigt, dass CD1-Proteine von CD4^–8^– T-Zelllinien, die von Patienten mit SLE stammen, erkannt werden. Porcelli, S., et al., Nature 341: 447-450 (1989). CD1-Proteine exprimierende Leukämiezellen wurden durch die T-Zellunabhängige MHC-Restriktion lysiert, sogar wenn keine fremdes (nicht-selbst) Antigen vorhanden war. DN T-Zellen lysierten Leukämiezellen in CD1-abhängiger Weise bei Fehlen des Antigens. Folglich besteht die Möglichkeit, dass CD1-Proteine eine Rolle bei Autoimmunkrankheiten spielen.
Das zentrale Dogma der Immunologie ist gewesen, dass das Immunsystem normalerweise nicht mit sich selbst reagiert. Autoimmunität definiert einen Status, bei dem die natürliche Nichtreaktivität oder Toleranz auf sich selbst endet. Folglich reagieren Antikörper oder Zellen mit Selbst-Bestandteilen, und lösen dadurch Krankheiten aus. Es gibt bis heute kein etabliertes einheitliches Konzept, was den Ursprung und die Pathogenese der verschiedenen Autoimmunerkrankungen erklärt. Der Krankheitsprozess kann unter anderem von sensibilisierten T-Lymphocyten ausgelöst sein. Diese Lymphocyten verursachen mit kaum verstandenen Mechanismen Gewebeläsionen, die die Freisetzung von zerstörenden Lymphokinen umfassen können oder die andere Entzündungszellen zu den Läsionen führen. Für einen Überblick über die Autoimmunität, siehe Theofilopoulos, A. N., Kapitel 11 in Basic and Clinical Immunology, 6. Ausgabe, Stites, D. P., et al., eds., Appleton und Lang, 1987.
Mycobakterien und Mycolsäuren
Die Mycobakterien sind eine Gattung aerober intrazellulärer Bakterien, die nach Invasion ihres Wirts, innerhalb endosomaler Kompartimente von Monocyten und Makrophagen überleben. Humane mycobakterielle Krankheiten umfassen Tuberkulose (von M. tuberculosis ausgelöst), Lepra (von M. leprae ausgelöst), Bairnsdale Ulzera (von M. ulcerans ausgelöst) und verschiedene Infektionen, die von M. marinum, M. kansasii, M. scrofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. fortuitum, M. chelonei, M. haemophilum, und M. intracellulare ausgelöst sind. Wolinsky, E., Kapitel 37 in Microbiology: Including Immunology and Molecular Genetics, 3. Ausgabe, Harper & Row, Philadelphia, 1980; Daniel, T. M., Miller, R. A. und Freedman, S. D., Kapitel 119, 120 beziehungsweise 121, in Harrison's Principles of Internal Medicin, 11. Ausgabe, Braunwald, E., et al., eds., McGraw-Hill, New York, 1987. Ein Drittel der Weltbevölkerung beherbergt M. tuberculosis (M. tb.) und ist in der Gefahr, Tuberkulose (TB) zu bekommen, die für 18,5% der Todesfälle bei Erwachsenen im Alter zwischen 15 und 59 verantwortlich ist. Bloom, B. R., und Murray, C. J. L., Science 257: 1055–1064 (1992). Weil eine verbesserte öffentliche Gesundheitsversorgung und antibiotische Therapie das Vorkommen und/oder die Schwere von TB in den Vereinigten Staaten merklich reduziert haben, kommen diese alarmierenden Zahlen zum großen Teil aus Ländern der Dritten Welt. Unglücklicherweise breitet sich mit dem Auftauchen von AIDS die Tuberkulose mit nahezu logarithmischer Rate aus und mehrfach resistente Stämme erscheinen auf der Bildfläche und sind heute für ein Drittel aller Fälle in New York City verantwortlich. Bloom, B. R., und Murray, C. J. L., Science 257: 1055–1064 (1992); U.S. Congress, Office of Technology Assessment, The Continuing Challenge of Tuberculosis; OTA-H-574, U.S. Government Printing Office, Washington, D. C., 1993. Mycobakterien-Stämme, die zuvor als nicht pathogen betrachtet wurden (z. B. M. avium), sind zu den wichtigsten Tod bringenden Pathogenen von immunsupprimierten AIDS-Patienten geworden. Außerdem sind die heutigen Mycobakterienimpfstoffe entweder unzureichend, im Falle des BGC-Impfstoffs gegen M. tb. oder bezüglich M. leprae nicht verfügbar. Kaufmann, S., Microbiol. Sci. 4: 324–328 (1987); U.S. Congress, Office of Technology Assessment, The Continuing Challenge of Tuberculosis, Seiten 62–67, OTA-H-574, U.S. Government Printing Office, Washington, D. C., 1993.
Die Hauptantwort auf Mycobakterien umfasst Zell-vermittelte verzögerte Hypersensitivitäts-(DTH)-Reaktionen, wobei T-Zellen und Makrophagen die Hauptrollen beim intrazellulären Abtöten und Eindämmen oder Einschließen (Granulom-Bildung) des Organismus spielen. Eine wichtige T-Zellantwort umfasst CD4⁺ Lymphocyten, die mycobakterielle Hitzeschock-Proteine (wie beispielsweise hsp65) als immundominante Antigene erkennen. Kaufmann, S. H., et al., Eur. J. Immunol. 17: 351–357 (1987). Außerdem enthalten Mycobakterien einen außer gewöhnlichen Anteil an Lipiden, der etwa bis zu 40% des Trockengewichts von Bacillus und 60% von der Zellwand beträgt. Goren, M. B., und Brennan, P. J., Mycobacterial Lipids: Chemistry and Biologic Activities in Tuberculosis, 1979. Vielleicht sind die Mycolsäuren die zahlreichsten und verschiedenartigsten Vertreter von mycobakteriellen Lipiden. Diese α-verzweigten, (β-Hydroxyfettsäuren besitzen einzigartige Strukturen, die in Mycobakterien und verwandten Bakterien-Species gefunden werden. Wolinsky, E., „Mycobacteria", Kapitel 37 in Microbiology: Including Immunology and Molecular Genetics, 3. Ausgabe, Davis, B. H., Herausgeber, Harper & Row, Philadelphia, 1980.
Mycolsäuren sind hauptsächlich in der Zellwand gefunden, zu Arabinogalactan-Polymeren verestert und mit dem Kern-Peptidoglycan verknüpft (McNeal, M. R., Res. Microbiol. 142: 451–563 (1991); Besra, G. S., Biochemistry 30: 7772–7777 (1991); McNeil, M., et al., Journal of Biological Chemistry 266: 13217–13223 (1991)) und können entweder durch alkalische oder saure Hydrolyse (Verseifung) freigesetzt werden. Minnikin, D. E., „Mycolic acids" in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of Lipids, Murhergee, K. D., und Weber, N., eds., CRC Press, 1993. Mycolsäuren sind die Hauptkomponente der den Organismus umgebenden Lipidhülle und verleihen dem Organismus seine hydrophobe Oberfläche und seine charakteristische Säureschnellfärbung. Goren, M. B., und Brennan, P. J., Mycobacterial Lipids: Chemistry and Bilogic Activities in Tuberculosis, 1979.
Anders als eukaryotische und bakterielle Fettsäuren, deren Größe im Bereich von C₁₂-C₂₄ liegt, liegen die Mycolsäuren im Bereich von C₆₀-C₉₀. Minnikin, D. E., „Lipids: Complex Lipids, their Chemistry, Biosynthesis and Roles" in The Biology of Mycobacteria, Vol, 1, Ratledge, C. und Sanford, J., eds., Academic Press, London, 1982. Im Gegensatz zu den geradkettigen Fettsäuren besitzen Mycolsäuren eine verzweigte Alkyl-Gruppe am α-Kohlenstoff und eine Hydroxyl-Gruppe am β-Kohlenstoff. Goren, M. B. und Brennan, P. J., Mycobacterial Lipids: Chemistry and Biologic Activities in Tuberculosis, 1979; Minnikin, D. E., „Lipids: Complex Lipids, their Chemistry, Biosynthesis and Roles" in The Biology of Mycobacteria, Vol, 1, Ratledge, C. und Sauford, J., eds., Academic Press, London, 1982; Takayama, K. und Qureshi, N., "Structure and Synthesis of Lipids" in The Mycobacteria: A Sourcebook, Teil A, Kubica, G. P. und Wayne, L. G., eds., Marcel Dekker, New York & Basel, 1984. Die lange Alkylhauptkette der Mycolsäure (die sogenannte Mero-Gruppe) ist sowohl hinsichtlich der Länge als auch der gebundenen funktionellen Gruppen sehr verschiedenartig. Zusätzlich zu Alkengruppen (Doppelbindungen) umfassen die funktionellen Gruppen der Mycolsäuren Methoxyl, Keto, einzelne Methylverzweigungen, Ethylen- und Cyclopropangruppen. Minnikin, D. E., „Lipids: Complex Lipids, their Chemistry, Biosynthesis and Roles" in The Biology of Mycobacteria, Vol, 1, Ratledge, C. und Sauford, J., eds., Academic Press, London, 1982. Die große Vielfalt der für Mycolsäuren verfügbaren funktionellen Grupppen, ihre variable Kettenlänge und die Verschiedenartigkeit unter den Stämmen erlaubt Mycolsäuren, einen potentiell hohen antigenen Variationsgrad einzunehmen, der dem von Peptiden mit einer großen Heterogenität in den Aminosäure-Seitenketten ähnlich ist. Folglich haben diese Lipid-Moleküle eine nicht zuvor richtig eingeschätzte immunologische Bedeutung. Für jede Mycobakterien-Species gibt es einen unterscheidbaren Fingerabdruck, der auf Mustern vorhandener Mycolsäure-Molekülen beruht. Derartige Muster sind für einzelne Species mittels Dünnschicht-Chromatographie (DC) bestimmt worden. Minnikin, D. E., „Lipids: Complex Lipids, their Chemistry, Biosynthesis and Roles" in The Biology of Mycobacteria, Vol, 1, Ratledge, C. und Sauford, J., eds., Academic Press, London, 1982; Dobson, G., et al., Chemical Methods in Bacterial Systematics, Academic Press, 1985; Valero-Guillen, P. L., et al., Journal of Applied Bacteriology 59: 113–126 (1985)), Gas-Chromatographie (GC) (Valero-Guillen, P. L., et al., Journal of Applied Bacteriology 59: 113-126 (1985); Athaly, M., et al., Journal of Applied Bacteriology 58: 507–512 (1985); Luquin, M., et al., Journal of Clinical Microbiology 29: 120–130 (1991)) und mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC); Qureshi, N., et al., Journal of Biological Chemistry 253: 5411–5417 (1978); Qureshi, N., et al., Journal of Biological Chemistry 255: 182–189 (1980); Butler, W. R., et al., Journal of Clinical Microbiology 29: 2468–2472 (1991); Butler, W. R. und Kilburn, J. O., Journal of Clinical Microbiology 28: 2094–2098 (1990).
Zusammenfassung der Erfindung
Verschiedene Aspekte der Erfindung stellen bereit

– ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, der ein CD1-präsentiertes Antigen enthält,
– einen Impfstoff, der eine spezifische T-Zellantwort in einem Tier auslöst,
– Verwendung eines CD1-präsentierten Antigens (oder seines funktionalen Äquivalents) zur Herstellung eines Medikaments, das eine spezifische T-Zellantwort für eine Impfung induziert,
– ein CD1-blockierendes Mittel, das eine auf CD1-beschränkte Antigenpräsentation hemmt,
– ein Verfahren zur Hemmung einer auf CD1-beschränkten Antigenpräsentation von CD1⁺ Zellen,
– ein Verfahren zum Nachweis eines CD1-präsentierten Antigens in einer Probe,
– ein Verfahren zum Isolieren eines CD1-präsentierten Antigens aus einer Probe, und
– ein isoliertes CD1-präsentiertes Antigen, wie es in den anhängigen Ansprüchen dargelegt ist.

Ein Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes bereit, der ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, umfassend die Schritte

(a) Inkubieren einer Probe, die ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, mit CD1-positiven Zellen;
(b) Trennen besagter CD1-positiver Zellen, die CD1-gebundenes Antigen zeigen, von besagter Probe;
(c) Trennen des CD1-präsentierten Antigens von besagten CD1-positiven Zellen, die besagtes Antigen zeigen; und
(d) Formulieren besagten getrennten CD1-präsentierten Antigens, um einen Impfstoff zu bilden.

Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes bereit, der ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, umfassend die Schritte

(a) Fraktionieren einer Probe, die ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, in zwei oder mehrere Fraktionen;
(b) Testen besagter Fraktionen auf die Anwesenheit eines CD1-präsentierten Antigens; und
(c) Formulieren einer oder mehrerer Fraktionen, die besagtes CD1-präsentiertes Antigen enthält, um einen Impfstoff zu bilden.

Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, worin:

(a) besagtes CD1-präsentiertes Antigen von einem CD1-Molekül präsentiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus CD1a, CD1b, CD1c, CD1d und CD1e; oder
(b) besagtes CD1-präsentiertes Antigen aus einer Mycobakterien-Species isoliert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. fortuitum und M. avium.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt einen Impfstoff bereit, der eine spezifische T-Zellantwort in einem Tier nach Verabreichung an besagtes Tier induziert, wobei der Impfstoff eine wirksame spezifische T-Zell-induzierende Menge eines CD1-präsentierten Antigens oder eines funktionalen Äquivalents davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt außerdem einen Impfstoff bereit, umfassend:

(a) ein oder mehrere Zytokine oder andere Moleküle, die eine CD1-Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen induzieren; oder
(b) ein oder mehrere verschiedene Antigene.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung eines CD1-präsentierten Antigens (oder seines funktionalen Äquivalents) zur Herstellung eines Medikaments bereit, das eine spezifische T-Zellantwort für eine Impfung induziert.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt außerdem einen Impfstoff oder die Verwendung eines Impfstoffes bereit, worin ein CD1-präsentiertes Antigen ist:

(a) aus verseiftem 6,6-Trehalosedimycolat isoliert; oder
(b) ein Lipid ist; oder
(c) eine Mycolsäure ist.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein CD1-blockierendes Mittel bereit, das eine auf CD1-beschränkte Antigenpräsentation hemmt und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Antikörper, einem synthetischen Peptid, einem Inhibitor einer auf CD1-beschränkten Antigenpräsentation und einem Antigen-Antagonisten, der von einem CD1-präsentierten Antigen abgeleitet ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Hemmung einer auf CD1-beschränkten Antigenpräsentation durch CD1-positive Zellen bereit, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens von Zellen, die ein CD1-Molekül zeigen, mit einem CD1-blockierenden Mittel, ausgenommen Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
. Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes CD1-präsentiertes Antigen, das mit einem Verfahren herstellbar ist, und ein Verfahren zum Nachweis eines CD1-präsentierten Antigens in einer Probe bereit, umfassend die Schritte:

(a) Inkontaktbringen besagter Probe mit CD1-positiven Zellen;
(b) Inkontaktbringen besagter CD1-positiver Zellen mit T-Zellen; und
(c) Messen der proliferativen oder cytolytischen Antwort von besagten T-Zellen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes CD1-präsentiertes Antigen, das mit einem Verfahren herstellbar ist, und ein Verfahren zum Nachweis eines CD1-präsentierten Antigens in einer Probe bereit, umfassend die Schritte:

(a) Inkubieren besagter Probe mit CD1-positiven Zellen, die besagtes CD1-präsentiertes Antigen binden, um CD1-positive Zellen zu erzeugen, die CD1-gebundenes Antigen zeigen;
(b) Trennen besagter CD1-positiver Zellen, die CD1-gebundenes Antigen zeigen, von besagter Probe; und
(c) Trennen des CD1-präsentierten Antigens von besagten CD1-positiven Zellen, die besagtes Antigen zeigen.

Folglich beruht die Erfindung auf der neuen und unerwarteten Beobachtung, dass CD1-Moleküle dazu dienen, T-Zellen fremde Antigene wie auch autoimmune Antigene zu präsentieren. Die Erfindung beruht außerdem auf der Beobachtung, dass isolierte Blutmonocyten zur Expression von CD1 induziert werden können und deshalb kompetent werden können, T-Zellen Antigene zu präsentieren, durch Inkontaktbringen der Monocyten mit Granulocyten/Makrophagen Koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) und Interleukin-4 (IL-4). Auf diesen beiden Beobachtungen beruhend, legt die Erfindung Verfahren zur Isolierung von CD1⁺ Antigen-präsentierenden Zellen (CD1⁺ APCs), die zur Identifizierung, Isolierung und Reinigung von CD1-präsentierten Antigenen verwendet werden, verschiedene Verfahren zur Bestimmung, ob eine Probe ein oder mehrere CD1-präsentierte Antigene enthält, Verfahren zur Isolierung und Reinigung von CD1-präsentierten Antigenen, gereinigte CD1-präsentierte Antigene, die mit den hier offengelegten Verfahren isoliert sind, und Verfahren zur Verwendung von isolierten CD1-präsentierten Antigenen in Impfstoffen offen. Es sind Verfahren zur Bestimmung beschrieben, ob eine Probe ein CD1-präsentiertes Antigen enthält. In einem derartigen Verfahren kann das Vorhandensein eines CD1-präsentierten Antigens bestimmt werden durch (1) Inkontaktbringen der Probe mit Zellen, die zur Expression eines CD1-Proteins induziert worden sind, (2) Inkontaktbringen der Zellen von dem ersten Schritt mit CD4^–8^– (doppelt negativen; DN) T-Zellen, die ein CD1-präsentiertes Antigen spezifisch erkennen, und (3) Messen der proliferativen oder cytolytischen Antwort von den DN T-Zellen, worin eine erhöhte T-Zellproliferation oder beziehungsweise T-Zell-vermittelte Cytolyse von CD1⁺ Zielzellen mit dem Vorhandensein eines CD1-präsentierten Antigens korreliert.
Verfahren zur Bestimmung, ob eine Probe ein CD1-blockierendes Mittel enthält, d. h. eine Zusammensetzung, die eine auf CD1-beschränkte Antigenpräsentation hemmt, sind ebenfalls beschrieben. Der oben beschriebene Test auf CD1-präsentiertes Antigen wird zweifach durchgeführt, wobei ein erster (Kontroll)-Test wie oben durchgeführt wird, und ein zweiter Test, der zusätzlich eine Probe enthält, die vermutlich ein CD1-blockierendes Mitte enthält. Das Vorhandensein von CD1-blockierenden Mitteln in der Probe korreliert mit einer proliferativen oder cytolytischen Antwort von T-Zellen in dem zweiten Test, die kleiner als die im ersten Test gemessene Antwort ist.
Eine Induktion der CD1-Expression in Zellen wie beispielsweise Monocyten, um CD1 Antigen-präsentierende Zellen (APCs) zu erzeugen, ist ebenfalls beschrieben. In einem Verfahren wird die CD1-Expression in isolierten Blutmonocyten durch Inkontaktbringen der Zellen mit einem oder mehreren Zytokinen induziert. Die bevorzugten Zytokine für eine CD1-Induktion sind Granulocyten/Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), GM-CSF in Kombination mit Interleukin-4 (IL-4), oder Interleukin-3 (IL-3). CD1⁺ APCs sind Zellen, die CD1-Proteine exprimieren und zeigen und sind folglich kompetent, auf CD1-beschränkte Antigene den DN α:β TCR T-Zellen zu präsentieren. CD1⁺ APCs sind hier in mehreren offengelegten Verfahren verwendet.
CD4^–8^– (DN) α:β TCR T-Zellen zur Verwendung in den hier offengelegten Verfahren sind ebenfalls beschrieben. DN α:β TCR T-Zellen erkennen (d. h. binden spezifisch) CD1-gebundene Antigene und proliferieren als Folge dieser Erkennung. Drei derartige isolierte Zelllinien, als DN1, DN2 und DN3 bezeichnet, sind hier beschrieben.
Verfahren zum Isolieren eines CD1-präsentierten Antigens aus einer Probe sind ebenfalls beschrieben. In einem derartigen Verfahren wird eine Probe, die ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, zuerst unter Anwendung konventioneller Techniken fraktioniert. Die resultierenden Fraktionen werden dann unter Anwendung der hier offengelegten Verfahren auf das Vorhandensein eines CD1-präsentierten Antigens getestet. Die Fraktionen, die das CD1-präsentierte Antigen enthalten, werden dann entweder bei der Entwicklung von Impfstoffen verwendet oder weiter fraktioniert, um höhere Reinheitsstufen des CD1-präsentierten Antigens zu erhalten.
Alternative Verfahren zur Isolierung CD1-präsentierter Antigene aus einer Probe, die auf der Fähigkeit eines CD1-präsentierten Antigens beruhen, entweder isoliertes CD 1 oder auf einer Zelloberfläche exprimiertes CD 1 zu binden, sind ebenfalls beschrieben. In einem derartigen Verfahren wird eine Probe, die ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, entweder mit CD1⁺ APCs oder gereinigten CD1-Molekülen inkubiert. Die resultierenden Komplexe aus Antigen: CD1⁺ APC oder Antigen: CD1-Molekül werden dann aus der Probe entfernt und Bedingungen unterworfen, in denen das CD1-Molekül das gebundene CD1-präsentierte Antigen freisetzt. Das freigesetzte CD1-präsentierte Antigen wird dann entweder von der CD1⁺ APC oder dem gereinigten CD1-Molekül gereinigt und kann unter Anwendung herkömmlicher immunologischer, biologischer und/oder genetischer Verfahren weiter charakterisiert werden. Gereinigte CD1-präsentierte Antigene oder synthetische oder gentechnisch hergestellte Derivate davon werden dann auf Aktivität des CD1-präsentierten Antigens in den hier offengelegten Verfahren getestet und können bei der Formulierung von Impfstoffen verwendet sein.
Durch Anwendung der obigen Verfahren zur Isolierung eines CD1-präsentierten Antigens stellt die vorliegende Erfindung außerdem isolierte Antigene bereit, die mit den hier offengelegten Verfahren dargestellt worden sind. Die mit den offengelegten Verfahren dargestellten isolierten CD1-präsentierten Antigene können entweder bei der Charakterisierung der natürlichen CD1-präsentierten Antigene, bei der Entwicklung oder Formulierung von Impfstoffen oder bei der Entwicklung von Autoimmuntherapien verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung beruht außerdem auf der Beobachtung, dass eine CD1-vermittelte Antigenpräsentation als Basis für die Entstehung einer Autoimmunerkrankung dienen kann. Auf Grundlage dieser Beobachtung stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Hemmung einer CD1-vermittelten Antigenpräsentation von einer APC bereit. Eine CD1-vermittelte Antigenpräsentation kann mit verschiedenen Zusammensetzungen gehemmt werden, die hier beschrieben sind oder mit den hier beschriebenen Verfahren isoliert werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 (Bild a und b). Expression von CD1a, CD1b und CD1c von Monocyten, die mit GM-CSF und IL-4 kultiviert waren, und Oberflächen-Phänotyp von CD1b-beschränkten T-Zellen, die für Mycobacterium tuberculosis spezifisch sind.
Bild a. Durchflusscytometrische Analyse von peripheren Blutmonocyten, die 60 Stunden in GM-CSF und IL-4 haltigem Medium kultiviert waren und eine Expression von CD1a, CD1b und CD1c zeigen. Zellen wurden mit monoklonalem Kontrollantikörper (mAk) (gepunktete Linie) oder mAk mit der in jedem Histogramm-Kästchen angegebenen Spezifität (durchgezogene Linie) gefärbt.
Bild b. Durchflusscytometrische Analyse der T-Zelllinie DN1, die die Expression von α:β TCRs, keine Expression von CD4 und minimale oder keine Expression von CD8 (gepunktete und durchgezogene Linien stellen wie in Bild a Kontroll-Ak und spezifische Ak dar).
2 (Bilder a–d). Antigenspezifität und Selbstrestriktion von proliferativen Antworten von CD4^–8^– T-Zelllinie DN1 und ihrem Subklon DN1.C7.
Bild a. Proliferative Antworten (Counts pro Minute (CPM) von eingebautem ³H-Thymidin von DN1 auf M. tuberculosis (schwarze Quadrate), M. leprae (schwarze Kreise), Escherichia coli (weiße Kreise) und Tetanustoxoid (weiße Quadrate). Antigen-präsentierende Zellen waren unterschiedlich GM-CSF- und IL-4-behandelte CD1⁺ Monocyten. Antigen-Konzentration (bezogen auf Proteingehalt) ist auf der x-Achse angegeben.
Bild b. Proliferative Antwort der T-Zellinie DN1 auf M. tuberculosis (1 μg Protein/ml) erfordert CD1⁺ Antigen-präsentierende Zellen (CD1⁺ APCs). APCs sind mit folgenden Symbolen angegeben: keine APCs, weiße Quadrate; GM-CSF und IL-4 behandelte Monocyten (CD 1+ APCs), schwarze Kreise; IFNγ behandelte Monocyten (CD1⁺), weiße Kreise; frisch isolierte Monocyten (CD1⁺), weiße Dreiecke). Die Anzahl zu jeder Kultur gegebener APCs ist auf der x-Achse angegeben.
Bild c. APCs von allen getesten Spendern unterstützten die proliferative Antwort der T-Zelllinie DN1 auf M. tuberculosis. Weiße Balken T-Zellen plus APCs ohne M. tuberculosis, schwarze Balken T-Zellen plus APCs mit M. tuberculosis (1 μg Protein/ml). APCs waren GM-CSF und IL-4 behandelte mononukleäre Zellen des peripheren Bluts von fünf nicht verwandten Spendern. HLA-Typisierung bestätigte, dass kein Allel des HLA-A, -B, -C, -DR, -DP oder DQ Locus von den fünf Spendern gleich war (Daten nicht gezeigt):
Bild d. Anti-CD1b mAk hemmte spezifisch die proliferative Antwort von DN1 und DN1.C7 auf M. tuberculosis (1 μg Protein/ml). APCs waren GM-CSF und IL-4 behandelte Monocyten. Schwarze Balken, proliferative Antwort von T-Zellen auf APCs mit M. tuberculosis (1 μg Protein/ml); gestrichelte Linien, Antwort auf APCs ohne M. tuberculosis; „nd", nicht bestimmt. Verwendete monoklonale Antikörper waren P3 (Kontroll IgG), OKT6 (anti-CD1a), WM-25 (anti-CD1b; Favaloro, E. J., et al., Disease Markers 4: 261–270 (1986)), 10C3 (anti-CD1c), W6/32 (anti-MHC Klasse I) und IVA12 (anti-MHC Klasse II; Shaw, S., Hum. Immun. 12: 191–211 (1985)).
3. Ein Vergleich der Fähigkeit von Antigen-präsentierenden Zelllinien CR1 und Zytokin-stimulierten Monocyten, Wachstum von T-Zelllinien 2.13.DN1 und G7, von der T-Zelllinie DN1 abstammende Klone, zu stimulieren. Weiße Balken, T-Zellen plus APCs ohne M. tuberculosis; schwarze Balken, T-Zellen plus APCs mit M. tuberculosis (1 μg Protein/ml).
4. (Bilder a-d). Präsentation von M. tuberculosis von CD1-Transfektanten der Lymphoblastenzelllinie C1R. C1R-Zellen, die stabil mit DNA von Vektor pSRα-NEO (scheintransfiziert) oder mit Konstrukten von pSRα-NEO, die das angegebene CD1-Molekül (CD1a, CD1b und CD1c) codierende cDNAs enthalten, transfiziert waren, wurden 12 Stunden in ausschließlich Medium (weiße Balken) oder in Medium kultiviert, das M. tuberculosis (25 μg Protein/ml, schwarze Balken) enthielt, markiert mit ⁵¹Cr und als Zielzellen für Cytolyse-Test mit verschiedenen Effektor-T-Zellen verwendet. Das Verhältnis Effektor-T-Zelle zu Zielzelle war 50 : 1.
Bild a. M. tb. CD1b-präsentiertes Ag-spetifische T-Zelllinie DN1.
Bild b. DN1 Subklon DN1.C/.
Bild c. CD1a autoreaktiver Klon BK6.
Bild d. CD1c autoreaktiver Klon 3C8.
5 (Bilder a–c). Auf CD1b beschränkte Präsentation von M. tuberculosis Antigen erfordert keine MHC Klasse II Region codierten Moleküle, sondern umfasst eine Antigen-Prozessierung mit Hilfe eines Chloroquin-sensitiven Pfades.
Bild a. Lyse von CD1-T2 Transfektanen durch T-Zelllinie DN1. T2-Zellen, die ausschließlich mit Vektor-DNA (scheintransfiziert) transfiziert sind, sind mit Kreisen gekennzeichnet, und T2-Zellen, die mit CD1b transfiziert sind, sind mit Dreiecken gekennzeichnet. Weiße Symbole repräsentieren Ziel-Zellen, die nicht mit M. tuberculosis vorinkubiert waren, schwarze Symbole repräsentieren Zielzellen, die 12 Stunden mit M. tuberculosis (10 μg Protein/ml) vorinkubiert waren. Durchflusscytometrische Analyse zeigte, dass eine Inkubation mit CD1b transfizierten T2-Zellen mit M. tuberculosis keinen Effekt auf eine CD1b-Expression besaß (Daten nicht gezeigt).
Bild b. Glutaraldehyd-Fixierung von CD1b⁺ APCs verhindert eine Präsentation von M. tuberculosis der DN1-Linie. CD1b⁺ APCs (GM-CSF- und IL-4-behandelte mononukleäre Zellen des peripheren Bluts PBMCs) waren 12 Stunden in Anwesenheit von M. tuberculosis (1 μg Protein/ml; „gepulste APCs") oder ausschließlich in Medium („nicht gepulste APCs") kultiviert, geerntet und ein Aliquot jeder Zellsuspension wurde mit 0,0125% Glutaraldehyd 30 Sekunden fixiert. Die resultierenden APC-Präparate wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Proliferation der Linie DN1 in Abwesenheit (weiße Balken) oder Anwesenheit (schwarze Balken) von löslichem M. tuberculosis Antigen (1 μg Protein/ml) zu stimulieren.
Bild c. Hemmung der CD1b-beschränkten Präsentation von M. tuberculosis durch Chloroquin. CD1b⁺ APCs von HLA-DR7⁺ Individuum wurden mit M. tuberculosis Antigen 60 Minuten bei Vorliegen der angegebenen Chloroquin-Konzentration gepulst, mit Glutaraldehyd fixiert und als APCs in Proliferationstests mit Linie DN1 (schwarze Kreise) oder mit der M. tuberculosis spezifischen, HLA-DR7⁺ beschränkten CD4+ T-Zelllinie DG.1 (weiße Dreiecke) verwendet. Die Ergebnisse sind in der prozentualen Hemmung der Antworten im Vergleich zu fixierten APCs, die mit M. tuberculosis ohne Chloroquin gepulst waren, ausgedrückt und sind für drei ähnliche Versuche repräsentativ.
6. Wirkung des Verdaus von Antigen mit den angegebenen Proteasen auf die proliferative Antwort der T-Zelllinie DG.1 auf M. tuberculosis Antigen.
7. Wirkung des Verdaus von Antigen mit den angegebenen Proteasen auf die proliferative Antwort der T-Zelllinie DN 1 auf M. tuberculosis Antigen.
B. Wirkung des Verdaus von Antigen mit den angegebenen Proteasen auf die proliferative Antwort der T-Zelllinie DG,1 auf M. fortuitum Antigen.
9. (Bilder a–c). Das mykobakterielle Antigen, das von einer DN α:β TCR⁺ T-Zelllinie erkannt wird, verteilt sich quantitativ in seiner organischen Phase nach Extraktion mit organischen Lösemitteln und ist auf CD1b beschränkt. Extraktion mit organischen Lösemitteln unterscheidet zwischen dem CD1b-beschränkten mykobakteriellen Antigen und mykobakteriellen Antigenen, die von herkömmlichen MHC Klasse II beschränkten CD4⁺ α:β TCR+ T-Zelllinie erkannt werden, und dem kleinen mycobakteriellen Nichtprotein-Liganden, der von DN α:β (Vγ2Vδ2) TCR⁺ T-Zellen erkannt wird. Pfeffer, K., et al., J. Immunology 148: 575–583 (1992). Mykobakterielle Gesamtbeschallungen wurden mit Chloroform/Methanol/H₂O extrahiert und die resultierenden drei Phasen wurden durch Kultivieren von T-Zellen mit CD1⁺ Monocyten und den angegebenen Verdünnungen der verschiedenen Antigenpräparaten getestet.
Bild a. Proliferative Antwort von der auf CD1-beschränkten DN T-Zelllinie DN1 auf mycobakterielle Gesamtbeschallungen
gestrichelte Linie), organische Phase (⎕, durchgezogene Linie), wässrige Phase (O, durchgezogene Linie) oder Interpase
durchgezogene Linie). Antigen-Konzentration auf der x-Achse als 1/Verdünnung, normalisiert auf den Standard der Gesamtbeschallungspräparate.
Bild b. Proliferative Antwort der HLA-DR7 (MHC) beschränkten Mycobakterien spezifischen CD4⁺ T-Zelllinie DG.1 auf Mycobakterien-Fraktionen nach Extraktion mit organischen Lösemitteln.
Bild c. Proliferative Antwort auf den Vγγ2Vδ2 T-Zellklon DG.SF68 Mycobakterien-Fraktionen nach Extraktion mit organischen Lösemitteln.
10. Cytolytische Antwort der DN1-Zellinie auf CD1-Transfektanten von C1R-Zellen, die mit mycobakteriellen Antigenpräparaten gepulst waren. CD1b oder CD1c Transfektanten (Porcelli, S., et al., Nature 341: 447–450 (1989)) von C1R-Lymphoblastenzellen, die entweder mit M. tuberculosis Antigenpräparaten nach Extraktion mit organischen Lösemitteln (+) oder ausschließlich Medium (-) gepulst waren, wurden als Ziele in cytolytischen Standardtests verwendet. Eine Erkennung durch die T-Zelllinie DN1 von C1R-Zellen, die mit CD1b transfiziert waren, erfolgte nur, wenn sie mit Antigen gepulst waren. Es erfolgte keine spezifische Antigen-Erkennung der CD1c⁺ Ziele.
11. Die chemische Struktur von 6,6 Trehalosedimycolat (Cordfaktor).
12. (Bilder a–c). Das von der auf CD1b-beschränkten T-Zelllinie DN1 erkannte Mycobakterien-Antigen ist Mycolsäure.
Bild a. Die proliferative Antwort von der auf CD1b-beschränkten T-Zelllinie DN1 korreliert mit Mycolsäure-Peaks der C18 Umkehrphasen-HPLC. Die gereinigten mycobakteriellen Acylketten-Fraktion, die gesamte auf CD1b-beschränkte Antigen enthält, wurde unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC chromatographiert und die resultierenden Fraktionen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, eine proliferative Antwort von der T-Zelllinie DN1 zu stimulieren. Der obere Teil des Bilds zeigt das Absorptionsspektrum bei 254 Ångström (ausgedrückt als optische Dichte, OD, x 10^–4) (durchgezogenen Linie) des eluierten Materials und die entsprechende Methylenchlorid-Konzentration (gestrichelte Linie) des Elutionsgradienten. Der große Absorptionspeak, der zwischen 2 und 6 Minuten eluiert, ist frei vom Derivatisierungsmittel Bromphenacylbromid. Der untere Teil des Bildes zeigt die proliferative Antwort der T-Zelllinie DN1 auf jede Eine-Minute-Fraktion. Die auf CD1b-beschränkte Antigen-Antwort ist als ein breiter Peak, der mit Mycolsäure korreliert, zu erkennen.
Bild b. Verseiftes 6,6 Trehalosedimycolat (Cordfaktor), nicht aber verseiftes Trehalosedibehenat stimuliert eine proliferative Antwort von der auf CD1b-beschränkten T-Zelllinie DN1. Mycolsäuren wurden durch Verseifen von gereinigtem Trehalosedimycolat entweder von M. tuberculosis (H37Ra) oder M. kansasii gebildet. Trehalosedibehenat (synthetischer Cordfaktor) wurde auf die selbe Weise behandelt. Antigen-Konzentration ist in μg/ml vom Cordfaktor auf der x-Achse angegeben.
Bild c. Umkehrphasen-HPLC Analyse von gereinigtem Trehalosedimycolat von M. tuberculosis (H37Ra) führt zur Stimulierung der auf CD1b-beschränkten T-Zelllinie DN1 durch Fraktionen, die Mycolsäure-Peaks entsprechen. Das verseifte Trehalosedimycolat von M. tuberculosis wurde wie in dem in Bild a gezeigten Versuch chromatographiert und Fraktionen wurden auf die Fähigkeit getestet, eine proliferative Antwort von der Linie DN 1 zu induzieren. Wie es aus Bild a ersichtlich ist, korreliert die Bioaktivität mit frühen Mycolsäure-Peaks.
13. Cytolytische Antwort der DN1 T-Zelllinie auf CD-Transfektanten von C1R-Zellen, die mit Mycolsäure, die durch Verseifung von M. tb. Cordfaktor (Sigma) dargestellt war, gepulst waren. CD1a, CD1b, CD1c oder Scheintransfektanten von C1R-Lymphoblastenzellen wurden mit aus Trehalosedimycolat hergestellten Mycolsäuren (+) oder nur mit Medium (-) gepulst, und als Ziele in cytolytischen Tests verwendet, deren Ergebnisse als % spezifische Lyse angegeben sind.
14. Mycolsäure ist nicht mitogen, sondern ist ein spezifisches auf CD1b-beschränktes Antigen und wird von der T-Zelllinie DN1 erkannt. Vier für Mycobakterien spezifische T-Zelllinien und zwei zusätzliche T-Zelllinien wurden auf die Fähigkeit getestet, entweder auf Gesamteschallungen von M. tuberculosis, Mycolsäure-Präparaten von gereinigtem Cordfaktor oder HPLC-gereinigte Mycolsäuren entweder von Beschallungen von M. tb. oder Cordfaktor zu antworten. Die Antworten dreier repräsentativer Mycobakterien spezifischer T-Zelllinien sind gezeigt, DN1
(DN, CD1b-beschränkt, α:β TCR⁺), DG.1 (⎕) (CD4⁺, HLA-DR7 beschränkt, α:β TCR⁺) und DN6 (O) (DN, CD1c-beschränkt, α:β TCR⁺). Für alle sechs T-Zelllinien getesteten APCs waren identisch GM-CSF- und IL-4-behandelte (CD1⁺) PBMCs von einem HLA-DR7 positiven Individuum.
Oberer Teil. Proliferative Antworten von drei für Mycobakterien spezifischen T-Zelllinien auf Gesamtbeschallungen von M. tb. (H37Ra, Sigma). Antigen-Konzentration ist auf der x-Achse als cpm × 10^–3 angegeben. Die drei gezeigten T-Zelllinien antworten alle auf Gesamtbeschallungen von Mycobakterien.
Mittlerer Teil. Proliferative Antwort auf HPLC-gereinigte Mycolsäuren, die aus M. tb. Beschallungen isoliert sind. Nur die auf CD1b.beschränkte T-Zelllinie DN1 antwortet auf gereinigte Mycolsäure.
Unterer Teil. Proliferative Antworten auf HPLC-gereinigte Mycolsäuren, die aus gereinigtem M. tb. Cordfaktor (Sigma) dargestellt sind. Nur die auf CD1b-beschränkte T-Zelllinie proliferiert als Antwort auf Cordfaktor Mycolsäuren. Nicht gezeigt sind drei weitere, im gleichen Versuch getestete T-Zelllinien SP-F3 (Roncarlo, M. G., et al., J. Exp. Medicine 168: 2139–2152 (1988)) (CD4⁺ α:β TCR⁺, DR-beschränkt, spezifisch für Tetanustoxoid), CP.1.15 (Morita, C. T., et al., Eur. J. Immunol. 21: 2999–3007 (1991)) (DN, Vγ2Vδ2 TCR⁺, spezifisch für Mycobakterien), BK6 (Porcelli, S., Nature 341: 447–450 (1989) (DN, α:β TCR⁺, autoreaktiv gegen CD1a). Alle drei antworteten nicht auf gereinigte Mycolsäuren, aber zwei proliferierten als Antwort auf ihr spezifisches Antigen (Tetanustoxoid – SP-F3, < 1 kDa M. tuberculosis Präparat – CP.1.15). BK6 zeigt cytolytische Aktivität gegen CD1a, aber ist nicht in der Lage, als Antwort auf CD1a⁺ APCs eines beliebigen getesteten Typs zu proliferieren. Porcelli, S., Nature 341: 447–450 (1989).
15. Wirkung der angegebenen monoklonalen Antikörper auf die proliferative Antwort von T-Zelllinie 2.13.DN1 (DN1, oberes Bild) und 8.23.DN1 (DN2, unteres Bild).
16. Auf CD1c beschränkte Präsentation von M. tuberculosis Antigen der T-Zelllinie DN2. Die Ergebnisse von cytolytischen Tests von CR1-Zellen, die mit Vektor (scheintransfiziert, Bild a) und mit DNA-Molekülen transfiziert sind, die das angegebene CD1-Protein (CD1a, CD1b und CD1c) codieren, worin die transfizierten Zellen entweder mit (schwarze Kreise) oder ohne (weiße Kreise) M. tuberculosis vorinkubiert waren.
17. Auf CD1c beschränkte Präsentation von M. tuberculosis Antigen der T-Zelllinie DN6. Die Ergebnisse von cytolytischen Tests von CR1-Zellen, die mit Vektor (scheintransfiziert, Bild a) und mit DNA-Molekülen transfiziert sind, die das angegebene CD1-Protein (CD1a, CD1b und CD1c) codieren, worin die transfizierten Zellen entweder mit (schwarze Kreise) oder ohne (weiße Kreise) M. tuberculosis vorinkubiert waren.
18. Proliferative Antwort der auf CD1c-beschränkten Zelllinie DN6 auf M. tb. Antigene in Beschallungen nach Extraktion der Antigene mit organischen Lösemitteln. Proliferation ist in cpm (³H-Thymidin-Einbau) auf der y-Achse angegeben. APCs waren CD1 exprimierende Monocyten. Antigene wurden über 6 logs titriert und die Ergebnisse eines repräsentativen Werts (1 : 3.750 Verdünnung des Antigens) sind gezeigt. cpm des Hintergrunds (ausschließlich Medium als Kontrolle) wurden von allen Werten abgezogen.
19. Proliferative Antwort der auf CD1c-beschränkten Zelllinie DN6 auf M. tb. Antigene in Beschallungen vor und nach Verseifung der Antigene. Proliferative Antwort in cpm ist auf der y-Achse angegeben und die Antigen-Konzentration (als 1/Verdünnung angegeben) ist auf der x-Achse gezeigt. Das Äquivalent von 10 mg M. tb. (Stamm H37Ra; Difco) wurde in PBS beschallt und war entweder direkt verwendet oder zuerst verseift. Alle Antigen-Verdünnungen wurden auf die anfängliche Standardkonzentrationen von 200 mg lyophilisierten Bakterien in 5 ml normiert.
Beschreibung der bevorzugten Anwendungsformen
Glossar
Antigen: Ein Molekül oder eine Zusammensetzung einer Sache, die (1) eine Immunantwort in einem Tier induziert und (2) mit einer oder mehreren Antigenerkennenden Komponenten des Immunsystems des Tiers spezifisch wechselwirkt.
Fremdartigen: Ein Antigen, das für ein normales, gesundes Tier nicht endogen ist.
Autoimmunes Antigen: Ein normales endogenes Molekül oder Zusammensetzung einer Sache in einem Tier, das/die ein Antigen in einer Autoimmunerkrankung ist. Gleichbedeutend mit „Selbstantigen" und „Autoantigen".
CD1-präsentiertes Antigen: Ein Antigen, das von einem Mitglied der CD1-Proteinfamilie gebunden und auf der Oberfläche einer CD1⁺ APC gezeigt wird. CD1-präsentierte Antigene variieren in ihrer Größe und Zusammensetzung in Abhängigkeit ihres Ursprungs und dem Mitglied der CD1-Familie, von dem sie erkannt sind. Wie hier verwendet, umfasst der Ausdruck „CD1-präsentiertes Antigen" diejenigen hier identifizierten Antigene und/oder diejenigen Antigene, die unter Verwendung der hier offengelegten Verfahren isoliert sind. Gleichbedeutend mit „auf CD1-beschränktes Antigen". „CD1-gebundenes Antigen" bezeichnet ein CD1-präsentiertes Antigen, das an sein passendes CD1-Molekül gebunden ist.
CD1-Proteinfamilie: Eine Sammlung Proteine, die durch ihre Struktur, immunologische Kreuzreaktivität und/oder Einteilung, mit bekannten CD1-Molekülen verwandt zu sein, identifiziert worden ist. Ein spezifisches CD1-Protein kann als ein Mitglied der CD1-Proteinfamilie bezeichnet werden. Mitglieder der CD1-Proteinfamilie umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d und CD1e (siehe Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137–183 (1991)).
CD1-positive Zelle: Eine Zelle, die ein oder mehrere Mitglieder der CD1-Proteinfamilie exprimiert und zeigt. Gleichbedeutend mit „CD1⁺ Zelle". Der Fachmann kann die hier beschriebenen oder in der Technik bekannten Verfahren anwenden, um zu bestimmen, ob eine Zelle ein oder mehrere Mitglieder der CD1-Proteinfamilie exprimiert (siehe Beispiel 1 und Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137–183 (1991)).
Antigen präsentierende Zelle (APC): Eine Zelle, die Antigen-Moleküle auf ihrer Oberfläche über Protein-Carrier zeigt, und die T-Zellen Antigen präsentiert. Antigenbindende Protein-Carrier umfassen MHC Klasse I Moleküle, MHC Klasse II Moleküle und CD1-Moleküle; die entsprechenden APCs werden als MHC I⁺ APCs, MHC II⁺ APCs und CD1⁺ APCs bezeichnet.
CD1-beschränkte T-Zelle: Ein reifer TCR positiver (TCR⁺) Lymphocyt des peripheren Bluts, der ein CD1-gebundenes CD1-präsentiertes Antigen erkennen kann. Die Definition von CD1-beschränkten T-Zellen ist enger als die anerkannte Definition in der Technik für T-Zellen, da sie auf eine Untergruppe T-Zellen begrenzt ist, die mit einem CD1-gebundenen CD1-präsentierten Antigen wechselwirken. Die bevorzugten CD1-beschränkten T-Zellen der vorliegenden Erfindung sind als CD4^–8^– charakterisiert.
CD4^–8^– T-Zelle: Ein reifer TCR positiver (TCR⁺) Lymphocyt des peripheren Bluts, der weder CD4 noch CD8 exprimiert. Gleichbedeutend mit „doppelt negative T-Zelle" und „DN T-Zelle". Techniken zur Identifizierung von CD4^–8^– T-Zellen sind in der Technik bekannt und können ohne weiteres in der vorliegenden Erfindung angewandt werden, zum Beispiel unter Verwendung der Durchflusscytometrie, wie in Beispiel 1 und in Panchomoorthy, G., et al., J. Immuno. 147: 3360–3369 (1991) beschrieben. Unter Verwendung derartiger Verfahren sind drei CD4^–8^– T-Zelllinien, als DN1, DN2 und DN6 bezeichnet, isoliert worden und hier beschrieben. DN2 und DN6 scheinen gleichartig zu sein, mit Ausnahme dass DN6 eine bessere Wachstumsrate zeigt.
Adjuvans: Ein Molekül oder Zusammensetzung einer Sache, die, wenn sie in ein Tier mit einem Antigen gegeben ist, die Immunantwort auf dieses Antigen verstärkt.
Gentechnisch verändert: Unterziehen einer menschlichen Manipulation, mit der Absicht, eine genetische Änderung einzuführen.
Probe: Eine beliebige Lösung, Emulsion, Suspension oder Extrakt, der/die unter Anwendung der hier offengelegten Verfahren getestet werden kann. Eine Probe kann, ist aber hierauf nicht beschränkt, ein löslicher Extrakt oder ein organischer Extrakt sein. Beispiel 1 und 2 stellen verschiedene von Mycobacterium tuberculosis abstammende Probenarten bereit.
Inkontaktbringen: Der Vorgang der Inkubation eines Gegenstands bei Anwesenheit eines anderen. Deshalb ist eine Zelle mit einer Probe in Kontakt gebracht, wenn die Zelle mit einer Probe inkubiert wird.
Fraktionierung: Eine Probe wird Bedingungen oder Verfahren unterzogen, die die Komponenten, beruhend auf physikalischen oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise aber hierauf nicht beschränkt, Größe, Ladung, Löslichkeit oder Zusammensetzung, trennen. Beispiele für Fraktionierungsverfahren umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, selektive Fällung, organische Extraktion, Größenausschluss-Dialyse oder -Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie.
Expression: Der Herstellungsvorgang eines Genprodukts durch Transkription eines DNA-Moleküls, um ein entsprechendes mRNA-Molekül zu erzeugen, das von Ribosomen und assoziierten Zellfaktoren in ein Polypeptid translatiert wird.
Zeigen: Der Vorgang der Lokalisierung eines Proteins oder Protein : Antigen Komplexes auf der äußersten Oberfläche einer Zelle, wo das Protein oder der Protein : Antigen Komplex für eine zweite Zelle oder für Moleküle, die von einer zweiten Zelle gezeigt sind, zugänglich ist. Von einem Protein oder Protein : Antigen Komplex wird angenommen, dass er von einer Zelle gezeigt ist, wenn er auf der äußersten Oberfläche der Zelle vorliegt und somit für eine zweite Zelle und/oder für Moleküle, die von einer zweiten Zelle gezeigt sind, zugänglich ist.
Antigen-Prozessierung: Der Vorgang, mit dem ein Antigen von Zellfaktoren behandelt wird, um für das Zeigen kompetent gemacht zu werden.
CD1-blockierendes Mittel: Eine Zusammensetzung oder Komponente, die in der Lage ist, die Wechselwirkung eines CD1-präsentierten Antigens mit CD1 zu blockieren, oder die Wechselwirkung zwischen CD1: Antigen Komplexen und ihren verwandten T-Zellrezeptoren zu blockieren. Blockierungsmittel umfassen (1) Mittel, die an CD1 binden, (2) Mittel, die an ein CD1-präsentiertes Antigen binden, (3) Mittel, die an einen CD1: Antigen Komplex binden, (4) Mittel, die an einen T-Zell-rezeptor binden, der einen CD1: Antigen Komplex erkennt, und (5) Mittel, die das Prozessieren eines CD1-präsentierten Antigens verhindern.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der neuen und unerwarteten Beobachtung, dass CD1-Moleküle dazu dienen, T-Zellen Antigene zu präsentieren. Die Erfindung beruht außerdem auf der Beobachtung, dass Zellen zur Expression von CD1 induziert werden können und deshalb kompetent werden können, T-Zellen Antigene zu präsentieren, durch Inkontaktbringen der Zellen mit Zytokinen wie beispielsweise Granulocyten/Makrophagen Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) und Interleukin-4 (IL-4). Auf Grundlage dieser beiden Beobachtungen legt die Erfindung verschiedene Verfahren zur Bestimmung, ob eine Probe ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, Verfahren zur Isolierung und Reinigung von CD1-präsentierten Antigenen, gereinigte CD1-präsentierte Antigene, die mit den hier offengelegten Verfahren isoliert sind, wie auch Verfahren zur Isolierung von CD1-positiven Zellen, die in der Lage sind, bei Identifizierung, Isolierung und Reinigung von CD1-präsentierten Antigenen Verwendung zu finden.
In einer Anwendungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bestimmung bereit, ob eine Probe ein CD1-präsentiertes Antigen enthält. In einem derartigen Verfahren kann das Vorhandensein eines CD1-präsentiertes Antigens durch ein erstes Inkontaktbringen der Probe mit einer CD1-positiven Zelle, zweitens Inkontaktbringen der Zelle des ersten Schrittes mit einer T-Zelle und dann Messen der T-Zellproliferation bestimmt werden.
Es sind Verfahren zur Charakterisierung von T-Zellklassen und zur Isolierung von T-Zellsubpopulationen beschrieben worden. Wysocki, L. J. und Sato, V. L., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 2844–2848 (1978); Wasik, M. A. und Morimoto, C., J. Immunol. 144: 3334–3340 (1990); Harriman, G. R., et al., J. Immunol. 145: 4206–4214 (1990); Koulova, L., et al., J. Immunol. 145: 2035–2043 (1990); Steward, M. und Male, D., Kapitel 25 in Immunology, 2. Ausgabe, Roitt, I., et al., eds., Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Verfahren zur Kultivierung von T-Zellen in vitro und zur Immortalisierung von T-Zellen durch Fusion mit nicht wachsenden, beschränkten Zellen, wie beispielsweise Myeloma, sind beschrieben worden. Paul, W. E., et al., Nature 294: 697–699 (1981); Williams, N., Nature 296: 605–606 (1982). Verfahren zur Identifizierung von CD4^–8^– T-Zellen sind in der Technik bekannt und können ohne weiteres in der vorliegenden Erfindung angewandt werden, zum Beispiel Verwendung der Durchflusscytometrie, wie es in Beispiel 1 und von Panchomoorthy, G., et al., J. Immuno. 147: 3360–3369 (1991) beschrieben ist. Die vorliegende Erfindung entwickelt diese Techniken weiter, indem sie Verfahren zur Anreicherung von T-Zellpopulationen zur Gewinnung isolierter T-Zellklone, die gegen CD1-präsentierte Antigene reaktiv sind, bereitstellt. Eine Population T-Zellen darf sich teilen und eine Subpopulation gemischter T-Zellen wird isoliert, beruhend auf der Proliferation bei Anwesenheit von CD1⁺ APCs und CD1-präsentiertem Antigen oder auf der cytolytischen Aktivität gegen transfizierte Zellen, die CD1-Moleküle in Anwesenheit eines CD1-präsentierten Antigens exprimieren. Unter Anwendung derartiger Verfahren sind drei CD4^–8^– T-Zelllinien, als DN1, DN2 und DN6 bezeichnet, isoliert worden und hier beschrieben. DN2 und DN6 scheinen gleichwertig zu sein, mit der Ausnahme, dass DN6 eine bessere Wachstumsrate zeigt.
Ebenfalls beschrieben ist die Induktion der CD1-Expression auf einer Zelle. In einem derartigen Verfahren kann eine Zelle zur Expression von CD1durch Inkontaktbringen der Zelle mit einem oder mehreren Zytokinen induziert werden. Die bevorzugten Zytokine für eine CD1-Induktion sind Granulocyten/Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), GM-CSF in Kombination mit Interleukin-4 (IL-4) oder Interleukin-3 (IL-3). In Beispiel 1 ist offengelegt, dass Monocyten zur Expression verschiedener Mitglieder der CD1-Familie induziert werden können durch Inkontaktbringen der Monocyten mit jeweils 100 Einheiten GM-CSF und IL-4 60 Stunden in mit 10% fötalem Kälberserum supplementiertem RPMI-1640. Unter Verwendung der hier offengelegten Methoden und Materialien kann der Fachmann ohne weiteres die Kontaktzeit, den Zytokin-Typ und Konzentration sowie die Kontaktbedingungen variieren, um ähnliche Ergebnisse zu erhalten, solange der Kontaktschritt für Induktion einer CD1-Expression hinreichend ist.
Mehrere Verfahren zur Bestimmung der Proliferation von T-Zellen sind in der Technik bekannt und können in den obigen Methoden angewandt werden. Der Fachmann kann ohne weiteres derartige Verfahren für die Anwendung in der vorliegenden Erfindung anpassen. Ein derartiges in Beispiel 1 beschriebenes Verfahren, misst die Einbaurate von ³H-Thymidin mittels Flüssigszintillation und mit in Morin, C. T., et al., Eur. J. Immunology, 21: 2999–3007 (1991) beschriebenen Verfahren.
Es sind ebenfalls Methoden zur Isolierung eines CD1-präsentierten Antigens beschrieben. In einer derartigen Methode wird eine Probe zuerst unter Anwendung herkömmlicher Verfahren fraktioniert. Die Probenfraktionen werden nun auf das Vorhandensein eines CD1-präsentierten Antigens, wie oben knapp dargelegt, getestet. Beispiele 2 und 3 beschreiben Fraktionierungsverfahren unter Anwendung einer organischen Extraktion mit Chloroform : Methanol und Kieselsäure-Chromatographie, um eine Probe, die einen Extrakt von M. tuberculosis enthält, zu fraktionieren, um ein CD1-präsentierten Antigen zu reinigen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Methoden zur Isolierung eines CD1-präsentierten Antigens bereit, die auf der Bindungsspezifität von CD1 mit einem CD1-präsentierten Antigen beruhen. In einem derartigen Verfahren wird eine Probe, die ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, zuerst entweder mit gereinigtem CD1 oder mit einer Zelle, die CD1 exprimiert und zeigt (eine „CD1+ Zelle"), in Kontakt gebracht. Der resultierende Antigen: CD1 Komplex oder Antigen: CD1⁺ Zellkomplex wird dann von der Probe getrennt. Unter Verwendung eines derartigen Verfahrens wird ein gereinigter Antigen: CD1 Komplex oder Antigen: CD1⁺ Zellkomplex erhalten. Um das CD1-präsentierte Antigen noch weiter zu reinigen, wird jeder Komplex-Typ unter geeigneten Bedingungen behandelt, so dass das CD1-gebundene Antigen von dem CD1-Molekül abgegeben wird.
Die obigen zwei Isolierungsmethoden können vom Fachmann kombiniert sein, um weitere Methoden zur Isolierung von CD1-präsentierten Antigenen abzuleiten. Bei einer derartigen Kombination wird eine Probe, wie oben beschrieben, fraktioniert bevor ein Reinigungsverfahren durchgeführt wird, das auf der Bindung eines CD1-präsentierten Antigens an CD1beruht.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem CD1-präsentierte Antigene bereit, die unter Anwendung der hier offengelegten Verfahren identifiziert und isoliert sind. Anders als MHC-präsentierte Antigene sind CD1-präsentierte Antigene keine Polypeptide. Ein CD1-präsentiertes Nichtpeptid-Antigen, das in Beispielen 2–4 genauer beschrieben ist, ist ein von M. tuberculosis isoliertes Lipid-Antigen, das Mycolsäuren umfasst. Ein anderes CD1-präsentiertes Antigen, das in Beispiel s und 6 beschrieben ist, ist ein komplexeres Lipid. Derartige Antigene werden für Impfstoffformulierung und entwicklung verwendet.
Die CD1-präsentierten Antigene der vorliegenden Erfindung (die unter Anwendung der hier offengelegten Verfahren identifiziert und isoliert sind) sind ohne weiteres als Impfstoffe zu verwenden. Ein Fachmann kann Routineverfahren zur Formulierung eines isolierten CD1-präsentierten Antigens zur Verwendung als einen Impfstoff anwenden. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Gennaro, A. R., Herausgeber, Mack, Easton, 1990; The Pharmacologist Basis of Therapeutics, 7. Ausgabe, Gilman, A. G., et al., eds., MacMillian, New York, 1985.
Die CD1-präsentierten Antigene der vorliegenden Erfindung können, wie es hier offengelegt ist, über einen großen Reinheitsbereich gereinigt sein. Ein Fachmann weiß die verschiedenen Reinigungsstrategien anzuwenden, um ein CD1-präsentiertes Antigen zu erhalten, das in erforderlichem Ausmaß für die beabsichtigten Zwecke gereinigt worden ist.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines gereinigten CD1-Antigens formuliert sein oder unter Verwendung eines CD1-gebundenen Antigens formuliert sein. Weil CD1-beschränkte Antigene T-Zellen als ein Komplex aus Antigen und CD1 präsentiert sind, kann die Verwendung eines Antigen: CD1 Komplexes in manchen Fällen bessere Immunisierungseigenschaften bereitstellen.
Es sind ebenfalls Tests auf Inhibitoren von CD1-beschränkter Antigenpräsentation für T-Zellen, d. h. CD1-blockierende Mittel, beschrieben. In einem derartigen Test ist die CD1-Antigenpräsentation durch Verwendung eines CD1-blockierenden Mittels gehemmt, das die Fähigkeit eines CD1-beschränkten Antigens, an CD1 zu binden, blockiert. Wie hier verwendet, wird von einem CD1-blockierenden Mittel angenommen, dass es die „CD1-beschränkte Antigenpräsentation hemmt", wenn das CD1-blockierende Mittel (1) das Binden eines CD1-präsentierten Antigens an ein CD1-Molekül verringert oder (2) das Binden eines CD1 : CD1-präsentiertes Antigen Komplexes an seine verwandten T-Zellrezeptoren verringert. Einige CD1-blockierende Mittel sind in der Lage, dieses Binden auf nicht mehr nachweisbare Levels zu verringern, während andere CD1-blockierende Mittel nur zu einer geringfügigen Verringerung führen. CD1-blockierende Mittel umfassen (1) Mittel, die an CD1 binden, (2) Mittel, die an CD1-präsentiertes Antigen binden, (3) Mittel, die an den CD1: Antigen Komplex binden und (4) Mittel, die an T-Zellrezeptoren binden, die den CD1: Antigen Komplex erkennen. Diesbezügliche Beispiele für blockierende Mittel umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, (1) polyklonale oder monoklonale Antikörper, die an den Teil eines CD1-Moleküls binden und diesen blockieren, der ein CD1-präsentiertes Antigen bindet, (2) polyklonale oder monoklonale Antikörper, die an den Teil eines CD1-präsentierten Antigens binden und diesen blockieren, der CD1 bindet, (3) synthetische Oligopeptide, die von dem CD1: Antigen-bindenden Teil eines T-Zellrezeptors abstammen und die an den Teil des CD1: Antigen Komplexes binden und diesen blockieren, der von intakten T-Zellrezeptoren gebunden wird und (4) synthetische Verbindungen, umfassend ein CD1-präsentiertes Antigen, das an ein gereinigtes CD1-Molekül oder an ein synthetisches Derivat davon chemisch gebunden ist.
In einer Alternative zur Hemmung der Antigenpräsentation von CD1-beschränkten Antigenen kann ein CD1-blockierendes Mittel eingesetzt sein, das die Wechselwirkung des Antigen: CD1 Komplexes mit den TCR-Molekülen auf der T-Zelle blockiert. Durch Hemmung des Präsentationsschrittes kann die Aktivierung einer spezifischen Untergruppe T-Zellen inhibiert werden. Pilotversuche zur Behandlung von Menschen, die an einer Autoimmunerkrankung (MS) leiden, mit Peptiden, die von TCR-Molekülen abstammen, werden gegenwärtig gemacht. Oksenberg, J. R., et al., J. Neurol. Sci. 115 (Suppl.): S29–S37 (1993). DNA-Moleküle, die TCR-Polypeptide codieren, die von den die CD1-präsentierten Antigene erkennenden T-Zellen gezeigt sind, sind gemäß den in der Technik bekannten Methoden isoliert worden. Oksenberg, J. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 988–992 (1989); Oksenberg, J. R., et al., Nature 345: 344–346 (1990) und erratum, Nature 353: 94 (1991); Uematsu, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 534–538 (1991); Panzara, M. A., et al., Biotechniques 12: 728–735 (1992); Uematsu, Y., Immunogenet. 34: 174–178 (1991). Die DNA-Sequenz wird in eine Peptid-Sequenz umgewandelt und der Teil der Polypeptid-Sequenz, der der Antigen-bindenden variablen Region eines TCR-Polypeptids entspricht, wird verwendet, um synthetische Oligopeptide zu entwickeln, die CD1: Antigen Komplexe auf ACPs binden und dadurch eine Antigenpräsentation hemmen. Oligopeptide sind gemäß Standardverfahren (Steward und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemicals Co., Rockland, Illinois, 1985) chemisch synthetisiert und aus Reaktionsmischungen mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt. Zusätzlich oder alternativ sind Methoden zum Erzeugen von anti-TCR Antikörpern und anti-TCR bindenden Peptiden in der Technik bezüglich MHC-Präsentation bekannt und können ohne weiteres dem hier offengelegten CD1-Präsentationssystem angepasst werden. Strominger, J. L., Cell 57: 895–898 (1989); Davis, M. M. und Bjorkman, P. J., Nature 334: 395–404 (1989).
Ein Fachmann kann ohne weiteres bekannte Methoden der Antikörper-Bildung ebenso wie die zweckmäßige Entwicklung von Blockierungsmitteln einsetzen, um die blockierenden Mittel der vorliegenden Erfindung zu gewinnen. Harlow, E. und Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Synthetic Peptides: Answers Guide, Freeman, W. H., New York, 1991; Kasprzak, A. A., Biochemistry 28: 9230–9238 (1989). Zusätzlich oder alternativ können Bibliotheken molekular verschiedenartiger Moleküle auf einzelne Mitgliedsmoleküle durchmustert werden, die CD1-blockierende Mittel sind. Wirksame CD1-blockierende Mittel werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, CD1-vermittelte proliferative und/oder cytolytische T-Zellantworten unter Verwendung der hier beschriebenen Materialien und Methoden zu hemmen.
Die Anwendungsformen der oben beschriebenen Erfindung können für die angegebenen Zwecke allein oder in Kombination miteinander oder anderen komplementären Methoden und/oder Zusammensetzungen angewandt sein.
Die Art und Methode zur Durchführung der vorliegenden Erfindung kann noch besser vom Fachmann mit Bezug auf die folgenden Beispiele verstanden werden, wobei die Beispiele in keinster Weise den Rahmen der vorliegenden Erfindung oder der hierauf gerichteten Ansprüche einschränken.
Beispiel 1: Antigenpräsentation von CD1b
Methoden
Durchflusscytometrie wurde wie zuvor beschrieben (Panchamoorthy, G., et al., J. Immunology 147: 3360–3369 (1991)) unter Verwendung folgender monoklonaler Antikörper (mAk) durchgeführt: P3 (IgG1 Kontrolle; Panchamoorthy, G., et al., J. Immunology 147: 3360–3369 (1991)), OKT6 (anti-CD1a; Reinherz, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci, (USA) 77: 1588–1592 (1980)), 4A7.6 (anti-CD1b; Olive, D., et al., Immunogenetics 20: 253–264 (1984)), 10C3 (anti.CD1c; Martin, L. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 9189–9193 (1987)), W6/32 (anti-HLA-A, B, C; Brodsky, F. M. und Parham, P. P., J. Immunology 128: 129–135 (1982)), BMA031 (anti-α:β TCR; Lanier, L. L., et al., in Leukocyte Typing III McMichael, A. J., Herausgeber, Seiten 175–178, Oxford University Press 1987), OKT4 (anti-CD4; Reinherz, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 1588–1592 (1980)), OKT8 (anti-CD8α; Reinherz, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 1588–1592 (1980)) und 2ST8-5H7 (anti-CD8β; Shiue, L., et al., J. Exp. Med. 168: 1993–2005 (1988)).
Monocyten waren aus Leukocyten-Konzentraten normaler Spender mittels Kunststoff-Adhärenz (Anegon, I., et al., Immunology 147: 3973–3980 (1991)) und mittels Inkubation bei 37°C in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) mit 0,53 mM EDTA (PBS/EDTA) abgelöst. Adhärente Zellen waren typischerweise >90% CD14⁺ und MHC Klasse II⁺ und negativ für CD1a, CD1b und CD1c wie es mittels Oberflächenfärbung bestimmt wurde (Daten nicht gezeigt). Um eine CD1-Expression zu induzieren, waren die Monocyten in RPMI-1640 (Gibco), das 10% fötales Kälberserum (FCS, Hyclone) mit jeweils 100 Einheiten GM-CSF und IL-4 (Genetics Research Institute) enthielt, 60 Stunden kultiviert. Zellen wurden unter Verwendung von PBS/EDTA wie oben geerntet.
T-Zelllinie DN1 wurde vom peripheren Blut eines Zufallsspenders etabliert. Nichtadhärente mononukleäre Zellen wurden mit mAk OKT4 und OKT8 und Kaninchen-Komplement behandelt und die verbleibenden lebenden Zellen wurden in einer Mischung aus OKT4 (anti-CD4), OKT8 (anti-CD8α) und anti-TCRδ1 (Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137–183 (1991)) mAk 1 Stunde suspendiert, gewaschen und 30 Minuten bei 4°C mit Ziege anti-Maus Immunglobulin-gekoppelten Magnetkügelchen (Dynal) inkubiert. Nach magnetischer Trennung und Entfernen von CD4⁺ und/oder CD8⁺ und/oder δ-TCR-Zellen wurden die verbleibenden CD4^–8^– α:β TCR⁺ Zellen mit der gleichen Anzahl autologer Monocyten in Komplettmedium (RPM-1640 mit 10% FCS und weiteren Supplementen, wie zuvor von Morita, C. T., et al., (Eur. J. Immun. 21: 2999–3007 (1991)) beschrieben, mit jeweils 100 Einheiten/ml GM-CSF und IL-4 kultiviert. Löslicher M. tuberculosis Extrakt, der mittels Beschallung von getrockneten Bacilli (Stamm H37Ra (Difco)) in PBS mit anschließender Zentrifugation bei 100.000 g zwecks Klären (d. h. Entfernen nichtlöslichen Materials) der Beschallungen hergestellt war, wurde bis zu einer Bakterienprotein-Konzentration von 10 μg/ml zugegeben. Mehr lösliche Antigenaktivität (d. h. T-Zellproliferation) wird von löslichen wässrigen Beschallungen von M. tb. durch Zugabe eines Detergens wie beispielsweise CHAPS oder Octylglucosid während des Beschallungsschrittes erhalten; ohne Zugabe eines Detergens geht 90 bis 95% der Antigenaktivität während der Klärung nach der Beschallung verloren. Kulturen wurden alle 10 bis 14 Tage mit M. tuberculosis und hetreologen CD1⁺ Monocyten (zur CD1-Expression induziert, wie zuvor beschrieben) in Komplettmedium restimuliert und wurden alle 3 bis 5 Tage mit frischem, 1 nM rekombinantes Interleukin-2 (IL-2) haltigem Medium versorgt.
Tests der T-Zellproliferationsantworten wurden dreifach mit jeweils 5 × 10⁴ T-Zellen und bestrahlten (5.000 Rad) APCs in 200 μl Komplettmedium in Mikrotiterplatten mit 96 flachbödigen Vertiefungen durchgeführt. Lösliche Extrakte von M. leprae und Escherichia coli wurden wie für M. tuberculosis beschrieben hergestellt. Monoklonale Antikörper wurden als gereinigtes Immunglobulin bis zu einer Endkonzentration von 25 μg/ml zugegeben. Kulturen wurden an Tag 5 (Tag drei für mAk-Blockierung) nach einem sechs Stunden Puls mit 1 μCi ³H-Thymidin (6,7 Ci/mmol, New England Nuclear) geerntet und ³H-Einbau wurde mittels Flüssigszintillationszählung bestimmt. Die Ergebnisse sind als durchschnittliche Counts pro Minute (CPM) des ³H-Thymidin-Einbaus von drei Kulturen angegeben. Isolierte Monocyten oder mononukleäre Zellen des peripheren Gesamtbluts (PBMCs) wurden wie oben mit rekombinanten GM-CSF und IL-4 oder mit IFNγ, 100 Einheiten/ml, 60 Stunden vor ihrem Zusammenmischen mit T-Zellen für Proliferationstests behandelt. T-Zellklon DN1.C7 ist für vier ausgiebig charakterisierte Subklone, die von DN1 durch Phythämagglutinin (PHA) Stimulation in limitierender Verdünnungskultur abstammten und unter Verwendung von PHA-Stimulation und IL-2 wie zuvor beschrieben vermehrt sind. Morita, C. T., et al., Eur. J. Immun. 21: 2999–3007 (1991). Sämtliche Klone, die von der DN1-Linie abstammen, besaßen einen Oberflächen-Phänotyp, der von der in 1b gezeigten nicht zu unterscheiden ist, d. h. α:β TCR-Expression, keine Expression von CD4 und minimale oder keine Expression von CD8.
Tests der cytolytischen T-Zellantwort wurden folgendermaßen durchgeführt. Methoden zum Transfizieren von C1R-Zellen und zum Testen der spezifischen cytolytischen Aktivität mittels ⁵¹Cr-Freisetzung sind beschrieben worden. Balk, S. P., et al., Science 253: 1411–1415 (1991) beziehungsweise Morita, C. T., et al., Eur. J.
Immun. 21: 2999–3007 (1991). BK6, ein α:β TCR cytotoxischer T-Zellklon, der CD1a zeigende Zellen lysiert, wurde aus dem Blut eines Patienten mit SLE wie zuvor beschrieben (Porcelli, S., et al., Nature 341: 447–450 (1989) isoliert, und Klon 3C8, ein α:β TCR cytotoxischer Zellklon, der Cd1c zeigende Zellen lysiert, wurde aus Blut eines normalen Spenders unter Anwendung des selben Verfahrens isoliert. Transfizierte Zellen wurden mit ⁵¹Cr markiert und als Zielzellen in cytolytischen Tests mit einem Verhältnis von Effektor (T-Zelle) zu Ziel (Transfektant) von etwa 50 : 1 verwendet. Testmethoden für ⁵¹Cr-Freisetzung und Berechnung der % spezifischen Lyse sind beschrieben worden. Brenner, M. B., et al., Nature 325: 689-694 (1987).
Stabile Transfektanten von T2-Zellen wurden unter Anwendung des für C1R-Zellen beschriebenen Verfahrens hergestellt. Balk, S. P., et al., Science 253: 1411-1415 (1991). APCs für Glutaraldehyd-Fixierung und Chloroquin-Versuche waren GM-CSF- und IL4-behandelte PBMCs wie oben beschrieben, und Glutaraldehyd-Fixierung und Chloroquin-Behandlung der APCs wurden gemäß veröffentlichter Verfahren durchgeführt. Chesnut, R. W., et al., J. Immun. 129: 2382–2388 (1982); Roncarolo, M. G., et al., J. Immunol. 147: 781–787 (1991). CD4⁺ T-Zelllinie DG.1 war abgeleitet von einem HLA-DR7⁺ Patienten mit rheumatoider Arthritis durch wiederholte Stimulation von Lymphocyten aus der Gelenkflüssigkeit mit autologen EBV-transformierten B-Zellen und gereinigtem M. tuberculosis Proteinderivat (PPD, Statens Serum Institute; Daten nicht gezeigt). Tests der proliferativen Antwort wurden wie oben durchgeführt, außer dass 2 × 10⁵ APCs pro Vertiefung zugegeben wurden und ³H-Thymidin-Einbau nach drei Tagen bestimmt wurde.
Ergebnisse
Um ein System zum Nachweis der Antigenpräsentation von CD1-Molekülen zu entwickeln, wurde die Fähigkeit von verschiedenen rekombinanten Zytokinen bewertet, die Expression von CD1a, CD1b und CD1c auf peripheren Blutmonocyten zu induzieren, die normalerweise keine signifikante Mengen dieser Moleküle exprimieren. Leukocyte Typing IV, Knapp, W., ed., Oxford University Press Oxford, U. K., Seiten 251–269, 1989. Hohe Mengen an CD1a, CD1b und CD1c wurden übereinstimmend auf Monocyten beobachtet, die mit einer Kombination aus Granulocyten/Monocyten Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) und Interleukin-4 (IL-4) kultiviert waren (1a). Alternativ kann GM-CSF auch allein verwendet sein, obwohl die resultierende Menge an CD1-Expression etwas geringer ist als die bei einer kombinierten GM-CSF- und IL-4-Behandlung resultierende Menge. Interleukin-3 (IL-3) kann ebenfalls allein oder in Kombination mit anderen Zytokinen verwendet werden. Monocyten, die ohne Zytokine kultiviert waren, oder diejenigen, die mit Interferon-γ kultiviert waren, exprimierten keine signifikanten Mengen an CD1a, CD1b oder CD1c (Daten nicht gezeigt).
Weil Monocyten effiziente Antigen-präsentierende Zellen (APCs) sind, folgerten wir, dass CD1⁺ Monocyten eine CD1-beschränkte T-Zellantwort auf ein exogenes Antigen stimulieren könnten. Weil die meisten bis heute identifizierten CD1-spezifischen T-Zellen einen doppelt negativen (DN; CD4^–8^–) Phänotyp besitzen (Porcelli, S., et al., Nature 341: 447–450 (1989); Faure, F., et al., Eur. J. Immun. 20: 703–706 (1990)), konzentrierten wir uns auf diese Untergruppe Zellen und erzeugten eine T-Zelllinie durch wiederholte Stimulation von α:β TCR⁺ CD4^–8^– T-Zellen von peripherem Blut mit einem löslichen Extrakt aus M. tuberculosis und heterologen CD1+ Monocyten (1b).
Untersuchungen zur Funktion der resultierenden T-Zelllinie (als DN1 bezeichnet) zeigten, dass diese T-Zellen proliferative Antworten auf Antigene gaben, die von M. tuberculosis und nah verwandten M. leprae Bakterien abstammten, aber nicht auf nichtverwandte bakterielle Antigene wie beispielsweise solche von E. coli oder Tetanustoxoid antworteten (2a). Diese Antworten waren von der Vorbehandlang der Monocyten mit GM-CSF und IL-4 abhängig (2b), und waren nicht auf polymorphe MHC-Determinanten beschränkt (2c). Diese fehlende MHC-Beschränkung stimmte mit der Antigenpräsentation von nicht-MHC-Molekülen überein. Um zu bestimmen, ob CD1-Moleküle für eine M. tuberculosis Antigenpräsentation erforderlich sind, wurden die Wirkungen von monoklonalen Antikörpern (mAk), die für CD1 oder MHC-Moleküle spezifisch sind, auf die M. tuberculosis induzierte Proliferation der T-Zelllinie DN1 und eines repräsentativen Subklons, DN1.C7, bestimmt. Nur anti-CD1b mAk zeigte eine signifikante Blockierung der M. tuberculosis induzierten proliferativen Antwort, und es waren keine übereinstimmenden Wirkungen mit anti-CD1a oder CD1c mAk oder mit mAk gegen monomorphe Determinanten der MHC Klasse I oder Klasse II Moleküle zu beobachten (2d).
B-Zelltransfektanten sind effektive Ziele für α:β TCR CD4^–8^– cytolytische T-Zellaktivität. Unter Verwendung der B-Lymphoblastenzelllinie C1R (Zenmour, J., et al., J. Immun. 148: 1941–1948 (1992)) wurden stabile Transfektanten erzeugt, die CD1a, CD1b und CD1c in vergleichbaren Mengen exprimieren und zeigen, und auf ihre Fähigkeit getestet, M. tuberculosis in einem cytolytischen Test zu präsentieren. Nur C1R-Zellen, die mit CD1b codierenden DNA-Sequenzen transfiziert und mit M. tuberculosis vor dem Test inkubiert waren, wurden von der α:β TCR CD4^–8^– T-Zelllinie DN1 und ihrem Subklon DN1.C7 lysiert (4a und 4b). Die Spezifität dieser auf CD1-beschränkten Antwort wurde unter Verwendung zweier α:β TCR⁺ CD4^–8^– T-Zellklone als Kontrolle, BK6 und 3C8, bestätigt, die von einer Mitogenstimulierung ohne M. tuberculosis Antigenen exponiert zu sein abstammten. Frühere Untersuchungen zeigen, dass BK6 und 3C8 Zielzelllinien, die CD1a beziehungsweise CD1c exprimieren, lysieren (Daten nicht gezeigt). Wie es für alle anderen reaktiven T-Zellklone vor dieser Offenlegung beschrieben wurde (Porcelli, S., et al., Nature 341: 447–450 (1989); Faure, F., et al., Eur. J. Immun. 20: 703–706 (1990); Balk, S. P., et al., Science 253: 1411–1415 (1991)), scheinen diese Klone autoreaktiv zu sein und erkennen ihre nichtpolymorphen CD1-Liganden in Abwesenheit exogener Antigene. Wie erwartet, lysierten Klone BK6 und 3C8 nur CD1a beziehungsweise CD1c exprimierende C1R-Transfektanten und Lyse war von einer Vorinkubation der Zielzellen mit M. tuberculosis nicht signifikant beeinflusst (4c und 4d).
Das Fehlen einer MHC-Beschränkung, wie es mit den vorausgehenden Versuchen gezeigt wurde, spricht dafür, dass MHC-codierte Antigen-präsentierende Moleküle nicht an der auf CD1b-beschränkten Präsentation von M. tuberculosis Antigenen der Zelllinie DN1 beteiligt sind. Als einen etwas stringenteren Test dieser Hypothese wurden CD1b-Transfektanten der T2-Zelllinie hergestellt, in denen ausgiebige chromosomale Deletionen in beiden MHC-Loci zu einem vollständigen Ausbleiben der MHC Klasse II Expression führen. Satter, R. D., et al., Immunogenetics 21: 235–246 (1985); Erlich, H., et al., Hum. Immun. 16: 205–219 (1986). Die MHC gebundenen Transportergene TAP-1 und TAP-2 (zum Überblick siehe Parham, P., Nature 357: 193–194 (1992)) sind ebenfalls von T2 deletiert, was zu einer mangelhaften Expression und Funktion von MHC Klasse I Molekülen führt. Hosken, N. A. und Bevan, M., Science 248: 367–370 (1990); Wei, M. und Cresswell, P., Nature 356: 443–446 (1992). Nichtsdestotrotz führte eine Transfektion von CD1b in T2 zu einer Expression von CD1b auf der Zelloberfläche auf einem ähnlichen Level wie auf anderen transfizierten B-Zelllinien (Daten nicht gezeigt) und bildeten eine Zielzelle, die M. tuberculosis der DN1-Zelllinie präsentierte (5).
Die Präsentation von exogenen Antigenen für T-Zellen erfordert im Allgemeinen Aufnahme und Prozessierung von komplexen Proteinantigen-Molekülen durch Antigen-präsentierende Zellen, ein Prozess der durch Aldehydfixierung der APC-Oberfläche und durch lysosomotrope Amine wie beispielsweise Chloroquin blockiert wird. Ziegler, H. K. und Unanue, E. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 175-179 (1982); Chesnut, R. W., et al., J. Immun. 129: 2382–2388 (1982). Nach diesen Kriterien zeigte die CD1b-beschränkte Präsentation von M. tuberculosis ebenfalls eine erforderliche Antigenaufnahme und -prozessierung. Eine leichte Fixierung von CD1b⁺ APCs mit Glutaraldehyd hob ihre Fähigkeit auf, Zelllinie DN 1 in Anwesenheit von löslichem M. tuberculosis Antigen zu stimulieren, obwohl die selben APCs, gepulst mit M. tuberculosis vor Fixierung, ihre Fähigkeit behielten, eine proliferative Antwort zu stimulieren (5b). Außerdem war die Präsentation von M. tuberculosis Antigenen der Zelllinie DN1 durch Chloroquin mit einer Dosisabhängigkeit, die tatsächlich mit derjenigen für die Hemmung der MHC Klasse II vermittelten Präsentation mycobakterieller Antigen identisch ist, stark gehemmt ( 5c), was darauf hinweist, dass das Prozessieren von Antigenen für CD1b und MHC Klasse II beschränkte Antworten ähnliche Pfade oder Organellen umfassen könnte oder dass die Pfade einen oder mehrere Chloroquin-sensitive Zellfaktoren teilen. Interessanterweise ist von T2-Zellen kürzlich gezeigt worden, dass sie beim Prozessieren von Antigenen, die von MHC Klasse II Molekülen präsentiert sind, defekt sind (Riberdy, J. M. und Cresswell, P., J. Immun. 148: 2586–2590 (1990), weil T2-Zellen die DMA- und DMB-Gene fehlen. Morris, P., et al., Nature 368: 551–554 (1994); Fling, S. P., et al., Nature 368: 554–558 (1994). Folglich lässt unsere Feststellung, dass CD1b transfizierte Zellen den DN1-Zellen M. tuberculosis präsentieren können, vermuten, dass die erforderliche Antigen-Prozessierung für CD1b und MHC Klasse 1 Moleküle, obwohl bezogen auf die Chloroquin-Sensitivität ähnlich, nicht identisch sind.
Mehrere Forscher haben gemutmaßt, dass Zellen, denen sowohl die Expression von CD4 als auch CD8-Molekülen fehlt, die von den Zelloberflächen-Molekülen präsentierten Antigenen mit anderen als von den klassischen MHC Klasse I und II Loci codierten Molekülen erkennen können. Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137-183 (1991); Janeway, C. A. Jr., et al., Immun. Today 6: 73–76 (1988); Bluestone, J. A. und Matis, L. A., J. Immun. 142: 1785–1788 (1989). Die obigen Resultate zeigen, dass ein Mitglied der CD1-Familie, CD1b, die spezifische Antwort von MHC nicht beschränkten CD4^–8^– T-Zellen auf ein exogenes Fremdantigen beschränken kann. Wie andere CD1-Proteine verbinden sich CD1b schwere Ketten nicht kovalent mit (β₂-Mikroglobulin (Olive, D., et al., Immunogenetics 20: 253–264 (1984)) und zeigen eine begrenzte aber signifikante Sequenzhomologie sowohl mit Klasse I als auch Klasse II Molekülen. (Calabi, F. und Milstein, C., Nature 323: 540–543 (1986); Balk, S. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 252–256 (1989). Diese Strukturmerkmale von CD1b, zusammen mit seiner entscheidenden Rollen in der Antigenerkennung (oben beschrieben), stützt die Schlussfolgerung, dass CD1b ein nichtpolymorphes Antigenpräsentierendes Molekül ist, das von einem nicht mit MHC verknüpften Gen-Locus codiert ist.
Diese Resultate zeigen eine mögliche Rolle für CD1-beschränkte T-Zellen in der gewöhnlichen Wirtsabwehr gegen mikrobielle Erkrankungen auf. Die obigen Resultate lassen eine funktionelle Parallele zwischen CD1 und MHC Klasse II Molekülen vermuten, da beide eine Präsentation exogener Antigene vermitteln, die über einen Chloroquin-sensitiven Pfad prozessiert sind, und beide ebenfalls als Liganden für die TCRs von autoreaktiven Zellen dienen können. (Porcelli, S., et al., Nature 341: 447–450 (1989); Glimcher, L. H. and Shevach, E. M., J. Exp. Med. 156: 640–645 (1982). Die begrenzte Verteilung von CD1-Molekülen im Gewebe in vivo liefert eine weitere Ähnlichkeit mit der MHC Klasse II Familie, da Mitglieder beider Familien auf Zelltypen auffallend exprimiert sind, die an der Antigenpräsentation für T-Zellen beteiligt sind, einschließlich Langerhans Zellen, dendritische Zellen in Lymphgeweben und vielen anderen Geweben, Zellen und möglicherweise Zytokinaktivierten Monocyten. Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137–183 (1991). Im Gegensatz dazu sind das Fehlen von Strukturpolymorphismen der CD1-Moleküle, ihre einzigartige Zytokin-Regulation auf Monocyten und der CD4^–8^– Phänotyp der hier beschriebenen CD1-beschränkten T-Zellen wichtige Unterschiede, die die CD1 und MHC Antigen-präsentierenden Systeme voneinander unterscheiden. Diese Unterschiede weisen auf eine unterschiedliche Rolle für CD1-beschränkte T-Zellen in der Zell-vermittelten Immunität.
Beispiel 2: Ein CD1b-präsentiertes Nichtpeptid-Antigen
Methoden
Das CD1b-präsentierte Antigen ist ein nicht zu dialysierendes Makromolekül (Daten nicht gezeigt). Eine höhere Antigenaktivität (d. h. proliferativere T-Zellaktivität) konnte von löslichen wässrigen Beschallungen von M. tb. durch Zugabe von Detergenzien wie beispielsweise CHAPS oder Octylglucosid während der Beschallung erhalten werden (siehe oben). Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass das Antigen hydrophob ist.
Um die chemische Beschaffenheit der von CD1 präsentierten Antigene zu charakterisieren, wurden mycobakterielle Antigene von dem nichtpathogenen Stamm M. tb. H37a (Difco) und M. fortuitum (ein schnell wachsender Stamm, der ebenfalls Antigenaktivität zeigt) gereinigt. Bakterien waren entweder im Handel erhältlich (M. tb. H37a, Difco) oder wurden angezogen und geerntet (M. fortuitum), beschallt und einer sequentiellen Fraktionierung unterzogen und auf biologische Aktivität untersucht. Alle gebildeten Fraktionen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die DN T-Zelllinie DN1 in einem 5 Tage Proliferationstest unter Verwendung bestrahlter, GM-CSF- und IL-4-behandelter Monocyten als APCs zu stimulieren und Messen des ³H-Thymidin-Einbaus in einem 6 Stunden Puls (Porcelli, S., et al., Nature 360: 593–597 (1992)). Zellwand-, Zellmembran- und Cytoplasma-Fraktionen wurden entweder von M. tb. oder M. fortuitum unter Anwendung eines aus publizierten Protokollen angepassten Verfahrens präpariert. Hunter, S. W., et al., Journal of Biological Chemistry 265: 14065–14068 (1990). Zusammengefasst: Zellen wurden lyophilisiert, in PBS/Octylglucosid resuspendiert, 20 Minuten beschallt und zur Herstellung von Cytosol-, Membran- und Zellwandfraktionen einer differentiellen Ultrazentrifugation unterzogen. Die Zellwand-Pellets wurden mit Hilfe eines differentiellen Sucrose-Gradienten weiter gereinigt. Charakteristische Strukturmerkmale der drei Fraktionen wurden durch negative Färbung mit Elektronenmikroskopie bestätigt. Der Großteil der Bioaktivität der DN1-Zelllinie lag in der Zellwandfraktion vor (Daten nicht gezeigt).
Um direkt zu prüfen, ob das CD1-beschränkte Antigen ein Protein ist, wurde eine Reihe von Protease-Verdauen des Antigens durchgeführt. Unter Verwendung mehrerer Endopeptidasen entweder mit begrenzter Aminosäure-Spezifität (Chymotrypsin, hydrophobe Reste), Trypsin (lys, arg) und V-8 (sauer) oder breite Aminosäure-Erkennung (Subtilisin, Proteinase K, Pronase), wurden Beschallungen entweder von M. tb. oder M. fortuitum verdaut und dann auf ihre Fähigkeit getestet, proliferative T-Zellantworten zu induzieren. Als eine Kontrolle wurde ein DR7-beschränkter, CD4⁺ T-Zellklon DG.1, der aus diesem Labor stammt und eine Determinante in mycobakteriellem PPD (gereinigtes Proteinderivat) erkennt, ebenfalls getestet. Eine SDS-PAGE Analyse und anschließende Silber-Färbung zeigte, dass ein Verdau mit V8 Protease, Proteinase K, Pronase E oder Subtilisin das in mycobakteriellen Antigen-Präparaten enthaltene Protein abbaut (Daten nicht gezeigt).
Ergebnisse
Das M. tuberculosis Antigen, das von DG.1, eine repräsentative CD4⁺ MHC Klasse II beschränkte T-Zelllinie, erkannt wird, wird durch eine Behandlung mit V8 Protease, Proteinase K oder Trypsin unwirksam gemacht (6). Wie in 6 gezeigt, proliferierten DG.1 Zellen stark als Antwort auf den Scheinverdau der mycobakteriellen Beschallung, aber mit Ausnahme von Chymotrypsin verhinderten alle anderen Protease-Behandlungen die proliferative Antwort vollständig.
Im Gegensatz dazu sind die der DN1-Zellinie von CD1b präsentierten M. tuberculosis und M. fortuitum Antigene von diesen breit reaktiven Proteasen nicht beeinträchtigt (7 beziehungsweise 8). Das von CD1b präsentierte mycobakterielle Antigen unterscheidet sich tiefgreifend von denjenigen, die von MHC Klasse I und II Antigen-präsentierenden Molekülen präsentiert sind. Es ist erwiesen, dass MHC-Moleküle Peptid-Antigene aus etwa 8–9 Aminosäuren für Klasse I und 13- 25 Aminosäuren für Klasse II binden und präsentieren. Weil dieses CD1b-präsentierte Antigen ein Makromolekül ist, das einem Protease-Verdau widersteht, ist es unwahrscheinlich, dass es ein Peptid ist. Folglich ist das CD1-System das erste bekannte Antigenpräsentationssystem, das andere Fremdsubstanzen als Peptide den α:β TCR⁺ T-Zellen präsentiert.
Beispiel 3: Reinigung eines CD1b-präsentierten Antigens
Methoden
M. fortuitum Bakterien wurden in Flüssigkultur bis zur stationären Phase angezogen und mittels Zentrifugation gesammelt, mittels Dampfautoklavierung sterilisiert (250°C, 18 p.s.i.) und lyophilisiert. Getrockneter M. tb. (Stamm H37a, Difco) oder M. fortuitum Bakterien wurden in Phosphat-gepufferter Saline (200 mg Bakterien pro 5 ml PBS) suspendiert und die Bakteriensuspension wurde mit einer Beschallungssonde zwecks Ausbrechen der Zellen beschallt. Die resultierende Beschallung wurde mit organischen Lösemitteln unter Verwendung eines Folch basierenden Zweiphasenextraktionssystems (Chloroform/Methanol/Wasser) extrahiert, das mycobakterielle Lipide in eine organische Phase quantitativ extrahiert. Goren, M. B., und Brennan, P. J., Mycobacterial Lipids: Chemistry and Biologic Activities in Tuberculosis, 1979. Die Beschallung wurde mit drei Volumenteilen einer Chloroform : Methanol (2 : 1 v/v) Lösung in einem Glasgefäß vereint und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden kräftig geschüttelt. Die Mischungsphasen wurden mittels Zentrifugation bei 800 g getrennt und in einen Glassiedekolben umgefüllt. Jede Fraktion wurde dann mittels Rotationsverdampfer (organische Phase) oder lyophilisiert (wässrige Phase und Interphase) getrocknet. Nach Verdampfen ließ die organische Phase einen dünnen Film aus einem wachsartigen Material auf der Kolbenoberfläche zurück. Um das in T-Zellproliferationstests zu testende Material zu präparieren, wurden Aliquote von Fraktionen als Liposomen durch Zugabe von Wasser (20 ml pro 200 mg Bakterien in ursprünglicher Beschallung) und anschließende Beschallung im Ultraschall-Wasserbad wieder gebildet. Die resultierende Rohsuspension wurde dann wiederholt durch eine 0,1 nm Filtermembran gezwungen, um eine Liposomen-Suspension gleicher Größe zu schaffen. T-Zellmedien mit 10% fötalem Kälberserum wurde zu den getrockneten Fraktionen gegeben und ohne weitere Präparation beschallt.
Zur weiteren Reinigung wurde das aus M. tuberculosis wie oben beschrieben extrahierte Material in Hexan gelöst und auf eine Kieselsäure-Säule aufgetragen. Eluieren mit organischen Lösemitteln mit anwachsender Polarität über die Kieselsäure-Säule trennt die Lipide auf Grund ihrer Polarität. Die polarsten Lipide wie beispielsweise Phospholipide binden am stärksten an die Silicagel-Säule und eluieren zuletzt, während Glycolipide im Allgemeinen weniger fest binden und früher eluieren. Neutrale Lipide wie beispielsweise Triglyceride oder Sterole binden an schwächsten und eluieren deshalb als erste.
Kleine offene Festphasenextraktionssäulen (SPE) (BakerBond, JT Baker) waren bevorzugt, da sie eine gleichzeitige Verarbeitung vieler Proben ermöglichten. Eine Silica basierende „gebundene" Säule mit Cyano (CN) funktionellen Gruppen (kovalent gebunden) wurde zur Fraktionierung der organischen Extrakte von M. tb. verwendet. Die organische Phase des Chloroform/Methanol Bakterienextrakts wurde getrocknet und in Hexan resuspendiert. Das Äquivalent von 5,3 mg getrockneter Bakterien in 200 μl Hexan wurde auf eine CN SPE Säule geladen. Die Säule wurde mit Hexan und dann mit 25% (v/v) Chloroform in Hexan gewaschen. Als nächstes wurde die bioaktive Fraktion mit 85% (v/v) Chloroform in Hexan mit einer 100% Wiedergewinnung der Bioaktivität eluiert. Durch Analyse der aktiven Fraktion auf Silica DC-Platten gemäß dem Verfahren von Kupke und Zeugner (Christie, W. W., Lipid Analysis, Seite 117, Pergamon Press, Oxford, U. K., 1982) wurden nur zwei Lipid-Haupttypen mit Kupferacetat sichtbar gemacht, die freien Fettsäuren und Mycolsäuren entsprechen (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis spiegelt eine bemerkenswerte Reinigung des organischen Ausgangsmaterials wider.
Proliferationstests wurden an Tag 2 (DG.SF68), Tag 3 (DG.1) oder an Tag 5 (DN1) geerntet. DG.SF68 ist ein Vγ2Vδ2 T-Zellklon, der aus diesem Labor stammt (PNAS in Druck, CM). APCs waren GM-CSF- und IL-4-behandelte Monocyten (DN.1) oder PBMC (DR7⁺) (DG.1) oder unbehandelte PBMC (DG.SF68). Cytolytische Tests sind als % spezifische Lyse angegeben und wurden wie beschrieben durchgeführt. Porcelli, S., et al., Nature 341: 447–450 (1989). Gezeigte Daten (9) sind mit einem Verhältnis von Effektor zu Ziel von 50 : 1 und mit M. tuberculosis Antigen mit einer Verdünnung von 1 : 20 erhalten.
Ergebnisse
Das relevante Antigen von M. tuberculosis ist aus einem im Handel erhältlichen Präparat von Stamm H37a (Difco) mittels Extraktion in einer Mischung aus Chloroform und Methanol isoliert, wie es oben beschrieben ist. Obwohl die Interphase mehr als 95% des Proteins enthält, werden 100% der auf CD1b-beschränkten Antigenaktivität (d. h. die Fähigkeit, eine α:β TCR DN proliferative T-Zellantwort zu induzieren) der Mycobakterien in die organische Phase extrahiert (9a). Dies stützt sehr stark die ursprüngliche Schlussfolgerung, dass das relevante bakterielle Antigen kein Peptid ist. Im Gegensatz dazu wurde ein herkömmliches MHC Klasse II beschränktes Antigen, das von DN γ:δ TCR⁺ T-Zellen erkannt wird, in der Interphase von wässriger und organischer Phase lokalisiert ( 9b). Im Gegensatz dazu verteilte sich in vier unabhängigen Antigenpräparationen das CD1b-beschränkte Antigen quantitativ in der organischen. Phase. Ergebnisse von cytolytischen Tests der Phasen mit Transfektanten bestätigten, dass das CD1b-präsentierte Antigen in der organischen Phase vorliegt (10).
Unter diesen Bedingungen wurde 100% der mycobakteriellen CD1-beschränkten Antigenaktivität nach CN-SPE-Chromatographie quantitativ wiedergewonnen. Zusätzlich diente die organische Phase als ein exzellentes Reinigungsmittel und die organische Phase wurde als Ausgangsmaterial für die nachfolgende Chromatographie verwendet. Ein alternatives und etwas allgemeineres Verfahren zur Reinigung des Antigens für eine nachfolgende Chromatographie ist die Verseifung der ganzen oder der beschallten Bakterien und Extraktion mit einer angesäuerten Hexanlösung. Weitere Reinigung des Antigens erfolgt durch Anwendung der Kieselsäure-Chromatographie, wie es oben beschrieben ist.
Beispiel 4: Mycolsäure ist ein CD1-präsentiertes Antigen
Methoden
Mit den oben erhaltenen Ergebnissen und anderen vorläufigen Daten, die vermuten lassen, dass die Aktivität mit Präparaten von freien Fettsäure-Acylketten auf CN-modifizierten Silicagel HPLC-Säulen mitchromatographierte (Daten nicht gezeigt), erschien es plausibel, dass das CD1b-präsentierte Antigen ein einzigartiges mycobakterielles Lipid, möglicherweise eine Mycolsäure, ist. Um diesen Punkt zu klären, wurde ein HPLC-Verfahren angewandt, mit dem Mycolsäuren auf einer C18 Umkehrphasen-Säule getrennt werden können, um Mycolsäuren darzustellen. Butler, W. R., et al., Journal of Clinical Microbiology 23: 182–185 (1986); Butler, W. R., et al., Journal of Clinical Microbiology 26: 50–53 (1988); Floyd, M. M., et al., Journal of Clinical Microbiology 30: 1327–1330 (1992). Umkehrphasen-Chromatographie trennt Acylketten primär auf Basis der Länge der Acylkette oder „Kohlenstoff-Anzahl", folglich ist es relativ einfach, eine gute Trennung der freien Fettsäuren von den viel größeren Mycolsäuren zu erreichen.
Dieses HPLC-Verfahren erfordert zunächst eine Verseifung der Probe, anschließend eine Derivatisierung der freien Fettsäuren oder Mycolsäuren mit der im Ultravioletten (OD₂₅₄) absorbierenden Verbindung p-Bromphenacylbromid, die an den Carboxyl-Terminus einer Acylkette bindet. In vorausgehenden Versuchen stellten wir fest, dass die Derivatisierung der bakteriellen Fraktion mit p-Bromphenacylbromid die Bioaktivität zerstörte. Allerdings konnte die CD1b-beschränkte Antigenaktivität dann durch Verseifung mit Methanol/KOH, ein Vorgang, der das Carboxyl-Ende der Acylkette durch Abspalten der Phenacylbromid-Gruppe freigibt (wie es mittels OD₂₅₄ auf HPLC getestet war), wiederhergestellt werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Acylkette abgespalten werden muss, um eine Form zu erhalten, die von CD1-positiven APCs präsentierbar ist und/oder dass eine freie Carboxyl-Gruppe für eine Präsentation des CD1-beschränkten Antigens entscheidend ist. Dies ist ein zusätzlicher Beweis, dass das Antigen eine Acylkette umfasst.
Das mit der SPE-CN-Säule gereinigte Präparat (Beispiel 3) wurde als Ausgangsmaterial für die C 18 Chromatographie verwendet. Proben wurden mit Methanol/KOH verseift und mit der UV-Absorptionsgruppe Bromphenacylbromid derivatisiert. Die aktive Fraktion wurde auf einer C18 Säule (Alltech Nucleosil C18 5 μm, 25 cm × 4,6 mm) unter Verwendung eines linearen Gradienten von 30 auf 90% Methylenchlorid in Methanol über 50 Minuten mit 1 ml/min laufen gelassen. Als Referenz wurde ein interner C₉₀-Standard (Ribi) eingesetzt und das resultierende Chromatogramm (12, Bild a, oberer Teil) besitzt ein mit publizierten Ergebnissen vergleichbares Muster. Floyd, M. M., et al., Journal of Clinical Microbiology 30: 1327–1330 (1992). Fraktionen wurden in Komplettmedium mit 10% FCS resuspendiert und bei einer 1 : 17 Verdünnung bezogen auf das ursprüngliche Beschallungsvolumen getestet.
Ergebnisse
Es wurde herausgefunden, dass die mit dem T-Zellproliferationstest getestete Bioaktivität mit den frühen Peaks im Bereich der Mycolsäuren (12a) mitwanderten. Um zu bestätigen, dass Mycolsäure von CD1b präsentiert ist, wurde eine Alternativquelle von Mycolsäuren, gereinigter Cordfaktor (Trehalosedimycolat; 11) getestet. Nach Verseifung stimulierte gereinigtes Trehalosedimycolat entweder von M. tuberculosis (von Sigma) oder M. kansasii (von Patrick Brennan) die Proliferation der T-Zelllinie DN1 (12b). Allerdings wurde keine Stimulierung mit Material erhalten, das aus verseiftem Trehalosedibehenat hergestellt ist, ein synthetisches Derivat des Cordfaktors, das eher zwei C₂₂-Fettsäureketten als Mycolsäuren enthält, die durch Verseifung freigesetzt werden. Dies spricht dafür, dass Mycolsäure, nicht Trehalose (die in jeder Probe vorliegt) oder Fettsäuren das der doppelt negativen α:β TCR T-Zelllinie DN1 von CD1b präsentierte Antigen ist. Es wurde dann eine HPLC-Analyse des verseiften Sigma Cordfaktors durchgeführt, und wiederum war die Bioaktivität in den Fraktionen lokalisiert, die mit den frühen Mycolsäure-Peaks übereinstimmen (12c). Zusammen zeigen die obigen Daten, dass das CD1-beschränkte mycobakterielle Antigen, das von der T-Zelllinie DN1 erkannt wird, eine Mycolsäure-Species ist.
Von Mycobakterien ist bekannt, dass sie hoch wirksame Adjuvanzien darstellen. Aldovini, A. und Young, R. A., Nature 351: 479–482 (1991). Eine Quelle des hier verwendeten CD1b-präsentierten Antigens, Mycolsäure, ist Trehalosedimycolat (d. h. mycobakterieller Cordfaktor), von dem gezeigt wurde, dass es die Antikörper-Bildung verstärkt (Bekierkunst, A., et al., J. Bacteriol. 100: 95–102 (1969); Bekierkunst, A., et al., Infection and Immunity 4: 245–255 (1971); Bekierkunst, A., et al., Infection and Immunity 4: 256–263 (1971)) und eine nichtspezifische Immunität gegen bakterielle Infektionen (Parant, M., et al., Infect. Immun. 20: 12–19 (1978) und Tumore stimuliert (Bekierkunst, A., et al., Infection and Immunity 10: 1044–1050 (1974).
Um sicherzustellen, dass die gereinigte Antigenaktivität ein echtes Antigen und kein nichtspezifisches Mitogen enthält, untersuchten wir die Spezifität der T-Zellproliferationsantwort auf M. tb. Rohpräparate und HPLC-gereinigte Mycolsäure von M. tb. und verseiftem Cordfaktor. Geamtbeschallungen von M. tb. (14, oberer Teil) enthalten Antigen, das von der MHC Klasse II beschränkten CD4⁺ α: β TCR⁺ T-Zelllinie DG.1 erkannt wird, wie auch ein Antigen, das von der CD1 b-beschränkten T-Zelllinie DN1 und der CD1c-beschränkten T-Zelllinie DN6 (siehe Beispiel 5, unten) erkannt wird. Allerdings enthält HPLC-gereinigte Mycolsäure entweder von M. tb. (14, mittlerer Teil) oder von verseiftem Cordfaktor (14, unterer Teil) Antigene, die nur von CD1b-beschränkten DN1-Zellen erkannt werden. Diese Spezifität ist ebenfalls in cytolytischen Tests von Transfektanten gezeigt ( 13). Die CD1b-beschränkte Antwort von DN1 war von anti-CD1b Antikörpern blockiert, war aber nicht von Antikörpern gegen MHC Klasse I oder II beeinträchtigt (15, oberer Teil).
Beispiel 5: Antigenpräsentation von CD1c
Zusätzlich zu der in Beispiel 1 offengelegten Präsentation von Antigenen von CD1b präsentieren CD1c-Moleküle ebenfalls Antigene. Eine separate CD4^–8^– α:β TCR⁺ T-Zelllinie, die von einer wiederholten Stimulierung mit Monocyten, die mit GM-CSF und IL-4 (um die CD1-Expression zu induzieren) und M. tb. Antigenen behandelt waren, abstammte, wurde isoliert und DN2 genannt (auch als 8.23.DN1 bezeichnet). Die Proliferation von DN2 wird vollständig durch Zugabe von mAk gegen CD1c gehemmt, wird aber von mAk gegen CD1b nicht beeinflusst (15, unterer Teil). Ein cytolytischer Test bestätigt dieses Ergebnis: C1R-Zellen, die ausschließlich mit Vektor oder mit CD1a, CD1b oder CD1c codierendem Vektor transfiziert sind, wurden mit oder ohne M. tuberculosis Beschallung vorinkubiert und als Ziele in cytotytischen Tests verwendet. Nur CD1c⁺ C1R-Zellen werden erkannt (16); eine Erkennung wird durch Vorinkubation mit der Beschallung verstärkt. Deshalb präsentieren den DN2 T-Zellen CD1c-Moleküle M. tuberculosis.
Eine zweite CD1c-beschränkte CD4^–8^– α:β TCR⁺ T-Zelllinie, die von einer wiederholten Stimulierung mit Monocyten, die mit GM-CSF und IL-4 (um die CD1-Expression zu induzieren) und M. tuberculosis Antigenen behandelt waren, abstammte, wurde isoliert und DN6 genannt. Cytolytische Tests (17) weisen darauf hin, dass DN6 in Anwesenheit von M. tb. Antigen CD1c⁺ Zellen lysiert.
Beispiel 6: Charakterisierung eines CD1C-prisentierten Antigens
Das DN6 T-Zellen von CD1c präsentierte Antigen ist keine Mycolsäure ( 14, mittlerer Teil). Allerdings zeigt die chemische Charakterisierung des von DN6 erkannten Antigens, dass das Antigen ein komplexes Lipid ist. Wenn M. tb. Beschallungen mit Chloroform : Methanol extrahiert sind (wie in Beispiel 3 beschrieben), wird die Antigenaktivität hauptsächlich sowohl in der Interphase als auch in der organischen Phase gefunden (18). Aus der organischen Phase wiedergewonnenes Antigen kann an CN-SPE-Säulen gebunden und eluiert werden (wie in Beispiel 3 beschrieben). Diese Untersuchungen zeigen, dass das Antigen hydrophob ist und die chromatographischen Eigenschaften eines Lipids besitzt.
Anders als beim CD1b-beschränkten mycobakteriellen Antigen zeigen allerdings die Ergebnisse zusätzlicher Versuche, dass das DN6-erkannte CD1c-präsentierte Antigen ein komplexes Lipid und keine freie Acylkette ist. Verseifung von M. tb. Beschallungen eliminiert die proliferative Antwort von DN6 (20). Weil eine Verseifung Ester-Bindungen spaltet, die Acylketten mit dem Kohlenhydrat-Rückgrat verbinden, lässt dieses Ergebnis vermuten, dass das von DN6 T-Zellen erkannte Antigen ein anderer Teil als eine freie Acylkette ist, oder diesen zusätzlich umfasst. Eine Verseifung zerstört oder entfernt vermutlich den zusätzlichen Teil, der z. B. ein Polysaccharid-Rückgrat oder eine Verzweigungsstelle sein kann. Im Gegensatz zu der Erkennung einer freien Mycolsäure durch die DN1 T-Zelllinie erkennt folglich die DN6 T-Zelllinie eine komplexere Lipidstruktur.
Es ist bemerkenswert, dass die CD1-präsentierten Antigene, die von den T-Zelllinien DN1 und DN6 erkannt werden, für M. tuberculosis nicht eindeutig sind. Die DN1- und DN6-erkannten CD1-präsentierten Antigene sind eher kreuzreaktiv mit Antigenen, die in vielen bis heute getesteten Mycobakterien-Species (M. fortuitum, M. avium, M. bovis (BCG) und M. leprae) gefunden werden. Im Falle einer CD1c-beschränkten Erkennung von DN6 T-Zellen ist ein Antigen in Corynebakterien erkannt (Daten nicht gezeigt), eine separate aber verwandte Bakteriengattung, die Mycolsäuren produzieren. Takayama, K. und Qureshi, N., „Structure and Synthesis of Lipids" in The Mycobacteria: A Sourcebook, Teil A, Kubica, G. P. und Wayne, L. G. eds., Marcel Dekker, New York & Basel, 1984. Folglich umfassen CD1-präsentierte Antigene mindestens mehrere bakterielle Lipid-Antigene; im Falle einer Autoimmunität umfassen CD1-präsentierte Antigene endogene Lipid-Antigene.
Beispiel 7: CD1-präsentierte Antigene umfassende Impfstoffe
Vor der vorliegenden Offenlegung war von Lipiden nicht bekannt, dass sie eine potenziell potente spezifische T-Zell-vermittelte Immunogenität besitzen. Die hier beschriebenen CD1-präsentierten Lipid-Antigene können als essentielle Bestandteile von Zusammensetzungen verwendet sein, die zur Entwicklung für Impfstoffe gegen mycobakterielle Pathogene dienen. Impfstoffe, die CD1-präsentierte Antigene umfassen, können direkt durch Injektion verabreicht sein. Alternativ kann auf Grund des Vorhandenseins von CD1 auf Zellen, die im Gastrointestinal-Epithel gefunden werden (Bleicher, P. A., et al., Science 250: 679–682 (1990)) eine orale Verabreichung von CD1-präsentierte Antigene umfassenden Impfstoffen angewandt sein, um derartige Impfstoffe in ein Tier einzubringen, das einen Impfstoff, umfassend ein CD1-präsentiertes Antigen, benötigt.
Impfstoffe, die die CD1-präsentierten Antigene der vorliegenden Erfindung umfassen, werden gemäß bekannter Verfahren formuliert. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Gennaro, A. R., Herausgeber, Mack, Easton, 1990; The Pharmacologist Basis of Therapeutics, 7. Ausgabe, Gilman, A. G., et al., MacMillian, New York, 1985. Pharmazeutisch verträgliche Lipid stabilisierende und lösende Mittel, die dem Fachmann bekannt sind, können zu den CD1-präsentierte Antigene umfassenden Impfstoffen gegeben sein, um ihre Wirkung zu steigern. Teng, N., et al., PCT veröffentlichte Patentanmeldung WO 91/01750 (21. Feb. 1991). Nunberg, J. H., U.S. Patent 4.789.702 (6. Dez. 1988).
Beispiel 8: Mittel und Methoden zur Hemmung CD1-beschränkter Antigenpräsentation
Die Offenlegung des CD1-Antigenpräsentationssystems ermöglicht mit verschiedenen Mitteln und Methoden eine Hemmung der CD1-beschränkten Antigenpräsentation. Jede beliebige Zusammensetzung, die die Prozessierung von CD1-präsentiertem Antigen hemmt, die mit dem Binden eines Antigens an ein CD1-Molekül interferiert oder die mit dem Binden des CD1: Antigen Komplexes an ein TCR-Molekül interferiert, hemmt die CD1-beschränkte Antigenpräsentation. Derartige Zusammensetzungen, auch CD1-blockierende Mittel genannt, sind für die Kontrolle unerwünschter T-Zell-vermittelter Immunität zweckdienlich, die z. B. bei Autoimmunerkrankungen vorkommt. Oksenberg, J. R., et al., J. Neurol. Sci. 115 (Suppl.): S29–S37 (1993).
CD1-blockierende Mittel umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, (1) ein gereinigtes CD1-Molekül oder ein synthetisches Derivat davon, das in der Lage ist, ein CD1-präsentiertes Antigen zu binden und die Wechselwirkung des Antigens mit auf APCs gezeigtem CD1 zu verhindern; (2) ein gereinigtes TCR-Polypeptid oder ein synthetisches Derivat davon, das in der Lage ist, an ein CD1-Antigen Komplex auf einer CD1⁺ APC zu binden und die Wechselwirkung des Komplexes mit T-Zellrezeptoren zu verhindern; (3) einen Antigen-Antagonisten, umfassend ein chemisch modifiziertes CD1-präsentiertes Antigen oder ein synthetisches Derivat eines CD1-präsentierten Antigens; (4) einen gereinigten CD1-Antigen Komplex oder ein synthetisches Derivat davon, das in der Lage ist, an einen T-Zellrezeptor zu binden, der einen CD1-Antigen Komplex auf einer CD1⁺ APC erkennt und die Wechselwirkung des T-Zellrezeptors mit CD1-Antigen Komplexen verhindert; (5) einen Antikörper, der ein CD1-Molekül bindet und folglich die Wechselwirkung des CD1-Moleküls und eines CD1-präsentierten Antigens verhindert; (6) einen polyklonalen oder monoklonaten Antikörper, der einen CD1: Antigen Komplex bindet und folglich die Wechselwirkung des CD1: Antigen Komplexes und seines verwandten TCR verhindert; (7) einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper, der einen TCR bindet, der ein CD1-präsentiertes Antigen erkennt, und folglich die Wechselwirkung des TCR mit seinem verwandten CD1: Antigen Komplex verhindert; und (8) eine Zusammensetzung, die einen wesentlichen Schritt in dem Pfad blockiert, durch den CD1-präsentierte Antigene prozessiert werden, bevor sie gezeigt werden.
Die vorausgehenden Beispiele enthalten folgende typische CD1-blockierende Mittel.
CD1-blockierende Mittel vom Typ (5) sind monoklonaler Antikörper WM25 gegen CD1b, welcher CD1b-beschränkte Antigenpräsentation spezifisch hemmt ( 15, oberer Teil), und monoklonaler Antikörper 10C3 gegen CD1c, welcher CD1 c-beschränkte Antigenpräsentation spezifisch hemmt (15, unterer Teil). Ein Fachmann kann die hier beschriebenen Verfahren anwenden, um Antikörper zu isolieren, die als CD1-blockierende Mittel vom Typ (6) oder (7) wirken, A Critical Analysis of Antibody in Transplantation, Burlington, W. J., ed. CRC Press, Boca Raton, 1992, CD1-blockierende Mittel vom Typ (8) sind Chloroquin (5c), das einen Prozessierungsschritt von CD1b-beschränkten Antigenen hemmt. Verfahren zur Formulierung und Verabreichung von Chloroquin sind dem Fachmann bekannt. Webster, L. T., „Drugs Used in the Chemotherapy of Protozoal Infections", Kapitel 41 und 42 in Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, B. Ausgabe, Gilman, A. G., et al., eds., Pergamon Press, New York, 1990. Obwohl Chloroquin ebenfalls die MHC-beschränkte Antigenpräsentation hemmt, kann der Fachmann unter Verwendung der hier offengelegten Verfahren Zusammensetzungen identifizieren und/oder isolieren, die ein Prozessieren von CD1-präsentierten Antigenen spezifisch hemmen.
Blockierende Mittel vom Typ (3), d. h. Antigen-Antagonisten, können von CD1-beschränkten Antigenen abstammen, die mit den Methoden der Erfindung isoliert sind. Varianten von MHC-beschränkter Peptid-Antigenen, die mit geringer Affinität als das ursprüngliche Peptid-Antigen binden, wirken als Antagonisten für reife T-Zellen bei einer MHC-beschränkten Antigenpräsentation. Wraith, D. C., et al., Cell 59: 247–255 (1989); Smilek, D. E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 9633–9637 (1991). Auf ähnliche Weise werden CD1-präsentierte Antigene mit den Methoden der Erfindung isoliert und gemäß den Standardtechniken chemisch modifiziert, um nichtantigene oder schwach antigene CD1-präsentierte Antigenderivate zu erzeugen. Zum Beispiel ist mit p-Bromphenacylbromid derivatisierte Mycolsäure nicht antigen (Beispiel 4). Antigen-Antagonisten sind als CD1-präsentierte Antigenderivate identifiziert, die die T-Zellproliferationsantworten oder cytolytische Antworten von CD1-Transfektanten hemmen oder verhindern, die nur erfolgen, wenn das ursprüngliche nichtmodifizierte CD1-präsentierte Antigen vorliegt (Beispiel 1).
Blockierende Mittel vom Typ (2), d. h. TCR-Derivate, die die Wechselwirkung des Antigen: CD1 Komplexes mit dem TCR-Molekül auf T-Zellen blockieren, können mit Hilfe der Offenlegung vom Fachmann dargestellt werden. DNA-Moleküle, die von einer T-Zelllinie gezeigte TCR-Polypeptide codieren, die ein CD1-präsentiertes Antigen der Erfindung erkennt, werden gemäß in der Technik bekannter Methoden isoliert. Oksenberg, J. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 988–992 (1989); Oksenberg, J. R., et al., Nature 345: 344–346 (1990) und erratum, Nature 353: 94 (1991); Uematsu, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 534–538 (1991); Panzara, M. A., et al., Biotechniques 12: 728–735 (1992); Uematsu, Y., Immunogenet. 34: 174-178 (1991). Die DNA-Sequenz wird in eine Peptid-Sequenz umgewandelt und der Teil der Polypeptid-Sequenz, der der Antigen-bindenden variablen Region eines TCR-Polypeptids entspricht, wird verwendet, um synthetische Oligopeptide zu entwickeln, die CD1: Antigen Komplexe auf ACPs binden und dadurch eine Antigenpräsentation hemmen. Oligopeptide sind gemäß Standardverfahren (Steward und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemicals Co., Rockland, Illinois, 1985) chemisch synthetisiert und aus Reaktionsmischungen mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt. Pilotversuche zur Behandlung von Menschen, die an einer Autoimmunerkrankung, MS, leiden, mit Peptiden, die von MHC-beschränkten α:β TCR-Molekülen abstammen, werden gegenwärtig unternommen. Oksenberg, J. R., et al., J. Neurol. Sci. 115 (Suppl.): S29-S37 (1993). Von TCR abstammende Peptide, die als CD1-blockierende Mittel fungieren, sind als von TCR abstammende Peptide identifiziert, die die T-Zellproliferationsantworten oder cytolytische Antworten von CD1-Transfektanten hemmen oder verhindern, die in Anwesenheit eines CD1-präsentierten Antigens erfolgen (Beispiel 1).
Die hier beschriebenen Tests auf CD1-präsentierte Antigene können zur Durchmusterung von Molekül-Bibliotheken auf CD1-blockierende Mittel angewandt werden. Bibliotheken von molekular verschiedenartigen Zusammensetzungen werden mit chemischen, biochemischen und/oder biotechnologischen Mitteln hergestellt. Derartige Bibliotheken umfassen kombinatorische Bibliotheken synthetischer Peptide (Houghten, R. A., et al., BioTechniques 13: 412–421 (1992)) und Bibliotheken mit Fusionsproteinen, die mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt sind, z. B. „Phagen-Display-Bibliotheken". Koivunen, E., et al., J. Biol. Chem. 268: 20205-20210 (1993). Die Bibliotheken werden auf das Vorhandensein von Mitgliedern durchmustert, die die hier beschriebenen DN T-Zellproliferationsantworten und/oder CD1 cytolytischen Antworten hemmen oder verhindern. CD1-blockierende Mitglieder werden aus der Bibliothek gemäß in der Technik bekannter Verfahren, die für den eingesetzten Bibliothekstyp geeignet sind, isoliert. Lowman, H. B., et al., Biochemistry 30: 10832–10838 (1991); Felicia, F., et al., J. Mol. Biol. 22: 301–310 (1991); Dandekar, T., et al., Neurochem. Int. 7: 247–253 (1985); Owens, R. A., et al., Biophys. Res. Commun. 181: 402–408 (1991).
Um ein CD1-blockierendes Mittel in einer Probe nachzuweisen, werden Tests auf CD1-präsentiertes Antigen zweifach durchgeführt. Der erste (Kontroll)-Test ist ein proliferativer T-Zelltest oder cytolytischer Test, der im Wesentlichen, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt wird. Der zweite Test ist mit dem ersten Test in jeder Hinsicht identisch, bis auf eine Ausnahme: der zweite Test enthält zusätzlich eine Probe, von der angenommen wird, sie enthalte ein CD1-blockierendes Mittel. Das Vorhandensein eines CD1-blockierenden Mittels in der Probe korreliert mit einer proliferativen T-Zellantwort oder cytolytischen Antwort im zweiten Test, die signifikant kleiner die als im ersten Test gemessene Antwort ist.

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, der ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, umfassend die Schritte (a) Inkubieren einer Probe, die ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, mit CD1-positiven Zellen; (b) Trennen besagter CD1-positiver Zellen, die CD1-gebundenes Antigen zeigen, von besagter Probe; (c) Trennen des CD1-präsentierten Antigens von besagten CD1-positiven Zellen, die besagtes Antigen zeigen; und (d) Formulieren besagten getrennten CD1-präsentierten Antigens, zur Bildung eines Impfstoffs.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, der ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, umfassend die Schritte (a) Fraktionieren einer Probe, die ein CD1-präsentiertes Antigen enthält, in zwei oder mehrere Fraktionen; (b) Testen besagter Fraktionen auf die Anwesenheit eines CD1-präsentierten Antigens; und (c) Formulieren einer oder mehrerer Fraktionen, die besagtes CD1-präsentiertes Antigen enthält, zur Bildung eines Impfstoffs.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin: (a) besagtes CD1-präsentiertes Antigen von einem CD1-Molekül präsentiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus CD1a, CD1b, CD1c, CD1d und CD1e; oder (b) besagtes CD1-präsentiertes Antigen aus einer Mycobakterien-Species isoliert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. fortiutum und M. avium.
Ein Impfstoff, der eine spezifische T-Zellantwort in einem Tier nach Verabreichung an besagtes Tier induziert, wobei der Impfstoff eine wirksame spezifische T-Zell-induzierende Menge eines CD1-präsentierten Antigens oder eines funktionalen Äquivalents davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Ein Impfstoff gemäß Anspruch 4, der mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt ist.
Ein Impfstoff gemäß Anspruch 4, außerdem umfassend: (a) ein oder mehrere Zytokine oder andere Moleküle, die eine CD1-Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen induzieren; oder (b) ein oder mehrere verschiedene Antigene.
Verwendung eines CD1-präsentierten Antigens (oder seines funktionalen Äquivalents) zur Herstellung eines Medikaments, das eine spezifische T-Zellantwort zur Impfung induziert.
Ein Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 4, 5 und 6 oder Verwendung gemäß Anspruch 7, worin besagtes CD1-präsentiertes Antigen ist: (a) aus verseiftem 6,6-Trehalosedimycolat isoliert; oder (b) ein Lipid ist; oder (c) eine Mycolsäure ist.
Ein CD1-blockierendes Mittel, das eine auf CD1-beschränkte Antigen-Präsentierung hemmt und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Antikörper, einem synthetischen Peptid, einem Inhibitor einer auf CD1-beschränkten Antigen-Präsentierung und einem Antigen-Antagonisten, der von einem CD1-präsentierten Antigen abgeleitet ist.
Ein Verfahren zur Hemmung einer auf CD1-beschränkten Antigen-Präsentierung von CD1-positiven Zellen, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens von Zellen, die ein CD1-Molekül zeigen, mit dem CD1-blockierenden Mittel von Anspruch 9, ausgenommen Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Ein Verfahren zum Nachweis eines CD1-präsentierten Antigens in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen besagter Probe mit CD1-positiven Zellen; (b) Inkontaktbringen besagter CD1-positiver Zellen mit T-Zellen; und (c) Messen der proliferativen oder cytolytischen Antwort von besagten T-Zellen.
Ein Verfahren zum Isolieren eines CD1-präsentierten Antigens aus einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Inkubieren besagter Probe mit CD1-positiven Zellen, die besagtes CD1-präsentiertes Antigen binden, um CD1-positive Zellen zu erzeugen, die CD1-gebundenes Antigen zeigen; (b) Trennen besagter CD1-positiver Zellen, die CD1-gebundenes Antigen zeigen, von besagter Probe; und (c) Trennen des CD1-präsentierten Antigens von besagten CD1-positiven Zellen, die besagtes Antigen zeigen.
Ein isoliertes CD1-präsentiertes Antigen, das mit einem Verfahren gemäß Anspruch 12 hergestellt ist.
Ein CD1-präsentiertes Antigen zur therapeutischen Verwendung, worin das Antigen eine spezifische T-Zellantwort induziert.