【発明の詳細な説明】
ＣＤ１により提示される抗原の単離方法、
ＣＤ１により提示される抗原から成るワクチン、
および該方法に使用する細胞株関連出願
本願は、米国特許出願第０７／９８９，７９０号（１９９２年１２月１０日出
願、放棄済み）の一部継続出願である米国特許出願第０８／０８０，０７２号（
１９９３年６月２１日出願）の一部継続出願である。発明における政府の権利に関する声明
本発明が成立するに至る過程で実施された研究の一部は米国政府の助成金を受
けて成されたものであり、米国政府は本発明において一定の権利を有する。発明の分野
本明細書に開示する発明は、試料にＣＤ１により提示される抗原が含まれてい
るかどうかを判定する方法、試料からＣＤ１により提示される抗原を単離する方
法、ＣＤ１により提示される抗原から成るワクチン、およびＣＤ１により提示さ
れる抗原の単離、同定、およびキャラクタライゼーションに有用な細胞株に関す
る。本発明のＣＤ１により提示される抗原はＭＨＣにより提示される抗原と同様
に、α：βＴＣＲ
Ｔ細胞を刺激して増殖性応答を起こさせるが、ＣＤ１により提示される抗原はＭ
ＨＣにより提示される抗原とは異なり、非ポリペプチド性の疎水性抗原である。
とくにミコバクテリウムの種から単離されたＣＤ１ｂにより提示される抗原はミ
コール酸を含有する。
背景技術の説明 免疫系とＴ細胞
動物は、有害作用を及ぼす可能性のある外来細胞または内因性ではあるが異常
な細胞（たとえば細菌やウイルスなどの病原体およびガン細胞や病原体感染細胞
などでそれぞれ代表される）を認識し、攻撃するが、内因性の正常細胞は許容す
る免疫系と総称される複雑な分子防御機構・細胞防御機構を持っている。外来性
または異常な生体分子の剌激を受けると、この免疫系は、その外来性または異常
生体分子と関連がある病原体やガン細胞や病原体感染細胞を中和し破壊するよう
に仕組まれた一連の作用を受ける。これらの作用は免疫応答と総称され、細胞性
免疫応答、液性（抗体性）免疫応答、または細胞性応答と液性応答の両要素を含
む免疫応答から成る。
液性免疫応答には、特定の外来性または異常な生体分子と結合する糖タンパク
質である抗体が関与する。抗体とは、鳥類の嚢または哺乳動物の骨髄中で発生し
て他器官、とくに脾臓へ移動して成熟するリンパ球であるＢ細胞によって産生さ
れる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子である［ロバートソン（Ro
bertson，M.）、Nature 301:114(1983)］。細胞性免疫応答は、動物の胸腺内で
成熟するリンパ球であるＴ細胞の作用によって起きる［ティザード（Tizard，I.
R.）、Immunology：An Introduction，2d Ed.，Saunders，Philadelphia（以下
「ティザード」（Tizard）という）、ｐ．163，1988］。Ｔ細胞とＢ細胞はどち
らも動物体内の様々な器官および／または組織の間を移動する［リドヤードとグ
ロッシ（Lydyard，P.，and Grossi，C.）、Chapter 3 in Immunology，2d Ed.，
Roitt，I.，et al.，eds.，Gower Medical Publishing，London，New York，198
9］。
Ｔ細胞は少なくとも２つの一般的なタイプの免疫機能、すなわちエフェクター
機能と調節機能を媒介するが、このことは、同じ動物の体内でもＴ細胞亜集団が
異なればＴ細胞作用も大幅に異なるという事実を反映している［ルーク（Rook，
G.）、Chapter 9 in Immunology，2d Ed.，Roitt，I.，et al.，eds.，Gower Me
dical Publishing，London，New York，1989］。エフェクター機能としては、遅
延過敏反応、同種移植片拒絶反応、腫瘍免疫、および移植片対宿主反応などが挙
げられる。エフェクター機能は、一部のＴ細胞がリンホカインと呼はれるタンパ
ク質を分泌する能力および他のＴ細胞（「細胞傷害性」または「キラー」Ｔ細胞
）が他細胞を殺す能力を反映している。Ｔ細胞の調節機能としては、「ヘルパー
」Ｔ細胞の能力が代表的である。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞と細胞傷害性Ｔ細胞
の両者と相互作用して、両者の挙動に影響を及ぼす生体分子を産生することで、
それぞれ抗体産生と
細胞傷害性作用を促進、制御する［モシエル（Mosier，D.E.）、Science 158:15
73-1575(1967)］。他にもサプレッサーＴ細胞やメモリーＴ細胞などのＴ細胞ク
ラスも存在する［ミエデマとメリーフ（Miedema，F.，and Melief，C.J.M.）、I
mmunol．Today 6:258-259(1983)；ティザード（Tizard）、pp．225-228］。
Ｔ細胞クラスは、Ｔ細胞が異なるとその表面上に表出（display）されるＣＤ
タンパク質も異なるという事実に基づき、ある程度区別される。未成熟Ｔ細胞は
ＣＤ４タンパク質とＣＤ８タンパク質の両者を表出し（すなわち、未成熟Ｔ細胞
はＣＤ４+８+である）、成熟ヘルパーＴ細胞はＣＤ４+８-であり（すなわちＣＤ
４タンパク質を表出し、ＣＤ８タンパク質を表出しない）、成熟細胞傷害性Ｔ細
胞はＣＤ４-８+である（すなわちＣＤ８タンパク質を表出し、ＣＤ４タンパク質
を表出しない）［スミス（Smith，L.）、Nature 326:798-800(1987)；ワイスマ
ンとクーパー（Weissman，I.L.，and Cooper，M.D.）、Sci．American 269:65-7
1(1993)］。抗原認識
動物の免疫系のＴ細胞とＢ細胞が正しく機能するためには、それらが出くわし
た外来性（「非自己」）または内因性（「自己」）であるが発現が異常な組成物
に由来する無数の分子組成物を正しく確実に同定しなければならない。免疫系に
よる認識と同定は分子レベルで起きる。免疫応答を引き起こ
す能力を有する分子組成物である抗原は、エピトープと呼はれる１つ以上の分子
大の同定要素から成る。たとえば１００個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有
するポリペプチド抗原は、それぞれ約３個ないし約２５個のアミノ酸から成るポ
リペプチドの一部分によって規定される数十個のエピトープから成るかも知れな
い。ポリペプチドだけから誘導できるエピトープの数は、約１千万個と推定され
る［ティザード（Tizard）、p.25］。
動物のＴ細胞またはＢ細胞が出くわした抗原は、正常な内因性（すなわち自己
）抗原、すなわちそれに対して免疫応答を示すと動物に傷害を引き起こす抗原か
、外来性または異常な（すなわち非自己）抗原、すなわちそれに対して免疫応答
を示さねばならない抗原）のいずれかと関連があるものとして同定される。免疫
系の抗原同定手段の一部として、個々のＴ細胞とＢ細胞は、それらの表面上に表
出されて特異的抗原と結合する抗原受容体を産生する［ターナー（Turner，M.）
、Chapter ５ in Immunology，2d Ed.，Roitt，Ｉ.，et al.，eds.，Gower Medi
cal Publishing，London，New York，1989］。Ｂ細胞は、Ｉｇ重鎖およびＩｇ軽
鎖と呼ばれる２つの抗体サブユニットのそれぞれの可変領域にあるユニークなア
ミノ酸配列によるユニークな抗原結合部分を有するＩｇ分子を含む抗原受容体を
産生し、表出する。各Ｂ細胞膜は２０，０００ないし２００，０００個の同じＩ
ｇ分子でできている［ティザード（Tizard）、pp．78-80 and 202］。
個々のＴ細胞によって産生されＴ細胞上で表出されるＴ細
胞抗原受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞表面上でジスルフィド結合によって結合して
いる重鎖（ＴＣＲβ）と軽鎖（ＴＣＲα）（ポリペプチドのサブユニット）を含
む。各ＴＣＲαサブユニットとＴＣＲβサブユニットは、Ｔ細胞ごとの変化がな
いアミノ酸配列であるカルボキシ末端定常領域、およびＴ細胞ごとに変化するア
ミノ酸配列であるアミノ末端可変領域を有している。ＴＣＲαサブユニットとＴ
ＣＲβサブユニットが会合すると、ＴＣＲαポリペプチドサブユニットとＴＣＲ
βポリペプチドサブユニットの可変領域が一体化して、α：βＴＣＲのユニーク
な抗原結合部分ができる。第２のタイプのＴＣＲヘテロダイマーであるγ：δが
記載されているが、それが何らかの機能を果たしているとしても内容は不明であ
る［デービスとブジョルクマン（Davis，M.M.，and Bjorkman，P.J.）、Nature 334
:395-404(1988)］。機能が不明の少なくとも１つの混合ＴＣＲヘテロダイマ
ーすなわちβ：δＴＣＲが記載されているが、成熟動物ではα：βＴＣＲ分子を
有するＴ細胞が数的に優勢である［ホッホステンバックとブレナー（Hochstenba
ch，F.，and Brenner，M.B.）、Nature 340：562-565(1989)］。
各Ｔ細胞またはＢ細胞は同じ抗原受容体を表出するが、表出された受容体は細
胞ごとに異なる。したがって、動物体内の抗原受容体の種類は非常に多様である
。この多様性の遺伝的基礎は次のとおりである。Ｉｇ重鎖の可変領域またはＴＣ
Ｒβ鎖の可変領域は、可変セグメント（Ｖ）、多様セグメント（Ｄ）、および連
結セグメント（Ｊ）という３つの遺伝子
セグメントによってコードされる。Ｉｇ軽鎖の可変領域またはＴＣＲα鎖の可変
領域は、ＶとＪの遺伝子セグメントによってコードされる。多くの異なるＶ、Ｄ
、およびＪの遺伝子セグメントをコードする多重ＤＮＡ配列が、生殖系列ＤＮＡ
中に未発現コピーとして存在し、ＴＣＲサブユニットを構成する類似のしかし異
なる可変遺伝子セグメント群も存在する。動物の発育過程で、ＶとＤとＪの遺伝
子セグメントまたはＶとＪの遺伝子セグメントの無差別連結によって、多様な可
変領域をコードする遺伝子が免疫系の個々の細胞中に形成される。Ｉｇ重鎖サブ
ユニットまたはＴＣＲβサブユニットの無差別に組み合わされた可変領域ができ
るＤＮＡ転位の過程をＶ−Ｄ−Ｊ連結と呼び、Ｉｇ軽鎖サブユニットまたはＴＣ
Ｒαサブユニットの転位可変領域ができる類似過程をＶ−Ｊ連結と呼ぶ［サカノ
ら（Sakano，H.，et al.）、Nature 280:288-294(1979)；アーリーら（Early，P
.，et al.）、Ce11 19:981-992(1980)；アルトら（Alt，F.W.，et al.）、Scien
ce 238:1079-1087(1987)；ハーローとレーン（Harlow，E.，and Lane，D.）、An
tibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold
Spring Harbor，pages 10-18，1988；デービスとブジョルクマン（Davis，M.M.
，and Bjorkman，P.J.）、Nature 334:395-404(1988)］。
機能的転位を受けたＩｇまたはＴＣＲサブユニット遺伝子とは、Ｖ−Ｄ−Ｊま
たはＶ−Ｊ連結のＤＮＡ転位によって、終止コドンまたはフレームシフト突然変
異の導入のために未
成熟に終止する読み取り枠を生じてはいないサブユニット遺伝子である。免疫系
の各Ｔ細胞またはＢ細胞は、機能的転位を受けたユニークな可変領域が存在する
それぞれの抗原受容体をコードする遺伝子を発現するので、ユニークな抗原認識
領域を有するタンパク質をそれぞれが産生する多くの異なるＴ細胞またはＢ細胞
ができる［ヘイ（Hay，F.）、Chapter 6 iｎImmunology，2d Ed.，Roitt，I.，e
t al.，eds.，Gower Medical Publishing，London，New York，1989］。動物の
Ｔ細胞上に表出される様々な抗原受容体の完全なリストをその動物のＴＣＲレパ
ートリーと呼ぶ［ベバンら（Bevan，M.J.，et al.）、Science 264:796-797(199
4)］。
成熟したＴ細胞またはＢ細胞の場合、抗原が細胞の抗原受容体に結合するとそ
の細胞が活性化される。すなわち、細胞が刺激されて、細胞性または液性免疫応
答の発生に関係する作用を示すようになる。通常、活性化された成熟Ｔ細胞また
はＢ細胞は抗原に応答して増殖する。一方、未成熟のＴ細胞またはＢ細胞の場合
は、それぞれ表出されたＴＣＲまたはＢ細胞抗原受容体に抗原が結合すると、陰
性選択またはクローン欠失と呼ばれる過程によってその細胞が除去される。クロ
ーン欠失は健康な野生動物の正常な発育の過程で起きるが、これが、免疫系がそ
の動物の正常な内因性（自己）抗原を許容すること、すなわちその動物の自己抗
原を非免疫原性抗原として処理することを学ぶ機構である。免疫系が自己抗原許
容性の獲得や維持ができなくなると、ヒトを含む動物の自己免疫疾患にまで達す
る可能性のある自己免疫応答（すなわち
自己抗原に対する自己免疫応答）が起きることがある。自己免疫疾患は、非自己
抗原に対する適当な免疫応答が免疫エフェクター生体分子（たとえば自己抗体）
や自己抗原と交差反応を起こす細胞の産生もたらす場合に起こりうる。ヒトの自
己免疫疾患としては、多発性硬化症（ＭＳ）や全身性紅斑性狼痕）などの肢体不
自由障害などが挙げられる［ロイット（Roitt，I.）、Chapter 23 in Immunolog
y，2d Ed.，Roitt，I.，et al.，eds.，Gower Medical Publishing，London，Ne
w York，1989；ステインマン（Steinman，L.）、Sci．Ameｒican 269:107-114(1
993)］。抗原提示
Ｂ細胞の抗原受容体は可溶性抗原と直接結合することができるが、Ｔ細胞は抗
原提示細胞（ＡＰＣ）と総称される他の特定のクラスの細胞上に表出される場合
に限って抗原に典型的に応答する［フェルドマンとメイル（Feldmann，M.，and
Male，D.）、Chapter 8 in Immunology，2d Ed.，Roitt，I.，et al.，eds.，Go
wer Medical Publishing，London，New York，1989］。たとえばマクロファージ
や樹状突起細胞などのＡＰＣは、ＡＰＣの表面上で表出されるＭＨＣ（主要組織
適合性複合体）として知られる糖タンパク質を介してポリペプチド由来の抗原を
提示する［ベバンら（Bevan，M.J.，et al.）、Seicnece 264:796-797(1994)］
。ＭＨＣ遺伝子産物の命名は種ごとに異なる。たとえば、ヒトＭＨＣタンパク質
はヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれ、ネズミＭＨＣ
タンパク質はＨ−２抗原とも呼ばれ、ラットＭＨＣタンパク質はＲＴ１抗原とも
呼ばれる［ティザード（Tizard）、p．181］。特定のＭＨＣタンパク質は、限ら
れた特異性を有する一部クラスの抗原と結合する。たいていの場合、ＴＣＲ：Ａ
ｇ：ＭＨＣ複合体中に存在する特異性決定基は（１）ＴＣＲの可変部分のユニー
クなポリペプチド配列と（２）抗原のユニークなポリペプチド配列であるが、Ｍ
ＨＣにより提示されるオリゴペプチド抗原はある程度はＭＨＣ分子内に埋め込ま
れており、抗原のＴＣＲ認識は適当なクラスのＭＨＣ分子が関与している場合に
限って起きる［ジャネウエイ（Janeway，C.A.）、Sci．American 269:73-79(199
3)］。この現象はＭＨＣ拘束と呼ばれ、Ｔ細胞の抗原認識と生理において基本的
に重要である［ジンケルナーゲルとドハーティー（Zinkernagel，R.M.，and Doh
erty，P.C.）、Nature 248:701-702(1974)］。
ＭＨＣが媒介する抗原提示においては、α：βＴ細胞抗原受容体がＭＨＣ遺伝
子産物と合わせてペプチド抗原を認識する。可溶性抗原の場合、認識はクラスＩ
Ｉの分子と合わせて起きる。ウイルス抗原の場合は、認識はクラスＩの分子と合
わせて起きる。さらに、大型の可溶性抗原がマクロファージや樹状突起細胞など
の適当な附属細胞によってポリペプチドから処理される。
ＭＨＣ拘束におけるＴ細胞によるポリペプチド抗原の認識に関係する一連の事
象は次のとおりである。ポリペプチド抗原が抗原提示細胞による食作用を受け、
内部に取り込まれ、
プロセシングされた後、該ポリペプチドに由来するペプチドが、クラスＩまたは
クラスＩＩのＭＨＣ分子と共に細胞表面上で表出される。抗原を提示するために
は、ＭＨＣクラスＩ分子はさらに別のタンパク質すなわちβ2ミクログロブリン
を必要とする［ティザード（Tizard）、pp．181-183］。次いで、Ｔ細胞抗原受
容体であるα：βヘテロダイマーがペプチド抗原とＭＨＣ遺伝子産物を合わせて
認識する。ペプチド抗原だけあるいはＭＨＣ遺伝子産物だけが認識されても、Ｔ
細胞活性化を引き起こすには不十分である。ＭＨＣ：Ａｇ複合体だけがＴＣＲ分
子によって正しく認識されうる［スチュワード（Steward，M.）、Chapter 7 in
Immunology，2d Ed.，Roitt，I.，et al.，eds.，Gower Medical Publishing，L
ondon，New York，1989］。
ＭＨＣタンパク質をコードする遺伝子は多様であるが、同じ動物個体内でも細
胞ごとに異なるＩｇ分子やＴＣＲ分子と異なり、ＭＨＣ抗原は動物個体ごとにあ
るいは近縁動物個体の群ことに異なる。マウスでは近交系マウスで代表されるフ
ァミリー群のメンバーは類似のＭＨＣ抗原を共有しているが、他系統のマウスの
個体とはそれを共有しない［スネル（Snell，G.D.）、Science 213:172-178(198
1)；オーエン（Owen，M.）、Chapter 4 in Immunology，2d Ed.，Roitt，I.，et
al.，eds.，Gower Medical Publishing，London，New York，1989］。変異体Ｍ
ＨＣ分子は異なる様々な抗原と結合する能力を有するであろうから、Ｔ細胞が認
識し（すなわちＭＨＣ関与状態で特異的に結合する）応答する抗原はマウスの
系統間で異なる［クーケ（CooKe，A.）、Chapter 11 in Immunology，2d Ed.，R
oitt，I.，et al.，eds.，Gower Medical Publishing，London，New York，1989
］。ヒトでは、ＭＨＣ（ＨＬＡ）分子をコードする特定の対立遺伝子がさらに高
度に自己免疫疾患と関連しているが、これはおそらく、これらのＭＨＣ分子が自
己抗原と結合する点（したがってＴ細胞への提示の時点）でより応答能が高まる
ためであろう［バウグハン（Vaughan）、Immunological Diseases，3rd Ed.，Vo
l．II，Samter，M.，ed.，pp．1029-1037(1978)；スタインマン（Steinman，L.
）、Sci．American 269:107-114(1993)］。二重陰性Ｔ細胞
一般に、ＣＤ８+Ｔリンパ球はＭＨＣクラスＩ複合体を認識し、ＣＤ４+細胞は
抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ複合体を認識する。α：βＴＣＲによる抗原
認識にはＣＤ８とＣＤ４の関与が重要である。ＣＤ４分子とＣＤ８分子はＴＣＲ
相互作用Ａｇ：ＭＨＣ複合体の親和性を増大させるので、共受容体と呼ばれるこ
ともある［ビエラーら（Bierer，B.E.，et al.）、Ann．Rev．Immunol. 7:579-5
99(1989)；スチュワード（Steward，M.）、Chapter 7 in Immunology，2d Ed.，
Roitt，I.，et al.，eds.，Gower Medical Publishing，London，New York，198
9］。ＭＨＣの関与がある場合の抗原認識ではＣＤ４とＣＤ８が重要であるため
、ＣＤ４-８-（二重陰性、ＤＮ）のＴ細胞は古くから未成熟胸腺Ｔ細胞前
駆体であると考えられてきた［リドヤードとグロッシ（Lydy ard，L.，and Gros
si，C.）、Chapters 2 and 14 in Immunology，2d Ed.，Roitt，I.，et al.，ed
s.，Gower Medical Publishing，London，New York，1989；スミス（Smith，L.
）、Nature 326:798-800(1987)；ストロミンジャーら（Strominger，J.L.，et a
l.）、Int．J．Cancer Suppl．4:43-47(1989)；シライら（Shirai，T.，et al.
）、J．Immunology 144:3756-3761(1990)；ワイスマンとクーパー（Weissman，I
.L．and Cooper，M.D.）、Sci．American 269:65-71（1993)］。
ＤＮ亜集団のＴ細胞は、それらが表出するＴＣＲに特徴がある。末梢血から単
離されたヒトＤＮ Ｔ細胞の大部分はδ：γＴＣＲを発現する［ポーセリら（Po
rcelli，S.，et al.）、Immunological Reviews 120:137-183(1991)］。ネズミ
ＤＮα：βＴＣＲ Ｔ細胞は高比率（約６０％）でＶβ８遺伝子産物を発現する
［フォウルケスら（Fowlkes，B.J.，et al.）、Nature 329:251-254(1987)；ビ
ックスら（Bix，M.，et al.）、J．Exp．Med．178:901-903(1993)］。マウスを
使ったいくつかの分析で、連結（Ｖ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ）の多様性が顕著に欠
落していること、およびとくにＴＣＲαサブュニットの生殖系列ＶおよびＪ遺伝
子要素の利用が制限されていることがわかる［コセキら（Koseki，J.，et al.）
、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:5248-5252(1990)；クボタら（Kubota，H.，e
t al.）、J．Immunol．149:1143-1150(1992)］。ヒトの新鮮ＤＮα：βＴＣＲ
Ｔ細胞を調ベ
たところ、Ｎ領域付加を受けていない非変異体（規定配列）のＶα２４−ＪαＱ
転位が顕著に優勢であることがわかった［ポーセリら（Porcelli，S.，et al.）
、J．Exp．Med. 178:1-16(1993)］。これらの知見を総合すると、ＤＮα：βＴ
ＣＲ Ｔ細胞は、抗原と抗原提示分子の両方または一方の限られたセットを認識
することを反映する限られた受容体レパートリーを有する特徴的なＴリンパ球亜
集団に相当するものであることが示唆される。ＣＤ１タンパク質
ＣＤ１座位の遺伝子によってコードされるポリペプチド分子は、α：βＴＣＲ
またはγ：δＴＣＲのいずれかを発現する一部のＣＤ４-８-Ｔ細胞クローンによ
って認識される［ポーセリら（Porcelli，S.，et al.）、Nature 341:447-450(1
989)；ファウレら（Faure，F.，et al.）、Eur.J. Immun. 20:703-706(1990)］
。ヒト染色体番号１の上にある遺伝子によってコードされるＣＤ１分子はヒト染
色体番号６の上にある遺伝子によってコードされるＭＨＣ分子と構造的に似てい
るため［カラビとミルステイン（Calabi，F．and Milstein，C.）、Nature 323:
540-543(1986)；バルクら（Balk，S.P.，et al.）、Proc．Natl．Acad．Sci．US
A 86:252-256(1989)］、ＣＤ１はＭＨＣ遺伝子によってコードされるものとは別
の抗原提示分子のファミリーに相当することが示唆されている［ポーセリら（Po
rcelli，S.，et al.）、Nature 341:447-450(1989)；ストロミンジャー（Stromi
nger，
J.L.）、Cell 57:895-898(1989)；ポーセリら（Porcelli，S.，et al.）、Immun
．Rev．120:137-183(1991)］ 。
５つのＣＤ１遺伝子はＭＨＣクラスＩ遺伝子のものと似たエキソン・ドメイン
構造（α１、α２、α３）を持っているが、生じるタンパク質は配列的に遠縁で
あるにすぎない。ＣＤ１ファミリーのすべてのメンバーは保存されたα３ドメイ
ンを共有しているが、このドメインですらクラスＩのＭＨＣα３ドメインのコン
センサス残基とのアミノ酸配列相同性は３２％にすぎず、α１ドメインとは相同
性が認められない。ＭＨＣ分子とＣＤ１分子の大きな違いは多型性である。ヒト
ＭＨＣ遺伝子は多型性が非常に高く、多数の対立遺伝子が既知のＭＨＣ座位のそ
れぞれに存在することが記載されている。一方、ＣＤ１遺伝子は明らかに非多型
性である。これらの違いにも関わらず、ＣＤ１タンパク質はＭＨＣクラスＩ分子
と同様に、β2ミクログロブリンと非共有結合的に結合した大型サブユニット（
重鎖）として発現される［バン・アグトーベンとテルホルスト（Van Agthoven，
A.，and Terhorst，C.J.）、Immunol. 128:426-432(1982)；テルホルストら（Te
rhorst，C.，et al.）、Cell 23:771-780(1981)］。
これまでにＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅという５種類
のＣＤ１遺伝子がヒトで同定されている。これら５つのＣＤ１遺伝子産物のうち
の４つは血清学的に定義されており、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、およびＣ
Ｄ１ｄと呼ばれ、それぞれおよそ４９ｋＤａ、４５ｋＤａ、４３ｋＤａ、および
４８ｋＤａの分子量を有するユニークな
重鎖によって区別される［アミオットら（Amiot，M.，et al.）、J．Immunol．1 36:
1752-1758(1986)；ポーセリら（Procelli，S.，et al.）、Immunol．Rev．12 0:
137-183(1991)；ブレイヒャーら（Bleicher，P.A.，et al.）、Scinece 250:6
79-682(1990)］。ＣＤ１タンパク質は、ランゲルハンス細胞（皮膚における主な
樹状突起抗原提示細胞）、活性化Ｂ細胞、リンパ節の樹状突起細胞、および活性
化血液単球などの幾つかのＡＰＣの上に表出される［ポーセリら（Porcelli，S.
，et al.）、Nature 360:593-597(1992)；Leukocyte Typing IV，Knapp，W.，ed
.，Oxford University Press，Oxford，U.K.，pp．251-269，1989；Tissue Anti
gens，Kissmeyer-Nielsen，F.，ed.，Munksgard，Copenhagen，Denmark，pp．65
-72，1989］。
過去の研究で、ＣＤ１タンパク質はＳＬＥ患者由来のＣＤ４-８-Ｔ細胞株によ
って認識されることが示されている［ポーセリら（Porcelli，et al.）、Nature 341
:447-450(1989)］。外来（非自己）抗原が存在しない場合でも、ＣＤ１タン
パク質発現白血病細胞はＭＨＣ拘束と無関係なＴ細胞によって溶解される。ＤＮ
Ｔ細胞は抗原の非存在下でＣＤ１依存的に白血病細胞を溶解した。したがって
、ＣＤ１タンパク質は自己免疫疾患に何らかの役目を果たしている可能性がある
。
免疫系は通常は自己に対して反応しないというのが免疫学のセントラルドグマ
であった。自己免疫とは、自己に対する自然の無応答性すなわち許容性がなくな
る状態と定義される
。その結果、抗体または細胞が自己の成分と反応して疾患を引き起こす。様々な
自己免疫障害の起源と病態発生を説明できる統一概念は未確立である。疾患過程
は、様々な原因のなかでもとくに感作Ｔリンパ球によって引き起こされるのかも
しれない。これらのリンパ球は、破壊的なリンホカインの放出を伴うかもしれな
い、あるいは他の炎症細胞を病変部に引きつける未解明の機構によって組織病変
を作り出す。自己免疫については、既報文献［テオフィロポウロス（Theofilopo
ulos，A.N.）、Chapter 11 in Basic and Clinical Immunology，6th Ed.，Stit
es，D.P.，et al.，eds.，Appleton and Lang，1987］を参照されたい。ミコバクテリアとミコール酸
ミコバクテリアは、宿主に侵入すると単球およびマクロファージのエンドソー
ム画分内で生存するようになる好気性細胞内細菌の１属である。ヒトのミコバク
テリア疾患としては、結核（Ｍ．ツベルクロシスによって引き起こされる）、ら
い（Ｍ．レプラエによって引き起こされる）、ブルーリ潰瘍（Bairnsdale ulcer
s）（Ｍ．ウルセランスによって引き起こされる）、およびＭ．マリヌム、Ｍ．
カンサシイ、Ｍ．スクロフラセウム、Ｍ．スズルガイ、Ｍ．キセノピ、Ｍ．フォ
ルツイツム、Ｍ．チェロネイ、Ｍ．ハエモフィルム、およびＭ．イントラセルラ
ーレによって引き起こされる様々な感染症などが挙げられる［ウォリンスキー（
Wolinsky，E.）、Chapter 37 in Microbiｏlogy：Including Immunology and Mo
l
ecular Genetics，3rd Ed.，Harper & Row，Philadelphia，1980；ダニエル、ミ
ラーおよびフリードマン（Daniel，T.M.，Miller，R.A．and Freedman，S.D.）
、それぞれChapters 119，120 and 121，in Harrison's Principles of Iｎtern
a 1 Medicine，11th Ed.，Braunwald，E.，et al.，eds.，McGraw-Hill，New Yo
rk，1987］。世界人口の３分の１はＭ．ツベルクロシス（Ｍ．ｔｂ）を保菌して
おり、１５〜５９歳の成人の死因の１８．５％を占める結核（ＴＢ）を発症する
危険性がある［ブルームとムレイ（Bloom，B.R.，and Murray，C.J.L.）、Scien
ce 257:1055-1064(1992)］。公衆衛生と抗生物質療法の進歩により米国における
ＴＢの発生率と重症度は大幅に低下したので、上記の警告的統計値は主に第３世
界諸国から得られたものである。不幸にも、エイズの出現により結核はほぼ対数
的に増加しつつあり、多剤抵抗性株が出現しつつあって、現在ではニューヨーク
市の全症例の３分の１を占めるに至っている［ブルームとムレイ（Bloom，B.R.
，and Murray，C.J.L.）、Science 257:1055-1064(1992)；米国議会技術評価局
（U.S．Congress，Office of Technology Assessment）、The Continuing Chall
enge of Tuberculosis，OTA-H-574，U.S．Government Priｎting Office，Washi
ngton，D.C.，1993］。かつては病原性を有さない株と考えられていたミコバク
テリア株（たとえばＭ．アビウム）が今や免疫が抑制されたエイズ患者を死に至
らしめる大きな原因となっている。さらに、現在のミコバクテリアワクチンは、
Ｍ．ツベルクロシスに対するＢＣＧワクチンの場合には不適当
であり、Ｍ．レプラエに関しては利用できない［カウフマン（Kaufmann, S.）、
Microbiol．Sci．4:324-328(1987)；米国議会技術評価局（U.S．Congress，Offi
ce of Technology Assessment）、The Continuing Challenge of Tuberculosis
，pp.62-67，OTA-H-574，U.S．Government Printing Office，Washington，D.C.
，1993］。
ミコバクテリアに対する主要応答では、生物の細胞内死および閉じ込め効果ま
たは壁防止効果（肉芽腫形成）に大きな役目を果たしているＴ細胞やマクロファ
ージとの細胞性遅延過敏反応（ＤＴＨ）が起きる。主要Ｔ細胞応答には、ミコバ
クテリア熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６５など）を免疫優性抗原として認識す
るＣＤ４+リンパ球が関与している［カウフマンら（Kaufmann，S.H.，et al.）
、Eur．J．Immunol．17:351-357(1987)］。ところが、ミコバクテリアはリピド
を極めて高い含有率で含んでおり、桿菌の乾物重の４０％、細胞壁の６０％を占
める［ゴーレンとブレナン（Goren，M.B.，and Brennan，P.J.）、Mycobacteria
l Lipids：Chemistry and Biologic Activities in Tuberculosis，1979］。お
そらく最も数が多く多様なミコバクテリアリピドはミコール酸であろう。これら
のα分岐βヒドロキシ脂肪酸は、ミコバクテリアおよび近縁細菌種に見られるユ
ニークな構造体の１群である［ウォリンスキー（Wolinsky，E.）、”Mycobacter
ia,”Chapter 37 in Microbiｏlogy：Including Immunology and Molecular Gen
etics，3rd Ed.，Davis，B.H.，ed.，Harper & Row，Philadelphia，1980］。
ミコール酸は主に細胞壁に含まれており、エステル化されてコアペプチドグリ
カンと結合したアラビノガラクタン重合体となっていて［マックニールとブレナ
ン（McNeil，M.R.,and Brennan，P.J.）、Res．Microbiol．142:451-563(1991)
；ベスラ（Besra，G.S.）、Biochemistry 30:7772-7777(1991)；マックニールら
（McNeil，M.，et al.）、Journalof Biological Chemistry 266:13217-13223(1
991)］、アルカリまたは酸加水分解（鹸化）によって遊離することができる［ミ
ニキン（Minnkin，D.E.）、”Mycolic acids″in CRC Handbook of Chromatogra
phy：Analysis of Lipids，Murhergee，K.D.,and Weber，N.，eds.，CRCPress，
1993］。ミコール酸は生物を覆うリピド被膜の主成分であり、生物に疎水性面と
特徴的な耐酸染色性を与えている［ゴーレンとブレナン（Goren，M.B.，and Bre
nnan，P.J.）、Mycobacterial Lipids：Chemistry and Biologic Activities in
Tuberculosis，1979］。
サイズがＣ12−Ｃ24の幅がある真核生物や細菌の脂肪酸と異なり、ミコバクテ
リアのミコール酸のサイズはＣ60−Ｃ90の幅がある［ミニキン（Minnikin，D.E.
）、”Lipids：Complex Lipids，their Chemistry，Biosynthesis and Roles”i
n The Biology of Mycobacteria，Vol．1，Ratledge，C.，and Sanford，J.，ed
s.，Academic Press，London，1982］。
ミコール酸は直鎖状脂肪酸と異なり、α炭素部分に分岐アルキル基を、またβ炭
素部分にヒドロキシル基を持っている［ゴーレンとブレナン（Goren，M.B.，and
Brennan，P.J.）、
Mycobacterial Lipids：Chemistry and Biiologic Activities in Tuberculosis
，1979；ミニキン（Minnikin，D.E.）、”Lipids：Complex Lipids，their Chem
istry，Biosynthesis and Roles”in The Biｏlogy of Mycobacteria，Vol．l，
Ratledge，C.，and Sanford，J.，eds.，Academic Press，London，1982；タカ
ヤマとクレシ（Takayama，I.，and Qureshi，N.）、”Structure and Synthesis
of Lipids”in The Mycobacteria：A Sourcebook，Part A，Kubica，G.P.，and
Wayne，L.G.，eds.，Marcel Dekker，New York & Basel，1984］。ミコール酸
の主要アルキル長鎖（いわゆるメロ基）は長さと置換官能基の両者が不均一であ
る。アルケン基（二重結合）以外のミコール酸官能基としては、メトキシル基、
ケト基、孤立メチルバランス（lone methyl barances）、エチレン基、およびシ
クロプロパノイド基などが挙げられる［ミニキン（Minnikin，D.E.）、”Lipids
：Complex Lipids，their Chemistry，Biosynthesis and Roles”in The Biolog
y of Mycobacteria，Vol．1，Ratledge，C.，and Sanford，J.，eds.，Academic
Press，London，1982］。ミコール酸が利用できる官能基は多数あること、鎖長
が様々であること、および株間で不均一であることから、ミコール酸は、アミノ
酸側鎖間の不均一性を有するペプチドによって提供されるものと同程度に高度の
抗原変異性を示すことができる。したがって、これらのリピド分子はかつてはあ
まり注目されなかった免疫学的意味合いを持っているかもしれない。各ミコバク
テリア種ごとに、含まれる免疫系分子のパターンに基づく特有
のフィンガープリントが存在する。このパターンは、薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）［ミニキン（Minnikin，D.E.）、”Lipids：Complex Lipids，their Ch
emistry，Biosynthesis and Roles”in The Biology of Mycobacteria，Vol．1
，Ratledge，C.，and Sanford，J.，eds.，Academic Press，London，1982；ド
ブソンら（Dobson，G.，et al.）、Chemical Methods in Bacterial Systematic
s，Academic Press，1985；バレロ−グイレンら（Valero-Guillen，P.L.，et al
.）、Journal of Applied Bacteriology 59:113-126(1985)］、ガスクロマトグ
ラフィー（ＧＣ）［バレロ−グイレンら（Valero-Guillen，P.L.，et al.）、Jo
urnal of Applied Bacteriology 59:113-126(1985)；アタルイエら（Athalye，M
.，et al.）、Journal of Applied Bacteriology 58:507-512(1985)：ルクイン
ら（Luquin，M．et al.）、Journal of Clinical Microbiology 29:120-130(199
1)］、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［クレシら（Qureshi，N
.，et al.）、Journal of Biological Chemistry 253:5411-5417(1978)；クレシ
ら（Qureshi，N.，et al.）、Journal of Biological Chemistry 255:182-189(1
980)；ブットラーら（Butler，W.R.，et al.）、Journal of Clinical Microbio
logy 29:2468-2472(1991)；ブットラーとキルバーン（Butler，W.R.，andKilbur
n，J.O.）、Journal of Clinical Microbiology 28:2094-2098(1990)］によって
種ごとに決定されている。
発明の概要
本発明は、ＣＤ１分子がＴ細胞に対する自己免疫抗原と同様に外来の抗原をも
提示する機能を有するという新規なかつ予想外の観察に基づいている。本発明は
さらに、単離された血液単球がＣＤ１を発現するように誘導され、従って単球を
顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイ
キン−４（ＩＬ−４）と接触させることによりＴ細胞に対する抗原を提示する能
力を持つに至るという観察に基づいている。これらの二つの観察に基づき、本発
明はＣＤ１により提示される抗原を同定し、単離し、そして精製するために使用
されるＣＤ１+抗原提示細胞（ＣＤ１+ＡＰＣｓ）を単離する方法、試料か１種以
上のＣＤ１により提示される抗原を含むか否かを判定する方法、ＣＤ１により提
示される抗原を単離しそして精製する方法、本明細書に開示されている方法によ
って単離され精製されたＣＤ１により提示される抗原、および単離されたＣＤ１
により提示される抗原をワクチンに使用する方法を開示する。
一つの態様においては、本発明は試料がＣＤ１により提示される抗原を含むか
否かを判定する方法を提供する。かかる方法の一つでは、試料中にＣＤ１により
提示される抗原が存在することは、（１）この試料をＣＤ１タンパク質を発現す
るように誘導された細胞と接触させ、（２）第１のステップで得られる細胞を、
ＣＤ１により提示される抗原を特異的に認識するＣＤ４-８-（二重陰性；ＤＮ）
Ｔ細胞と接触させ、そして（３）ＤＮ Ｔ細胞の増殖性応答または細胞溶解性
応答を測定ことにより判定することができる。ここでそれぞれ、Ｔ細胞増殖の増
加またはＣＤ１+標的細胞のＴ細胞を介する細胞溶解が起これば、ＣＤ１により
提示される抗原の存在と相関する。関連する一つの態様においては、本発明は、
試料がＣＤ１ブロッキング物質、即ちＣＤ１拘束性抗原提示を阻害する組成物を
含むか否かを判定する方法を提供する。この関連態様においては、上述のＣＤ１
により提示される抗原の測定は２重に行われ、第１の（対照の）測定は上記のよ
うに行い、そして第２の測定はさらにＣＤ１ブロッキング物質を含むと思われる
試料を加えて行う。試料中にＣＤ１ブロッキング物質が存在すると、第２の測定
におけるＴ細胞増殖性応答または細胞溶解性応答が第１の測定で得られたものよ
りも小さいことと相関する。
本発明はさらに、ＣＤ１+抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）を生成させるために、単
球のような細胞中でＣＤ１発現を誘導する方法を提供する。一つの方法では、１
種以上のサイトカインと血液の単球を接触させることにより、単離されたこの細
胞中でＣＤ１発現が誘導される。ＣＤ１誘導のためのサイトカインとしては、顆
粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−
４と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦ、またはインターロイキン−３が好ましい。ＣＤ
１+ＡＰＣｓは、ＣＤ１タンパク質を発現しそして表出する細胞であり、従って
ＤＮα：βＴＣＲ Ｔ細胞に対するＣＤ拘束性抗原を提示する能力を有する。Ｃ
Ｄ１+ＡＰＣｓは本明細書に開示される方法の幾つかで使用されている。
本発明はさらに、本明細書に開示される方法で使用するためのＣＤ４-８-（Ｄ
Ｎ）α：βＴＣＲ Ｔ細胞を提供する。（ＤＮ）α：βＴＣＲ Ｔ細胞はＣＤ１
結合抗原を認識（即ち特異的に結合）し、そして該認識の結果として増殖する。
本明細書には、ＤＮ１、ＤＮ２およびＤＮ６と名付けられたこのような単離され
た細胞株３株が記載されている。
本発明はさらに、ＣＤ１により提示される抗原を試料から単離する方法を提供
する。そのような方法の一つでは、ＣＤ１により提示される抗原を含む試料をま
ず通常の技術を用いて分画する。ついで、その結果得られる画分を本明細書に開
示される手順を用いてＣＤ１により提示される抗原が存在するか否かをテストす
る。ついで、ＣＤ１により提示される抗原を含む画分はワクチンの開発に用いら
れるか又はより高純度のＣＤ１により提示される抗原を得るためにさらに分画さ
れる。
本発明はさらにＣＤ１により提示される抗原を試料から単離する別の方法を提
供する。この方法は単離されたＣＤ１または細胞表面で発現されたＣＤ１と結合
するＣＤ１により提示される抗原の能力に依存する。そのような方法の一つでは
、ＣＤ１により提示される抗原を含む試料をＣＤ１+ＡＰＣＳまたは精製された
ＣＤ１分子のいずれかとインキュベートする。ついで、その結果生ずる抗原：Ｃ
Ｄ１+ＡＰＣｓ複合体または抗原：ＣＤ１分子複合体を試料から取り出し、ＣＤ
１分子が結合しているＣＤ１により提示される抗原を放出する条件の下に置く。
ついで、放出されたＣＤ１により提示さ
れる抗原を精製してＣＤ１+ＡＰＣｓまたは精製ＣＤ１分子を除き、さらに通常
の免疫学的、生化学的および／または遺伝学的方法を用いて特性を調べる。つい
で、精製されたＣＤ１により提示される抗原、またはそれらの合成によるもしく
は遺伝子工学的に作られた誘導体を本明細書に開示される手順でＣＤ１により提
示される抗原の活性を測定し、そして、ワクチンの処方に用いられてもよい。
ＣＤ１により提示される抗原を単離する上記の手順を用いて、本発明はさらに
本明細書に開示される方法によって調製された、単離されたＣＤ１により提示さ
れる抗原を提供する。これらの開示される方法によって調製されるＣＤ１により
提示される抗原は、ＣＤ１により提示される抗原の性質の特性を明らかにするた
めに、ワクチンの開発または処方のために、あるいは自己免疫治療の開発のため
に使用することができる。
本発明はさらに、ＣＤ１媒介抗原提示が自己免疫疾患の増悪の根拠として役立
ち得るという観察に基づく。この観察に基づき、本発明はＣＤ１+ＡＰＣにより
ＣＤ１媒介抗原提示を阻害する方法および手段を提供する。ＣＤ１媒介抗原提示
は本明細書に記述されるまたは本発明の方法によって単離されるさまざまな組成
物により阻害することができる。
図面の簡単な説明
図１（パネルａとｂ）：ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で培養した単球
によるＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、およびＣＤ
１ｃの発現、およびミコバクテリウム ツベルクロシスに対して特異的なＣＤ１
ｂ拘束性Ｔ細胞の表面表現型。
パネルａ：ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を含む培地中で６０時間培養したＣＤ１ａ
、ＣＤ１ｂ、およびＣＤ１ｃの発現を示した末梢血単球のフローサイトメトリー
分析。細胞を対照モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（点線）または各ヒストグラム
ボックスに示した特異性を有するｍＡｂ（実線）で染色した。サイトカインの非
存在下またはインターフェロン−γの存在下で培養した単球は有意量のＣＤ１ａ
、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃを発現しなかった（データは示さない）。
パネルｂ：α：βＴＣＲの発現を示し、ＣＤ４の発現は示さず、ＣＤ８の発現
はほとんどあるいは全く示さなかったＴ細胞株ＤＮ１のフローサイトメトリー分
析（点線と実線はパネルａと同様に対照および特異的ｍＡｂを示す）。
図２（パネルａ−ｄ）：ＣＤ４-８-Ｔ細胞株ＤＮ１およびそのサブクローンＤ
Ｎ１．Ｃ７の増殖性応答の抗原特異性と自己制限性。
パネルａ：Ｍ．ツベルクロシス（黒塗り四角）、Ｍ．レプラエ（黒塗り丸）、
エシェリキア コリ（白抜き丸）、および破傷風毒素（白抜き丸）に対するＤＮ
１の増殖性応答（3Ｈ−チミジン取り込み量の１分あたり計数値（ＣＰＭ））。
抗原提示細胞は不均一のＧＭ−ＣＳＦ処理およびＩＬ−４処理ＣＤ１+単球であ
った。抗原濃度（タンパク質含有率換算）はｘ軸上に示した。
パネルｂ：Ｍ．ツベルクロシス（１μｇタンパク質／ｍｌ
）に対するＴ細胞株ＤＮ１の増殖性応答には、ＣＤ１+抗原提示細胞（ＣＤ１+Ａ
ＰＣ）が必要である。ＡＰＣは次の記号で示した。ＡＰＣなし、白抜き四角；Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ処理およびＩＬ−４処理単球（ＣＤ１+ＡＰＣ）、黒塗り丸；ＩＦＮ
γ処理単球（ＣＤ１+）、白抜き丸；新鮮単離単球（ＣＤ１+）、白抜き三角。各
培養物に添加したＡＰＣの数をｘ軸上に示した。
パネルｃ：調べたすべてのドナーのＡＰＣは、Ｍ．ツベルクロシスに対してＴ
細胞株ＤＮ１が増殖性応答を示したことに根拠を与えるものであった。白抜きバ
ーはＭ．ツベルクロシス非存在下のＴ細胞とＡＰＣを示し、黒塗りバーはＭ．ツ
ベルクロシス存在下（１μｇタンパク質／ｍｌ）のＴ細胞とＡＰＣを示す。ＡＰ
Ｃは５名の未処理ドナーのＧＭ−ＣＳＦ処理およびＩＬ−４処理末梢血単核細胞
であった。ＨＬＡタイプ分画を行なったところ、５名のドナー全員がＨＬＡ−Ａ
、−Ｂ、−Ｃ、−ＤＲ、−ＤＰ、または−ＤＱ座位の対立遺伝子を共有していな
いことが判明した（データは示さない）。
パネルｄ：抗ＣＤ１ｂｍＡｂはＭ．ツベルクロシス（１μｇタンパク質／ｍｌ
）に対するＤＮ１およびＤＮ１．Ｃ７の増殖性応答を特異的に阻害した。ＡＰＣ
はＧＭ−ＣＳＦ処理およびＩＦ−４処理単球であった。黒塗りバーはＭ．ツベル
クロシス存在下（１μｇタンパク質／ｍｌ）のＡＰＣに対するＴ細胞の増殖性応
答を示し、波線はＭ．ツベルクロシス非存在下のＡＰＣに対する応答を示し、「
ｎｄ」は測定してい
ないことを示す。使用したモノクローナル抗体は、Ｐ３（対照ＩｇＧ）、ＯＫＴ
６（抗ＣＤ１ａ）、ＷＭ−２５［抗ＣＤ１ｂ；ファバロロら（Favaloro，E.J.，
et al.）、DiseaseMarkers 4:261-270(1986))］、１０Ｃ３（抗ＣＤ１ｃ）、Ｗ
６／３２（抗ＭＨＣクラスＩ）、およびＩＶＡ１２［抗ＭＨＣクラスＩＩ；ショ
ー（Shaw，S.）、Hum．Immun．12:191-211(1985)］であった。
図３：抗原提示細胞株ＣＲ１およびサイトカイン剌激単球が、Ｔ細胞株ＤＮ１
から得られたクローンであるＴ細胞株２．１３ＤＮ１およびＧ７の成長を刺激す
る能力の比較。白抜きバーはＭ．ツベルクロシス非存在下のＴ細胞とＡＰＣを示
し、黒塗りバーはＭ．ツベルクロシスの存在下（１μｇタンパク質／ｍｌ）のＴ
細胞とＡＰＣを示す。
図４（パネルａ−ｄ）：リンパ芽球様細胞株Ｃ１ＲのＣＤ１トランスフェクタ
ントによるＭ．ツベクロシスの提示。ベクターｐＳＲα−ＮＥＯ ＤＮＡ（モッ
ク）または図に示したＣＤ１分子をコードするｃＤＮＡを含むｐＳＲα−ＮＥＯ
の構築物（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ）で安定的にトランスフェクトされた
Ｃ１Ｒ細胞を培地のみ（白抜きバー）またはＭ．ツベルクロシスを含む培地（２
５μｇタンパク質／ｍｌ、黒塗りバー）中で１２時間培養し、51Ｃｒで標識し、
様々なエフェクターＴ細胞の存在下で細胞溶解性測定の標的細胞として使用した
。標的細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率は５０：１であった。
パネルａ：Ｍ．ｔｂＣＤ１ｂにより提示されるＡｇ特異的
Ｔ細胞株ＤＮ１。
パネルｂ：ＤＮ１サブクローンＤＮ１．Ｃ７。
パネルｃ：ＣＤ１ａ自己反応性クローンＢＫ６。
パネルｄ：ＣＤ１ｃ自己反応性クローン３Ｃ８。
図５（パネルａ−ｃ）：Ｍ．ツベルクロシス抗原のＣＤ１ｂ拘束性提示はＭＨ
ＣクラスＩＩ領域によってコードされた分子を必要としないが、クロロキン感受
性経路による抗原プロセシングが関与している。
パネルａ：Ｔ細胞株ＤＮ１によるＣＤ１Ｔ２トランスフェクタントの溶解。ベ
クターＤＮＡのみでトランスフェクトされたＴ２細胞（モックトランスフェクタ
ント）を丸で示し、ＣＤ１ｂでトランスフェクトされたＴ２細胞を三角で示した
。白抜き記号はＭ．ツベルクロシスの存在下で前培養しなかった標的細胞を示し
、黒塗り記号はＭ．ツベルクロシス（１０μｇタンパク質／ｍｌ）の存在下で１
２時間の前培養を行なった標的細胞を示す。フローサイトメトリー分析で、ＣＤ
１ｂでトランスフェクトされたＴ２細胞をＭ．ツベルクロシスの存在下で培養し
てもＣＤ１ｂ発現に影響を及ぼさないことが示された（データは示さない）。
パネルｂ：ＣＤ１ｂ+ＡＰＣをグルタールアルデヒドで固定すると、細胞株Ｄ
Ｎ１に対するＭ．ツベルクロシスの提示が防止される。ＣＤ１ｂ+ＡＰＣ（ＧＭ
−ＣＳＦ処理およびＩＦ−４処理末梢血単核細胞、ＰＢＭＣ）をＭ．ツベルクロ
シスの存在下（１μｇタンパク質／ｍｌ、「パルス化ＡＰＣ」）または非存在下
培地（「非パルス化ＡＰＣ」）中で１２
時間培養し、集菌し、各細胞懸濁液の一定量を０．０１２５％グルタールアルデ
ヒドで３０秒間固定した。生じたＡＰＣ調製物が、可溶性Ｍ．ツベルクロシス抗
原（１μｇタンパク質／ｍｌ）の非存在下（白抜きバー）または存在下（黒塗り
バー）で細胞株ＤＮ１の増殖を刺激する能力があるかどうかを調べた。
パネルｃ：クロロキンによるＭ．ツベルクロシスのＣＤ１ｂ拘束性提示の阻害
。ＨＬＡ−ＤＲ７+の個体から得たＣＤ１ｂ+ＡＰＣを図に示した濃度のクロロキ
ンの存在下３７℃で６０分間Ｍ．ツベルクロシス抗原でパルス化し、グルタール
アルデヒドで固定し、細胞株ＤＮ１（黒塗り丸）またはＭ．ツベルクロシス特異
的ＨＬＡ−ＤＲ７+拘束性ＣＤ４+Ｔ細胞株ＤＧ．１（白抜き三角）の存在下での
増殖測定にＡＰＣとして使用した。結果は、クロロキン非存在下でＭ．ツベルク
ロシスでパルス化した固定ＡＰＣに対する応答阻害率で表わしたが、数字は同様
の３つの実験の代表値である。
図６：図に示したプロテアーゼによる抗原消化がＭ．ツベルクロシス抗原に対
するＴ細胞株ＤＧ．１の増殖性応答に及ぼす影響。
図７：図に示したプロテアーゼによる抗原消化がＭ．ツベルクロシス抗原に対
するＴ細胞株ＤＮ１の増殖性応答に及ぼす影響。
図８：図に示したプロテアーゼによる抗原消化がＭ．フォルツイツム抗原に対
するＴ細胞株ＤＮ１の増殖性応答に及ぼす影響。
図９（パネルａ−ｃ）：ＤＮα：βＴＣＲ+Ｔ細胞株によって認識されるミコ
バクテリア抗原は有機溶媒による抽出後に有機相中に定量的に分配され、ＣＤ１
ｂ拘束を受ける。有機溶媒による抽出を行なうと、ＣＤ１Ｂ拘束性ミコバクテリ
ア抗原が、従来のＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＣＤ４+α：βＴＣＲ+Ｔ細胞株によっ
て認識されるミコバクテリア抗原およびＤＮγ：δ（Ｖγ２Ｖδ２）ＴＣＲ+Ｔ
細胞によって認識される小型の非タンパク質性ミコバクテリアリガンドと区別さ
れる［プフェッファーら（Pfeffer，K.，et al.）、J．Immunology 148:575-583
(1992)］。全ミコバクテリア超音波処理物をクロロホルム／メタノール／Ｈ2Ｏ
で抽出し、生じた３相を、ＣＤ１+単球および図に示した希釈率で希釈した様々
な抗原調製物の存在下でＴ細胞を培養することによって測定した。
パネルａ：全ミコバクテリア超音波処理物（■、破線）、有機相（□、実線）
、水相（○、実線）、またはインターフェース（■、実線）に対するＣＤ１ｂ拘
束性ＤＮ Ｔ細胞株ＤＮ１の増殖性応答。ｘ軸上の抗原濃度は全超音波処理物標
品に対して正規化させた希釈率の逆数で示した。
パネルｂ：有機溶媒抽出後のミコバクテリア画分に対するＨＬＡ−ＤＲ７（Ｍ
ＨＣ）拘束性ミコバクテリア特異的ＣＤ４+Ｔ細胞株ＤＧ．１の増殖性応答。
パネルｃ：有機溶媒抽出後のミコバクテリア画分に対するＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞
クローンＤＧ．ＳＦ６８の増殖性応答。
図１０：ミコバクテリア抗原調製物でパルス化したＣ１Ｒ
細胞のＣＤ１トランスフェクタントに対するＤＮ１細胞株の細胞溶解性応答。Ｃ
１Ｒリンパ芽球様細胞のＣＤ１ｂまたはＣＤ１ｃトランスフェクタント［ポーセ
リら（Porcelli，S.，et al.）、Nature 341:447-450(1989)］を、有機溶媒（＋
）で抽出した後のミコバクテリア抗原調製物または培地単独（−）のいずれかで
パルス化した標準細胞溶解性測定の標的として使用した。ＣＤ１ｂでトランスフ
ェクトしたＣ１Ｒ細胞のＴ細胞株ＤＮ１による認識は抗原でパルス化した場合に
限って起きる。ＣＤ１ｃ+標的に対しては抗原特異的認識は起きない。
図１１：６，６−トレハロースジミコレート（コード因子）の化学構造。
図１２（パネルａ−ｃ）：ＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞株ＤＮ１によって認識される
ミコバクテリア抗原はミコール酸である。
パネルａ：ＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞株ＤＮ１の増殖性応答は逆相Ｃ１８ＨＰＬＣ
上のミコール酸ピークと相関する。ＣＤ１ｂ拘束性抗原をすべて含んでいる精製
ミコバクテリアアシル鎖画分を逆相ＨＰＬＣを用いるクロマトグラフィーに付し
、生じた画分がＴ細胞株ＤＮ１による増殖性応答を刺激する能力を測定した。パ
ネルの上段は溶出物の２５４オングストロームにおける吸光度スペクトル（光学
密度単位ＯＤ、ｘ１０-4で表わす）（実線）ならびに対応する溶出勾配の塩化メ
チレン濃度（破線）を示す。２分と６分の間に溶出する大きな吸光度ピークは誘
導剤として使用した遊離の臭化ブロモフ
ェナシルである。パネルの下段は、それぞれの１分間画分に対するＴ細胞株ＤＮ
１の増殖性応答を示す。ＣＤ１ｂ拘束性抗原応答はミコール酸と相関する広いピ
ークとして見られる。
パネルｂ：鹸化６，６−トレハロースジミコレート（コード因子）はＣＤ１ｂ
拘束性Ｔ細胞株ＤＮ１による増殖性応答を刺激するが、鹸化トレハロースジベヘ
ネートは刺激しない。Ｍ．ツベルクロシス（Ｈ３７Ｒａ）またはＭ．カンサシイ
のいずれかから精製されたトレハロースジミコレートの鹸化によってミコール酸
ができた。トレハロースジベヘネート（合成コード因子）も同じやり方で処理し
た。抗原濃度はｘ軸上にコード因子１ｍｌあたりのμｇで示した。
パネルｃ：Ｍ．ツベルクロシス（Ｈ３７Ｒａ）から精製したトレハロースジミ
コレート（Ｈ３７Ｒａ）を逆相ＨＰＬＣで分析すると、ミコール酸ピークに対応
する画分によるＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞株ＤＮ１の刺激が起きる。Ｍ．ツベルクロ
シスの鹸化トレハロースジミコレートをパネルａに示した実験と同様のクロマト
グラフィーに付し、画分が細胞株ＤＮ１による増殖性応答を誘導する能力がある
かどうか調べた。パネルａからわかるように、生理活性は早期ミコール酸ピーク
と相関する。
図１３：Ｍ．ツベルクロシスのコード因子（Sigma社）から鹸化によって調製
したミコール酸でパルス化したＣ１Ｒ細胞のＣＤトランスフェクタントに対する
ＤＮ１Ｔ細胞株の細胞溶解性応答。Ｃ１Ｒリンパ芽球様細胞のＣＤ１ａ、ＣＤ１
ｂ、ＣＤ１ｃ、またはモックトランスフェクタントを、トレハロースジミコレー
ト（＋）から調製したミコール酸または培地のみ（−）でパルス化したものを細
胞溶解性測定の標的として使用した。結果は特異的溶解率（％）で示した。
図１４：ミコール酸は分裂促進性はないが、ＣＤ１ｂによって拘束されＴ細胞
株ＤＮ１によって認識される特異的抗原である。ミコバクテリアに対して特異的
な４つのＴ細胞株と別の２つのＴ細胞株について、全Ｍ．ツベルクロシス超音波
処理物、精製コード因子から調製したミコール酸調製物、またはＭ．ｔｂ超音波
処理物かコード因子からＨＰＬＣ精製したミコール酸のいずれかに対する応答能
力があるかどうかを調べた。３つの代表的なミコバクテリア特異的Ｔ細胞株の応
答を次のように示した。ＤＮ１（■）（ＤＮ、ＣＤ１ｂ拘束、α：βＴＣＲ+）
、ＤＧ．１（□）（ＣＤ４+、ＨＬＡ−ＤＲ７拘束、α：βＴＣＲ+）およびＤＮ
６（○）（ＤＮ、ＣＤ１ｃ拘束、α：βＴＣＲ+）。調べた６つのＴ細胞株のす
べてについて、ＨＬＡ−ＤＲ７陽性個体のＧＭ−ＣＳＦ処理およびＩＬ−４処理
（ＣＤ１+）ＰＢＭＣがＡＰＣであった。
上段パネル：Ｍ．ｔｂ（Ｈ３７Ｒａ、Sigma社）の全超音波処理物に対する３
つのミコバクテリア特異的Ｔ細胞株の増殖性応答。抗原濃度はｘ軸上にｃｐｍ
ｘ １０-３で示した。図に示した３つのＴ細胞株はいずれも全ミコバクテリア
超音波処理物に応答する。
中段パネル：Ｍ．ｔｂ超音波処理物から単離したＨＰＬＣ
精製ミコール酸に対する増殖性応答。ＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞株ＤＮ１だけが精製
ミコール酸に応答する。
下段パネル：精製Ｍ．ｔｂコード因子（Sigma社）から作成したＨＰＬＣ精製
ミコール酸に対する増殖性応答。ＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞株ＤＮ１だけが、コード
因子ミコール酸に応答して増殖する。同じ実験で調べた他の３つのＴ細胞株すな
わちＳＰ−Ｆ３［ロンカルロら（Roncarlo，M.G.，et al.）、J．Exp．Medicine 168
:2139-2152(1988)］（ＣＤ４+α：βＴＣＲ+、ＤＲ拘束、破傷風毒素特異的
）、ＣＰ．１．１５［モリタら（Morita，C.T.，et al.）、Eur．J．Immunol. 2 1:
2999-3007(1991)］（ＤＮ、Ｖγ２Ｖδ２ＴＣＲ+、ミコバクテリア特異的）、
およびＢＫ６［ポーセリ（Porcelli，S.）、Nature 341:447-450(1989)］（ＤＮ
、α：βＴＣＲ+、ＣＤ１ａに対して自己反応性）はここでは示さない。３つの
株すべてが精製ミコール酸に応答したわけではなく、２つが特異的抗原（破傷風
毒素−ＳＰ−Ｆ３、＜１ｋＤａＭ．ツベルクロシス調製物−ＣＰ．１．１５）に
対して応答して増殖した。ＢＫ６はＣＤ１ａに対して細胞溶解活性を示すが、調
べたどのタイプのＣＤ１ａ+ＡＰＣに対しても応答して増殖することができない
［ポーセリ（Porcelli，S.）、Nature 341:447-450(1989)］。
図１５：図に示したモノクローナル抗体がＴ細胞株２．１３．ＤＮ１（ＤＮ１
、上段パネル）および８．２３．ＤＮ１（ＤＮ２、下段パネル）の増殖性応答に
及ぼす影響。
図１６：Ｔ細胞株ＤＮ２に対するＭ．ツベルクロシス抗原
のＣＤ１ｃ拘束性提示。ベクター（モック、パネルａ）および図に示したＣＤ１
タンパク質をコードするＤＮＡ分子（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、およびＣＤ１ｃ）で
トランスフェクトしたＣＲ１細胞の細胞溶解測定の結果。トランスフェクトされ
た細胞はＭ．ツベルクロシスの存在下（黒塗り丸）または非存在下（白抜き丸）
で前培養した。
図１７：Ｔ細胞株ＤＮ６に対するＭ．ツベルクロシス抗原のＣＤ１ｃ拘束性提
示。ベクター（モック、パネルａ）および図に示したＣＤ１タンパク質をコード
するＤＮＡ分子（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、およびＣＤ１ｃ）でトランスフェクトし
たＣＲ１細胞の細胞溶解測定の結果。トランスフェクトされた細胞はＭ．ツベル
クロシスの存在下（黒塗り丸）または非存在下（白抜き丸）で前培養した。
図１８：有機溶媒による抗原抽出後の超音波処理物中のＭ．ツベルクロシス抗
原に対するＣＤ１ｃ拘束性細胞株ＤＮ６の増殖性応答。増殖はｙ軸上にｃｐｍ（3
Ｈチミジン取り込み量）単位で示した。ＡＰＣはＣＤ１発現単球であった。６
つの対数点における抗原力価を求め、代表的な対数点（抗原の１：３，７５０希
釈物）の結果を示した。バックグランドｃｐｍ（培地のみ対照から求めた）をす
べての値から差し引いた。
図１９：抗原の鹸化前後の超音波処理物中のＭ．ｔｂ抗原に対するＣＤ１ｃ拘
束性細胞株ＤＮ６の増殖性応答。増殖性応答をｙ軸上にｃｐｍ単位で示し、抗原
濃度（希釈倍率の逆数で示す）をｘ軸上に示した。Ｍ．ｔｂ（Ｈ３７Ｒａ株、Di
fco社）の１０ｍｇ相当量をＰＢＳ中で超音波処理し、そのまままたは鹸化して
から使用した。すべての抗原希釈液は５ｍｌ中の２００ｍｇ凍結乾燥菌体の標準
初期濃度に対して正規化した。
好適な態様の説明 用語
抗原：（１）動物における免疫応答を誘導するとともに、（２）その動物の免
疫系の１つ以上の抗原認識成分と特異的に相互作用を示す分子または組成物。
外来抗原：正常健康動物にとって内因性でない抗原。
自己免疫抗原：特定の自己免疫疾患における抗原であって、動物体内の正常内
因性分子または組成物である抗原。「自己抗原」および「自家抗原」と同義。
ＣＤ１により提示される抗原：ＣＤ１ファミリーのタンパク質の１メンバーに
よって結合され、ＣＤ１+ＡＰＣの表面上に表出される抗原。ＣＤ１により提示
される抗原は起源およびそれらを認識するＣＤ１ファミリーのメンバーによって
サイズと組成が異なる。本明細書で使用する場合、「ＣＤ１により提示される抗
原」という用語は、本明細書中で同定される抗原および本明細書に開示される手
順を用いて単離される抗原の両方または一方を含む。「ＣＤ１拘束性抗原」と同
義。「ＣＤ１結合抗原」とは、適当なＣＤ１分子に結合しているＣＤ１により提
示される抗原をいう。
ＣＤ１ファミリーのタンパク質：構造、免疫学的交差反応
性、および／または分布に基づき既知のＣＤ１分子と関連していることが確認さ
れるタンパク質の１群。ある特定のＣＤ１タンパク質を、ＣＤ１ファミリーのタ
ンパク質のメンバーということもできる。ＣＤ１ファミリーのタンパク質のメン
バーとしては、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ，ＣＤ１ｄ、およびＣＤ１ｅなど
が挙げられるが、これらに限定されない［ポーセリら（Porcelli，S.，et al.）
、Immun．Rev．120:137-183(1991)参照］。
ＣＤ１陽性細胞：ＣＤ１ファミリーのタンパク質の１つ以上のメンバーを発現
し、表出する細胞。「ＣＤ１+細胞」と同義。当該分野に熟練せる者であれば、
本明細書で説明する手順または当該分野において既知の手順を用いて、ある細胞
がＣＤ１ファミリーのタンパク質の１つ以上のメンバーを発現しているかどうか
を判定することができる［実施例１およびポーセリら（Porcelli，S.，et al.）
、Immun．Rev．120:137-183(1991)参照］。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）：タンパク質担体を介して表面上に抗原分子を表出し
、Ｔ細胞に対して抗原を提示する細胞。抗原結合タンパク質担体としては、ＭＨ
ＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、およびＣＤ１分子などが挙げられ、対
応するＡＰＣはＭＨＣＩ+ＡＰＣ、ＭＨＣＩＩ+ＡＰＣ、およびＣＤ１+ＡＰＣと
呼ばれる。
ＣＤ１拘束性Ｔ細胞：ＣＤ１に結合したＣＤ１により提示される抗原を認識し
うる成熟末梢血ＴＣＲ陽性（ＴＣＲ+）リンパ球。ＣＤ１拘束性Ｔ細胞の定義は
、ＣＤ１に結合した
ＣＤ１により提示される抗原と相互作用を示すＴ細胞サブセットに限定されてい
るので、その定義は当該分野で認められているＴ細胞の定義より狭い。本発明の
好ましいＣＤ１拘束性Ｔ細胞はＣＤ４−８−であることを特徴とする。
ＣＤ４-８-Ｔ細胞：ＣＤ４とＣＤ８を発現しない成熟末梢血ＴＣＲ+リンパ球
。「二重陰性Ｔ細胞」および「ＤＮＴ細胞」と同義。ＣＤ４-８-Ｔ細胞を同定す
る技術は当該分野において既知であり、たとえば実施例１および既報［パンチョ
ムーシーら（Panchomoorthy，G.，et al.）、J．Immuno. 147:3360-3369(1991)
］に記載されているようにしてフローサイトメトリーを用いて本発明に容易に使
用することができる。このような手順を用いて、ＤＮ１、ＤＮ２、およびＤＮ６
という３つのＣＤ４-８-Ｔ細胞株が単離されているが、これらについても本明細
書で説明する。ＤＮ６の方が良好な成長率を示すという点を除けばＤＮ２とＤＮ
６は同等であると思われる。
アジュバント：抗原とともに動物に導入されるとその抗原に対する免疫応答を
強化する分子または組成物。
遺伝子操作を受ける：遺伝子変化を導入する目的で人為的操作に付すこと。
試料：本明細書に開示する手順を用いて試験することができる溶液、乳剤、懸
濁液、または抽出物。試料は可溶性抽出物または有機抽出物であってもよいが、
これらに限定されない。実施例１と２にミコバクテリウム ツベルクロシスから
得られる様々なタイプの試料を示す。
接触：ある対象物を別の対象物の存在下でインキュベートする過程。したがっ
て、ある細胞を試料と接触させるということは、その細胞をその試料とともにイ
ンキュベートするということである。
分画：試料を、限定されないが、サイズ、電荷、溶解度、組成などの物理的ま
たは化学的性質に基づき、その成分を分離する条件または手順に付すこと。分画
手順の例としては、選択的沈殿、有機抽出、サイズ排除透析またはクロマトグラ
フィー、およびイオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限
定されない。
発現：ＤＮＡ分子の転写によって対応するｍＲＮＡ分子ができ、それがリボソ
ームおよび関連細胞性因子によってポリペプチドへと翻訳されることによって遺
伝子産物ができる過程。
表出（Displaying）：タンパク質またはタンパク質：抗原複合体が第２の細胞
または第２の細胞によって表出される分子にアクセスできる場である細胞最外面
にタンパク質またはタンパク質：抗原複合体が局在化される過程。タンパク質ま
たはタンパク質：抗原複合体は、細胞の最外面に存在しているという理由で第２
の細胞および／または第２の細胞によって表出される分子にアクセスできる場合
にその細胞によって表出されるという。
抗原のプロセシング：表出能を示すようにするために細胞性因子によって抗原
が処理される過程。
ＣＤ１ブロッキング剤：ＣＤ１により提示される抗原とＣ
Ｄ１の相互作用をブロックする能力またはＣＤ１：抗原複合体とそれらのコグネ
ートＴ細胞受容体の相互作用をブロックする能力を有する組成物または化合物。
ブロッキング剤としては、（１）ＣＤ１と結合する薬剤、（２）ＣＤ１により提
示される抗原と結合する薬剤、（３）ＣＤ１：抗原複合体と結合する薬剤、（４
）ＣＤ１：抗原複合体を認識するＴ細胞受容体と結合する薬剤、および（５）Ｃ
Ｄ１により提示される抗原のプロセシングを防止する薬剤などが挙げられる。
本発明は、ＣＤ１分子がＴ細胞に対する抗原を提示する機能を果たすという予
想外の新知見に基づくものである。本発明はさらに、顆粒球／マクロファージコ
ロニー剌激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）やインターロイキン−４（ＩＬ−４）などのサ
イトカインと接触させることによってＣＤ１を発現させるように誘導することで
Ｔ細胞に対する抗原提示の応答能を細胞にもたせることができるというという知
見に基づくものである。これら２つの知見に基づき、本発明は、試料がＣＤ１に
より提示される抗原を含んでいるかどうかを判定する様々な方法、ＣＤ１により
提示される抗原を単離精製する方法、本明細書に開示する方法によって単離され
た精製ＣＤ１により提示される抗原、ならびにＣＤ１により提示される抗原の同
定、単離、および精製に使用することができるＣＤ１陽性細胞を単離する方法を
開示するものである。
１つの態様においては、本発明は、試料がＣＤ１により提示される抗原を含ん
でいるかどうかを判定する方法を提供する。１つのそのような方法においては、
試料中のＣＤ１によ
り提示される抗原の存在は、まず試料をＣＤ１陽性細胞と接触させ、次いでその
第１段階の細胞をＴ細胞と接触させた後、Ｔ細胞の増殖を測定することによって
判定することができる。
Ｔ細胞のクラスをキャラクタライゼーションする方法およびＴ細胞の亜集団を
単離する方法が記載されている［ワイソッキとサトー（Wysocki，L.J.，and Sat
o，V.L.）、Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）75:2844:2848(1978)；ワシクとモ
リモト（Wasik，M.A.，and Morimoto，C.）J．Immunol. 144:3334-3340(1990)；
ハリマンら（Harriman，G.R.，et al.）、J．Immunol．145:4206-2414(1990)；
コウロバら（Koulova，L.，et al.）、J．Immunol．145:2035-2043(1990)；スチ
ュワードとメイル（Steward，M.，and Male，D.）、Chapter 25 in Immunology
，2d Ed.，Roitt，I.，et al.，eds.，Gower Medical Publishing，London，New
York，1989］。イン・ビトロでＴ細胞を培養する方法、およびＴ細胞をミエロ
ーマなどの非生育制限細胞と融合させて不死化させる方法が記載されている［パ
ウルら（Paul，W.E.，et al.）、Nature 294:697-699(1981)；ウイリアムス（Wi
lliams，N.）、Nature 296:605-606(1982)］。ＣＤ４-８-Ｔ細胞を同定する技術
は当該分野において既知であり、たとえば実施例１および既報［パンチョムーシ
ーら（Panchomoorthy- G.，et al.）、J．Immuno. 147:3360-3369(1991)］に記
載されているようにしてフローサイトメトリーを利用して、本発明に使用するこ
とができる。本発明は、Ｔ細胞集団を強化する
ことでＣＤ１により提示される抗原に対して反応性を示す単離Ｔ細胞クローンを
得る方法を提供することによって、これらの技術をさらに進歩せしめるものであ
る。Ｔ細胞の集団を細胞分裂させ、ＣＤ１+ＡＰＣおよびＣＤ１により提示され
る抗原の存在下の増殖の有無に基づき、またはＣＤ１により提示される抗原の存
在下でのＣＤ１分子を発現するトランスフェクト細胞に対する細胞傷害性活性の
有無に基づき、混合Ｔ細胞亜集団を単離する。このような手順を用いて、ＤＮ１
、ＤＮ２、およびＤＮ６という３つのＣＤ４-８-Ｔ細胞株を単離したが、これら
について本明細書で説明する。ＤＮ６の方が成長率が高いという点を除けば、Ｄ
Ｎ２とＤＮ６は同等であると思われる。
本発明はさらに、細胞上にＣＤ１発現を誘導する方法を提供する。１つのその
ような方法においては、細胞を１つ以上のサイトカインと接触させることによっ
てＣＤ１の発現を誘導することができる。好ましいＣＤ１誘導用サイトカインは
、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦとイ
ンターロイキン−４（ＩＬ−４）を組み合わせたもの、あるいはやインターロイ
キン−３（ＩＬ−３）である。実施例１は、１０％ウシ胎仔血清を加えたＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地中で単球をそれぞれ１００単位のＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４に６
０時間接触させることによって、ＣＤ１ファミリーの様々なメンバーを発現する
よう誘導することができることを開示している。当該分野に熟練せる者であれば
、本明細書で開示する方法と材料を用いて、接触工程がＣＤ
１発現の誘導に十分である場合に、接触時間、サイトカインのタイプと濃度、お
よび接触条件を変更して同様の結果を容易に得ることができる。
当該分野においてはＴ細胞増殖を判定するいくつかの手順が既知であり、上記
方法に使用することができる。当該分野に熟練せる者であれば、このような手順
を本発明における使用に適応させることが容易に可能である。実施例１で説明す
る１つのそのような手順では、液体シンチレーションおよび既報［モリタら（Mo
rita，C.T.，et al.）、Eur．J．Immunol．21:2999-3007(1991)］に記載の方法
によって3Ｈチミジンの取り込み率を測定する。
本発明はさらに、試料からＣＤ１により提示される抗原を単離する方法を提供
する。１つのそのような方法においては、試料をまず常法を用いて分画する。次
いで、上記で概説したようにして、試料の画分にＣＤ１により提示される抗原が
含まれているかどうかを調べる。実施例２と３は、クロロホルム：メタノールに
よる有機抽出とケイ酸クロマトグラフィーを用いてＭ．ツベルクロシス抽出物含
有試料を分画することでＣＤ１により提示される抗原を精製する分画手順につい
て説明している。
本発明はさらに、ＣＤ１により提示される抗原へのＣＤ１結合の特異性に基づ
きＣＤ１により提示される抗原を単離する方法を提供する。１つのそのような方
法においては、まずＣＤ１により提示される抗原を含有する試料を精製ＣＤ１ま
たはＣＤ１を発現し表出する細胞（「ＣＤ１+細胞」）と接
触させる。次いで、生じた抗原：ＣＤ１複合体または抗原：ＣＤ１+細胞複合体
を試料から分離する。この手順を用いて、精製された抗原：ＣＤ１複合体または
抗原ＣＤ１+細胞複合体が得られる。ＣＤ１により提示される抗原をさらに精製
するためには、いずれかのタイプの複合体をＣＤ１結合抗原のＣＤ１分子からの
遊離に適した条件下で処理する。
当該分野の熟練者であれば、上記２つの単離方法を組み合わせて別のＣＤ１に
より提示される抗原の単離方法を確立することができる。１つのそのような組み
合わせにおいては、ＣＤ１に対するＣＤ１により提示される抗原の結合に基づく
精製方法を実施する前に、上記のようにして試料を分画する。
本発明はさらに、本明細書に開示する手順を用いて同定または単離されるＣＤ
１により提示される抗原を提供する。ＭＨＣにより提示される抗原とは異なり、
ＣＤ１により提示される抗原はポリペプチドではない。実施例２〜４で詳細に説
明している１つのＣＤ１により提示される非ペプチド抗原は、Ｍ．ツベルクロシ
スから単離されたミコール酸を含んで成るリピド抗原である。実施例５と６で説
明している別のＣＤ１により提示される抗原はさらに複雑なリピドである。この
ような抗原はワクチンの処方と開発に用途がある。
本発明のＣＤ１により提示される抗原（本明細書に開示する手順を用いて同定
または単離されたもの）はワクチンとして容易に使用できる。当該分野の熟練者
であれば、通常の処方方法を用いてワクチン用単離ＣＤ１により提示される抗原
を処方することができる［Remington's Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，G
ennaro，A.R.，ed.，Mack，Easton，1990；The Pharmacologist Basis of Thera
peutics，7th Ed.，Gilman，A.G.，et al.，eds.，MacMillan，New York，1985
参照］。
本発明のＣＤ１により提示される抗原は、本明細書に開示するようにして広範
囲の純度に精製することができる。当該分野の熟練者にとっては、様々な精製方
法を用いて、目的に必要な程度まで精製されたＣＤ１により提示される抗原を得
る手段が公知である。
本発明のワクチンは、精製されたＣＤ１により提示される抗原を用いて処方す
ることができる。また、ＣＤ１結合抗原を用いて処方することもできる。ＣＤ１
拘束性抗原は抗原とＣＤ１の複合体としてＴ細胞に提示されるので、場合によっ
ては抗原：ＣＤ１複合体の使用によってさらに優れた免疫特性を得ることができ
る。
本発明はさらに、Ｔ細胞に対するＣＤ１拘束性抗原提示の阻害物質すなわちＣ
Ｄ１ブロッキング剤の測定方法を提供する。１つのそのような方法においては、
ＣＤ１ブロッキング剤を用いてＣＤ１拘束性抗原がＣＤ１に結合する能力をブロ
ックすることによってＣＤ１抗原の提示を阻害する。本明細書で使用する場合、
（１）ＣＤ１分子に対するＣＤ１により提示される抗原の結合または（２）コグ
ネートＴ細胞受容体へのＣＤ１：ＣＤ１により提示される抗原複合体の結合を低
下させる場合に、ＣＤ１ブロッキング剤が「ＣＤ１拘束性抗
原提示を阻害する」という。そのような結合を検出不可能なレベルまでブロック
しうるＣＤ１ブロッキング剤もあれば、そのような結合をわずかしか低下させな
いＣＤ１ブロッキング剤もある。ＣＤ１ブロッキング剤としては、（１）ＣＤ１
と結合する薬剤、（２）ＣＤ１により提示される抗原と結合する薬剤、（３）Ｃ
Ｄ１：抗原複合体と結合する薬剤、および（４）ＣＤ１：抗原複合体を認識する
Ｔ細胞受容体と結合する薬剤などが挙げられる。それぞれのブロッキング剤の具
体例としては、（１）ＣＤ１により提示される抗原と結合するＣＤ１分子の一部
分に結合してそれをブロックするポリクローナルまたはモノクローナル抗体、（
２）ＣＤ１と結合するＣＤ１により提示される抗原の一部分に結合してそれをブ
ロックするポリクローナルまたはモノクローナル抗体、（３）Ｔ細胞受容体のＣ
Ｄ１：抗原結合部分に由来する合成オリゴペプチドであって、無傷のＴ細胞受容
体によって結合されているＣＤ１：抗原複合体の一部分に結合してそれをブロッ
クするもの、および（４）精製ＣＤ１分子またはその合成誘導体に化学的に結合
させたＣＤ１により提示される抗原から成る合成化合物などが挙げられる。
ＣＤ１拘束性抗原の抗原提示を阻害する別の方法においては、抗原：ＣＤ１複
合体とＴ細胞上のＴＣＲ分子との相互作用をブロックするＣＤ１ブロッキング剤
を用いることができる。提示段階を阻害することによって、特定のＴ細胞サブセ
ットの活性化を阻害することができる。ＴＣＲ分子由来ペプチドを用いて自己免
疫疾患（ＭＳ）患者を治療するパイロッ
ト試験が進行中である［オクセンベルグら（OKsenberg，J.R.，et al.）、J．Ne
urol．Sci．115(Suppl.):S29-S37(1993)］。本発明のＣＤ１により提示される抗
原を認識するＴ細胞によって表出されるＴＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ
分子は当該分野において既知の方法によって単離される［オクセンベルグら（Ok
senberg，J.R.，et al.）、Proc.Natl．Acad．Sci．（USA）86:988-992(1989)；
オクセンベルグら（Oksenberg，J.R.，et al.）、Nature 345:344-346(1990)お
よび正誤表、Nature 353:94(1991)；ウエマツら（Uematsu，Y.，et al.）、Proc
．Natl．Acad．Sci．（USA） 88:534-538（1991）；パンザラら（Panzara，M.A.
，et al．）、Biotechniques 12:728-735(1992)；ウエマツ（Uematsu，Y.）、Im
munogenet. 34:174-178(1991)］。ＤＮＡ配列をポリペプチド配列に変換し、Ｔ
ＣＲポリペプチドの抗原結合可変領域に対応するポリペプチド配列の一部を用い
て、ＡＰＣ上のＣＤ１：抗原複合体と結合し、それにより抗原提示を阻害する合
成オリゴペプチドを設計する。オリゴペプチドは常法［スチュワードとヤング（
Steward and Young）、Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Co.
，Rockland，Illinois，1985］に従い化学的に合成し、逆相高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）によって反応混合物から精製する。付加的にあるいは代替
的に、抗ＴＣＲ抗体および抗ＴＣＲ結合ペプチドを作成する方法もＭＨＣ提示に
関しては当該分野において公知であり、本明細書に開示するＣＤ１提示方式に容
易に適応させることができる［ストロミンジャ
ー（Strominger，J.L.）、Cell 57:895-898(1989)；デービスとブジョルクマン
（Davis，M.M.，and Bjorkman，P.J.）、Nature 334:395-404(1989)］ 。
当該分野の熟練者であれば、公知の抗体作成方法ならびに妥当なブロッキング
剤デザインを利用して、本発明のブロッキング剤を容易に得ることができる［ハ
ーローとレーン（Harlow，E.，and Lane，D.）、Antibodies：A Laboratory Man
ual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，1988；Synhtetic Pepti
des：Answers Guide，Freeman，W.H.，New York，1991；カスプルザク（Kasprza
k，A.A.）、Biochemistry 28:9230-9238(1989)］。付加的にあるいは代替的に、
分子量的に多様な分子のライブラリーをスクリーニングして、ＣＤ１ブロッキン
グ剤である個々のメンバーの分子を検出することができる。ＣＤ１介在Ｔ細胞増
殖性応答と細胞傷害性応答の両方または一方を阻害する能力に基づき、本明細書
に説明する材料と方法を用いて、有効なＣＤ１ブロッキング剤を同定することが
できる。
上記本発明の態様は、単独で、または互いに組み合わせるか、他の補足的方法
および／または組成物と組み合わせて、目的の用途に使用することができる。
当該分野に熟練せる者であれば、以下の実施例を参照することによって本発明
の実施手順と方法をさらに詳細に理解できるが、これらの実施例は本発明の範囲
および本発明に係る請求の範囲を制限するものではない。
実施例１：CD1bによる抗原提示 方法
流動血球計算は、下記のモノクロナール抗体（mAbs）を用いて既報に記載され
ているような（パンチャモオルシィー(Panchamoorthy，G.)ら、J．Immunology 1 47
:3360-3369(1991)）方法で実施された:P3（IgG1コントロール；パンチャモオ
ルシィー(Panchamoorthy，G.)ら、J．Immunology 147:3360-3369(1991)）、OKT6
（anti-CD1a；ラインハーッ（Reinherz，E.）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．（US
A） 77:1588-1592(1980)），4A7.6（anti-CD1b；オリーブ(Olive，D.)ら、Immun
ogenetics 20:253-264(1984)），10C3（anti-CD1c；マーチン（Martin，L.H）ら
、Proc．Natl．Acad．Sci．（USA） 84:9189-9193(1987)），W6/32（anti-HLA-A
,B,C；ブロドスキー(Brodsky，F.M.)およびパーハム（Parham，P.P.）J．Immuno
logy 128:129-135(1982)）,BMA031（anti-α：βTCR；ラニエル（Lanier，L.L.
）ら、in Leukocyte Typing III，McMichael，A.J.，ed.，pp．175-178、Oxford
University Press，1987），OKT4（anti-CD4；ラインハーツ（Reinherz，E.）
ら、Proc．Natl．Acad Sci．（USA）77:1588-1592(1980)），OKT8（anti-CD8α
：ラインハーツ（Reinherz，E.）ら、Proc．Natl．Acad，Sci．（USA） 77:1588
-1592(1980)）および2ST8-5H7（anti-CD8β；シューエ（Shiue，L.）ら、J．Exp
．Med. 168:1993-2005（1988））。
単球を正常なドナーの濃縮白血球からプラスティック接着
により単離した（アネゴン(Anegon，I.)ら、J．Immunology 147:3973-3980(1991
)，そして0.53 mM EDTAを含む燐酸緩衝食塩水（PBS）（PBS/EDTA）の中で37℃下
でインキュベートすることにより分離した。接着細胞は通常＞90%CD14+およびMH
C classII+であり、又表面染色によりCD1a，CD1bおよびCD1cに対して陰性である
ことが判った（データは示されていない）。CD1発現を誘発する為に、単球を１
ｍｌ当たり100単位のGM-CSFおよびIL-4(Genetics Research Institute)をそれぞ
れ含む１０％仔牛胎児血清（FCS，Hyclone）を含むRPMI-1640(Gibco)の中で６０
時間培養した。細胞は上記のようにPBS/EDTAを用いて採取した。
Ｔ細胞株DN1は、無作為に選ばれた正常ドナーの抹消血液から確立した。非接
着性の単核球細胞をmAbs OKT4およびOKT8およびうさぎの補体を用いて処理し、
そして残りの生存細胞をOKT4 mAb(anti-CD4)、OKT8 mAb（anti-CD8α）およびan
ti-TCRδ１mAb(ポルセリー(Porcelli,S.)ら、Immun.Rev.120:137-183(1991))の
混合物の中に１時間懸濁し、洗浄し、そしてやぎの抗マウス免疫グロブリンと結
合した磁気ビーズ(Dynal)を用い４℃で３０分間インキュベートした。CD4+およ
び／又はCD8+および／又はδ-TCR細胞の磁気分離および除去の後に、残りのCD4-
8-α：βTCR+細胞を１ｍｌ当たり 100単位のGM-CSFおよびIL-4をそれぞれ含む
完全媒地（10%FCSおよびモリタ（Morita，C.T.）ら、により以前に記載された追
加の添加物(Eur．J．Immun. 21:2999-3007(1991)を含むRPM-1640)の中の同数の
自己由来単球と共に培
養された。脱湿された桿菌(H37Ra株(Dlfco))をPBSの中で超音波処理し、ついで
超音波被処理物を透明化する（即ち、不溶物質を除去する為に）為に100,000ｇ
で遠心分離することにより作られたＭ．ツベルクロシス可溶性抽出物が加えられ
て10μg/ｍｌのバクテリアタンパク質濃度にされた。超音波処理のプロセス中に
CHAPS又はオクチルグルコシドのような界面活性剤を加えることにより、Ｍ.tb.
の可溶水性超音波被処理体から可溶性の更に高い抗原性（即ちＴ細胞増殖性の）
活性が得られる；上記の界面活性剤を加えることがなければ超音波処理後の清澄
化中に抗原性の活性の90から95%が失われる。培養物は、１０日から１４日毎に
完全媒地中のＭ．ツベルクロシスおよび異種CD1+単球（上述のようにCD1を発現
するように誘発された）を用いて改めて剌載を与え、そして３日から４日毎に１
nM組換えインターロイキン-2（IL-2）を含む新鮮な媒地を補給した。
Ｔ細胞増殖応答測定はそれぞれ５×104のＴ細胞および96ウエルの平底マイク
ロタイタープレート（Linbro）の中の完全媒質200μｌの中の照射された(5,000
Rad)APCsを用いて３重に実施された。Ｍ．ツベルクロシスに関して記載されたと
同様に、M.レプレ（leprae）およびエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）可
溶性抽出物が作られた。モノクロナール抗体を精製免疫グロブリンとして25μg/
ｍｌの最終濃度で加えた。培養物を、１μCi3H−チミジン（6.7Ci/mmol，New En
gland Nuclear）による６時間のパルスの後５日目（mAbブロッキングの場合には
３日目）に採取し、そし
て3Hの取り込みを液体シンチレーションカウンティングにより測定した。結果は
、３つの培養物の3H−チミジン取り込みの１分当たりの平均カウント(CPM)とし
て表した。取り出された単球又は全抹消血液の単核球細胞(PBMCs)は、上述のよ
うに組換えGM-CSFおよび組換えIL-4により或はIFNγ 100単位／ｍｌを用いて６
０時間処理した後、それらをＴ細胞と組み合わせて増殖測定に使用された。Ｔ細
胞クローンDN1.C7は、限界希釈培養する際にフィトヘマグルチニン（PHA）剌激
によりDN1から誘導され、そして上述のようにPHA刺激およびIL-2を用いて増殖せ
しめられた４つの広汎に特性化されたサブクローンの代表である。（Morita，C.
T.）ら、Eur．J．Immun. 21:2999-3007(1991)。DN1株から誘導されたすべてのク
ローンは、図1bに示されたもの、即ち、α：βTCR発現、CD4の発現不能およびCD
8の最小発現又は発現不能とは識別出来ぬ表面表現型を持っていた。
Ｔ細胞の細胞溶解性応答測定は下記のように行われた。C1R細胞のトランスフ
ェクションの方法および51Cr放出による特異的細胞溶解活性の測定方法は既に報
告されている。それぞれ、バルク（Balk，S.P.）ら、Science 253:1411-1415(19
91)およびモリタ（Morita，C.T.）ら、Eur．J．Immun.21:2999-3007(1991)。CD1
aを示す細胞を溶解させるα：βTCR細胞障害性Ｔ細胞クローンであるBK6は上述
のようなSLEを持つ患者の血液から単離され(ポルセリー(Porcelli，S.)ら、Natu
re 341:447-450(1989))、そしてCD1cを示す細胞を溶解させるα：βTCRを細胞障
害性Ｔ細胞クローンである
クローン3C8は同じ方法を用いて正常なドナーの血液から単離された。トランス
フェクトされた細胞は、51Crで標識されそして約50:1のエフエクター（Ｔ細胞）
対ターゲット （トランスフェクトされた細胞）比で細胞溶解測定にターゲット
細胞として用いられた。51Cr放出の測定法および比溶解パーセンテージを計算す
る方法は記載されている。ブレンネル(Brenner，M.B.)ら、Nature 325:689-694
（1987）。
Ｔ２細胞の安定なトランスフェクタントを、C1R細胞に対して記載された方法
を用いて作られた。バルク （Balk，S．P.）ら、Science 253:1411-1415(1991)
。グルタルアルデヒド固定およびクロロキン実験の為のAPCsは、上述のようにGM
-CSF処理されたPBMCsおよびIL-4処理されたPBMCsであり、そしてAPCsのグルタル
アデヒド固定およびクロロキン処理は公表された方法によって行った。チェスナ
ット（Chesnut，R．W.）ら、J．Immun．129:2382-2388(1982)；ロンカルオロ（R
oncarolo，M．G.）ら、J．Immunol．147:781-787(1991)。CD4+Ｔ細胞株DG.1は、
滑液リンパ球を自己由来のEBV-形質転換されたＢ細胞およびＭ．ツベルクロシス
の精製タンパク質誘導体（PPD，Statens Serum Institute;データは示されてい
ない）で反復剌激されたHLA-DR7+リューマチ性間節炎患者由来のものであった。
増殖性応答測定は上述のように行われたが、但しこの場合にはウエル毎に２×105
のAPCsが加えられ、そして3H−チミジンの取り込みは３日後に測定された。結果
CD1分子による抗原提示を検出するために、通常は有意なレベルのこれらの
分子を発現せぬ末梢血液単球についてCD1a，CD1bおよびCD1cの発現を誘発する各
種の組替えサイトカインの能力を評価した。Leukocyte Typing IV，Knapp，W.，
ed.，Oxford University Press，Oxford，U.K.，pp．251-269，1989。CD1a，CD1
bおよびCD1cの高レベルが、顆粒球／単球コロニー剌激因子（GM-CSF）とインタ
ーロイキン-4（IL-4）を組合わせて培養された際の単球において一貫して観察さ
れた(図1a)。上記の代わりに、GM-CSFを単独で使用することが出来るが、この場
合にはGM-CSFと IL-4の組合わせの場合と比較してCD1発現の得られたレベルは
幾らか低い。インターロイキン-3（IL-3）も又単独又は他のサイトカインとの組
合わせで用いることが出来る。サイトカインなしで培養された単球又はインター
フェロン−γと共に培養された単球は、有意のレベルではCD1a，CD1b又はCD1cを
発現しなかった（データは示されない）。
単球は有効な抗原提示細胞（APCs）であるから、我々はCD1+単球は、外因性抗
原に対するCD1拘束性Ｔ細胞応答を剌激するのではないかと考えた。今日まで同
定された大抵のＣＤ１特異的Ｔ細胞はダブルネガティブ（DN;CD4-8-）表現型（
ポルセリー（Porcelli，S.）ら、Nature 341:447-450(1989)；ファウレ(Faure，
F.)ら、Eur．J. Immun.20:703-706（1990））であるから、我々はこの細胞の集
合に注目し、そしてα：βTCR+CD4-8-Ｔ細胞の末梢血液をＭ．ツベル
クロシスの可溶性抽出物および異種ＣＤ１+単球の可溶性抽出物で反復剌激する
ことによりＴ細胞株を作り出した（図１ｂ）。
得られたＴ細胞株（DN1と称される）の機能を調べると、これらのＴ細胞はＭ
．ツベルクロシスからおよび密接に関連を持つM．レプレ桿菌由来の抗原に対し
ては特異的増殖性応答を示したが、しかしE．coli由来の抗原や破傷風毒素のよ
うな関係のない細菌性抗原には該応答を示さなかった(図2a)。これらの応答はGM
-CSFおよびIL-4(図2b)により予め処理されている単球に依存しており、そして多
形性MHC決定基により拘束されることはなかった(図2c)。このMHC拘束性の欠如は
、非MHC分子による抗原提示上の拘束性と一致した。CD1分子がＭ．ツベルクロシ
ス抗原提示に必要であるか否かを決定する為に、CD1分子又はMHC分子に特異的な
モノクロナール抗体(mAbs)のＭ．ツベルクロシスにより誘発されるＴ細胞株DN1
および代表的なサブクローン、DN1．C7の増殖に対する効果を測定した。anti-CD
1b mAbはＭ．ツベルクロシスにより誘発される増殖性応答の有意な遮断を示すに
過ぎず、又anti-CD1a mAb又はCD1c mAb又はMHCクラスＩ又はクラスII分子の単形
性決定基に対するmAbを使用しては一貫性のある効果は認められなかった(図2d)
。
Ｂ細胞トランスフェクタントは α：βTCR CD4-8-細胞溶解性Ｔ細胞活性に対
する有効なターゲットである。Ｂリンパ芽球様細胞株C1R（ゼンモール(Zenmour
，J.)ら、J.Immun．148:1941-1948(1992)）を用いることにより、同等
のレベルでCD1a，CD1b又はCD1cを発現し機能する安定なトランスフェクタントが
作り出され、そして細胞溶解性測定に於いてＭ．ツベルクロシスを提示するそれ
らの能力がテストされた。CD1bをコードするDNA配列を用いてトランスフェクト
され、かつ側定前にＭ．ツベルクロシスと共にインキュベートされたC1R細胞の
みが、α：βTCR DNＴ細胞株DN1およびそのサブクローンDN1．C7により溶解され
た（図4aおよびb）。このCD1b拘束性応答の特異性はＭ．ツベルクロシス抗原に
暴露されることなく分裂誘発因子剌激により誘導された２つのコントロールCD4-
8-α：βTCR+Ｔ細胞クローン、BK6および3C8を用いて確認された。既報の報告は
BK6および3C8はそれぞれCD1aおよびCD1cを発現するターゲット細胞株を溶解する
ことを実証している（データは示されない）。この開示の行われる以前に記載さ
れているすべての他のCD1反応性Ｔ細胞クローンに関しては（ポルセリー（Porce
lli，S.）ら、Nature 341:447-450(1989)；ファウレ(Faure，F.)ら、Eur．J．I
mmun. 20:703-706 (1990)；バルク（Balk，S.P.）ら、Science 253:1411-1415(1
991)）、これらのクローンは自己反応的であると考えられ、外因性の抗原の存在
せぬ場合には自己の非多形性CD1リガンドを認識する。予想される通り、クロー
ンBK6および3C8はそれぞれCD1a又はCD1cを発現するC1Rトランスフェクタントの
みを溶解した。そしてこの溶解は、ターゲット細胞をＭ．ツベルクロシスと予め
インキュベートすることによって有意な影響を受けなかった（図4cおよびd）。
既報の実験により実証されたMHC拘束性の欠如から、MHCにコードされた抗原提
示分子は、ＤＮ１株に対するＭ．ツベルクロシス抗原のCD1b拘束性提示には関与
していないと主張された。この仮説を更に厳密に裏付けるものとして、両MHC位
置に広汎な染色体の欠失を与えた結果、MHCクラスII分子の発現が完全に欠如し
ているＴ２細胞株のCD1bトランスフェクタントが形成された。サルター(Salter
，R.D.)ら、Immunogenetics 21:235:246 (1985)；エルリッヒ（Erlich，H.）ら
、Hum．Immun．16:205-219（1986）。MHCによりリンクされたトランスポータ遺
伝子TAP-1およびTAP-2（パーハム（Parham，P.）Nature 357:193-194（1992）の
中でレビューされている）も又Ｔ２から欠落することにより、MHCクラスＩ分子
の発現と機能に欠陥をもたらす。ホスケン（Hosken，N.A.）およびビーバン（Be
van，M.）Science 248:367-370（1990)；ウェイ(Wei，M.)およびクレスウエル（
Cresswell，P.)Nature 356:443-446（1992）。ところがCD1bがＴ２にトランスフ
ェクトされると、細胞表面上に他のトランスフェクトされたＢ細胞株に見られる
レベルと類似のレベルでCD1bを発現させ（データは示さない）、そしてＭ．ツベ
ルクロシスをDN1株に提示するターゲット細胞を生成させた（図５ａ）。
Ｔ細胞に対する外因性抗原の提示には一般に抗原提示細胞による複合タンパク
質抗原分子の取り込みおよび処理を必要とするが、この処理はAPC表面のアルデ
ハイド固定によりおよびクロロキンのような好リソソームアミンによりブロック
される。ツェグラー（Ziegler，H.K.）およびウナニュエ（Unanue，E.R.）Proc
．Natl．Acad．Sci．USA 79:175-179(1982)；チェスナット(Chesnut，R.W.)ら、
J．Immun．129:2382-2388(1982)。これらの基準により、Ｍ．ツベルクロシスのC
D1b拘束性提示も又抗原の取り込みおよび処理を必要としていることが明かとな
った。グルタルアルデヒドによるCD1b+APCsのゆるやかな固定は、それらのＭ．
ツベルクロシス溶解性抗原の存在下でのDN1株を剌激する能力を完全に消滅させ
たが、固定前にＭ．ツベルクロシスによりパルス処理された同じAPCsは、増殖性
の応答を剌激する能力を保持していた(図5b)。更にDN1株に対するＭ．ツベルク
ロシス抗原の提示は、クロロキンによりミコバクテリウム抗原のMHCクラスIIに
より媒介される提示の阻害の場合と事実上同一の投与量依存性を以って強く阻害
され(図5c)、CD1bおよびMHCクラスII拘束性応答のための抗原の処理には同様の
経路又は細胞内器官が関与することがあり、或は経路は一つ以上のクロロキン感
受性の細胞因子を共有することを示している。Ｔ２細胞は最近、それがDMAおよ
びDMB遺伝子を欠いている故に、MHCクラスII分子により提示される抗原の処理に
は欠陥を持つことが実証された（リバディー（Riberdy,J.M.）およびクレスウェ
ル（Cresswell，P.） J．Immun. 148:2586-2590（1992））ことは興味のあるこ
とである。モーリス（Morris，P.）ら、Nature 368:551-554(1994)；フライング
(Fling，S.P.)ら、Nature 368:554-558（1994）。この様に、CD1bをトランスフ
ェクトされたＴ２細胞は、DNIにＭ．ツベル
クロシスを提示し得るという我々の実験結果は、抗原処理におけるCD1bおよびMH
CクラスII分子の必要性はクロロキン感受性に関して類似しているものの、同じ
ではないことを示唆する。
幾人かの研究者達は、CD4およびCD8分子の両者の発現を欠くＴ細胞が古典的な
MHCクラスＩおよびIIの位置によりコードされるもの以外の細胞表面分子により
提示される抗原を認識することが出来るのではと考えた。ポルセリー（Porcelli
，S.）ら、Immun．Rev．120:137-183(1991)；ジャンウエイ（Janeway，C.A．Jr.
）ら、Immun．Today 6:73-76(1988)；ブルーストーン（Bluestone，J.A.）およ
びマチス（Matis，L.A.）J．Immun. 142:1785-1788（1989）。上記の結果は、CD
1ファミリの一つのメンバーであるCD1bがMHC非拘束性CD4-8-Ｔ細胞の外因性異種
抗原に対する特異的応答を拘束することができることを実証するものである。他
のCD1タンパク質と同様に、CD1ｂの重鎖はβ2-ミクログロブリンに非共有的に結
合し（オリーブ(Olive，D.)ら、Immunogenetics20:253-264(1984)）そして両MHC
クラスＩおよびII分子に対して限定されているが、しかし有意な配列の相同性を
示す。カラビィ（Calabi，F.）およびミルステーン（Milstein，C.）Nature 323
:540-543(1986);バルク（Balk，S.P.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:252-256
(1989)。CD1bのこれらの構造的な特徴は、抗原の認識における重要なその役割と
共に、CD1bがMHCにリンクされていない遺伝子上の位置によりコードされている
非多形性抗原提示分子であるという
結論を支持する。
これらの結果は正常な宿主を細菌性疾患から守る際のCD1拘束性Ｔ細胞の役割
の可能性を示す。上記の結果は、CD1とMHCクラスII分子との間の機能的平行性を
示唆する。何故ならば両者ともクロロキン感受性の経路を通じて処理された外因
性抗原の提示を両者は媒介し、又両者は自己反応性Ｔ細胞のTCRsに対するリガン
ドとして作用することも出来るからである。ポルセリー（Porcelli，S.）ら、Na
ture 341:447-450(1989)；グリムチャー(Glimcher，L.H.)およびシーバック（Sh
evach，E.M.）J．Exp．Med. 156:640-645（1982）。in vivoでのCD1分子の限定
された組織分布は更にMHCクラスIIファミリーとの類似性を明らかにする、何故
ならばランゲルハンス細胞、リンパ様のおよび多くの他の組織の中の樹状細胞、
８細胞および多分サイトカインにより活性化された単球を含むＴ細胞に対する抗
原提示に関与する細胞タイプ上で両ファミリーのメンバーの発現が顕著に認めら
れるからである。ポルセリー(Porcelli，S.)ら、Immun．Rev．120:137-183(1991
)。上記と異なり、本明細書の記載のCD1分子の構造的多形性欠如、それらの単球
に於けるユニークなサイトカイン調整およびCD1拘束性Ｔ細胞のCD4-8-表現型は
、CD1とMHCの抗原提示システムを識別する為の重要な差異である。これらの差異
は細胞を媒介させた免疫性に於けるCD1拘束性Ｔ細胞の明確な役割を指し示す。
実施例２：非ペプチド抗原はCD1bにより提示される 方法
CD1bにより提示された抗原は透析不能の巨大分子である（データは示さない）
。抗原性の高い（すなわちＴ細胞増殖性の）活性は、M．tb.の可溶性水性超音波
処理物から、超音波処理中にCHAPS又はオクチルグルコシドのような界面活性剤
を加えることにより、得ることが出来た（上記参照）。この結果はこの抗原が疎
水性であることを示唆する。
CD1により提示された抗原の化学的性質を明らかにする為に、ミコバクテリウ
ム抗原を非病原性のM．tb.株H37Ra(Difco)およびM．フォルツイツム(fortuitum)
（同様に抗原活性を含む急速に成長する株）から精製した。細菌は市販のもの(M
．tb．H37Ra，Difco)か又は培養され採取されたもの(M．フォルツイツム)であり
、超音波処理を行い逐次分画プロトコールを施し、そして生物学的活性を分析し
た。得られたすべての画分について、照射し、GM-CSF-処理およびIL-4-処理した
単球をAPCsとして用い、かつ６時間のパルス処理での3H-チミジンの取り込みを
測定することにより５日間の増殖測定中にDNT細胞株DN1を刺激するそれら画分の
能力をテストした（ポルセリー（Porcelli，S.）ら、Nature 360:593-597（1992
））。細胞壁、細胞膜並びに細胞原形質部分を公表されたプロトコールから採用
された方法を用いてM．tb．又はM．フォルツイツムの何れかから調製した。ハン
ター（Hunter，S.W.）ら、Journal of Biological Chemistry 265:14065-14068(
1990)。簡略に述べれば、細胞を凍結乾燥し、
PBS／オクチルグルコシドの中に再懸濁し、２０分間超音波処理を行い、そして
分画超遠心分離を施すことにより細胞ゾル、細胞膜および細胞壁の各画分を調製
した。細胞壁ペレットは分画スクロース勾配により更に精製した。３つの画分の
特徴的な構造上の特性は電子顕微鏡を用いてネガティブ染色により確認された。
DN1細胞株に対する生物的活性の大部分は細胞壁画分内に存在した（データは示
さない）。
CD1b拘束性抗原がタンパク質であるか否かを直接評価する為に、抗原の一連の
プロテアーゼ消化を実施した。限定されたアミノ酸特異性(キモトリプシン（疎
水性残基）、トリプシン（lys，arg）およびV-8(酸性))、又は広汎なアミノ酸認
識（ズブチリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ）を持つ各種のエンドペプチ
ダーゼを用い、M．tb.又はM．フォルツイツムの超音波処理物を消化し、ついで
Ｔ細胞増殖性応答を誘発する能力を測定した。コントロールとして、この研究室
で誘導されたミコバクテリウムPPD（精製されたタンパク質誘導体）の決定基を
認識するDR7拘束性の、CD4+Ｔ細胞クローンDG.1もテストした。SDS-PAGEによる
分析およびその後の銀染色はV8プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ
又はズブチリシンによる消化がミコバクテリウム抗原標品に含まれるタンパク質
を分解することを実証した（データは示さない）。結果
代表的なCD4+MHCクラスII拘束性Ｔ細胞株であるDG.1
により認識されるＭ．ツベルクロシス抗原は、V8プロテアーゼ、プロテイナーゼ
Ｋ、又はトリプシンによる処理により効力を失わされる（図６）。図６ に示す
ように、DG.1細胞はミコバクテリウムの超音波処理物の偽消化物に応じて強力に
増殖したが、キモトリプシンを除き他のすべてのプロテアーゼ処理は増殖性応答
を完全に停止した。
上記に反し、CD1bにより株DN1に提示されたＭ．ツベルクロシスおよびM.フォ
ルツイツム抗原はこれらの広域反応性プロテアーゼによって影響されることはな
い（それぞれ図７および図８）。CD1bにより提示されたミコバクテリウム抗原は
MHCクラスＩおよびII抗原提示分子により提示されるものとは基本的に異なる。M
HC分子はクラスＩに対して約8-9アミノ酸の又クラスIIに対して13-25アミノ酸の
ペプチド抗原と結合し、かつ提示することが充分確認されている。このCD1bによ
り提示された抗原はプロテアーゼに対し耐性を持つ巨大分子である為にペプチド
であるとは考えられない。この様にしてCD1システムはペプチド以外の外来性物
質をα：βTCR+Ｔ細胞に提示する最初の知られた抗原提示システムである。
実施例３：CD1bにより提示される抗原の精製 方法
M．フォルツイツムバクテリアを液体培養で定常期まで増殖させ、遠心分離に
より収菌し、スチーム（stream）オートク
レーブ（250℃，18psi）により滅菌し、そして凍結乾燥した。脱湿されたM．tb
．（Ｈ３７Ｒａ株、Difco）又はM．フォルツイツムバクテリアを燐酸緩衝食塩水
の中に懸濁し（５ｍＬPBS当たり200mgバクテリア）、そしてバクテリア懸濁液を
プローブソニケータで超音波処理することにより細胞を破砕した。得られた超音
波処理物は、ミコバクテリウムのリピドを定量的に有機相に抽出するFolchの２
相抽出系（クロロフォルム／メタノール／水）の有機溶媒で抽出した。ゴレン（
Goren，M.B.）およびブレンナン(Brennan，P.J.)ミコバクテリアリピド：Tuberc
ulosisにおける化学および生物学的活性、1979。この超音波処理物をガラス容器
の中で３倍容量のクロロフォルム：メタノール(2:1 v/v)溶液と混合し、この混
合物を室温で２４時間激しく撹拌した。混合物を800gの遠心分離により相分離し
、そして有機相を集めてガラス沸騰フラスコに移した。各画分を次にロータリー
エバポレーターにより乾燥し（有機相）或は凍結乾燥した（水性相および界面相
）。蒸発後、有機相はフラスコの表面上に蝋性の物質の薄膜を残した。Ｔ細胞増
殖測定においてテストされる材料を作る為に、各画分の分別部分に水を加え（最
初の超音波処理物中のバクテリアの200mg当たり20ｍＬ）続いて水浴ソニケータ
での超音波処理により各画分をリポソームとして再構成した。得られた粗懸濁液
を次に0.1nmフィルタメンブランを反復して強制的に通すことにより均一なサイ
ズのリポソーム懸濁液を作成した。あるいは、１０％仔牛胎児血清を含むＴ細胞
培地を乾燥画分に加え、追加的な処理を伴
うことなく超音波処理を施した。
上述のＭ．ツベルクロシスから抽出された物質をさらに精製するために、ヘキ
サンに溶かして珪酸のカラムにかけた。シリカカラム上で極性を増大させながら
有機溶剤で溶出することにより、リピドがその極性に基づいて分離された。燐脂
質のような極性の最も高いリピドはシリカカラムに最も強く結合する為に最後に
溶出したのに対し、グリコリピドは一般に結合が強くなく早い時点で溶出する。
トリグリセライド又はステロールのような中性脂質は結合が最も弱く、従って最
初に溶出する。
固相抽出（SPE）小型開放カラム（BakerBond，JT Baker）は多くのサンプルを
同時に処理することが出来る為に好まれた。シアン（CN）官能基と（共有的に）
”結合”されたシリカをベースとするカラムがM．tb.の有機抽出物の分別に用い
られた。バクテリアのクロロフォルム／メタノール抽出物の有機相を乾燥して、
ヘキサン中に再懸濁した。200μＬヘキサン中の脱湿バクテリアの5.3mg当量を0.
5グラムCN SPEカラムに負荷した。カラムをヘキサンにより、ついでヘキサン中
に25%(v/v)クロロフォルムを混入して洗浄した。次に生物活性画分をヘキサン中
の85%(v/v)クロロフォルムで溶出させ、生物活性を100％以上で回収した。クプケ
及びツォイグナー（Kupke and Zeugner）の方法により（クリスティエ（Christi
e，W.W.）Lipid Analysis，117頁、Pergamon Press，Oxford，U.K.，(1982)）、
シリカをベースとしたTLC プレート上での活性画分の分析によれば、リピドの
２
つの主要な種類のみが酢酸銅により可視化した（データは示されていない）。こ
れは遊離脂肪酸およびミコール酸に相当する。この結果は出発有機物質からの顕
著な精製の反映である。
増殖測定は２日目（DG．SF68）、３日目（DG.1）又は５日目（DN1）に採取さ
れた。DG．SF68はこの研究室において作り出されたvγ2Vδ2Ｔ細胞クローンであ
る(PNAS 印刷中、CM)。APCsはGM-CSFにより処理された単球およびIL-4により処
理された単球(DN1)又はPBMC(DR7+)(DG.1)であるか又は処理されぬPBMC(DG．SF68
)であった。細胞溶解測定は比溶解％として表され、そして上述のように実施さ
れた。ポルセリー（Porcelli，S.）ら、Nature 341:447-450（1989）。示された
データ（図９）は50:1のターゲットに対するエフェクタ比および１:20の希釈で
のＭ．ツベルクロシス抗原を用いている。結果
Ｍ．ツベルクロシスの関連の抗原はH37Ra株(Difco)の市販製剤から上述のよう
なクロロフォルムおよびメタノールの混合物中に抽出することにより単離される
。界面相は95%以上のタンパク質を含んでいるが、ミコバクテリウム抽出物のCD1
b拘束性抗原活性（即ちα：βTCR DN Ｔ細胞増殖性応答を誘導する能力）の100%
が有機相中に含まれている（図9a）。この事は関連バクテリア抗原の性質が非ペ
プチド性であるという当初の結論を強く支持するものである。これとは逆に
、DNγ：δ TCR+Ｔ細胞により認識される従来のMHCクラスIIに拘束性抗原は、水
性相と有機相の界面の相中に存在した(図9b)。しかし上記に反し、４つの独立し
た抗原製剤ではCD1b拘束性抗原は定量的に有機相の中に分配された。これらの相
のトランスフェクタント細胞溶解測定の結果により、CD1bにより提示された抗原
が有機相に存在することが確認された(図10)。
これらの条件下では、ミコバクテリウムのCD1により提示される抗原の活性の1
00%がCN SPEクロマトグラフィーの後に定量的に回収された。更に有機相抽出は
優れた精製ステップとして役立ち、そして有機相はその後のクロマトグラフィー
の為の出発物質として用いられた。上記と別の幾らかより一般的な後続のクロマ
トグラフィーのための抗原精製手順は、バクテリア全体又は超音波処理されたバ
クテリアを鹸化し、そしてヘキサンの酸性溶液で抽出することである。抗原を更
に精製することは上述のような珪酸クロマトグラフィーを用いて達成される。実施例４：ミコール酸はCD1bにより提示される抗原である 方法
上記の結果、並びに活性がCN修飾されたシリカHPLCカラム上で遊離脂肪酸アシ
ル鎖標品と共クロマトグラフされたことを示唆する予備データ（データは示され
ていない）から見れば、このCD1bにより提示される抗原はユニークなミコバ
クテリウムリピド、多分ミコール酸であると考えるのが妥当であろう。この点を
解明する為に、C18逆相カラムクロマトグラフィー上でミコール酸を分離するHPL
C法を使用して、ミコール酸が作られた。バッテラー（Butler，W.R.）ら、Journ
al of Clinical Microbiology 23:182-185(1986)；バッテラー(Butler，W.R.)ら
、Journal of Clinical Microbiology26:50-53(1988)；フロイド(Floyd，M.M.)
ら、Journal of Clinical Microbiology 30:1327-1330(1992)。逆相クロマトグ
ラフィーは主としてアシル鎖の長さ又は”炭素数”に基づいてアシル鎖を分離す
る。従って遊離脂肪酸と遥かに大きいミコール酸とを確実に分離することは比較
的容易である。
このHPLC法では先ずサンプルの鹸化が必要であり、続いてアシル鎖のカルボキ
シル末端に結合する紫外線(OD254)吸収性化合物であるｐ−ブロモフェナシルブ
ロミドで脂肪酸又はミコール酸の誘導体化を行う。予備実験においては我々はｐ
−フェナシルブロミドでバクテリアの画分を誘導体化するプロセスが生物活性を
破壊することを認めた。しかしCD1b拘束性抗原性活性は、その後メタノール性KO
Hによる鹸化により回復することが可能であった。このプロセスは、フェナシル
ブロミド基を切り離すことにより、アシル鎖のカルボキシル末端をフリーにする
ものである(HPLC上でOD254により検定されるように)。この結果は、CD1ポジティ
ブAPCsにより提示することの出来る形を実現するにはアシル鎖が切断されねばな
らぬこと、および／又は遊離のカルボキシル基がCD1b拘束性抗原の提示の為に不
可欠であることを示すもので
ある。これは抗原がアシル鎖を含むことの別の証拠である。
SPE CNカラムで精製された標品（実施例３）はC18クロマトグラフィーの為の
出発物質として用いられた。試料をメタノール性KOHで鹸化し、そして紫外線吸
収基であるブロモフェナシルブロミドを用いて誘導体化した。活性画分をC18カ
ラム(Alltech Nucleosil C185μm，25 cm×4.6mm)上、メタノール中メチレンク
ロライドの３０〜９０％の直線濃度勾配を用い50分間にわたり１ｍＬ／分の割合
で流した。コントロールとしてＣ90内部標準（Ribi）を用いて得られたクロマト
グラム（図12、パネルａ 、上部）は公表された結果と同等のパターンを示す。
フロイド(Floyd，M.M.)ら、Journal of Clinical Microbiology 30:1327-1330(1
992)。画分は10%FCSを含む完全培地中に再懸濁化し、そして最初の超音波処理物
容量に対する１:17希釈でテストした。結果
Ｔ細胞増殖性応答測定により測定された生物活性はミコール酸の領域内の早期
ピークと共に移行することが見い出された（図12a）。ミコール酸がCD1bにより
提示されることを確認する為に、ミコール酸の別の給源である精製されたコード
ファクタ（トレハロースジミコレート、図１１）をテストした。鹸化するとM．t
b．（Sigmaから）又はM．kansasii（Patrick Brennanから）から得られた精製さ
れたトレハロースジミコレートはＴ細胞株DN1の増殖を刺激した（図12b）。しか
し鹸化により遊離されるミコール酸を含まず、２つ
のＣ22脂肪酸鎖を含むコードファクタの合成誘導体である鹸化されたトレハロー
スジミコレートから作られた物質によっては刺激は達成できなかった。このこと
はトレハロース（サンプルの各々に存在する）でも脂肪酸でもなく、ミコール酸
がダブルネガティブα：βTCRＴ細胞株DN1に対してCD1bにより提示された抗原で
あることを充分に想定させる。次に鹸化されたSigmaコードファクタのHPLC分析
を実施し、再び生物活性が早期のミコール酸ピークに対応する画分に見出された
（図12c）。合わせると、上記のデータは、Ｔ細胞株DN1により認識されるCD1b拘
束性ミコバクテリウム抗原はミコール酸の一つの種類であることを示す。
ミコバクテリウムは極めて有効なアジュバントであることが知られている。ア
ルドビニィ(Aldovini,A.)およびヤング（Young，R.A.）Nature 351:479-482(199
1)。この場合に使用されているCD1bにより提示される抗原の一つ給源であるミコ
ール酸はトレハロースジミコレート（即ちミコバクテリウムのコードファクタ）
であり、これは抗体形成を増大せしめ(ベカイエルカンスト(Bekierkunst，A.)ら
、J．Bacteriol．100:95-102(1969)；ベカイエルカンストら、Infection and Im
munity 4:245-255(1971)；ベカイエルカンストら、Infection and Immunity 4:2
56-263(1971))そして細菌感染（パラント（Parant，M.）ら、Infect.Immun．20:
12-19（1978））および腫瘍（ベカイエルカンストら、Infection and Immunity 10:
1044-1050(1974)）に対する非特異的免疫を剌激することが実証された。
精製された抗原活性が真実の抗原を含み不特定の分裂誘発因子を含まぬことを
確かめる為に、我々は粗M．tb．標品並びにM．tb．および鹸化されたコードファ
クタからのHPLCにより精製されたミコール酸に対するＴ細胞増殖性応答の特異性
を調べた。M．tb.の超音波処理物の全体（図14、上部パネル）はMHCクラスII拘
束性CD4+α：βTCR+Ｔ細胞株DG.1により認識される抗原、並びにCD1b拘束性Ｔ細
胞株DN1およびCD1c拘束性Ｔ細胞株DN6により認識される抗原を含む（下の実施例
５を参照のこと）。しかしM．tb．（図14、中部パネル）から又は鹸化されたコ
ードファクタ（図14、下部パネル）からのHPLCにより精製されたミコール酸（図
14、下部パネル）はCD1b拘束性DN1Ｔ細胞によってのみ認識される抗原を含む。
この特異性も又トランスフェクタントの細胞溶解測定において実証されている(
図13)。
DN1のCD1b拘束性応答は抗-CD1b抗体によりブロックされたが、しかしMHCクラ
スＩ又はIIに対する抗体によっては影響を蒙らなかった（図15、上部パネル）。
実施例５：CD1cによる抗原提示
実施例１に於いて開示されたCD1bによる抗原の提示に加えCD1c分子も又抗原を
提示する。GM-CSFおよびIL-4（CD1発現を誘発する為に）およびＭ．ツベルクロ
シス抗原により処理された単球による反復剌激により誘導された別個のCD4-8-α
：βTCR+Ｔ細胞株を単離し、そしてDN2（8.23.
DN1とも呼ばれる）と命名された。DN2の増殖はCD1cに対するmAbsを与えることに
より完全に阻害されるが、しかしCD1bに対するmAbsによっては影響を受けない（
図１５、下部パネル）。細胞溶解測定によりこの結果は裏付けられる：ベクター
のみ又はCD1a、CD1b又はCD1cをコードするベクターでトランスフェクトされたC1
R細胞をＭ．ツベルクロシス超音波処理物の存在下または非存在下に予めインキ
ュベートし、ついで細胞溶解測定のターゲットとして用いた。CD1c+C1R細胞のみ
が認識される（図１６）；認識は超音波処理物との予備インキュベーションによ
り高められる。従ってCD1c分子はＭ．ツベルクロシス抗原をDN2Ｔ細胞に提示す
る。
GM-CSFおよびIL-4（CD1発現を誘発する為）およびＭ．ツベルクロシス抗原に
より処理された単球による反復刺激により誘発された第２CD1c拘束性CD4-8-α：
βTCR+Ｔ細胞株を単離し、DN6と名付けた。細胞溶解測定（図17）によれば、DN6
はM．tb．抗原の存在下でCD1c+細胞を溶解することが示される。
実施例６：CD1cにより提示される抗原の特性化
CD1cにより DN6Ｔ細胞に提示される抗原はミコール酸ではない（図14、中央
パネル）。しかしDN6により認識される抗原の化学特性化によれば、抗原は複合
リピドであることが判る。M．tb.の超音波処理物をクロロフォルム：メタノール
により抽出する時（実施例３に記載のように）抗原活性は実質的に界面相と有機
相の両者に見出される(図18)。有機相から回収される抗原はCN SPEカラムに結合
することができ、そして溶出される（実施例３に記載された如く）。これらの実
験により抗原は疎水性であり又クロマトグラフィーではリピドの性質を持つこと
が実証される。
しかしCD1b拘束性ミコバクテリウム抗原と異なり、追加実験の結果は、DN6に
より認識されCD1cにより提示される抗原が複合リピドであり、遊離アシル鎖では
ないことを示す。M．tb.の超音波処理物を鹸化すると、DN6の増殖性応答は消失
する(図20)。鹸化はアシル鎖を炭水化物バックボーンに接続するエステル結合を
切断するから、この結果はDN6Ｔ細胞により認識される抗原が遊離アシル鎖以外
の或る部分であるか又は追加的な部分であることを示唆している。鹸化は多分例
えばポリサッカライドバックボーン又は分岐点であるかもしれない追加的部分を
破壊し、又は除去するのであろう。従ってDN1Ｔ細胞株による遊離ミコール酸の
認識とは異なり、DN6Ｔ細胞株はより複合的なリピド構造を認識する。
Ｔ細胞株DN1およびDN6により認識されるCD1により提示される抗原は、Ｍ．ツ
ベルクロシスにユニークではないことは特筆に値する。寧ろDN1およびDN6により
認識されるCD1により提示される抗原は、今日テストされている多くのミコバク
テリウムの種に見られる抗原に対して交叉反応性を示す（M.フォルツイツム、M.
アビウム(avium))、M. ボービス(bovis)(BCG)およびM．レプレ(leprae)）。DN6
Ｔ細胞
によるCD1c拘束性の場合には、別の属であるがミコール酸を産生する近縁の属の
細菌であるコリネバクテリウム(Corynebacteria)において一つの抗原が認識され
る（データは示されず）。タカヤマ(Takayama，K.)およびクレシ（Qureshi，N.
）”Structure and Synthesis of Lipids”in The Mycobacteria:A Sourcebook
，Part A,キュービカ（Kubica，G.P.）およびウエイン(Wayne，L.G.)編、Marcel
Dekker，New York＆Basel，1984。この様にCD1により提示された抗原は少なく
とも幾つかの細菌リピド抗原を含む；自己免疫の場合にはCD1により提示される
抗原は内因性リピド抗原を含む。
実施例７：CD1により提示される抗原を含むワクチン
本開示以前には、リピドが潜在的に強力な特異的Ｔ細胞媒介免疫原性を持つこ
とは知られていなかった。本明細書に記載のCD1により提示されるリピド抗原は
ミコバクテリウム病原体に対するワクチンとして機能もするようにデザインされ
る組成の必須成分として用いることが出来る。CD1により提示される抗原を含む
ワクチンは注射により直接投与することが出来る。或は上記の代わりに胃腸管の
上皮に見られる細胞上のCD1の存在（ブレイチャー（Bleicher，P.A.）ら、Scien
ce 250:679-682(1990)）の故に、CD1により提示される抗原を含むワクチンの経
口投与がCD1より提示された抗原を含むワクチンを必要とする動物にかかるワク
チンを投与する為に用いることが出来る。
本発明のCD1により提示される抗原を含むワクチンは、既知の方法に従って処
方される。Remington's Pharmaceutical Sciences,第１８版、ゲンナロ(Gennaro
，A.R.)編、Mack，Easton，1990；The Pharmacologist Basis of Therapeutics,
第７版、ギルマン（Gilman，A.G.）ら編、MacMillian,New York，1985.この分野
の熟練者に知られている薬学的に許容されるリピド安定剤およびリピド可溶化剤
はその有効性を高める為にCD1により提示される抗原を含むワクチンに加えるこ
とが出来る。テング（Teng，N.）ら、PCT特許出願WO 91/01750号公報（1991年２
月21日）。ナンバーグ(Nunberg,J.H.)米国特許第4,789,702号（1988年12月６日
）。実施例８：CD1拘束性抗原提示を阻止する為の手段と方法
CD1抗原提示システムの開示は、CD1拘束性抗原提示を阻害する為の各種の手段
と方法を可能にする。CD1により提示される抗原の処理を阻害し、抗原のCD1分子
への結合を妨害し又はCD1：抗原複合体のTCR分子への結合を妨害する組成物があ
れば、抗原のCD1拘束性提示を阻害するであろう。かかる組成物は、CD1ブロッキ
ング物質と呼ばれるが、例えば自己免疫疾患において生じる好ましくないＴ細胞
媒介免疫をコントロールする為に有用である。オクセンバーグ（Oksenberg，J.R
.)ら、J．Neurol．Sci．115(Suppl.):S29-S37（1993）。
CD1ブロッキング物質は下記に限定されることはないが、（１）精製されたCD1
分子、又はその合成誘導体であってCD1に
より提示される抗原を結合し、かつAPCs上で表出され、CD1と抗原との相互作用
を防止することの出来るもの；（２）精製されたTCRポリペプチド又はその合成
誘導体であってCD1+APC上でCD1−抗原複合体に結合することが可能であり、かつ
複合体とＴ細胞受容体との相互作用を防止することの出来るもの；（３）化学的
に修飾されたCD1により提示される抗原を含む抗原拮抗体又はCD1により提示され
る抗原の合成誘導体；（４）精製されたCD1−抗原複合体又はその合成誘導体で
あってCD1+APC上でCD1−抗原複合体を認識するＴ細胞受容体に結合し、かつＴ細
胞受容体とCD1−抗原複合体との相互作用を阻止することの出来るもの；（５）C
D1分子と結合し、こうしてCD1分子とCD1により提示される抗原との相互作用を阻
止する抗体；（６）CD1:抗原複合体と結合し、これによりCD1：抗原複合体とそ
のコグネート(cognate)TCRとの相互作用を阻止するポリクロナール抗体又はモノ
クロナール抗体；（７）CD1により提示される抗原を認識するTCRと結合し、これ
によりTCRとそのコグネートCD1:抗原複合体との相互作用を阻止するポリクロナ
ール抗体又はモノクロナール抗体；および（８）CD1により提示される抗原が表
出される前に処理される経路中の不可欠なステップをブロックする組成物を含む
。
上記の実施例は下記の如きCD1ブロッキング剤の類例を含む。
タイプ(５)のCD1ブロッキング物質は、CD1b拘束性抗原提示を特異的に阻害す
る、CD1bに対するモノクロナール抗体WM
25（図15、上部パネル）およびCD1c拘束性抗原提示を特異的に阻害する、CD1cに
対するモノクロナール抗体10C3(図15、下部パネル)をその代表とする。タイプ(
６)又は(７)のCD1ブロッキング物質として作用する抗体を単離する為の本明細書
に記載の方法を熟練者は使用することが可能であり、又この分野の熟練者は治療
の目的で抗体を処方する方法を知っている。A Critical Analysis of Antibody
Therapy in Transplantation，バーリントン（Burlington，W.J.）編、CRCPress
，Boca Raton，1992。
タイプ(８)のCD1ブロッキング物質の代表的なものはクロロキン(図5c)であり
、これはCD1b拘束性抗原の処理の中の或るステップを阻害する。クロロキンの処
方および投与の方法はこの分野の熟練者には既知である。ウエブスター（Webste
r，L.T.）"Drugs Used in the Chemotherapy of Protozoal Infections,"in Goo
dman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics４１章及び４
２章、第８版、ギルマン（Gilman，A.G.）ら編、Pergamon Press，New York，19
90。クロロキンもMHC拘束性抗原提示を阻害するが、この分野の熟練者は本明細
書中に開示されている方法を用いてCD1拘束性抗原の処理を特異的に阻害する組
成物を特定しおよび／又は単離することが出来る。
タイプ(３)のブロッキング物質、即ち抗原拮抗物質は本発明の方法により単離
されるCD1拘束性抗原から誘導することが出来る。オリジナルペプチド抗原より
も低い親和性で結合するMHC拘束性ペプチド抗原の変種は、MHC拘束性抗原提示
に於ける成熟Ｔ細胞に対する拮抗物質として作用する。ライス（Wraith，D.C.）
ら、Cell 59:247-255(1989)；スミイレク（Smilek，D.E.）ら、Proc．Natl．Aca
d．Sci．（USA）88:9633-9637(1991)。同様にCD1により提示される抗原は本発明
の方法により単離され、かつ標準技法により化学的に修飾することにより非抗原
性又は弱抗原性のCD1により提示される抗原誘導体を作り出すことが出来る。例
えばp−ブロモフェナシルブロミドにより誘導体化されたミコール酸は非抗原性
である（実施例４）。抗原拮抗物質はCD1により提示される抗原誘導体として同
定される。これはオリジナルの、非修飾CD1により提示される抗原の存在する時
にのみ起きるＴ細胞増殖性応答又はCD1トランスフェクタント細胞溶解性応答を
阻害又は防止する（実施例１）。
タイプ(２)のブロッキング物質、即ち抗原：CD1複合体とＴ細胞上のTCR分子と
の相互作用をブロックするTCR誘導体はこの分野の熟練者により本開示に基づい
て作ることが出来る。CD1により提示される本発明の抗原を認識するＴ細胞株に
より表出されるTCRポリペプチドをコードするDNA分子は、この分野における既知
の方法に基づいて単離される。オスケンバーグ(Oskenberg，J.R.)ら、Proc．Nat
l．Acad.Sci.(USA)86:988-992(1989)；オクセンバーグ(Oksenberg，J.R.)ら、Na
ture 345:344-346（1990）及び修正版（and erratum）、Nature 353:94(1991)；
ウエマツ（Uematsu Y.）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）88:534-538(1991)
；パンザラ(Panzara，M.A.)ら、Biotechniques 12:728-735（1992
）；ウエマツ、Immunogenet．34:174-178（1991）。このDNA配列はポリペプチド
配列に変換され、そしてTCRポリペプチドの抗原結合可変領域に該当するポリペ
プチド配列の一部は、APCs上でCD1：抗原複合体と結合しこれにより抗原提示を
阻害する合成オリゴペプチドをデザインするのに用いられる。オリゴペプチドは
標準的手法に従って化学的に合成され（ステバルト及びヤン(Stewart and Young
)，Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Co.，Rockland，Illinoi
s，1985)そして逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により反応混合物から
精製される。自己免疫疾患、MS，を持つヒトの治療の最初の試みが、MHC拘束性
α：βTCR分子から誘導されたペプチドを用いて現在進行中である。オクセンバ
ーグ(Oksenberg，J.R.)ら、J．Neurol．Sci．115(Suppl.)：S29-S37(1993)。CD1
ブロッキング物質として機能するTCR−誘導ペプチドは、CD1により提示される抗
原の存在下で起きるＴ細胞増殖性応答又はCD1トランスフェクタント細胞溶解性
応答を阻害又は防止するTCR誘導ペプチドとして同定される（実施例１）。
本明細書に記載されたCD1により提示される抗原の測定は、分子ライブラリー
からCD1ブロッキング剤をスクリーニングするために用いることが出来る。分子
的に種々な組成を持つライブラリーは、化学的、生化学的および／又はバイオテ
クノロジー的な手段により作られる。この様なライブラリーの中には、合成ペプ
チドの組合わせライブラリー（combinatorial libraries）（ホウテン(Houghten
，R.A.)ら、BioTechn
iques 13:412-421（1992））および組換えDNAテクノロジーにより作られる融合
タンパク質、例えばファージ表出ライブラリーが含まれる。コイバンネン（Koiv
unen，E.）ら、J．Biol．Chem. 268:20205-20210（1993）。これらのライブラリ
ーは、本明細書に記載のDNT細胞増殖性応答および／又はCD1細胞溶解性応答を阻
害又は防止するメンバーの有無についてスクリーニングされる。CD1ブロッキン
グメンバーは、この分野での既知でしかも用いられたライブラリーのタイプに適
合した技法に基づいてライブラリーから単離される。ローマン（Lowman，H.B.）
ら、Biochemistry 30:10832-10838(1991)；ヘリシイア(Felicia，F.)ら、J．Mol
．Biol．22:301-310(1991)；ダンデカル（Dandekar，T.）ら、Neurochem．Int．7：
247-253（1985）；オーウェン(Owens，R.A.)ら、Biophys．Res．Commun．181
:402-408(1991)。
サンプル中からCD1ブロッキング物質を検出する為には、CD1により提示される
抗原に対する測定を２重に実施する。第１の（コントロール）測定は、実施例１
に記載の方法と実質的に同様に行われるＴ細胞増殖性又は細胞溶解性測定である
。第２の測定は次の点を除きあらゆる点で第１の測定と同一である：すなわち第
２の測定はCD1ブロッキング物質を含む可能性のあるサンプルを追加的に含む。
サンプル中のCD1ブロッキング物質の存在と第１の測定で測定されたよりも有意
に少ない第２の測定におけるＴ細胞増殖性応答又は細胞溶解性応答との間に相関
関係が認められる。
参照による挿入
本明細書中に引用されたすべての刊行物は、参照の形でその全文が本明細書の
中に挿入されている。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ブレナー，ミッシェル ビー.
アメリカ合衆国 マサチューセッツ
01770 シェルボーン，ピー．オー．ボッ
クス 497，グリーン レーン 49
(72)発明者 ベックマン，エバン
アメリカ合衆国 マサチューセッツ
02146 ブルックリン，キルシス ロード
８