CN107531787B

CN107531787B - 靶向cd1d的单域抗体

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Publication number: CN107531787B
Application number: CN201680007612.0A
Authority: CN
Inventors: 约翰内斯·耶勒·范德弗利特; 坦尼亚·丹妮丝·德格鲁伊杰; 亨德里克·马里纳斯·威廉·费尔霍伊尔; 蕾妮·科妮莉亚·格拉里达·德布鲁恩; 罗兰·拉姆里斯
Original assignee: Stichting VU VUmc
Current assignee: Rafah Medical Public Ltd
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2016-01-27
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2036-01-27
Also published as: KR20170128254A; JP2018508229A; US20240067726A1; JP7165701B2; US11591394B2; US20180142020A1; SG11201706128PA; WO2016122320A1; EA201791691A1; AU2016212777B2; CN114504645A; EP3250608A1; AU2016212777A1; CA2975078A1; KR102574729B1; US10501541B2; CN107531787A; AU2022200922A1; JP2020172550A; US20200115450A1

Abstract

本发明涉及复合物，具体涉及与非经典MHC蛋白CD1d特异性结合并调节CD1d介导的生物功能的多肽。本发明具体涉及包含至少一种单域抗体或由至少一种单域抗体组成的这样的复合物和多肽，其中至少一种单域抗体特异性结合CD1d。本发明还提供了使用这种复合物、多肽和/或单域抗体的方法和用途。

Description

靶向CD1D的单域抗体

技术领域

本发明总体上涉及免疫学领域，更具体地涉及与人CD1d结合的单域抗体领域，包括改变CD1d介导的生物学功能的抗体，所述CD1d介导的生物学功能包括例如CD1d限制性T细胞(包括自然杀伤T(NKT)细胞)的活化和调节表达CD1d的细胞的功能。例如，提供包含至少一种与CD1d结合的单域抗体的复合物(compound)、这种包含至少一种单域抗体的复合物的用途和包含这种复合物的(药物)组合物。

背景技术

CD1d是在各种人细胞(包括抗原呈递细胞(APC))表面上表达的CD1(分化群1)族糖蛋白(包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和CD1e)的成员之一。人CD1d由CD1D编码，也称为R3G1。展示CD1d的APC包括朗格汉斯细胞、(活化的)B细胞、树突细胞(例如在淋巴结中)和(活化的)血液单核细胞。CD1d也由各种其它细胞类型表达，例如在肝脏、胰腺、皮肤、肾脏、子宫、结膜、附睾、胸腺和扁桃体中(参见例如Canchis et al.(1992)Immunology 80:561-565)。

通过CD1d活化/刺激的细胞包括自然杀伤T细胞(NKT细胞)。NKT细胞是具有T细胞和自然杀伤细胞二者的特性的T细胞的异质组。NKT细胞是表达α/βT细胞受体(TCR)以及多种分子标记的T细胞的亚群，所述多种分子标记通常与NKT细胞相关。

1型NKT细胞或恒定型NKT细胞是最著名的NKT细胞组，其与常规αβT细胞的不同之处在于它们的T细胞受体在多样性(“恒定”)方面受到更大的限制。包括这些恒定型NKT细胞和其它CD1d限制性T细胞(2型NKT)在内的NKT细胞识别由APC上存在的CD1d分子呈递的(自身或外源的)脂质和糖脂。(脂质呈递)CD1d和TCR之间的相互作用触发细胞因子的释放，细胞因子包括Th1样细胞因子或Th2样细胞因子，如干扰素-γ，肿瘤坏死因子-α和白细胞介素如IL-4、IL-5和IL-13。

已经证实不同的脂质能结合CD1d分子，包括分支菌酸、二酰基甘油和鞘脂。α-半乳糖神经酰胺KRN7000是体外和体内NKT细胞活化中脂质结合CD1d的最佳研究配体。其它配体包括异环球三己糖基神经酰胺、(微生物衍生的)葡糖醛酰基神经酰胺、α-C-半乳糖神经酰胺、苏糖醇神经酰胺和各种(人和非人)糖脂，如溶血磷脂酰胆碱和溶血鞘磷脂蛋白(参见例如Fox et al(2009)PLOS Biology 7:10:e1000228)。

现已证明NKT细胞在调节自身免疫、过敏、抗微生物和抗肿瘤免疫应答中的重要作用(van der Vliet et al.(2004)Clinical Immunology 112(1):8-23)。在生理学上，NKT细胞可以通过依赖于环境的多种机制来增强或抑制包括抗肿瘤、自身免疫和抗病原体反应在内的免疫应答(Yue et al.(2010)The Journal of Immunology 184:268-276)，所述机理包括诱导多发性骨髓瘤细胞的细胞死亡。可能涉及NKT细胞的病症包括自身免疫性或炎性疾病，包括重症肌无力、牛皮癣、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬化、结肠炎、自身免疫性肝炎、动脉粥样硬化和哮喘。除了细胞因子释放之外，导致细胞溶解的NKT细胞效应子功能(如穿孔素释放和颗粒酶释放和细胞死亡)也可能与涉及NKT细胞的病症(例如癌症)有关。因此，调节CD1d介导的作用具有潜在的疗效。

一直需要能够尽可能特异性地结合CD1d和/或与CD1d相互作用的复合物，即同时在体外和体内最低限度地结合或不结合CD1家族的其它家族成员。特别需要这样的复合物，其结合和/或调节(活化或抑制)涉及CD1d的生物学功能，例如但不限于NKT细胞活化。这样的复合物可以例如在CD1d介导的功能起作用的各种疾病中显示益处。

发明内容

本发明提供了包含至少一种单域抗体的复合物。所述单域抗体与人CD1d结合。与人CD1d结合的单域抗体包含具有本文公开的氨基酸序列的CDR1、CDR3和CDR3区及其保守序列变体。

优选地，所述单域抗体具有本文公开的(例如表1中所示的)CDR1、CDR2和CDR3区域的组合。

更优选地，单域抗体具有选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

本发明的复合物可以是任何种类的复合物，例如一种复合体，只要与人CD1d结合的单域抗体包含在该复合物中即可。优选地，所述复合物是多肽。在某些实施方案中，复合物可以仅由与人CD1d结合的单域抗体组成。在其它实施方案中，复合物由与人CD1d结合的单域抗体和标记物组成。在其它实施方案中，复合物可以包含与人CD1d结合的单域抗体，所述单域抗体连接至药物活性剂和/或其它抗体。

还提供了本发明复合物在医疗中的用途和/或作为诊断剂的用途。

还提供了包含本文公开的复合物的药物组合物、核苷酸序列和宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本发明复合物的核苷酸序列。

附图说明

图1：所选择的纳米抗体各自的CD1d特异性。使用流式细胞术检测同种型对照mAb(IgG2b)、抗CD1d 51.1单克隆抗体、R2阴性对照VHH和各CD1d特异性VHH的结合。数据表明结合至CD1a、CD1b、CD1c和CD1d转染的肿瘤细胞系(n＝3)。

图2：通过CD1d特异性纳米抗体诱导moDC成熟和细胞因子产生。将未成熟的moDC与CD1d特异性纳米抗体一起培养。24小时后，收集上清液以检测细胞因子产生(ELISA)。72小时后，使用流式细胞术分析moDC的成熟标记物CD83的细胞表面表达。NC＝阴性对照，PC＝阳性对照，IgG2b＝同种型对照单克隆抗体，51.1＝抗CD1d 51.1单克隆抗体，LPS＝脂多糖，LPS-PMB＝具有多粘菌素B的脂多糖。数据表示平均值+SEM，n＝3。

图3：α-GalCer诱导的iNKT细胞活化的抑制。将CD1d转染的HeLa细胞与载体对照(veh)或α-GalCer一起脉冲处理(pulsed)过夜(所有其它条件)。洗涤后，将经载体或α-GalCer脉冲处理的HeLa-CD1d与IgG2b同种型对照单克隆抗体、抗CD1d 51.1单克隆抗体、阴性对照VHH R2或中和抗CD1d VHH(VHH 24(18-29c))培养2小时，之后添加iNKT细胞。24小时后，使用流式细胞术测定iNKT细胞活化(CD25表达)。数据表示3次实验的平均值+SEM。抗CD1d VHH优异地中和iNKT细胞活化。

图4：诱导iNKT细胞活化。将CD1d转染的C1R细胞与载体对照(veh)或α-GalCer一起脉冲处理过夜。洗涤后，将经载体或α-GalCer脉冲的C1R-CD1d在特异性抗CD1d VHH存在或不存在的条件下培养2小时，之后加入iNKT细胞。24小时后，使用流式细胞术测定iNKT细胞活化(CD25表达)。代表性的流式细胞术点图显示iNKT细胞被α-GalCer活化，但与抗CD1dVHH(VHH12(18-14b))共培养后更显著。数据来自使用多种表达CD1d的肿瘤细胞系的多个实验。

图5：抗CD1d纳米抗体诱导膜联蛋白V结合。将C1R细胞、CD1d转染的C1R细胞(左图)和MM.1s细胞和CD1d转染的MM.1s细胞(右图)与IgG2b同种型对照单克隆抗体、抗CD1d 51.1单克隆抗体、阴性对照VHH R2或CD1d特异性VHH(VHH19(19-23G))一起培养24小时。然后通过流式细胞术测定表明早期细胞凋亡的、结合膜联蛋白V的靶细胞的百分比。数据表示3次实验的平均值±SEM。

图6：使用板结合(platebound)β2m-人CD1d(±载体，α-GalCer和/或抗-CD1d VHH)诱导iNKT细胞活化。用由与β2m-hCD1d(负载有载体对照或α-GalCer)融合的抗EGFR VHH组成的双特异性构建体包被96孔板。在存在或不存在抗-CD1d VHH(VHH12)的情况下，将包被的板培养2小时，之后加入iNKT细胞。24小时后，使用流式细胞术测定iNKT细胞活化(CD25表达)。代表性流式细胞术点图显示iNKT细胞被负载有α-GalCer的β2m-hCD1d轻度活化，而与负载有α-GalCer的β2m-hCD1d和抗-CD1d VHH(VHH12(18-14b))共培养后重度活化。

图7：对CD1d-α-GalCer介导的iNKT细胞活化的剂量依赖性抑制。在iNKT与CD1d转染的HeLa细胞、抗CD1d单克隆抗体51.1(10μg/ml)、对照VHH(500nM)或抗-CD1d VHH(VHH24；500nM)共培养24h后，测定iNKT CD25表达、IFN-γ和TNF-α产生，其中所述CD1d转染的HeLa细胞被用载体对照(载体)或α-GalCer(所有其它条件)和培养基(载体和α-GC)一起进行脉冲处理。图形表示在iNKT细胞上的CD25表达(a)。抗CD1d VHH(●符号)和对照非抑制性但CD1d特异性VHH(

符号)对IFN-γ和TNF-α产生的浓度依赖性作用。◆表示负载有载体的对照的情况(b)。平均值+SD，n＝3，**p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。测试的VHH为VHH24。

图8：抗CD1d VHH12的剂量依赖性iNKT细胞活化。将CCRF-CEM(T-ALL，CD1d阳性；n＝4)和CD1d转染的MM.1s(多发性骨髓瘤；n＝3)细胞用载体对照或αGC一起脉冲处理，与抗CD1d VHH和对照一起孵育，并与iNKT共培养24小时，然后测定iNKT CD25表达。*p<0,05，**p<0,01，***p<0.001，****p<0.0001(与图4相比)。

图9：诱导iNKT细胞脱粒(左)和对CD1d+肿瘤细胞系的细胞毒性(右)。将CCRF-CEM细胞(CD1d阳性)与载体对照或αGC一起进行脉冲处理，与抗CD1d VHH和对照一起孵育，与iNKT(E:T比为1:2)共培养指定时间(6、12或18h)，并用CD107a(t＝4h)或膜联蛋白V和7-AAD染色以进行流式细胞术。N＝5；*p<0.05；***p<0.001。所示的抗CD1d VHH为VHH12。

图10：诱导iNKT细胞对CD1d+原代多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性。将来自MM患者的、解冻的原代骨髓样品与载体对照或αGC一起进行脉冲处理，或与抗CD1d VHH和对照孵育，然后与iNKT共培养指定时间(8和16小时)，之后测定存活MM细胞的百分比。所示的抗CD1d VHH为VHH12。

图11：由抗CD1d VHH12诱导iNKT细胞因子产生。为了检测细胞因子产生，将HeLa-CD1d与载体对照、OCH(α-半乳糖神经酰胺的鞘氨醇截短类似物(α-GC)；报道用于在iNKT细胞中诱导Th2细胞因子产生的糖脂)或αGC一起进行脉冲处理，与抗-CD1d VHH和对照一起孵育并与iNKT共培养24小时，然后分析上清液(通过流式微球分析(CBA)分析)。N＝4；*p<0.05；****p<0.0001。

具体实施方式

定义

在下面的描述和示例中，使用了许多术语。为了清楚一致的理解说明书和权利要求(包括这些术语的范围)，提供以下定义。除非本文另有定义，所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。

实施本发明方法中所用的常规技术的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。常规技术在分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域的实践是本领域技术人员所熟知的并且在手册中有论述。

在本文及其权利要求中，动词“包括”及其词形变化在其非限制性意义上用于指包括该动词后的项目，但不排除未具体提及的项目。其涵盖动词“基本上由...组成”以及“由...组成”。

如本文所用，单数形式“一个(a/an)”、“一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示对象，除非上下文另有明确规定。例如，使用“一个”复合物的方法包括使用多个该复合物(例如10个、100个、1000个、10,000个，10万个，数百万个或更多个分子)。

术语“比对”是指基于短或长段的相同或相似氨基酸的存在对两个或多个分子/复合物的氨基酸序列进行比较。比对氨基酸序列的几种方法是本领域已知的，下面将进一步解释。

“序列同一性”是核苷酸序列或氨基酸序列的同一性的量度。通常对序列进行比对以获得最高阶的匹配。“同一性”本身具有本领域公认的含义，可以通过公开的技术进行计算。通常用于确定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括但不限于在GUIDE TO HUGECOMPUTERS,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994以及Carillo,H.,andLipton,D.,SIAM J.Applied Math(1988)48:1073中公开的那些。确定同一性和相似性的方法可以编入计算机程序中。用于确定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于，GCS程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research(1984)12(1):387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.(1990)215:403)。本文公开的序列同一性通过计算相似氨基酸的百分比来确定(与参照序列相似的氨基酸的数目除以参照序列中的氨基酸的总数)，基本上如下文所述。

以与SEQ ID NO:1的参照氨基酸序列具有至少例如70％的“序列同一性”的氨基酸序列为例，该氨基酸序列与参照序列相同，除了相对于SEQ ID NO:1的参照氨基酸序列的每10个氨基酸，该多肽序列可以包含最多3个氨基酸的改变。因此，氨基酸序列相对于参照氨基酸序列的同一性百分比将基于参照氨基酸序列的全长计算。换句话说，为了获得与参照氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，参照序列中至多30％的氨基酸残基可被缺失或被其它氨基酸取代，或可以将占参照序列总氨基酸残基的至多30％的数量的氨基酸插入参照序列。参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基末端位置、羧基末端位置或那些末端位置之间的任何位置，以单独的方式散布在参照序列的残基之间或以一个或多个连续基团的方式散布在参照序列内。

术语“氨基酸序列”或“蛋白质”或“肽”是指由氨基酸链组成的分子，不涉及特定的作用模式、尺寸、3维结构或来源。因此，其“片段”或“部分”仍可被称为“氨基酸序列”或“蛋白质”或“肽”。“分离的氨基酸序列”用于指具有特定序列的氨基酸链，并且其不再处于其原始天然环境中，例如在体外或在重组细菌或人宿主细胞中。

每个免疫球蛋白分子具有可变结构域。免疫球蛋白分子的可变结构域被细分为高变(HV)区和框架(FR)区。相对于给定位置中最常见的氨基酸，HV区域在该位置具有高比例的不同氨基酸。高变区被称为互补决定区(CDR)。免疫球蛋白分子具有三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。四个框架区具有少得多的可变氨基酸序列，将CDR区域隔开。CDR区可以直接结合抗原，如CD1d。

描述

本发明总体上涉及包含与人CD1d结合的单域抗体的复合物。本发明人发现了与人CD1d结合的单域抗体及其抗原结合部分。

在第一方面，提供了包含至少一种与人CD1d结合的单域抗体的复合物，其中所述单域抗体包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含与SEQ ID NO:22具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:43具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

如前所述，CD1d(Entrez Gene ID 912；NCBI参照序列:NP_001757；Balk et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:252-256)在多种细胞中表达，包括慢性淋巴细胞性白血病患者的B细胞；肝细胞；树突细胞和肿瘤细胞，并且本文公开的单域抗体可以用于结合CD1d，例如但不限于与这些细胞中任何一种细胞上的CD1d结合或用于与表达CD1d的其它细胞上的CD1d结合或用于与未结合细胞的CD1d分子，未结合任何物质的CD1d分子或例如与载体、聚合物或其它蛋白连接或结合的CD1d分子结合。

包含与人CD1d结合的单域抗体的复合物可以是任何种类的复合物或复合体，只要其包含与CD1d结合的单域抗体即可。优选地，由于存在与人CD1d结合的单域抗体，本发明的复合物可以与人CD1d结合。

根据本发明的复合物还可以包含其它官能团或非官能团。例如，本发明的单域抗体可以连接到纳米颗粒、脂质体、病毒、标记物、另一种抗体或蛋白质结构(例如受体)上，或者可以与抗原、肽、药物、标记物或核酸融合。例如，复合物还可以包含磁珠以使其与表达CD1d的细胞分离。

CD1d单域抗体可以通过抗体的羧基或氨基末端连接，或者可以在除羧基或氨基末端以外的位点连接。与CD1d单域抗体的连接可以是直接连接(即没有任何中间序列)，或通过接头氨基酸序列、接头分子或化学键连接。例如，连接可以是物理和/或化学连接。

在一个实施方案中，所述复合物是双特异性抗体或多特异性抗体。在一个实施方案中，复合物是二价抗体或多价抗体。二价或多价可以使抗体以高亲合力结合多聚体抗原；双特异性或多特异性可以实现与两种抗原的交叉连接。

该复合物包含至少一种与人CD1d结合的单域抗体，其中单域抗体包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含与SEQ ID NO:22具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，且CDR2包含与SEQ ID NO:43具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

单域抗体(sdAb，也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(CDR)1(CDR1)、单个CDR2和单个CDR3。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。

单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。

像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。纳米抗体的分子量仅为约12-15kDa，比由两条重链和两条轻链组成的普通抗体的分子量(150-160kDa)小得多。

CDR1、CDR2和CDR3序列可以在物种间进行交换。例如，选自美洲驼免疫球蛋白分子的CDR序列可与人免疫球蛋白分子中的CDR序列交换，以获得具有得自美洲驼CDR序列的特异性的人免疫球蛋白分子。这可能是有利的，因为与原始的美洲驼框架序列相比，人序列对人类较少产生免疫原性。CDR序列的这种交换被称为人源化。

因此，根据本发明的免疫球蛋白分子可以具有人源免疫球蛋白序列或源自美洲驼的免疫球蛋白序列，并且CDR1、CDR2和CDR3序列被替换为本发明的CDR序列以使其与人CD1d结合。换句话说，本发明的复合物可以包含具有本文公开的CDR的人源化单域抗体。例如，单域抗体可以具有人框架序列和本文公开的CDR区。

包含在本发明的复合物中的单域抗体包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含与SEQ ID NO:22具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，且CDR2包含与SEQ IDNO:43具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22的序列对应于本文表1中以17-1E表示的单域抗体的CDR1序列。为了本发明的目的，单域抗体17-1E也可以称为1号VHH。单域抗体17-1E的序列显示为SEQ IDNO:1，并且除表1所示的CDR1、CDR2和CDR3的序列之外，其还包含框架序列。

SEQ ID NO:43序列对应于本文表1中以17-1E表示的单域抗体的CDR2的序列。

对于本文所述的所有单域抗体，例如，如表1中所列的单域抗体，CDR1之前的区域可以称为框架区(FW)1，CDR1和CDR2之间的区域可以称为FW2，CDR2和CDR3之间的区域可以称为FW3，CDR3之后的区域可以称为FW4。可以基于CDR1、CDR2和CDR3以及整个单域抗体的序列容易地确定各框架区FW1、FW2、FW3或FW4，并因此同样地被公开。

惊奇地发现，可以获得多种单域抗体，就各种单域抗体的CDR1和CDR2而言，所述多种单域抗体具有高的氨基酸序列同一性。所发现的单域抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列列于表1。例如，表1中以19-23G表示的单域抗体的VHH编号为19，并且具有如下序列的组合：对应于SEQ ID NO:37的CDR1序列、对应于SEQ ID NO:58的CDR2序列以及对应于SEQ ID NO:79的CDR3序列。包括该VHH的框架区的整个序列为SEQ ID NO:16。

然而，根据本发明，只要CDR1显示出与SEQ ID NO:22至少60％的序列同一性并且CDR2包含与SEQ ID NO:43具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列，单域抗体就可以包含CDR1、CDR2和CDR3的任何组合。例如，还考虑到单域抗体包含第一VHH(例如10号VHH)的如表1所示的CDR1和第二VHH(例如20号VHH)的如表1所示的CDR2。

换句话说，应当理解，基于本发明，本领域技术人员可以在不需要付出过度劳动的情况下提供本发明的复合物，其包含至少一种与人CD1d结合的单域抗体，其中单域抗体的CDR1包含与SEQ ID NO:22具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，并且单域抗体的CDR2包含与SEQ ID NO:43具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。例如，基于表1所示的各种CDR1和CDR2。

在优选的实施方案中，CDR1在其全长上显示出与SEQ ID NO:22至少60％的序列同一性。在优选实施方案中，CDR2在其全长上显示出与SEQ ID NO:43至少60％的序列同一性。优选地，CDR1在其全长上显示出与SEQ ID NO:22至少60％的序列同一性，并且CDR2在其全长上显示出与SEQ ID NO:43至少60％的序列同一性。优选地，CDR1和/或CDR2分别与SEQ IDNO:22和/或SEQ ID NO:43显示出至少65％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、99％的同一性。

还提供了包含至少一种与人CD1d结合的单域抗体的复合物，其中单域抗体包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，并且其中CDR1包含与SEQ ID NO:22具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:43具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且CDR3包含与SEQ ID NO:64具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；或者其中CDR1包含选自SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:42的氨基酸序列，CDR2包含选自SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，CDR3包含选自SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:84的氨基酸序列。

发现在所提供的可包含于本发明的复合物中的单域抗体中，存在如下一组序列：CDR1，其为与SEQ ID NO:22具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；CDR2，其为与SEQ IDNO:43具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；CDR3，其为与SEQ ID NO:64具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。单域抗体就各自的互补决定区而言具有高度的同一性。在优选实施方案中，CDR1在其全长上显示出与SEQ ID NO:22至少90％的序列同一性。在优选实施方案中，CDR2在其全长上显示出与SEQ ID NO:43至少80％的序列同一性。在优选实施方案中，CDR3在其全长上显示出与SEQ ID NO:64至少70％的序列同一性。优选地，CDR1在其全长上显示出与SEQ ID NO:22至少90％的序列同一性，CDR2在其全长上显示出与SEQ ID NO:43至少80％的序列同一性，并且CDR3在其全长上显示与SEQ ID NO:64至少70％的序列同一性。优选地，CDR1显示出与SEQ ID NO:22至少90％、92％、95％、97％、99％的同一性，CDR2显示出与SEQ ID NO:43至少80％、82％、85％、90％、92％、95％、97％、99％的同一性，CDR3显示出与SEQ ID NO:64至少70％、72％、75％、78％、80％、82％、85％、90％、92％、95％、97％、99％的同一性。

根据本发明，在优选的实施方案中，单域抗体可以包含CDR1、CDR2和CDR3的任何组合，只要满足以下条件即可：CDR1显示出与SEQ ID NO:22至少90％的序列同一性，CDR2包含与SEQ ID NO:43具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，CDR3包含与SEQ ID NO:64具有至少70％同一性的氨基酸序列。例如，也可以预期单域抗体包含表1所示的第一VHH(例如10号VHH；SEQ ID NO:31)的CDR1和表1所示的第二VHH(例如20号VHH；SEQ ID NO:59)的CDR2，和表1所示的第一VHH或第二VHH或第三VHH(例如21号VHH；SEQ ID NO:81)的CDR3。

换句话说，应当理解，基于本发明，在优选的实施方案中，本领域技术人员可以在不需付出过度劳动的情况下提供本发明的复合物，其包含至少一种单域抗体，所述单域抗体通过组合不同的CDR1、CDR2和CDR3结合人CD1d，其中单域抗体的CDR1包含与SEQ ID NO:22具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，单域抗体的CDR2包含与SEQ ID NO:43具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，单域抗体的CDR3包含与SEQ ID NO:64具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。例如，基于表1所示的各种CDR1、CDR2和CDR3。

在另一个优选的实施方案中，提供了包含至少一种与人CD1d结合的单域抗体的复合物，其中所述单域抗体包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含选自SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:42的氨基酸序列，CDR2包含选自SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，CDR3包含选自SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:84的氨基酸序列。

优选地，提供了包含至少一种本文公开的、与人CD1d结合的、单域抗体的复合物，其中所述单域抗体具有如表1中组合列出的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列变体。

尽管可以理解本领域技术人员能够基于本文公开的各种CDR1、CDR2、CDR3以及提供的其它序列(包括各种框架序列和单域抗体的全长序列)提供各种单域抗体，但单域抗体优选具有如表1中组合显示的CDR1、CDR2和CDR3及其保守序列变体。换句话说，本发明的复合物包含单域抗体，其中优选地，CDR1、CDR2和CDR3为表1中所示的同一种VHH的CDR1、CDR2和CDR3。例如，单域抗体具有表1中所示的同一VHH(例如VHH1、VHH2、VHH3...VHH14、VHH18、VHH19...VHH24)的CDR1、CDR2和CDR3。发现组合示出的CDR1、CDR2和CDR3(即来自同一VHH)尤其有利于与CD1d结合。本领域技术人员会理解，表1中公开的CDR1、CDR2和CDR3组合的保守序列变体也包括在内。

实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。这种保守的氨基酸取代是本领域公知的，例如WO 04/037999、WO 00/46383、WO 01/09300和WO 04/037999中所述。保守取代优选是以下(a)-(e)组中的一个氨基酸被相同的(a)-(e)组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小的脂族、非极性或轻微极性的残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；(e)芳族残基：Phe、Tyr和Trp。

保守取代的优选实例如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代，Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代，Ser被Thr取代；Thr被Ser取代，Trp被Tyr取代；Tyr被Trp取代；和/或Phe被Val、Ile或Leu取代。

优选地，单域抗体具有如表1中组合列出的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，包括其保守序列变体。更优选地，单域抗体具有如表1中组合列出的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

还提供了本文和上文所公开的复合物，其中所述复合物包含选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:21的氨基酸序列或其保守序列变体。

换句话说，优选地，本发明复合物中包含的单域抗体包含选自SEQ ID NO:1-SEQID NO:21的氨基酸序列或如上所述的其保守序列变体，或由选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:21的氨基酸序列或如上所述的其保守序列变体组成。这些序列1-22表示具有表1中组合示出的CDR1、CDR2和CDR3的单域抗体，包括框架区。这些单域抗体和其CD1d结合特性在本文公开的实施例中详细描述。SEQ ID NO:1对应于1号VHH；SEQ ID NO:2对应于2号VHH；SEQ IDNO:3对应于3号VHH；SEQ ID NO:4对应于4号VHH；SEQ ID NO:5对应于5号VHH；SEQ ID NO:6对应于6号VHH；SEQ ID NO:7对应于7号VHH；SEQ ID NO:8对应于8号VHH；SEQ ID NO:9对应于9号VHH；SEQ ID NO:10对应于10号VHH；SEQ ID NO:11对应于11号VHH；SEQ ID NO:12对应于12号VHH；SEQ ID NO:13对应于13号VHH；SEQ ID NO:14对应于14号VHH；SEQ ID NO:15对应于18号VHH；SEQ ID NO:16对应于19号VHH；SEQ ID NO:17对应于20号VHH；SEQ ID NO:18对应于21号VHH；SEQ ID NO:19对应于22号VHH；SEQ ID NO:20对应于23号VHH；SEQ ID NO:21对应于表1所示的24号VHH。

还提供了包含在本发明复合物中的单域抗体，其在全长上与选自SEQ ID NO:1-21的序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列同一性(并且适用于本文公开的所有序列)。

尽管本发明复合物可以是包含与CD1d结合的单域抗体的任何种类的复合物，但在优选的实施方案中，复合物是与药物活性剂或标记物或标志物连接的多肽。例如，包含与CD1d结合的单域抗体的多肽可以连接到优选递送至表达CD1d的细胞的药物活性剂。另一个实例包括本发明的复合物，其包含CD1d结合单域抗体和抗原。这些复合物可用于例如基于树突细胞的疫苗中。活性剂可以连接到本发明的复合物，优选本发明的多肽，以使活性剂在其递送部位释放。另一个实例是其中本发明的复合物(例如本发明的多肽)包含标记物。标记物可以是例如荧光标记物或放射性标记物的形式，但不限于此。使得能够检测本发明复合物的存在或定位的任何种类的标记物可以适当地用于本发明的上下文中。在另一个实施方案中，复合物是多肽。

此外，在本发明的另一个优选实施方案中，提供了前述权利要求要求中任一项所述的复合物，其中所述复合物包含其它单域抗体，其中所述复合物包含标记物，其中药物活性剂连接至复合物，其中所述单域抗体是人源化的，其中所述复合物是双特异性或多特异性复合物(双特异性或多特异性可以实现两种抗原的交叉连接)，其中所述复合物是二价或多价复合物(二价或多价可以允许抗体以高亲和力结合多聚体抗原)，其中所述复合物与抗原、肽或核苷酸序列融合，其中所述复合物是脂质体、病毒和/或其中所述复合物是纳米颗粒。

还提供了本文公开的复合物，其中单域抗体结合人CD1d，但不结合人CD1a、人CD1b和/或人CD1c。换句话说，在特定用途中，本发明复合物包含特异性结合人CD1d而不结合人CD1a、CD1b和/或CD1c的单域抗体。本发明复合物优选确实与人CD1d结合而不与人CD1a、CD1b和/或CD1c结合。由SEQ ID NO:1-21表示的单域抗体是与人CD1d特异性结合的单域抗体的实例。本领域技术人员知道如何确定单域抗体是否对人CD1d具有特异性而不需要付出过度的劳动，这从实施例可以看出。

如本文所述，令人惊奇地发现，可以提供包含与CD1d结合的单域抗体的复合物，就CDR1、CDR2和/或CDR3序列而言，所述单域抗体具有高的氨基酸同一性。此外，发现可以提供包含本文所述的单域抗体的复合物，该复合物具有不同的功能特性和特征，这可以从实施例看出。因此，还提供了本文教导的复合物，其中所述复合物能够诱导树突细胞(优选单核细胞衍生的树突细胞)的成熟，优选地，其中单域抗体具有表1中组合列出的、VHH2或VHH5的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3或其保守序列变体，或者其中单域抗体为VHH2或VHH5或其保守序列变体；和/或该复合物能够抑制糖脂(例如α-半乳糖神经酰胺)诱导的CD1d限制性T细胞(例如恒定型自然杀伤T细胞)活化，优选地，其中单域抗体具有表1中组合列出的、VHH5或VHH24的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列变体，或者其中单域抗体为VHH5或VHH24或其保守序列变体；和/或该复合物能够诱导CD1d限制性T细胞(例如恒定型自然杀伤T细胞)的活化和/或刺激糖脂(例如α-半乳糖神经酰胺)诱导的CD1d限制性T细胞(例如恒定型自然杀伤T细胞)的活化，优选地，其中单域抗体具有表1中组合列出的、VHH12的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列变体，或者其中单域抗体为VHH12或保守序列变体；和/或该复合物能够在表达CD1d的细胞(优选表达CD1d的肿瘤)中诱导膜联蛋白V结合(例如，膜联蛋白V与接触此类复合物的细胞的结合；膜联蛋白V结合是早期细胞凋亡的标志物)和/或细胞凋亡，优选地，其中单域抗体具有表1中组合列出的、VHH3、VHH6、VHH8或VHH19的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列变体，或者其中单域抗体是VHH3或VHH6或VHH8或VHH19，或其保守序列变体。

发现具有如表1所示的CDR的单域抗体VHH2和VHH5显示出诱导树突细胞(优选单核细胞衍生的树突细胞)成熟的活性(参见实施例)，以及诱导细胞因子(以IL-12为例)产生的活性。包含这种单域抗体的复合物可用于，例如在癌症、疟疾和HIV的治疗中，在体外或体内诱导树突细胞成熟和细胞因子产生，例如IL-12的产生，和/或用作抗微生物剂或抗病毒剂。此外，如本文所讨论的，树突细胞上的CD1d触发可用于疫苗接种方法(参见例如Yue et al.(2010)J Immunol.184(1):268-76；Yue et al.(2005)Proc Natl Acad Sci U S A.102(33):11811-6；Teng et al.(2009)J Immunol.182(6):3366-71；或Teng et al.(2009)JImmunol.183(3):1911-20)。

此外，发现(参见实施例)可以提供本发明的复合物，其能够抑制糖脂(即可以由CD1d结合/呈递的所有糖脂，例如α-半乳糖神经酰胺)诱导的CD1d限制性T细胞(例如恒定型自然杀伤T细胞)的活化，优选地，其中单域抗体具有表1中组合列出的、VHH5或VHH24的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列变体。包含这种单域抗体的复合物可用于在体外或体内抑制糖脂(例如α-半乳糖神经酰胺)诱导的CD1d限制性T细胞(包括恒定型自然杀伤T细胞)的活化，例如用于研究和/或从慢性过度刺激中解救iNKT细胞(恒定型自然杀伤T细胞)或其它CD1d限制性T细胞亚群(参见例如Terabe et al.(2014)Cancer ImmunolImmunother.63(3):199-213)。

此外，还提供了本发明的复合物，其能够诱导包括恒定型自然杀伤T细胞在内的CD1d限制性T细胞的活化，和/或刺激糖脂(例如α-半乳糖神经酰胺)诱导的CD1d限制性T细胞(包括恒定型自然杀伤T细胞)的活化，优选地，其中单域抗体具有如表1中组合列出的VHH12的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列变体。包含这种单域抗体的复合物可用于在体内或体外在不存在外源性糖脂的条件下诱导恒定型自然杀伤T细胞的活化和/或刺激糖脂(包括α-半乳糖神经酰胺)诱导的恒定型自然杀伤T细胞的活化，例如在癌症的治疗中。iNKT细胞可以通过(1)直接溶解肿瘤细胞或通过(2)产生诸如IFN-γ的免疫调节细胞因子(例如与DC相互作用后)来发挥肿瘤细胞毒性，其中免疫调节细胞因子触发NK细胞、细胞毒性T细胞等的次级免疫效应子来发挥抗肿瘤作用。例如在Schneiders et al.(2011)Clin Immunol.140(2):130-41中对其进行了综述。

此外，还提供了本发明的复合物，其可结合靶向CD1d的构建体，该构建体使得可以在肿瘤位点靶向iNKT细胞并靶向活化iNKT细胞，优选地，其中单域抗体具有如表1中组合列出的VHH12的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列变体，优选地，其中单域抗体为VHH12。这是有用的并且是建立在Stirnemann K et al.J Clin Invest.2008Mar；118(3):994-1005提出的方法上的。

还提供了一种复合物，其能够在表达CD1d的细胞(优选表达CD1d的肿瘤)中诱导指示早期细胞凋亡的膜联蛋白V结合的增加，和/或诱导细胞凋亡，优选地，其中单域抗体具有表1中组合列出的、VHH3、VHH6、VHH8或VHH19的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列变体。包含这种单域抗体的复合物可用于，在体外或体内，在表达CD1d的细胞中诱导膜联蛋白V结合的增加和/或细胞凋亡，例如在癌症治疗中。该复合物可在例如CD1d+恶性肿瘤中使用，例如在多发性骨髓瘤中使用，其可导致细胞死亡(Blood.2009Mar 12；113(11):2498-507)。

还提供了如上所述的具有不同功能的包含单域抗体的此类复合物的用途，例如用于治疗病症，所述复合物的功能有利于该病症的治疗。

在另一个优选的实施方案中，提供了本文所述的复合物，其中所述复合物是单域抗体，优选地，其中所述复合物是具有表1中组合列出的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的单域抗体，或其保守序列变体，或其中单域抗体具有选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:21的氨基酸序列或其保守序列变体。

还提供了包含与人CD1d结合的抗体(优选单域抗体)的复合物，其中抗体(优选单域抗体)包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列与表1中所示的编号为1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12、13、14、18、19、20、21、22、23或24的VHH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别具有至少80％、90％、95％或100％氨基酸序列同一性。优选地，包含抗体(优选单域抗体)的复合物具有与表1中所示的编号为1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12、13、14、18、19、20、21、22、23或24的VHH的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其保守序列变体。优选地，该复合物是抗体，优选单链抗体。表1所示的每种特异性抗体或包含其中(即每个VHH编号中)组合显示的CDR1、CDR2、CDR3的抗体具有如实施例和说明书中所示的令人惊讶且非显而易见的特性。还提供了核酸或包含该核酸的载体，所述核酸编码本文公开的本发明的CDR1、CDR2和/或CDR3、抗体、单域抗体或复合物。

本领域技术人员将理解本文所述的复合物可以具有多种用途，包括作为研究工具、作为诊断工具、作为在体内或体外将例如药物递送至靶点(表达CD1d)的手段，以在体内或体外靶向两种或更多种不同的受体、分子和/或抗原(例如，其中该复合物是双特异性或多特异性的)，诸如此类。优选地，本文所述的复合物用于医学治疗或在体内用作诊断剂。可受益于本文公开的复合物的病症包括但不限于癌症、HIV、疟疾、哮喘、过敏、自身免疫性疾病、炎性肠病和移植物抗宿主疾病(GVHD)。因此，在另一个实施方案中，提供了包含本发明复合物的药物组合物，例如包含本文所述的单域抗体。本领域技术人员将理解，除了本文公开的复合物之外，药物组合物可以包含其它化合物，例如其它药物活性成分和/或赋形剂。

还提供了本文所述的复合物的用途，其中所述复合物用于体外或其中所述复合物用于体外诊断方法，例如用于检测从患者获得的样品中的CD1d表达，以及/或检测表达CD1d的细胞。

根据本发明的另一方面，提供了编码本文所述复合物的核苷酸序列。在该实施方案中，本发明复合物是多肽，例如该复合物是单域抗体，例如其序列选自SEQ ID NO:1-21及其保守序列变体。

本文公开的序列涉及氨基酸序列。因此，本领域技术人员能够提供编码氨基酸序列的核苷酸序列，因为这仅需要使用密码子表将氨基酸序列转化为核苷酸序列。

这样的核苷酸序列可用于将其可操作地连接到启动子序列、polyA信号等，以提供可用于抗体表达的基因构建体。包含核苷酸序列的这种基因构建体可以包含在宿主细胞中。还提供了包含本发明核苷酸序列的这种宿主细胞或非人生物体。

在优选的实施方案中，提供本文公开的核苷酸序列，其编码包含选自下述氨基酸序列的复合物：SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:42或保守序列变体，和/或编码包含选自下述氨基酸序列的复合物：SEQ ID NO:43-SEQ ID NO:63或其保守序列变体和/或编码包含选自下述氨基酸序列的复合物：SEQ ID NO:64-SEQ ID NO:84或其保守序列变体。

还提供了用于制备本文公开的复合物的方法，其中所述方法包括使包含本发明的核酸的宿主细胞表达复合物；并获得所述复合物。用于表达和获得的方法对于本领域技术人员是熟知的。

最后，还提供了包含CDR1和/或CDR2和/或CDR3的抗体，优选包含CDR1和CDR2，更优选包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有选自SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:42或其保守序列变体的氨基酸序列，CDR2具有选自SEQ ID NO:43-SEQ ID NO:63或其保守序列变体的氨基酸序列，CDR3具有选自SEQ ID NO:64-SEQ ID NO:84或其保守序列变体的氨基酸序列。优选地，互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与表1中所示的编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、18、19、20、21、22、23或24的VHH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％或100％氨基酸序列同一性。

抗体可以是任何类型的抗体，包括单域抗体、单链抗体、人源化抗体、4-链抗体或任何其它免疫球蛋白分子。抗体可以连接到其它官能团或非官能团，例如抗体可以是双特异性或多特异性抗体，和/或二价或多价抗体，如上文所公开的，可以包含融合至例如纳米颗粒、药物、肽、核酸等的标记物。抗体可以用于(人类)患者的治疗，例如用于治疗癌症，或可用于结合和检测人CD1d和/或表达人CD1d的细胞。

如果序列表中所提供的SEQ ID NO:22-84与表1所示的序列不同，则以表1所示的序列为准。

表1：本文所用的VHH编号、VHH参考号以及本发明各种CD1d抗体

的CDR1、CDR2和CDR3序列

表2：与17-1E相比时，CDR1、CDR2和CDR3中的序列同一性

实施例

免疫

如文献(Roovers RC et al.Cancer Immunol Immunother.2007；56:303-17)所述，对两只单独的美洲驼(Lama glama)进行免疫。简言之，在第0天、第14天、第28天和第35天皮下注射10⁸个稳定的CD1d转导的C1R细胞。为了构建噬菌体展示库，在第43天收集150ml血液。

CD1d特异性VHH的选择

为了构建噬菌体展示文库，从收集的150ml血液样品中分离出外周血淋巴细胞(PBL)。从分离的淋巴细胞中制备cDNA并将其用作模板以扩增编码仅有重链的抗体的可变结构域的基因。将PCR片段连接到pUR8100噬菌体载体中并转化到大肠杆菌细胞中。以这种方式，获得了两个VHH文库，随后将该文库在噬菌体上表达并用于进行筛选。为此，将两个文库的噬菌体在4℃下与CD1d转染的HeLa细胞一起孵育2小时。然后洗涤细胞，并将结合的噬菌体在4℃下用100mM HCl洗脱7分钟。然后用Tris-HCl中和移出的噬菌体，然后感染大肠杆菌。然后使用野生型C1R细胞在4℃下对选定的噬菌体进行2次反选择，时间1小时，之后将未结合的噬菌体与CD1d转染的C1R细胞一起孵育1小时。然后如上所述洗脱结合的噬菌体并感染大肠杆菌。将细菌铺板在含有2％葡萄糖/氨苄青霉素的琼脂板上以产生编码VHH DNA的单个菌落。将来自单个菌落的VHH DNA用Sfi1/BstEII消化酶消化，并克隆至质粒pMEK219中，其为来自pHen1的衍生物(Hoogenboom HR,et al.Nucleic Acids Res 1991；19:4133-4137)。加入HC-V盒以使得能够克隆Sfi1/BstEII，GenIII序列的C末端myc和6×HIS标签缺失。将pMEK219-VHH转化到大肠杆菌TG1细菌中。

使用过夜培养物接种添加有0.1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基。当达到所需的OD600时，加入IPTG至最终浓度1mM。使蛋白质产生进行2-5小时。所有培养物的生长在37℃下进行，同时以200-220rpm的转速剧烈摇动。通过在4℃下旋动培养15分钟来停止蛋白质产生。将细菌沉淀重悬于PBS中并在-80℃下冷冻至少1小时。将细菌悬浮液解冻，在4℃下轻微摇动1小时，并以4500rpm的转速旋转30分钟。使用上清液通过流式细胞术确认与CD1d转染的C1R细胞的结合。

所选VHH的CD1d特异性

使用表达CD1a、CD1b、CD1c或CD1d的C1R和K562细胞通过流式细胞术评价确认CD1d特异性结合。在96孔板中进行染色，所有孵育均在4℃于FACS缓冲液中进行30分钟。为了初步筛选与CD1d的结合，将细胞与含有抗CD1d VHH的25μl上清液一起孵育。洗涤后，将细胞与抗-myc标签抗体克隆4A6(Merck Millipore，马萨诸塞州，美国)一起孵育，最终稀释度1:500，洗涤并与山羊抗小鼠F(ab)2APC(Beckman Coulter，富勒顿，加州，美国)一起孵育，最终稀释度1:200。在最终洗涤步骤后，通过流式细胞术(FACSFortessa，BD Biosciences)评估与细胞的VHH结合。选择显示特异性结合的VHH。使用抗CD1d 51.1单克隆抗体(eBiosciences Inc，新泽西州，美国)作为阳性对照，使用对偶氮染料RR6具有特异性的纳米抗体作为阴性对照。在对抗CD1d VHH进行纯化(见下文)和测序后确认所选择的抗CD1dVHH与CD1d的结合。对于这些实验，以5μg/ml的浓度测试抗CD1d VHH和对照。代表性数据如图1所示。

指纹分析和测序

为了选择结构不同的对CD1d有特异性的VHH，所选VHH的DNA通过菌落PCR来扩增，用Hinf1消化，随后在2％琼脂糖凝胶上跑胶。基于消化模式，可以选择不同的单种生物群落(family)。然后对单独的单种生物群落进行测序(BaseClear B.V.，莱顿，荷兰)，以确认其为独特的菌落。

VHH产生和纯化

如上所述制备含有独特的抗CD1d VHH的上清液。为了纯化，随后将这些上清液与经洗涤的Talon树脂(Clontech，Mountain View，加州，美国)在室温下孵育1小时。Talon树脂用PBS洗涤3次，用15mM咪唑/PBS(pH7)洗涤一次，用150mM咪唑/PBS(pH7)洗脱。将洗脱的级分用PBS透析两次，时间为24小时。通过Nanodrop测量(Thermo Fisher ScientificInc.，威明顿，特拉华州，美国)测定纯化的VHH的浓度，通过考马斯染色的蛋白质凝胶证实纯度。

抗CD1d介导的moDC成熟

如文献(Lameris R.et al,Methods Mol Biol,2014；1139:155-65)所述，产生未成熟的单核细胞衍生的树突细胞(moDC)。在48孔板中于完全培养基(含有HEPES、10％FCS、0.05mMβ-巯基乙醇(β-ME)、100IU/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素和2.0mM L-谷氨酰胺)中在浓度为6×10⁴个细胞/孔的条件下、在5ng/ml rhIL-4、500U/ml rhGM-CSF、1000U/mlrhINF-γ、25μg/ml多粘菌素B和500nM抗CD1d VHH或阴性对照VHH的存在下培养moDC。使用LPS(200ng/ml)作为阳性对照。24小时后，取上清液用于分析IL-12和II-10的产生(未示出)(使用ELISA)。72小时后，收集细胞并使用流式细胞术(FACS Fortessa，BD Biosciences)分析moDC成熟标志物(PE标记的抗CD86(未显示)，APC标记的抗CD83，BD Biosciences)的表达。代表性数据如图2所示。

抗CD1d VHH抑制αGalCer诱导的iNKT活化

如文献(Lameris R.et al,Methods Mol Biol 2014；1139:155-65)所述，产生iNKT细胞。将5×10⁴个CD1d转染的HeLa细胞在含有10％FCS、0.05mMβ-ME、100IU/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、2.0mM的L-谷氨酰胺和400ng/ml的α-GalCer的DMEM中、在96孔板中于37℃培养过夜。然后洗涤HeLa-CD1d细胞，并在37℃下与500nM抗CD1d VHH(或阴性对照VHH)一起孵育2小时，之后加入5×10⁴个静息(CD25表达<25％)iNKT。24小时后，收集上清液用于检测IFN-γ和IL-4(使用ELISA)，同时收获iNKT细胞，将其重悬于FACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析，以检测对iNKT细胞活化的诱导(或抑制)(通过活化标志物CD25在iNKT细胞上的表达(FACS Fortessa，BD Biosciences)来评价)。至少VHH24的代表性结果见图3和图7。

抗CD1d VHH诱导iNKT细胞活化

如文献(Lameris R.et al,Methods Mol Biol 2014；1139:155-65)所述产生iNKT细胞。在存在或不存在100ng/mlα-GalCer或载体对照的情况下，将5×10⁴个CD1d转染的HeLa细胞、CD1d转染的C1R细胞和CD1d转染的MM.1s细胞在含有10％FCS、0.05mMβ-ME、100IU/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、2.0mM L-谷氨酰胺的DMEM中、在96孔板中于37℃下培养过夜。然后洗涤负载有α-GalCer或载体对照的CD1d转染细胞，并在37℃下与500nM抗CD1d VHH(或阴性对照VHH)一起孵育2小时，之后加入5×10⁴个静息(CD25表达<25％)iNKT细胞。24小时后，收集上清液用于检测IFN-γ和IL-4(使用ELISA)，同时收获iNKT细胞，使其重悬浮于FACS缓冲液中，并通过流式细胞术分析，以评价对iNKT细胞活化的诱导(通过活化标志物CD25在iNKT细胞上的表达(FACS Fortessa，BD Biosciences)来评价)，参见图4和图8(浓度依赖性)的代表性结果，显示了VHH12的数据。

对抗CD1d VHH诱导的膜联蛋白V结合的分析

将CD1d-C1R和CD1d-MM.1s(以及作为阴性对照的未转染的C1R和MM.1s细胞系)在37℃下在48孔板中以1×10⁵个细胞/孔培养，并与500nM抗CD1d VHH、阴性对照VHH或抗CD1d51.1单克隆抗体(作为阳性对照)一起孵育。24小时后，根据制造商的实验方案(VPSDiagnostics，Hoeven，荷兰)用膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)对细胞进行染色，并通过流式细胞术(FACS Fortessa，BD Biosciences)进行分析。实验结果如图5所示。

通过板结合CD1d和抗CD1d VHH诱导iNKT细胞活化

如文献(Lameris R.et al,Methods Mol Biol 2014；1139:155-65)所述产生iNKT细胞。将α-GalCer(1mM)或载体对照(100％DMSO)在80℃下加热2分钟，超声处理5分钟，随后在无菌的、温的(37℃)0.1％triton-X中稀释至浓度为100μM。接下来，以1:1的比例加入6μM由与β2m-人CD1d融合的抗EGFR VHH组成的双特异性构建体。α-GalCer和β2m-CD1d-抗EGFR构建体的终浓度分别为50μM和3μM。载体和α-GalCer在室温下摇动孵育过夜。用抗Flag单克隆抗体(Sigma，克隆M2；1:1000)包被96孔板，并在4℃孵育过夜。第二天，用PBS洗涤经抗Flag单克隆抗体包被的板两次，并在室温和摇动的条件下与PBS稀释的负载有α-GalCer或载体的构建体(构建体浓度为0.5μM)一起孵育2小时。用PBS洗涤后，将包被的板与250nM抗CD1d VHH在37℃孵育2小时，之后加入1×10⁵个静息(CD25表达<25％)iNKT细胞。24小时后，收获iNKT细胞，将其重悬于FACS缓冲液中，并通过流式细胞仪进行分析，以评价对iNKT细胞活化的诱导(通过活化标志物CD25在iNKT细胞上的表达(FACS Fortessa，BD Biosciences)来评价)。结果示于图6中。

VHH12

除了以上所示的数据之外，还使用VHH12进行了其它实验。实验结果如图9、图10和图11所示。图9示出了诱导iNKT细胞脱粒(左)和对CD1d+肿瘤细胞系的细胞毒性(右)。图10示出了诱导iNKT细胞对CD1d+原代多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性。图11示出了由抗CD1dVHH12诱导iNKT细胞的细胞因子产生。为了检测细胞因子产生，将HeLa-CD1d细胞与载体对照、OCH(α-半乳糖神经酰胺(α-GC)的鞘氨醇截短衍生物；报道用于在iNKT细胞中诱导Th2细胞因子产生的糖脂)或αGC一起脉冲处理，与抗-CD1d VHH和对照一起孵育，并与iNKT共培养24小时，然后(通过流式微球分析(CBA))分析上清液。N＝4；*p<0.05；****p<0.0001。所示的抗CD1d VHH为VHH12。

结果

各实验的代表性结果示于附图和附随的文字中；在以上本发明的上下文中讨论了其它实验数据。

序列表

<110> VUMC

<120> CD1d

<130> P32016NL00

<160> 84

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 1

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr

20 25 30

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val Ala

35 40 45

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Ser Leu Glu Asn

100 105 110

Met Asn Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 2

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr Thr

20 25 30

Met Gly Trp Cys Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Cys Val Ala

35 40 45

Val Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser

100 105 110

Met Asn Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val

35 40 45

Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu

100 105 110

Ser Met Arg Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Gly Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Val Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg

100 105 110

Thr Leu Glu Ser Met Lys Asp Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 5

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 5

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr

20 25 30

Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Gly Ser

35 40 45

Val Lys Gly Gly Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Pro Arg Thr

100 105 110

Ser Glu Ser Met Arg Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 6

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ala Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Tyr Tyr Ser Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Ile Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Asn Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg

100 105 110

Thr Leu Glu Ser Met Arg Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 7

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Val Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Thr Ile Arg Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser

35 40 45

Val Lys Gly Gly Ile Arg Trp Asp Asp Glu Asn Pro Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asn Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Phe Glu Arg Thr

100 105 110

Leu Glu Asn Met Arg Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 8

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Asp Gly Glu Ser Pro Ile Tyr Ala

50 55 60

Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg

100 105 110

Thr Leu Glu Ser Met Arg Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 9

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Val Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Tyr Leu Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg

100 105 110

Thr Leu Glu Ser Met Asn Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 10

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Ile Tyr Ala

50 55 60

Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg

100 105 110

Thr Leu Glu Ser Met Arg Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 11

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Ser Ile Asn Asn Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser

35 40 45

Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Tyr Tyr Ser Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ser Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr

100 105 110

Leu Glu Asn Met Arg Tyr Ser Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Met Phe Ser Asp Asn

20 25 30

Val Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Val Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Thr Ile Arg Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg His Thr Ile Pro Val Pro Ser Thr Pro Tyr Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Gly Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg

100 105 110

Thr Leu Glu Asn Met Asn Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 14

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 14

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr

20 25 30

Met Gly Gly Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser

35 40 45

Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr

100 105 110

Leu Glu Ser Met Asn Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 15

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Ile Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg

100 105 110

Thr Leu Glu Ser Met Lys Asp Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 16

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Thr Val Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser

35 40 45

Val Lys Gly Gly Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr

100 105 110

Leu Glu Ser Met Arg Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 17

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 17

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr

20 25 30

Met Gly Val Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser

35 40 45

Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Gly Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Gly Arg Thr

100 105 110

Leu Glu Ser Met Asn Asn Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 18

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Gly

35 40 45

Ser Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg

100 105 110

Ala Leu Glu Asn Met Asn Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 19

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Tyr Tyr Ser Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Ile Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Phe

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg

100 105 110

Thr Leu Glu Ser Met Arg Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 20

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Thr Ile Arg Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser

35 40 45

Val Lys Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Asn Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Leu Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Ser

100 105 110

Leu Glu Asn Met Asn Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 21

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn

20 25 30

Ala Met Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp

35 40 45

Ser Val Lys Gly Val Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala His Val Ala Gly Phe Asp Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 22

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 23

Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 24

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 25

Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 26

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 27

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ala

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 28

Val Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 29

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 30

Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 31

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 32

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 33

Gly Ser Met Phe Ser Asp Asn Val Met Gly

1 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 34

Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 35

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 36

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 37

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Thr

1 5 10

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 38

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 39

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 40

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 41

Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1

<400> 42

Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly

1 5 10

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 43

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 44

Val Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 45

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 45

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 46

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 47

Gly Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 48

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 48

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 49

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 49

Gly Ile Arg Trp Asp Asp Glu Asn Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 50

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 50

Ala Ile Arg Trp Asp Gly Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Glu Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 51

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 51

Val Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 52

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 52

Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Gly Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 53

Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 54

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 54

Thr Ile Arg Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 55

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 55

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 56

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 56

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 57

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 58

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 58

Gly Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 59

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 59

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 60

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 61

Ala Ile Arg Trp Ser Asp Glu Ser Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 62

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 62

Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 63

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2

<400> 63

Val Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 64

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 64

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Ser Leu Glu Asn Met

1 5 10 15

Asn Tyr Trp

<210> 65

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 65

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Asn Tyr Trp

<210> 66

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 66

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Arg Tyr Trp

<210> 67

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 67

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Lys Asp Trp

<210> 68

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 68

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Pro Arg Thr Ser Glu Ser Met

1 5 10 15

Arg Tyr Trp

<210> 69

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 69

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Arg Tyr Trp

<210> 70

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 70

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Phe Glu Arg Thr Leu Glu Asn Met

1 5 10 15

Arg Tyr Trp

<210> 71

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 71

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Arg Tyr Trp

<210> 72

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 72

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Asn Tyr Trp

<210> 73

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 73

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Arg Tyr Trp

<210> 74

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 74

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Asn Met

1 5 10 15

Arg Tyr Ser

<210> 75

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 75

Thr Ile Pro Val Pro Ser Thr Pro Tyr Asp Tyr Trp

1 5 10

<210> 76

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 76

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Asn Met

1 5 10 15

Asn Tyr Trp

<210> 77

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 77

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Asn Tyr Trp

<210> 78

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 78

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Lys Asp Trp

<210> 79

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 79

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Arg Tyr Trp

<210> 80

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 80

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Gly Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Asn Asn Trp

<210> 81

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 81

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Ala Leu Glu Asn Met

1 5 10 15

Asn Tyr Trp

<210> 82

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 82

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Thr Leu Glu Ser Met

1 5 10 15

Arg Tyr Trp

<210> 83

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 83

Arg Leu Val Pro Pro Gly Ile Pro Ile Glu Arg Ser Leu Glu Asn Met

1 5 10 15

Asn Tyr Trp

<210> 84

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3

<400> 84

His Val Ala Gly Phe Asp Glu Tyr Asn Tyr Trp

1 5 10

Claims

1.包含与人CD1d结合的至少一种单域抗体的复合物，其中所述单域抗体具有分别如SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:75所示的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

2.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物包含其它单域抗体。

4.根据权利要求3所述的复合物，其中所述复合物为双特异性抗体。

5.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物为多特异性复合物。

6.根据权利要求5所述的复合物，其中所述复合物是双特异性复合物。

7.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物包含标记物，其中药物活性剂与所述复合物连接，其中所述复合物为多价复合物，其中所述复合物与抗原、肽或核苷酸序列融合，其中所述复合物为脂质体，其中所述复合物为病毒，或其中所述复合物为纳米颗粒。

8.根据权利要求7所述的复合物，其中所述复合物为双价复合物。

9.根据权利要求1所述的复合物，其中所述单域抗体与人CD1d结合，但不与人CD1a、人CD1b和/或人CD1c结合。

10.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物为单域抗体，并且其中所述单域抗体为具有分别如SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:75所示的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的单域抗体，或者其中，所述单域抗体具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

11.根据权利要求1所述的复合物，其中所述单域抗体为人源化单域抗体。

12.权利要求1-11中任一项所述的复合物在制备药物或体内诊断剂中的用途。

13.药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的复合物。

14.核酸，其编码结合人CD1d的单域抗体，其中所述单域抗体具有分别如SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:75所示的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

15.宿主细胞，其包含权利要求14所述的核酸。

16.制备权利要求1-11中任一项所述的复合物的方法，其中所述方法包括使权利要求15所述的宿主细胞表达单域抗体；并得到所述复合物，其中所述单域抗体为所述复合物或其一部分。