CN113272325A - 双作用CD1d免疫球蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学领域，更具体地涉及与人CD1d结合的结合部分和/或免疫球蛋白的领域，所述结合部分和/或免疫球蛋白包括这样的抗体及其片段，其修饰CD1d介导的生物功能，例如增强CD1d‑限制性T细胞(包括自然杀伤T细胞和γδT细胞)的活化和降低其活化，以及调节表达CD1d的细胞的功能。本发明还涉及与CD1d和γδTCR和/或肿瘤靶标结合的双特异性、三特异性或多特异性免疫球蛋白。本发明还涉及药物制剂以及这样的单特异性、双特异性和三特异性或多特异性结合部分和/或免疫球蛋白在治疗疾病或病症中的用途。

Description

双作用CD1d免疫球蛋白
技术领域
本发明涉及免疫学领域，更具体地涉及与人CD1d结合的结合分子和/或免疫球蛋白的领域，所述结合分子和/或免疫球蛋白包括修饰CD1d介导的生物功能，例如活化和阻断CD1d限制性T细胞(包括自然杀伤T(natural killer T，NKT)细胞和gamma(γ)-delta(δ)T细胞)，以及调节表达CD1d的细胞的功能的抗体及其片段。本发明还涉及与CD1d和γδT细胞受体(T cell receptor，TCR)和/或肿瘤靶标结合的双特异性、三特异性或多特异性的结合分子和/或免疫球蛋白。本发明还涉及药物制剂以及这样的单特异性、双特异性和三特异性或多特异性结合分子和/或免疫球蛋白在治疗疾病或病症中的用途。
背景技术
CD1d是糖蛋白CD1(分化群1)家族(包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和CD1e)的成员，并且在多种人细胞包括抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)的表面上表达。它们是与I类MHC蛋白有关的非经典MHC蛋白，并且参与脂质抗原向T细胞亚群的呈递。在人中，CD1d由CD1D(也称为R3G1)编码。展示CD1d的APC包括B细胞、树突细胞(例如在淋巴结中)和单核细胞。CD1d还由例如肝、胰、皮肤、肾、子宫、结膜、附睾、胸腺和扁桃体中的多种其他细胞类型表达(Canchis et al.(1992)Immunology 80：561)。
通过CD1d活化/刺激的细胞包括CD1d限制性自然杀伤T细胞(Natural Killer T-cell，NKT细胞)。NKT细胞是共有T细胞和自然杀伤细胞二者的特性的异质T细胞群。NKT细胞是表达alpha(α)/beta(β)T细胞受体(TCR)以及通常与NK细胞相关的多种分子标志物的T细胞亚群。
1型或不变NKT(invariant NKT，iNKT)细胞是研究得最好的NKT细胞群，并且与常规αβ-T细胞的不同之处在于其T细胞受体的多样性要有限得多(“不变”)。这些不变的、还有其他CD1d限制性的NKT细胞(II型NKT)识别由存在于APC上的CD1d分子呈递的数种抗原，例如(自身或外来的)脂质、糖脂、硫苷脂、磷脂、脂肽、疏水性肽和/或两亲性α-螺旋肽(EnricoGirardi et al.(2016)J Biol Chem.291(20)：10677)。(抗原呈递)CD1d与TCR之间的相互作用触发了细胞因子的释放，所述细胞因子包括Th1样和/或Th2样细胞因子，例如干扰素-γ，肿瘤坏死因子-α以及白介素如IL-4、IL-5和IL-13。
α-半乳糖基神经酰胺，KRN7000，是体外和体内NKT细胞活化中脂质结合CD1d的最佳研究配体。另一些配体包含异球蛋白三己糖基神经酰胺(针对小鼠iNKT细胞)、(微生物来源的)糖醛糖基神经酰胺、α-C-半乳糖基神经酰胺、苏糖醇神经酰胺以及多种(人和非人)糖脂，例如溶血磷脂酰胆碱(lysophophatidylcholine)和溶血鞘磷脂(lysosphingomyelin)(Fox et al(2009)PLOS Biology 7：10：e1000228)。
已经表明iNKT细胞在自身免疫、变应性、抗微生物和抗肿瘤免疫应答的调节中的重要作用(van der Vliet et al.(2004)Clin Immunol 112(1)：8)。在生理上，NKT细胞可根据情况通过多种机制(Yue et al.(2010)J Immunol 184：268)增强或抑制免疫应答(包括抗肿瘤、自身免疫和抗病原体应答)，包括在多发性骨髓瘤细胞中诱导细胞死亡。其中可涉及(不变)NKT细胞的病症包括自身免疫性或炎性疾病，包括重症肌无力、银屑病、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬化、结肠炎、自身免疫性肝炎、动脉粥样硬化和哮喘。除细胞因子释放之外，导致细胞裂解(例如穿孔素释放和颗粒酶释放以及细胞死亡)的NKT细胞效应物功能在其中涉及NKT细胞的病症中(例如在癌症中)也可能是相关的。
CD1d限制性NKT细胞基于其T细胞受体(TCR)的使用情况和抗原特异性被分为两个主要亚群：I型NKT细胞，其使用经典的不变TCRα链并且识别α-半乳糖基神经酰胺(α-galactosylceramide，α-GalCer)，以及II型NKT细胞，其使用更多样化的αβ-TCR库(repertoire)并且不识别α-GalCer。另外，最近已鉴定使用非经典αβ-TCR的α-GalCer-反应性NKT细胞和使用γδ-或δ/αβ-TCR的CD1d限制性T细胞，进一步揭示了CD1d限制性T细胞中的多样性(Macho-Fernandez and Brigl(2015)Front Immunol 6：362)。
I型NKT细胞
Kawano及同事在1997年对首个经CD1d呈递的抗原α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)的发现使得我们对NKT细胞生物学，特别是I型或不变NKT(iNKT)细胞的了解有了数个重要的进步(Kawano et al.(1997)Science 278：1626)。在小鼠中，I型NKT细胞表达恒定Vα14Jα18 TCRα链，而在人中表达Vα24Jα18，其与有限的TCRβ链库(在小鼠中为Vβ8、Vβ7、Vβ2，而在人中仅为Vβ11)配对。I型NKT细胞甚至在稳定状态下也可以具有高度自身反应性，并显示出具有高表面水平的活化标志物CD69、CD44和CD122(IL-2Rβ链)和低表达的CD62L(由归巢于淋巴结的初始T细胞表达的标志物)的活化/记忆表型(Bendelac et al(1992)J ExpMed 175：731；Matsuda et al.(2000)J Exp Med 192：741)。I型NKT细胞极为重要地有助于自然抗肿瘤应答，如与WT小鼠相比，I型NKT细胞缺陷型Jα18-/-小鼠中自发性肿瘤的迅速生长所表明的(Smyth et al.(2000)J Exp Med 191：661；Swann et al(2009)Blood 113：6382；Bellone et al(2010)PLoS One 5：e8646)。此外，α-GalCer对I型NKT细胞的活化通过其IFN-γ产生以及随后对树突细胞(dendritic cell，DC)和NK细胞的活化提供了针对恶性血液病和实体瘤的强效作用(Smyth et al(2002)Blood 99：1259；Berzofsky and Terabe(2008)J Immunol 180：3627)。相比之下，经硫苷脂活化的II型NKT细胞通过消除响应于α-GalCer的I型NKT活化来抑制抗肿瘤免疫力(Terabe et al(2000)Nat Immunol 1：515；Terabe et al(2005)J Exp Med 202：1627；Renukaradhya et al(2008)Blood 111：5637)，就细胞因子分泌和扩增而言(Ambrosino et al(2007)J Immunol 179：5126)。此外，与TNF-α组合的其IL-13产生导致通过髓样来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)进行的TGF-β分泌上调，并导致细胞毒性T细胞活性降低(Terabe et al(2003)J ExpMed 198：1741)。
II型NKT细胞
在其余CD4+T细胞中首先在MHC II缺陷型小鼠中描述了不表达Vα14-Jα18重排且不识别α-GalCer的CD1d限制性T细胞(Cardell Set al(1995)J Exp Med 182：993)。从那时起被称为多样化NKT(diverse NKT，dNKT)、II型NKT或变体NKT(variant NKT，vNKT)细胞，存在于小鼠和人二者中的这种NKT细胞群表现出更加异质的TCR库。数条证据表明，II型NKT细胞可促进和调节一系列免疫应答，有时与I型NKT细胞的作用相反。
γδT细胞
除具有αβTCR的CD1d限制性T细胞之外，最近在小鼠和人二者中均描述了表达γδTCR的CD1d限制性T细胞。人γδT细胞根据其Vδ链表达可分为两个主要群：Vδ2+和“非Vδ2”亚群，后者尤其(inter alia)包含Vδ1+γδT细胞和较不普遍的Vδ3+γδT细胞(McVay et al(1999)Crit Rev Immunol 19：431；Vantourout and Hayday(2013)Nat Rev Immunol 13：88)。Vδ1+γδT细胞主要是组织驻留性的，并且存在于皮肤中和黏膜表面处，而Vδ2+γδT细胞主要在人血液中。与αβT细胞相比，由γδT细胞识别的抗原类型以及抗原呈递在γδTCR识别中的作用和功能更不清楚。有趣地，最近发现一些γδT细胞直接识别经CD1d呈递的脂质抗原(Hayday and Vantourout(2013)Immunity 39：994)。在2013年，Uldrich et al(2013)Nature Immunol 14：1137)鉴定了识别与选择的糖脂抗原，包括αGalCer组合的CD1d的γδ-T细胞群。这些T细胞被称为CD1d限制性Vδ1+T细胞。不受理论的束缚，认为Vδ1+T细胞可发挥炎性应答，对于有效的抗肿瘤应答可能产生反作用。
发明内容
由于上述原因，调节CD1d介导的作用具有潜在的治疗益处。一直需要可以在体外和体内二者与CD1d特异性结合和/或相互作用的结合分子。特别地，需要这样的结合分子，其结合和/或调节(激活或抑制)涉及CD1d的生物功能，例如但不限于NKT细胞活化。这样的结合分子可例如在其中CD1d介导的功能发挥作用的多种疾病中显示出益处。
本发明人先前已经鉴定了定名为1D12或VHH 12的单结构域抗体，该单结构域抗体特异性活化iNKT(I型NKT)细胞，而无需CD1d配体(WO2016122320)。本发明首次表明1D12不仅能够使iNKT细胞活化，而且同时能够阻断CD1d限制性Vδ1+T细胞活化。现在，这种观察导致了这样的观念，即1D12可用于治疗由CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的病症。技术人员将意识到，这种特定用途不限于1D12，而是扩展至在功能和/或结构上类似于1D12的任何抗体。
在第一方面中，本发明提供了包含能够与单结构域抗体1D12(SEQ ID NO：4)竞争与CD1d分子结合的第一结合部分的结合分子，其用于治疗由CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的病症。
在第二方面中，本发明提供了包含能够与1D12(SEQ ID NO：4)竞争与CD1d分子结合的第一结合部分并且包含能够与Vγ9Vδ2-TCR特异性结合的第二结合部分的结合分子，其中所述结合分子能够使Vγ9Vδ2 T细胞活化。本发明人已经表明，双特异性CD1d/Vγ9Vδ2-TCR抗体可诱导iNKT细胞和Vγ9Vδ2-T细胞的脱颗粒并控制CD1d表达肿瘤细胞的生长。此外，在小鼠多发性骨髓瘤模型中，与无抗体情况下的单独的iNKT细胞和γδT细胞的混合物相比，在双特异性CD1d/Vγ9Vδ2-TCR抗体下iNKT细胞和γδT细胞二者的输注显著延长了存活。
在另一方面中，本发明提供了根据本发明第二方面的组合物以及可药用赋形剂。
在又一方面中，本发明提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有此需要的对象施用根据本发明的结合分子。
本发明的另一些方面和实施方案描述于下。
附图说明
图1：抗CD1d VHH介导的不变自然杀伤T(iNKT)细胞的活化和抑制。在iNKT细胞与用载剂对照(载剂)或αGalCer(无论是否与抗CD1d VHH 1D12(100nM)或1D22(1000nM)组合)脉冲的经CD1d转染的HeLa细胞共培养24小时之后，确定iNKT CD25表达和干扰素-γ(IFN-γ)产生。示出了如通过CD25表达所描绘的iNKT细胞被1D12显著活化(A)或被1D22抑制(B)的代表性点状图，另外是iNKT细胞IFN-γ产生的显著提高(通过1D12)或降低(通过1D22)(C和D)。数据表示从不同供体获得的iNKT的3至4次单独实验的平均值+SD，**P＜0.01，***P＜0.001，其用单因素方差分析(one-way analysis of variance)及Tukey事后检验(Tukey’spost hoc test)来计算。
图2：Vδ1-sulf-CD1d相互作用被抗CD1d VHH 1D12阻止并且被1D22降低。将内源性或硫苷脂负载的CD1d-PE四聚体与PBS(对照)、1D12或1D22(4∶1的VHH∶CD1d比)一起孵育，在此之后使用四聚体对与CD3-APC组合的Jurkat-Vδ1细胞进行染色(终浓度四聚体2μg/ml)。四聚体结合被1D12阻止并且被1D22(A)降低。将C1R-CD1d细胞与DMSO对照或硫苷脂(25μg/ml)一起孵育，在此之后添加培养基或抗CD1d VHH(1000或100nM)，并孵育30分钟。接下来，添加Jurkat-Vδ1细胞，并将共培养物孵育另外的24小时，在此之后通过流式细胞术确定CD69表达(B)。N＝3。
图3：靶向双特异性CD1d和Vγ9Vδ2-TCR的VHH对iNKT细胞和Vγ9Vδ2-T细胞的双重活化，其导致效应细胞脱颗粒和快速的肿瘤细胞裂解。在存在仅培养基、单价1D12或双特异性1D12-5C8的情况下，将CD1d表达CCRF-CEM细胞与iNKT细胞或Vγ9Vδ2-T细胞或二者以效应物与靶标的比为1∶2一起孵育。在存在1D12的情况下，观察到iNKT细胞的稳健脱颗粒(如通过CD107a表达所示的)，但仅在存在双特异性VHH的情况下，看到iNKT细胞和Vγ9Vδ2-T细胞同时脱颗粒(A)。因此，观察到活CCRF-CEM细胞显著降低(B)。数据表示从不同供体获得的iNKT/Vγ9Vδ2-T的3个单独实验的平均值+SD。
图4：双特异性1D12-5C8支持iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞扩增并诱导肿瘤生长控制。在存在仅培养基或双特异性1D12-5C8的情况下，将iNKT、Vγ9Vδ2-T或混合物(2∶3的比)与MM.1s-CD1d细胞以效应物与靶标的比为1∶10一起孵育。观察到明显的iNKT细胞扩增诱导，然而仅在存在1D12-5C8和iNKT细胞的情况下观察到Vγ9Vδ2-T扩增(A)。值得注意地，在存在1D12-5C8的情况下，肿瘤生长受到控制(B)。数据表示从不同供体获得的配对iNKT/Vγ9Vδ2-T的3个单独实验的平均值+SD。
图5：抗CD1d VHH 1D12和抗CD1d 51.1mAb而非抗CD1d VHH 1D22干扰1D12-5C8双特异性VHH的结合。将经CD1d转染的多发性骨髓瘤细胞(MM.1s)与PBS(阴性对照，NC)、抗CD1d VHH(1000nM)或抗CD1d mAb(100nM)一起孵育45分钟，在此之后添加PBS(NC)或生物素化的1D12-5C8双特异性VHH(100nM)，并孵育另外的30分钟。在充分洗涤之后，将样品用链霉抗生物素蛋白-APC染色并通过流式细胞术进行分析。数据表示3个单独实验的平均值+SD，****P＜0.0001，其用双因素方差分析及Tukey事后检验来计算。
图6：在存在iNKT和/或γδT细胞的情况下，双特异性抗体1D12-5C8在小鼠多发性骨髓瘤模型中促进存活。图A示出了施用抗体1D12-5C8和/或iNKT细胞对存活的作用。图B示出了施用抗体1D12-5C8和/或γδT细胞的作用。图C示出了施用抗体1D12-5C8和/或iNKT和γδT细胞的混合物(“混合物(mix)”)的作用。
具体实施方式
如上所述，在第一主要方面中，本发明提供了包含能够与单结构域抗体1D12(SEQID NO：4)竞争与CD1d分子结合的第一结合部分的结合分子，其用于治疗由CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的病症。
“由CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的病症”是这样的疾病或病症，其中CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引发、维持或加剧该疾病或病症或者对该疾病或病症的预后或进展具有负面影响。其中负面影响意指由于CD1d限制性Vδ1+T细胞的作用，与其中没有Vδ1+T细胞作用的情况相比，该疾病得以持续、加重或减弱程度较小。优选地，负面影响是由于活化的Vδ1+T细胞的(抗)炎性作用引起。这样的病症或疾病特别包括需要1型辅助T(helper T，Th1)细胞应答并且受到2型辅助T(Th2)细胞的T细胞应答负面影响的那些疾病。名称“Th1”和“Th2”细胞在本领域中是公知的，并且通常认为Th1细胞主要对胞内微生物群(例如胞内细菌和病毒)具有活性，而Th2细胞则主要激活体液免疫系统(B细胞、嗜酸性粒细胞等)以便对抗胞外微生物群，例如原生动物。此外，Th1细胞促进了肿瘤细胞的杀伤，而Th2细胞则抵消了这样的作用。
由CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的病症的一个实例是CD1d限制性外周T细胞淋巴瘤(peripheral T cell lymphoma，PTCL(Bachy et al(2016)J Exp Med213No.5：841))。在一个优选实施方案中，提供了根据本发明应用的结合分子，其用于治疗恶性血液病，例如CD1d限制性外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、CD1d+T细胞急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、CD1d+淋巴瘤、CD1d+慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、CD1d+急性髓细胞性白血病(acute myelogenousleukemia，AML)和CD1d+套细胞淋巴瘤，优选地用于治疗CD1d限制性Vδ1+PTCL。
根据本发明的“结合分子”可以是任何种类的结合分子，例如复合物，只要其包含如本发明所限定的第一结合部分或由其组成即可。优选地，结合分子是多肽，更优选地是抗体。在某些实施方案中，结合分子可仅由能够与1D12(SEQ ID NO：4)竞争与人CD1d结合的第一结合部分组成。在另一些实施方案中，结合分子可由能够与1D12竞争与人CD1d结合的第一结合部分和标记组成。在又一些实施方案中，结合分子可包含能够与1D12竞争与人CD1d结合的第一结合部分，其与药物活性剂和/或其他结合部分连接。因此，结合分子可包含单个结合部分或多个，例如两个、三个或四个结合部分。在一个优选实施方案中，结合分子包含两个结合部分，优选能够与两种不同的表位结合。优选地，表位在不同的靶标(蛋白质)上。
本文中使用的术语“抗体”意在指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一种的衍生物，其具有在通常的生理条件下以显著时段的半衰期与抗原特异性结合的能力，所述时段例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更多、约48小时或更多、约3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相关的功能上限定的时期(例如足以诱导、促进、增强、和/或调节与与抗原结合的抗体相关的生理应答的时间和/或足以使抗体募集效应物活性的时间)。与抗原相互作用的结合区(或结合结构域)包含免疫球蛋白分子的重链和轻链二者的可变区。抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞和T细胞)以及补体系统的组分，例如C1q，补体激活经典途径中的第一组分。然而，在一些实施方案中，抗体的Fc区已被修饰成具有惰性，“惰性”意指这样的Fc区，其至少不能结合任何Fcγ受体，诱导Fc介导的FcR交联，或诱导Fc介导的通过单独蛋白质(例如抗体)两个Fc区进行的靶抗原交联。在另一个实施方案中，惰性Fc区另外不能结合C1q。在一个实施方案中，该抗体在第234位和第235位包含突变(Canfield and Morrison(1991)J ExpMed 173：1483)，例如，在第234位的Leu至Phe突变和在第235位的Leu至Glu突变。在另一个实施方案中，抗体包含第234位的Leu至Ala突变、第236位的Leu至Ala突变和第329位的Pro至Gly突变。
如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文中使用的术语抗体包括保留与抗原特异性相互作用(例如结合)能力的抗体片段。已经表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。涵盖在术语“抗体”之内的结合片段的一些实例包括：(i)Fab’或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段或如WO2007059782中所述的单价抗体；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；和(iv)基本上由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接起来，使得它们能够成为单蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(single chain Fv，scFv)，参见例如Bird et al.，Science 242，423-426(1988)和Huston et al.，PNAS USA 85，5879-5883(1988))。除非另有说明或上下文明确指出，否则这样的单链抗体涵盖在术语抗体之内。尽管这样的片段通常被包括在抗体的含义之内，但是它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。在本发明情况下的这些和其他可用抗体片段在本文中进一步讨论。还应理解，除非另有指明，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体和人源化抗体，以及保留与通过任何已知技术(例如酶切割、肽合成和重组技术)提供的抗原特异性结合能力的抗体片段(抗原结合片段)。如此产生的抗体可具有任何同种型。
本文中使用的术语“免疫球蛋白重链”、“免疫球蛋白的重链”或“重链”意在指免疫球蛋白的链之一。重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH)和限定免疫球蛋白同种型的重链恒定区(本文中缩写为CH)构成。重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。重链恒定区还可包含铰链区。本文中使用的术语“免疫球蛋白”意在指结构上相关的糖蛋白类别，其由两对多肽链、一对轻(L)链和一对重(H)链组成，所有四对链均可能通过二硫键相互连接。在免疫球蛋白(例如IgG)的结构内，两条重链通过所谓的“铰链区”中的二硫键相互连接。与重链同样地，每条轻链通常由数个区构成；轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL)。轻链恒定区通常由一个结构域CL构成。此外，VH和VL区可进一步细分为高变的区(或高变区，其可能是序列高变的和/或形成结构上限定的环)，也称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，散布有更保守的区，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，从氨基端至羧基端按以下顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR序列可通过使用多种方法来确定，所述方法例如由Choitia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901或Kabat et al.(1991)Sequence of protein of immunological interest，fifth edition.NIH publication提供的方法。用于CDR确定和氨基酸编号的多种方法可在www.abysis.org(UCL)上进行比较。
本文中使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白(亚)类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任何同种异型，例如IgG1m(za)和IgG1m(f)[SEQ ID NO：407])。因此，在一个实施方案中，抗体包含IgG1类或其任何同种异型的免疫球蛋白的重链。此外，每个重链同种型均可与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。
本文中使用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区来源于非人物种(例如，来源于啮齿动物)并且恒定区来源于不同物种例如人的抗体。嵌合抗体可通过抗体工程来产生。“抗体工程”是用于不同种类的抗体修饰的通用术语，并且其是技术人员公知的过程。因此，嵌合抗体可以是遗传工程化重组抗体。一些嵌合抗体可以是遗传工程化的或酶工程化的。产生嵌合抗体在技术人员的知识范围内，并因此，根据本发明的嵌合抗体的产生可通过除本文中所述之外的其他方法来进行。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低抗体的免疫原性。它们通常可包含对目的抗原具有特异性的非人(例如鼠)可变区，以及人恒定抗体重链和轻链结构域。在嵌合抗体的情况下使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链二者的CDR和框架区的区。
本文中使用的术语“人源化抗体”是指遗传工程化的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和被修饰以与人可变结构域具有高水平序列同源性的非人可变结构域。这可通过将一起形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人接纳体框架区(FR)上来实现。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可帮助鉴定框架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列、任选地包含针对非人氨基酸序列的一个或更多个氨基酸回复突变的主要人框架区，以及完全人恒定区。任选地，可应用不一定是回复突变的另外的氨基酸修饰以获得具有优选特征例如亲和力和生物化学特性的人源化抗体。非人来源的抗体的氨基酸序列不同于人来源的抗体，并因此，非人抗体在施用于人患者时具有潜在的免疫原性。然而，尽管抗体是非人来源的，但其CDR区段负责抗体与其靶抗原结合的能力，并且人源化旨在维持抗体的特异性和结合亲和力。因此，进行非人治疗性抗体的人源化以使其在人中的免疫原性最小化，而同时这样的人源化抗体维持非人来源抗体的特异性和结合亲和力。
在一个方面中，本发明涉及多特异性抗体，其包含根据本文中所述的任何方面或实施方案的结合分子的至少第一结合部分，以及除第一结合区之外结合一个或更多个不同靶标的一个或更多个结合部分。这样的多特异性抗体可以是双特异性、三特异性或四特异性抗体。
术语“多特异性抗体”是指对至少两种不同的，例如至少三种通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这样的表位可以在同一或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，则这样的靶标可以在同一细胞或者不同的细胞或细胞类型上。
术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的，通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这样的表位可以在同一或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，则这样的靶标可以在同一细胞或者不同的细胞或细胞类型上。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二重链。
可用于本发明的双特异性抗体分子的一些实例包含(i)具有包含不同抗原结合区的两个臂的单抗体，(ii)对两种不同表位具有特异性的单链抗体，例如通过额外的肽接头串联连接的两个scFv；(iii)双可变结构域抗体(DVD-IgTM)，其中每条轻链和重链包含通过短肽连接串联的两个可变结构域；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)
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其是两个单链双抗体(diabody)的融合体，产生对每种靶抗原均具有两个结合位点的四价双特异性抗体；(vi)柔性抗体(flexibody)，其是scFv与双抗体的组合，产生多价分子；(vii)基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”的所谓的“对接与锁定(dock and lock)”分子
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当将其应用于Fab时，可产生由与不同Fab片段连接的两个相同Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(viii)所谓的蝎形分子(Scorpion molecule)，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；以及(ix)双抗体。
不同类别的双特异性抗体的一些实例包括但不限于(i)具有互补CH3结构域以迫使异二聚化的IgG样分子；(ii)重组IgG样双靶向分子，其中所述分子的两侧各自包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；以及(vi)基于ScFv和双抗体的抗体和重链抗体(例如，结构域抗体，
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)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，结构域抗体，
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)彼此融合或者与与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合的另一种蛋白质或载体分子融合。
具有互补CH3结构域分子的IgG样分子的一些实例包括但不限于
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(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、隆突-入-穴(Knobs-into-Holes)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电匹配(electrostatically-matched)(Amgen，Chugai，Oncomed)、LUZ-Y(Genentech，Wranik et al.J.Biol.Chem.2012，287(52)：43331-9，doi：10.1074/jbc.M112.397869.Epub 2012 Nov 1)、DIG体和PIG体(Pharmabcine，WO2010134666，WO2014081202)、链交换工程化结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body，SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonics(Merus，WO2013157953)、FcΔAdp(Regeneron)、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat)、Azymetric支架(Zymeworks/Merck)、mAb-Fv(Xencor)、二价双特异性抗体(Roche，WO2009080254)和
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分子(Genmab)。
重组IgG样双靶向分子的一些实例包括但不限于双靶向(Dual Targeting，DT)-Ig(GSK/Domantis，WO2009058383)、二合一抗体(Two-in-one Antibody)(Genentech，Bostrom，et al 2009.Science 323，1610-1614)、交联Mab(Cross-linked Mab)(KarmanosCancer Center)、mAb2(F-Star)、ZybodiesTM(Zyngenia，LaFleur et al.MAbs.2013 Mar-Apr；5(2)：208-18)，使用共同轻链的方法，κλBodies(NovImmune，WO2012023053)和
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(CoVX/Pfizer，Doppalapudi，V.R.，et al2007.Bioorg.Med.Chem.Lett.17，501-506)。
IgG融合分子的一些实例包括但不限于双可变结构域(Dual Variable Domain，DVD)-IgTM(Abbott)、双结构域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis)、IgG样双特异性(ImClone/Eli Lilly，Lewis et al.Nat Biotechnol.2014 Feb；32(2)：191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ，Dimasi et al.J Mol Biol.2009 Oct 30；393(3)：672-92)和BsAb(Zymogenetics，WO2010111625)、HERCULES(Biogen Idec)、scFv融合体(Novartis)、scFv融合体(Changzhou Adam Biotech Inc)和TvAb(Roche)。
Fc融合分子的一些实例包括但不限于ScFv/Fc融合体(Academic Institution，Pearce et al Biochem Mol Biol Int.1997Sep；42(6)：1179)、SCORPION(EmergentBioSolutiohs/Trubion，Blankenship JW，et al.AACR 100th Annual meeting 2009(摘要#5465)；Zymogenetics/BMS，WO2010111625)、双亲和力再靶向技术(Dual AffinityRetargeting Technology)(Fc-DARTTM)(MacroGenics)和Dual(ScFv)2-Fab(国家抗体医学研究中心-中国(National Research Center for Antibody Medicine-China))。
Fab融合双特异性抗体的一些实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、
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(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性(Bivalent Bispecific)(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。
基于ScFv、双抗体的抗体和结构域抗体的一些实例包括但不限于双特异性T细胞接合剂(Bispecific T Cell Engager)
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(Micromet，串联双抗体(TandemDiabody，Tandab)(Affimed)、双亲和力再靶向技术(DARTTM)(MacroGenics)、单链双抗体(Academic，Lawrence FEBS Lett.1998 Apr 3；425(3)：479-84)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Human Serum Albumin ScFv Fusion)(Merrimack，WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech，Zhu et al.Immunol CellBiol.2010Aug；88(6)：667-75)、双靶向
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(Ablynx，Hmila et al.，FASEBJ.2010)、双靶向仅重链结构域抗体。
在本发明的上下文中，“结合部分”是能够与靶标特异性结合的部分，优选为多肽，更优选为抗体。结合部分可例如包含：完整的免疫球蛋白分子，例如单克隆抗体。或者，结合部分可包含抗原结合功能片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异性双链抗体、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、单结构域抗体
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至少包含足以与其靶标特异性结合的氨基酸序列的(多)肽，以及人工免疫球蛋白片段，例如塑性抗体(plasticantibody)(Hoshino et al(2008)J Am Chem Soc 130(46)：15242)。在一个优选实施方案中，本发明的结合部分是单结构域抗体。优选地，本发明的结合部分包含三个重链CDR。
本文中使用的术语“特异性结合”是指结合部分或结合分子与预定的抗原或靶标(例如人CD1d)的结合，当通过例如表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)技术在BIAcore 3000仪器中使用抗原作为配体以及结合部分或结合分子作为分析物进行确定时，通常以对应于以下KD的亲和力与所述预定的抗原或靶标(例如人CD1d)结合：约10- 6M或更小，例如10-7M或更小，例如约10-8M或更小，例如约10-9M或更小、约10-10M或更小或者约10-11M或甚至更小；并且以对应于这样的KD的亲和力与预定抗原结合，该KD比结合部分或结合分子针对与除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。亲和力较低的程度取决于结合部分或结合分子的KD，使得当结合部分或结合分子的KD非常低时(即，结合部分或结合分子是高度特异性的)，则针对抗原的亲和力比针对非特异性抗原的亲和力低的程度可以是至少10,000倍。本文中使用的术语“KD”(M)是指抗原与结合部分或结合分子之间的特定相互作用的解离平衡常数。
如所述的，上述结合部分能够与单结构域抗体1D12竞争与人CD1d的结合。在本发明的上下文中，“竞争(competition)”或“能够竞争”或“竞争(compete)”是指在存在结合结合配偶体的另一分子(例如，不同的CD1d抗体)的情况下，特定结合分子(例如CD1d抗体)结合特定结合配偶体(例如CD1d)的倾向性的任何可检测的显著降低。通常来说，竞争意指由另一CD1d结合分子或部分的存在引起的CD1d结合分子或部分之间的结合至少约25％降低，例如至少约50％，例如至少约75％，例如至少90％降低，如通过例如ELISA分析或流式细胞术使用足量的两种或更多种竞争性结合分子或部分确定的。用于通过竞争性抑制来确定结合特异性的另外的方法可见于例如Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)，Colligan etal.，eds.，Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc，and WileyInterScience N.Y.，(1992，1993)，和Muller，Meth.Enzymol.92，589-601(1983))中。优选地，本发明的结合分子与抗体1D12结合CD1d上相同的表位的至少一部分或在该相同的表位附近结合，更优选地结合与1D12相同的表位或与1D12的表位重叠的表位结合。用于确定结合分子(例如抗体)的表位的方法是本领域已知的。其中“在……附近”意指其结合CD1d以使得结合分子至少在空间上阻碍1D12与CD1d的结合。本发明的结合分子可包含与1D12相同或不同的CDR序列。在一个更优选实施方案中，本发明的结合分子包含与1D12相同的CDR1(SEQID NO 1)、CDR2(SEQ ID NO：2)和CDR3(SEQ ID NO：3)序列。在一个最优选实施方案中，本发明的结合分子包含与1D12(SEQ ID NO：4)的序列相同的序列或者其包含SEQ ID NO：85中所示的序列。
如上所述，在另一个主要方面中，本发明提供了包含能够与1D12(SEQ ID NO：4中所示抗体)竞争与CD1d分子结合的第一结合部分并且包含能够与Vγ9Vδ2-TCR特异性结合的第二结合部分的结合分子。“与Vγ9Vδ2-TCR特异性结合”意指结合分子结合Vγ9Vδ2-TCR，但不排除在不存在另一亚基的情况下结合分子与一个单独的亚基结合，即与单独的Vγ9链结合或与单独的Vδ2链结合。例如，如在本文中表2中可见，抗体5C8是结合Vγ9Vδ2-TCR但当单独表达Vδ2链时也结合Vδ2链的抗体。
在一个优选实施方案中，结合分子结合Vγ9Vδ2-TCR的Vδ2链。此外，优选地，结合分子能够使Vγ9Vδ2 T细胞活化，而与Vγ9Vδ2 T细胞的天然配体无关。本发明提供了这样的见解，即包含双特异性免疫球蛋白复合物的这样的结合分子能够抑制Vδ1+T细胞并能够使(Vγ9)Vδ2+T细胞活化。Vγ9Vδ2 T细胞的活化对于多种疾病的治疗具有益处。Vδ2 TCR链特异性免疫球蛋白优于Vγ9TCR链特异性免疫球蛋白，因为Vγ9可与例如Vδ1TCR链配对，从而导致吸引可能产生反作用的γδ-T细胞并使其活化。
术语“第一”和“第二”结合部分不指其在结合分子中的取向/位置，即，其对于N-或C-端没有意义。术语“第一”和“第二”仅用于正确和一致地指代权利要求书和说明书中的两个不同的结合部分。在一个优选实施方案中，第一结合部分和第二结合部分通过一个或更多个酰胺键，优选地通过接头，更优选包含氨基酸GGGGS(SEQ ID NO：83)的接头彼此偶联。根据本发明的包含通过肽接头(GGGGS)连接的第一和第二结合部分的结合分子的两个非限制性实例示出于表1(SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：87)中。在另一个优选实施方案中，结合分子是双特异性抗体，例如全长双特异性抗体。当在本文中使用时，术语“全长抗体”是指包含所有重链和轻链恒定结构域和可变结构域的抗体，所述恒定结构域和可变结构域对应于通常存在于该同种型的野生型抗体中的那些。
在本发明的上下文中，“能够使Vγ9Vδ2 T细胞活化”意指在存在根据本发明的结合分子的情况下，特别是在存在表达CD1d的靶细胞的情况下，Vγ9Vδ2 T细胞被活化。优选地，Vγ9Vδ2 T细胞的活化可通过基因表达和/或(表面)标志物表达(例如，活化标志物，例如CD25、CD69或CD107a)和/或分泌蛋白(例如，细胞因子或趋化因子)谱来测量。在一个优选实施方案中，结合分子能够诱导活化(例如，CD69和/或CD25表达的上调)，从而导致Vγ9Vδ2T细胞的脱颗粒(以CD107a表达的提高为标志；实施例3)和细胞因子产生(例如，TNFα、IFNγ)。优选地，Vγ9Vδ2T细胞的活化在体内发生，特别是在已施用根据本发明的结合分子的人体中发生，并且该人体包含Vγ9Vδ2 T细胞并且优选CD1d+靶细胞。优选地，本发明的结合分子能够将Vγ9Vδ2 T细胞上的CD107a表达提高至至少10％，更优选至少20％，更优选至少40％，最优选至少90％(当将其用于如实施例3中所述的测定中时)，其中例如10％意指细胞的总数目的10％对于CD107a呈阳性。在另一个实施方案中，在存在本发明的结合分子的情况下，对于CD107a呈阳性的细胞的数目提高1.5倍，例如2倍，例如5倍。
类似地，对于iNKT细胞，在本发明的上下文中“能够使……活化”意指在存在根据本发明的结合分子或根据本发明应用的结合分子的情况下，特别是在存在CD1d分子的情况下，优选地在细胞表面上存在CD1d分子的情况下，iNKT cell细胞表现不同。使用标志物，例如CD25(实施例1)、CD69、CD107a(实施例3)，或者细胞因子/趋化因子，例如IFNγ(实施例1)、TNFα、IL-2来确定iNKT细胞是否被活化。优选地，iNKT细胞的活化在体内发生，特别是在已施用根据本发明的结合分子的人体中发生，并且该人体包含iNKT细胞并且优选CD1d+靶细胞。其中，CD1d+靶细胞意指有助于疾病致病性的CD 1d+细胞，而不是正常的CD1d表达细胞。优选地，本发明的结合分子能够将iNKT细胞上的CD107a表达提高至至少20％，更优选地至至少30％，最优选地至至少40％(当将其用于如实施例3中所述的测定中时)，其中例如10％意指细胞的总数目的10％对于CD107a呈阳性。在另一个实施方案中，在存在本发明的结合分子的情况下，对于CD107a呈阳性的细胞的数目提高1.5倍，例如2倍，例如5倍。此外，优选地，与“载剂”对照相比，本发明的结合分子能够将iNKT细胞上的CD25表达提高至至少10倍，更优选地至至少20倍，最优选地至至少30倍，如在FACS中使用别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)缀合的CD25通过流式细胞术的平均荧光强度所测量的(当将本发明的结合分子用于实施例1中所述的测定中时)。优选地，本发明的结合分子能够将通过iNKT细胞的IFNγ表达提高至少1.5倍，例如至少2倍或至少3倍(当将其用于如实施例1中所述的测定中时)。
双特异性(或多特异性)结合分子优选地诱导Th1型应答。在一个优选实施方案中，提供了根据本发明的包含第一和第二结合部分的结合分子，其用作药物，优选地用于治疗肿瘤。在本发明的上下文中的肿瘤意指：在一个位置中(例如实体瘤)或分布在人体上(例如转移瘤)的异常组织团块(mass)。另外，异常组织团块也意指播散性肿瘤(disseminatedtumor)(例如，液体血液肿瘤)。肿瘤也是经典的炎症病征。然而，这样的炎症(非癌性)肿瘤和其他非恶性肿瘤不包括在此处的定义之内。在一个优选实施方案中，所述肿瘤是癌症，尤其是可能引起死亡的癌症。肿瘤的治疗特异于肿瘤的位置和类型。良性肿瘤有时可以简单地忽略，或者可使其尺寸降低(减缩(debulk))或通过手术完全去除。对于恶性或一些良性肿瘤，选择包括化学治疗、放射和手术。造血和淋巴组织的肿瘤(所谓的血液肿瘤)也包括在内并且尤其包含白血病，例如ALL、AML、CLL，小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocyticlymphoma，SLL)，慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)和急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia，AMoL)，淋巴瘤例如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma)，以及骨髓瘤。
在一个优选实施方案中，提供了根据本发明的包含第一结合部分的结合分子或根据本发明应用的包含第一和第二结合部分的结合分子，其中所述结合分子能够降低Vδ1T细胞活化。在该情况下降低Vδ1T细胞活化意味着Vδ1T细胞不再能够识别其在CD1d分子上的配体，所述CD1d分子与如本发明中所限定的结合分子结合。这样的降低的Vδ1T细胞活化可例如通过测量Vδ1+T细胞上的活化标志物CD69的表达来确定。在较低活化的Vδ1+T细胞(如实施例2中使用的Jurkat细胞)中观察到较低的CD69表达水平。特别是在Vδ1+肿瘤细胞的情况下使用时，阻断意指根据本发明的结合分子的存在对肿瘤细胞生长和/或生存力具有负面影响。优选地，当在如实施例2中所述的测定中进行测试时，与“载剂”对照相比，通过根据本发明的结合分子将Jurkat细胞上的CD69表达提高小于5倍，例如小于2倍。
优选地，根据本发明应用的结合分子能够使iNKT细胞活化。如前所述，本发明人已经表明1D12能够使iNKT细胞活化，而与iNKT细胞的外源配体例如α-半乳糖基神经酰胺的存在无关。本发明还提供了这样的见解，即Vδ1+T细胞对CD1d的识别可被这样的结合分子阻断，并且根据本发明的结合分子中第二结合部分的存在使得能够使Vδ2+T细胞活化。这样的三重作用的结合分子，即能够降低CD1d限制性Vδ1+T细胞的活化和使iNKT细胞活化，以及同时允许Vδ2+T细胞活化，产生了偏向Th1型抗肿瘤应答的微环境。Vδ1+T细胞的活化降低，iNKT细胞的活化和Vδ2+T细胞的活化协同作用于肿瘤侵袭性微环境，从而促进了有效的肿瘤细胞杀伤。
因此，可对根据本发明的结合分子进行修饰以使得其不仅降低Vδ1+T细胞的活化并使iNKT细胞活化，而且通过在γδ-T细胞上聚类Vδ9Vδ2-TCR而结合Vδ2+T细胞并使其活化。为此，第二结合部分被涵盖在根据本发明的结合分子内。该第二结合部分能够与Vγ9Vδ2-TCR结合，优选与Vδ2链结合。与TCR的Vδ2链或Vγ9链结合的数种这样的抗体描述于WO2015156673中，并示出于表1和表2中。在另一方面中，本发明提供了治疗有此需要的对象的方法，其包括向对象施用与之前限定的包含与CD1d结合的结合部分但不包含与Vγ9Vδ2-TCR结合的结合部分的第二结合分子组合的根据本发明的包含第一和第二结合部分的第一结合分子，其中第一部分与CD1d结合并且第二结合部分与Vγ9Vδ2-TCR结合。如果第一和第二结合分子在非常不同的浓度下具有其作用，则这样的组合治疗可能特别有用。例如，可将过量的在高浓度下阻断的CD1d抗体与在低浓度下使γδ-T细胞活化的CD1d/Vγ9Vδ2抗体组合。
表1 VHH(CDR)、TCR链以及根据本发明的结合分子中包含的多种VHH序列的名称。
Figure BPA0000304990310000181
Figure BPA0000304990310000191
Figure BPA0000304990310000201
Figure BPA0000304990310000211
Figure BPA0000304990310000221
Figure BPA0000304990310000231
Figure BPA0000304990310000241
Figure BPA0000304990310000251
表2：来自WO2015156673：VHH与表达Vγ9或Vδ2链(分别与非Vδ2或Vγ9链配对)、表达完整的Vγ9Vδ2 TCR或不表达任何Vγ9Vδ2 TCR链的γδT细胞的结合。“-”指示平均荧光指数(Mean Fluorescence Index，MFI)低于1.5，“+/-”指示MFI为1.5至4.5，“+”指示MFI为4.6至20，并且“++”指示MFI高于20。
Figure BPA0000304990310000252
Figure BPA0000304990310000261
因此，还提供了根据本发明的结合分子或根据本发明应用的结合分子，其中第二结合部分能够与以下单结构域抗体竞争与Vγ9Vδ2-TCR结合：5E3(SEQ ID NO：59)、6H1(SEQID NO：60)、5G3(SEQ ID NO：61)、5C1(SEQ ID NO：62)、5D3(SEQ ID NO：63)、6E3(SEQ IDNO：64)、6H4(SEQ ID NO：65)、6C1(SEQ ID NO：66)、6H3(SEQ ID NO：67)、6G3(SEQ ID NO：68)、5C8(SEQ ID NO：69)、5F5(SEQ ID NO：70)、6A1(SEQ ID NO：71)、6E4(SEQ ID NO：72)、5C7(SEQ ID NO：73)、5D7(SEQ ID NO：74)、5B 11(SEQ ID NO：75)或6C4(SEQ ID NO：76)，优选与以下单结构域抗体竞争与Vγ9Vδ2-TCR结合：5E3(SEQ ID NO：59)、6H1(SEQ ID NO：60)、5G3(SEQ ID NO：61)、5C1(SEQ ID NO：62)、5D3(SEQ ID NO：63)、6E3(SEQ ID NO：64)、6H4(SEQ ID NO：65)、6C1(SEQ ID NO：66)、6H3(SEQ ID NO：67)、6G3(SEQ ID NO：68)、5C8(SEQ ID NO：69)、5F5(SEQ ID NO：70)、6A1(SEQ ID NO：71)或6E4(SEQ ID NO：72)。优选地，第二结合部分与与如由结合部分5E3、6H1、5G3、5C1、5D3、6E3、6H4、6C1、6H3、6G3、5C8、5F5、6A1、6E4、5C7、5D7、5B11或6C4识别的(优选地，如由结合部分5E3、6H1、5G3、5C1、5D3、6E3、6H4、6C1、6H3、6G3、5C8、5F5、6A1或6E4识别的)相同或部分重叠的表位序列，更优选地相同的表位序列结合。
在根据本发明的结合分子或根据本发明应用的结合分子的一些实施方案中，第一结合部分或第二结合部分或二者是单结构域抗体。单结构域抗体(sdAb，也称为
Figure BPA0000304990310000271
或VHH)是技术人员公知的。单结构域抗体包含单CDR1、单CDR2和单CDR3。单结构域抗体的一些实例是仅重链抗体(即天然不包含轻链的抗体)的可变片段、来源于常规抗体的单结构域抗体和工程化抗体。单结构域抗体可来源于任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼(llama)、鲨鱼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可来源于骆驼科(Camelidae)物种中(例如骆驼、单峰骆驼、羊驼(alpaca)和原驼(guanaco)中)产生的抗体。
像完整抗体一样，单结构域抗体也能够与特定抗原选择性地结合。单结构域抗体可仅包含免疫球蛋白链的可变结构域，即CDR1、CDR2和CDR3和框架区。其中，单结构域抗体的分子量为仅约12至15kDa，比由两条重链和两条轻链构成的常见抗体(150至160kDa)或者甚至由一条轻链和部分重链构成的Fab片段(53kDa)要小得多。单结构域抗体的形式在与其靶标结合时具有较少空间位阻的优点。
在一个优选实施方案中，提供了根据本发明的结合分子或根据本发明应用的结合分子，其中所述第一结合部分包含CDR1序列GSMFSDNVMG(SEQ ID NO：1)、CDR2序列TIRTGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：2)和/或CDR3序列TIPVPSTPYDY(SEQ ID NO：3)，或者这些序列中的任一个，其中任何氨基酸，优选至多4个氨基酸，更优选至多3个，更优选至多2个，最优选至多1个独立地被替换，优选根据表3被保守地替换。
在另一个优选实施方案中，提供了根据本发明的结合分子或根据本发明应用的结合分子，其中所述第一结合部分包含SEQ ID NO：4中所示的序列或SEQ ID NO：85中所示的序列。
表3：保守性氨基酸替换
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu lle；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；lle
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr，Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val lle；Leu
lle Leu，Val
在一个优选实施方案中，提供了根据本发明的结合分子或根据本发明应用的结合分子，其中对于每个VHH，第二结合部分包含表1中所示组合中的CDR 1、CDR2和CDR3序列。更具体地，第二结合部分包含根据SEQ ID NO：5的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：6的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：7的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：8的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：9的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：10的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：11的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：12的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：13的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：14的CDR1序列、根据SEQ ID NO：15的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：16的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：17的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：18的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：19的CDR3序列；或根据SEQ ID NO：20的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：21的CDR 2序列和/或根据SEQID NO：22的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：23的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：24的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：25的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：26的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：27的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：28的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：29的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：30的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：31的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：32的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：33的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：34的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：35的CDR1序列、根据SEQ ID NO：36的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：37的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：38的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：39的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：40的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：41的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：42的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：43的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：44的CDR 1序列、根据SEQ IDNO：45的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：46的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：47的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：48的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：49的CDR 3序列；或根据SEQ IDNO：50的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：51的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：52的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：53的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：54的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：55的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：56的CDR1序列、根据SEQ ID NO：57的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：58的CDR 3序列，或者这些序列中的任一个，其中任何氨基酸，优选至多4个氨基酸，更优选至多3个，更优选至多2个，最优选至多1个独立地根据表3被保守地替换。
更优选地，第二结合部分包含根据SEQ ID NO：5的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：6的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：7的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：8的CDR 1序列、根据SEQID NO：9的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：10的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：11的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：12的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：13的CDR3序列；或根据SEQ IDNO：14的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：15的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：16的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：17的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：18的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：19的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：20的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：21的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：22的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：23的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：24的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：25的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：26的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：27的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：28的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：29的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：30的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：31的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：32的CDR1序列、根据SEQ ID NO：33的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：34的CDR3序列；或根据SEQ ID NO：35的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：36的CDR 2序列和/或根据SEQID NO：37的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：38的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：39的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：40的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：41的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：42的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：43的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：44的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：45的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：46的CDR 3序列，或者这些序列中的任一个，其中任何氨基酸，优选至多4个氨基酸，更优选至多3个，更优选至多2个，最优选至多1个独立地根据表3被保守地替换。
在一个优选实施方案中，提供了根据本发明应用的结合分子，其包含能够与CD1d特异性结合的结合部分，其中所述第一结合部分包含根据SEQ ID NO：1的CDR1序列、根据SEQ ID NO：2的CDR2序列和根据SEQ ID NO：3的CDR3序列。
在一个优选实施方案中，提供了根据本发明的包含能够与CD1d特异性结合的第一结合部分并且包含能够与Vγ9Vδ2-TCR特异性结合的第二结合部分的结合分子，其中
●所述第一结合部分包含根据SEQ ID NO：1的CDR1序列、根据SEQ ID NO：2的CDR2序列和根据SEQ ID NO：3的CDR3序列，并且
●所述第二结合部分包含根据SEQ ID NO：5的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：6的CDR2序列和根据SEQ ID NO：7的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：8的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：9的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：10的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：11的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：12的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：13的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：14的CDR1序列、根据SEQ ID NO：15的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：16的CDR 3序列；或根据SEQ IDNO：17的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：18的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：19的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：20的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：21的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：22的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：23的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：24的CDR 2序列和根据SEQID NO：25的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：26的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：27的CDR2序列和根据SEQ ID NO：28的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：29的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：30的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：31的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：32的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：33的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：34的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：35的CDR1序列、根据SEQ ID NO：36的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：37的CDR 3序列；或根据SEQ IDNO：38的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：39的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：40的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：41的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：42的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：43的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：44的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：45的CDR 2序列和根据SEQID NO：46的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：47的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：48的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：49的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：50的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：51的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：52的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：53的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：54的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：55的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：56的CDR1序列、根据SEQ ID NO：57的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：58的CDR 3序列。
在一个实施方案中，提供了包含能够与CD1d特异性结合的结合部分的结合分子，其用于治疗由CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的病症，优选地用于治疗CD1d限制性Vδ1+外周T细胞淋巴瘤，其中所述第一结合部分包含根据SEQ ID NO：1的CDR1序列、根据SEQ ID NO：2的CDR2序列和根据SEQ ID NO：3的CDR3序列。
在一个实施方案中，本发明涉及包含能够与CD1d特异性结合的第一结合部分并且包含能够与Vγ9Vδ2-TCR特异性结合的第二结合部分的结合分子，其用于治疗由CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的病症，优选地用于治疗CD1d限制性Vδ1+外周T细胞淋巴瘤，其中
●所述第一结合部分包含根据SEQ ID NO：1的CDR1序列、根据SEQ ID NO：2的CDR2序列和根据SEQ ID NO：3的CDR3序列，并且
●所述第二结合部分包含根据SEQ ID NO：5的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：6的CDR2序列和根据SEQ ID NO：7的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：8的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：9的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：10的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：11的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：12的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：13的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：14的CDR1序列、根据SEQ ID NO：15的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：16的CDR 3序列；或根据SEQ IDNO：17的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：18的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：19的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：20的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：21的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：22的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：23的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：24的CDR 2序列和根据SEQID NO：25的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：26的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：27的CDR2序列和根据SEQ ID NO：28的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：29的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：30的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：31的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：32的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：33的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：34的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：35的CDR1序列、根据SEQ ID NO：36的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：37的CDR 3序列；或根据SEQ IDNO：38的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：39的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：40的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：41的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：42的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：43的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：44的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：45的CDR 2序列和根据SEQID NO：46的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：47的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：48的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：49的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：50的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：51的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：52的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：53的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：54的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：55的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：56的CDR1序列、根据SEQ ID NO：57的CDR 2序列和根据SEQ ID NO：58的CDR 3序列。
在一个更优选实施方案中，第二结合部分包含选自SEQ ID NO：59至76、86或88中任一个的序列，或者这些序列中的任一个，其中任何氨基酸，优选至多20个氨基酸，更优选至多15个，更优选至多10个，更优选至多5个，更优选至多4个，更优选至多3个，更优选至多2个，最优选至多1个独立地被替换，优选根据表3被保守地替换。
在一个最优选实施方案中，第二结合部分包含选自SEQ ID NO：59至72、86或88中的任一个的序列，或者这些序列中的任一个，其中任何氨基酸，优选至多20个氨基酸，更优选至多15个，更优选至多10个，更优选至多5个，更优选至多4个，更优选至多3个，更优选至多2个，最优选至多1个独立地被替换，优选根据表3被保守地替换。
在另一个优选实施方案中，第一结合部分包含SEQ ID NO：85中所示的序列，并且第二结合部分包含SEQ ID NO：86中所示的序列。
在另一个优选实施方案中，第一结合部分包含SEQ ID NO：85中所示的序列，并且第二结合部分包含SEQ ID NO：88中所示的序列。
在另一个优选实施方案中，结合分子包含SEQ ID NO：87中所示的序列或由其组成。
CDR1、CDR2和CDR3序列或框架区可以在物种之间交换。例如，可以从美洲驼免疫球蛋白分子中选择CDR序列，并将其与人免疫球蛋白分子中的CDR序列交换，以获得具有来源于美洲驼CDR序列的特异性的人免疫球蛋白分子。这可能是有利的，因为与包含原始美洲驼框架序列的抗体相比，人序列对人的免疫原性可能较低。这样的序列交换被称为人源化。因此，如由本发明提供的免疫球蛋白分子可具有人来源的免疫球蛋白序列或来源于另一些动物，例如但不限于骆驼科、美洲驼、鲨鱼的免疫球蛋白序列，并且具有被根据本发明的CDR序列替代的CDR1、CDR2和CDR3序列以便提供人CD1d结合。换言之，根据本发明的结合分子可包含具有如本文中所公开的CDR的人源化单结构域抗体。例如，单结构域抗体可具有人框架序列和如本文中所公开的CDR区。
因此，本发明提供了能够使iNKT细胞活化并同时降低Vδ1+T细胞活化的结合分子。在一个优选实施方案中，提供了根据本发明的结合分子或根据本发明应用的结合分子，所述结合分子还包含肿瘤靶向部分。肿瘤靶向部分包含能够与肿瘤抗原特异性结合的结合部分。优选地，所述结合分子还包含能够结合Vγ9Vδ2-TCR并且能够与表1中所示出的任何VHH竞争与Vγ9Vδ2-TCR结合的结合部分。
肿瘤抗原是由引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域公知的，并且包括例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、EGFRvIII、白介素-11受体α(Interleukin-11 receptor alpha，IL-11Rα)、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra或CD213A2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、B7H3(CD276)、Kit(CD117)、碳酸酐酶(CA-IX)、CS-1(也称为CD2亚群1)、黏蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、BCMA、由裂点簇区(breakpoint cluster region，BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Ab1)组成的致癌基因融合蛋白bcr-ab1、受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(HER2/neu)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)、CD19、CD123、周期蛋白B1、凝集素反应性AFP、Fos相关抗原1、肾上腺素受体β3(ADRB3)、甲状腺球蛋白、酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(ephrin type-A receptor 2，EphA2)、晚期糖基化终末产物的受体(RAGE-1)、肾遍在1(renal ubiquitous 1，RU1)、肾遍在2(renal ubiquitous 2，RU2)、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX2)、A激酶锚固蛋白4(A kinase anchor protein 4，AKAP-4)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK)、前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、由T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SquamousCell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3，SART3)、C型凝集素样分子-1(C-type lectin-like molecule-1，CLL-1或CLECL1)、岩藻糖基GM1、globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)、MN-CAIX、上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)、EVT6-AML、转谷氨酰胺酶5(transglutaminase 5，TGS5)、人端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)、聚唾液酸、胎盘特异性1(placenta-specific 1，PLAC1)、肠羧酸酯酶、LewisY抗原、唾液酸化Lewis黏附分子(sialyl Lewisadhesion molecule，sLe)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座K 9(LY6K)、热休克蛋白70-2突变型(heat shock protein 70-2 mutated，mut hsp70-2)、M-CSF、禽v-myc、骨髓细胞瘤病病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)、Ras同源家族成员C(Ras Homolog FamilyMember C，RhoC)、酪氨酸酶相关蛋白2(Tyrosinase-related protein 2，TRP-2)、细胞色素P450 1B1(Cytochrome P450 1B1，CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节物兄弟(Brother of the Regulator of Imprinted Site))、蛋白酶、前列腺-特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)、癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)、LMP2、神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)、肿瘤蛋白p53(p53)、p53突变体、大鼠肉瘤(Ras)突变体、糖蛋白100(gplOO)、prostein、OR51E2、泛连接蛋白3(pannexin 3，PANX3)、前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membraneantigen，PSMA)、前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)、高分子量黑素瘤相关抗原(high molecular weight-melanoma-associated antigen，HMWMAA)、甲型肝炎病毒细胞受体1(Hepatitis A virus cellular receptor 1，HAVCR1)、血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)、血小板来源生长因子受体β(Platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFR-beta)、豆荚蛋白(legumain)、人乳头瘤病毒E6(human papilloma virus E6，HPV E6)、人乳头瘤病毒E7(human papilloma virus E7，HPV E7)、存活素(survivin)、端粒酶、精子蛋白17(spermprotein 17，SPA17)、阶段特异性胚胎抗原4(Stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)、酪氨酸酶、TCRγ替代阅读框蛋白(TCR Gamma Alternate Reading FrameProtein，TARP)、威尔姆斯瘤蛋白(Wilms tumor protein，WT1)、前列腺癌肿瘤抗原1(prostate-carcinoma tumor antigen-1，PCTA-1)、黑素瘤凋亡抑制剂(melanomainhibitor of apoptosis，ML-IAP)、MAGE、黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)、黑素瘤癌睾丸抗原1(melanoma cancer testis antigen-1，MAD-CT-1)、黑素瘤癌睾丸抗原2(melanomacancer testis antigen-2，MAD-CT-2)、由T细胞1识别的黑素瘤抗原(MelanA/MART1)、X抗原家族成员1A(XAGE1)、延伸因子2突变型(elongation factor 2 mutated，ELF2M)、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、N-乙酰基氨基葡萄糖基转移酶V(NA17)、中性粒细胞弹性蛋白酶、肉瘤易位断裂点、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、ephrinB2、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、雄激素受体、胰岛素生长因子(insulin growth factor，IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体、神经节苷脂GD2(GD2)、邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)、神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)、神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGa3p(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(G protein-coupled receptor class C group 5，member D，GPRC5D)、G蛋白偶联受体20(G protein-coupled receptor 20，GPR20)、X染色体开放阅读框61(chromosome X open readingframe 61，CXORF61)、叶酸受体(FRα)、叶酸受体β、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(Receptortyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(Fms-LikeTyrosine Kinase 3，Flt3)、肿瘤相关糖蛋白72(Tumor-associated glycoprotein 72，TAG72)、Tn抗原(TN Ag或(GalNAca-Ser/Thr))、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)、肿瘤内皮标志物1(tumor endothelial marker 1，TEM1或CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(tumor endothelial marker 7-related，TEM7R)、密封蛋白-6(claudin 6，CLDN6)、甲状腺刺激激素受体(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)、尿路斑块蛋白2(uroplakin 2，UPK2)、间皮素、蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、嗅觉受体51E2(Olfactory receptor 51E2，OR51E2)、位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)、CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1，LAIR1)；IgA受体的Fc片段(Fc fragment of IgA receptor，FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 2，LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300 molecule-like family member f，CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(C-type lectin domain family 12 member A，CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的黏蛋白样激素受体样2(EGF-like module-containingmucin-like hormone receptor-like 2，EMR2)；淋巴细胞抗原75(lymphocyte antigen75，LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)；Fc受体样5(Fc receptor-like 5，FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(immunoglobulin lambda-like polypeptide 1，IGLL1)；叶酸受体(FRα)；间皮素；EGFR变体III(EGFR variant III，EGFRvIII)；B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)；GD2；CLL-1；CA-IX；MUC1；HER2；及其任何组合。在一个优选实施方案中，肿瘤抗原选自叶酸受体(FRα)、间皮素、EGFRvIII、IL-13Ra、CD123、CD19、CD33、BCMA、GD2、CLL-1、CA-IX、MUC1、HER2，及其任何组合。在一个实施方案中，肿瘤靶向部分是与以下特异性结合的免疫球蛋白：PD-L1、EGFR、CD40、Her2、PSMA、MUC-1、CEA、c-met、CD19、CD20、BCMA、Her3、AFP、CAIX或CD38。
如已经提及的，根据本发明的结合分子能够产生有益于通过例如iNKT细胞和Vγ9Vδ2 T细胞进行肿瘤细胞杀伤的微环境。因此，提供了用于治疗肿瘤的根据本发明的包含第一结合部分和第二结合部分的结合分子。这样的结合分子不仅对CD1d+肿瘤有效，而且对本身不表达CD1d但(部分)依赖于肿瘤环境中CD1d+抑制性细胞(例如MDSC或肿瘤相关巨噬细胞(tumour-associated macrophage，TAM))的肿瘤也有效。优选地，肿瘤选自恶性血液病例如T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、冒烟型骨髓瘤(smolderingmyeloma)、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、骨髓单核细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病和脾边缘区淋巴瘤，或实体瘤例如肾细胞癌、黑素瘤、结直肠癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、胃食管癌、小肠癌、中枢神经系统肿瘤、髓母细胞瘤、肝细胞癌、卵巢癌、胶质瘤、神经母细胞瘤、尿路上皮癌、膀胱癌、肉瘤、阴茎癌、基底细胞癌、梅克尔细胞癌、神经内分泌癌、神经内分泌肿瘤、原发不明癌(carcinoma of unknown primary，CUP)、胸腺瘤、外阴癌、宫颈癌、睾丸癌、胆管癌、阑尾癌、间皮瘤、壶腹癌、肛门癌和绒毛膜癌。
药物组合物、剂量、施用方式和治疗方法
在另一个主要方面中，本发明涉及药物组合物，其包含
●结合分子，例如抗体，其包含能够与抗体1D12竞争与CD1d分子结合的第一结合部分并且包含能够与Vγ9Vδ2-TCR特异性结合的第二结合部分，其中所述结合分子能够使Vγ9Vδ2 T细胞活化，以及
●可药用赋形剂。
可根据常规技术，例如(Rowe et al.，Handbook of PharmaceuticalExcipients，2012 June，ISBN 9780857110275)中公开的那些，将多肽(例如抗体)与可药用的载体或稀释剂以及任何其他已知的辅料和赋形剂一起配制。可药用的载体或稀释剂以及任何其他已知的辅料和赋形剂应适合于多肽或抗体以及选择的施用方式。对药物组合物的载体和其他组分的适合性基于对本发明的所选择的化合物或药物组合物的所期望生物学特性没有显著的负面影响(例如，小于对抗原结合的显著性影响(10％或更低的相对抑制，5％或更低的相对抑制等))来确定。药物组合物还可包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如非离子洗涤剂，例如吐温20或吐温80)、稳定剂(例如糖或不含蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合于包含在药物组合物中的其他材料。另一些可药用的赋形剂和载体包括与本发明的结合分子在生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。
本发明提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有此需要的对象施用如本文中所限定的结合分子。在一个实施方案中，对象是人。本发明的方法涉及施用有效量的结合分子。“治疗”或其变化形式是指出于减轻、改善、阻止或消除(治愈)症状或疾病状态的目的而施用有效量的根据本发明的治疗活性多肽。“有效量”或“治疗有效量”是指在所需的剂量下和时段内有效达到所期望治疗结果的量。多肽(例如抗体)的治疗有效量可根据因素，例如个体的疾病阶段、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望应答的能力而变化。治疗有效量也是其中治疗有益作用胜过抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。
施用可通过任何合适的途径进行，但是其通常是肠胃外的，例如静脉内、肌内或皮下。用于结合分子(例如抗体)的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。
本发明的结合分子(例如抗体)，也可以以组合治疗施用，即与与待治疗的疾病或病症相关的其他治疗剂组合施用。因此，在一个实施方案中，含抗体的药物与一种或更多种另一些治疗剂例如细胞毒性剂、化学治疗剂或抗血管生成剂组合。这样的组合施用可以是同时的、分开的或依次的。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防疾病(例如癌症)的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用与放射治疗和/或手术组合的治疗有效量的本发明的结合分子或药物组合物。
本发明的另一些方面和实施方案
在另一方面中，本发明提供了包含能够与CD1d分子特异性结合的第一结合部分的结合分子，其中所述结合分子能够降低Vδ1T细胞活化并能够使iNKT细胞活化，所述结合分子用于治疗由CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的病症，优选地用于治疗CD1d限制性Vδ1+外周T细胞淋巴瘤。
在又一方面中，本发明提供了包含能够与CD1d分子特异性结合的第一结合部分并且包含能够与Vγ9Vδ2-TCR特异性结合的第二结合部分的结合分子，其中所述结合分子能够降低Vδ1T细胞活化、能够使iNKT细胞活化，并且能够使Vγ9Vδ2 T细胞活化。
在另一方面中，本发明涉及包含能够与单结构域抗体1D12竞争与CD1d分子结合的第一结合部分的抗体，其用于治疗由CD1d-限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的的病症，优选地用于治疗CD1d限制性Vδ1+外周T细胞淋巴瘤。优选地，所述抗体能够降低Vδ1T细胞活化和/或能够使iNKT细胞活化。
在另一方面中，本发明涉及包含能够与1D12竞争与CD1d分子结合的第一结合部分并且包含能够与Vγ9Vδ2-TCR特异性结合的第二结合部分的抗体，例如双特异性抗体，其中所述结合分子能够使Vγ9Vδ2 T细胞活化。优选地，所述抗体能够降低Vδ1T细胞活化和/或能够使iNKT细胞活化。优选地，第一和/或第二结合部分是单结构域抗体。
制备本发明结合分子的方法
本发明的结合分子，例如多肽，特别是抗体，通常是重组产生的，即通过在合适的宿主细胞中表达编码该多肽的核酸构建体，随后从细胞培养物中纯化所产生的重组多肽。核酸构建体可通过本领域公知的标准分子生物学技术来产生。通常使用载体将构建体引入到宿主细胞中。合适的核酸构建体、载体是本领域已知的。适合于多肽(例如抗体)重组表达的宿主细胞是本领域公知的，并且包括CHO、HEK-293、Expi293F、PER-C6、NS/0和Sp2/0细胞。
实施例
材料
细胞系
将用CD1d稳定转导的经人EB病毒(Epstein-Barr virus)转化的B淋巴母细胞细胞系C1R，以及人细胞系JY在补充有以下的Iscove改良Dulbecco培养基(目录no.12-722F；Lonza，Basel，Switzerland)中培养：10％(v/v)胎牛血清(目录no.SV30160.03；HyClone GEHealthcare，Chalfont，St Giles，UK)、0.05mmβ-巯基乙醇、100IU/ml青霉素钠、100μg/ml硫酸链霉素和2.0mm 1-谷氨酰胺(目录no.10378-016；Life Technologies，Carlsbad，CA)。将用CD1d稳定转导的人宫颈腺癌细胞系HeLa在补充有以下的Dulbecco改良Eagle培养基(目录no.BE12-709F；Lonza)中培养：10％(v/v)胎牛血清、0.05mmβ-巯基乙醇、100IU/ml青霉素钠、100μg/ml硫酸链霉素和2.0mm 1-谷氨酰胺。将具有或不具有mcherry/luc并用CD1d稳定转导的人骨髓瘤细胞系MM.1s、人急性T淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM、用Vδ1硫苷脂CD1d限制性TCR转导的人急性T细胞白血病细胞系Jurkat，以及人急性髓性白血病细胞系MOLM-13和NOMO-1在补充有以下的RPMI-1640(目录no.BE12-115F；Lonza)培养基中培养：10％(v/v)胎牛血清、0.05mmβ-巯基乙醇、100IU/ml青霉素钠、100μg/ml硫酸链霉素和2.0mm 1-谷氨酰胺。CCRF-CEM和MM1.s的遗传特征通过PCR单基因座技术来确定，并发现与公开的DNA谱相同。将细胞进行支原体阴性检测，并频繁通过流式细胞术测试纯度(转染子)。
流式细胞术和单克隆抗体
在该研究中使用了以下抗体：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)缀合的Vδ2、FITC CD69、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)缀合的CD25(目录no 555432和#340907)，以及APC CD3购自BDBiosciences(Franklin Lakes，NJ)。藻红蛋白-花青7缀合的Vα24(目录no.PN A66907)和Vβ11PE(目录no.IM2290)购自Beckman Coulter(Brea，CA)。7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)购自Sigma(St Louis，MO)，PEVγ9购自Biolegend(SanDiego，USA)，PE CD107a购自Miltenyi(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)和FITC膜联蛋白V购自VPS Diagnostics(Hoever，the Netherlands)(目录no.A700)。四聚体在内部制成。除非另有指明，否则在4°下在FACS缓冲液(补充有0.1％BSA和0.02％叠氮化钠的PBS)中进行流式细胞术染色，持续30分钟。在FACS Fortessa(BD Biosciences)上对样品进行分析。
DC、iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞系的产生
moDC和原代人iNKT和γδT细胞如前所述(De Bruin et al(2016)Clin Immunol169：128)产生。简言之，使用CD14 MicroBeads(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)从外周血单个核细胞中分离单核细胞，并将其在存在1000U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Sanofi Leukine，Bridgewater，NJ)和20ng/ml IL-4(目录no.204-IL/CF；R&D Systems，Minneapolis，MN)的情况下，在完全RPMI-1640培养基中培养5至7天，并随后在存在或不存在100ng/mlα-GalCer(目录no.KRN7000；Funakoshi，Tokyo，Japan)的情况下用100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(目录no.L6529；Sigma)成熟，持续48至72小时。使用磁珠分选从健康志愿者的外周血单个核细胞中纯化iNKT细胞，并将其每周在补充有1％人AB血清、10U/ml IL-7(目录no.207-IL/CF；R&D Systems)和10ng/ml IL-15(目录no.34-8159；eBioscience)的Yssel培养基中用成熟的α-GalCer负载的moDC进行刺激。使用磁珠分选从健康志愿者的外周血单个核细胞中纯化γδT细胞，并将其每周在补充有1％人AB血清、100U/ml IL-2(BioVision，Mountain View，Califomia，USA)、10U/ml IL-7和10ng/ml IL-15的Yssel培养基中用帕米膦酸盐(10μM)(PCH，Pharmachemie BV，Haarlem，TheNetherlands)负载的moDC进行刺激。或者，将γδT细胞每周在如上所述补充的RPMI-1640培养基中用经辐照的饲养细胞(两个供体的1×106个混合的PBMC和0.1×106个JY细胞)、10IU/mL rhIL-7、10μg/mL rhIL-15和50ng/mL PHA进行刺激。根据培养密度，将培养的细胞分板接种(split)并添加新鲜的培养基。将纯(＞95％Vα24+Vβ11+或Vγ9+Vδ2+)iNKT和γδT细胞用于实验。
抗CD1d和抗γδTCR特异性VHH的产生
抗CD1d和抗γδTCR特异性VHH如前所述(Lamefis R et al(2016)Immunology 149(1)：111；De Bruin et al(2016)Clin Immunol 169：128)鉴定并产生。无标签1D12、1D22和1D12-5C8由UPE(Utrecht，the Netherlands)产生。
体内异种移植小鼠多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)模型
通过将CD1d+MM细胞静脉内转移到NOD scidγ(NSG)小鼠中，建立了播散性MM模型。将雌性18至26周龄的NSG小鼠(Charles River)用2Gy辐照24小时，然后通过尾静脉静脉内(i.V.)注射2.5×106个MM.1s.mcherry/luc.CD1d细胞(第0天)。在第7、14和21天，将1×107个人iNKT细胞、人γδT细胞或其混合物(1∶1的比)i.V.注射。将小鼠每两周一次腹膜内(i.p.)注射PBS或双特异性抗体1D12-5C8(100μg/小鼠)。当达到预设的人终点时，对小鼠进行安乐死。动物实验已通过荷兰动物科学程序中央机构(Dutch Central Authority forScientific Procedures on Animals)(CCD)批准。
实施例1
iNKT细胞活化的调节
为了评价1D12和1D22刺激或抑制iNKT细胞活化的能力，将5×104个Hela-CD1d细胞/孔接种在96孔组织培养板中，并将其用载剂对照(DMSO 0.01％)或100ng/mlα-GalCer脉冲过夜。然后将细胞用PBS洗涤，并在指定浓度下与培养基或抗CD1d特异性VHH孵育1小时。随后，向每个孔添加5×104个纯且静息的iNKT。在24小时之后，通过CBA(BD Biosciences)对培养上清液的细胞因子产生(的诱导或抑制)进行分析，而收获iNKT细胞并通过流式细胞术对CD25表达进行分析。如图1中可见，我们鉴定出了完全阻断iNKT细胞活化和细胞因子产生(P＜0.0001)并因此识别CD1d-α-GalCer复合物的抗CD1d VHH(克隆1D22)。与之形成鲜明对比的是，即使在不存在外源添加的糖脂Ag的情况下，发现抗CD1d VHH克隆1D12仍能增强CD1d限制性iNKT细胞活化(图1a和c)(P＜0.0001)。
实施例2
Jurkat-Vδ1细胞活化的调节
已知iNKT细胞对接在CD1d的F’袋极端，这与硫苷脂-CD1d限制性Vδ1-T细胞相反，后者更多对接在A’袋。因此，我们评价了1D12和1D22对硫苷脂-CD1d限制性Vδ1-T细胞的作用。为了评价1D12和1D22对Jurkat-Vδ1细胞活化的作用，将1×105个C1R-CD1d细胞/孔接种在96孔组织培养板中，并将其用载剂对照(DMSO 0.05％)或25μg/ml硫苷脂脉冲2小时。然后将细胞与培养基或抗CD1d特异性VHH(100nM(未示出)或1000nM)一起孵育1小时。随后，向每个孔添加5×104个Jurkat-Vδ1。在24小时之后，收获Jurkat-Vδ1细胞，并通过流式细胞术对CD69表达进行分析。如图2B中可见，在共培养期间添加1D12完全消除了Vδ1-Jurkat的活化，而1D22对活化标志物CD69的表达仅具有有限的影响。用100nM或1000nM进行孵育产生了相似的结果(数据未示出)。
为了评价1D12和1D22对Jurkat-Vδ1细胞上CD1d-四聚体结合的作用，将内源性或硫苷脂负载的CD1d-PE四聚体与PBS(对照)、1D12或1D22(VHH∶CD1d的比为约4∶1)在室温下一起孵育30分钟，在此之后向与CD3-APC组合的Jurkat-Vδ1细胞添加四聚体(终浓度四聚体2μg/ml)，并将其在4℃下孵育45分钟。通过流式细胞术对数据进行分析。硫苷脂负载的CD1d四聚体与1D12的孵育完全阻止了与Jurkat-Vδ1细胞的结合，而1D22仅具有有限的影响(图2A)。这些数据支持抗CD1d VHH调节特异性CD1d限制性T细胞的反应性的能力，这与已知的mAb(例如51.1mAb)形成鲜明对比，后者阻断广泛的CD1d限制性T细胞的CD1d-TCR相互作用(Nambiar et al.(2015)MAbs 7：638；Migalovich Sheikhet et al.(2018)Front Immunol9：753)。
实施例3
双特异性抗CD1d-抗Vγ9Vδ2 TCR VHH对iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞的双活化
先前，出于抗肿瘤治疗目的已将良好表征的抗Vγ9Vδ2-TCR VHH与对肿瘤相关抗原具有特异性的VHH融合。CD1d在多种(血液)恶性病上以及肿瘤相关巨噬细胞和髓样来源的抑制细胞上表达，并因此可将其用作抗癌治疗靶标。为了评价1D12-5C8诱导iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞的双活化导致肿瘤靶标裂解的能力，在存在单独的培养基、单价1D12或双特异性1D12-5C8的情况下，将1×105个CCRF-CEM细胞与5×104个iNKT细胞、5×104个Vγ9Vδ2-T细胞或5×104个混合的iNKT/Vγ9Vδ2-T(1∶1的比)一起孵育。在4小时之后，通过CD107a表达测量效应细胞的脱颗粒，并通过流式细胞术对其进行分析。为了评估对靶细胞的细胞毒性，在16小时共培养之后使用流式细胞术细胞计数珠对活CCRF-CEM细胞(膜联蛋白V和7-AAD阴性)进行量化。
为了确定1D12-5C8支持iNKT和Vγ9Vδ2-T扩增并控制肿瘤生长的能力，将来自同一供体的新鲜分离的iNKT和Vγ9Vδ2-T扩增1周。随后将5×104个MM.1s-CD1d细胞与培养基或1D12-5C8(50nM)一起孵育30分钟，在此之后以10∶1的靶标：效应物比添加iNKT、Vγ9Vδ2-T细胞或其混合物(比为2∶3)。在7天之后使用流式细胞术细胞计数珠对活MM.1s-CD1d(或MOLM-13或NOMO-1)、iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞(7-AAD阴性)进行量化。
如图3a中可见，仅在存在1D12-5C8的情况下，观察到iNKT和Vγ9Vδ2-T细胞的稳健的同时脱颗粒。此外，效应细胞活化导致活肿瘤细胞的显著降低(图3b)。
在体内不利的效应物与靶标的比通常需要扩增肿瘤靶向效应细胞以控制肿瘤生长。为了研究在这样的环境下双特异性1D12-5C8 VHH是否可诱导效应细胞扩增和肿瘤控制二者，将MM.1s-CD1d细胞与1D12-5C8一起孵育，在此之后以效应物与靶标的比为1∶10添加iNKT、Vγ9Vδ2-T细胞或其混合物。在7天共培养之后，通过流式细胞术量化这些细胞来评价1D12-5C8诱导扩增和控制肿瘤生长的能力。如图4a中可见，在存在双特异性构建体的情况下观察到iNKT的扩增。然而，仅在存在iNKT细胞和双特异性构建体二者的情况下，Vγ9Vδ2-T细胞才显示出扩增。此外，通过与效应细胞组合的双特异性构建体诱导了稳健的肿瘤生长控制(图4b)。类似地，在急性髓性白血病肿瘤细胞系MOLM-13和NOMO-1下观察到肿瘤生长控制和效应细胞扩增，强调了该双特异性抗CD1d-抗V 9Vδ2-TCR VHH的强抗肿瘤效力和广泛适用性。
实施例4
1D12和1D12-5C8的结合竞争
为了评价1D12结合是否会干扰1D12-5C8结合，将1×105个MM1s-CD1d细胞与PBS(阴性对照，NC)、1D12(1000nM)、1D22(1000nM)或抗CD1d mAb 51.1(100nM)一起孵育45分钟，在此之后在4℃下添加PBS(NC)或NHS-生物素(ThermoFischer Scientific Inc.，Waltham，MA)连接的1D12-5C8(100nM)，持续另外的30分钟。在充分洗涤之后，将样品用链霉抗生物素蛋白-APC(eBioscience，San Diego，CA)染色，并通过流式细胞术进行分析。
为了评价1D12与1D12-5C8之间的竞争，将CD1d表达MM细胞依次与PBS、1D12、1D22(其不应干扰1D12-5C8结合)或抗CD1d mAb 51.1一起孵育，随后与生物素化1D12-5C8一起孵育。然后通过流式细胞术分析链霉抗生物素蛋白-APC的结合来确定1D12-5C8与CD1d复合的能力。如图5中可见，1D12或抗CD1d mAb 51.1(而非1D22)的预孵育极大降低了1D12-5C8结合。
实施例5
体内异种移植小鼠多发性骨髓瘤(MM)模型
在体内模型中研究双特异性CD1d/Vδ2结合抗体1D12-5C8的抗肿瘤效力，其中小鼠i.v.接种有MM.1s.mCherry/luc.CD1d细胞以建立播散性MM模型，随后从肿瘤接种之后7天开始接种3次i.v.输注的人iNKT细胞、人γδT细胞或其混合物(无论是否与1D12-5C8组合)。而每两周一次i.p.给药单独的1D12-5C8没有作用(中位存活：47天相对于49.5天，P＞0.05)，与单独的iNKT(中位存活58.5天)相比，1D12-5C8和iNKT细胞的组合处理显著(p＜0.0001)延长了存活，其中在研究终止(第90天)时所有小鼠仍活着。与用仅人γδT细胞进行处理相比，人γδT细胞和1D12-5C8的处理显示出中位存活从48天提高至60天的趋势(p＝0.16)。与无抗体的单独的细胞混合物(中位存活55天)相比，在每两周一次i.p.给药1D12-5C8下iNKT细胞和γδT细胞二者的输注显著延长了存活，其中7/8只小鼠在研究终止(第90天)时仍活着(p＞0.0001)。
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Claims (19)

1.结合分子，其包含第一结合部分，所述第一结合部分能够与SEQ ID NO：4中所示的单结构域抗体竞争与CD1d分子结合，所述结合分子用于治疗由CD1d限制性Vδ1+T细胞活化引起、维持和/或传播的病症，优选地用于治疗CD1d限制性Vδ1+外周T细胞淋巴瘤。
2.结合分子，其包含能够与SEQ ID NO：4中所示抗体竞争与CD1d分子结合的第一结合部分并且包含能够与Vγ9Vδ2-TCR特异性结合的第二结合部分，其中所述结合分子能够使vγ9Vδ2 T细胞活化。
3.根据权利要求2所述的结合分子，其用作药物。
4.根据权利要求2所述的结合分子，其用于治疗肿瘤。
5.根据权利要求1、3或4所述应用的结合分子或根据权利要求2所述的结合分子，其中所述结合分子能够降低Vδ1 T细胞活化。
6.根据权利要求1或3至5中任一项所述应用的结合分子，或根据权利要求2或5所述的结合分子，其中所述结合分子能够使iNKT细胞活化。
7.根据权利要求1或3至6中任一项所述应用的结合分子，或根据权利要求2、5或6所述的结合分子，其中所述结合分子与SEQ ID NO：4中所示抗体结合CD1d上相同的表位。
8.根据权利要求3或4所述应用的结合分子，或根据权利要求2或5至7所述的结合分子，其中所述第二结合部分能够与具有根据SEQ ID NO：59至76中任一个的序列的单结构域抗体竞争与Vγ9Vδ2-TCR结合，优选地，其中所述第二部分与具有根据SEQ ID NO：59至76中任一个的序列的单结构域抗体结合相同的表位。
9.根据权利要求1或3至8中任一项所述应用的结合分子，或根据权利要求2或5至8中任一项所述的结合分子，其中所述第一和/或第二结合部分是抗体的结合部分。
10.根据权利要求2所述的结合分子，其中所述结合分子与SEQ ID NO：4中所示抗体结合CD1d上相同的表位，其中所述结合分子能够使iNKT细胞活化，并且其中所述第一和第二结合部分是抗体的结合部分。
11.根据权利要求1或3至9中任一项所述应用的结合分子，或根据权利要求2或5至10中任一项所述的结合分子，其中所述第一和/或第二结合部分是单结构域抗体。
12.根据权利要求1或3至9或11中任一项所述应用的结合分子，或根据权利要求2或5至11中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合部分包含根据SEQ ID NO：1的CDR1序列、根据SEQ ID NO：2的CDR2序列和/或根据SEQ ID NO：3的CDR3序列，或者这些序列中的任一个，其中任何氨基酸，优选至多4个氨基酸，更优选至多3个，更优选至多2个，最优选至多1个独立地根据表3被保守地替换。
13.根据权利要求1或3至9或12中任一项所述应用的结合分子，或根据权利要求2或5至12中任一项所述的结合分子，其中所述第一结合部分包含SEQ ID NO：85中所示的序列。
14.根据权利要求3至9或11至13中任一项所述应用的结合分子，
或根据权利要求2或5至13中任一项所述的结合分子，其中所述第二结合部分包含根据SEQ ID NO：5的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：6的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：7的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：8的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：9的CDR 2序列和/或根据SEQ IDNO：10的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：11的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：12的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：13的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：14的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：15的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：16的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：17的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：18的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：19的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：20的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：21的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：22的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：23的CDR1序列、根据SEQ ID NO：24的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：25的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：26的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：27的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：28的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：29的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：30的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：31的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：32的CDR 1序列、根据SEQ IDNO：33的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：34的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：35的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：36的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：37的CDR 3序列；或根据SEQ IDNO：38的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：39的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：40的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：41的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：42的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：43的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：44的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：45的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：46的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：47的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：48的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：49的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：50的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：51的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：52的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：53的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：54的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：55的CDR 3序列；或根据SEQ ID NO：56的CDR 1序列、根据SEQ ID NO：57的CDR 2序列和/或根据SEQ ID NO：58的CDR3序列，或者这些序列中的任一个，其中任何氨基酸，优选至多4个氨基酸，更优选至多3个，更优选至多2个，最优选至多1个独立地根据表3被保守地替换。
15.根据权利要求3至9或11至14中任一项所述应用的结合分子，或根据权利要求2或5至14中任一项所述的结合分子，其中所述第二结合部分包含SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：88中所示的序列。
16.根据权利要求3至9或11至15中任一项所述应用的结合分子，或根据权利要求2或5至15中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子包含SEQ ID NO：87中所示的序列。
17.根据权利要求1、3至9或11至16中任一项所述应用的结合分子，或根据权利要求2或5至16中任一项所述的结合分子，其还包含肿瘤靶向部分。
18.根据权利要求4至17中任一项所述应用的结合分子，其中所述肿瘤选自恶性血液病例如T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、冒烟型骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、骨髓单核细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病和脾边缘区淋巴瘤，或实体瘤例如肾细胞癌、黑素瘤、结直肠癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、胃食管癌、小肠癌、中枢神经系统肿瘤、髓母细胞瘤、肝细胞癌、卵巢癌、胶质瘤、神经母细胞瘤、尿路上皮癌、膀胱癌、肉瘤、阴茎癌、基底细胞癌、梅克尔细胞癌、神经内分泌癌、神经内分泌肿瘤、原发不明癌(CUP)、胸腺瘤、外阴癌、宫颈癌、睾丸癌、胆管癌、阑尾癌、间皮瘤、壶腹癌、肛门癌和绒毛膜癌。
19.药物组合物，其包含结合分子，例如根据权利要求2至18中任一项所述的抗体以及可药用赋形剂。
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