DE3856059T2

DE3856059T2 - Peptid-Determinante mit Einfluss auf die Immunität

Info

Publication number: DE3856059T2
Application number: DE3856059T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Steinman; Scott Zamvil
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1987-08-17
Filing date: 1988-08-17
Publication date: 1998-07-16
Anticipated expiration: 2008-08-18
Also published as: DE3856059D1; ES2109217T3; EP0304279A3; EP0304279A2; EP0805162A1; ATE159952T1; JPH01131124A; EP0304279B1; CA1340012C; GR3025673T3

Description

Die Modulation der Immunantwort wird erreicht durch Verwenden von Peptiden, die ein "Motiv" in der Sequenz aufweisen. Das Motiv definiert Sequenzen eines Immunogens, die verwendet werden können, um die Immunantwort auf ein Antigen zu modulieren. Spezifische Motive werden hinsichtlich endogener Wirtsproteine vermieden.
Säugerspezies haben sich zusammen mit Pathogenen entwickelt, wo der Wirt Mechanismen entwickeln mußte, um sich zu schützen, um zu überleben. Das Immunsystem, das der primäre Schutzmechanismus ist, hatte die Fähigkeit zu entwickeln, auf eine große Vielzahl von lebensbedrohenden Situationen zu antworten, die nicht nur Pathogene umfassen, sondern auch endogene Erkrankungen wie Tumoren und genetische Defekte. Indem es Schutzmechanismen entwickelte, hat das Immunsystem eine Reihe verschiedener Wege entwickelt, wo die einzelnen Wege auf verschiedene Reize reagieren können, um den Wirt zu schützen. Viele der Wege des Immunsystems sind mit dem Nachweis einer fremden antigenen Substanz verbunden, die dann B-Zellen oder T-Zellen stimulieren kann, um eindringende Pathogene davon abzuhalten, zu proliferieren und um toxische Substanzen zu entfernen.
Trotz des außergewöhnlichen Spektrums an Antigenen, mit denen sich das Immunsystem auseinandersetzen muß, muß das Immunsystern in der Lage sein, zwischen selbst und nicht-selbst zu unterscheiden. In vielen Fällen scheitert das Immunsystem, was zu Angriffen führt, die auf endogene Proteine und/oder Zellen gerichtet sind. Solche Autoimmunerkrankungen können extrem schwächend sein und können zum Tode führen.
Die Tatsache, daß Pathogene in der Lage sind, in einen Säuger wirt einzudringen und Krankheit zu verursachen, ist ein Beleg für die Tatsache, daß, während in den meisten Fällen das Immunsystem in der Lage ist, zu verhindern, daß die Infektion tödlich ist, das Immunsystem mit der Infektion fertig werden muß, nachdem sie entstanden ist. Da in vielen Fällen die Krankheit nicht nur schwächend sein kann, sondern auch dauernde Wirkungen haben kann, besteht ein substantielles Interesse daran, zu verhindern, daß sich ein Pathogen, wie beispielsweise ein Virus, ein Bakterium oder anderer Mikroorganismus, festsetzt. Zu diesem Zweck sind Impfstoffe entwickelt worden, die das Immunsystem aktivieren, so daß nach Invasion des targetierten Pathogens das Immunsystem in der Lage ist, schnell zu antworten und den Wirt zu schützen. Es besteht auch ein Interesse daran, das Immunsystem zu modulieren, um organtransplantationen zu erlauben, Autoimmunerkrankungen zu inhibieren und die Wirtsantwort auf Neoplasien oder andere Krankheitszustände nativer Zellen zu verstärken. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse an der Entwicklung von Techniken und Zusammensetzungen, die verbesserten Schutz gegen eine Vielzahl von Erkrankungen erlauben.

Relevante Literaturstellen

Steinman, et al., Nature (1977) 265:173-175, beschreibt die Regulierung von Autosensibilisierung gegen enzephalitogenes Myelinbasisprotein durch Makrophagen- assoz iiertes unlösliches Antigen.
Steinman, et al., Neurology (1980) 30:755-759, beschreibt eine Studie, die lösliches Protein bei der Bewertung von Zelltoleranz gegen Myelinbasisprotein einbezieht. Jahnke, et al., Science (1985) 229:282-284, berichtet von einem Sequenzhomologievergleich zwischen bestimmten viralen Proteinen und Proteinen, die mit Enzephalomyelitis und Neuritis verbunden sind.
Zamvil, et al., Nature (1985) 317:355-358, beschreibt Induktionen von chronischer relapsierender Paralyse und Demyelination durch T-Zellklone, die spezifisch sind für Myelinbasisprotein. Zamvil, et al., Nature (1986) 324:258-260, und Zamvil, et al., J. Immunol. (1987), 139:1075-1079, beschreiben ein T-Zellepitop des Autoantigens Myelinbasisprotein, das Enzephalomyelitis induziert. Sriram, et al., Cellular Immunology (1983) 75:378-382, beschreibt die Wirkung von intravenöser Verabreichung von Myelinbasisprotein von der Maus, das mit syngeneischen Milzzellen gekoppelt ist, um die Induktion von experimenteller allergischer Enzephalitis (EAE) zu induzieren. Siehe auch Sette et al. Nature (1987) 328:395, der Sequenzen mitteilt, die innerhalb des betreffenden Motivs auftreten.
Price et al., J. Immunol. (1986), 136(7):2426-2431, verwendeten die Epitope in einer Region von MBP von Mensch und Rind, um vier monoklonale Antikörper herzustellen, von der die Schlußfolgerung gezogen wurde, daß eher die meiste, wenn nicht die gesamte, Oberfläche eines Proteins immunogen ist, als daß es ein einzelnes dominantes Epitop in der Region 80-89 gibt (wie vor kurzem vorgeschlagen worden war).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Entsprechend einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid vorgesehen, welches eine Sequenz umfaßt von mindestens 9 Aminosäuren aus P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, dessen Sequenz durch nicht mehr als zwei nicht-konservative Läsionen modifiziert ist.
Entsprechend einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid vorgesehen, welches eine Sequenz umfaßt von mindestens 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, umfaßt, dessen Sequenz durch nicht mehr als zwei Läsionen modifiziert ist.
Entsprechend einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid vorgesehen von nicht mehr als 15 Aminosäuren, das eine Sequenz umfaßt von mindestens 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, dessen Sequenz optional durch nicht mehr als zwei nicht-konservative Lasionen modifiziert ist.
Entsprechend einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid vorgesehen von nicht mehr als 15 Aminosäuren, welches eine Sequenz umfaßt von wenigstens 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, dessen Sequenz optional modifiziert ist durch nicht mehr als zwei Läsionen.
Entsprechend einem fünften Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Polypeptids von weniger als 60 Aminosäuren vorgesehen, welches eine Sequenz von 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP) umfaßt, das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, wobei die Sequenz optional bis zu zwei nicht-konservative Läsionen aufweist, für die Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, welches B-Zellen und T-Zellen umfaßt, tolerant zu machen für ein interessierendes Immunogen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.
Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Polypeptids von weniger als 60 Aminosäuren vorgesehen, das eine Sequenz umfaßt von 9 Aminosäuren von P89- 101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, wobei die Sequenz optional bis zu zwei Läsionen aufweist, für die Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, welches B-Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.
Gemäß einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen die Verwendung eines Polypeptids von wenigstens 9 und weniger als 60 Aminosäuren, das eine Sequenz einschließt, die die Aminosäuren HFFK umfaßt, für die Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, welches B-Zellen und T- Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.
Gemäß einem achten Aspekt der Erfindung ist vorgesehen die Verwendung eines Polypeptids, das eine Sequenz aus 9 bis 15 Aminosäuren von hMBP umfaßt und die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, dessen Sequenz modifiziert ist durch nicht mehr als zwei nicht-konservative Läsionen, für die Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, welches B- Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.
Gemäß einem neunten Aspekt der Erfindung ist vorgesehen die Verwendung eines Polypeptids, welches eine Sequenz von 9 bis 15 Aminosäuren von hMBP umfaßt und die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, dessen Sequenz modifiziert ist durch nicht mehr als zwei Lasionen, für die Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, welches B-Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.
Die hierin verwendete Aminosäuresequenznumerierung hinsichtlich MBP ist so, wie in Martenson, 1984, in Experimental Allergic Encephalomyelitis. A Useful Model for Multiple Sclerosis. Alvard, ed Alan Liss, NY, angegeben (siehe infra unter Experimental, Synthetic MBP Peptides); wobei dem nicht entgegensteht, daß andere Numerierungssysteme manchmal verwendet worden sind, z.B. in Price et al (oben), wo die korrespondierende Aminosäuresequenz 87-99 wäre.
Neue Oligopeptide und ihre Verwendung werden beschrieben, um das Immunsystem hinsichtlich eines speziellen Immunogens zu modulieren. Die Oligopeptide umfassen eine Aminosäuresequenz, die durch ein "Motiv" definiert wird&sub1; die in dem interessierenden Immunogen vorhanden ist. Das das Motiv enthaltende Ohgopeptid wird mindestens 9 Aminosäuren aufweisen und braucht nicht mehr als etwa 15 Aminosäuren der Sequenz des Immunogens aufzuweisen, gewöhnlich mit der definierten Motivsequenz, die verschieden ist von der C-terminalen Sequenz der Oligopeptidsequenz. Eine oder mehrere Sequenzen können in demselben Immunogen identifiziert werden, das die definierte Motivsequenz aufweist. Oligopeptide, die diese Sequenzen enthalten, können in einer einzelnen Zusammensetzung verwendet werden, um mit einer Vielzahl von Haplotypen wirksam zu sein. Das die Immunogenmotivsequenz enthaltende Fragment kann durch sich selbst verwendet werden als Teil eines größeren Fragmentes, wo das Immunogen an eine andere als die Wildtypsequenz gebunden ist, oder kann kovalent an andere organische Moleküle gebunden sein, entweder Proteine oder Nicht-Proteinmoleküle.
Wenn man von einem Epitop spricht, wird das Epitop das Grundelement oder die kleinste Einheit der Erkennung durch einen Rezeptor sein, insbesondere Immunglobuline und T-Zellrezeptoren, wo die Sequenz benachbart oder nicht-benachbart sein kann, und die Aminosäuren, die für die Rezeptorerkennung essentiell sind, in der Sequenz benachbart oder nicht-benachbart sein können. T-Zellepitope beteiligen benachbarte Reste, während Immunoglobulinepitope Konformationsdeterminanten sind und entweder benachbart oder nicht-benachbart sein können.
Die Immunantwort, die moduliert wird, gründet sich auf einen ternären Komplex, der eine Zelle mit einem Transplantationsantigen, einen T-Zellrezeptor, der durch das Transplantationsantigen beschränkt ist, und ein Polypeptid umaßt, das spezifisch an die Kombination aus Transplantationsantigen und T- Zellrezeptor bindet. Die Transplantationsantigene können in zwei Klassen, Klasse I und Klasse II geteilt werden. Klasse I ist relativ ubiquitär, wird auf den meisten kernhaltigen Zellen eines Säugerwirts gefunden und weist ein polymorphes 45 Kd Transmembranprotein auf, das nicht-kovalent assoziiert ist mit einem 12 Kd nicht-polymorphen Protein "β&sub2;-Mikroglublin". Im Gegensatz dazu sind Klasse II-Transplantationsantigene beschränkt auf relativ wenig Sätze von Zellen, in erster Linie Lymphozyten, Makrophagen, und dendritische Zellen und umfassen polymorphe α- und β-Ketten. Im Falle von Transplantationsantigenen der Klasse I ist man in erster Linie befaßt mit zellulären Aberrationen oder Erkrankungszuständen, wie beispielsweise virale Infektion, Mycoplasmeninfektion, Neoplasien, oder dergleichen, oder mit Organtransplantaten. Die beteiligten T-Zellen werden normalerweise die Zerstörung der aberranten Zellen verursachen.
Im Gegensatz dazu sind Transplantationsantigene der Klasse II mit der Aktivierung des zellulären Immunsystems befaßt, was zur Expansion von Zellen führt, die mit dem Schutz des Wirts gegen aberrante physiologische Zustände befaßt sind. Die aberranten physiologischen Zustände können einhergehen mit Invasionen von Pathogenen, einschließlich Viren, Bakterien, Pilzen, Protisten, Toxinen oder dergleichen. Zusätzlich können Zellen der Klasse II mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen einhergehen, wie beispielsweise rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematosus, Diabetes, Multipler Sclerose, etc., ebenso wie mit jenen zellulären Aberrationen oder Erkrankungszuständen, die mit Transplantationsantigenen der Klasse 1 verbunden sind.
Transplantationsantigene der Klasse I sind auch bei der Abstoßung von Organtransplantaten beteiligt. Das Immunsystem ist in der Lage, die fremde Natur der Transplantationsantigene, die auf dem transplantierten Organ präsent sind, zu erkennen und das Organ anzugreifen. In dieser Situation wünscht man nicht, den Wirt vor den fremden Zellen zu schützen, sondern den Teil des Immunsystems, der spezifisch ist für das Angreifen des Organtransplantates ist, zu verringern.
In vielen Situationen wird auch ein Interesse dahingehend bestehen, Lymphozytenantwort in vitro zu kontrollieren. Diese Situationen können spezifisches Zerstören von Zellen, die mit Mycoplasmen oder Viren infiziert sind, Entfernen einer speziellen Untergruppe von Zellen aus einer Mischung von neoplastischen und normalen Zellen, Expandieren einer speziellen Untergruppe oder Untergruppen von Zellen in einer Mischung, Vorsehen von konditioniertem Medium zur Herstellung verschiedener Lymphokine, wie IL-2, oder dergleichen, umfassen. Das in vitro System kann Vollblut, Plasma, Serum, zelluläre Fraktionen, normale oder immortalisierte Zellen etc. umfassen.
Die Motivsequenz wird Teil einer Sequenz eines interessierenden Immunogens sein, wobei gewöhnlicherweise mehr als eine Teilsequenz in dem Immunogen sein wird, das das interessierende Motiv einschließt. Das Oligopeptid, das das interessierende Motiv umfaßt, kann von irgendeiner Stelle der Immunogensequenz sein, d.h. N-terminal oder C-terminal proximal oder zentral, wo die Oligopeptidsequenz normalerweise im wesentlichen homolog sein wird mit von 9 bis 15 Aminosäuren der Immunogensequenz, obwohl längere Sequenzen auch verwendet werden können.
Gewöhnlicherweise wird der Unterschied in der Homologie nicht mehr als zwei nicht-konservative Läsionen sein, noch gewöhnlichererweise nicht mehr als zwei Läsionen, die Insertionen, Deletionen, konservative oder nicht-konservative Substitutionen sein können.
Gewöhnlicherweise wird die in dem Oligopeptid vorhandene Motivsequenz an einem anderen als dem C-Terminus des Oligopeptids sein, wünschenswerterweise am N-Terminus und nicht näher am C-Terminus, als das Zentrum der Sequenz, wo die zweite, dritte oder vierte Aminosäure des Motivs (abhängig davon, ob vier oder fünf Aminosäuren in dem Motiv sind) die zentrale Aminosäure ist.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung werden gewöhnlich wenigstens eine Sequenz eines interessierenden Immunogens umfassen, einschließlich des interessierenden Motivs, und kann zwei oder mehr Oligopeptidmotive umfassen, die Sequenzen von etwa 9 bis 15 Aminosäuren enthalten, die in dem Immunogen vorhanden sind, abhängig von der Anzahl von in dem Immunogen vorhandenen Motiven. Wenn somit eine Vielzahl von Motiven in dem Immunogen vorhanden sind, können alle oder weniger als alle der Sequenzen, die die Motive einschließen, in einer einzigen Zusammensetzung verwendet werden. Gewöhnlicherweise wird es nicht mehr als 10 verschiedene Motiv umfassende Oligopeptide geben, gewöhnlichererweise nicht mehr als etwa 6 verschiedene Oligopeptide in der Zusammensetzung.
Die in dieser Erfindung verwendeten Oligopeptide, die Motiventhaltende Regionen definieren und nicht an heterologe Sequenzen gebunden sind (das sind andere Sequenzen als die natürlichen Sequenzen, an die sie normalerweise gebunden sind), werden nicht natives Myelinbasisprotein einschließen.
Beim Herstellen der interessierenden Zusammensetzungen würde man ein interessierendes Immunogen auswählen, gegen das eine Immunantwort eines Wirts moduliert werden soll. Somit kann das interessierende Immunogen ein mit einem Pathogen assozuertes Protein sein. Pathogene schließen ein Viren, Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, Pilze, Protisten etc. Das interessierende Immunogen kann ein Capsidprotein, ein Enzymprotein, ein Hüllprotein, ein Oberflächenmembranprotein oder irgendein anderes Protein sein, das natürlicherweise eine Immunantwort induzieren kann, die bei der Verteidigung des Wirts gegen das Pathogen hilft. Andere interessierende Proteine werden Säugerproteine einschließen, wie Transplantationsantigene, Oberflächenmembranproteine, die mit der Blutgruppe assoziiert sind, oder anderes zelluläres Protein, das durch ein Wirtsimmunsystem als fremd erkannt werden kann. Eine dritte Gruppe von Oligopeptiden wird mit Proteinen assoziiert sein, die für den Wirt endogen sind, verbunden mit Autoimmunerkrankungen, wo das Oligopeptid dazu dienen kann, den Wirt tolerant zu machen, um einen Immunangriff gegen das endogene Protein oder die Zelle zu verhindern, die das endogene Protein herstellt. Andere Immunogene werden auch von Interesse sein.
Das spezielle interessierende Protein wird auf die Gegenwart des interessierenden Motivs und eine oder mehrere Sequenzen, die das ausgewählte Motiv einschließen, gescreent werden. Wo der Haplotyp des beabsichtigten Rezipienten bekannt ist, kann eine Sequenz gegenüber einer anderen bevorzugt sein. Wo jedoch der Haplotyp nicht bekannt ist&sub1; oder die Zusammensetzung einer Anzahl verschiedener Wirte verabreicht werden kann, wird es häufig wünschenswert sein, eine Anzahl der Sequenzen als Ohgopeptide in derselben Zusammensetzung zu kombinieren. Die Oligopeptide können als die einzelnen Peptide vorliegen, oder miteinander verbunden sein in einer einzigen Sequenz, mit oder ohne dazwischenliegenden Brücken, wo irgendwelche Brücken anders sein werden als die natürlicherweise auftretenden dazwischenliegenden Sequenzen des Immunogens. Wünschenswerterweise würde irgendeine derartige Sequenz weniger als 100 Aminosäuren aufweisen, gewöhnlichererweise weniger als etwa 60 Aminosäuren.
Die interessierenden Oligopeptide können auf eine Vielzahl von Wegen modifiziert werden. Zu Zwecken der Tolerierung können die interessierenden Peptide mit syngeneischen Milzzellen konjugiert werden, oder an Immunogen geknüpft werden, gegen das der Wirt kürzlich immunisiert worden ist, wie z.B. Tetanustoxoid, Rinderserumalbumin etc. Adjuvanzien werden normalerweise vermieden. Alternativ kann das Oligopeptid für Immunisierung verwendet werden (Steinman et al., Nature (1977) 265:173-177; und Steinman et al., Neurology (1980) 30:755-759). Um die Immunantwort gegen eine Vielzahl von Immunogenen zu verstärken, die mit demselben oder einem verschiedenen Organismen verbunden sein können, wie bereits hingewiesen, können die interessierenden Oligopeptide mit Oligopeptiden verknüpft sein, die dasselbe oder ein anderes Motiv desselben Immunogens teilen doer assoziiert sind mit einem Epitop eines anderen Immunogens. Das Epitop kann oder kann nicht das interessierende Motiv einschließen. Somit wird das resultierende Polypeptid in der Lage sein, das Immunsystem für eine Vielzahl von Immunogenen, die mit demselben oder anderen Organismus verbunden sind, zu aktivieren, zu inaktivieren oder tolerant zu machen. Dieser Ansatz weist besondere Vorteile dort auf, wo Vakzine gegen eine Reihe von Erkrankungen verwendet werden, wie beispielsweise der TORCH-Komplex, verschiedene Kindererkrankungen, Erkrankungen, die für bestimmte Orte endemisch sind, und dergleichen.
Die interessierenden Oligopeptide können nicht nur an andere Oligopeptide, oder Proteine, gebunden sein, sondern können mit einer Vielzahl von Nicht-Proteinprodukten, besonders Lipopolysacchariden, Polysacchariden, Lipiden, Glyceriden und dergleichen, konjugiert sein. In vielen Fällen können diese Verbindungen inaktivierte Toxine sein, die die Herstellung von neutralisierenden Antikörpern besorgen oder verschiedene zytotoxische T-Zellen für ein spezielles Pathogen aktivieren.
Transplantationsantigene weisen polymorphe Regionen auf, wo die individuellen Allele mit spezifischen Wirten verbunden sind. Für den größten Teil wird der Wirt diploid und heterozygot sein, so daß jeder Wirt zwei Haplotypen aufweisen wird, was bedeutet, daß es zwei verschiedene Kopien eines speziellen Transplantationsantigentyps vom selben Locus gibt, sofern der Wirt nicht homozygot an dem speziellen Locus ist. Somit werden, was einen einzelnen Wirt oder eine Vielzahl von Wirten anbelangt, Mischungen von Oligopeptiden gewöhnlicherweise verwendet werden.
Die vorliegenden Zusammensetzungen finden Verwendung in einer Vielzahl von Wegen, die mit dem Immunsystem verbunden sind. Die interessierenden Zusammensetzungen können als Vakzine verwendet werden zum Aktivieren der Immunantwort auf ein spezielles Pathogen oder Toxin. Die interessierenden Zusammensetzungen können verwendet werden, um ein Individuum, im Falle eines Organtransplantates, tolerant zu machen, so daß die Abstoßung des Organtransplantates oder Graft vs host-Erkrankung wesentlich verringert werden kann. Die interessierenden Zusammensetzungen können auch verwendet werden, um vor Autoimmunerkrankungen zu schützen, so daß das Immunsystem gehindert werden wird, native Proteine oder Wirtszellen anzugreifen. Die interessierenden Zusammensetzungen können verwendet werden bei der Behandlung von Krebs. Andere Situationen, die das Immunsystem beteiligen, können auch die interessierenden Zusammensetzungen in vorteilhafter Weise verwenden.
Abhängig von der speziellen Anwendung können die interessierenden Zusammensetzungen in einer Vielzahl von Wegen verabreicht werden, durch sich selbst oder in Verbindung mit verschiedenen Zusätzen. Die interessierenden Zusammensetzungen können mit verschiedenen Adjuvanzien kombiniert werden, wie beispielsweise Alum, BOG, Ölen, Muramyl-Dipeptid. Alternativ können die interessierenden Zusammensetzungen kovalent verbunden werden durch irgendeine herkömmliche Verbindungsgruppe an ein geeignetes Immunogen, wie beispielsweise Tetanustoxoid, Gamma-Globulin vom Rind, Keyhole limpet-Hämozyanin etc. Verschiedene Träger können verwendet werden, die physiologisch akzeptabel sind, wie beispielsweise Wasser, Alkohol, Sahne, Phosphat gepufferte Sahne, Zucker, Mineralöl, etc. Andere Additive können auch umfaßt werden, wie beispielsweise Stabilisatoren, Detergenzien, Aromastoffe, Eindickmittel etc. Die Menge an verabreichtem aktiven Ingrediens wird weit schwanken, abhängig von der speziellen Zusammensetzung, dem speziellen Wirt, der Anzahl und Häufigkeit der Verabreichungen, der Art und Weise der Verabreichungen etc. Gewöhnlicherweise werden es von etwa 0,01 bis 10 ug/kg des Wirts, gewöhnlichererweise von etwa 0,05 bis 5 ug/kg des Wirts sein, wobei die Konzentration zwischen 10 ug/ml bis 1 mg/ml schwanken kann.
Die Art und Weise der Verabreichung kann in weitem Umfang variiert werden, abhängig von der Formulierung und Natur des aktiven Ingrediens. Die Verabreichung kann parenteral, intravaskular, peritoneal, subkutan, oral etc. sein, kann Katheter, Pumpen, Membranen mit konstanter Diffusion etc. verwenden.
Die interessierenden Zusammensetzungen können auch verwendet werden zu diagnostischen Zwecken, um T-Zellen nachzuweisen, die an das Oligopeptid binden. Somit kann das interessierende Oligopeptid verwendet werden in Verbindung mit einem Transplantationsantigen und T-Zellen, um die Größe der T-Zellpopulation zu bestimmen, die durch eine spezielle Sequenz stimuliert wird. Das interessierende Peptid kann auch verwendet werden in kompetetiven Bestimmungen, um Bindungsaffinität von Oligopeptiden zu vergleichen.
Die interessierenden zusammensetzungen können in vielfältiger Weise verwendet werden. Die Oligopeptide können gemäß herkömmlichen Synthesetechniken synthetisiert werden, insbesondere automatisierte Synthesemaschinen, oder können hergestellt werden durch rekombinante Techniken, wo eine geeignete DNA-Sequenz für die Insertion in eine Expressionskassette zur Expression in einem Mikroorganismenwirt erdacht wird. Besonders dort wo das Oligopeptid an ein oder mehrere andere Oligopeptide gebunden werden wird, können die rekombinanten Techniken in vorteilhafter Weise verwendet werden.
Eine große Anzahl von Expressionsvektoren sind kommerziell erhältlich oder in der Literatur beschrieben, wobei die Expressionsvektoren transkriptionelle und translationelle Insertions- und Terminationsregionen einschließen, die durch einen Polylinker getrennt sind, der eine Vielzahl von nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen aufweist. Sequenzen können hergestellt werden, die für das interessierende Oligopeptid oder Polypeptid codieren, oder dessen Sequenz in den Polylinker zur Expression in den Wirt inseriert werden kann. Falls erwünscht, kann die Sequenz mit einer Signalsequenz hergestellt werden, so daß das Produkt sekretiert und prozessiert wird, um das reife Polypeptid zu liefern.
Alternativ kann das Polypeptid kovalent an ein weiteres Polypeptid oder anderes Molekül konjugiert werden, indem eine geeignete Funktionalität vorgesehen wird, die als eine Stelle zum Verknüpfen verwendet werden kann. Zum Beispiel kann ein cystein verwendet werden, um mit einem aktivierten Olefin, z.B. Maleimid, zu reagieren, um einen Thioether zu bilden. Alternativ kann das Oligopeptid modifiziert werden an seinem N-Terminus, um eine Verknüpfungsstelle vorzusehen, insbesondere wo das Oligopeptid synthetisiert wird, was eine Vielzahl von funktionellen Gruppen einschließen kann. Wenn passend, kann das synthetisierte Oligopeptid konjugiert werden, wenn es noch an einen Träger gebunden ist, gefolgt vorn Entfernen des Konjugats vom Träger. Alternativ kann ein Tyrosin verwendet werden, das durch eine Diazo-Gruppe verknüpft werden kann. Andere herkömmliche Techniken können auch verwendet werden.
Die interessierenden Oligopeptide können von einer großen Vielzahl von Organismen abgeleitet werden, einschließlich Pathogenen, wie beispielsweise Retroviren, wie beispielsweise das menschliche Retrovirus HTLV1-4, Pseudomonas, Bordatella pertussis, Herpes simplex-Virus I und II. Eine Anzahl von Pathogenen sind in U.S. Patentnr. 4,208,479 aufgelistet, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die folgenden Sequenzen können mit Vorteil in den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein, um tolerant zu machen. G-A-P-S; G-A-V-G; E-W-V-S; K-V-P-T; G-V-V- L-G; G-A-V-I-G; G-I-L-G; K-A-A-S (verbunden mit P&sub0;) ; Ac-A-S-Q-K-R; K-Y-L-A-T; G-I-L-D; R-F-F-G; K- I-F-K (verbunden mit P&sub1;) ; Ac-S-N-K-F-L; K-F-L-G; K-L- V-S; E-Y-M-K; G-L-A-T; R-V-I-I-S; K-M-V-V-E; R-I-Y-E (verbunden mit P&sub2;) ; G-L-L-E; K-L-I-E; H-A-F-Q; G-A-V- R; K-W-L-G; K-F-V-G; R-M-Y-G; K-L-M-G (verbunden mit PLP) ; und L-V-A-K; K-I-W-R; E-W-V-I-K; K-V-F-I-D; K-I- F-T; K-Y-I-A-E (verbunden mit AChR). Diese Sequenzen werden normalerweise Teil von Oligopeptidsequenzen von 9 bis 15 oder mehr Aminosäuren sein, wie beschrieben für die anderen Motive.
Die folgenden Beispiele werden zu Zwecken der Veranschaulichung und nicht zu Zwecken der Beschränkung angeboten.

EXPERIMENTE

Die Determinante von Myelinbasisprotein (MBP) PS-17 (Zamvil, et al., Nature, aaO.) enthält ein Muster P-S-Q-R-H-G-S-K-Y-L- A-T-A. Unter Verwendung des Algorithmus für das interessierende Motiv zum Vorhersagen von T-Zellklonen wurde das Epitop des Klons F1-28, eine MBP-spezifische T-Zelle, isoliert (Zamvil et al., J. ExP. Med. (1985) 162:2107), der Klon das Autoantigen Myelinbasisprotein erkennt. Ein Peptid, das den Aminosäuren P35-47 entspricht und zwei Muster GILD und RFFS enthält, wurde synthetisiert und gezeigt, daß es stimulierend wirkt. Die getestete Peptiddeterminante war G-I-L-D-S-I-G-R-F-F-S-G-D-R-G- A-P. Man zeigte mit überlappenden Peptiden, daß das stimulierende Epitop tatsächlich aus L-D-S-I-G-R-F-F-S-G-D-R-G-A-P besteht (Zamvil, et al., Nature (1986) 324:258).
Bei einer anderen Erkrankung, Myasthenia gravis, wurde ein T- Zellepitop entdeckt durch Verwendung des interessierenden Algorithmus, um synthetische Peptide des Acetylcholinrezeptors zu konstruieren. Das Peptid AChR P215-232, D-T-P-Y-L-D-I-T-Y- H-F-V-M-Q-R-L-P-L war besonders stimulierend in einer Anzahl von Myasthenikern. Andere stimulierende Peptide schlossen 277- 291 und 330-347 ein, die dem interessierenden Algorithmus folgten. Antigen-spezifische T-Zellklone werden aus Lymphozyten des peripheren Blutes (PBL) isoliert, in vitro kultiviert mit Antigen und syngeneischen bestrahlten PBL als Antigen-präsentierende Zellen (APL) (Ounningham et al., J. Gen. Virol. (1985) 66:249); Eckles et al., Nature (1981) 301:716).
Um autoimmunogene Peptide tolerigen zu machen, können diese Peptide mit Lymphozyten konjugiert werden (Sriram, et al., 1983, aaO.) oder durch Koppeln des Peptids an einen Träger, wie beispielsweise Tetanustoxoid oder Rinderserumalbumin, unter Verwendung herkömmlicher Verbindungsgruppen (Herzenberg et al., Ann. Rev. Imm. (1983) 1:609-632).

Synthetische MBP-Peptide:

Peptide, die den Aminosäuresequenzen von (R) Ratten- und (B) Rinder-MBP (Martenson, 1984, In Experimental Allergic Encephalomyelitis. A Useful model for multiple sclerosis. Alvard, Hrsg. Alan Liss, N.Y.) entsprechen, wurden wie kürzlich beschrieben synthetisiert unter Verwendung von Festphasentechniken (Erickson und Merrifield, 1976, In The Proteins Vol 2, Neurath, Hrsg. Academic Press, NY, 5. 255). Peptide wurden von den verschiedenen organischen Nebenprodukten getrennt und die Reinheit wurde durch Hochdruckflüssigphasensäulen (Merck, Darmstadt, Deutschland) und durch Aminosäureanalyse bestimmt. Diese Peptide wurden nicht weiter gereinigt, da sie alle mehr als 90 % des erwünschten Produktes enthielten.
Die oben beschriebenen interessierenden Peptide wurden in den folgenden Testprozeduren verwendet:
Proliferationstest: Proliferative Antworten wurden wie kürzlich beschrieben (Zamvil et al., Nature (1985) 317:355) bestimmt. 1x10&sup4; T-Zellen wurden mit 5x10&sup5; röntgenbestrahlten (3000 Rad) PL/J-Milz-APC in 0,2 ml Kulturmedium in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen mit Flachboden (Falcon, 3072) kultiviert. Peptide wurden zur Kultur zugesetzt und wobei sich die angezeigten Endkonzentrationen ergaben. Nach 48-stündiger Inkubation wurde jeder Napf mit 1 uCi ³H-Thymidin gepulst und 16 Stunden später geerntet. Der mittlere cpm-Thymidin-Einbau wurde für Dreifachkulturen berechnet. Standardabweichungen von Replikakulturen waren innerhalb des 10 % Mittelwertes.
Man fand, daß P35-47 des menschlichen Myelinbasisproteins (MBP), das das RFFS-Motiv umfaßt, stimulierend wirkt mit Maus T-Zellen, die durch MHC I-EuαEuβ beschränkt waren; man fand, daß PS-17 von menschlichem Myelinbasisprotein, das das Motiv KYLAT umfaßt, stimulierend wirkt mit Maus T-Zellen, die durch I-AsαAuβ oder I-AuαAuβ beschränkt waren; und man fand, daß P89- 101 des menschlichen Myelinbasisprotein, das das Motiv HFFK umfaßt, stimulierend wirkt mit Maus T-Zellen, die durch I-AsαAsβ beschränkt waren.
Der Algorithmus kann verwendet werden, um zu definieren, welcher immunogener Teil eines Autoantigens Sequenzhomologie mit Pathogenen teilt. Zum Beispiel im Falle von MBP teilte mit P35-47 Paramyxoviren und Influenza und MBP 89-101 teilte mit Picorna-Virus, wobei die kritische Sequenz, die die T-Zelle triggert mit einem Pathogen geteilt wird.
Es ist offensichtlich aus den obigen Ergebnissen, daß Sequenzen identifiziert und verwendet werden können als Peptide, um das Immunsystem in einer Vielzahl von Wegen zu modulieren. So kan als ein Beispiel ein Wirt gegen autoimmunogene Peptide tolerant gemacht werden durch Verwendung der interessierenden Peptide als Tolerogene in einer Toleranz erzeugenden Art und Weise. In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, den Wirt zu immunisieren, um einen weiteren Angriff gegen endogene Zellen oder Komponenten zu inhibieren. Das Verfahren sieht weiter Schutz gegen verschiedene Erkrankungen vor, die aus Impfung resultieren, durch Eliminieren irgendwelcher Sequenzen, die in Beziehung zu stimulatorischen Sequenzen stehen, die in endogenen Proteinen gefunden werden, insbesondere Proteinen, die mit dem Nervensystem zu tun haben.
Alle erwähnten Publikationen und Patentanmeldungen in dieser Beschreibung sind ein Anzeichen für den Grad der Qualifikation der Fachleute, die diese Erfindung betrifft. Alle Publikationen und Patentanmeldungen werden hierin durch Bezugnahme in demselben Umfang aufgenommen, als ob jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Bezugnahme aufgenommen angezeigt worden wäre.

Claims

1. Ein Polypeptid, welches eine Sequenz von wenigstens 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, umfaßt, dessen Sequenz durch nicht mehr als zwei nicht-konservative Läsionen modifiziert ist (und dadurch natives hMBP-Protein ausschließt).

2. Ein Polypeptid, welches eine Sequenz von wenigstens 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, umfaßt, dessen Sequenz modifiziert ist durch nicht mehr als zwei Läsionen (und dadurch natives hMBP-Protein ausschließt).

3. Ein Polypeptid von nicht mehr als 15 Aminosäuren, welches eine Sequenz von wenigstens 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, umfaßt, dessen Sequenz optional modifiziert ist durch nicht mehr als zwei nicht-konservative Läsionen.

4. Ein Polypeptid von nicht mehr als 15 Aminosäuren, welches eine Sequenz von wenigstens 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Basisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, umfaßt, dessen Sequenz optional modifiziert ist durch nicht mehr als zwei Läsionen.

5. Ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Polypeptid weniger als 100 Aminosäuren aufweist.

6. Ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Polypeptid weniger als 60 Aminosäuren aufweist.

7. Ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid bis zu 15 Aminosäuren aufweist.

8. Ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, um ein Säugerwirtsimmunsystem, das B-Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.

9. Die Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, das B-Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.

10. Die Verwendung eines Polypeptids von weniger als 60 Aminosäuren, welches eine Sequenz von 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hBMP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, umfaßt, wobei die Sequenz optional bis zu zwei nicht-konservative Läsionen aufweist, umfaßt, bei der Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, das B-Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen durch ein Transplantationsantigen des Wirts beschränkt ist.

11. Die Verwendung eines Polypeptids von weniger als 60 Aminosäuren, das eine Sequenz von 9 Aminosäuren von P89-101 von menschlichem Myelinbasisprotein (hMBP), das die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, umfaßt, wobei die Sequenz optional bis zu zwei Läsionen aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, das B-Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen durch ein Transplantationsantigen des Wirts beschränkt ist.

12. Die Verwendung nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, wobei die Sequenz eine Länge von 9 bis 15 Aminosäuren aufweist.

13. Die Verwendung eines Polypeptids von wenigstens 9 und weniger als 60 Aminosäuren, einschließlich einer Sequenz, die die Aminosäuren HFFK umfaßt, bei der Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, das B-Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.

14. Die Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid nicht länger als 15 Aminosäuren ist.

15. Die Verwendung eines Polypeptids, das eine Sequenz von 9 bis 15 Aminosäuren von hMBP umfaßt und die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, dessen Sequenz durch nicht mehr als zwei nicht-konservative Läsionen modifiziert ist, bei der Herstellung eines Medikaments&sub1; um ein Säugerwirtsimmunsystem, das B-Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.

16. Die Verwendung eines Polypeptids, das eine Sequenz von 9 bis 15 Aminosäuren von hMBP umfaßt und die Stelle aus Aminosäuren HFFK einschließt, dessen Sequenz modifiziert ist durch nicht mehr als zwei Lasionen, bei der Herstellung eines Medikaments, um ein Säugerwirtsimmunsystem, welches B-Zellen und T-Zellen umfaßt, für ein interessierendes Immunogen tolerant zu machen, wobei das Immunogen beschränkt ist durch ein Transplantationsantigen des Wirts.

17. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei die Sequenz durch chemische Mittel mit einem weiteren Epitop von hMBP verbunden ist.

18. Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Sequenz durch chemische Mittel mit einem weiteren Epitop von hMBP verbunden ist.