JP2512796B2 - 自己抗原の経口投与による自己免疫疾患の治療法 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 発明の名称 自己抗原の経口投与による自己免疫疾患の治療法 本出願は、1987年６月24日に出願され、“自己抗原の
経口投与による自己免疫疾患の治療”なる名称を有する
米国特許出願第065,734号の一部継続出願である。

発明の背景 発明の分野 本発明は、自己免疫疾患、とりわけＴ細胞媒介性また
はＴ細胞依存性自己免疫疾患の治療の分野に関するもの
である。本発明は、これらの自己免疫疾患を予防的およ
び治療的に処置するための、自己抗原、またはそのフラ
グメントまたは類似体の経口または腸内投与を教示する
ものである。

背景となる技術の簡単な説明 自己免疫疾患は、正常な組織に対する細胞または抗原
の関与する異常な免疫応答によって生じる。自己免疫疾
患を抑制するために、免疫応答を非特異的に抑制する非
常に顕著な薬物を含む、多数の方法が開発された。免疫
応答を妨げるために抗原の経口投与によって免疫寛容を
誘導する方法は、ウェルズ（Wells）によって1911年に
初めて示された。ウェルズ（Wells,H.,J.Infect.Dis. 9:
147（1911））。免疫不応答の経口的誘導も、数種類の
Ｔ細胞依存性抗原について示された。ヌガン等（Ngan,
J.et al.,J.Immunol. 120:861（1978））、ゴウタム等
（Gautam,S.et al.,J.Immunol. 135:2975（1985））、タ
イタス等（Titus,R.et al.,Int.Arch.Allergy Appl.Imm
un. 65:323（1981））。また、最近の文献は、マウスモ
デルにおけるコラーゲン誘発性関節炎を抑制するため
の、コラーゲンの経口投与を記載している。ナグラー−
アンダーソン（等（Nagler-Anderson et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci(USA) 83:7443-7446（1986）。

科学者らはまた、種々の動物モデルにおいて、自己免
疫疾患を抑制するための方法を研究した。実験的アレル
ギー性脳脊髄炎（EAE）は、ミエリン塩基性タンパク（M
BP）に対して導かれるＴ細胞媒体自己免疫疾患であり、
数種の哺乳動物種において、多発性硬化症のためのモデ
ルとして研究された。アルボード等（Alvord,E.et a
l.）の実験的アレルギー性脳脊髄炎‥多発性硬化症のた
めの有用なモデル（リス、ニューヨーク、1984）（Expe
rimental Allergic Encephalomyelitis‥A Useful Mode
l For Multiple Sclerosis（Allan R.Liss,New York,19
84））参照。EAEの免疫調節は、少なくとも一部分、サ
プレッサーＴ細胞（Ts）に依存していることが知られて
いる。Tsは、EAEから回復したラットに存在することが
示された。スウィアコッツ等（Swierkosz,J.et al.,J.I
mmunol. 119:1501（1077）。また、サプレッサーＴ細胞
は、ある種のマウス系によって示される。EATに対する
不応答の原因であることが示された。ランド等（Lando,
Z.et al.,Nature 287:551（1980））。

EAEの抗原特異的抑制を誘導するために種々の方法が
使用され、ランド等（Lando,Z.et al.,J.Immunol. 126:1
526（1981））によって示されたフロイント不完全アジ
ュバンドに乳化されたMBPでの免疫、およびスリラム等
（Sriram,S.et al.,Cell.Immunol. 75:378（1983））
によって示されたMBP−コンジュゲートしたリンパ球の
静脈内注射を包含する。

アルボード等（Alvord et al.）による３つの論文
は、Annals of Neurology、第６巻、pp.461-468、468-4
73、および474-482にそれぞれ報告されている。これら
の論文の内の第１および第２の論文は、非特異的補助因
子、例えば抗生物質またはステロイドと一緒に投与され
る時のみ、MBPの非経口投与によってサルのEAEが抑制さ
れることを開示している。第３の報告は、多発性硬化症
に罹患している患者の脳脊髄液中に、MBPを抗原活性ペ
プチドフラグメントに分解する数種のプロテアーゼが存
在していることを開示している。

トラウゴット等（Traugott et al.,J.Neurological S
cience 56:65-73（1982））およびレイン等（Raine et a
l.,Lab.Investigation 48:275-84（1983））は、MBPを単
独、またはフロイント不完全アジュバンド（IFA）中、
またはミエリンの脂質ハプテン、即ちガラクトセレブロ
シドと組み合わせて非経口投与することによって、慢性
再発性EAEに罹患しているモルモット系を処置すると、E
AEの臨床的症状が抑制されたことを開示している。

更に、マッケンナ等（McKenna et al.,Cell.Immun. 8
1:391-402（1983））は、フロイント完全アジュバンド
中のモルモットMBPを使用し、同系脾臓白血球または同
系赤血球にカップリングされたモルモットMBPをラット
に予め注射しておくと、EAEの次の誘導が抑制されたこ
とを開示している。抑制の程度は、投与されたMBPの量
に明らかに関係があった。

ストレジャン等による報告（Strejan et al.,Cell.Im
mun. 84:171-184（1984））は、ホスファチジルセリンリ
ポソームカプセルに封入されたモルモットMBPをラット
に予め注射しておくと、フロイント完全アジュバンド中
モルモットMBPを注射したラットに現れるEAEの臨床的徴
候および症状を抑制したことを開示している。

マッケンナ等による別の論文（McKenna et al.,Cell.
Immun. 88:251-259（1984））は、彼等の1983年の報告に
記載された、モルモットMBP白血球コンプレックスを注
射することによる抑制効果は、シクロホスファミド、即
ちサプレッサーＴリンパ球の産生を阻害する薬物を動物
に予め処置しておいた時に消失したことを開示してい
る。

クラスナー等による報告（Krasner et al.,Neurology
36:92-94（1986））は、合成ＣコポリマーＩがMBPと免
疫学的交差反応を示さないことを記載している。この物
質は動物をEAEから保護するので、多発性硬化症の治療
法として試験されている。

また、ソビエトのベリク等からの報告（Belik et a
l.,Vopr.Med.Khim. 24:372-377（1978））は、EAEに罹患
しているモルモットへの“アルカリ性ミエリンタンパク
フラグメント”および“合成脳炎誘発性ペプチド”の非
経口投与を開示している（英文要約による）。動物は、
ウシ“アルカリ性ミエリンタンパクフラグメント”また
は“合成脳炎誘発性ペプチド”で感作した該動物に“ア
ルカリ性ミエリンタンパクフラグメント”を投与した後
に回復した。

ブラレイ−ミュレン等による報告（Braley-Mullen et
al.,Cell.Immun. 51:408（1980））およびナグラー−ア
ンダーソンによる報告（Nagler-Anderson et al.上記）
は共に、自己抗原−リンパ球コンジュゲートを動物に注
射することによって誘導された、他の２種類の実験的自
己免疫疾患の症状の抑制を開示している。ブラレイ−ミ
ュレン等の報告は、フロイント不完全アジュバンド中サ
イログロブリン抗原をモルモットに注射することによっ
て、これらの動物の実験的自己免疫甲状腺炎が抑制され
たことを開示している。ナグラー−アンダーソン等の報
告は、アジュバンド中ＴタイプIIコラーゲンで動物を免
疫する前に、可溶性であるが分解されないＴタイプIIコ
ラーゲンを胃内投与することによって、マウスのＴタイ
プIIコラーゲン誘発性関節炎が抑制されたことを記載し
ている。

発明の要約 本発明は、動物におけるＴ細胞媒介またはＴ細胞依存
性自己免疫疾患の治療法であって、該動物に、該自己免
疫疾患に特異的な自己抗原、自己抗原のフラグメント、
または自己抗原に構造的に類似している類似体を、自己
免疫疾患の治療に有効な量で経口または腸内投与するこ
とからなる方法を教示するものである。その様な疾患の
臨床的または組織学的効果の両者は、投与量に依存して
抑制される。また、経口または腸内投与が自己免疫疾患
の発症の前であっても後であっても抑制が生じる。更
に、疾患は、自己抗原の疾患非誘発性および疾患誘発性
フラグメントの経口または腸内投与によっても抑制され
る。従って、自己抗原の経口または腸内投与は、自己免
疫疾患を自然に免疫調節し得る有効かつ簡便な方法であ
る。

図面の簡単な説明 第１図は、ルイス系ラットにおける増殖性応答の、経
口的に誘導される抑制の抗原特異性を示すグラフであ
る。−７、−５および−２日目に動物にMBPまたはBSA50
0μｇを投与し、次いで０日目にCFA中MBP100μｇで免疫
した。免疫の９日後、リンパ節を摘出し、実施例３の記
載の様にして、MBP、BSAおよびPPD（全て50μg/ml）に
対する増殖性応答を調べた。刺激指数＝実験値cpm/対照
値cpm。

第２図は、間接の腫脹によって測定した、経口的に誘
導されたアジュバンド関節炎抑制を示すグラフである。

第３図は、再発性ネズミEAEを惹起するためのプロト
コールの図式的説明である。

第４図は、SJLマウスにおいて、経口的に誘導された
リンパ球増殖抑制を示す棒グラフである。動物にMBP400
μｇを２週間で７回投与し、CFA（0.6mg/ml M.tubercul
osis）中MBP400μｇで免疫した。刺激指数は、MBPで誘
発された増殖をバックグラウンドで除したものである。

第５図は、ミエリン塩基性タンパク（MBP）投与ラッ
トから得られた脾臓および腸間膜リンパ節細胞（LNC）
による、膝窩浸出リンパ節細胞（PLNC）の応答の抗原特
異的抑制を示すグラフである。結果は、MBP（丸）並び
にMycobacterium tuberculosis（四角）に対するPLNCの
抑制百分率として表わされている。黒丸または黒四角は
脾臓細胞の応答を示す。白丸または白四角は腸間膜リン
パ節細胞の応答を示す。

第６図は、MBP経口投与後の、MBPに対するIgG応答の
特異的抑制を示すグラフである。ラットから時々採血
し、血清を抗OVA（第6A図、白丸）または抗MBP（第6B
図、白四角）抗体について試験した。これらの血清を、
投与しないでチャレンジした動物（黒記号）から得た血
清と比較した。結果は、ELISA O.D.492レベル±S.D.と
して表わされている。

好ましい態様の説明 本発明は、Ｔ細胞媒介性またはＴ細胞依存性自己免疫
疾患の治療法であって、この様な自己免疫疾患に特異的
な自己抗原並びに自己抗原の生物学的に活性なフラグメ
ントおよびその類似体の傾向または腸内投与による治療
法に関するものである。“治療”なる語句は、この様な
自己免疫疾患を防ぐための予防的手段およびこの様な自
己免疫疾患の発症後の症状の抑制または軽減の両者を包
含して意味する。

自己免疫疾患は、免疫系が動物体内の外来の物質と、
動物自体を構成している種々の物質を区別し得ないとい
う、ヒトを含む動物の免疫系の機能不全である。“動
物”なる語句は、免疫調節系を有し、自己免疫疾患にか
かり得る全ての生命形態を包含する。

“自己抗原”は、正常でない状況において、その動物
のリンパ球または抗体によって動物自体の一部分である
と認識されず、それが外来の物質であるかの様に免疫調
節系によって攻撃される、動物体内で通常見出だされる
物質である。この様な自己抗原の“生物学的に活性なフ
ラグメント”という用語は、同じ生物学的応答、即ち経
口または腸内投与するとＴ細胞媒介性またはＴ細胞依存
性自己免応答を抑制または排除する活性を誘導する、そ
の部分的アミノ酸配列を包含する。この様な自己抗原の
“類似体”なる語句は、同じ生物学的活性、即ち経口ま
たは腸内投与するとＴ細胞媒介性またはＴ細胞依存性自
己免疫応答を排除または抑制する活性を有する、これら
の自己抗原に構造的に非常に類似している化合物を包含
する。従って、この語句は、自己抗原のアミノ酸配列と
１またはそれ以上のアミノ酸が異なる（実質上同等の生
物学的活性を保持している）アミノ酸配列、および疾患
の症状を抑制または軽減するその活性において自己抗原
の生物学的活性に類似している化合物を包含する。この
様な化合物は、自己免疫疾患における攻撃部位である標
的器官からの組織からなっていることもある。

本発明の主要な用途は、集合的な自己免疫疾患と呼ば
れる疾患であって、多発性硬化症、重症筋無力症、慢性
関節リウマチ、真性糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、自己免
疫性甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、および例えば毒
性アイビーの様な植物要素によって生じることもある接
触感受性疾患を包含するがこれに限定されない、大きな
カテゴリーの疾患の治療である。

実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）は、ミエリン塩
基性タンパク（MBP）に対するＴ細胞媒介性自己免疫疾
患であり、数種の哺乳動物種において、多発性硬化症の
ためのモデルとして研究されてきた。EAEの免疫調節
は、少なくとも一部分、サプレッサーＴ細胞（Ts）に依
存していることが知られている。TsはEAEから回復した
ラットに存在しており、Tsはある種のマウス系におい
て、疾患に対する免疫不応答の原因であることが示され
た。

アジュバンド性関節炎（AA）は、ルイス系ラットの尾
の基部にMycobacterium tuberculosisを注射すること
によって惹起される、慢性関節リウマチの自己免疫の動
物モデルである、注射後10-15日で、動物は重篤な進行
性関節炎を発症する。

本発明は、MBPの経口または腸内投与が急性−相性EAE
の抑制に有効な手段であり、Mycobacteria tuberculosi
sの経口または腸内投与がアジュバンド性関節炎の抑制
に有効な方法であることの発見および確認を基礎とす
る。経口的または経腸的に誘導される寛容（トレラン
ス）はドーズ・ディペンデントであり、疾患の臨床的お
よび組織学的両症状の重篤度を軽減する。ウシ血清アル
ブミン（BSA）の様な非同類抗原は、経口的また経腸的
にはEAEへの罹患し易さに影響を有していないので、EAE
に対して経口的または経腸的に誘導される寛容は、MB
P、即ち疾患を媒介するＴ細胞が感作される抗原に特異
的であるということができる。

更に、ラットへのMBPの経口または腸内投与は、MBPに
対する免疫応答の抑制を誘導する。例えば、リンパ球の
増殖および抗MBP抗体の産生は共に低下する。イン・ビ
トロにおいて疾患の抑制おび抗原特異的細胞応答の抑制
の両者の原因である細胞は、Ｔ細胞由来の、サプレッサ
ー／細胞毒性CD8＋Ｔリンパ球である。

従って、多発性硬化症のためのEAE動物モデルおよびA
Aのための動物モデルを使用して以下に説明するよう
に、本発明によって教示される、MBPの様な自己抗原の
経口または腸内投与からなる簡便な方法は、自己免疫疾
患の発症および自己抗原に対するある種の免疫応答の両
者を抑制する有効な治療法である。

“導入”または“投与”なる語句は、自己抗原、その
生物学的に活性なフラグメントまたは生物学的に活性な
類似体が、食事により口から胃へ、または胃管によって
胃内、即ち腸内に導入されることを意味する。

通常、自己抗原、フラグメントまたは類似体は、経口
的または腸内に、１日当たり１から1000mgの量で導入さ
れ、単一投与形態または複数回投与形態で投与すること
ができる。自己抗原、フラグメントまたは類似体を１日
当たり25から850mgの量で投与するのが好ましい。当業
者には理解される様に、実際の投与量は、自己抗原、患
者の年令、性別、身体的条件、および同時に行われるそ
の他の治療の関数である。

自己抗原、フラグメントまたは類似体を経口的に導入
する場合、これをその他の食物と混合し、固形、半固
形、懸濁液、または乳濁液の形態で食するか、これを薬
学的に許容し得る担体、着香剤等と混合することができ
る。

自己抗原、フラグメントまたは類似体を腸内投与する
場合、これを固形、半固形、懸濁液または乳濁液の形態
で導入してもよいし、水、懸濁化剤、乳化剤を包含する
薬学的に許容し得る担体のいずれかと混合してもよい。

動物：マサチューセッツ、ウィルミントン、チャールズ
・リバー・ラボラトリーから、体重150〜220gの雌性ル
イス系ラットを入手し、全ての試験で使用した。

動物の免疫：ラットの両後足裏に、フロイント完全アジ
ュバンド（CFA）に乳化させたモルモットMBP50μｇを投
与して免疫した。幾つかの試験では、この乳化された抗
原にオバルブミン（OVA）（シグマ社）50μｇを加え、
同様に注射した。EAEを四肢の麻痺によって特性化し、
以下の様にして評価した:0）疾患なし;1）低下された活
性、四肢をひきずる;2）軽い麻痺、不安定な歩行;3）中
程度の不全対麻痺；四肢が外側に広がる;4）四肢の麻
痺。

経口による寛容の誘導： プラスチックチューブで覆われた23−ゲージ針を使用
し、ラットに1mlPBS中1mgのMBPまたはウシ血清アルブミ
ン（BSA）を４日間隔で５回与えた。

増殖の検定：免疫の９日後、ラットを殺し、その膝窩リ
ンパ節を摘出した。リンパ節をステンレス鋼網に押し付
けることによって単一の細胞懸濁液を調製した。総数10
⁵個のリンパ節細胞（LNC）を、指示された数の、投与ラ
ット由来の被照射（2000ラド）またはそのままのLNC
（４倍）と一緒に丸底96ウェルプレート（Costar）中で
培養した。この培養物にMBPおよびMycobacterium tuber
culosis（Mt）、50μg/mlを20μｌ容量で加えた。培養
物を80時間インキュベートし、培養の最後16時間、１μ
Ci［³Ｈ］TdR/ウェルでパルスした。次いで、培養物を
自動細胞収穫機で集め、標準液体シンチレーションカウ
ンターで読み取った。

プライムしたLNC（PLNC）の増殖の抑制百分率を、以
下の式によって算出した： 増殖培地：全ての試験において、ROMI（Gibco）を使用
した。２×10^-5M 2−メルカプトエタノール、１％ピル
ビン酸ナトリウム、１％ペニシリンおよびストレプトマ
イシン、１％非必須アミノ酸、および１％自己血清を加
えた後、培地を滅菌濾過した。

種々の細胞サブセットの精製：脾臓細胞からCD3、CD4お
よびCD8群を枯渇させるために、ネガティブな選択を行
った。ペトリ皿を、PBS/BSA中1/1000ヤギ抗マウスIgG＋
IgM抗体（Tago）10mlで４℃にて一夜覆った。次いで、
プレートを洗浄し、PBS中３％ウシ胎児血清で20℃にて3
0分間覆い、再び洗浄した。ルイスのLNCを、マウス抗ラ
ットモノクローナル抗原（Serotec/Bioproducts）を使
用し、PBS中1/100に希釈したCD3（MRC,OX/38）、CD4（W
3/25）、またはCD8（OX/8）について染色した。細胞を
氷上で30分間染色し、洗浄し、予め覆っておいたペトリ
皿に、15×10⁶細胞/5mlPBS/プレート、４℃で蒔いた。6
0分後、非粘着性細胞を含有している上清を穏やかに吸
引し、細胞の試験および計数前に２回遠心した。このプ
ロトコールにより、メンブラン免疫蛍光を調べることに
よって蛍光活性化細胞ソーター中で調べると約85-95％
純度の細胞群を得た。

養子免疫伝達の試験：供与体ラットに、MBPまたはBSAの
いずれかを1mg×５回、３−４日間隔で投与し、最終投
与の４日後に殺した。腸間膜LNCおよび脾細胞を集め、
直後に、または増殖培地中、コンカバリン−Ａ（Con−
Ａ）1.5μg/mlで48時間活性化した後、腹腔内注射し
た。養子免疫伝達の試験のために注射した細胞数は、以
下の通りであった：活性化されているかいない総LNC
群、120×10⁶;CD3枯渇されたLNC、60×10⁶;CD4枯渇され
た群、80×10⁶;CD8枯渇されたLNC、95×10⁶。４時間
後、EAEを惹起するために、受容体ルイス系ラットをBP/
CFAで免疫した。

抗体の血清中濃度:MBPおよびOVAに対する抗体力価の測
定のために、固相酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を
使用した。微量滴定プレートを、１ウェル当たり、10μ
g/ml再蒸留水の抗原0.1mlと一緒にインキュベートし
た。プレートを25℃で18時間インキュベートした。PBS/
ツウィーン−20（Bio-Rad）、pH7.5で３回洗浄した後、
プレートを３％BSA/PBSと一緒に37℃で２時間インキュ
ベートし、２回洗浄し、希釈した血清100μｌを４回加
えた。プレートを37℃で２時間インキュベートした。PB
S/ツウィーン−20で３回洗浄した後、プレートを、１％
BSA/PBS中1:1000に希釈したペルオキシダーゼ−コンジ
ュゲートヤギ抗ラットIgG抗体（Tago,USA）100μl/ウェ
ルと一緒に25℃にて１時間インキュベートした。30％Ｈ
₂Ｏ₂を含有しているＤ−フェニレンジアミン（0.4mg/ml
リン酸）クエン酸バッファー、pH5.0）に接触させるこ
とによって、着色反応を得た。0.4N H₂SO₄を加えて反応
を終止させ、ELISAリーダーでOD492nmを読み取った。

イン・ビトロにおける抗体産生の測定：投与された、投
与されていない、チャレンジされたラットから膝窩およ
び脾臓LNCを得、単独、または指示された別のPLNCを加
えた照射体（2000ラド）をペトリ皿1ml当たり10⁷細胞の
濃度で蒔いた。培養物を、抗原（20μg/ml）を加えるか
加えない増殖培地にてインキュベーター中、３日間維持
し、次いで集めた。希釈した上清を使用してイン・ビド
ロのIgG抗体の産生および分泌を試験し、前記ELISA試験
を使用して抗体の産生を測定した。

EAEの抑制の原因であるミエリン塩基性タンパク分子の
種々の領域の識別：固相ペプチド法を使用し、モルモッ
トのミエリン塩基性タンパクの１−37領域の重複フラグ
メントを合成した。ホウテン（Houghten,R.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 825131-5135（1985））。次いで、これ
らのフラグメントを、全ミエリン塩基性タンパク15mgま
で、等モル濃度で経口投与した。これらは、免疫前、−
７、−５、および−２日目に投与した。次に、確立され
た方法に従い、フロイントのアジュバンドに入れた塩基
性タンパクで動物をチャレンジし、評価した。

経口経路によるタンパク抗原の投与により、どのフラグ
メントに免疫応答があるかを調べることの説明：フロイ
ントのアジュバンドで足裏に免疫するかまたは経口投与
し、動物に、全ミエリン塩基性タンパクを与えた。７〜
10日後、脾臓およびリンパ節細胞を摘出し、イン・ビト
ロにてミエリン塩基性タンパク分子の種々のフラグメン
トで再刺激いた。

実施例 実施例１ 急性−相性EAEへの罹患し易さおよびその重篤度に対
する、MBPおよびその消化性フラグメントの投与の効果
を、ルイス系ラットで調べた。結果は、この天然の経路
の寛容誘導が、疾患の発症およびMBPへの免疫応答の両
者を抑制することを示している。

EAEの抑制を経口的に誘導するために、ルイス系ラッ
トに、20Gボール・ポイント針を備えた注射器で、モル
モットの脳から精製したMBPを与えた（ディープラー等
（Diebler,G.,et al.,Prep.Biochem. 2:139（1972））。
対照群動物に、等量のウシ血清アルブミン（BSA）また
は食塩水のみを与えた。Mycobacterum tuberculosis200
μ含有フロイント完全アジュバンド（CFA）に乳化させ
たMBP50μｇで後足裏注射により免疫することによっ
て、EAEを惹起した。疾患は通常、免疫後12〜15日目の
後足の麻痺および失調を特徴とし、全ての場合、ラット
は16日目までに回復した。第１シリーズの試験は、疾患
の発症に対するMBPの投与回数および投与量の効果を調
べた。ラットに免疫日（０日目）の７日前（−７日目）
に１回または−14、−７および０日目に３回、種々の量
のMBPを投与した。結果（第Ｉ表）は、ラットにMBPを投
与するとEAEが抑制され、経口的に誘導される抑制はド
ーズ・ディペンデントであることを示している。複数
回、500μｇを投与すると、疾患を完全に抑制し、この
投与量での１回投与より効果的であった。EAEの臨床的
症状の発現以外に、ラットの疾患の組織学的徴候を調べ
た。免疫の16日後、ラットを殺し、脳を摘出し、ホルマ
リン溶液中で固定させた。固定液は、70％エタノール10
0ml、37％ホルマリン10mlおよび氷酢酸5mlからなる溶液
であった。各ラットからパラフィンに包埋した組織のス
ライドを調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色
した。胸管周囲の炎症の病巣を、確立された方法（ソー
ベル等（Sobel,R.,et al.,J.Immunol. 132:2393（198
4））によって、コードされたスライド上で定量化し
た。第Ｉ表に示される様に、ラットに−14、−７および
０日目に500μｇのMBPを投与すると、脳の炎症の損傷数
を著しく低下した。100μｇの投与した動物では中程度
の低下が見いだされ、25μgMBPを投与したラットでは炎
症の有意な低下が見いだされなかった。

実施例２ 第２シリーズの試験は、経口的に誘導された抑制の効
果が、抗原に予め接触させておくことによって影響され
るか否かを調べるために、MBPによる免疫の前または後
にMBPを投与することの効果を調べた。これらの試験の
ために、動物に、疾患の能動的誘導の前または後に500
μｇのMBPを３回投与した（MBPによる免疫）。結果（第
II表）は、感作の前または後のいずれであっても動物に
MBPを投与すると疾患の臨床的発症が抑制され、免疫の
前に抗原を投与すると効果がより完全であることを示し
ている。しかしながら、組織学的試験は、MBPへの感作
の前または後にMBPを投与したラットでは胸管周囲腫脹
が著しく低下することを示した。疾患の60％より大きい
抑制は、ラットに免疫後、＋５または＋７日目から３回
投与した場合にも起こった（データは示されていな
い）。

更に、MBPによる免疫の前または後の種々の時期にラ
ットにMBP100μｇを投与する試験を行った。第III表に
示される様に、疾患の抑制は免疫の前または後に１回投
与した場合に見られる。

実施例３ MBPへの細胞性または体液性免疫応答に対する、MBPの
経口投与の効果をも調べた。ラットに種々の投与量のMB
Pを与え、投与後の種々の時期に免疫した後に、MBPに対
する増殖応答を調べた。免疫の10日後、ラットを殺し、
浸出（膝窩）リンパ節の単一細胞懸濁液を調製した。細
胞を微量用ウェルで４日間培養し、最後の24時間には³
Ｈ−チミジンを加えた。２％グルタミン、１％ペニシリ
ン／ストレプトマイシン、５×10^-5M 2−メルカプトエ
タノールおよび５％ウシ胎児血清含有RPMI 1640中に４
×10⁴細胞を含んでいる0.2ml容量を各微量用ウェルに加
え、MBPを50μg/mlで加えた。ウェルを１μCiトリチウ
ム含有チミジンでパルスし、多重収穫器によってガラス
繊維フィルターに集め、標準液体シンチレーション法に
よって計測した。

結果（第ＩおよびII表）は、MBPを投与すると、MBPに
対する増殖応答が著しく（75-92％）低下することを示
している。増殖の抑制は、疾患の抑制と異なり、免疫後
の投与を含む、試験した全ての投与量および投与法にお
いて起こった。MBPに対して経口的に誘導される増殖応
答抑制は、第１図に示される様に、抗原特異的である。
具体的には、MBPの投与は、精製されたタンパク誘導体
（PPD）、CFAによる免疫の結果、増殖応答を誘導するM.
tuberculosis由来の抗原、に対する増殖応答を抑制しな
い。関連性のない抗原、RSAの投与は、PPDに対する増殖
応答に影響せず、MBPに対する増殖応答をごくわずかに
抑制する。

実施例４ 更に、抗MBP抗体の産生に対するMBP投与の効果を試験
した。MBPに投与したラットを免疫し、免疫の16日後、
心臓せっ刺によって血液を採取した。血清中の抗MBP抗
体の濃度を、ELISAによって測定した。MBP溶液（PBS中
0.05mg/ml）0.1ml容量を各微量用ウェルに入れ、37℃で
３時間インキュベートした。0.05％ツィーン含有PBS（P
BST）でウェルを洗浄し、PBS中５％BSA、pH9.0と一緒に
４℃で一夜ブロックした。PBSTでウェルを洗浄した後、
希釈したラット血清を加え、室温で３時間インキュベー
トし、PBSTで洗浄した後、第２の抗体（ペルオキシダー
ゼコンジュゲートしたヤギ抗ラット）を室温で１時間加
えた。基質を加え、反応は指示順序であった； 該コントロールおよび数プロセッサーは同時に非同期
的に作動し得； 該コントロールプロセッサーの最大スピードより速く
作動する内部数プロセッシング部品を含む該数プロセッ
サー； データ貯蔵メモリー； それを介して該数プロセッサーが該データ貯蔵メモリ
ーに接触しているマルチポート登録ファイル； 該データ貯蔵メモリーにデータ仲介領域を提供する第
１のポート、およびローカル結果バスに接続され、該内
部数プロセッシング部品の出力を選択的に受信する第２
のポートを有する該登録ファイル； 該結果バスから読み取り、書きとる様に接続されてい
るメモリーおよびアドレスコントロラーを含むローカル
スタック。

6.以下からなるマルチプロセッサーシステムの数プロ
セッシングサブシステム： コントロールプロセッサーおよび数プロセッサーであ
って、該コントロールプロセッサーが、該数プロセッサ
ーに命令順序を実行するように命令するように接続され
ているプロセッサー； 該コントロールおよび数プロセッサーが同時に非同期
的に作動し得る（A72.1.wp） （ａ） 指示された日に種々の投与量のMBPをラットに
投与し、０日目にCFA（M.tuberculosis200μｇ）中50μ
gMBPで免疫した。免疫したラット総数に対する罹患した
ラットの数を示す。免疫した対照群には、BSAまたは食
塩水を投与した。

（ｂ） 免疫後16日目にラットを殺し、脳を摘出し、固
定した。動物１匹当たりの胸管周囲炎症病巣の平均数＋
/s.d.を示す。ND＝試験せず （ｃ） ラットを免疫した10日後、浸出リンパ節細胞に
ついて、MBPに対する増殖応答を測定した。２％グルタ
ミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５×10^-5
M 2−メルカプトエタノールおよび５％ウシ胎児血清含
有RPMI中４×10⁵細胞を含有している0.2ml容量を各微量
用ウェルに加え、MBPを50μg/mlで加えた。ウェルを１
μCiトリチウム含有チミジンでパルスし、多重収穫器を
使用してガラス繊維フィルターに収穫し、標準液体シン
チレーション法を使用して計数した。免疫対照群につい
て、MBPに対する増殖応答の阻害百分率を示す。免疫対
照群の平均刺激指数（MPB刺激CPM/バックグラウンドCP
M）は、6.0（29,888CPM/4960CPM）であった。

（ｄ） 16日目にラットを殺し、心臓せっ刺によって血
液を採取した。血清をPBS中1/15,625に希釈し、ELISAに
よって抗MBP抗体濃度を測定した。微量用ウェル当た
り、MBP溶液（PBS中0.05mg/ml）0.1ml容量を加え、37℃
で３時間インキュベートした。ウェルを0.05％ツィーン
含有PBS（PBST）で洗浄し、PBS中５％BSA、pH9.0と一緒
に４℃で一夜ブロックした。PBSTでウェルを洗浄した
後、希釈したラット血清を加え、室温で３時間インキュ
ベートし、PBSTで洗浄した後、第２の抗体（ペルオキシ
ダーゼコンジュゲートしたヤギ抗ラット）を室温で１時
間加えた。基質を加え、0.1M NaFlで反応を止めた。プ
レートをタイターテック（Titertek）マルチスキャンに
て450nmで読み取った。CFAのみで免疫したラット由来の
血清についてもAbs₄₅₀を測定し、バックグラウンドとし
て全ての値から減じた。免疫対照群について、450nmに
おけるペルオキシダーゼ基質の吸収によって測定され
た、抗体濃度の減少パーセントを示す（バックグラウン
ドを減じた免疫対照群のＡ₄₅₀における平均吸収は0.148
であった）。

（ｅ） 自由度１のチースクエア（chi-square）分析に
よって各群を比較した：＊ｐ＜0.5、＊＊ｐ＜0.1、＊＊
＊ｐ＜.001。

（ａ） 指示された日に500μｇのMBPをラットに投与
し、０日目にCFA中50μgMBPで免疫した。

（ｂ） 第Ｉ表参照。

（ｃ） 第Ｉ表参照。免疫対照群の平均刺激指数は9.4
であった（82,247CPM/8,718CPM）。

（ｄ） 第Ｉ表参照。バックグラウンドを減じた免疫対
照群のＡ₄₅₀における平均吸収は0.403であった。

（ｅ） 第Ｉ表参照。

指示された日に100μgMBPをラットに投与し（免疫日＝
０）、CFA（.5mg/ml M.tuberculosis）中50μMBPで免疫
した。

実施例５ EAEに対して経口的に誘導された保護の持続を調べる
ために、更に試験を行った。−７、−５および−２日目
に500μgMBPを投与した後、最終投与の後の種々の時間
的長さで、ラットを免疫した。ラットにおいて、EAEは
投与後４週間まで完全に抑制され、MBPを投与したラッ
トの50％は８週間までに再び疾患に罹患する様になっ
た。結果を第IV表に示す。この結果は、疾患に対する寛
容は最終投与後少なくとも４週間維持され、疾患の誘導
に対する罹患し易さは投与後８週間で現れることを示し
ている。

−７、−５および−２日目にラットに500μgMBPを投
与し、指示された日にCFA中50μgMPBで免疫した。対照
群ラット（BSA投与）を同様に免疫した。

実施例６ ラットにおけるモルモットMBPの脳炎誘発領域は、単
独でEAEを誘導し得る、75-84残基に位置する特異的デカ
ペプチド配列であり、分子のその他の領域は非脳炎誘発
性であるということが知られている（ハシム（Hashim,
G.,Myelin:Chemistry and Biology,Alan R.Liss,N.Y.
（1980）））。また、その他の抗原については、免疫原
決定基と異なる部位に別のサプレッサー決定基が存在す
ることが報告されている（ヨウエル等（Yowell,R.,et a
l.,Nature 279:70（1979）））。そこで、MBPの脳炎誘発
性および脳炎非誘発性フラグメントの両者が経口投与に
よってEAEを防ぎ得るか否かを調べた。モルモットMBPの
フラグメントを制限ペプシン消化によって作成し、カラ
ムクロマトグラフィーによって分離した（ホワイテイカ
ー等（Whitaker,J.,et al.,J.Biol.Chem. 250:9106:（19
75）））。３種類のフラグメントをラットに投与し、動
物を全MBPで免疫した。ラットに投与された時、疾患誘
発性（フラグメント44-89）および脳炎非誘発性（フラ
グメント１−37および90-170）両ペプチドがEAEを抑制
し、脳炎非誘発性フラグメントの法が脳炎誘発性フラグ
メントより疾患の抑制に有効であることがわかった（第
Ｖ表）。１個のアミノ酸の置換によって脳炎誘発性配列
（75-84残基）と異なるデカペプチド（S79）が合成さ
れ、CFAと一緒にラットに注射された時、抑制を誘導す
ることが報告されている（カーディス等（Kardys,E.,et
al.,J.Immunol. 127:862（1981）））。S79（Ala-Gln-G
ly-His-Arg-Pro-Gln-Asp-Glu-Gly）を動物に投与する
と、これがEAEを抑制することもわかった（第Ｖ表）。
脳炎誘発性配列を含む幾つかの部位がモルモットMBPと
異なり、モルモットMBPのための脳炎誘発性投与量では
ラットにおいて脳炎誘発性ではないウシMBP（ホロシツ
等（Holoshitz,J.,et al.,J.Immunol．131:2810（198
3）））も、免疫前に動物に投与した時、疾患を抑制し
た。

−７、−５および−２日目に、ルイシ系ラットに、表
示された量のMBPフラグメントまたはペプチド（全モル
モットMBP500μｇと等モル）を投与し、０日目にCFAと
一緒にモルモットMBP50μｇで免疫した。免疫したラッ
ト総数に対する罹患したラット数を示す。（ａ）チース
クエア（chi-square）分析によって、各群を免疫対照群
と比較した：＊＊ｐ＞.01、＊＊＊ｐ＜.001。

実施例７ Mycobacteriaの投与による、アジュバンド誘発性関節炎
の抑制 尾の基部に10mg/mlのフロイント完全アジュバンド0.1
mlで免疫することによって、雌性ルイス系ラットにアジ
ュバンド性関節炎を惹起した。免疫前、−７、−５およ
び−２日目、０日目、および免疫後、＋７および＋14日
目に、動物にリン酸緩衝化食塩水中Mycobacteria tuber
culosis2.0mgを投与した。免疫後３週間、関節の腫脹を
調べることによって、関節炎を評価した（第VI表および
第２図）。

実施例８ SJLマウスにおける、EAEの養子免疫伝達モデル 養子免疫再発性EAEの実施および再現可能なモデル
を、SJLマウスで確立した。このモデルのためのプロト
コールは、モクタリアン等（Mokhtarian,et al.,Natur
e，309:356（1984））から採用した。このプロトコール
を、第３図に図式的に示す。簡単に言うと、供与体動物
を、CFA中MBP400μｇおよびM.tuberculosis30μｇを含
有している乳濁液で免疫する。その10日後、浸出リンパ
節を摘出し、50μg/mlMBPと一緒に４日間培養し、十分
洗浄し、４−６×10⁷生存細胞を雌性受容体動物に静脈
内注射した。標準的スケールを使用して動物の臨床的EA
Eを評価し、標準Ｈ＆Ｅ組織学的検定によって病理学的
に評価した（ブラウン等（Brown,A.,et al.,Lab Inves
t. 45:278（1981））、ルブリン等（Lublin,F.,et al.,
J.Immunol. 126:819（1981））およびバーナード等（Ber
nard,C.et al.,Eur.J.Immunol. 16:655（1976））。再発
数を調べ得るように、伝達数少なくとも100日間、動物
をモニターした。

実施例９ SLJマウスにおける、経口的に誘導される増殖応答抑制 CFA（0.6mg/ml M.tuberculosis）中MBP400μｇで免疫
する前に２週間毎日MBP400μｇを投与すると、MBP免疫
に対する応答において、リンパ節細胞の増殖が抑制され
る。結果を第４図に示す。この図は、対照群の結果対投
与群の結果を、バックグラウンドで除したMBP誘発性増
殖の関数（刺激指数）として示す。

本発明は、本出願の様式および態様、および上記の態
様に限定されない。本発明は、本発明によって教示され
る自己免疫疾患の抑制を生じるあらゆる変更法にも包含
する。これらの等価法も、請求の範囲によって定義され
る保護の分野に包含される。

実施例10 MBP投与した供与体ラットから非投与同系受容体ラット
への、EAE発症に対する保護的寛容の養子免疫伝達 受容体ラットにMBPまたはBSAを、1mg×５回、３−４
日間隔で投与し、最終投与の４日後に殺した。腸間膜リ
ンパ節細胞（LNC）および脾臓細胞を集め、直後に、ま
たは増殖培地中、コンカナバリン−Ａ（Con−Ａ）1.5μ
g/mlで48時間活性化した後に腹腔内注射した。養子免疫
伝達試験のために注射した細胞数は、以下の通りであっ
た：活性化されているかまたはされていない全LNC群、1
20×10⁶;CD3枯渇LNC、60×10⁶;CD4枯渇群、80×10⁶；お
よびCD8枯渇LNC、95×10⁶。４時間後、EAEの誘導のため
に、受容体ルイス系ラットをMBP/CFAで免疫した。投与
した供与体ラットから非投与同系受容体ラットへ、EAE
発症に対する寛容を伝達する活性を第VII表に示す。非
投与ラットまたはウシ血清アルブミン（BSA）投与供与
体ラットから得られたLNCは、EAEに対する保護を伝達し
なかった。しかしながら、MBP投与した供与体から得ら
れた脾臓細胞または腸間膜（MES）リンパ節細胞は共
に、受容体において誘導されたEAEに対して、それぞれ
疾患の50％および57％抑制を示し、リラティブ保護を伝
達し得た。疾患の最大重篤度平均値も、MBP投与した供
与体ラットから離れた脾臓細胞または腸間膜リンパ節細
胞の場合、受容体において著しく低下された。これらの
結果は、EAE誘導に対する経口的寛容は細胞由来であ
り、保護の原因である細胞は、腸間膜リンパ節および脾
臓の両者において、濃縮されて見出されるということを
示す。

ルイス系ラットに、MBPまたはBSAを、１投与当たり1m
g、３日間隔で５回投与するか、または処置せずにおい
た。次に、ラットを殺し、その脾臓または腸間膜リンパ
節を摘出した。LNCを集め、Con−Ａの存在下で48時間活
性化した。リンパ芽球を集め、３回洗浄し、非投与同系
ラットに腹腔内注射した。４時間後、EAEの誘導のため
に、受容体ラットをMBP/CFAでチャレンジした。疾患を1
0日目から毎日評価した（＊結果は統計的に有意であ
る、ｐ＜0.05）。

実施例11 EAEに対する寛容を媒介するリンパ節細胞サブポピュレ
ーションの識別 Ｔ細胞、ヘルパーＴリンパ球（CD4）またはサプレッ
サー／細胞毒性Ｔリンパ球（CD8）の枯渇の前または後
に、MBP投与した供与体ラットから得たCon−Ａ活性化脾
臓細胞（SPC）を非投与同系ラットに移した。脾臓細胞
からCD3、CD4およびCD8群を枯渇させるために、負の選
択を使用した。ペトリ皿を、PBS/BSA中1/1000ヤギ抗マ
ウスIgG＋IgM抗体（Tago）10mlで、４℃にて一夜覆っ
た。次に、プレートを洗浄し、PBS中３％ウシ胎児血清
で20℃にて30分間覆い、再び洗浄した。ルイス系ラット
のLNCを、PBS中1/100に希釈したCD3（MRC,OX/38）、CD4
（W3/25）またはCD8（OX/8）について、マウス抗ラット
モノクローナル抗体（Serotec/Bioproducts）で染色し
た。細胞を氷上で30分間染色し、洗浄し、予め覆ったペ
トリ皿に、15,000,000細胞/5mlPBS/プレートで、４℃で
蒔いた。60分後、非粘着細胞を含有している上清を穏や
かに吸引し、細胞試験および計数前に２回遠心した。こ
のプロトコールから、メンブラン免疫蛍光を調べること
によって蛍光活性化細胞選別機で調べた結果。約85-95
％純度の細胞群を得た。結果を第VIII表に示す。この結
果は、SPCはEAEからの保護を伝達し得る（50％の発生
率）が、Ｔ細胞枯渇SPCは受容体ラット（２群）を保護
するその活性を失ったことを示す。即ち、保護を伝達し
得る脾臓細胞はＴリンパ細胞であるらしい。しかしなが
ら、CD8細胞が枯渇すると（４群）、保護を伝達し得
ず、一方、CD4＋枯渇SPCはEAEからラットを保護する有
意な活性を示した。このことから、MBPの経口投与後に
生成され、疾患の誘導に対する寛容を媒介する抗原特異
的Ｔリンパ球は、サプレッサー／細胞毒性サブセット由
来であることがわかる。

供与体ラットにMPBを投与し、第Ｉ表の解説欄の記載
と同様にして処置した。ある種のサブポピュレーション
の枯渇前（１群）または後（２−４群）に、非投与受容
体ラットに、Con−Ａ活性化SPCを注射した。CD3、CD4ま
たはCD8リンパ球の枯渇は、SPCにモノクローナルIgG抗
体をカップリングさせて選別することによって行った。
受容体ラットをMBP/CFAで免疫し、10日目からEAEを記録
した（＊結果は統計的に有意である。ｐ＜0.05）。

実施例12 MBP投与ラット由来のリンパ節細胞を加えることによ
る、イン・ビトロ抗MBP T細胞応答の抑制 ラットをMBP/CFAで免疫し、９日後、そのプライムさ
れた腸間膜浸出リンパ節（PLNC）を集めた。リンパ節を
ステンレス鋼網に押し付けることによって、単一の細胞
懸濁液を調製した。合計10⁵個のLNCを、丸底96ウェルプ
レート（Costar）中、表示した数の、被照射（2000Ra
d）またはそのままの、投与ラット由来のLNCと一緒に培
養した（４回）。MBPおよびMycobacterium tuberculosi
s50μg/mlを、20μｌ容量で培養物に加えた。培養物を8
0時間インキュベートし、培養の最後の16時間、１μCi
［³Ｈ］TdR/ウェルでパルスした。培養物を自動細胞収
穫器で集め、標準液体シンチレーションカウンターで読
み取った。

プライムされたLNC（PLNC）の増殖の抑制パーセント
を、以下の式で算出した： PNCを、MBPまたはMycobacterium tuberculosisの存在
下、非投与またはMBP投与ラットから得た、照射したSPC
または腸間膜LNCと一緒に培養した。MBP投与した供与体
ラットから得たLNCを、最終投与後の種々の日に試験し
た。結果を第５図に示す。試験の時間枠内では、投与ラ
ットから得たLNCは、Mycobacterium tuberculosisに対
するPLNCの応答に影響しなかったことがわかる。しかし
ながら、投与ラットから得たSPCおよび腸間膜LNCの両者
は、MBPに対するPLNCの増殖を抑制することができた。P
LNC応答の抗原特異的抑制は、腸間膜LNCよりSPCの使用
において、より大きかった。抑制はMBPの最終投与後５
〜36日目に現れ、このことは、抑制の誘導が投与直後に
達成され、比較的長時間維持されることを示している。

従って、EAE誘導に寛容となる様に与えられたラット
から得たLNCは、投与に使用された抗原に対してのみの
細胞免疫応答を抑制し得る抗原特異的リンパ球であるこ
とらしい。

実施例13 MBP投与ラットから得られた被照射SPCおよびそのサブポ
ピュレーションの存在下の、PLNCの抗MBP応答の抑制 抑制の原因であるSPCのサブポピュレーションを調べ
るために、最終投与の20日後に、MBP投与ラットからSPC
を得、ある種のリンパ球群を枯渇させ、照射し、MBPと
一緒にMBP/CFAで免疫したラットから得たPLNCと混合し
た。膝窩および脾臓LNCを、単独で、または表示したそ
の他のPLNCと一緒に照射（2000Rad）して、10⁷細胞/ml
ペトリ皿の濃度で蒔いた。培養物を、抗原（20μg/nl）
を加えるかまたは加えない増殖培地でインキュベーター
中、３日間維持し、集めた。希釈した上清を使用してイ
ン・ビトロのIgG抗体の産生および分泌を調べ、ELISA試
験を使用して抗体産生を測定した。微量滴定プレート
を、再蒸留水中、10μｇ抗原/ml、１ウェル当たり0.1ml
と一緒に、インキュベートした。プレートを25℃で18時
間インキュベートした。PBS/ツウィーン−20（Bio-Ra
d）,pH7.5で３回洗浄した後、プレートを３％BSA/PBSと
一緒に37℃で２時間インキュベートし、２回洗浄し、希
釈した血清100μｌを４回加えた。プレートを37℃で２
時間インキュベートした。PBS/ツウィーン−20で３回洗
浄した後、プレートを、１％BSA/PBS中1:1000希釈のペ
ルオキシダーゼコンジュゲートしたヤギ抗ラットIgG抗
体（Tago,USA）100μl/ウェルと一緒に25℃で１時間イ
ンキュベートした。30％Ｈ₂Ｏ₂含有Ｄ−フェニレンジア
ミン（0.4mg/mlリン酸クエン酸バッファー、pH5.0）に
接触させることによって、着色反応を得た。0.4N H₂SO₄
を加えて反応を止め、ELISAリーダーにてOD492nmを読ん
だ。第IX表に示された結果は、非投与ラットから得たSP
Cの存在下のMBPに対するその応答に比較した、MBP投与
ラットから得たSPCの存在下のPLNCの抗原増殖の抑制パ
ーセントを示す。これは、MBP投与ラット（１群）から
得たSPCはMBPに対するPLNCの応答を抑制する（70％）こ
とを示した。Ｔ細胞（２群）またはサプレッサー／細胞
毒性Ｔ細胞（３群）の枯渇は、抑制を廃止する。しかし
ながら、ヘルパーＴリンパ球（CD4、４群）の枯渇は、P
LNCの抗MBP増殖応答の阻害を高める。CD4枯渇SPCを希釈
すると、96％）1:1比）から18％（SPC:PLNCの1:100
比）、抑制が低下する。

これらの結果は、イン・ビトロにおける疾患阻害およ
び抗原特異的細胞応答の両者の原因である細胞はＴ細胞
由来であり、これらはサプレッサー／細胞毒性Ｔリンパ
球であるとを示唆している。

MBP投与したルイス系ラットから脾臓を摘出し、次い
で、細胞を集め、照射し、MBP/CFA免疫した同系ラット
から採取した原因物質PLNCと一緒に蒔いた。SPCを非処
理細胞として使用するか、またはカップリングおよび選
別のために適当なモノクローナル抗体を使用してCD3、C
D4またはCD8Tリンパ球を枯渇させた。結果をMBPに対す
るPLNC応答の抑制パーセントとして表すと、非投与ラッ
トから採取した被照射SPCの存在下のPLNCの応答に類似
している。

実施例14 MBPに対する経口的寛容によって誘導される、抗MBP IgG
産生の体液性抑制 ルイス系ラットを、MBPを投与するかまたは処置せず
におき、次いで、CFAに乳濁させたオバルブミン（OVA）
と混合いたMBPでチャレンジした。次ぎに、種々の時期
にラットをしゃ血し、抗OVAまたは抗MBP抗体について血
清を調べた。第6a図に示される様に、MBP投与ラットに
おける抗OVA IgG血清濃度は影響されなかったが、MBP投
与ラットにおける抗MBP IgG血清濃度は低下した（6
b）。

実施例15 イン・ビトロにおけるIgG産生の抑制の原因である細胞
タイプの決定 ルイス系ラットにMBPを投与するか、または投与せず
におき、次いで、MBP＋OVA/CFAで免疫した。12日後、PL
Nを摘出し、MBPまたはOVAの存在下でPLNCを３日間培養
し、上清を集め、1:20に希釈し、そのIgG含有量を調べ
た。第Ｘ表に示される様に、投与ラット（２群）から
得、MBPと一緒にイン・ビトロで培養したPLNCは、非投
与ラット（１群、45％抑制）から得たPLNCに比較して、
抗MBP IgG産生の点で応答が少なかった。同一ラットか
らのPLNCにおける抗OVA IgGの産生は、影響されなかっ
た（４群対５群）。また、MBP投与し、免疫したラット
から得た照射PLNCと、MBPと一緒に培養した免疫ラット
のPLNCを混合したところ、後者の抗体産生が低下し（３
群、35％抑制）、一方、OVAに対する抗体力価は影響さ
れなかった（６群）。さらに、CD8＋細胞を除去する
と、抗MBP抗体の抑制が中止され、養子免疫伝達および
増殖応答と同様に、CD8＋細胞が抑制の原因であること
を示した。

ラットをMBP＋OVAおよびCFAで免疫した（５回目のMBP
投与の約３日後）。12日後、そのPLNCを採取し、MBPと
一緒に（１−４群）またはOVAと一緒に（５−７群）、
３日間培養した。幾つかの群では、MBP投与し免疫した
ラットから得た照射PLNCを照射し、MBPの存在下（３
群）またOVAの存在下（７群）、免疫PLNCと一緒に培養
した。これらの刺激体の上清を集め、希釈し、ELISAに
よってIgG濃度を調べた。

実施例15 MBPの重複合成ポリペプチドによる、EAEを能動的に抑制
するMBP領域の識別 モルモットのミエリン塩基性タンパクのアミノ酸１−
37フラグメントの重複フラグメントを、固相ペプチド法
を使用して合成した。ホウテン（Houghten,R.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 82:5131-5135（1985））。次いで、こ
れらのフラグメントを、前ミエリン塩基性タンパク15mg
に対する等モル濃度で経口投与した。これらを免疫前、
−７、−５および−２日目に投与した。次ぎに、確立さ
れた方法に従って、フロイントのアジュバンド中塩基性
タンパクで動物をチャレンジし、評価した。

死亡率、疾患の存在および疾患の重篤度について、動
物を評価した。第XI表に示される様に、6/6対照群動物
が罹患し、3/6の死亡率であった。重複ペプチドフラグ
メントを投与した動物では、フラグメント１−10以外、
全てのフラグメントの使用によって、死亡率の低下があ
った。疾患の重篤度の観点では、アミノ酸５〜20の分子
領域が疾患のもっとも著しい低下を示す。これらの結果
は、それ自体が抑制原フラグメントであるアミノ酸領域
１−37では、この分子の特定の領域は、経口投与した場
合、多かれ少なかれ抑制的に働くことを示している。

固相ペプチド法を使用し、モルモットのミエリン塩基
性タンパクの１−37領域の重複フラグメントを合成し
た。次いで、これらのフラグメントを、全ミエリン塩基
性タンパク15mgまで、等モル濃度で経口投与した。これ
らを、免疫前、−７、−５および−２日目に投与した。
次いで、確立された方法に従い、フロイントのアジュバ
ンド中塩基性タンパクで動物をチャレンジし、評価し
た。

実施例16 経口経路によるタンパク抗原の投与によってどのフラグ
メントに対する免疫応答があるかを決定することの説明 足裏にフロイントのアジュバンドと一緒に免疫するか
経口的に投与して、動物に全ミエリン塩基性タンパクを
投与した。その７〜10日後、脾臓およびリンパ節細胞を
採取し、塩基性タンパク分子の種々のフラグメントによ
ってイン・ビトロで再刺激した。

第XII表に示される様に、ミエリン塩基性タンパクを
フロイントのアジュバンド中、抹梢より投与した場合、
増殖によって測定される、主要な応答は44-89脳炎誘発
領域に対してである。しかしながら、第XIII表に示され
るように、経口投与した場合、主要な応答はフラグメン
ト１−37、脳炎非誘発性サプレッサー決定基に対してで
ある。

動物の後足裏に、CFA中50μgMBPで免疫した。10日
後、リンパ節を採取し、イン・ビトロで10μgMBPまたは
等モル量のMBPフラグメントで刺激した。

動物に全MBP1mg×３を投与し、投与の15日後、種々の
器官から細胞を採取し、増殖を測定した。結果を、単独
で培養された細胞と比較し、CPMにおける変化×10^-3で
表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．83（1986），Ｐ Ｐ．7443−7446 Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｊｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．75（1983），ＰＰ．378 −382

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｔ細胞媒介性またはＴ細胞依存性の自己免
   疫疾患のための経口または腸内投与用の治療薬であっ
   て、該自己免疫疾患に特異的な自己抗原、またはそのフ
   ラグメントを必須成分とする治療薬。
2. 【請求項２】少なくとも１種の多発性硬化症に特異的な
   自己抗原を含む、多発性硬化症のための治療薬。
3. 【請求項３】上記自己抗原がMBPであり、上記疾患が多
   発性硬化症である、請求項１記載の治療薬。
4. 【請求項４】上記MBPのフラグメントが脳炎非誘発性MBP
   フラグメントである、請求項３記載の治療薬。
5. 【請求項５】上記脳炎非誘発性MBPフラグメントが、下
   記の配列： からなる群から選ばれる、MBPのアミノ酸１〜37を含
   む、請求項４記載の治療薬。
6. 【請求項６】上記脳炎非誘発性MBPフラグメントが、下
   記の配列： からなる群から選ばれる、MBPのアミノ酸５〜20の領域
   を含む、請求項５記載の治療薬。