DE60130877T2 - Modifizierte peptide enthaltende pharmazeutische präparationen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Präparate, die modifizierte Peptidantigene, insbesondere Peptide, die für Impfungen geeignet sind, umfassen.
  • Bei der Entwicklung moderner Impfstoffe werden Peptide immer wichtiger. In Mausmodellen wurde gezeigt, dass die Co-Injektion einer Mischung von Poly-L-arginin oder Poly-L-lysin zusammen mit einem geeigneten Peptid als Impfung die Tiere vor Tumorwachstum schützt (Buschle et al., Gene Ther. Mol. Biol. 1 (1998) 309–321); Schmidt et al., PNAS 94 (1997), 3262–3267). Dieses chemisch definierte Vakzin ist in der Lage, große Mengen von Antigen/Peptid-spezifischen T-Zellen zu induzieren. Um Antigenspezifische T-Zellen zu induzieren, müssen Peptide von Antigen präsentierenden Zellen (APCs) aufgenommen werden. Diese APCs induzieren eine Immunkaskade, die schließlich zu Induzierung Antigen-spezifischer Immuneffektorzellen führt, z. B. zytotoxischen T-Zellen. Antigene Peptide müssen ein "Depot" bilden, das den APCs genügend Zeit gibt, die Injektionsstelle (des Vakzins) zu infiltrieren. Leider bilden die meisten Peptide kein solches Depot, selbst wenn sie zusammen mit einem Adjuvans injiziert werden. Es ist in Fachkreisen ein wohl bekanntes Problem, dass zahlreiche vielversprechende Peptide, die antigene Regionen medizinisch wichtiger Pathogene definieren, in vivo keine ausreichende Immunantwort auslösen.
  • Die WO 97/40852 betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Bindungsaffinität eines Peptid-Epitops für Moleküle der MHC-Klasse II durch Anhängen einer hydrophoben Aminosäuresequenz an das N-Ende des Peptid-Epitops. Dieses modifizierte Peptid weist eine verbesserte Fähigkeit auf, an Moleküle der MHC Klasse II zu binden, wobei diese so gebildeten Komplexe verwendet werden, um T-Zellen zu inaktivieren, Rezeptoren tragen, die ein Epitop am modifizierten Peptid erkennen. Die gebildeten Komplexe können daher therapeutisch zur Inaktivierung ungewünschter Immunantworten, z. B. Autoimmunantworten, verwendet werden. Daher ist das Ziel der modifizierten Peptide gemäß der WO 97/40852 nicht eine verstärkte Aufnahme in Antigen-präsentierende Zellen, sonder eine Verbesserung der Bindung des Peptid-Epitops an Moleküle der MHC-Klasse II und daher eine Inaktivierung von T-Zellen. Dies steht im Gegensatz zur Aktivierung von T-Zellen durch Antigenpräsentierende Zellen, die das Antigen aufnehmen, es prozessie ren, und die prozessierten Fragmente des Antigens an ihrer Zelloberfläche über Vermittlung von MHC-Molekülen präsentieren.
  • In der US 5,726,292 ist ein Konstrukt beschrieben, das ein Protein, ein Protein-Fragment, Polypeptid oder Peptid, einen hydrophoben Anker und ein Proteosom umfasst, welches Konstrukt als immunogene Zusammensetzung zur Anwendung als therapeutisches Mittel und Vakzin verwendet wird. Dieses Konstrukt weist eine verbesserte immunpotenzierende Aktivität auf. Der hydrophobe Anker kann ein hydrophobes Peptid mit einer Länge von etwa 3 bis 50 Aminosäuren sein. Es ist in diesem Dokument gezeigt, dass das die hydrophobe Aminosäuresequenz alleine (ohne Proteosom) aufweisende Peptid nicht immunogen war, wogegen dasselbe Peptid, das den hydrophoben Schwanz an Proteosome komplexiert aufweist, starke immunogene Aktivitäten aufwies infolge der Verankerung in der Lipid-Komponente.
  • Daher besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, pharmazeutische Präparate zur Verfügung zu stellen, die Peptide aufweisen, welche bei einem Säuger, insbesondere bei Menschen, bei denen dieses Peptid angewendet wird, eine ausreichende Immunantwort auslösen. Ein weiteres Ziel besteht darin, Zusammensetzungen mit modifizierten Peptiden zur Verfügung zu stellen, die von Wildtyp-Antigenen abgeleitet sind und die eine stärkere Immunantwort ermöglichen als das Wildtyp-Peptid. Weiters sollen erfindungsgemäß nicht immunogene Peptide, die Antigene sind, derart modifiziert werden, dass sie immunogen werden. Noch ein weiteres Ziel besteht darin, die immunogene Qualität von Peptidantigenen in pharmazeutischen Zusammensetzungen zu verbessern.
  • Diese Ziele werden mit einem pharmazeutischen Präparat erreicht, das Peptide der Formel XN-PeptidL-XM umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass XN und/oder XM ausgewählt sind aus
    • a) (FI)1-5, (FI)1-5W, (FI)1-5W(FI)1-5, (FL)1-5, (FL)1-5W, (FL)1-5W(FL)1-5, (FI)1-5(FL)1-5, (FL)1-5(FI)1-5, F(II)1-5, (FIL)1-5, (FLI)1-5, (FLL)1-5, (FIF)1-5, (FLF)1-5, (WIL)1-5, (WLI)1-5, (LWI)1-5, (IWL)1-5, (WI)1-5, (WL)1-5, (WL)1-5F, (WI)1-5F, (FV)1-5, (FVI)1-5, (FAI)1-5, (FIA)1-5, (FIV)1-5, (FAI)1-5, (FV)1-5C-C(FV)1-5, (FA)1-5C-C(FA)1-5 und (FV)1-5C-C(FA)1-5, FI)1-5C-C(FI)1-5, (FL)1-5C-C(FL)1-5, (WI)1-5C-C(WI)1-5; (FI)1-5WC-C, (FI)1-5C-C, (FL)1-5WC-C, (FL)1-5C-C, (WI)1-5C-C, (WI)1-5FC-C, worin F Phe ist, I Ile ist, W Trp ist, C Cys ist, C-C eine Cysteinbrücke ist, L Leu ist, V Val ist und A Ala ist; oder
    • b) (ED)1-5, (EDE)1-5, (DED)1-5, (DE)1-5, (DEE)1-5, (EED)1-5, (EXE)1-5, (DXD)1-5, (EXD)1-5, (EX)1-5, (DX)1-5, (ED)1-5(FI)1-5 und (FI)1-5(ED)1-5, (ED)1-5C-C(ED)1-5, (ED)1-5C-C, worin X ausgewählt ist aus Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Cys und Met und E Glu ist, D Asp ist, F Phe ist, I Ile ist, C Cys ist und C-C eine Cysteinbrücke ist;
    wobei PeptidL ein potentiell immunogenes Fragment ist, bestehend aus L-Aminosäureresten, die von einem natürlich vorkommenden Protein abgeleitet sein können; alternativ kann das PeptidL auch ein synthetisch entworfenes immunogenes Peptid sein; L eine ganze Zahl von 6 bis 25 ist, wobei XN und XM Aminosäuresequenzen sind, die an dieser Position und in dieser Konstellation mit PeptidL nicht vorkommen, d. h. nicht natürlich vorkommen, wenn sie aus einer natürlich vorkommenden Substanz abgeleitet und nicht in dieser Position/Konstellation beschrieben sind, wenn sie von einem synthetischen Peptid-Design-Verfahren abgeleitet sind, und eine polykationische Substanz.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung beobachteten, dass insbesondere hydrophobe Peptide in der Lage sind, spezifische T-Zellen zu induzieren, z. B. das mit Tyrosinase in Zusammenhang stehende Protein-2-abgeleitete Peptid VYDFFVWL. Viele Peptide, die Antigene sind, die potenziell als ein Vakzin geeignet sind, sind jedoch an sich nicht sehr hydrophob. Daher macht der Zusatz von Aminosäuren gemäß der vorliegenden Erfindung am N- und/oder C-Ende zu einer bekannten (nicht hydrophoben) Peptidsequenz in Kombination mit einer polykationischen Substanz ein solches Peptid hydrophob und daher stärker immunogen. Mit der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass je mehr hydrophobe Aminosäuren am N- und/oder C-Ende eines neutralen oder hydrophilen Antigens zugegeben wurden, umso mehr Peptid-spezifische T-Zellen durch ein solches modifiziertes Antigen induziert wurden, wenn diese modifizierten Peptide mit polykationischen Substanzen kombiniert sind.
  • Im Prinzip kann jedes Peptid modifiziert werden, um ein immunogenes Peptid in der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zu werden. Es wird jedoch erfindungsgemäß bevorzugt, Peptide zu modifizieren, die für antigene Determinanten kodieren. Insbesondere Peptide mit einer geringen Hydrophobizität oder sogar hydrophile Peptide, die – obwohl sie vielleicht für eine exponierte Oberflächendeterminante eines Pathogens kodieren – keine wirksame Immunantwort auslösen (d. h. nur potenziell pathogen sind), können in effiziente Immunogene umgewandelt werden, wenn sie erfindungsgemäß modifiziert werden. Wenn das PeptidL ein Peptid ist, das aus natürlichen Quellen durch Fragmentierung von Pathogenproteinen erhalten worden ist, sollte die Länge derart gewählt werden, dass sie dafür geeignet ist, z. B. die antigene Determinante sterisch zu definieren. Daher ist L eine ganze Zahl von 6 bis 25, insbesondere von 8 bis 25.
  • Vorzugsweise sind die Aminosäurereste über Peptidbindungen mit PeptidL und miteinander verbunden. Solche Peptide können durch rekombinante Expression oder Merrifield Festphasentechniken leicht und wirtschaftlich hergestellt werden. Diese Verfahren führen zu Aminosäureketten, die durch Peptidbindungen verbunden sind. Andere kovalente chemische Verbindungen zwischen den einzelnen Aminosäureresten sind jedoch ebenfalls möglich, insbesondere Disulfidbindungen (C-C) oder andere Verbindungen, bei welchen funktionelle Gruppen der Aminosäurereste betroffen sind. In der vorliegenden Beschreibung sind Aminosäurereste (wenn nicht anders angegeben) über Peptidbindungen verbunden (d. h. "CC" bedeutet C, über Peptidbindung an C gebunden; "C-C" bedeutet C, über Disulfidbindung an C gebunden).
  • Andererseits konnte auch gezeigt werden, dass der Zusatz von negativ geladenen Aminosäuren am N- und/oder C-Ende eines bekannten Peptids auch zu verbesserten immunogenen Eigenschaften, zur Bildung eines "Depots" führt.
  • Daher haben die in der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Peptide XN und/oder XM ausgewählt aus (FI)1-5, (FI)1-5W, (FI)1-5W(FI)1-5, (FL)1-5,
    (FI)1-5, (FI)1-5W(FL)1-5, (FI)1-5(FL)1-5, (FL)1-5(FI)1-5, F(II)1-5, (FIL)1-5, (FLI)1-5, (FLL)1-5, (FLF)1-5, (FLF)1-5, (WIL)1-5, (WLI)1-5, (LWI)1-5, (IWL)1-5, (WI)1-5, (WL)1-5, (WL)1-5F, (WI)1-5F, (FV)1-5, (FVI)1-5, (FAI)1-5, (FIA)1-5, (FIV)1-5, (FAI)1-5, (FV)1-5C-C(FV)1-5, (FA)1-5C-C(FA)1-5 und (FV)1-5C-C(FA)1-5, (FI)1-5C-C(FI)1-5, (FL)1-5C-C(FL)1-5, (WI)1-5C-C(WI)1-5; (FI)1-5WC-C, (FI)1-5C-C, (FL)1-5WC-C, (FL)1-5C-C, (WI)1-5C-C, (WI)1-5FC-C, worin F Phe ist, I Ile ist, W Trp ist, C Cys ist, C-C eine Cysteinbrücke ist, L Leu ist, V Val ist und A Ala ist.
  • Peptide mit negativ geladenen "Schwänzen" sind Peptide, worin XN und/oder XM ausgewählt sind aus (ED)1-5, (EDE)1-5, (DED)1-5, (DE)1-5, (DEE)1-5, (EED)1-5, (EXE)1-5, (DXD)1-5, (EXD)1-5, (EX)1-5, (DX)1-5, (ED)1-5(FI)1-5 und (FI)1-5(ED)1-5, (ED)1-5C-C(ED)1-5, (ED)1-5C-C, worin X ausgewählt ist aus Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Cys und Met und E Glu ist, D Asp ist, F Phe ist, I Ile ist, C Cys ist und C-C eine Cysteinbrücke ist.
  • Die vorliegenden pharmazeutischen Präparate sind besonders für Impfungen geeignet. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Vakzin, das ein pharmazeutisches Präparat gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, gegebenenfalls mit weiteren pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanzen, insbesondere Adjuvantien. Bevorzugte Adjuvantien in der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung sind natürlich polykationische Substanzen, die besonders geeignet sind, wenn negativ geladene Aminosäure-"Schwänze" als XN und/oder XM verwendet werden.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden polykationische(n) Verbindung(en) kann (können) jede polykationische Verbindung sein, die die charakteristischen Auswirkungen gemäß WO 97/30721 aufweist. Bevorzugte polykationische Verbindungen sind ausgewählt aus basischen Polypeptiden, organischen Polykationen, basischen Polyaminosäuren oder Mischungen davon. Diese Polyaminosäuren sollten eine Kettenlänge von mindestens vier Aminosäureresten haben (vgl.: Tuftsin, wie in Goldman et al., (1983) beschrieben). Besonders bevorzugt sind Substanzen wie Polylysin, Polyarginin und Polypeptide, die mehr als 20%, insbesondere mehr als 50% basische Aminosäuren in einem Bereich von mehr als 8, insbesondere mehr als 20 Aminosäureresten enthalten, oder Mischungen davon. Andere bevorzugte Polykationen und ihre pharmazeutischen Zusammensetzungen sind in der WO 97/30721 (z. B. Polyethylenimin) und WO 99/38528 beschrieben. Vorzugsweise enthalten diese Polypeptide zwischen 20 und 500 Aminosäurereste, insbesondere zwischen 30 und 200 Reste.
  • Diese polykationischen Verbindungen können chemisch oder re kombinant erzeugt werden, oder sie können von natürlichen Quellen abgeleitet werden.
  • Kationische (Poly-)Peptide können auch anti-mikrobiell sein und Eigenschaften haben, über welche in Ganz et al., 1999; Hancock, 1999, ein Überblick gegeben ist. Diese (Poly-)Peptide können prokaryontischen oder tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein, oder sie können chemisch oder rekombinant erzeugt sein (Andreu et al., 1998; Ganz et al., 1999; Simmaco et al., 1998). Die Peptide können auch zur Klasse der Defensine gehören (Ganz, 1999; Ganz et al., 1999). Sequenzen solcher Peptide kann man beispielsweise in der Antimicrobial Sequences Database unter der folgenden Internet-Adresse finden:
    http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag1.html
  • Solche Wirtsverteidigungspeptide oder Defensine sind auch eine bevorzugte Form des polykationischen Polymers gemäß der vorliegenden Erfindung. Im Allgemeinen wird eine Verbindung, die als Endprodukt eine Aktivierung (oder Niederregulierung) des adaptiven Immunsystems, vorzugsweise durch APCs (einschließlich dendritischer Zellen) vermittelt, ermöglicht, als polykationisches Polymer verwendet.
  • Besonders bevorzugt zur Verwendung als polykationische Substanz sind bei der vorliegenden Erfindung von Cathelicidin abgeleitete antimikrobielle Peptide oder deren Derivate, insbesondere antimikrobielle Peptide, die von Säuger-Cathelicidin, vorzugsweise von Mensch, Rind oder Maus, stammen.
  • Zu den aus natürlichen Quellen stammenden polykationischen Verbindungen zählen HIV-REV oder HIV-TAT (abgeleitete kationische Peptide, Antennapedia-Peptide, Chitosan oder andere Chitin-Derivate), oder andere Peptide, die von diesen Peptiden oder Proteinen mittels biochemischer oder rekombinanter Erzeugung abgeleitet wurden. Andere bevorzugte polykationische Verbindungen sind Cathelin oder verwandte oder abgeleitete Substanzen von Cathelin. Beispielsweise ist Mäuse-Cathelin ein Peptid, das die Aminosäure-Sequenz NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH hat. Verwandte oder abgeleitete Cathelin-Substanzen enthalten die gesamte oder Teile der Cathelin-Sequenz mit mindestens 15–20 Aminosäureresten. Derivatisierungen können die Substitution oder Modifizierung der natürlichen Aminosäuren durch Aminosäuren, die nicht zu den 20 Standard-Aminosäuren gehören, inkludieren. Au ßerdem können weitere kationische Reste in solche Cathelin-Moleküle eingeführt werden. Diese Cathelin-Moleküle werden bevorzugt mit dem Antigen kombiniert. Diese Cathelin-Moleküle erwiesen sich überraschenderweise auch als Adjuvans wirksam für ein Antigen ohne die Zugabe weiterer Adjuvantien. Es ist daher möglich, solche Cathelin-Moleküle als effiziente Adjuvantien in Vakzin-Formulierungen mit oder ohne weitere immunaktivierende Substanzen zu verwenden.
  • Eine weitere bevorzugte, gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende polykationische Substanz ist ein synthetisches Peptid, das mindestens 2 KLK-Motive, getrennt durch einen Linker aus 3 bis 7 hydrophoben Aminosäuren, enthält.
  • Immunstimulierende Desoxynukleotide sind z. B. natürliche oder künstliche CpG enthaltende DNA, kurze DNA-Abschnitte, die von Nicht-Vertebraten stammen, oder in Form kurzer Oligonukleotide (ODNs) vorliegen, die nicht-methylierte Cytosin-Guanin-Dinukleotide (CpG) in einem bestimmten Basen-Kontext enthalten (z. B. Krieg et al., 1995), aber auch Inosin enthaltende ODNs (I-ODNs) oder Poly-I:C und Oligo-dI:C.
  • Neuroaktive Verbindungen, beispielsweise in Kombination mit polykationischen Substanzen, sind in der WO 01/24822 beschrieben.
  • Die erfindungsgemäßen Vakzinzusammensetzungen können gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, z. B. als i. v.-Vakzine, DNA-Vakzine, orale Vakzine, transdermale Vakzine, topische Vakzine, intranasale Vakzine und als Kombinationsvakzine. Die Dosierungen können durch Standardverfahren ausgewählt werden. Für Vakzine, bei denen es sich um Verbesserungen bekannter Vakzine handelt, ist jedoch für den gleichen Schutz eine geringere Dosierung als beim bekannten Vakzin möglich und daher bevorzugt.
  • Vorzugsweise wird das Vakzin in einer lagerstabilen Form zur Verfügung gestellt, z. B. lyophilisiert, gegebenenfalls zur Verfügung gestellt in Kombination mit einer geeigneten Rekonstitutionslösung.
  • Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Zeichnungen noch detaillierter beschrieben, wäre jedoch natürlich nicht darauf beschränkt.
  • 1 zeigt die Immunisierung mit einem von Ovalbumin abgeleiteten Peptid mit einem hydrophoben Schwanz und (gegebenen falls) Polyarginin.
  • 2 zeigt die Immunisierung mit von Ovalbumin abgeleitetem Peptid und einem negativ geladenen Aminosäureschwanz mit Polyarginin.
  • 3 zeigt die Immunisierung mit einem von Ovalbumin abgeleiteten, Klasse I H-2Kb-eingeschränkten Peptid, das durch direktes Hinzufügen von F und I am C-Ende „hydrophober" gemacht wurde.
  • 4 zeigt die Immunisierung mit einem Ovalbumin-Peptid, das durch direktes Hinzufügen von L und A am N-Ende „hydrophober" gemacht wurde.
  • Beispiel 1:
  • Das von Ovalbumin abgeleitete Klasse I H-2Kb restringierte Peptid ("245"), SIINFEKL (wobei es sich um einen schwachen Induktor von T-Zellen handelt, allein oder in Kombination mit einem Adjuvans wie Poly-L-arginin) wurde hydrophober gemacht, indem direkt F und I zugegeben wurden oder FIFIW über eine C-C-Brücke zugegeben wurde. Gruppen von 4 Mäusen (C57BL/6, weiblich, 8 Wochen alt, H-2b) wurde subkutan in die Flanke 3 Mal (Tage 0, 21 und 28) Folgendes injiziert (Dosis 100 μg Peptid, Molarität angepasst; +/– 100 μg Poly-L-arginin pro Maus):
    • 1) SIINFEKL (Peptid "245", 4 von 8 Aminosäuren (AS) hydrophob)
    • 2) FISIINFEKL (6 von 10 AS hydrophob)
    • 3) FIFISIINFEKL (8 von 12 AS hydrophob)
    • 4) FIFIFISIINFEKL (10 von 14 AS hydrophob)
    • 5) SIINFEKL + Poly-L-arginin
    • 6) FISIINFEKL + Poly-L-arginin
    • 7) FIFISIINFEKL + Poly-L-arginin
    • 8) FIFIFISIINFEKL + Poly-L-arginin
    • 9) FIFIWC-CSIINFEKL (11 von 15 AS hydrophob)
    • 10) FIFIWC-CSIINFEKL + Poly-L-arginin
  • Eine Woche nach der dritten Impfung wurde jeweils die Milz entfernt, und die Splenozyten wurden ex vivo mit Peptid SIINFEKL ("245") aktiviert, um IFN-7 produzierende spezifische Zellen zu bestimmen (ELISpot-Assay).
  • Je mehr hydrophobe Aminosäuren am N-Ende des Peptids SIINFEKL zugegeben wurden, desto mehr Peptid-spezifische T-Zellen wurden induziert (siehe 1). Die Peptide FIFISIINFEKL und FIFIFISIINFEKL waren sogar in der Lage, ohne Zugabe von Poly-L-arginin etwa 100 Peptid-spezifische T-Zellen pro 1 Million Milzzellen zu induzieren. Das Peptid FIFIFISIINFEKL in Kombination mit Poly-L-arginin induzierte mehr als 400 SIINFEKL-spezifische T-Zellen unter 1 Million Splenozyten (ähnlich wie Peptid FIFIWC-CSIINFEKL).
  • Beispiel 2:
  • Das neutrale Peptid SIINFEKL (eine negativ geladene (E), eine positiv geladene (K) Aminosäure) wurde durch den Zusatz (am N-Ende) von EE bzw. EDED negativ gemacht.
  • Gruppen von 4 Mäusen (C57BL/6, weiblich, 6 Wochen alt, II-2b) wurde subkutan in die Fußsohle 3 Mal (Tage 0, 14, 28) Folgendes injiziert (Dosis 100 μg Peptid, Molarität angepasst; + 100 μg Poly-L-arginin pro Maus):
    • 1) SIINFEKL (Peptid "245") + Poly-L-arginin
    • 2) EESIINFEKL (Peptid "246") + Poly-L-arginin
    • 3) EDEDSIINFEKL (Peptid "080") + Poly-L-arginin
  • Gruppen von 4 Mäusen wurden subkutan in die Fußsohle 3 Mal geimpft, wie angegeben. Eine Woche nach der dritten Impfung wurden der Lymphknoten in der Kniekehle und die Milz entfernt, und Lymphknotenzellen und Splenozyten wurden ex vivo mit Peptid SI-INFEKL ("245") aktiviert, um IFN-γ produzierende spezifische Zellen zu bestimmen (ELISpot-Assay).
  • Wie aus 2 ersichtlich ist, versetzt der Zusatz von 4 negativ geladenen Aminosäuren (EDED) am N-Ende von Peptid SIINFEKL dieses Peptid (in Kombination mit Poly-L-arginin) in die Lage, eine große Menge spezifischer IFN-γ produzierender T-Zellen im ableitenden (Kniekehlen-)Lymphknoten (lokale Antwort) und in der Milz (systemische Antwort) zu induzieren.
  • So formen der Zusatz von hydrophoben Aminosäuren sowie die Zugabe von negativ geladenen Aminosäuren das Peptid SIINFEKL zu einem guten Induktor spezifischer T-Zellen um.
  • BEISPIEL 3:
  • C-Ende anstatt N-Ende
  • SIINFEKL mit 4 hydrophoben (fett) Aminosäuren wurde durch direktes Anfügen von F und I am C-Ende „hydrophober" gemacht. Das bereits beschriebene (an N-Ende verlängerte) Peptid FIFISIINFEKL diente als Kontrolle für SIINFEKLFIFI.
  • Gruppen von 4 Mäusen (C57BL/6, weiblich, 8 Wochen alt, H-2b) wurde subkutan in die Hinterfußsohlen Folgendes injiziert (Dosis 100 μg Peptid, Molarität angepasst; + 100 μg Poly-L-arginin pro Maus):
    • 1) SIINFEKL (Peptid "245") + Poly-L-arginin (4 von 8 AS hydrophob)
    • 2) FIFISIINFEKL (Peptid "1015") + Poly-L-arginin (8 von 12)
    • 3) SIINFEKLFIFI (Peptid "1078") + Poly-L-arginin (8 von 12)
  • Gruppen von 4 Mäusen wurden subkutan in die Hinterfußsohlen wie angegeben geimpft. 7 Tage nach der Impfung wurden Einzelzell-Suspensionen der Milzen hergestellt, und die Zellen wurden ex vivo restimuliert, um IFN-γ produzierende Zellen über ELISpot-Assay zu detektieren.
  • Wie aus 3 ersichtlich ist, konnten im Gegensatz zum Peptid SIINFEKL die Peptide FIFISIIFEKL und SIINFEKLFIFI (in Verbindung mit Poly-L-arginin) große Mengen an SIINFEKL-spezifischen IFN-γ produzierenden T-Zellen induzieren.
  • Somit funktioniert die Zugabe hydrophober Aminosäuren gleichermaßen gut (hinsichtlich der Induktion von Peptid-spezifischen T-Zellen) am N-Ende bzw. am C-Ende.
  • BEISPIEL 4:
  • L und A anstelle von F und I
  • Das Peptid SIINFEKL mit 4 hydrophoben (fett) Aminosäuren wurde durch direktes Anfügen von L und A am N-Ende „hydrophober" gemacht. Das bereits beschriebene (am N-Ende verlängerte) Peptid FIFIFISIINFEKL diente als Kontrolle für das Peptid LALALASIINFEKL.
  • Gruppen von 4 Mäusen (C57BL/6, weiblich, 8 Wochen alt, H-2b) wurde subkutan in die Hinterfußsohlen Folgendes injiziert (Dosis 100 μg Peptid, Molarität angepasst; + 100 μg Poly-L-arginin pro Maus):
    • 1) SIINFEKL (Peptid "245") + Poly-L-arginin
    • 2) FIFIFISIINFEKL (Peptid "1016") + Poly-L-arginin
    • 3) LALALASIINFEKL (Peptid "1135") + Poly-L-arginin
  • Das Ergebnis des Impfversuchs mit dem Peptid SIINFEKL, das durch direktes Anfügen von L und A am N-Ende „hydrophober" gemacht wurde, ist in 4 gezeigt. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00110001
    Figure 00120001
    Figure 00130001

Claims (3)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid der Formel XN-PeptidL-XM, dadurch gekennzeichnet, dass XN und/oder XM ausgewählt sind aus a) (FI)1-5, (FI)1-5W, (FI)1-5W(FI)1-5, (FL)1-5, (FL)1-5W, (FL)1-5W(FL)1-5, (FI)1-5(FL)1-5, (FL)1-5(FI)1-5, F(II)1-5, (FIL)1-5, (FLI)1-5, (FLL)1-5, (FIF)1-5, (FLF)1-5, (WIL)1-5, (WLI)1-5, (LWI)1-5, (IWL)1-5, (WI)1-5, (WL)1-5, (WL)1-5F, (WI)1-5F, (FV)1-5, (FVI)1-5, (FAI)1-5, (FIA)1-5, (FIV)1-5, (FAI)1-5, (FV)1-5C-C(FV)1-5, (FA)1-5C-C(FA)1-5 und (FV)1-5C-C(FA)1-5, (FI)1-5C-C(FI)1-5, (FL)1-5C-C(FL)1-5, (WI)1-5C-C(WI)1-5; (FI)1-5WC-C, (FI)1-5C-C, (FL)1-5WC-C, (FL)1-5C-C, (WI)1-5C-C, (WI)1-5FC-C, worin F Phe ist, I Ile ist, W Trp ist, C Cys ist, C-C eine Cysteinbrücke ist, L Leu ist, V Val ist und A Ala ist; oder b) (ED)1-5,(EDE)1-5, (DED)1-5, (DE)1-5, (DEE)1-5, (EED)1-5, (EXE)1-5, (DXD)1-5, (EXD)1-5, (EX)1-5, (DX)1-5, (ED)1-5(FI)1-5 und (FI)1-5(ED)1-5, (ED)1-5C-C(ED)1-5, (ED)1-5C-C, worin X ausgewählt ist aus Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Cys und Met und E Glu ist, D Asp ist, F Phe ist, I Ile ist, C Cys ist und C-C eine Cysteinbrücke ist; wobei PeptidL ein potentiell immunogenes Fragment ist, bestehend aus L-Aminosäureresten; L eine ganze Zahl von 6 bis 25 ist, mit der Maßgabe, dass XN und XM Aminosäuresequenzen sind, die in dieser Position mit PeptidL nicht natürlich vorkommen, wenn aus einer natürlich vorkommenden Substanz abgeleitet und nicht in dieser Position/Konstellation mit PeptidL beschrieben, wenn von einem synthetischen Gestaltungsverfahren für Peptide abgeleitet, und eine polykationische Substanz.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die polykationische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus basischen Polypeptiden, organischen Polykationen und polykationischen antimikrobiellen Peptiden, insbesondere antimikrobielle Peptide, die aus Cathelicidin abgeleitet sind, oder Mischungen davon.
  3. Vakzin umfassend eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2.
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