WO1997010335A1 - Rekombinantes polypeptid basierend auf der primärsequenz der invarianten kette mit mindestens einer primärsequenz von einem spezifischen t-zellepitop oder eines proteinderivats und dieses rekombinante polypeptid kodierende nukleinsäuren - Google Patents

Rekombinantes polypeptid basierend auf der primärsequenz der invarianten kette mit mindestens einer primärsequenz von einem spezifischen t-zellepitop oder eines proteinderivats und dieses rekombinante polypeptid kodierende nukleinsäuren Download PDF

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recombinant polypeptide
cell epitope
invariant chain
nucleic acid
sequence
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PCT/DE1996/001763
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Arthur Melms
Georg Malcherek
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Universität Tübingen
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acids which contain at least one nucleic acid sequence coding for a recombinant polypeptide, the recombinant polypeptide at least partially containing the primary sequence of the invariant chain and at least one primary sequence of a specific T cell epitope or a protein and in antigen presenting cells for binding the specific T cell epitope to MHC class II molecules is processed in the desired manner.
  • the vaccines known to date in the prior art tend, inter alia, to cause side effects because of the breadth of their immunogenicity.
  • one a ⁇ zelnes viral or bacterial antigen in the control of MEH ⁇ reren nundert amino acids whereas T cells recognize only a klei ⁇ NEN Ausscr.nitt ( ⁇ 20 amino acids)
  • vaccines based on peptides have been developed.
  • peptides have several disadvantages, such as a short half-life, an unpredictable and unspecific distribution in the organism, a low uptake in the cell, an unclear processing route.
  • Antigens are presented as protein fragments on the surface of so-called "antigen-presenting cells” and recognized by T-lymphocytes as effector cells.
  • the MHC class I and class II molecules act as peptide receptors in the antigen-presenting cells. To ensure a functional dichotomy, the MHC molecules are loaded with the processed antigen peptides in a precisely regulated manner in certain MHC loading compartments.
  • MHC molecules are representatives of a polymorphic gene family that is chromosomally encoded in a special region, the main histocompatibility complex ("major histocompatibility complex", "MHC”).
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA human leukocyte antigen
  • MHC class I molecules are loaded directly at the site of the biosynthesis with de novo translated virus or tumor antigens, but also with the body's own cytosolic protein fragments.
  • MHC class II molecules hereinafter referred to as "MHC II molecules” are loaded in cellular compartments that are connected to the extracellular environment.
  • the MHC II molecules comprise the HLA-DR, HLA-DQ and HLA-DP molecules, each of all official in various genetically ko ⁇ alleles occur.
  • bakteri ⁇ elle Ancigene from the extracellular milieu added ⁇ to and practice-antigen after intracellular processing in the senting cells are presented on their cell surface.
  • the physiology of the MHC molecules is designed so that they can present the broadest possible spectrum of antigenic peptides. Consequently, the number of copies of a defined antigenic peptide on the cell surface of antigen-presenting cells is very small (order of magnitude 10 of a defined antigenic peptide with a total population of about 10 peptide receptors). This means that a very heterogeneous mixture of a large number of different antigenic peptides (“peptide ligands”) bound to MHC molecules is exposed on the cell surface of the antigen-presenting cells.
  • MHC / peptide complexes have so far been based on the expression of recombinant MHC molecules, e.g. B. in the baculovirus or E. col i expression system. These MHC II molecules have an empty binding pit and can be loaded with suitable peptides in vitro. The loading efficiency is very different and can only be used for in vitro investigations.
  • MHC II molecules which, constructed as a fusion protein (of the ⁇ chain), terminally have a desired ligand via a flexible linker.
  • This ligand section spontaneously fills the binding pit, so that, depending on the cell type used, a more or less large proportion of MHC II molecules carries this defined peptide ligand.
  • This approach is limited to DNA transfection of host cells, while a direct Ap ⁇ plication at the protein level is not possible.
  • the present invention is therefore based on the object of increasing the antigenicity of proteins and / or of reducing the (intrinsic) heterogeneity of the MHC II / antigenic peptide complexes of antigen-presenting cells, wooei
  • the above-mentioned disadvantages of the vaccination processes described in the prior art should be eliminated.
  • a new system for a directed and highly specific stimulation of the immune system by precisely definable antigenic peptides is to be provided, for example in order to improve the vaccination of mammals.
  • a nucleic acid which contains at least one nucleic acid sequence coding for a recombinant polypeptide, the recombinant polypeptide at least partially the primary sequence of the invariant chain and at least one primary sequence of a specific T cell epitope which is in the region of the invariant chain comprising the CLIP sequence is inserted, and the recombinant polypeptide is processed in antigen-presenting cells in such a way that the specific T cell epitope is generated and binds to MHC II molecules.
  • a nucleic acid which contains at least one nucleic acid sequence coding for a recombinant polypeptide, the recombinant polypeptide at least partially containing the primary sequence of the invariant chain and at least one primary sequence from a specific T cell epitope, at least an amino acid of the region of the invariant chain comprising the CLIP sequence is deleted and replaced by the T cell epitope, and wherein the recombinant polypeptide is processed in antigen-presenting cells in such a way that the specific T cell epitope is generated and transferred to MHC II Molecule binds.
  • hybrid protein denotes a construct which is produced using molecular biological techniques and is based on the natural DNA of the original genome or the natural DNA modified with a foreign DNA sequence and can be recombined, e.g. with plasmids and can be replicated and expressed in a suitable host system.
  • T cell epitope means an antigenic / immunogenic sequence of a protein which activates T lymphocytes and, according to the invention, comprises the primary sequence of the T cell epitope or the primary sequence of an (antigenic) polypeptide or protein or antigen which contains at least one primary sequence of a T cell epitope.
  • T lymphocytes usually recognize this stimulus using a T cell receptor in the form of a peptide linked to MHC molecules.
  • T cell epitopes can also only cause partial activation, with a decoupling of various processes associated with T cell activation being possible. This can relate to the decoupling of the proliferative or cytotoxic from the release of individual media substances (lymphokines) or their qualitative or quantitative composition.
  • ligands have minor changes in their primary sequence compared to conventional T cell epitopes (e.g. substitution of individual amino acids) and are referred to in the literature as "altered peptide ligands" ("altered peptide ligands", “APLs"). Under experimental conditions, the APLs are believed to have immunotherapeutic potential.
  • One embodiment of the present invention relates in particular to the modulation of a subpopulation of T-lymphocytes, which is characterized by the expression of the CD4 feature, and the antigens by means of so-called MHC II recognizes molecules.
  • T-lymphocytes which is characterized by the expression of the CD4 feature, and the antigens by means of so-called MHC II recognizes molecules.
  • MHC class II restricted these T cells are called "MHC class II restricted”.
  • CD4-Ly ⁇ - phocytes comprise the most important regulatory T cell population, which are included in a large number of so-called T cell-dependent immune reactions.
  • RA rheumatoid arthritis
  • IDDM juvenile insulin-dependent diabetes mellitus
  • MS multiple sclerosis
  • processing of the recombinant polypeptide in antigen-presenting cells means the intracellular degradation of antigenic proteins in units which can ultimately be presented in association with MHC molecules on the cell surface.
  • the processing of MHC class II restricted antigens takes place in distinct cellular compartments, which are called endosomal-lysosomal compartments or "class II compartment” or "class II loading compartment”.
  • MHC II molecules, invariant chain or its degradation products, HLA-DM and antigenic peptides are concentrated there as minimal functional elements.
  • proteinases such as cathepsin D and E, which have their optimum activity at acidic pH, are given a function in antigen processing.
  • the recombinant polypeptide at least partially contains the primary sequence of the invariant chain.
  • invariant chain (II) denotes a conserved polypeptide which, for example, contains all MHC class II alleles and isotypes investigated to date. is associated with humans and mice.
  • the invariant chain comes in four isoforms, p33, p35, p41 and p43, the sequence of which is encoded outside the MHC locus. It performs its regulatory function in antigen processing through its association in the endoplasmic reticulum with MHC II molecules immediately after its biosynthesis.
  • the invariant chain is one of the first proteins that associate with MHC II molecules in the endoplasmic reticulum and, which is particularly important in this context, remains associated with the MHC II molecules until a so-called "class II" loading compartment "is reached. It is believed that in this distinct cellular sub-compartment, which contains a number of regulatory factors such as e.g. B. concentrate the invariant chain or its degradation products, HLA-DM, MHC II molecules and antigens, the invariant chain is cleaved by proteolytic activity, a complex of MHC II molecules with peptide derivatives of the invariant chain (so-called " CLIPs ”) occurs.
  • CLIPs complex of MHC II molecules with peptide derivatives of the invariant chain
  • the region of the invariant chain comprising the CLIP sequence can be at least partially deleted and replaced by a desired T cell epitope.
  • area encompassing the CLIP sequence means a section in the natural invariant chain that contains the CLIP region from the AS positions 97 to 126 (based on the isoform p35 starting at the first start codon) with the sequence
  • Suitable T cell epitopes are preferably inserted into the CLIP region from AS positions 97-126, more preferably 107-115, of the natural invariant chain or at least one amino acid of this region is deleted and replaced by the T cell epitope.
  • the constructs which contain the nucleic acid according to the invention and which are produced by conventional technological methods, must have the correct reader frame for the desired expression of the recombinant polypeptides.
  • Another object of the present invention is a vector which contains the above-defined nucleic acid according to the invention for the expression of the recombinant polypeptide in prokaryotic or eukaryotic host cells.
  • He invention ⁇ proper vector may preferably contain suitable regula ⁇ innovative elements such as promoters, enhancers, zen Terminationssequen-.
  • the inventive vector can ⁇ example, an expression vector or a vector for preferably stable integration of the nucleic acid according to the invention into the genetic material of a host cell.
  • a suitable expression system is, for example, the baculovirus system, the E. coli expression system, or expression vectors for mammalian cells such as, for. B. on vaccinia, adeno, SV40 or on retrovirus based vectors.
  • Another object of the present invention is a host cell which contains the nucleic acid according to the invention or the vector according to the invention.
  • Suitable host cells are, for example, prokaryotes, such as E. coli, or eukaryotic host cells such as COS, Heia, CHO cells, in particular mammalian antigen-presenting cells.
  • the nucleic acid according to the invention is either stably integrated in the genetic material of the host cell or the vector according to the invention contains suitable regulatory regions for replication, transcription and / or translation in vivo and / or in vitro, i.e. also in the cell-free system.
  • Another object of the invention is the recombinant polypeptide itself, which is encoded by the nucleic acid sequence defined above, it being possible for the nucleic acid sequence to be degenerate in accordance with the genetic code.
  • the he find proper recombinant polypeptide can be prepared by post-Translational reactions in vivo, or by in the art known chemical and / or enzymatic methods in vi tro be ddext mo ⁇ .
  • the nucleic acid sequence of the invention and hybrid DNA, the vector of the invention and the invention ReKoM ⁇ binante polypeptide may be prepared by methods known in the art are prepared.
  • the hybrid DNA can be in a suitable expression vector (z. B. pQE31, Fa. Diagen, Hilden, Germany) and competent M15 cells as host cells can be transfor ⁇ mized by CaCl 2 method. Transformed cells are selected using their ampicillin resistance and as individual colonies for the Cultivation in liquid medium used. After induction with IPTG, the recombinant protein is produced and, after 3 hours, purified from the cell lysate by means of metal affinity chromatography.
  • composition comprising the nucleic acid according to the invention or the recombinant polypeptide and optionally at least one pharmaceutically acceptable carrier is a further subject of the present invention.
  • the nucleic acid according to the invention can serve as a universally usable vehicle for enhancing and homogenizing the antigen presentation for, in particular, CD4 positive T cells from mammals, preferably from humans.
  • T-cell epitopes of any origin can be introduced into the loading compartment for the MHC II molecules by the recombinant polypeptide according to the invention, the T-cell epitopes from the recombinant polypeptide being processed by processing signals and using intrinsic binding properties on MHC II molecules are presented.
  • the homogenization of the T cell epitopes on the surface of antigen presenting ("immunocompetent") cells can be used to investigate the autoreactive potential at the T cell level.
  • the T cell epitopes are used as probes for a possible predisposition to autoimmune diseases.
  • Known T cell epitopes can be used as a probe for a predisposition of e.g. B. rheumatic arthritis, multiple sclerosis, insulin-dependent diabetes mellitus, myasthenia gravis are used.
  • Another object of the present invention is thus a diagnostic kit for the detection of autoimmune diseases which contains at least the nucleic acid according to the invention or the recombinant polypeptide according to the invention.
  • the recombinant polypeptide expressed by the nucleic acid according to the invention in antigen-presenting cells or the recombinant polypeptide according to the invention itself can be taken up into the antigen-presenting cell and then specifically processed and presented the desired T (s) Cell epitopes (epitopes) are used for highly specific and selective vaccination.
  • Such a vaccination, initiated by the nucleic acid according to the invention or the recombinant polypeptide according to the invention surprisingly shows the following advantages:
  • the intracellular processing of the recombinant polypeptide selectively and highly specifically generates only a specific T cell epitope or antigenic fragment.
  • the processing efficiency of a T cell epitope contained in the recombinant polypeptide according to the invention is several orders of magnitude higher; i.e. an application with a tailor-made antigen or antigenic peptide shows a significantly higher vaccination efficiency in vivo with significantly reduced molar vaccine doses.
  • Vaccination with a hybrid consisting of parts of the invariant chain and a known antigen containing T cell epitopes is possible without T cell epitopes having to be exactly defined.
  • This approach should be useful in combating intracellular pathogens (viruses, parasites, mycobacteria) and enhancing the T cell response against tumor antigens.
  • T cell epitopes allow focused and specific intervention in the case of allergic reactions with the aim of desensitizing allergen-specific T cells. Analogously, this approach should also in autoimmune diseases as well as in the con ⁇ trolls be possible transplant rejection.
  • the recombinant polypeptide according to the invention can be used to modulate the immune response through self, foreign and design. ner peptides are used, such a modulation being able to be carried out more efficiently owing to the advantages of the recombinant polypeptide according to the invention listed above.
  • the activation state of T cells can be influenced by integrating so-called "altered peptide ligands (APL)" as T cell epitopes in the recombinant polypeptide according to the invention.
  • APL altered peptide ligands
  • FIG. 1 shows the titration curves of various forms of administration of the tetanus toxin (TT) or the antigenic peptides / polypeptides from Clos tridiiuv tetani, the incorporation rate of 3 H-thymidine being shown as a measure of the T cell proliferation as a function of the antigen concentration .
  • the basal proliferation without the addition of an antigen is 1,500 cpm.
  • the antigenic TT peptide TT (1061-1075) contains the T cell epitope.
  • the Ii-TT hybrid contains the core sequence TT (1064-1072) instead of the CLIP core sequence Iii07 -T -I ⁇ i5 of the invariant chain.
  • TTC is a recombinant polypeptide of the C fragment of the TT which naturally contains the antigenic TT peptide TT (1061-1075).
  • the CLIP-TT hybrid is a hybrid of a CLIP peptide in which the CLIP core sequence has been replaced by the core epitope TT (1064-1072). In the Ii-P-TT hybrid, the proportion of the CLIP sequence at the N-terminus is shortened.
  • FIG. 2 is a Coomassie blue staining of an SDS polyacrylamide gel with the display of a recombinant II-TT hybrid protein after purification by means of metallo-affinity chromatography.
  • Lane 2 shows the recombinant Ii-TT hybrid protein as a single band with a molecular weight of about 22 kilodaltons (K). Molecular weight markers with 20 K and 30 K are shown in lane 1.
  • T cell epitope from the tetanus toxin is integrated into the sequence of the invariant chain.
  • This hybrid antigen enhances the MHC class II restricted T helper cell response by several potencies compared to the natural antigen or the recombinant C fragment.
  • the system uses as an antigen the toxin from Clos tridi um tetani, from which a T cell epitope is integrated into the invariant chain as a processing unit.
  • the primary sequence of this tetanus toxin is known (Eisel et al., EMBO J., 1986), as are a large number of antigenic determinants generated therefrom for human T cells.
  • the T cell epitope TT (1061-1075) of this tetanus toxin has recently been identified as the dominant T cell epitope for T cells from DR17-positive donors (Malcherek et al., In press).
  • the restriction element for the detection of TT (1061-1075) is the MHC class II molecule HLA-DR17.
  • the specific contact points to the HLA-DR17 molecule on the one hand (so-called anchors) and to the T-cell receptor on the other hand (T-cell receptor contact points) can be dissociated with the aid of alanine-substituted peptide analogs and set to a core epitope of nine amino acids (IREDNNITL) (Malcherek et al., in press).
  • the additional amino acids outside this core sequence of the TT peptide generally stabilize the binding to the MHC molecule without these amino acid side chains interacting specifically with the MHC molecule (Malcherek et al., J. Immunol. 1994, 153: 1141).
  • the titration curves of various dosage forms of the tetanus toxin or of the antigenic peptides / polypeptides show the antigenic character of the Ii-TT hybrid protein, which moreover has a dramatically increased immunogenicity compared to the native antigen and the recombinant C fragment of the TT has (see FIG. 1).
  • This amplification effect is all the more remarkable in view of the fact that the dominant T cell epitope TT (1061-1075) of tetanus toxin is already processed very efficiently in its physiological environment in the native toxin and is recognized by specific T cells (Malcherek et al. , under pressure) .
  • hybrid peptides can be used to show that the core sequence is indeed sufficient for optimal stimulation (cf. FIG. 1).
  • These hybrid peptides are designed so that the core sequence from the tetanus toxin is flanked by amino acids from the CLIP peptides. The aim is to imitate the situation that is expected when processing the hybrid antigen.
  • the shorter peptide KPVSK-TT (1064-1072) -QA (“Ii-P-TT-Hybrid”) stimulates as well as the original T cell epitope TT (1061-1075).
  • the longer peptide on the other hand, which is more or less a CLIP hybrid (“CLIP-TT hybrid”), clearly has a stronger antigenic potential than TT (1061-1075).
  • sequences of the CLIP region outside the core sequence of II (107-115) can increase the antigenicity of the core sequence of the T cell epitope.
  • a further strengthening effect of the antigenicity of the hybrid protein in comparison to the native protein or to the recombinant C fragment is provided by the sequences lying on the invariant chain for optimal processing of the T cell epitopes.
  • p35 Ii The cDNA of p35 Ii (pcDV; ] _, Strubin et al., 1986) is amplified with 5'- and 3 '-specific oligonucleotide primers in such a way that only the coding sequence is newly inserted in EcoRI restriction sites in pBluescript KS + "(from Stratagene, Heidelberg, Germany) can be subcloned.
  • the PstI / BamHI fragment is then converted into pQE3 1 (Diagen, Hilden, Germany), a bacterial expression vector, subcloned, the plasmid DNA cassette pQE31 / Ii-TT being obtained.
  • the expression of the recombinant Ii-TT hybrid protein follows essentially in accordance with the instructions for the QIAexpress system (Diagen, Hilden, Germany).
  • Cla ⁇ tent E. coli M15 cells are mized with pQE31 / II-TT transfor ⁇ and 100 ml of bacterial culture of at ODgoo ° 'with 5: IPTG induced.
  • IPTG induced IPTG induced.
  • the cell pellet is lysed in 20 ml of 6M guanidine hydrochloride and the supernatant after ultracentrifugation (21,500 rpm, TI45) is chromatographed on a Ni-NTA metal affinity column (Diagen, Hilden, Germany). land) cleaned.
  • the pH 4.5 eluate is analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the Coomassie blue staining shows a single band at 22 KD with no visible bacterial contaminants.
  • the identity of the II-TT protein hybrid was determined by ELISA with the li-specific monoclonal antibodies M-B741 (gift from Prof. Dr. Rieber, Institute of Immunology, Kunststoff) and SD3253.74 (gift from Dr. H. Kaibacher, Physiological-Chemical Institute, University of Tübingen).)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die mindestens eine für ein rekombinantes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten, wobei das rekombinante Polypeptid mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Primärsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop enthält, und in Antigen-präsentierenden Zellen für eine Bindung des spezifischen T-Zellepitops an MHC II-Moleküle in gewünschter Weise prozessiert wird.

Description

REKOMBINANTES POLYPEPTID BASIEREND AUF DER PRIMARSEQUENZ DER INVARIANTEN KETTE MIT MINDESTENS EINER PRIMÄRSEQUENZ VON EINEM SPEZIFISCHEN T-ZELLEPITOP ODER EINES PROTEINDERIVATS UND DIE¬ SES REKOMBINANTE POLYPEPTID KODIERENDE NUKLEINSÄUREN
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die minde¬ stens eine für ein rekombinantes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten, wobei das rekombinante Polypep¬ tid mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Primärsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop oder einem Protein enthält und in Antigen-präsen- tierenden Zellen für eine Bindung des spezifischen T- Zellepitops an MHC Klasse II-Moleküle in gewünschter Weise prozessiert wird.
Gegen eine Vielzahl von Pathogenen stehen keine geeigneten Impfstoffe zur Verfügung. Bei den herkömmlichen Methoden der Vakzinierung werden abgetötete oder abgeschwächte Erreger als Impfstoff verwendet. Um unerwünschte Nebenwirkungen oder sogar einen Krankheitsausbruch zu verhindern, wurde in einzelnen Fällen versucht, Impfstoffe auf wenige, definierte Antigene zu beschränken, die mittels molekularbiologischer Methoden in na¬ hezu reiner Form herstellbar sind und dennoch einen effizien¬ ten Impfschutz zu gewährleisten (z.B. Hepatitis B-Impfung mit einem rekombinanten HBsAg ["Hepatitis B surface Antigen"] ) .
Die bisher im Stand der Technik bekannten Impfstoffe neigen unter anderem aufgrund der Breite ihrer Immunogenitat dazu, Nebenwirkungen hervorzurufen. Beispielsweise besteht ein ein¬ zelnes virales oder bakterielles Antigen in der Regel aus meh¬ reren nundert Aminosäuren, wohingegen T-Zellen nur einen klei¬ nen Ausscr.nitt (< 20 Aminosäuren) erkennen Um die Spezifität der T-Zellen auszunützen, wurden u.a. Impf¬ stoffe auf Peptidbasis entwickelt. Peptide weisen jedoch meh¬ rere Nachteile, wie eine kurze Halbwertszeit, eine nicht vor¬ hersagbare und unspezifische Verteilung im Organismus, eine geringe Aufnahme in die Zelle, einen unklaren Prozessierungs- weg, auf. Diese Faktoren führen zwangsläufig dazu, daß vom physiologischen Gesichtspunkt sehr hohe Konzentrationen an Peptiden eingesetzt werden müssen, um eine gewünschte Im¬ munantwort zu erzielen. Dies schränkt selbstverständlich den Einsatz von Peptiden als spezifische Immuntherapeutika stark ein.
Antigene werden als Proteinfragmente an der Oberfläche von so¬ genannten "Antigen-präsentierenden Zellen" präsentiert und von T-Lymphozyten als Effektorzellen erkannt. Die MHC Klasse I- und Klasse II-Moleküle fungieren dabei als Peptidrezeptoren in den Antigen-präsentierenden Zellen. Zur Gewährleistung einer funktionellen Dichotomie werden die MHC-Moleküle in exakt re¬ gulierter Weise in bestimmten MHC-Beladungskompartimenten mit den prozessierten Antigenpeptiden beladen.
MHC-Moleküle sind Vertreter einer polymorphen Genfamilie, die chromosomal in einer besonderen Region, dem Haupt-Histokompa- tibilitätskomplex ("major histokompatibility complex", "MHC") , kodiert ist. Die MHC-Moleküle beim Menschen werden als HLA ("human leukocyte antigen" ) -Moleküle bezeichnet. MHC Klasse I- Moleküle werden direkt am Ort der Biosynthese mit de novo translatierten Virus- oder Tumorantigenen, aber auch körperei¬ genen zytosolischen Proteinfragmenten beladen. Im Gegensatz dazu werden MHC Klasse II-Moleküle (nachstehend kurz als "MHC II-Moleküle" bezeichnet) in zellulären Kompartimenten beladen, die in Verbindung mit dem extrazellulären Milieu stehen. Beim Menschen umfassen die MHC II-Moleküle die HLA-DR, HLA-DQ und HLA-DP Moleküle, die jeweils in verschiedenen genetisch ko¬ dierten Allelen auftreten. So können beispielsweise bakteri¬ elle Ancigene aus dem extrazellulären Milieu aufgenommen wer¬ den und nach intrazellulärer Prozessierung in den Antigen-pra- sentierenden Zellen an deren Zelloberfläche präsentiert wer¬ den.
Zur Gewährleistung einer effektiven Immunüberwachung, ist die Physiologie der MHC-Moleküle so ausgelegt, daß sie ein mög¬ lichst breites Spektrum antigener Peptide präsentieren können. Folglich ist die Kopienzahl eines definierten antigenen Pep- tids an der Zelloberfläche Antigen-präsentierender Zellen sehr gering (Größenordnung 10 eines definierten antigenen Peptids bei einer Gesamtpopulation von etwa 10 Peptidrezeptoren) . Dies bedeutet, daß an der Zelloberfläche der Antigen-präsen¬ tierenden Zellen ein sehr heterogenes Gemisch aus einer Viel¬ zahl verschiedener, an MHC-Moleküle gebundener, antigener Pep¬ tide ( "Peptidliganden" ) exponiert ist.
Experimentelle Ansätze zur Herstellung definierter MHC/Peptid- Komplexe basieren bisher auf der Expression von rekombinanten MHC Molekülen z. B. im Baculovirus- oder E. col i-Expressions- system. Diese MHC II-Moleküle haben eine leere Bindungsgrube und können in vi tro mit geeigneten Peptiden beladen werden. Die Beladungseffizienz ist sehr unterschiedlich und lediglich für in vitro-Untersuchungen anwendbar.
Ein anderer Ansatz geht von rekombinanten MHC II-Molekülen aus, die, als Fusionsprotein (der ß Kette) konstruiert, termi¬ nal einen gewünschten Liganden über einen flexiblen Linker be¬ sitzen. Dieser Ligandenabschnitt füllt spontan die Bindungs¬ grube, sodaß in Abhängigkeit vom verwendeten Zelltyp ein mehr oder weniger großer Anteil von MHC II-Molekülen diesen defi¬ nierten Peptidliganden trägt. Dieser Ansatz ist limitiert auf die DNA-Transfektion von Wirtszellen, während eine direkte Ap¬ plikation auf Proteinebene nicht möglich ist.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Antigenität von Proteinen zu verstärken und/oder die (intrinsische) Heterogenität der MHC II/antigenes Peptid-Kom- plexe von Antigen-präsentierenden Zellen zu verringern, wooei u.a. die vorstehend aufgeführten Nachteile der im Stand der Technik beschrieben Vakzinierungsverfahren beseitigt werden sollen. Insbesondere soll ein neues System für eine gerichtete und hochspezifische Stimulation des Immunsystems durch exakt definierbare antigene Peptide bereitgestellt werden, um bei¬ spielsweise die Vakzinierung von Säugern zu verbessern.
Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen gekenn¬ zeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst. Insbesondere wird in einer ersten erfindungsgemäßen Ausführungsform eine Nukleinsäure bereitgestellt, die minde¬ stens eine für ein rekombinantes Polypeptid kodierende Nuk¬ leinsäuresequenz enthält, wobei das rekombinante Polypeptid mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Primärsequenz von einem spezifischen T- Zellepitop, das in den die CLIP-Sequenz umfassenden Bereich der invarianten Kette eingefügt ist, enthält, und wobei das rekombinante Polypeptid in Antigen-präsentierenden Zellen der¬ art prozessiert wird, daß das spezifische T-Zellepitop erzeugt wird und an MHC II-Moleküle bindet.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Nukleinsäure bereitgestellt, die mindestens eine für ein re¬ kombinantes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, wobei das rekombinante Polypeptid mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Pri¬ märsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop enthält, wobei mindestens eine Aminosäure des die CLIP-Sequenz umfassenden Bereichs der invarianten Kette deletiert ist und durch das T- Zellepitop ersetzt ist, und wobei das rekombinante Polypeptid in Antigen-präsentierenden Zellen derart prozessiert wird, daß das spezifische T-Zellepitop erzeugt wird und an MHC II-Mole¬ küle bindet .
Die Begriffe "Nukleinsäure" und Nukleinsäuresequenz" bedeuten natürliche oder halbsynthetische oder synthetische oder modifizierte Nukleinsäuremoleküle aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden.
Der Begriff "rekombinantes Polypeptid" bzw. "Hybridprotein" bezeichnet ein mit molekularbiologischen Techniken hergestell¬ tes Konstrukt, dem die natürliche DNA des original Genoms bzw. die natürliche DNA modifiziert mit einer fremden DNA-Sequenz zugrunde liegt und rekombiniert werden kann, z.B. mit Plasmi¬ den, und in einem geeigneten Wirtssystem repliziert und expri¬ miert werden kann.
Der Begriff "T-Zellepitop" bedeutet eine antigene/immunogene Sequenz eines Proteins, das eine Aktivierung von T-Lymphozyten bewirkt, und umfaßt erfindungsgemäß die Primärsequenz des T- Zellepitops oder die Primärsequenz eines (antigenen) Polypep¬ tids bzw. Proteins bzw. Antigens, das mindestens eine Primär¬ sequenz eines T-Zellepitops enthält. T-Lymphozyten erkennen diesen Stimulus mit Hilfe eines T-Zellrezeptors normalerweise in der Form eines Peptids, das an MHC-Moleküle gebunden ist. T-Zellepitope können in bestimmten Fällen auch nur eine parti¬ elle Aktivierung bewirken, wobei eine Entkopplung verschiede¬ ner mit der T-Zellaktivierung assoziierter Vorgänge stattfin¬ den kann. Dies kann die Entkopplung der proliferativen oder zytotoxischen gegenüber der Ausschüttung von einzelnen Media¬ torstoffen (Lymphokinen) oder deren qualitative oder quantita¬ tive Zusammensetzung betreffen. Diese Art von Liganden weisen im Vergleich zu konventionellen T-Zellepitopen geringe Verän¬ derungen in ihrer Primärsequenz auf (z.B. Substitution von einzelnen Aminosäuren) und werden in der Literatur als "veränderte Peptidliganden" ("altered peptide ligands", "APLs") bezeichnet. Unter experimentellen Bedingungen wird den APLs ein immuntherapeutisches Potential zugeschrieben.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Modulation einer Subpopulation von T-Lym¬ phozyten, die durch die Expression des Merkmals CD4 charakte¬ risiert ist und die Antigene unter Vermittlung von sogenannten MHC II-Molekülen erkennt. In der Terminologie werden diese T- Zellen als "MHC Klasse II-restringiert " bezeichnet. CD4-Lyτπ- phozyten umfassen die wichtigste regulatorische T-Zellpopula- tion, die in eine Vielzahl sogenannter T-zellabhängiger Immun¬ reaktionen einbezogen sind. Dazu gehören neben physiologischen Aufgaben wie die Abwehr und Elimination von Pathogenen und entarterter körpereigener Zellen durch zeilvermittelte Immun¬ reaktionen und Wechselwirkungen zur Bildung hochaffiner Anti¬ körper durch Immunglobuline produzierender B-Lymphozyten die Mitbeteiligung bei pathologischen Immunreaktionen wie der Ge- webeabstoßung und organspezifischen Autoimmunerkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (RA) , dem juvenilen Insulin-pflich- tigen Diabetes mellitus (IDDM) , der multiplen Sklerose (MS) und einer Vielzahl anderer Erkrankungen des Menschen, bei denen eine Immunpathogenese nachgewiesen ist .
Das funktionelle Merkmal "Prozessierung des rekombinanten Polypeptids in Antigen-präsentierenden Zellen" bedeutet die intrazelluläre Degradation von antigenen Proteinen in Einhei¬ ten, die letztendlich assoziiert mit MHC-Molekülen an der Zelloberfläche präsentiert werden können. Die Prozessierung von MHC Klasse II restringierten Antigenen findet in distink- ten zellulären Kompartimenten, die als endosomal-lysosomale Kompartimente oder "class II compartment" oder "class II loading compartment" bezeichnet werden, statt. Dort sind als minimale funktionelle Elemente MHC II-Moleküle, invariante Kette bzw. deren Abbauprodukte, HLA-DM und antigene Peptide konzentriert. Im allgemeinen werden Proteinasen wie Kathepsin D und E, die ihr Aktivitätsoptimum bei saurem pH haben, eine Funktion bei der Antigenprozessierung eingeräumt.
In den erfindungsgemäßen Ausführungsformen enthält das rekom¬ binante Polypeptid mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette. Der Begriff invariante Kette (Ii) bezeich¬ net ein konserviertes Polypeptid, das beispielsweise mit allen bisher untersuchten MHC-Klasse II-Allelen und -Isotyper. aus Mensch und Maus assoziiert ist. Die invariante Kette kommt in vier Isoformen vor, p33, p35, p41 und p43, deren Sequenz au¬ ßerhalb des MHC-Locus kodiert wird. Ihre regulatorische Funk¬ tion bei der Antigenprozessierung übt sie durch ihre Assozia¬ tion im endoplasmatischen Retikulum mit MHC II-Molekülen un¬ mittelbar nach ihrer Biosynthese aus. Als Chaperonin (Begleitmolekül) unterstützt sie die Assoziation der MHC a- und ß-Untereinheiten, und im Komlex mit MHC II-Molekülen ver¬ hindert sie die vorzeitige Beladung der Bindungsgrube der MHC II-Moleküle mit Proteinfragmenten. Signalsequenzen der invari¬ anten Kette führen diesen Komplex in das "class II loading compartment". Nach stufenweiser Degradation der invarianten Kette können die MHC II-Moleküle beladen werden, wobei als Intermediat Peptide, aus der invarianten Kette assoziiert mit MHC II-Molekülen ("CLIPs", "class II associated invariant chain peptides"), auftreten.
Die invariante Kette ist eines der ersten Proteine, die im en- doplasmastischen Retikulum mit MHC II-Molekülen assoziieren und, was in diesem Zusammenhang besonders wichtig ist, so lange mit den MHC II-Molekülen assoziiert bleibt, bis ein so¬ genanntes "class II loading compartment" erreicht wird. Man nimmt an, daß in diesem distinkten zellulären Subkompartiment, in dem sich eine Reihe von Regulationsfaktoren wie z. B. die invariante Kette bzw. deren Abbauprodukte, HLA-DM, MHC II-Mo¬ leküle und Antigene konzentrieren, die invariante Kette durch proteolytische Aktivität gespalten wird, wobei ein Komplex aus MHC II-Molekülen mit Peptidderivaten der invarianten Kette (sog. "CLIPs") auftritt. Die Bindung der CLIPs an die MHC II- Moleküle wurde bereits eingehend untersucht, wobei in eigenen Untersuchungen festgestellt wurde, daß die CLIP-Sequenz soge¬ nannte "Supermotive" enthält, die es den CLIPs ermöglichen, unabhängig vom Allel- oder Isotyp in der MHC II-Peptidbin- dungsgrube ähnlich wie konventionelle Liganden zu binden.
In den erfindungsgemäßen Ausführungsformen enthält das von der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenz kodierte rekom¬ binante Polypeptid mindestens teilweise Primärsequenzen der natürlichen invarianten Kette, wobei in den die CLIP-Sequenz umfassenden Bereich der natürlichen invarianten Kette ein vor¬ stehend definiertes T-Zellepitop eingefügt ist. Ferner kann der die CLIP-Sequenz umfassende Bereich der invarianten Kette wenigstens teilweise deletiert sein und durch ein gewünschtes T-Zellepitop ersetzt werden.
Der Ausdruck "CLIP-Sequenz umfassender Bereich" bedeutet einen Abschnitt in der natürlichen invarianten Kette, der die CLIP- Region von den AS-Positionen 97 bis 126 (bezogen auf die Iso¬ form p35 mit Beginn beim ersten Startcodon) mit der Sequenz
L P K P P K P V S K M R M A T P L L M Q A L P M G A L P Q G
und gegebenenfalls die CLIP-Region flankierende N- und/oder C- terminale Bereiche, die bei Insertion von einem gewünschten T- Zellepitop oder bei Deletion und Substitution durch ein ge¬ wünschtes T-Zellepitop die Antigenprozessierung nicht nachtei¬ lig beeinflussen, umfaßt. Vorzugsweise werden geeignete T- Zellepitope in die CLIP-Region von AS-Positionen 97-126, mehr bevorzugt 107-115, der natürlichen invarianten Kette inser¬ tiert bzw. mindestens eine Aminosäure dieses Bereichs dele¬ tiert und durch das T-Zellepitop ersetzt. Selbstverständlich müssen auf Nukleinsäureebene die durch herkömmliche ger.- technologische Methoden hergestellten Konstrukte, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, für die gewünschte Expression der rekombinanten Polypeptide das richtige Le¬ seraster aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist em Vektor, der die vorstehend definierte, erfindungsgemäße Nu.-c- leinsäure zur Expression des rekombinanten Polypeptids m pro- karyotischen oder eukaryotischen Wirtszellen enthält. Der er¬ findungsgemäße Vektor kann vorzugsweise geeignete regulato¬ rische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminationssequen- zen, enthalten. Der erfindungsgemaße Vektor kann beispiels¬ weise ein Expressionsvektor oder ein Vektor zur vorzugsweise stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das genetische Material einer Wirtszelle sein. Ein geeignetes Ex¬ pressionssystem ist beispielsweise das Bakulovirus-System, das E. coli-Expressionssystem, bzw. Expressionsvektoren für Säugerzellen wie z. B. auf Vaccinia- , Adeno-, SV40- oder auf Retroviren basierende Vektoren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder den erfindungsgemäßen Vektor enthält. Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise Prokaryonten, wie E. coli , oder eukaryotische Wirtszellen wie COS-, Heia-, CHO-Zellen, insbesondere Antigen- präsentierende Zellen von Säugern. Für eine ausreichende Ex¬ pressionsrate ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure entweder im genetischen Material der Wirtszelle stabil integriert oder der erfindungsgemäße Vektor enthält geeignete regulatorische Bereiche zur Replikation, Transkription und/oder Translation in vivo und/oder in vi tro, d.h. auch im zellfreien System.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist das rekombinante Polypeptid selbst, das von der vorstehend definierten Nuklein¬ säuresequenz kodiert wird, wobei die Nukleinsäuresequenz ent¬ sprechend dem genetischen Code degeneriert sein kann. Das er¬ findungsgemäße rekombinante Polypeptid kann durch post-trans- lationale Reaktionen in vivo oder durch im Stand der Technik bekannte chemische und/oder enzymatische Methoden in vi tro mo¬ difiziert sein.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz bzw. Hybrid-DNA, der erfindungsgemäße Vektor sowie das erfindungsgemäße rekom¬ binante Polypeptid können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann die Hybrid- DNA in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert werden (z. B. pQE31, Fa. Diagen, Hilden, Deutschland) und kompetente M15- Zellen als Wirtszellen können mittels CaCl2-Methode transfor¬ miert werden. Transformierte Zellen werden mittels ihrer Ampi- cillinresistenz selektioniert und als Einzelkolonien für die Kultivierung im Flüssigmedium verwendet. Nach Induktion mit IPTG wird das rekombinante Protein erzeugt und nach 3 Stunden aus dem Zellysat mittels Metallaffinitätschromatographie auf¬ gereinigt .
Ferner ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder das rekombinante Polypeptid und gegebenenfalls mindestens einen pharmazeutisch verträg¬ lichen Träger ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfin¬ dung.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann als universell einsetzbares Vehikel zur Verstärkung und Homogenisierung der Antigenprasentation für insbesondere CD4 positive T-Zellen von Säugern, vorzugsweise von Menschen, dienen. T-Zellepitope jeg¬ licher Herkunft können in das Beladungskompartiment für die MHC II-Moleküle durch das erfindungsgemäße rekombinante Poly¬ peptid eingeschleust werden, wobei die T-Zellepitope aus dem rekombinanten Polypeptid über Prozessierungssignale pro- teolytisch prozessiert und über intrinsische Bindungsei¬ genschaften auf MHC II-Molekülen präsentiert werden.
Die Homogenisierung der T-Zellepitope an der Oberfläche von Antigen-präsentierenden ("immunkompetenten") Zellen kann zur Untersuchung des autoreaktiven Potentials auf T-Zellebene verwendet werden. Bei einer derartigen diagnostischen Verwen¬ dung werden die T-Zellepitope als Sonden für eine mögliche Prädisposition für Autoimmunkrankheiten herangezogen. Bekannte T-Zellepitope können als Sonde für eine Prädisposition von z. B. Rheumatischer Arthritis, Multipler Sklerose, Insulin¬ abhängiger Diabetis mellitus, Myasthenia gravis verwendet wer¬ den. Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfin¬ dung ein diagnostischer Kit zum Nachweis von Autoimmunkrank¬ heiten, der mindestens die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder das erfindungsgemäße rekombinante Polypeptid enthält. Ferner kann entweder das durch die erfindungsgemäße Nuklein¬ säure in Antigen-präsentierenden Zellen exprimierte rekom¬ binante Polypeptid oder das erfindungsgemäße rekombinante Po¬ lypeptid selbst durch Aufnahme in die Antigen-präsentierende Zelle und anschließender spezifischer Prozessierung und Prä¬ sentation des (der) gewünschten T-Zellepitops (-epitope) für eine hochspezifische und selektive Vakzinierung verwendet wer¬ den. Eine derartige Vakzinierung, initiiert durch die erfin¬ dungsgemäße Nukleinsäure bzw. das erfindungsgemäße rekom¬ binante Polypeptid, zeigt überraschenderweise folgende Vor¬ teile:
- Durch die intrazelluläre Prozessierung des rekombinanten Polypeptids wird selektiv und hochspezifisch nur ein bestimmtes T-Zellepitop oder antigenes Fragment erzeugt.
- Die Prozessierungseffizienz eines im erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptid enthaltenen T-Zellepitops ist um mehrere Größenordnungen höher; d.h. eine Applikation mit ei¬ nem maßgeschneiderten Antigen bzw. antigenen Peptid zeigt in vivo eine deutlich höhere Vakzinierungseffizienz bei deut¬ lich verringerten molaren Vakzindosen.
- Die Vakzinierung mit einem Hybrid bestehend aus Teilen der invarianten Kette und einem bekannten, T-Zellepitope enthal¬ tenden Antigen ist möglich, ohne daß T-Zellepitope exakt de¬ finiert sein müssen. Dieser Ansatz sollte bei der Bekämpfung intrazellulärer Pathogene (Viren, Parasiten, Mycobakterien) und einer Verstärkung der T-Zellantwort gegen Tumorantigene nützlich sein.
- Die Möglichkeit der Applikation von definierten T-Zellepito- pen erlaubt ein fokussiertes und spezifisches Eingreifen bei allergischen Reaktionen, mit dem Ziel allergenspezifische T- Zellen zu desensibilisieren. In analoger Weise sollte dieser Ansatz auch bei Autoimmunerkrankungen wie auch bei der Kon¬ trolle von Transplantatsabstoßungen möglich sein.
Ferner kann das erfindungsgemäße rekombinante Polypeptid zur Modulation der Immunantwort durch Selbst-, Fremd- und Desig- ner-Peptide verwendet werden, wobei eine derartige Modulation aufgrund der vorstehend aufgeführten Vorteile des erfindungs¬ gemäßen rekombinanten Polypeptids effizienter durchgeführt werden kann. Ferner kann durch Integration von sogenannten "altered peptide ligands (APL) " als T-Zellepitope im erfin¬ dungsgemäßen rekombinanten Polypeptid der Aktivierungszustand von T-Zellen beeinflußt werden.
Figur 1 zeigt die Titrationskurven verschiedener Darrei¬ chungsformen des Tetanustoxins (TT) bzw. der antigenen Pep¬ tide/Polypeptide von Clos tridiiuv tetani , wobei die Einbaurate von 3H-Thymidin als Maß der T-Zellproliferation in Abhängig¬ keit der Antigenkonzentration dargestellt ist. Die basale Pro- liferation ohne Zugabe eines Antigens liegt bei 1.500 cpm. Das antigene TT-Peptid TT(1061-1075) enthält das T-Zellepitop. Das Ii-TT-Hybrid enthält die Kernsequenz TT(1064-1072) an¬ stelle der CLIP-Kernsequenz Iii07-T-iιi5 der invarianten Kette. TTC ist ein rekombinantes Polypeptid des C-Fragments des TT, das natürlicherweise das antigene TT-Peptid TT(1061-1075) ent¬ hält. Das CLIP-TT-Hybrid ist ein Hybrid eines CLIP-Peptids, bei dem die CLIP-Kernsequenz gegen das Kernepitop TT(1064- 1072) ausgetauscht wurde. Beim Ii-P-TT-Hybrid ist der Anteil der CLIP-Sequenz am N-Terminus verkürzt.
Figur 2 ist eine Coomassie Blau-Färbung eines SDS-Poly- acrylamidgels mit Darstellung eines rekombinanten Ii-TT-Hy- bridproteins nach Aufreinigung über eine Metallo-Affmitäts- chromatographie.
Spur 2 zeigt das rekombinante Ii-TT-Hybridprotem als Einzel¬ bande bei einem Molekulargewicht von etwa 22 Kilodalton (K) . Molekulargewichts-Marker mit 20 K und 30 K sind in Spur 1 ge¬ zeigt .
Durch das nachfolgende Beispiel wird die vorliegende Erfindung naher erläutert. Beispiel
Ein gut charakterisiertes T-Zellepitop aus dem Tetanustoxin wird in die Sequenz der invarianten Kette integriert. Dieses Hybrid-Antigen verstärkt die MHC Klasse II restringierte T- Helferzell-Antwort im Vergleich zu dem natürlichen Antigen bzw. dem rekombinanten C-Fragment um mehrere Potenzen.
Das System, worin die hocheffiziente Prozessierung des Hybrid¬ proteins demonstriert wird, benützt als Antigen das Toxin aus Clos tridi um tetani , aus dem ein T-Zellepitop in die invariante Kette als Prozessierungseinheit integriert wird. Die Primärse¬ quenz dieses Tetanustoxins ist bekannt (Eisel et al . , EMBO J. , 1986) , ebenso eine Vielzahl daraus generierter antigener De¬ terminanten für humane T-Zellen.
Das T-Zellepitop TT(1061-1075) dieses Tetanustoxins wurde kürzlich als dominantes T-Zellepitop für T-Zellen von DR17-po- sitiven Spendern nachgewiesen (Malcherek et al . , in Druck) . Das Restriktionselement für die Erkennung von TT(1061-1075) ist das MHC Klasse II-Molekül HLA-DR17. Die spezifischen Kon¬ taktstellen zum HLA-DR17 Molekül einerseits (sogenannte Anker) und zum T-Zellrezeptor andererseits (T-Zellrezeptor-Kontakt- stellen) können mit Hilfe Alanin-substituierter Peptidanaloga dissoziiert werden und auf ein Kernepitop von neun Aminosäuren (I R E D N N I T L) festgelegt werden (Malcherek et al . , in Druck) . Die zusätzlichen Aminosäuren außerhalb dieser Kernse¬ quenz des TT-Peptids stabilisieren in der Regel die Bindung zum MHC Molekül, ohne daß diese Aminosäureseitenketten in spe¬ zifischer Weise mit dem MHC Molekül interagieren (Malcherek et al. , J. Immunol. 1994, 153: 1141) .
Die Titrationskurven verschiedener Darreichungsformen des Te¬ tanustoxins bzw. der antigenen Peptide/Polypeptide zeigen den antigenen Charakter des Ii-TT-Hybridprotems , das darüber¬ hinaus eine dramatisch verstärkte Immunogemtät im Vergleich zum nativen Antigen und dem rekombinanten C-Fragment des TT aufweist (vgl. Fig. 1) . Dieser Verstärkungseffekt wird umso bemerkenswerter in Anbetracht der Tatsache, daß das dominante T-Zellepitop TT(1061-1075) des Tetanustoxins bereits in seiner physiologischen Umgebung im nativen Toxin sehr effizient pro¬ zessiert und von spezifischen T-Zellen erkannt wird (Malcherek et al. , in Druck) . Verdeutlicht wird dieser Sachverhalt durch die geringen Antigenkonzentrationen im picomolaren Bereich, die notwendig sind, um T-Zellen in vi tro zur halbmaximalen Proliferationsleistung zu stimulieren (vgl. Fig. 1) . Die Spe- zifität der Stimulation des T-Zellklons kann mittels eines an¬ deren rekombinanten Ii-Konstrukts demonstriert werden, das die T-Zellen nicht zur Proliferation anregt.
Zudem kann mittels zweier weiterer Hybridpeptide dargestellt werden, daß in der Tat die Kernsequenz für eine optimale Sti¬ mulation ausreichend ist (vgl. Fig. 1) . Diese Hybridpeptide werden so konzipiert, daß die Kernsequenz aus dem Tetanustoxin von Aminosäuren aus den CLIP-Peptiden flankiert wird. Damit soll die Situation imitiert werden, die bei der Prozessierung des hybriden Antigens erwartet wird. Das kürzere Peptid KPVSK- TT(1064-1072) -QA ( "Ii-P-TT-Hybrid") stimuliert ähnlich gut wie das originale T-Zellepitop TT(1061-1075) . Das längere Peptid hingegen, das quasi ein CLIP-Hybrid ( "CLIP-TT-Hybrid" ) dar¬ stellt, hat aber eindeutig ein stärkeres antigenes Potential als TT(1061-1075) .
Diese Daten sind ein sicheres Indiz dafür, daß Sequenzen der CLIP-Region außerhalb der Kernsequenz von Ii (107-115) die An- tigenität der Kernsequenz des T-Zellepitops verstärken können. Eine weitere Verstärkungswirkung der Antigenität des Hybrid¬ proteins im Vergleich zum nativen Protein bzw. zum rekombinan¬ ten C-Fragment liefern die auf der invarianten Kette liegenden Sequenzen für eine optimale Prozessierung der T-Zellepitope.
Diese Daten zeigen ferner, daß antigene Sequenzen anstelle von CLIP-Sequenzen in Ii-Hybridkonstrukten effektiv prozessiert werden, und die MHC Klasse II restringierte T-Zellantwort auf einer molaren Basis dramatisch verstärken.
1. Konstruktion der Plasmid-DNA-Kassette pQE31/Ii-TT
Die cDNA der p35 Ii (pcDV;]_, Strubin et al . , 1986) wird mit 5'- und 3 ' -spezifischen Oligonukleotid-Primern so amplifi- ziert, daß nur die kodierende Sequenz mittels neu eingefüg¬ ter EcoRI-Restriktionsschnittstellen in pBluescript KS+" (Fa. Stratagene, Heidelberg, Deutschland) subkloniert wer¬ den kann. Mittels Oligonukleotid-gerichteter, ortsspezifi¬ sche Mutagenese, basierend auf Polymerase Kettenreaktion (PCR) , wird eine NspV-Restriktionschnittstelle generiert, und die weiter 3 ' -gelegene Ncol-Restriktionschnittstelle zerstört. Diese Ii-Mutante, welche die original Proteinse¬ quenz der Ii kodiert, wird durch NspV/NcoI-Spaltung um die CLIP-Kernsequenz von Iii07-Iill5 (die Nomenklatur ist auf den Translationsstart bei Methionin 1 der nativen Ii bezo¬ gen) deletiert. In diese Ii-Kassette werden die Oligonuk¬ leotide ligiert, die für die Kernsequenz des T-Zellepitops [TT(1064-1072) ] aus dem Tetanustoxin kodieren. Das Pstl/BamHI-Fragment wird anschließend in pQE31 (Fa. Diagen, Hilden, Deutschland) , ein bakterieller Expressionsvektor, subkloniert, wobei die Plasmid-DNA-Kassette pQE31/Ii-TT er¬ halten wird.
2. Expression des rekombinanten Polypeptids Ii-TT
Die Expression des rekombinanten Ii-TT-Hybridproteins er¬ folgt im wesentlichen entsprechend den Anleitungen zum QIA- express-System (Fa. Diagen, Hilden, Deutschland) . Kompe¬ tente E. coli M15-Zellen werden mit pQE31/Ii-TT transfor¬ miert und 100 ml Bakterienkultur bei ODgoo von °' 5 mit: IPTG induziert. Nach 3h wird das Zellpellet in 20 ml 6M Guanidi- niumhydrochlorid lysiert und der Überstand nach Ultrazen- trifugation (21.500 UPM, TI45) chromatographisch über eine Ni-NTA-Metall-Affinitätssäule (Fa. Diagen, Hilden, Deutsch- land) gereinigt. Das pH 4,5-Eluat wird mittels SDS-Poly- acrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Die Coo- massie Blau-Färbung zeigt eine Einzelbande bei 22 KD ohne sichtbare bakterielle Kontaminanten. (Die Identität des Ii- TT-Proteinhybrids wurde durch ELISA mit den li-spezifischen monoklonalen Antikörpern M-B741 (Geschenk von Prof. Dr. Rieber, Institut für Immunologie, München) und SD3253.74 (Geschenk von Dr. H. Kaibacher, Physiologisch-Chemisches Institut, Universität Tübingen) bestätigt.)

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure, enthaltend mindestens eine für ein rekom¬ binantes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, wobei das rekombinante Polypeptid mindestens teilweise die Pri¬ märsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Pn¬ märsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop, das in den die CLIP-Sequenz umfassenden Bereich der invarianten Kette eingefügt ist, enthält, und wobei das rekombinante Poly¬ peptid in Antigen-präsentierenden Zellen derart prozes¬ siert wird, daß das spezifische T-Zellepitop erzeugt wird und an MHC II-Moleküle bindet.
2. Nukleinsäure, enthaltend mindestens eine für ein rekom¬ binantes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, wobei das rekombinante Polypeptid mindestens teilweise die Pri¬ märsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Pn¬ märsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop enthält, wobei mindestens eine Aminosäure des die CLIP-Sequenz um¬ fassenden Bereichs der invarianten Kette deletiert ist und durch das T-Zellepitop ersetzt ist, und wobei das rekom¬ binante Polypeptid m Antigen-präsentierenden Zellen der¬ art prozessiert wird, daß das spezifische T-Zellepitop er¬ zeugt wird und an MHC II-Molekύle bindet.
3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei der die CLIP- Sequenz umfassende Bereich die AS-Positionen 97 bis 126 der invarianten Kette ist.
4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das T-Zellepitop von einem Selbstprotein, oder einem viralen, prokaryotischen oder eukaryotischen Antigen stammt.
5 Vektor, enthaltend die Nukleinsäure von einem der Ansprü¬ che 1 bis 4, zur Expression des rekombinanten Polypeptids in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen
6. Wirtszelle, enthaltend die Nukleinsäure von einem der An¬ sprüche 1 bis 4 oder den Vektor von Anspruch 5.
7. Wirtszelle nach Anspruch 6, worin das rekombinante Poly¬ peptid exprimiert wird.
8. Rekombinantes Polypeptid, enthaltend mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Primärsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop, das in den die CLIP-Sequenz umfassenden Bereich der invarianten Kette eingefügt ist, wobei das rekombinante Polypeptid in Antigen-präsentierenden Zellen derart pro¬ zessiert wird, daß das spezifische T-Zellepitop erzeugt wird und an MHC II-Moleküle bindet.
9. Rekombinantes Polypeptid, enthaltend mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Primärsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop, wobei mindestens eine Aminosäure des die CLIP-Sequenz um¬ fassenden Bereichs der invarianten Kette deletiert ist und durch das T-Zellepitop ersetzt ist, und wobei das rekom¬ binante Polypeptid in Antigen-präsentierenden Zellen der¬ art prozessiert wird, daß das spezifische T-Zellepitop er¬ zeugt wird und an MHC II-Moleküle bindet.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Nuklein¬ säure von einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das rekom¬ binante Polypeptid von Anspruch 8 oder 9, und gegebenen¬ falls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
11. Diagnostischer Kit zum Nachweis von Autoimmunkrankheiten, enthaltend die Nukleinsäure von einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das rekombinante Polypeptid von Anspruch 8 oder 9.
PCT/DE1996/001763 1995-09-14 1996-09-16 Rekombinantes polypeptid basierend auf der primärsequenz der invarianten kette mit mindestens einer primärsequenz von einem spezifischen t-zellepitop oder eines proteinderivats und dieses rekombinante polypeptid kodierende nukleinsäuren WO1997010335A1 (de)

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