DE19534170C1 - Rekombinantes Polypeptid basierend auf der Primärsequenz der invarianten Kette mit mindestens einer Primärsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop oder eines Proteinderivats und dieses rekombinante Polypeptid kodierende Nukleinsäuren - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die minde­ stens eine für ein rekombinantes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten, wobei das rekombinante Polypep­ tid mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Primärsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop oder einem Protein enthält und in Antigen-präsen­ tierenden Zellen für eine Bindung des spezifischen T-Zellepitops an MHC Klasse II-Moleküle in gewünschter Weise prozessiert wird.

Gegen eine Vielzahl von Pathogenen stehen keine geeigneten Impfstoffe zur Verfügung. Bei den herkömmlichen Methoden der Vakzinierung werden abgetötete oder abgeschwächte Erreger als Impfstoff verwendet. Um unerwünschte Nebenwirkungen oder sogar einen Krankheitsausbruch zu verhindern, wurde in einzelnen Fällen versucht, Impfstoffe auf wenige, definierte Antigene zu beschränken, die mittels molekularbiologischer Methoden in na­ hezu reiner Form herstellbar sind und dennoch einen effizien­ ten Impfschutz zu gewährleisten (z. B. Hepatitis B-Impfung mit einem rekombinanten HBsAg ["Hepatitis B surface Antigen"]).

Die bisher im Stand der Technik bekannten Impfstoffe neigen unter anderem aufgrund der Breite ihrer Immunogenität dazu, Nebenwirkungen hervorzurufen. Beispielsweise besteht ein ein­ zelnes virales oder bakterielles Antigen in der Regel aus meh­ reren hundert Aminosäuren, wohingegen T-Zellen nur einen klei­ nen Ausschnitt (< 20 Aminosäuren) erkennen.

Um die Spezifität der T-Zellen auszunützen, wurden u. a. Impf­ stoffe auf Peptidbasis entwickelt. Peptide weisen jedoch meh­ rere Nachteile, wie eine kurze Halbwertszeit, eine nicht vor­ hersagbare und unspezifische Verteilung im Organismus, eine geringe Aufnahme in die Zelle, einen unklaren Prozessierungs­ weg, auf. Diese Faktoren führen zwangsläufig dazu, daß vom physiologischen Gesichtspunkt sehr hohe Konzentrationen an Peptiden eingesetzt werden müssen, um eine gewünschte Im­ munantwort zu erzielen. Dies schränkt selbstverständlich den Einsatz von Peptiden als spezifische Immuntherapeutika stark ein.

Antigene werden als Proteinfragmente an der Oberfläche von so­ genannten "Antigen-präsentierenden Zellen" präsentiert und von T-Lymphozyten als Effektorzellen erkannt. Die MHC Klasse I- und Klasse II-Moleküle fungieren dabei als Peptidrezeptoren in den Antigen-präsentierenden Zellen. Zur Gewährleistung einer funktionellen Dichotomie werden die MHC-Moleküle in exakt re­ gulierter Weise in bestimmten MHC-Beladungskompartimenten mit den prozessierten Antigenpeptiden beladen.

MHC-Moleküle sind Vertreter einer polymorphen Genfamilie, die chromosomal in einer besonderen Region, dem Haupt-Histokompa­ tibilitätskomplex ("major histokompatibility complex", "MHC"), kodiert ist. Die MHC-Moleküle beim Menschen werden als HLA ("human leukocyte antigen")-Moleküle bezeichnet. MHC Klasse I-Moleküle werden direkt am Ort der Biosynthese mit de novo translatierten Virus- oder Tumorantigenen, aber auch körperei­ genen zytosolischen Proteinfragmenten beladen. Im Gegensatz dazu werden MHC Klasse IT-Moleküle (nachstehend kurz als "MHC II-Moleküle" bezeichnet) in zellulären Kompartimenten beladen, die in Verbindung mit dem extrazellulären Milieu stehen. Beim Menschen umfassen die MHC II-Moleküle die HLA-DR, HLA-DQ und HLA-DP Moleküle, die jeweils in verschiedenen genetisch ko­ dierten Allelen auftreten. So können beispielsweise bakteri­ elle Antigene aus dem extrazellulären Milieu aufgenommen wer­ den und nach intrazellulärer Prozessierung in den Antigen-prä­ sentierenden Zellen an deren Zelloberfläche präsentiert wer­ den.

Zur Gewährleistung einer effektiven Immunüberwachung, ist die Physiologie der MHC-Moleküle so ausgelegt, daß sie ein mög­ lichst breites Spektrum antigener Peptide präsentieren können. Folglich ist die Kopienzahl eines definierten antigenen Pep­ tids an der Zelloberfläche Antigen-präsentierender Zellen sehr gering (Größenordnung 10² eines definierten antigenen Peptids bei einer Gesamtpopulation von etwa 10⁵ Peptidrezeptoren). Dies bedeutet, daß an der Zelloberfläche der Antigen-präsen­ tierenden Zellen ein sehr heterogenes Gemisch aus einer Viel­ zahl verschiedener, an MHC-Moleküle gebundener, antigener Pep­ tide ("Peptidliganden") exponiert ist.

Experimentelle Ansätze zur Herstellung definierter MHC/Peptid- Komplexe basieren bisher auf der Expression von rekombinanten MHC Molekülen z. B. im Baculovirus- oder E. coli-Expressions­ system. Diese MHC II-Moleküle haben eine leere Bindungsgrube und können in vitro mit geeigneten Peptiden beladen werden. Die Beladungseffizienz ist sehr unterschiedlich und lediglich für in vitro-Untersuchungen anwendbar.

Ein anderer Ansatz geht von rekombinanten MHC II-Molekülen aus, die, als Fusionsprotein (der β Kette) konstruiert, termi­ nal einen gewünschten Liganden über einen flexiblen Linker be­ sitzen. Dieser Ligandenabschnitt füllt spontan die Bindungs­ grube, so daß in Abhängigkeit vom verwendeten Zelltyp ein mehr oder weniger großer Anteil von MHC II-Molekülen diesen defi­ nierten Peptidliganden trägt. Dieser Ansatz ist limitiert auf die DNA-Transfektion von Wirtszellen, während eine direkte Ap­ plikation auf Proteinebene nicht möglich ist.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Antigenität von Proteinen zu verstärken und/oder die (intrinsische) Heterogenität der MHC II/antigenes Peptid-Kom­ plexe von Antigen-präsentierenden Zellen zu verringern, wobei u. a. die vorstehend aufgeführten Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Vakzinierungsverfahren beseitigt werden sollen. Insbesondere soll ein neues System für eine gerichtete und hochspezifische Stimulation des Immunsystems durch exakt definierbare antigene Peptide bereitgestellt werden, um bei­ spielsweise die Vakzinierung von Säugern zu verbessern.

Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen gekenn­ zeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst. Insbesondere wird in einer ersten erfindungsgemäßen Ausführungsform eine Nukleinsäure bereitgestellt, die minde­ stens eine für ein rekombinantes Polypeptid kodierende Nuk­ leinsäuresequenz enthält, wobei das rekombinante Polypeptid mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Primärsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop, das in den die CLIP-Sequenz umfassenden Bereich der invarianten Kette eingefügt ist, enthält, und wobei das rekombinante Polypeptid in Antigen-präsentierenden Zellen der­ art prozessiert wird, daß das spezifische T-Zellepitop erzeugt wird und an MHC II-Moleküle bindet.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Nukleinsäure bereitgestellt, die mindestens eine für ein re­ kombinantes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, wobei das rekombinante Polypeptid mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Pri­ märsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop enthält, wobei mindestens eine Aminosäure des die CLIP-Sequenz umfassenden Bereichs der invarianten Kette deletiert ist und durch das T-Zellepitop ersetzt ist, und wobei das rekombinante Polypeptid in Antigen-präsentierenden Zellen derart prozessiert wird, daß das spezifische T-Zellepitop erzeugt wird und an MHC II-Mole­ küle bindet.

Die Begriffe "Nukleinsäure" und "Nukleinsäuresequenz" bedeuten natürliche oder halbsynthetische oder synthetische oder modifizierte Nukleinsäuremoleküle aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden.

Der Begriff "rekombinantes Polypeptid" bzw. "Hybridprotein" bezeichnet ein mit molekularbiologischen Techniken hergestell­ tes Konstrukt, dem die natürliche DNA des original Genoms bzw. die natürliche DNA modifiziert mit einer fremden DNA-Sequenz zugrunde liegt und rekombiniert werden kann, z. B. mit Plasmi­ den, und in einem geeigneten Wirtssystem repliziert und expri­ miert werden kann.

Der Begriff "T-Zellepitop" bedeutet eine antigene/immunogene Sequenz eines Proteins, das eine Aktivierung von T-Lymphozyten bewirkt, und umfaßt erfindungsgemäß die Primärsequenz des T-Zellepitops oder die Primärsequenz eines (antigenen) Polypep­ tids bzw. Proteins bzw. Antigens, das mindestens eine Primär­ sequenz eines T-Zellepitops enthält. T-Lymphozyten erkennen diesen Stimulus mit Hilfe eines T-Zellrezeptors normalerweise in der Form eines Peptids, das an MHC-Moleküle gebunden ist. T-Zellepitope können in bestimmten Fällen auch nur eine parti­ elle Aktivierung bewirken, wobei eine Entkopplung verschiede­ ner mit der T-Zellaktivierung assoziierter Vorgänge stattfin­ den kann. Dies kann die Entkopplung der proliferativen oder zytotoxischen gegenüber der Ausschüttung von einzelnen Media­ torstoffen (Lymphokinen) oder deren qualitative oder quantita­ tive Zusammensetzung betreffen. Diese Art von Liganden weisen im Vergleich zu konventionellen T-Zellepitopen geringe Verän­ derungen in ihrer Primärsequenz auf (z. B. Substitution von einzelnen Aminosäuren) und werden in der Literatur als "veränderte Peptidliganden" ("altered peptide ligands", "APLs") bezeichnet. Unter experimentellen Bedingungen wird den APLs ein immuntherapeutisches Potential zugeschrieben.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Modulation einer Subpopulation von T-Lym­ phozyten, die durch die Expression des Merkmals CD4 charakte­ risiert ist und die Antigene unter Vermittlung von sogenannten MHC II-Molekülen erkennt. In der Terminologie werden diese T-Zellen als "MHC Klasse II-restringiert" bezeichnet. CD4-Lym­ phozyten umfassen die wichtigste regulatorische T-Zellpopula­ tion, die in eine Vielzahl sogenannter T-zellabhängiger Immun­ reaktionen einbezogen sind. Dazu gehören neben physiologischen Aufgaben wie die Abwehr und Elimination von Pathogenen und entarteter körpereigener Zellen durch zellvermittelte Immun­ reaktionen und Wechselwirkungen zur Bildung hochaffiner Anti­ körper durch Immunglobuline produzierender B-Lymphozyten die Mitbeteiligung bei pathologischen Immunreaktionen wie der Ge­ webeabstoßung und organspezifischen Autoimmunerkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (RA), dem juvenilen Insulin-pflich­ tigen Diabetes mellitus (IDDM), der multiplen Sklerose (MS) und einer Vielzahl anderer Erkrankungen des Menschen, bei denen eine Immunpathogenese nachgewiesen ist.

Das funktionelle Merkmal "Prozessierung des rekombinanten Polypeptids in Antigen-präsentierenden Zellen" bedeutet die intrazelluläre Degradation von antigenen Proteinen in Einhei­ ten, die letztendlich assoziiert mit MHC-Molekülen an der Zelloberfläche präsentiert werden können. Die Prozessierung von MHC Klasse II restringierten Antigenen findet in distink­ ten zellulären Kompartimenten, die als endosomal-lysosomale Kompartimente oder "class II compartment" oder "class II loading compartment" bezeichnet werden, statt. Dort sind als minimale funktionelle Elemente MHC II-Moleküle, invariante Kette bzw. deren Abbauprodukte, HLA-DM und antigene Peptide konzentriert. Im allgemeinen werden Proteinasen wie Kathepsin D und E, die ihr Aktivitätsoptimum bei saurem pH haben, eine Funktion bei der Antigenprozessierung eingeräumt.

In den erfindungsgemäßen Ausführungsformen enthält das rekom­ binante Polypeptid mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette. Der Begriff invariante Kette (II) bezeich­ net ein konserviertes Polypeptid, das beispielsweise mit allen bisher untersuchten MHC-Klasse II-Allelen und -Isotypen aus Mensch und Maus assoziiert ist. Die invariante Kette kommt in vier Isoformen vor, p33, p35, p41 und p43, deren Sequenz au­ ßerhalb des MHC-Locus kodiert wird. Ihre regulatorische Funk­ tion bei der Antigenprozessierung übt sie durch ihre Assozia­ tion im endoplasmatischen Retikulum mit MHC II-Molekülen un­ mittelbar nach ihrer Biosynthese aus. Als Chaperonin (Begleitmolekül) unterstützt sie die Assoziation der MHC α-und β-Untereinheiten, und im Komplex mit MHC II-Molekülen ver­ hindert sie die vorzeitige Beladung oder Bindungsgrube der MHC II-Moleküle mit Proteinfragmenten. Signalsequenzen der invari­ anten Kette führen diesen Komplex in das "class II loading compartment". Nach stufenweiser Degradation der invarianten Kette können die MHC II-Moleküle beladen werden, wobei als Intermediat Peptide, aus der invarianten Kette assoziiert mit MHC II-Molekülen ("CLIPs", "class II associated invariant chain peptides"), auftreten.

Die invariante Kette ist eines der ersten Proteine, die im en­ doplasmastischen Retikulum mit MHC II-Molekülen assoziieren und, was in diesem Zusammenhang besonders wichtig ist, so lange mit den MHC II-Molekülen assoziiert bleibt, bis ein so­ genanntes "class II loading compartment" erreicht wird. Man nimmt an, daß in diesem distinkten zellulären Subkompartiment, in dem sich eine Reihe von Regulationsfaktoren wie z. B. die invariante Kette bzw. deren Abbauprodukte, HLA-DM, MHC II-Mo­ leküle und Antigene konzentrieren, die invariante Kette durch proteolytische Aktivität gespalten wird, wobei ein Komplex aus MHC II-Molekülen mit Peptidderivaten der invarianten Kette (sog. "CLIPs") auftritt. Die Bindung der CLIPs an die MHC II-Moleküle wurde bereits eingehend untersucht, wobei in eigenen Untersuchungen festgestellt wurde, daß die CLIP-Sequenz soge­ nannte "Supermotive" enthält, die es den CLIPs ermöglichen, unabhängig vom Allel- oder Isotyp in der MHC II-Peptidbin­ dungsgrube ähnlich wie konventionelle Liganden zu binden.

In den erfindungsgemäßen Ausführungsformen enthält das von der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenz kodierte rekom­ binante Polypeptid mindestens teilweise Primärsequenzen der natürlichen invarianten Kette, wobei in den die CLIP-Sequenz umfassenden Bereich der natürlichen invarianten Kette ein vor­ stehend definiertes T-Zellepitop eingefügt ist. Ferner kann der die CLIP-Sequenz umfassende Bereich der invarianten Kette wenigstens teilweise deletiert sein und durch ein gewünschtes T-Zellepitop ersetzt werden.

Der Ausdruck "CLIP-Sequenz umfassender Bereich" bedeutet einen Abschnitt in der natürlichen invarianten Kette, der die CLIP-Region von den AS-Positionen 97 bis 126 (bezogen auf die Iso­ form p35 mit Beginn beim ersten Startcodon) mit der Sequenz

L P K P P K P V S K M R M A T P L L M Q A L P M G A L P Q G

und gegebenenfalls die CLIP-Region flankierende N- und/oder C-ter­ minale Bereiche, die bei Insertion von einem gewünschten T-Zellepitop oder bei Deletion und Substitution durch ein ge­ wünschtes T-Zellepitop die Antigenprozessierung nicht nachtei­ lig beeinflussen, umfaßt. Vorzugsweise werden geeignete T-Zellepitope in die CLIP-Region von AS-Positionen 97-126, mehr bevorzugt 107-115, der natürlichen invarianten Kette inser­ tiert bzw. mindestens eine Aminosäure dieses Bereichs dele­ tiert und durch das T-Zellepitop ersetzt. Selbstverständlich müssen auf Nukleinsäureebene die durch herkömmliche gen­ technologische Methoden hergestellten Konstrukte, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, für die gewünschte Expression der rekombinanten Polypeptide das richtige Le­ seraster aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der die vorstehend definierte, erfindungsgemäße Nuk­ leinsäure zur Expression des rekombinanten Polypeptids in pro­ karyotischen oder eukaryotischen Wirtszellen enthält. Der er­ findungsgemäße Vektor kann vorzugsweise geeignete regulato­ rische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminationssequen­ zen, enthalten. Der erfindungsgemäße Vektor kann beispiels­ weise ein Expressionsvektor oder ein Vektor zur vorzugsweise stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das genetische Material einer Wirtszelle sein. Ein geeignetes Ex­ pressionssystem ist beispielsweise das Bakulovirus-System, das E. coli-Expressionssystem, bzw. Expressionsvektoren für Säugerzellen wie z. B. auf Vaccinia-, Adeno-, SV40- oder auf Retroviren basierende Vektoren.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder den erfindungsgemäßen Vektor enthält. Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise Prokaryonten, wie E. coli, oder eukaryotische Wirtszellen wie COS-, Hela-, CHO-Zellen, insbesondere Antigen­ präsentierende Zellen von Säugern. Für eine ausreichende Ex­ pressionsrate ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure entweder im genetischen Material der Wirtszelle stabil integriert oder der erfindungsgemäße Vektor enthält geeignete regulatorische Bereiche zur Replikation, Transkription und/oder Translation in vivo und/oder in vitro, d. h. auch im zellfreien System.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist das rekombinante Polypeptid selbst, das von der vorstehend definierten Nuklein­ säuresequenz kodiert wird, wobei die Nukleinsäuresequenz ent­ sprechend dem genetischen Code degeneriert sein kann. Das er­ findungsgemäße rekombinante Polypeptid kann durch post-trans­ lationale Reaktionen in vivo oder durch im Stand der Technik bekannte chemische und/oder enzymatische Methoden in vitro mo­ difiziert sein.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz bzw. Hybrid-DNA, der erfindungsgemäße Vektor sowie das erfindungsgemäße rekom­ binante Polypeptid können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann die Hybrid- DNA in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert werden (z. B. pQE31, Fa. Diagen, Hilden, Deutschland) und kompetente M15-Zellen als Wirtszellen können mittels CaCl₂-Methode transfor­ miert werden. Transformierte Zellen werden mittels ihrer Ampi­ cillinresistenz selektioniert und als Einzelkolonien für die Kultivierung im Flüssigmedium verwendet. Nach Induktion mit IPTG wird das rekombinante Protein erzeugt und nach 3 Stunden aus dem Zellysat mittels Metallaffinitätschromatographie auf­ gereinigt.

Ferner ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder das rekombinante Polypeptid und gegebenenfalls mindestens einen pharmazeutisch verträg­ lichen Träger ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfin­ dung.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann als universell einsetzbares Vehikel zur Verstärkung und Homogenisierung der Antigenpräsentation für insbesondere CD4 positive T-Zellen von Säugern, vorzugsweise von Menschen, dienen. T-Zellepitope jeg­ licher Herkunft können in das Beladungskompartiment für die MHC II-Moleküle durch das erfindungsgemäße rekombinante Poly­ peptid eingeschleust werden, wobei die T-Zellepitope aus dem rekombinanten Polypeptid über Prozessierungssignale pro­ teolytisch prozessiert und über intrinsische Bindungsei­ genschaften auf MHC II-Molekülen präsentiert werden.

Die Homogenisierung der T-Zellepitope an der Oberfläche von Antigen-präsentierenden ("immunkompetenten") Zellen kann zur Untersuchung des autoreaktiven Potentials auf T-Zellebene verwendet werden. Bei einer derartigen diagnostischen Verwen­ dung werden die T-Zellepitope als Sonden für eine mögliche Prädisposition für Autoimmunkrankheiten herangezogen. Bekannte T-Zellepitope können als Sonde für eine Prädisposition von z. B. Rheumatischer Arthritis, Multipler Sklerose, Insulin abhängiger Diabetis mellitus, Myasthenia gravis verwendet wer­ den. Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfin­ dung ein diagnostischer Kit zum Nachweis von Autoimmunkrank­ heiten, der mindestens die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder das erfindungsgemäße rekombinante Polypeptid enthält.

Ferner kann entweder das durch die erfindungsgemäße Nuklein­ säure in Antigen-präsentierenden Zellen exprimierte rekom­ binante Polypeptid oder das erfindungsgemäße rekombinante Po­ lypeptid selbst durch Aufnahme in die Antigen-präsentierende Zelle und anschließender spezifischer Prozessierung und Prä­ sentation des (der) gewünschten T-Zellepitops (-epitope) für eine hochspezifische und selektive Vakzinierung verwendet wer­ den. Eine derartige Vakzinierung, initiiert durch die erfin­ dungsgemäße Nukleinsäure bzw. das erfindungsgemäße rekom­ binante Polypeptid, zeigt überraschenderweise folgende Vor­ teile:

• - Durch die intrazelluläre Prozessierung des rekombinanten Polypeptids wird selektiv und hochspezifisch nur ein bestimmtes T-Zellepitop oder antigenes Fragment erzeugt.
• - Die Prozessierungseffizienz eines im erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptid enthaltenen T-Zellepitops ist um mehrere Größenordnungen höher; d. h. eine Applikation mit ei­ nem maßgeschneiderten Antigen bzw. antigenen Peptid zeigt in vivo eine deutlich höhere Vakzinierungseffizienz bei deut­ lich verringerten molaren Vakzindosen.
• - Die Vakzinierung mit einem Hybrid bestehend aus Teilen der invarianten Kette und einem bekannten, T-Zellepitope enthal­ tenden Antigen ist möglich, ohne daß T-Zellepitope exakt de­ finiert sein müssen. Dieser Ansatz sollte bei der Bekämpfung intrazellulärer Pathogene (Viren, Parasiten, Mycobakterien) und einer Verstärkung der T-Zellantwort gegen Tumorantigene nützlich sein.
• - Die Möglichkeit der Applikation von definierten T-Zellepito­ pen erlaubt ein fokussiertes und spezifisches Eingreifen bei allergischen Reaktionen, mit dem Ziel allergenspezifische T-Zellen zu desensibilisieren. In analoger Weise sollte dieser Ansatz auch bei Autoimmunerkrankungen wie auch bei der Kon­ trolle von Transplantatsabstoßungen möglich sein.

Ferner kann das erfindungsgemäße rekombinante Polypeptid zur Modulation der Immunantwort durch Selbst-, Fremd- und Desig­ ner-Peptide verwendet werden, wobei eine derartige Modulation aufgrund der vorstehend aufgeführten Vorteile des erfindungs­ gemäßen rekombinanten Polypeptids effizienter durchgeführt werden kann. Ferner kann durch Integration von sogenannten "altered peptide ligands (APL)" als T-Zellepitope im erfin­ dungsgemäßen rekombinanten Polypeptid der Aktivierungszustand von T-Zellen beeinflußt werden.

Fig. 1 zeigt die Titrationskurven verschiedener Darrei­ chungsformen des Tetanustoxins (TT) bzw. der antigenen Pep­ tide/Polypeptide von Clostridium tetani, wobei die Einbaurate von ³H-Thymidin als Maß der T-Zellproliferation in Abhängig­ keit der Antigenkonzentration dargestellt ist. Die basale Pro­ liferation ohne Zugabe eines Antigens liegt bei 1500 cpm. Das antigene TT-Peptid TT(1061-1075) enthält das T-Zellepitop. Das Ii-TT-Hybrid enthält die Kernsequenz TT(1064-1072) an­ stelle der CLIP-Kernsequenz Ii₁₀₇-Ii₁₁₅ der invarianten Kette. TTC ist ein rekombinantes Polypeptid des C-Fragments des TT, das natürlicherweise das antigene TT-Peptid TT(1061-1075) ent­ hält. Das CLIP-TT-Hybrid ist ein Hybrid eines CLIP-Peptids, bei dem die CLIP-Kernsequenz gegen das Kernepitop TT(1064-1072) ausgetauscht wurde. Beim Ii-P-TT-Hybrid ist der Anteil der CLIP-Sequenz am N-Terminus verkürzt.

Fig. 2 ist eine Coomassie Blau-Färbung eines SDS-Poly­ acrylamidgels mit Darstellung eines rekombinanten Ii-TT-Hy­ bridproteins nach Aufreinigung über eine Metallo-Affinitäts­ chromatographie.

Spur 2 zeigt das rekombinante Ii-TT-Hybridprotein als Einzel­ bande bei einem Molekulargewicht von etwa 22 Kilodalton (K). Molekulargewichts-Marker mit 20 K und 30 K sind in Spur 1 ge­ zeigt.

Durch das nachfolgende Beispiel wird die vorliegende Erfindung näher erläutert.

Beispiel

Ein gut charakterisiertes T-Zellepitop aus dem Tetanustoxin wird in die Sequenz der invarianten Kette integriert. Dieses Hybrid-Antigen verstärkt die MHC Klasse II restringierte T-Helferzell-Antwort im Vergleich zu dem natürlichen Antigen bzw. dem rekombinanten C-Fragment um mehrere Potenzen.

Das System, worin die hocheffiziente Prozessierung des Hybrid­ proteins demonstriert wird, benützt als Antigen das Toxin aus Clostridium tetani, aus dem ein T-Zellepitop in die invariante Kette als Prozessierungseinheit integriert wird. Die Primärse­ quenz dieses Tetanustoxins ist bekannt (Eisel et al., EMBO J., 1986), ebenso eine Vielzahl daraus generierter antigener De­ terminanten für humane T-Zellen.

Das T-Zellepitop TT(1061-1075) dieses Tetanustoxins wurde kürzlich als dominantes T-Zellepitop für T-Zellen von DR17-po­ sitiven Spendern nachgewiesen (Malcherek et al., in Druck) Das Restriktionselement für die Erkennung von TT(1061-1075) ist das MHC Klasse II-Molekül HLA-DR17. Die spezifischen Kon­ taktstellen zum HLA-DR17 Molekül einerseits (sogenannte Anker) und zum T-Zellrezeptor andererseits (T-Zellrezeptor-Kontakt­ stellen) können mit Hilfe Alanin-substituierter Peptidanaloga dissoziiert werden und auf ein Kernepitop von neun Aminosäuren (I R E D N N I T L) festgelegt werden (Malcherek et al., in Druck). Die zusätzlichen Aminosäuren außerhalb dieser Kernse­ quenz des TT-Peptids stabilisieren in der Regel die Bindung zum MHC Molekül, ohne daß diese Aminosäureseitenketten in spe­ zifischer Weise mit dem MHC Molekül interagieren (Malcherek et al., J. Immunol. 1994, 153 : 1141).

Die Titrationskurven verschiedener Darreichungsformen des Te­ tanustoxins bzw. der antigenen Peptide/Polypeptide zeigen den antigenen Charakter des Ii-TT-Hybridproteins, das darüber­ hinaus eine dramatisch verstärkte Immunogenität im Vergleich zum nativen Antigen und dem rekombinanten C-Fragment des TT aufweist (vgl. Fig. 1). Dieser Verstärkungseffekt wird umso bemerkenswerter in Anbetracht der Tatsache, daß das dominante T-Zellepitop TT(1061-1075) des Tetanustoxins bereits in seiner physiologischen Umgebung im nativen Toxin sehr effizient pro­ zessiert und von spezifischen T-Zellen erkannt wird (Malcherek et al., in Druck). Verdeutlicht wird dieser Sachverhalt durch die geringen Antigenkonzentrationen im picomolaren Bereich, die notwendig sind, um T-Zellen in vitro zur halbmaximalen Proliferationsleistung zu stimulieren (vgl. Fig. 1). Die Spe­ zifität der Stimulation des T-Zellklons kann mittels eines an­ deren rekombinanten Ii-Konstrukts demonstriert werden, das die T-Zellen nicht zur Proliferation anregt.

Zudem kann mittels zweier weiterer Hybridpeptide dargestellt werden, daß in der Tat die Kernsequenz für eine optimale Sti­ mulation ausreichend ist (vgl. Fig. 1). Diese Hybridpeptide werden so konzipiert, daß die Kernsequenz aus dem Tetanustoxin von Aminosäuren aus den CLIP-Peptiden flankiert wird. Damit soll die Situation imitiert werden, die bei der Prozessierung des hybriden Antigens erwartet wird. Das kürzere Peptid KPVSK- TT(1064-1072)-QA ("Ii-P-TT-Hybrid") stimuliert ähnlich gut wie das originale T-Zellepitop TT(1061-1075). Das längere Peptid hingegen, das quasi ein CLIP-Hybrid ("CLIP-TT-Hybrid") dar­ stellt, hat aber eindeutig ein stärkeres antigenes Potential als TT(1061-1075).

Diese Daten sind ein sicheres Indiz dafür, daß Sequenzen der CLIP-Region außerhalb der Kernsequenz von Ii(107-115) die An­ tigenität der Kernsequenz des T-Zellepitops verstärken können. Eine weitere Verstärkungswirkung der Antigenität des Hybrid­ proteins im Vergleich zum nativen Protein bzw. zum rekombinan­ ten C-Fragment liefern die auf der invarianten Kette liegenden Sequenzen für eine optimale Prozessierung der T-Zellepitope.

Diese Daten zeigen ferner, daß antigene Sequenzen anstelle von CLIP-Sequenzen in Ii-Hybridkonstrukten effektiv prozessiert werden, und die MHC Klasse II restringierte T-Zellantwort auf einer molaren Basis dramatisch verstärken.

1. Konstruktion der Plasmid-DNA-Kassette pQE31/Ii-TT

Die cDNA der p35 Ii (pcDV₁, Strubin et al., 1986) wird mit 5′- und 3′-spezifischen Oligonukleotid-Primern so amplifi­ ziert, daß nur die kodierende Sequenz mittels neu eingefüg­ ter EcoRI-Restriktionsschnittstellen in pBluescript KS⁺′′ (Fa. Stratagene, Heidelberg, Deutschland) subkloniert wer­ den kann. Mittels Oligonukleotid-gerichteter, ortsspezifi­ sche Mutagenese, basierend auf Polymerase Kettenreaktion (PCR), wird eine NspV-Restriktionschnittstelle generiert, und die weiter 3′-gelegene NcoI-Restriktionschnittstelle zerstört. Diese Ii-Mutante, welche die original Proteinse­ quenz der Ii kodiert, wird durch NspV/NcoI-Spaltung um die CLIP-Kernsequenz von Ii₁₀₇-Ii₁₁₅ (die Nomenklatur ist auf den Translationsstart bei Methionin l der nativen Ii bezo­ gen) deletiert. In diese Ii-Kassette werden die Oligonuk­ leotide ligiert, die für die Kernsequenz des T-Zellepitops [TT(1064-1072)] aus dem Tetanustoxin kodieren. Das PstI/BamHI-Fragment wird anschließend in pQE31 (Fa. Diagen, Hilden, Deutschland), ein bakterieller Expressionsvektor, subkloniert, wobei die Plasmid-DNA-Kassette pQE31/Ii-TT er­ halten wird.

2. Expression des rekombinanten Polypeptids Ii-TT

Die Expression des rekombinanten Ii-TT-Hybridproteins er­ folgt im wesentlichen entsprechend den Anleitungen zum QIA- express-System (Fa. Diagen, Hilden, Deutschland). Kompe­ tente E. coli M15-Zellen werden mit pQE31/Ii-TT transfor­ miert und 100 ml Bakterienkultur bei OD₆₀₀ von 0,5 mit IPTG induziert. Nach 3h wird das Zellpellet in 20 ml 6M Guanidi­ niumhydrochlorid lysiert und der Überstand nach Ultrazen­ trifugation (21 500 UPM, TI45) chromatographisch über eine Ni-NTA-Metall-Affinitätssäule (Fa. Diagen, Hilden, Deutsch­ land) gereinigt. Das pH 4,5-Eluat wird mittels SDS-Poly­ acrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Die Coo­ massie Blau-Färbung zeigt eine Einzelbande bei 22 KD ohne sichtbare bakterielle Kontaminanten. (Die Identität des Ii- TT-Proteinhybrids wurde durch ELISA mit den Ii-spezifischen monoklonalen Antikörpern M-B741 (Geschenk von Prof. Dr. Rieber, Institut für Immunologie, München) und SD₃253.74 (Geschenk von Dr. H. Kalbacher), Physiologisch-Chemisches Institut, Universität Tübingen) bestätigt.)

Claims (11)

1. Nukleinsäure, enthaltend mindestens eine für ein rekom­ binantes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, wobei das rekombinante Polypeptid mindestens teilweise die Pri­ märsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Pri­ märsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop, das in den die CLIP-Sequenz umfassenden Bereich der invarianten Kette eingefügt ist, enthält, und wobei das rekombinante Poly­ peptid in Antigen-präsentierenden Zellen derart prozes­ siert wird, daß das spezifische T-Zellepitop erzeugt wird und an MHC II-Moleküle bindet.

2. Nukleinsäuren nach Anspruch 1, wobei mindestens eine Aminosäure des die CLIP-Sequenz um­ fassenden Bereichs der invarianten Kette deletiert ist und durch das T-Zellepitop ersetzt ist.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei der die CLIP- Sequenz umfassende Bereich die AS-Position 97 bis 126 der invarianten Kette ist.

4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das T-Zellepitop von einem Selbstprotein, oder einem viralen, prokaryotischen oder eukaryotischen Antigen stammt.

5. Vektor, enthaltend die Nukleinsäure von einem der Ansprü­ che 1 bis 4, zur Expression des rekombinanten Polypeptids in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen.

6. Wirtszelle, enthaltend die Nukleinsäure von einem der An­ sprüche 1 bis 4 oder den Vektor von Anspruch 5.

7. Wirtszelle nach Anspruch 6, worin das rekombinante Poly­ peptid exprimiert wird.

8. Rekombinantes Polypeptid, enthaltend mindestens teilweise die Primärsequenz der invarianten Kette und mindestens eine Primärsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop, das in den die CLIP-Sequenz umfassenden Bereich der invarianten Kette eingefügt ist, wobei das rekombinante Polypeptid in Antigen-präsentierenden Zellen derart pro­ zessiert wird, daß das spezifische T-Zellepitop erzeugt wird und an MHC II-Moleküle bindet.

9. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 8, wobei mindestens eine Aminosäure des die CLIP-Sequenz um­ fassenden Bereichs der invarianten Kette deletiert ist und durch das T-Zellepitop ersetzt ist.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Nuklein­ säure von einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das rekom­ binante Polypeptid von Anspruch 8 oder 9.

11. Verwendung der Nukleinsäure von einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des rekombinanten Polypeptids von Anspruch 8 oder 9 in einem diagnostischen Kit zum Nachweis von Autoimmunkrankheiten.