DE69822779T2

DE69822779T2 - Peptid aus humanem Interleukin-2 zur Steigerung der Vasopermeabilität und dessen Immunkonjugate

Info

Publication number: DE69822779T2
Application number: DE69822779T
Authority: DE
Inventors: Alan L. Epstein; Leslie A. Khawli
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1998-01-09
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2018-01-16
Also published as: ATE263247T1; CA2219961A1; CA2219961C; EP0931836B1; DE69822779D1; ES2218717T3; EP0931836A1; HK1023788A1; AU5182198A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Fähigkeit von monoklonalen Antikörpern (MAbs) Tumore zu targetieren und sich an diesen Tumoren anzulagern wurde vielfach sowohl an Tiermodellen, als auch am Menschen demonstriert. Obwohl die Ausprägung des Targetings bei verschiedenen MAbs variiert, ist die Anzahl der Antikörper, welche sich an Tumore binden, relativ zu der Anzahl, welche sich an normales Gewebe binden genügend hoch, um einen klares Tumorbild unter Verwendung von einschlägigen radioaktiven Markern abzubilden.
Bei der Therapie bestimmt jedoch die Quantität der Antikörper, welche sich im Tumorgebiet anhäufen, die Nutzlast der an therapeutischen Radionukliden, -Toxinen oder Arzneimitteln, welche dem Tumor verabreicht werden. Früher Studien, welche in Tumoren von Patienten nach den prozentuale Anteil an in den Tumor injizierten Dosen von radioaktiv markierten MAbs gemessen haben, zeigten extrem niedrige Werte in der Größenordnung von 0,01–0,1% (siehe, z. B., Goldenberg, D. M., Arch. Pathol. Lab. Med. 112: 580–587 (1988); Epenetos et al., Cancer Res. 46: 3183–3191 (1986)). Wenn man die relative Widerstandskraft der meist bösartigen Tumoren gegenüber Arzneimitteltherapie und Radiotherapie berücksichtigt, so ist es geboten, dass die Ansammlung von MAbs in der Tumorgegend wirkungsvoll verbessert werden muss, um einen adäquaten Therapie-Index zu erreichen, der zur Erreichung einer maximalen Tumorzerstörung und der nachhaltigen Therapie erforderlich ist.
Um die Effektivität der monoklonalen Antikörpertherapie (MAb) zu verbessern, haben eine Anzahl von Forschern Immunokonjugate hergestellt, welche aus MAbs und biologischen Reaktionsmodifizierern zusammengesetzt waren, wie z. B. dem Cobra Venom Faktor (Vogel, C. and Muller-Eberhard, H., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 78(12): 7707–7711 (1981), Vogel, G. et al „Hematology and Blood Transfusion," in Modern Trends in Human Leukemia VI, 29: 514–517 (1985), Rolf Neth, Ed.), formyl-methionyl-leuZyl-phenylalanine (Obrit, R. Sandberg, A., Cellular Immunology 81: 169–174 (1983); Obrist, et al., Bent 53: 251 (1986)), und interferon-y (Flanney, G. etal., Eur. J. CancerClin. Oncol., 20(6): 791–798 (1984)).
Diese Studien zeigten, dass Immunokonjugate direkte spezifische Reaktionen, wie Tumorrizidaleffekte oder Chemotaxis, speziell in der Tumorgegend ohne nachweisbare Toxizität im normalen Organgewebe erzielten. Jedoch verbesserte dieser Vorstoß ausschließlich die Effektivität der monoklonalen Antikörper Therapie, ohne das Problem zu lösen, dass nur extrem geringe Mengen von monoklonalen Antikörpern in der Tumorgegend akkumuliert werden.
Ein weiterer Lösungsversuch ist, die Veränderung der Physiologie der Tumorgefäße zur Verbesserung der Aufnahme von Makromolekülen durch den Tumor zu verändern. Dieser Ansatz benutzt MAbs als Träger für die Verabreichung von vasoaktiven Peptiden und Präparaten an den Tumor. Sieben verschiedene vasoaktive Präparate, nämlich Tumor-nekrose Faktor α, Interleukin-1β, Interleukin-2 (IL-2), Physalaemin, Histamin, Bradykinin, oder Leukotrien wurden chemisch verbunden mit einem monoklonalen Antikörper, welcher auf degenerierte Zellen in einer Nekrose-Region des Tumors targetiert wurde. Während alle sieben Immunokonjugate eine spezifische Verbesserung der monoklonalen Antikörperaufnahme im Tumor aufwiesen, zeigte das IL-2/MAb Konjugat den höchsten Prozentsatz an injizierter Dosis pro Gramm des Tumors (Khawli, et al., Cancer 73: 824–831 (1994)).
Interleukin-2 ist ein vielversprechender Bewerber für Bemühungen, den therapeutischen Index der MAb-Therapie zu verbessern. Es ist ein 15.000 Dalton Protein, welches durch Helfer-T-Lymphozyten produziert wird. Als ein potenter biologischer Modulator im Immunsystem von Tieren und Menschen, erfüllt er eine zentrale Rolle in der Vermehrung von zellulären Immunreaktionen. Seine Hauptfunktion umfasst die Proliferation von T-Lymphozyten (Morgan, D. A, et al., Science 193: 1007–1008, (1976)) und die Generation von nicht-spezifischen tumorabtötenden Zellen durch aktivierte Makrophagen, Lymphokin-Aktivierte Killerzellen (LAK Zellen) (Grimm, E. A., et al., J. Exp. Med. 155: 1823–1841 (1982)), und Tumor infiltrierende Lymphozyten (TIL- Zellen) (Rosenberg, S. A., et al., Science 233: 1318–1321 (1986)). Zusätzlich zu seiner Zytokin-Aktivität, wurde gezeigt, dass IL-2 eine vaskuläre Permeabilität produziert, wenn diese systematisch unter Verursachung eines Efflux von intravaskularen Flüssigkeiten in extravaskulare Zwischenräume verabreicht wird (Kapillar Leck Syndrom) (Rosenstein, M., et al., Immunology 137: 1735–1742 (1986); Ohkubo, C., et al., Cancer Res. 51: 1561–1563 (1991); Edwards, M. J., et al., Cancer Res. 52: 3425–3431 (1992); Dame, N. K., et al., J. Immunol. 142: 2660–2669 (1989)).
Menschliches IL-2 ist ein globuläres Protein, bestehend aus 133 Aminosäuren und ist in der Struktur ähnlich zu Interleukin-4 und dem „Granulocyt/Macrophage-Colony Stimulating Factor" (GM-CS F)(Bazan, J. F., Science 257: 410–412 (1992)).
Strukturelle Untersuchungen von IL-2 zeigen, dass es aus vier großen amphipathischen alpha Spiralen aufgebaut ist, welche in einer antiparallelen Weise angeordnet sind, mit hydrophoben Flächen, welcher einen sehr stabilen hydrophobischen Kern bilden (Bazan, J. F., (1992); McKay, D. B., Science 257: 412–413 (1992)). Zusätzlich ist eine Disulfid-Bindung bedeutsam zur Stabilisierung der Tertiär-Struktur und ist wesentlich für die biologische Aktivität von IL-2 (Landgraf, B. E., Proteins 9: 207 (1991)). Der Verlust dieser Disulfid-Bindung, ebenso wie auch geringe andere Veränderungen in der primären der sekundären Strukturebenen heben die Zytokin-Aktivität auf, wie in zielgerichteten Mutagenese Studien gezeigt wurde (Cohen et al., Science 234: 349–352 (1986)). Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass eine intakte, native IL-2 Struktur eine Voraussetzung für die biologische Aktivität, wegen der einzigartigen Struktur des IL-2 Rezeptors ist, welcher entweder einer niedrige Affinität (α-Kette), eine mittlere Affinität (β und γ-Ketten) oder eine hohe Affinität (α, β und γ-Ketten) aufweist. (Smith, K. A., Blood 81: 1414–1423 (1993)).
Peptidfragmente von IL-2 sind verwendet worden, um monoklonale Antikörper herzustellen, welche in diagnostischen Assays und zur Identifikation von IL-2 Bindungen verwendet werden können (EP0 157 643). Zudem wurde ein kleines Fragment von IL-2 identifiziert, welches dieses bindet, jedoch nicht den IL-2 Rezeptor aktiviert (JP 2-209892). Infolgedessen blockiert das Fragment die Zytokin-Aktivität von IL-2, welche die Bindung des IL-2-Rezeptors erfordert.
Wenn IL-2 alleine als therapeutischer Wirkstoff eingesetzt wird oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, wie etwa Interferon-A, LAK, TILs oder monoklonalen Antikörpern, werden 20 bis 50% der teilweisen oder kompletten Antworten in gewissen menschlichen Neoplasmen erzeugt, welche Lymhpoma, Nierenzellen-Krebs und Melanome umfassen. (Lotze, M. T., Interleukin-2," in Human Zytokines, Ed. by Aggarwal and Gutterman, pp. 81–96 (1992); Marincola, F. M., Biologic Therapy of Cancer Updates 4(3): 1–16 (1994); 5 Thompson, J. A., et al., Hematologic Growth Factors 2(5): 351–355 (1994)). Die Wirkung von IL-2 gegen Krebs wurde seiner Fähigkeit zugeschrieben, primär durch T-Expansion und durch Umleitung von aktivierten T-Zellen in das Gewebe die Immnunresistenz des Wirts zu erhöhen. Jedoch hat die Verabreichung von IL-2 verschiedene systematische Effekte, welche mit dem Kapillar Leck Syndrom („capillary leak syndrome") verbunden sind, einschließlich Ödemformung, Hypotension und Nieren-Dysfunktion. Diese Nebenwirkungen begrenzen die Verabreichung von höheren Dosen von IL-2 und können zu einen einem Abbruch der Therapie führen.
Ein Ansatz die toxischen Effekte der systematischen IL-2 Verabreichung zu reduzieren, wäre möglicherweise, IL-2 direkt einer Tumorgegend durch ein Antikörper Verabreichungssystem zu zuführen. Konsequenterweise wurde IL-2 erfolgreich mit einer Anzahl von Immunokonjugaten und Fusionsproteinen eingesetzt. Einer Reihe von Forschern hat gezeigt, dass die IL-2 Zytokin-Aktivität durch solche Konstrukte bewahrt werden kann. Zum Beispiel setzten Gillies et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89, 1428–1432 (1992)) ein genetisch konstruiertes Fusionsprotein in einen chimärischen Anti-gangliosiden GD2 Antikörper und IL-2 ein, welche das Töten von auf GD-2 ausgerichtete Melanom-Zielzellen durch einen TIL-Zelllinie verbesserte. Savage et al. (Br. J. Cancer Arts 67: 304–310 (1993)) konstruierten dem ähnlich ein aus einer Kette bestehendes IL-2 Fusionsproteinen, welches die Fähigkeit besitzt, sowohl Antigene als auch IL-2 Rezeptoren an sich zu binden, als die Proliferation von peripheren menschlichen Blutleukozyten zu stimulieren. Zudem demonstrierten Naramura et al. (Immunol. Lett. 39: 91–99 (1994)), dass ein genetisch konstruiertes Fusionsproteinen, welches aus IL-2 und aus einem Maus/Mensch chimärischen monoklonalen Antikörper besteht, welcher gegen deren menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor gerichtet ist, Immuneffektorzellen in vitro aktiviert, und die zellulare Zytotoxizität gegen menschliche Melanomzellen verbessert.
Im Gegensatz zu der Arbeit, welche sich hauptsächlich auf die IL-2 Zytokin-Aktivität richtet, zielt ein anderer Ansatz auf den Einsatz der Toxizität. So wurde z. B. IL-2 kovalent an einen Tumor spezifischen monoklonalen Antikörper (MAb/IL-2) gebunden, um eine örtlich vorgegebene Vasopermeabilität in dem Tumorgebiet zu erzielen (Khawli, et al., (1994); LeBerthon et al., Cancer Res. 51: 2894–2698 (1991)). Die Erzeugung von undichten Tumor Endithelien, welche mit MAb/IL-2 vorbehandelt wurden, produzierten einen 3–4 fachen Anstieg der Aufnahme von monoklonalen Antikörpern, was in normalem Gewebe nicht beobachtet werden konnte. Anders als die vorhergehenden oben zitierten Studien, (Gillies et al., Savage et al., and Naramura et al.), zerstörte die Chemie, welcher zum Anbinden von IL-2 an die monoklonalen Antikörper benutzt wurde, welche die Zytokin-Aktivität von IL-2 ohne die Vasopermeabilitätseffekte zu berühren.
Zusammengenommen, bestärkten diese Studien die Erkenntnis, dass die Vasopermeabilität für die Aktivität von IL-2 eine stabile Eigenschaft des Moleküls zu sein scheint, verglichen mit der Zytokin-Aktivität, welche anfälliger für Zerstörung der tertiären Struktur von IL-2 scheint. Konsequenterweise ist es vorteilhaft ein synthetisches IL-2 Peptid zu entwickeln, welches die biologische Aktivität der Vasopermeabilität aufweist, aber nicht die Zytokin-Aktivität des Moleküls aufweist. Ein solches Peptid kann eingesetzt werden, um potente vasoaktive Immunokonjugate zu verbessern, welche eine reduzierte Toxizität für normales Gewebe aufweisen, und welches eingesetzt werden kann, um die Verabreichung von therapeutischen und diagnostischen Wirkstoffen in Tumoren u. a. Gewebe zu verbessern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Permeabilität verbessernde Peptide, welche den Bedarf nach wirksamen vasoaktiven Wirkstoffen erfüllen, welche die Aufnahme von therapeutischen und diagnostischen Wirkstoffen in einem Tumorgebiet verbessern. Ein vasoaktives Peptid mit den Eigenschaften der vorliegenden Erfindung umfasst ein Fragment von Interleukin-2, welches im Wesentlichen frei von Zytokin-Aktivitäten ist. Das vasoaktive Peptid ist in der Lage, die vaskuläre Permeabilität zu verbessern, wenn es mit einem Träger-Makromolekül zusammengefügt wird, wobei das Peptid für sich allein im Wesentlichen im lebenden Organismus weniger wirksam ist.
Ein besonders vorteilhaftes Träger-Makromolekül dient als Transportvehikel, welches sich an dem Ort neoplastischen Gewebes lokalisieren kann. Das vasoaktive Peptid und das Transportvehikel können mittels einer chemischen Reaktion zusammengefügt werden, um ein Konjugat zu bilden. Alternativ kann ein Expressionsvektor gentechnisch manipuliert werden, um ein Fusionsprotein zu erzeugen, welches ein Transportvehikel exprimiert, welches innerhalb einer geeigneten Zelllinie mit einem die Permeabilität verbessernden Peptid (PEP) verbunden ist.
Eine bevorzugte Ausführung der vorliegenden Erfindung umfasst ein PEP, welches mindestens einen Cystein-Rest hat, welches eine Disulfid-Bindung mit einem weiteren PEP bilden kann. Eine besonders bevorzugte Ausführung umfasst einen PEP Dimer, welcher mit einer Disulfid-Bindung verbunden ist.
Eine weitere Ausführung der vorliegenden Erfindung enthält ein synthetisches Peptid, welches mindestens 22 Aminosäuren besitzt, entsprechend den Resten 37 bis 58 von IL-2. Eine besonders bevorzugte Ausführung enthält eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 37 Aminosäuren lang ist, gemäß SEQ ID NO: 1.
Andere Versionen der Erfindung umfassen ein Konjugat oder ein Fusionsprotein, worin das Transportvehikel ein tumorspezifischer monoklonaler Antikörper ist. Bevorzugte Versionen der Erfindung enthalten Konjugate und Fusionsproteine, worin das Transportvehikel aus der Gruppe gewählt wird, welche aus einem murinen Antikörper, einem menschlichen Antikörper und einer Chimäre von menschlichen und murinen Antikörpern zusammengesetzt ist. Die bevorzugtesten Ausführung beinhalten einen monoklonalen Antikörper, welcher aus einer Gruppe ausgewählt wird, welche aus Lym-1, Lym-2, TNT-1, TNT-2 und TV-1 besteht.
Die Konjugate und Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung können bei einer Methode zur Therapie von neoplastischem Gewebe verwendet werden. Die therapeutische Methode umfasst das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Konjugats oder Fusionsproteins an einen Tumor-tragenden Wirt. Die Therapie umfasst weiter die Verabreichung eines antineoplastischen therapeutischen Wirkstoffs, nach oder gleichzeitig mit der Verabreichung eines Konjugats oder Fusionsproteins. Solch eine therapeutische Methode kann die Aufnahme eines antineoplastischen Wirkstoffs in einem Tumorgebiet verbessern. Ein Anwendungspaket zur Verwendung während der therapeutischen Behandlung enthält einerseits ein vasoaktives Konjugat oder Fusionsprotein und andererseits einen antineoplastischen Wirkstoff.
In ähnlicher Weise können die vasoaktiven Konjugate und Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung bei einer diagnostischen Methode für Tumorbildaufbereitung verwendet werden. Die Methode umfasst das Verabreichen einer wirksamen Menge eines vasoaktiven Konjugates oder Fusionsproteins an einen Tumor-tragenden Wirt. Die Methode umfasst weiter die Verabreichung eines Tumorbildaufbereitungsmittels, nach oder gleichzeitig mit dem Verabreichen eines Konjugat oder Fusionsproteins. Die diagnostische Methode kann die Menge eines Tumorbildaufbereitungsmittels erhöhen, welches sich in einem Tumorgebiet ansammelt. Ein diagnostisches Anwendungspaket zum Gebrauch im Tumorbildaufbereitungsverfahren enthält einerseits ein vasoaktives Konjugat oder Fusionsprotein und andererseits ein entsprechendes Tumorbildaufbereitungsmittel.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden mit Bezug auf die folgende Beschreibung, beigefügten Ansprüchen und begleitenden Zeichnungen:
1(A) zeigt die Aminosäure (SEQ ID NO: 1) und DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 2) des PEP (aa22–58 der vollen Länge IL-2),
1(B) zeigt eine schematische Zeichnung von IL-2, wobei Spiralen (Helices) als Zylinder gezeigt werden (McKay D. B., (1992)),
1(C) zeigt ein Stereogramm einer C-α-Spur einer Atomstruktur eines IL-2 Moleküls (McKay, D. B. (1992)),
1(D) zeigt ein Banddiagramm eines Mitglieds der rechtsdrehenden Zylinderfamilie der vorhergesagten IL-2 Strukturen ((Cohen et al. (1986))), worin die PEP-Sequenz hervorgehoben wird, und die Disulfid-Bindung in den 1(B), 1(C) und 1(D) gezeigt wird;
2 zeigt ein schematisches Diagramm der chemischen Produktion eines die Permeabilität verbessernden Peptid (Pep)(A) Dimers und (B) Monomers;
3 zeigt die Ergebnisse der Biodistributions-Studien mit rekombinanten menschlichen IL-2 (rhIL-2) und PEP Immunokonjugaten in Tumor-tragenden Nacktmäusen, worin die Ergebnisse entweder als ein (A) % injiziertes Dosis/Gramm- oder (B) Tumor/Organ-Verhältnis ausgedrückt werden, (n = 4); und
4 zeigt die Ergebnisse von Biodistributions-Studien mit rhIL-2, PEP, PEP Monomer und PEP Dimer Immunokonjugaten in Tumor-tragenden Nacktmäusen, worin die Ergebnisse als (A) % injizierte Dosis/Gramm- und (B) Tumor/Organ-Verhältnissen ausgedrückt werden.
Detaillierte Beschreibung
Diese Erfindung liefert ein aktives, im Wesentlichen synthetisches IL-2 Peptid, und ihr Dimer, welche eine Vasopermeabilitäts-Aktivität haben, aber welche frei von Zytokin-Aktivität sind. Die Erfindung liefert auch starke vasoaktive Immunokonjugate dieser Peptide mit tumorspezifischen Antikörpern. Solche Konjugate erleichtern die Zuführung therapeutischer und diagnostischer Mittel in Tumore und andere Geweben.
Die Permeabilität verbessernde Peptide
Die Erfindung liefert vasoaktive IL-2 Peptide, welche im Wesentlichen frei von zytokiner Aktivität sind. Diese neuartigen Peptide schließen Teile der Aminosäuresequenz der IL-2, Sequenzen, welche auch aus der Nukleotidensequenz hergeleitet werden können, welche durch Taniguchi et al. beschrieben wurden (Nature 302: 305–310 (1983)), hierin durch Referenz integriert. Die Peptide sind vorzugsweise synthetisch. Die monomeren Peptide können auch aus natürlich vorkommendem IL-2 mittels bekannter Technik isoliert werden.
Eine Serie ausgeprägter, die Permeabilität verbessernder Peptide (PEP) sind synthetisiert worden, welche, wenn an ein geeignetes Transportvehikel gekoppelt, für eine gesteigerte vaskuläre Permeabilität im lebenden Organismus (in vivo) verantwortlich sind. Überdies sind die synthetischen Peptide als solche nach intravenöser Verabreichung kurzlebig und haben vernachlässigbare Effekte auf vaskuläre Permeabilität verglichen mit unverändertem IL-2. Folglich muss das vasoaktive Peptid mit einem geeigneten Transportvehikel verbunden werden, um die Vasopermeablitätseffekte der Peptide zu maximieren. Vorzugsweise weisen die Peptide, alleine oder verbunden mit einem Transportvehikel, unbedeutende Zytokin Aktivität in IL-2 Bioassays auf, wie zum Beispiel T-Zellproliferation und Zytotoxizitätsassay. Zusammengenommen gewährleisten diese Merkmale des PEP, wenn mit einem Transportvehikel verbunden, einen leistungsfähigen vasoaktiven Wirkstoff, minimieren jedoch eine potenzielle toxische Wirkungen auf normale Gewebe.
Die Länge des PEP ist vorzugsweise mindestens etwa 22 Aminosäuren lang und besonders vorteilhaft etwa 37 Aminosäuren lang. Bevorzugte Ausgestaltungen der Peptide beinhalten Aminosäurereste der Nummern 37 bis 58, 33 bis 58, oder 37 bis 72 der Aminosäuresequenz SEQ ID No: 3. Diese bevorzugten Ausgestaltungen bieten etwa 50% der Permeabilitätseffekte eines IL-2 Immunokonjugates, wenn sie mit einem entsprechenden Transportvehikel verbunden sind. Die bevorzugteste Ausgestaltung des PEP umfasst die Restenummern 22 bis 58 von SEQ OD NO: 3, d. h. der ganzen Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1. Diese PEP-Ausgestaltung bietet ein Optimum von etwa 100% der Vasopermeabilität eines IL-2 Immunokonjugats, wenn mit einem entsprechenden Transportvehikel verbunden.
Die vollständige Aminosäuresequenz des IL-2 Peptid-Fragments, welches das bevorzugteste PEP (SEQ ID NO: 1) ist, wie auch die entsprechende DNA Sequenz (SEQ ID NO: 2), wird in 1A gezeigt. Der Standort dieses Fragments in dem intakten IL-2 Molekül wird schematisch in drei Diagrammen gezeigt, welche von Forschern verwendet worden sind, um das IL-2 Molekül (siehe, 1B, 1C, und 1D) darzustellen.
Die Permeabilitätseffekte der Peptide der vorliegenden Erfindung werden weiter optimiert, wenn das PEP ein Dimer umfasst, welcher vorzugsweise mit einer Disulfid-Bindung verbunden ist. Folglich schließt eine bevorzugte Ausgestaltung des PEP einen Cystein-Rest ein und ist mit einem anderen PEP-Molekül in der Lage, eine Disulfid-Bindung zu bilden. Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung umfasst einen PEP Dimer, welcher eine Dislufid-Brücke besitzt, welche mit zwei Cytsein-Resten verbunden ist.
Die PEP-Moleküle erwerben ihre Fähigkeit, eine lokalisierte Zunahme vaskulärer Permeabilität zu produzieren, wenn sie mit Transportvehikeln verbunden sind, welche das vasoaktive Peptid an entsprechende Tumor-Targets leiten können. Die Verbindung des PEP mit entsprechenden Transportvehikeln, wie tumorspezifischen monoklonalen Antikörpern (MAb) kann leicht mit chemischen Konjugationsmitteln erreicht werden, wie weiter unten beschrieben. Alternativ kann das PEP mit dem Tumor-spezifischen MAb verbunden unter Verwendung von gentechnische Verfahren, um ein PEP/MAb Fusionsprotein zu ermöglichen, wie ebenfalls unten beschrieben. Zusätzlich zu dem PEP können die Konjugate oder Fusionsproteine geeignete Linkermoleküle einschließen, z. B. Peptide oder bifunktionale Reagenten, welche Störungen der tertiären Struktur des PEP oder des MAb überwinden können.
Die Permeabilität verbessernde Eigenschaften der Konjugate können durch in vivo-Versuche bestimmt werden, wie jene, welche in Beispiel 7 beschrieben sind. Beispielhafte in vitro Prüfungen für Zytokin Aktivitäten sind in Beispiel 8 zu finden.
Auswahl von Transportvehikeln
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung umfasst die Wirksamkeit eines vasoaktiven Peptids, wenn es mit einem Tumor-spezifischen Transportvehikel verbunden ist. MAbs sind ideale Transportvehikel, weil sie homogen sind, erkennen spezifische Determinanten, und sind relativ biokompatibel. Bevorzugte Transportvehikel schließen MAbs von Maus, Kaninchen oder anderen Säugetierarten ein. Am besten wird die Immunogenizität von nicht-menschlichen MAbs durch die Auswahl von menschlichen oder Mensch-Maus chimärischen MAbs als Transportvehikel vermieden.
Geeignete monoklonale Antikörper (MAbs) zur Verwendung in der Erfindung umfassen nicht nur jene, welche eine Spezifität für Antigene haben, welche für Tumorzellen einzigartig sind, sondern auch jene, welche eine gemeinsame Spezifität für Antigene von normalen Geweben haben. Die Haupteigenschaft dieser monoklonalen Antikörper ist ihre Wirksamkeit als Träger, welche vorzugsweise vasoaktive Wirkstoffe am Ort des Tumors konzentrieren. Geeignete monoklonale Antikörper sind jene, welche eine Spezifität zu Antigenen haben, welche entweder reichlicher oder leichter in Tumorgewebe gebunden sind als in normalem Gewebe.
Einige MAbs gegen Tumor- oder normale zellulare Antigene, passend zum Gebrauch in Immunokonjugaten, sind kommerziell verfügbar (z. B. Centocor, Malvern, PA). Andere können durch die von Kohler und Milstein eingeführten Hybridom-Verfahren aufbereitet werden (Nature 256: 495 (1975)) und kommerzielle Anwendungspakete erleichtert diesen Prozess, z. B. HyBRL Prep Kit (Bethesda Research Labs, Bethesda Research Labs, Bethesda, MD).
Die Auswahl von Hybridom Zelllinien, welche geeignete MAbs produzieren, wird dadurch erreicht, dass zuerst einige Tage lang Hybridom Zellen gezüchtet werden, zum Beispiel in den Wells von Mikrotiterplatten. Die Zell-Überstände werden dann auf das Vorkommen von MAb zu Tumor oder zellularen Antigenen getestet mittels irgendeines geeigneten Immunassays, zum Beispiel ELISA. Die positiv getesteten Zellen werden dann im größeren Maßstab auf Kulturen ausgedehnt, um größere Mengen von MAbs zu produzieren. Eine adäquate Menge an MAb kann dann von den Überständen gereinigt werden, zum Beispiel durch Verwendung der Protein A Affinitäts-Chromatographie.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden kommerziell verfügbarer MAbs, welche spezifisch für Lymphoma Zellen sind, z. B. Lym-1 und Lym-2, verwendet (Techniclone, Corp., Tustin, CA).
In einer anderen bevorzugter Ausführung werden MAbs, welche spezifisch für intrazellulare Antigene sind, welche in degenerierenden Zellen zugänglich sind, verwendet z. B. sind TNT-1 und TNT-2 (Techniclone, Corp., Tustin, CA).
In einer weiteren bevorzugten Ausführung werden MAbs verwendet, welche spezifisch auf Tumorblutgefäße sind, z. B. TV-1 (Epstein A. L, Cancer Res. 55: 2673–2680 (1995), (in dieser Schrift als Referenz aufgeführt).
Das MAb des Immunokonjugats kann entweder ein intakter ganzer Antikörper, oder das monovalente HL Isoform, oder der F(ab')₂ Teil eines Antikörpers oder ein Fab Antikörperfragment sein. Das vollständige oder teilweise Entfernen des FC-Teils des Antikörpermoleküls kann dessen Gebrauch erleichtern durch Entfernen von Gebieten oder Domänen, welche mit Nicht-Tumorbestandteilen wie FC Rezeptoren oder Komponenten interagieren, während die Antikörperfragmente wie Fab, HL und F(ab')₂, welche jeweils 1/3, 1/2 und 2/3 des Gewichtes des ganzen Antikörpers haben, besser in der Lage sind, durch das interstitielle Gewebe und in den Tumor zu diffundieren. Jedoch werden die Fab, HL und F(ab')₂ Fragmente schneller vom Kreislauf freigegeben. Fab Fragmente können aufbereitet werden durch Aufschluss der ganzen Antikörper mittels Papain oder Aufschluss der ganzen Antikörper mittels Pepsin um F(ab)₂ Fragmente zu erzielen, gefolgt von dem Aufschluss von Interchain Disulfid-Bindung um einwertige Fragmente zu erhalten.
Außerdem sollten geeignete Transportvehikel ihre Fähigkeit bewahren, sich mit Antigenen zu binden, gefolgt von chemischer Konjugation mit vasoaktiven Peptiden. Die Immunreaktivität von MAbs, vor und nach der Konjugation mit Peptiden kann durch jeden geeigneten Immunassay wie den in Beispiel 6 beschriebenen Radioimmunassay bestimmt werden. Vorzugsweise werden in vivo Immunokonjugate mit im Vergleich zu unkonjugierten Antikörpern mehr als 75% Inmmunreaktivität verwendet.
Chemische Konjugationsmethoden
Sowohl die strukturelle Verbindung zwischen dem MAb und dem vasoaktiven Peptid als auch das chemische Verfahren mit welchem sie verbunden werden, sollte so gewählt werden, dass die bindende Fähigkeit des MAbs und die biologische Aktivität des Peptids, wenn in dem Konjugat zusammengefügt, minimal beeinträchtigt wird. Wie von den Fachleuten anerkannt, gibt es eine Reihe von geeigneten chemischen Konjugationsverfahren einschließlich der folgenden Verfahren.
1. Konjugation mittels CDI Verfahren
Carbodiimide (GDIs), welche Anhydride von Harnstoff sind, können Cross-Links bilden zwischen dem Antikörper und den Peptiden, ohne Rücksicht auf die Orientierung des jeweiligen Moleküls. Konjugate werden durch Kondensation des Antikörpers und des Peptids unter sauren Bedingungen mit CDI erzeugt. Dieses Verfahren ergibt ein rasches und einfaches Mittel der Konjugation.
2. Konjugation mittels SPDP Verfahren
N Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio) Propionat (SPDP) ist ein hetero-bifunctionales Reagens, welches Thiol-Gruppen an die End-Aminobausteine von Proteinen andockt und es ist bei einer Vielzahl von Immunokonjugaten verwendet worden.
3. Konjugation mittels SMCC Verfahren
Peptide können ebenfalls an Antikörper gekoppelt werden indem das bifunktionale Reagens Succinimidyl-4-(N Maleimido Methyl) Cyclohexan 1-Carboxylat (SMCC) verwendet wird.
4. Konjugation mittels NHS Verfahren
N-Hydroxisuccinimide (NHS) aktiviert eine End- COOH-Gruppe zum Beispiel eines Peptids, um ein aktives Ester-Derivat zu bilden, welches kovalent an das Protein des monoklonalen Antikörpers gebunden sein kann.
5. Glutaraldehyde
Ein alternatives Verfahren zur Konjugation von Peptiden an Proteine verwendet Glutaraldehyde als ein Koppel-Reagens.
Nucleophilische Gruppen wie Sulfhydryl und Aminogruppen binden sich kovalent an die Aldehyde und bilden eine Schiff-Base. Überschüssige aktive Glutaraldehyd-Gruppen können anschließend durch Addition von Glycin blockiert und die überschüssigen Peptid- und Glycin-Moleküle durch Dialyse entfernt werden.
Gentechnisch erzeugte Fusionsproteine
Gentechnisch erzeugte Fusionsproteine, konstruiert durch Klonen der Gensequenz von leichten und schweren Ketten von Antikörpern, vereinigt mit Folgen, welche vasoaktive Peptide kodieren, bieten eine attraktive Alternative zur chemischen Verbindung von vasoaktive Peptiden mit MAbs. Diese Konstrukte können maßgeschneidert werden, um weniger immunogenisch zu sein als MAbs von nicht-menschlichen Quellen. Außerdem ermöglichen Fusionsproteine definierte molare Mengen von PEP Monomeren oder alternativ mindestens wenigstens in Tandemanordnung verbundene PEP Sequenzen, um an bestimmten Gebieten des MAbs angelagert zu werden.
Als Beispiel wird mRNA von Hybridom-Zellen isoliert, welches einen monoklonelen Antikörper darstellt. Von diesem mRNA wird cDNA entgegengesetzt transkribiert und durch eine polymerase Kettenreaktion verstärkt. Bestimmte Regionen, welche schwere und leichte Ketten eines Immunglobulins kodieren, z. B. variable und/oder konstante Regionen, können verstärkt werden durch die Auswahl von geeigneten Oligonucleotiden Primern, welche auf die gewünschte Regionen) zielen. Das cDNA wird sequenziert, durch Einschränkung auf Endonucleasen abgebildet, und in einen entsprechenden Übertragungsvektor geklont. Bei einem Minimum sind die Immunglobulin Sequenzen, welche eine Antigen-Bindungsdomäne kodieren, d. h. die variable leichte Kette und die variablen Regionen der schweren Ketten, im Transfervektor enthalten. Zusätzlich kann ein gekürzter oder voller Längenanteil der konstanten Region, welche das ursprüngliche oder ein anderes Immunglobin kodiert, im Zusammenhang mit der variablen Region verbunden werden, um eine Expression der zusammengefügten Regionen zu ermöglichen. Beispielsweise kodiert eine bevorzugte Ausführung der Erfindung ein chimäres MAb, bestehend aus einer murinen variablen Region, welche mit den entsprechenden menschlichen konstanten Regionen der schweren und leichten Ketten verbunden sind.
Eine entsprechende DNA Sequenz, welche mindestens ein vasoaktives Peptid kodiert, ist dann mit einer Region eines Immunglobulin Gens gebunden, welches die Carboxy-Terminus kodiert, vorzugsweise die konstante Region einer schweren Kette. Das beste Gebiet zur Anlagerung für jedes vasoaktive Peptid kann unterschiedlich sein und kann leicht durch experimentelle Methoden ermittelt werden. Zum Beispiel können keine oder verschiedene Längen von Aminosäureverschlüsselungslinkern zwischen dem PEP und der Carboxy-Terminus des Immunglobulin Gens eingefügt werden. Außerdem können zwei oder mehr in Tandemanordnung verbundene PEP Sequenzen zu der (den) entsprechenden Regionen) eines Immunglobulin Gens verbunden werden. Die entstehenden Expressionsprodukte können dann auf biologische Aktivität getestet werden.
Das fertig konstruierte Gen für das Fusionsprotein wird in einen Expressionsvektor eingeführt, welcher in eukaryotische oder prokaryotische Zellen mittels Gentransfektionsverfahren eingeführt wird, z. B. mittels Elektroporation oder das Kalziumphosphat-Verfahren. Das Fusionsproteinprodukt kann dann in großem Maßstab in Zellkulturen exprimiert und gereinigt werden.
Verwendung von vasoaktiven Peptiden
Ein erfolgreiches vasoaktives Immunokonjugat oder Fusionsprotein maximiert die klinische Wirksamkeit von monoklonaler Antikörper-basierter Diagnose und Therapie. Klinisch wird das vasoaktive Immunokonjugat oder Fusionsprotein vor oder mit einem intravenös injizierten immundiagnostischen, chemotherapeutischen oder immuntherapeutischen Wirkstoff verabreicht. Die Induktion einer lokalisierten Permeablilitätsänderung innerhalb der Tumor-Vaskulatur macht den Tumor anfälliger für eine Penetration und wird die Abgabe von Medikamenten, Toxinen, Radioisotopen, monoklonalen Antikörpern oder Konjugaten von monoklonalen Antikörpern mit Medikamenten, Toxinen oder Radioisotopen zum Tumorgebiet verbessern.
Die Eignung der tumorspezifischen Antikörper, Immunokonjugaten und gentechnisch konstruierten Fusionsproteine zur Verwendung in vivo wird von ihrer Biodistribution, der zellularen Lokalisierung, der selektiven Bindung und der Geschwindigkeit der Clearance des Tumorwirts oder eines Tiermodells des Tumorwirts bestimmt. Studien zu Abschätzung dieser Eignung werden einfach mit Hilfe von MAbs ausgeführt. Zum Beispiel kann radioaktive Iodination von Antikörperteilen durch das modifizierte Chloramin T Verfahren nach Beispiel 6 geschafft werden. Ein Tumorwirt wird mit Immunokonjugat, einem Fusionsprotein behandelt oder unbehandelt gelassen. Nach der Injektion eines Tumorwirtes mit dem bezeichneten MAb kann die Wirksamkeit eines vasoaktiven Konjugats oder Fusionsproteins durch entsprechendes Radioabbildung, Biodistribution, histologische Studien und autoradiographische Methoden beurteilen werden.
Die Zeit, welche benötigt wird, um die maximale vasoaktive Wirkung zu produzieren, hängt von dem speziell gewählten Konjugat oder dem Fusionsprotein ab. Jedoch kann ein optimales Intervall zwischen der Zeit der Verabreichung des vasoaktiven Wirkstoffes und des therapeutischen oder diagnostischen Wirkstoffs experimentell bestimmt werden. Zum Beispiel kann die Fähigkeit eines radioaktiv markierten MAbs sich selektiv in einem Tumorgebiet zu konzentrierten, durch Radioabbildung bestimmt werden. Spätere Gammaszintillationsbilder (100.000 cpm) werden von einem anästhesierten Wirt an wechselnden Tagen nach der Injektion von radioaktiv markierten MAb mit Hilfe einer Gammas-Scintillationskamera mit einem Lochkollimator erhalten. Die Kamera wird vorzugsweise an ein Rechnersystem angeschlossen. Ein geeigneter ¹³¹I Standard mit derselben Aktivität gezählt, wird um die Daten zu quantisieren.
Weitere Biodistributions-Studien können mit Hilfe von Tiermodellen ausgeführt werden, worin das Wirtstier zu einem optimalen Zeitpunkt getötet wird, wie durch die oben beschriebenen Bildaufbereitungs-Studien bestimmt. Blut, größere Organe und Tumorgewebe werden dann herausgeschnitten, gewogen und gezählt, um die Biodistribution des MAb zu bestimmen. Außerdem kann Tumorgewebe fixiert und eingebettet werden und Gewebeabschnitte geprüft mithilfe Autoradiographie, um das Gebiet des gebundenen radioaktiv markierten MAbs im Tumor zu bestimmen.
Es wird erwartet, dass die Minimalzeit zwischen der Verabreichung eines vasoaktiven Konjugats oder Fusionsproteins und der Verabreichung eines diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoffes mindestens etwa 20 Minuten beträgt und die Maximalzeit 72 Stunden ist.
Die Dosis eines zu verabreichenden vasoaktiven Immunkonjugats oder Fusionsproteins basiert auf Kriterien von medizinischem Urteil und Erfahrung, sowohl objektiver als auch subjektiver Art. Jedoch ist ein adäquates Maß einer wirksamen Dosis jener Betrag, welcher die klinische Wirksamkeit der Therapie oder die Genauigkeit der Diagnose auf ein statistisch bedeutsames Maß verbessert. Ein Vergleich kann zwischen behandelten und unbehandelten Tumorwirten gemacht werden, denen äquivalente Dosen des diagnostischen therapeutischen Wirkstoffs verabreicht werden. Wo ein diagnostischer oder therapeutischer Wirkstoff für normales Gewebe toxisch ist, müsste ein vasoaktives Konjugat oder Fusionsprotein eine solche toxische Wirkung minimieren.
Ein bevorzugter therapeutischer Wirkstoff ist ein klinisch nützlicher MAb. Außerdem kann ein antineoplastischer therapeutischer Wirkstoff in einen tumoricidaler Wirkstoff eingebracht werden wie z. B. ein Radioisotop, ein chemotherapeutisches Medikament oder ein Toxin.
Ein diagnostischer Wirkstoff kann für die Tumorbildaufbereitung verwendet werden und besteht aus einem MAb, der eine Spezifität für einen Tumor hat, welcher ein Kennzeichen besitzt, welches in vivo detektierbar ist. Vorzugsweise umfasst dieses Kennzeichen ein radioaktives Isotop. Zusätzlich zu dem detektierbaren Kennzeichen kann der Tumorbildaufbereitungswirkstoff auch einem cytotoxischen Wirkstoff wie z. B. einem Radioisotop, Medikament oder Toxin beigefügt sein.
In einer weiteren Version der Erfindung wird das vasoaktive Immunokonjugat oder Fusionsprotein mit einem tumoricidalen Wirkstoff verbunden.
Folglich ist die therapeutische Methode ein vereinfachtes Verfahren, welches daraus besteht, einem tumor-tragenden Wirt eine wirksame Menge eines vasoaktiven Konjugates oder Fusionsproteins zu verabreichen, welches mit einem chemotherapeutischen Wirkstoff, Toxin oder Radioisotop verbunden ist.
Ähnlich kann das vasoaktive Immunokonjugat oder Fusionsprotein direkt mit einem detektierbaren Kennzeichen verbunden, wie einem Radioisotop. Folglich kann die diagnostische Methode einfach das Verabreichen des gekennzeichneten Immunokonjugats an einen tumor-tragenden Wirt umfassen in einer solchen Menge, welche ausreicht, um eine klare Tumorabbildung zu erhalten.
Die bisherigen Versionen der vorliegenden Erfindung haben viele Vorteile, einschließlich der Fähigkeit, welche vaskuläre Permeabilität im Gebiet von neoplastischem oder anderem krankem Gewebe zu erhöhen. Außerdem liefern die bisherigen Versionen der Erfindung starke vasoaktive Wirkstoffe, welche die Aufnahme von therapeutischen und diagnostischen Wirkstoffen in einem Tumorgebiet mit einem Minimum an toxischen Nebenwirkungen auf normale Gewebe verbessern.
Beispiele
Reagenzen
Alle Chemikalien, wie z. B. N-Hydroxysuccinimid (sulfo-NHS), 1-cyclohexy-3-(Morpholinoethyl)Carbodiimid Metho-p-Toluenesulfonat (CDI), und Chloramin T wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Iodo-beads wurden von Pierce (Rockford, IL) bezogen. Alle Lösungsmittel von analytischem Grad wurden so eingesetzt, wie sie geliefert wurden. Iodin-125 wurde als Natrium Iodid in 0.05 N Natrium Hydroxid Lösung von (ICN Biomedicals, Irvine, CA) bezogen. Radioaktive Proben wurden mit einem 1282 Compugamma Zähler (LKB Instruments, Pleasant Hill, CA) oder einem CRC-7 Dosis Calibrator (Capintec Inc., Pittsburgh, PA) gezählt.
Murine monoklonale Antikörper Lym-1 (IgG2a) und TNT-1 (IgG2a) wurden von Techniclone, Corp. (Tustin, CA) bezogen. Lym-1 ist gegen eine Variante von HLA-Dr Antigen gerichtet, exprimiert auf der Zelloberfläche menschlicher B-Lymphozyte und malignanter Lymphome (Epstein, A. L., et al., Cancer Res. 47: 830–840 (1987)), wobei TNT-1 erkennt ein Epitope erkennt, welchesvon Nucleohistone in dem Kern von Säugetierzellen exprimiert wurde. (Epstein, A. L., et al., Cancer Res. 48: 5842–5848 (1988)). Die Protein-Konzentration von Antikörper Präparaten wurde aufgrund von optischer Spektroskopie bei 280 nm abgeschätzt. Rekombinante menschliche IL-2 (rhIL-2) wurden von Hoffman La-Roche (Nutley, NJ) bezogen oder Chiron (Emeryville, CA) bezogen. Menschliches Serum Albumin (HSA) wurden von Sigma Chemical Company bezogen.
Für in vivo Experimente wurden Raji Burkitt's Lymphoma Zelllinien und ME-180 menschliche Gebärmutterhals-Karzinom Zelllinien benutzt, wie vorhergehend beschrieben (Chen, F.-M., et al., J. Nucl. Med. 31: 1059–1066 (1990)). Beide Zelllinien wurden in RPMI-1640 Medium, welches 10% fötales Kälber Serum (Hyclone Laboratories, Logan, UT), Penicillin G (100 U/ml), und Streptomycin Sulfat (100 μg/ml) enthält. Für in vitro Zytotoxizitäts-Studien wurde die K562 menschliche Erythroleukemische Zelllinie, die Daudi Burkitt's Lymphoma Zelllinie, und die Maus P815 Mastocytoma Zelllinie benutzt. Alle diese Zelllinien wurden in einem 37°C gut humidifizierten 5% CO2 Inkubator kultiviert und zweimal wöchentlich routinemäßig bewegt.
Beispiel 1
Synthese von menschlichem IL-2 Peptid Fragmenten
Peptide wurden nach der Merrifield Methode (Merrifield, B., Science 232: 341–347 (1986)) synthetisiert, unter Einsatz eines einsäuligen Synthetisierers (Model 430A, Applied Biosystems, Foster City, CA). Die geschützten Peptide wurden in einer Festkörpersynthese zusammengestellt und durch Trifluoressigsäuren getrennt (Fields, C. G. et al., Peptide Res. 4: 95–101 (1991); King, D. S., et al., Int. J. Peptide Pret. Res. 36: 255–266 (1990)). Die Peptide wurden dann durch Gel Infiltration auf Sephadex G-10 in 30% Essigsäure aufgereinigt und lyophilisiert. Eine Liste der verschiedenen Peptid Fragmente von IL-2 welche durch diese Prozedur erhalten wurde ist in Tabelle 1 aufgeführt (siehe unten).
Beispiel 2
Konjugation von Rekombinantem IL-2 zu Tumorspezifischen monoklonalen Antikörpern
Rekombinantes IL-2 wurde radioaktiv iodiert und in Tracermengen eingesetzt, während aufeinander folgernder Bindungs-Reaktionen, um die Bindung von IL-2 zu Antikörpern oder HSA zu bestimmen. Lyophilisiertes IL-2 wurde in einer genügenden Menge Wasser aufgelöst, um eine finale Konzentration von 2 mg/ml zu erreichen. 50 μl der IL-2 Lösung (100 μg), 100 μCi von trägerfreiem Iodin und 5 μl Chloramin T (10 mg/ml) wurden in Wasser zu 100 μl in 0.1 M Phosphatpuffer, ph 7.4, gegeben und die Reaktion wurde dann 1 Min. bei Raumtemperatur ruhen gelassen.
Die Reaktion wurde mit 100 μl eines Ionen-Austausch Resins (AG1 = X8; Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) in PBS abgeschreckt. Nach 1 Min. wurde die Suspension entnommen und in einer Spin-X Zentrifugen-Einheit (Costar, Cambridge, MA) gegeben und gefiltert, um das Resin zu entziehen.
Die gekoppelte Reaktion wurde durch die Zugabe von 500 μl IL-2 (2 mg/ml) zu 500 μl Antikörper (10 mg/ml), CDI (14 mg) und sulfo-NHS (8 mg) initialisiert. Wodurch sich ein Gesamtvolumen von 1,4 ml in 0,1 M Phospatpuffer, ph 7,4 ergab. Die Reaktion wurde über Nacht bei 4°C inkubiert, nach der Zentrifugation wurden die lösbar angekoppelten Antikörper auf einer Sephadex G-100 Säule kalibriert mit blauem Dextran chromatographiert. Die co-eluierten Radioaktivitäts- und Antikörper-Spitzen zeigten, dass IL-2 an dem Antikörper anhaftet. Von der Antikörperkonzentration und der Radioaktivität zu schließen, wurde ungefähr ein Molekül von IL-2 an je einem Antikörper angebunden. Dieses Immunokonjgat umfasste ein Minimum von 75 Antikörper Bindungsreaktivität, wie durch ein Lebendzell-Bindungsassay determiniert werden konnte. (Epstein et al., (1987); Geifer, S. A., et al., J. Immunoassay 12: 1–4 (1991)).
Beispiel 3
Konjugation von IL-2 Peptid-Fragmenten zu Antikörper und menschlichem Serum Albumin
Teilstücke des IL-2 Peptid-Fragments wurden nach dem Beispiel 1 entsprechend präpariert, radioaktiv iodisiert bevor diese mit Antikörpern oder HSA unter Anwendung eines ein wenig abweichenden Verfahrens konjugiert wurden.
Lyophilisierte Peptid-Fragmente wurden in 10% wässrigem Ethanol mit einer finalen Konzentration von 1 mg/ml gelöst. 100 μl dieser Lösung wurden einer Lösung von 100 μCi von Na¹²⁵I in 0.1 N-NaOH und in einem äquivalenten Volumen von 0.1 M Essigsäure neutralisiert. Die Mischung wurde kräftig durchmischt und zwei Iodo-beads wurden eingebettet. Die Mischung durfte dann für 1 Std. ruhen. Nach der Inkubation wurde die Mischung mit einer Spritze aufgezogen und die Iodo-beads wurden zweimal mit 100% wässrigem Ethanol aufgereinigt. Die kombinierten Substanzen wurden auf einer kurzen Sephadex G-10 Säulen gereinigt. (eluiert mit PBS, pH 7,4).
Die Reinheit der radioaktiv markierten Fragmente wurde durch eine instant Dünnschicht Chromatographie (ITLC) determiniert. Die ITLC Streifen (2 × 20 cm) bestanden aus von Kieselerdegel durchtränkend Fasern (No. 61886, Gelmen Sciences, Ann Arbor, MI), wurden durch das Erhitzen bei 110°C für 15 Min. aktiviert, vor der Benutzung mit 1 μl von der Probe betropft, Luft getrocknet, in zwei Hälften geschnitten und abgezählt, um die gebundenen und ungebundenen Fragmente mittels Radioaktivität zu bestimmen. In diesem System wandern freie Iodine mit dem Lösungsmittel, während markierte Peptide in der Nähe der Ursprungs verbleiben. In allen Fällen, verbanden sich mehr als 90% der Radioaktivität mit den IL-2 Peptid-Fragmenten. Die verschiedenen radioaktiv markierten IL-2 Fragmente wurde in Tracer-Mengen zum Nachverfolgen in der Reaktions-Mischung benutzt, um die Bindung der Peptid Fragmente an Antikörper zu erkennen, wie weiter unten beschreiben wird.
Kopplungs-Reaktionen wurden durch die Hinzufügung von unterschiedlichem Peptid-Fragmenten zu den Antikörpern, HSA, CDI und sulfo-NHS im Gewichtsverhältnis 1 : 2 : 50 : 50 initiiert, um ein Gesamtvolumen von 0,6 ml in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7.4 zu ergeben. Die Reaktionen wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Zentrifugation wurden die löslichen gekoppelten Antikörper chromatographisiert mit einer G-100 Säulen mit blauem Dextrin kalibriert. Von der Antikörperkonzentration und Radioaktivität kann ungefähr darauf geschlossen werden, dass ein Molekül der IL-2 Peptid-Fragmente an jeden Antikörper oder HSA-Molekül gebunden wurde.
Als ein alternatives Verfahren zur Konjugation von Peptid wurde ein Protein Glutaraldehyde als ein Kopplungsreagens benutzt. Nucleophilie-Gruppen, so wie Sulfhydryl und Aminogruppen binden sich kovalent an den Aldehyd an, unter Bildung einer Schiff Basis. 2 mg Protein (10 mg/ml in PBS, pH 8,0) wurden mit 2 bis 3 mg Peptid (5 mg/ml in H₂O) bei Raumtemperatur gemischt.
Das pH wurde durch die Zugabe von minderndem NaOH bei 8.0 gehalten. 100 ml von 0,02%iger frischer Glutaraldehyde-Lösung wurde der Reaktionslösung während der Mischung über 9–10 Minuten zugefügt. Die Mischung wurde über Nacht bei 4°C gelagert. Die übrigen aktiven Glutaraldehyde-Gruppen wurden durch Zusatz von 0.2 M-Glycin gesperrt (0.2 ml) für 2 Std. Die überzähligen Peptid und Glycin-Moleküle wurden durch Dialyse entfernt.
Konjugierte Peptid-Fragmente wurden durch einen schnellen Protein-flüssigkeits-Chromatographen (FPLC) bei Raumtemperatur analysiert, unter Nutzung eines Pharmacia Systems (Pharmacia, Piscataway, NJ) ausgestattet mit zwei P-500 Lösungspumpen, einem MV-8 Motorventilinjektor, einem Einzelweg-UV-Monitor, einem vollautomatisierter Controller LLC-500, und einem RE C-482 Zweistift-Schreiber.
Die Konjugate wurden von einem mit Superose-12 HR 10/30 mit vorgepackten Säule (Pharmacia) elueirt, welche ein 0,1 M PBS, pH 7,2 als ein Lösungsmittelsystem mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1,0 ml/min. aufweist.
Die UV-Absorption des FPLC-Eluats wurde bei 280 nm entdeckt. Die konjugierten Antikörper erschienen nach 650 Sekunden und den freien Fragmente nach 1170 Sekunden. Immunokonjugate hatten ein Minimum von 75% der Antikörperbindemittelreaktionsfähigkeit, wie von einem indirekten Zellbindemittelassay bestimmt. (Epstein-et al., (1987); Gaffar-et al. (1991))
Beispiel 4
Konjugation von PEP Dimer zu Antikörper
Das PEP-Dimer wurde vorbereitet, indem man das monovalente Peptid durch das intrinsische Cystein (Aminosäure #58) verkettet, um eine Disulfid-Bindung, wie graphisch in 2A gezeigt, zu bilden. Die Thiol-Form des PEP regenerierte sich durch Behandlung mit 10 mM-2-Mercaptoethylamine für 30 min., gefolgt von Gel-Filtrierung auf einer Sephadex G-10 Säule, neutralisiert mit 0.1 M-Natriumphosphat, pH 6.8. Das Peptid wurde dann für 16 Std. bei Raumtemperatur bei pH 9 unter Zusatz von 5 M NaOH (2) inkubiert. Der erwünschte Peptid-Dimer wurde durch Gelfiltrierung auf einer Sephadex G-25 Säule von dem Reaktionsgemisch gereinigt, neutralisiert mit Phosphatpuffer, pH 7.4. Erträge von 90% PEP-Dimer wurden unter diesen Umständen ohne die Bildung hoch molekularer Gewichtsspezies gefunden. Das PEP-Dimer wurde unter den oben beschriebenen Zuständen zu Antikörpern gekoppelt, und hatte ungefähr den gleichen Konjugationsertrag wie die anderen Peptide.
Beispiel 5
Konjugation von PEP-Phenylmaleimid-Monomer zu Antikörper
1. Synthese von N-phenylmaleimid
Die Ansatz, N-phenylmaleimide zu synthetisieren, wird in 2B schematisch gezeigt. Maleic-Anhydrid (1.33 g, 13.6 mmol) wurde in Toluen (15 ml) und Anilin (1.3 g, 13.9 mmol) aufgelöst; Toluen (20 ml) wurde tropfenweise über einen 20 Min. Zeitraum hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 45 Min. bei Raumtemperatur umgerührt und dann in einem Eiswasserbad abgekühlt. Das ausgefallene Erzeugnis, N-phenylmaleamic-Säure, wurde zur Filtrierung gesammelt, mit Hexan gewaschen und über Nacht getrocknet (2.1 g Ertrag).
Die Proton (¹H) nuklear Magnetresonanz (NMR) Analyse des Erzeugnisses wurde auf einem Hitachi Perkin-Elmer R-24 60 MHz-Instrument aufgezeichnet. NMR-Probenkonzentrationen waren über 10% (w/v) der angezeigten Lösungsmittel. Chemische Verschiebungen (ppm) zu dem niedrigeren Feld (δ) verhältnismäßig zu dem internen Tetramethylsilan (TMS) wurden gemeldet. Die folgenden Ergebnisse zeigen, dass das Erzeugnis N-phenylmaleamic Säure ergab: ¹H-NMR (Me₂SO-d₆, δ); 10.3 (1H, singlet, OH), 7–7.8 (5H, multiplets, 5 aryl-CH), 6.4 (2H, doublets of doublets, COCH=CHCO).
N-phenylmaleamic-Säure (2.0 g, 10 mmol) wurde hinzugefügt und die Lösung wurde bei 120°C gerührt. Der braune Ausfall wurde gefiltert und zum Trocknen unter reduziertem Druck verdampfte und das Residuum wurde in Diethyl-Äther aufgelöst. Das Äther-Gemisch wurde gefiltert und das Filtrat wurde wieder zum Trocknen verdampft. Das erhaltene Residuum wurde auf einer Blitzchromatographsäule angewandt (30 × 200 mm) bestehend aus Kieselgel 60, 230–400 Maschenweite (Nr. 9385, E. Merck, Darmstadt, Deutschland). Elution mit 500 ml von Ethylessigsäure/Hexan (1 : 3) brachte fünfzig Fraktionen hervor. Fraktionen 25–40 wurden verbunden, um reines N-phenylmaleimid zu erhalten (1.5 g Ertrag): TLC (EtOAc/hexane, 1 : 3) R_f 0.45. ¹NMR (CDCL₃, δ): 7–7.8 (5H, multiplets, 5 aryl-CH); 6.8 (2H, singlet, COCH=CHCO).
Die Erzeugnis Isolation und Identifizierung wurde durch Hochleistungsflüssig-Chromatographie (HPLC) durchgeführt, unter Benutzung eines Beckman-System-Gold-Instruments (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) ausgerüstet mit zwei 110B-Lösungsmittelpumpen, einem 210A Injektorventil, einem 166 programmierbaren Absorbierungs-Sucher, und einem 406 Schnittstellenmodul. Eine Zorbax GF-250 Umgekehrtphasensäule (DuPont, Wilmington, DE) wurde bei einer Durchflußrate von 1 ml/min mit 100% Acetonitril eluiert. Durch Spitzen-Detektion wurde eine UV-Absorbtion bei 254 nm bestimmt. Das Ausgangsmaterial, N-phenylmaleamic-Säure, erschienen nach 220 Sekunden gefolgt von dem erwünschten Erzeugnis nach 340 Sekunden.
2. Reaktion von PEP mit N-phenylmaleimid und Bildung des Immunokonjugats
Die Konjugation von N-Phenylmaleimid zu dem PEP wurde durch Zusatz eines 2.5-fachen molaren Übermaßes von N-Phenylmaleimid (in 15 μl Methanol) mit PEP aufgelöst in 0.1 M-Citrat-Puffer, pH 6.0 vollbracht. Die Reaktion wurde für 30 min bei 37°C fortgeführt. Das Reaktionsgemisch, welches PEP-Phenylmaleimid-Konjugat aufweist, wurde 15 mM-Mercaptoethylamin ausgesetzt, um die Disulfid-Bindung zu reduzieren, welche sich während der Reaktion bilden können und zur Reaktion über Nacht ruhen gelassen. Das finale Reaktionkonjugat wurde auf einer Sephadex-G-10-Säule durch Gelfiltrierung gereinigt, welche mit 0.01 M-PBS, pH 7.2, eluiert wurde. Die Kopplung des PEP-Phenylmaleimid-Monomers zum Antikörper funktioniert genau so, wie mit dem Dimer oben beschrieben und erzeugt ungefähr den gleichen Konjugationsertrag.
Beispiel 6
Vorbereitung und and Analyse von monoklonalen Antikörpern
1. Radioiodination von Antikörpern
F(ab')₂-Fragmente der Lym-1 und TNT-1 monoklonalen Antikörpern wurden mit Iodin-125, unter Einsatz einer veränderte Chloramin-T-Methode radioaktiv markiert. In Kurzfassung wurde die Iodinationsreaktion von Summations-Chloramin T in einem Gewichtsverhältnis von 10 : 1 (Antikörper : Chloramin T) initiiert. Die Reaktion wurde unter Zusatz von Natrium-Metabisulfit gelöscht, und das Gemisch wurde auf einer Sephadex-G-25-Gelsäule chromatographisiert, welche vorher mit PBS neutralisiert wurde, welches 1% Kälber Serum Albumin enthielt (σ). Bruchteile von ¹²⁵I-markierten monoklonalen Antikörpern wurden gesammelt und mit dem gleichen Puffer verdünnt zu einem für eine Injektion geeignetem Volumen.
Radioaktiv markierte Antikörper wurden analysiert unter Einsatz eines analytischen ITLC-System, wie in Beispiel 3 beschrieben. Alle Vorbereitungen enthüllten die gleiche radiochemische Reinheit (98%).
2. Immunoreaktivität von radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpern
Die Immunoreaktivität von radioaktiv markierten Lym-1-Vorbereitungen wurde durch ein Lebendzell-Radioimmunoassay überwacht. Raji-Zellen wurden zweimal in kaltem PBS gewaschen, welches 1 mg/ml Kälber Serum Albumin und 0.02% Natrium-Azid (sodium azide) enthielt. Resuspendierte Zellen (5 × 10⁵) in 100 μl Waschpuffer wurden mit einer Pipette in Mikrotiterwells (Immulon Removawell Strips; Dynatech Labs, Inc., Alexandria, VA) aufgebracht. Die Mikrotiterplatten wurden in der vorhergehenden Nacht mit BSA (10 mg/ml) in PBS mit Azid vorbehandelt, um die Antikörperlösungen davon abzuhalten, sich an die Wells zu binden. Radioaktiv markierte Lym-1 oder Lym-1 Immunokonjugate wurden dann in einem Volumen von 100 μl/Well hinzugefügt (100,000 cpm/Well) und die Platten wurden für 30 min bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln inkubiert. Die Platten wurden dann 4 Mal gewaschen, nachdem mit 1000 UpM für 5 Min. gedreht, und nachdem wurden die Überstände mit einer 12-Spitzen Micromatic-Vielfach-Pipette ansaugt, und dann wurden die Zellen in 200 μl Waschpuffer resuspendiert unter Benutzung einer Titertek Multichannel Pipette (Flow-Labs, McLean, VA). Die Wells wurden dann mechanisch getrennt und in einem Gamma Zähler gezählt, um die Menge von markierten Bindungen an den Zellen zu erfassen.
Ungefähr 80% der radioaktiv markierten Lym-1 F(ab')₂-Vorbereitungen banden Raji-Zellen, wie durch Lebendzell-Radioimmunoassays zu ermitteln war. Das radioaktiv markierte TNT-1 F(ab')₂ hatte eine Immunoreaktivität von 80% in einem Paraformaldehyde-Aceton-behandelten Zellassay, welcher in unserem Labor entwickelt wurde (Gaffar-et-al., (1991)).
Beispiel 7
In Vivo Vasopermeabilitätsstudien
1. Tumor-Modelle und Bioverteilungsstudien
TNT-1 Immunokonjugate wurden im menschlichen Gebärmutterhals-Karzinom-System ME-180 getestet, um das Targeting von TNT-1 Immunokonjugaten an intrazelluläre Antigene, verfügbar in durchlässigen (toten) Tumor-Zellen, zu zeigen. Die menschliche Gebärmutterhals-Zelllinie ME-180 wurde heterotransplantiert in den linken Oberschenkel von 6 Wochen alten weiblichen athymischen Nacktmäusen (Harlan Sprague Dawley, San Diego, CA) durch subkutane Injektion eines 0.2 ml Inokulums, bestehend aus 107 Zellen. Die Tumoren wurden für 3–4 Wochen wachsen gelassen bis sie zu einem Durchmesser von ungefähr 1 cm gewachsen waren.
Lym-1 Immunokonjugate wurden im Raji-Lymphoma-Modell getestet, um das Zelloberfläche-Antigen-Targeting zu zeigen. Die Raji-Lymphoma-Zelllinie wurde genutzt, um Heterotransplantate in 6 Wochen alten Nacktmäusen zu erzeugen durch subkutane Injektion eines 0.2 ml Inokulums, bestehend aus 4 × 107 Raji-Zellen und 4 × 106 menschlichen fötalen Fibroblasten Feeder-Zellen, in den linken Oberschenkel. Zur Sicherstellung einer hohen Angehrate der implantierten Zellen wurden die Mäuse drei Tage vor der Injektion mit 400 Rad bestrahlt, unter Verwendung eines Caesium-Bestrahlers. Die Tumoren wurden 14–18 Tage wachsen gelassen bis sie zu einem Durchmesser von ungefähr 1 cm gewachsen waren.
Um die relativen Wirkungen der Immunokonjugate auf die Bioverteilung und die Tumor-Aufnahme von Lym-1 oder TNT-1 in Tumor-tragenden Mäusen zu testen, wurden separaten Gruppen von 4-5 Mäusen intravenös Injektionen von 30 μg des Antikörpers allein oder des Antikörper-Konjugats verabreicht. 2.5 Stunden nach Injektion erhielt jede Gruppe 50 μCi von ¹²⁵I-markiertem Lym-1 oder TNT-1 F(ab')₂ Fragment als Tracer.
Für die Bioverteilungsanalyse wurden alle Tiere 72 Stunden später durch eine Überdosis Natrium-Pentobarbital getötet. Verschiedene Organe, Blut und Tumor wurden entnommen, gewogen und Proben in einem Gamma-Zähler gezählt. Für jede Maus wurden die Ergebnisse als Tumor: Organ-Verhältnis (cpm pro Gramm Tumor/cpm pro Gramm Organ) und in Prozent injizierter Dosis/Gramm (%ID/g) angegeben. Aus diesen Ergebnissen wurde für jede Gruppe der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet.
2. Identifizierung von vasoaktiven IL-2 Peptid-Fagmenten
Basierend auf den Primär-. Sekundär- und Tertiärstrukturen von IL-2 wurde eine Reihe distinkter Peptide synthetisiert, um die Sequenzen zu identifizieren, die verantwortlich für erhöhte vaskuläre Permeabilität sind. Die Peptide und ihre Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet. Jedes Peptid und rhIL-2, sowie ihre entsprechenden Immunokonjugate mit MAb Lym-1, wurden auf ihre Fähigkeit geprüft, vaskuläre Permeabilität des Tumors und eine erhöhte Antikörper-Aufnahme in Raji Tumor-tragenden Nacktmäusen zu induzieren.
Tafel 1 Vasopermeabilitätsaktivität von Interleukin-2 synthetischen Peptid Fragmenten und Immunokonjugaten
Kontrollstudien nutzten intakte IL-2 und das Lym-1/IL-2 Immunokonjugat, um merklich erhöhte Level der Lym-1 Aufnahme in Raji Tumor-tragenden Nacktmäuse zum Vergleich zu ermitteln. Wie früher beobachtet (LeBerthon et al. (1991)), kann erhöhte Permeabilität trotz der Tatsache erreicht werden, dass chemisch konjugiertes MAb/IL-2 keine Zytokin-Aktivität zeigt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, produzierte ein Vasokonjugat, abgeleitet von einem synthetischen Peptid, designiertes 3C, ungefähr 100% der Vasopermeabilitäts-Wirkungen des chemischen Lym-1/IL-2 Konjugats. Drei andere Vasokonjugate, bestehend aus den synthetischen Peptiden 3B, B1 und A3, die kleinere Fragmente von 3C enthielten, erzeugten in diesen Assays ungefähr die Hälfte der Vasopermeabilitäts-Wirkungen von Lym-1/IL-2.
Wie erwartet hatte die intravenöse Verabreichung der ungeschützten und kurzlebigen unkonjugierten synthetischen Fragmente selbst keine Wirkungen auf die Lym-1 Aufnahme in Tumor-tragenden Nacktmäusen. Daher ist die Konjugation von Peptiden an ein anderes Makromolekül, wie zum Beispiel an einen Antikörper, erforderlich, um die biologische Aktivität der synthetischen Peptide zu zeigen. Im Vergleich dazu hatte natives IL-2 im in vivo-Model eine Vasopermeabilität von 75%.
Nach den Ergebnissen, die in Tabelle 1 dargestellt sind, scheint es, dass die gesamte Sequenz der Aminosäuren 22–58 der SEQ ID NO: 3 optimale Vasopermeabilität erzeugt. Allerdings behalten Konjugate, bestehend aus den Aminosäuren 37–58, 33–58 und 37–72 der SEQ ID NO: 3 50% der Aktivität zurück, wohingegen Fragment E6, bestehend aus den Aminosäuren 22–38 der SEQ ID NO: 3, keine Aktivität hat.
3. In vivo Analyse der PEP Immunokonjugate
MAb alleine, MAb/IL-2 oder MAb/PEP Immunokonjugate wurden genutzt, um Tumor-tragende Nacktmäuse in zwei Tumor-Modellen vorzubehandeln, um die erhöhte Aufnahme des Tumors von radioaktiv markiertem MAb 2.5 Stunden nach der Vorbehandlung zu zeigen. TNT-1 Immunokonjugate wurden im menschlichen ME-180 Gebärmutterhals-Karzinom-System genutzt, um das Targeting an intrazelluläre Antigene, verfügbar in durchlässigen (toten) Tumor-Zellen, zu zeigen. In Komplementärstudien wurden Lym-1 Immunokonjugate im Raji Lymphoma-Model genutzt, um das Zelloberfläche-Antigene-Targeting zu zeigen.
Wie in 3A gezeigt, ergab die TNT-1 Vorbehandlung 1.28% der injizierten Dosis im Tumor und TNT-1/IL-2 und TNT-1/PEP Vorbehandlungen führten zu 4.5 bzw. 4.4 Prozent injezierter Dosis/Gramm. Gleichermaßen eindrucksvoll führte die Vorbehandlung allein mit Lym-1 zu lediglich 1.4% der injizierten Dosis von radioaktiv markiertem Lym-1, im Tumor angesammelt, während Lym-1/IL-2 und Lym-1/PEP 5.7 bzw. 5.6 Prozent der injizierten Dosis/Gramm ergaben (4A). Bei beiden Systemen gab es einen annähernd vierfachen Anstieg der radioaktiv markierten Antikörper innerhalb des Tumors.
Zusätzlich zu diesen Ergebnissen erhöhte die Nutzung von IL-2 oder PEP Immunokonjugaten das spezifische Targeting radioaktiv markierter Antikörper, wie durch die höheren Tumor/Organ-Verhältnisse gezeigt (4A und 4B).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PEP äquivalent zu rhIL-2 ist nach Konjugation zu zwei unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern zur Erhöhung der Antikörper-Aufnahme im Tumor. Im Gegensatz zu IL-2 allerdings zeigte unkonjugiertes PEP, welches ein molekulares Gewicht von 3700 Daltons hat, keine Vasopermeabilitäts-Aktivität nach intravenöser Verabreichung in die Maus (Tabelle 1), vermutlich wegen seiner schnellen Degradation und dem Clearance vom Blutkreislauf.
4. In vivo Bewertung vom PEP Monomer und von Dimer Immunokonjugaten
Das Vorhandensein des terminalen Cystein (Aminosäure #58) deutet an, dass sich die Dimerisierung des synthetischen Peptids während der Konjugations-Vorgänge ereignen könnte. Um abzuschätzen, ob die Dimerisierung die Vasopermeabilitäts-Wirkungen von PEP beeinflusste, wurden Monomer- und Dimer-Formen von PEP vor Konjugation erzeugt, wie in Example 5 beschrieben und in 2 zusammengefasst. Vasokonjugate, die mit diesen chemisch erzeugten Fragmenten konstruiert wurden, wurden deswegen nur aus Monomer- oder Dimer-Formen von PEP zu Vergleichszwecken zusammengesetzt.
Genutzt als Vorbehandlung in Tumor-tragenden Nacktmäusen, zeigten Bioverteilungsanalysen, dass das Vasokonjugat, bestehend aus dem Dimer, eine annähernd zweifache Erhöhung der Antikörper-Aufnahme in den Tumor hatte im Vergleich zu dem Vasokonjugat, dass mit dem PEP Monomer konstruiert wurde (4). Zusätzlich ergab das Vasokonjugat, das mit dem PEP Dimer konstruiert wurde annähernd dieselbe Erhöhung bei der Antikörper-Aufnahme wie das MAb/IL-2 Konjugat, was darauf hindeutet, dass die Dimerisierung wichtig für die Generierung der optimalen Vasopermeabilität auf der Tumorseite in diesem Modell-System war.
Beispiel 8
Zytokin-Studien
1. IL-2 Bioassays (Proliferations-Assay)
Das Wachstum einer unabhängigen IL-2 Indikator-Zelllinie, CTLL-2, wurde genutzt, um die biologische Aktivität von PEP, PEP Konjugaten und positiver menschlicher rekombinanter Kontroll-IL-2 zu vergleichen. Proben von PEP, PEP Konjugaten oder IL-2 Standards (100 μl/Well) wurden der Reihe nach dreifach verdünnt von einer anfänglichen Konzentration von 8.1 pM (rekombinantes IL-2) in sterilen 96-Well Flachboden-Mikrotiterplatten. CTLL Zellen (4 × 105) mit einem Volumen von 50 μl wurden jedem Well hinzugefügt. Platten wurden für 18 Stunden in 5% CO2 bei 37°C inkubiert, dann mit 0.5 μCi von 3H-Thymidin für 6 Stunden gepulst (25 μl von einer 1 : 50 Verdünnung von 1.0 mCi im Medium; Amersham, Arlington Hts. IL), vor Ernte der Wells auf einem Glasfaser-Filterpapier und Flüssig-Szinitillationszählung in Glas-Minivials. Während rekombinantes IL-2 hoch aktiv als eine Positiv-Kontrolle war, kam keine der PEP-enthaltenen Präparationen zur Unterstützung der Proliferation der T-Zelllinie in Frage.
2. Zytotoxizitäts-Experimente
Die Fähigkeit von PEP und PEP Konjugaten, LAK Zelltötung zu induzieren, wurde durch 51Cr-Release-Mikrotoxizitäts-Assays in 96-Well Mikrotiterplatten getestet, wie früher beschrieben (Katsanis, E., et al., Blood 78: 1286–1291 (1991). Es wurden zwei Populationen Effektorzellen genutzt, menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) oder murine Splenozyten. Die Effektorzellen wurden isoliert durch Ficoll Dichtegradientenzentrifugation und für 4 Tage in vitro in Medien inkubiert, die 13.7 pM oder 80 pM PEP oder 13.7 pM Antikörper/PEP oder HSA/PEP Konjugate bei einer Dichte von 0.5 × 106 Zellen/ml enthielten. Frisch isolierte Effektoren in Medien ohne menschliches rekombinantes IL-2 wurden als Kontrollen benutzt. Menschliche Zellen wurden in RPMI-1640 mit 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10% fötalem Kälber-Serum kultiviert. Murine Zellen wurden in demselben Kulturmedium wie oben angezogen, aber ergänzt mit 10 mM nicht-essentieller Aminosäuren, 100 mM Natrium-Pyruvat und 25 mM 2-Mercaptoethanol (Sigma).
Drei verschiedene Tumor-Target-Zelllinien wurden getestet. PBMC Effektoren wurden gegen zwei maligne Tumor-Target-Zelllinien getestet, K562 (NK sensitiv) und Daudi (NK resistent). Zur Abschätzung des Tötungs-Potenzials der T-Zellen wurden aktivierte murine Splenozyten gegen die P815 Mastozytom-Zelllinie getestet in einem Tumor-gerichteten Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-Assay (reverse ADCC)(Anderson, P. M., et al., J. Immunol. 142: 1383–1394 (1989)). Hinzufügen von 10 ng/ml von 145-2C11 anti-murinem CD3 Antikörper (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) zu den Platten, die die Fc Rezeptor-positiven P815 Zelllinien enthalten, führt zu einem merklich vermehrten Töten durch aktivierte T-Zellen.
Zytotoxizitäts-Assays nutzten 500 51Cr-markierte Tumor-Targets pro Well in V-Boden-Mikrotiterplatten und Effektor : Target-Verhältnisse von 30 : 1, 10 : 1 und 3.3 : 1, erreicht durch dreifache fortlaufende Verdünnung der ersten Reihe vor dem Hinzufügen radiaoktiv markierter Targets. Die Platten wurden 5 min bei 500 rpm zentrifugiert, um den Zell-Kontakt sicherzustellen, 4 Stunden bei 37°C inkubiert und dann noch einmal bei 1,000 rpm zentrifugiert. Einhundert Mikroliter des Überstands wurden in Glas-Szintillations-Vials geerntet vor der Flüssig-Szintillationszählung.
Keine der PEP oder PEP Konjugat-Präparationen induzierte LAK Zelltötung der Target-Zelllinien in keinem der oben beschriebenen Zytotoxizitäts-Assays. Im Vergleich war rekombinantes menschliches IL-2, welches als eine Positiv-Kontrolle diente, hoch aktiv.
Beispiel 9
Rekombinant entwickelte vasoaktive Immunokonjugate
Konstruktion eines PEP/MAb-Fusionsproteinexpressionsvectors kann unter Einsatz eines standardmäßigen molekularen Klonverfahren durchgeführt werden. Ein Transfervektor für einen Mensch/Maus-chimärischen monoklonalen Antikörper kann als einen Elternvektor errichtet und benutzt werden. Der Transfervektor wird cDNA-Sequenzen für eine chimärische Mensch/Maus schwere Verkettung unter der Kontrolle eines ersten Promoters und einer chimärischen Mensch/Maus leichten Verkettung unter der Kontrolle eines zweiten Promoters tragen. Ein Beispiel solch eines Transfervektors ist der Baculovirus-Vektor, pBVchLYM-1, von Hu et al. (Hum. Antibod. Hybridomas 6(1): 57–67 (1995), mit dieser Schrift durch eine Referenz verbunden.
Die Nukleotidfolge, welche das PEP codiert, wie z. B. eine cDNA ist im Wesentlichen homolog nach SEQ-ID NO: 2, und wird in einer entsprechenden Restriktions-Enzymgegend nahe dem Ende 3' des schweren Ketten-Gens eingefügt werden. Der resultierende Expressionsvektor wird eine chimärische Leichtkette codieren und auch ein Fusionsprotein, welches aus der chimärischen Schwerkette mit PEP bestand, und welches an dem Carboxy-Terminus befestigt ist. Der Expressionsvektor wird in einer geeigneten Zelllinie transfeziert sein und die Leicht-Kette und das Schwer-Kettenfusionsprotein werden in Zellkulturen co-expremiert sein. Die schweren und leichten Ketten des chimärischen-PEP/MAb-Fusionsprotein werden sich innerhalb der transfezierten Zellen selbstständig versammeln und können anschließend von der Zellkultur durch eine Protein A Affinitäts Chromatographie gereinigt werden.
Beispiel 10
Klinische Verwendung und Anwendung
PEP-Immunokonjugate oder Fusionsproteine können benutzt werden um die Verabreichung von therapeutisch oder Tumorabbildungswirkstoffen zu verbessern. Der Wirkungsmechanismus der PEP enthaltenden Moleküle ist die Vergrößerung der vaskulären Permeabilität in der Tumorgegend. Im tierischen Modell, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, verbesserte die Verabreichung von PEP-Immunokonjugaten 2.5 Stunden vor der Verabreichung von radio iodisierten MABs eine merklich verbesserte Aufnahme des radioaktiven Tracers in Tumoren. Dementsprechend wird das PEP-Immunokonjugat oder Fusionsprotein im Allgemeinen dem Tumorwirt 1–3 Stunden vor der nachfolgenden Dosis von therapeutisch oder Tumorabbildungs-Wirkstoffen eingegeben.
Obwohl die gegenwärtige Erfindung in vielen Details mit Referenz auf gewisse bevorzugte Ausführungen beschrieben worden ist, sind andere Ausführungen möglich. Zum Beispiel kann das PEP mit einem Verabreichungsträger vereinigt werden, welcher einen Giftstoff einschließt. Deswegen sollte der Geist und Anwendungsbereich der angehangenen Ansprüche sich nicht auf die Beschreibung der bevorzugten hierin enthaltenen Ausführungen beschränkt werden.
SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Ein isoliertes und aufgereinigtes vasoaktives Peptid, das Peptid umfasst ein Fragment von Interleukin-2, welches Aminosäuren 37 bis 58 von SEQ ID NO: 3 enthält, worin das Fragment und das Peptid im wesentlichen frei von Zytokin-Aktivität ist und die vaskuläre Permeabilität erhöht, wenn es am Zielort lokalisiert ist.
Dimer des vasoaktiven Peptids nach Patentanspruch 1.
Vasoaktive Peptid nach Patentanspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid aus einem Teil von SEQ ID NO: 3 von den Aminosäureresten 22 bis 72, die die Aminosäurereste 37 bis 58 von SEQ ID NO: 3 enthalten, und aus dem Teil aus 22 bis 51 Aminosäuren in der Länge besteht.
Peptid nach Patentanspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil von SEQ ID NO: 3 ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus a) Aminosäureresten 37 bis 58: b) Aminosäureresten 33 bis 58; c) Aminosäureresten 22–58; und d) Aminosäureresten 37 bis 72.
Peptid nach Patentanspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es aus den Resten 37 bis 58 der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 besteht.
Peptid nach Patentanspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 besteht.
Dimer nach Patentanspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass jedes Peptid wenigstens ein Cystein-Rest einschließt, die Cystein-Reste, die das Dimer durch eine Disulfid-Brücke bilden.
Konjugat dadurch gekennzeichnet, dass a) ein Transportvehikel, das am Ort des neoplastischen Gewebes lokalisiert; und b) das vasoaktive Peptid nach Patentanspruch 1, wobei das Peptid mit dem besagten Transportvehikel verbunden ist.
Konjugat nach Patentanspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass das Transportvehikel ein Tumor-spezifischer monoklonaler Antikörper ist.
Konjugat nach Patentanspruch 9 dadurch gekennzeichnet, dass der monoklonale Antikörper aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem murinen, einem humanen und einer Chimäre aus humanen und murinen Antikörpern besteht.
Konjugat nach Patentanspruch 9 dadurch gekennzeichnet, dass der monoklonale Antikörper ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Lym-1, Lym-2, TNT-1, TNT-2 oder TV-1 besteht.
Konjugat nach Patentanspruch 9 dadurch gekennzeichnet, dass es ferner einen antineoplastischen Wirkstoff umfasst, der an das Transportvehikel gebunden ist.
Konjugat nach Patentanspruch 12 dadurch gekennzeichnet, dass der besagte antineoplastische Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Arzneimitteln, Toxinen oder Radioisotopen besteht.
Fusionsprotein dadurch gekennzeichnet, dass a) ein Transportvehikel, das am Ort des neoplastischen Gewebes lokalisiert, das Vehikel, welches wenigstens eine terminale Aminosäure hat; und b) wenigstens ein vasoaktives Peptid gemäß Patentanspruch 1, das Peptid, das wenigstens mit einer terminalen Aminosäure des Transportvehikels verbunden ist.
Fusionsprotein nach Patentanspruch 14 dadurch gekennzeichnet, dass es ferner einen Aminosäure-Linker enthält, der mit dem Transportvehikel und dem vasoaktiven Peptid verbunden ist.
Fusionsprotein nach Patentanspruch 14 dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine vasoaktive Peptid zwei hintereinander verbundene vasoaktive Peptide umfasst.
Fusionsprotein nach Patentanspruch 16 dadurch gekennzeichnet, dass es ferner einen Aminosäure-Spacer enthält zwischen den beiden hintereinander verbundenen vasoaktiven Peptiden.
Fusionsprotein nach Patentanspruch 14 dadurch gekennzeichnet, dass das Transportvehikel wenigstens eine Antigen-Bindungsdomäne eines Immunglobulins umfasst.
Fusionsprotein nach Patentanspruch 14 dadurch gekennzeichnet, dass das Transportvehikel einen Mensch-Maus chimären monoklonalen Antikörper umfasst.
Ein Vektor für die Expression des Fusionsproteins, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Fusionsprotein-Sequenz, die dadurch ist gekennzeichnet, dass 1) eine Transportvehikel kodierende Sequenz, das Transportvehikel, das die Fähigkeit hat, am Ort des neoplastischen Gewebes zu lokalisieren und 2) eine vasoaktive Peptid-kodierende Sequenz, die DNA dadurch gekennzeichnet, dass, die für das vasoaktive Peptid nach Patentanspruch 1 kodiert, die Peptid kodierende Sequenz, die einen Leserahmen hat, der an den Leserahmen der der Transportvehikel- kodierenden Sequenz angepasst ist; und b) ein Expressionsvektor, der wenigstens eine Sequenz hat, die die Expression des Fusionsproteins in den Zellen regelt.
Zelllinie zur Expression des Fusionsproteins, gekennzeichnet durch: a) dem Expressionsvektor nach Patentanspruch 20; und b) eukaryotischen Zellen, die den Expressionsvektor und das Fusionsprotein beherbergen.
Nutzung des vasoaktiven Peptids zur Herstellung eines Medikaments für die Nutzung innerhalb einer Methode zur Behandlung von neoplastischem Gewebe in einem Tumor-tragenden Wirt, besagte Methode, die dadurch gekennzeichnet, dass: a) Verabreichung einer effektiven Menge des Konjugats an einen Wirt, der das Gewebe hat, das Konjugat dadurch gekennzeichnet, dass: 1) ein Transportvehikel, dass am Ort des neoplastischen Gewebes lokalisiert; und 2) das vasoaktive Peptid nach Patentanspruch 1, das Peptid verbunden mit besagtem Transportvehikel; und b) gleichzeitige oder anschließende Verabreichung eines antineoplastischen therapeutischen Mittels an den genannten Wirt.
Methode nach Patentanspruch 22 dadurch gekennzeichnet, dass das antineoplastische Mittel ein immunologisches Mittel ist.
Methode nach Patentanspruch 22 dadurch gekennzeichnet, dass das besagte antineoplastische Mittel aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus chemotherapeutischen Arzneimitteln, Toxinen und Radionukleotiden besteht.
Nutzung eines vasoaktiven Peptids zur Herstellung eines Medikaments für die Nutzung innerhalb einer Methode zur Behandlung neoplastischer Gewebe in einem Tumor-tragenden Wirt, besagte Methode dadurch gekennzeichnet, dass Verabreichen einer effektiven Menge des Konjugats an einen Wirt, der genanntes Gewebe hat, das Konjugat dadurch gekennzeichnet, dass: a) ein Transportvehikel, dass am Ort des neoplastischen Gewebes lokalisiert; b) das vasoaktive Peptid nach Patentanspruch 1, das Peptid, dass mit an das Transportvehikel verbunden ist; und c) ein tumorizides Mittel.
Nutzung des vasoaktiven Peptids zur Herstellung eines diagnostischen Mittels für die Nutzung innerhalb einer Methode zur Diagnose von neoplastischem Gewebe, besagte Methode dadurch gekennzeichnet, dass: a) Verabreichung einer effektiven Menge des Konjugats an einen Wirt, der genanntes Gewebe hat, das Konjugat dadurch gekennzeichnet, dass: 1) ein Transportvehikel, dass am Ort des neoplastischen Gewebes lokalisiert, und 2) das vasoaktive Peptid nach Patentanspruch 1, das Peptid, das verbunden ist mit dem genannten Transportvehikel; und b) gleichzeitige oder anschließende Verabreichung eines Tumor-darstellenden Mittels an den genannten Wirt.
Nutzung des vasoaktiven Peptids zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Nutzung innerhalb einer Methode zur Diagnose von neoplastischem Gewebe, diese Methode dadurch gekennzeichnet, dass das Verabreichen einer effektiven Menge des Konjugats an einen Wirt, der das genannte Gewebe hat, das Konjugat dadurch gekennzeichnet, dass: a) ein Transportvehikel, das am Ort des neoplastische Gewebes lokalisiert b) das vasoaktive Peptid nach Patentanspruch 1, das Peptid, das verbunden ist mit dem Transportvehikel; und c) einem nachweisbaren Label.
Therapeutischer Satz, gekennzeichnet durch: a) einem Konjugat, das Konjugat dadurch gekennzeichnet, dass: 1) ein Transportvehikel, das am Ort des neoplastischen Gewebes lokalisiert, und 2) das vasoaktive Peptid nach Patentanspruch 1, das Peptid, das verbunden ist mit dem genannten Transportvehikel; und b) einem antineoplastischen therapeutischen Mittel.
Diagnostischer Satz, gekennzeichnet durch: a) einem Konjugat, das Konjugat gekennzeichnet durch: 1) einem Transportvehikel, das am Ort des neoplastischen Gewebes lokalisiert, und 2) das vasoaktive Peptid nach Patentanspruch 1, das Peptid, das verbunden ist mit dem genannten Transportvehikel; und b) ein Tumor-darstellendes Mittel.