DE60038551T2 - Peptidepitope die von krankheitsfördernden cd4+ t lymphocyten erkannt werden - Google Patents

Peptidepitope die von krankheitsfördernden cd4+ t lymphocyten erkannt werden Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet von Erkrankungen mit immunologischer Ätiologie, insbesondere Krankheiten, an denen CD4+ T-Lymphozyten beteiligt sind.
  • Nach der Internalisierung und proteolytischen Prozessierung von intakten Proteinantigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) binden Klasse-II-Haupthistopatibilitätskomplex(MHC-)-Moleküle auf den APCs kurze antigene Peptide (Epitope), die von den Antigenen abgeleitet sind, wobei sie die gebundenen Peptide CD4+ T-Lymphozyten präsentieren [Germain, R. N. (1994), Cell 76: 287–299]. Klasse-II-MHC-Gene und die von ihnen kodierten Moleküle sind zwischen Individuen in hohem Maße variabel, und Unterschiede zwischen den Klasse-II-MHC-Molekülen haben eine tiefgreifende Wirkung darauf, welche Peptide für die Präsentation als T-Zellepitope selektiert werden. Die verschiedenen Formen (Allele) von Klasse-II-MHC-Molekülen, die von einem Individuum exprimiert werden, üben eine bedeutende Wirkung aus hinsichtlich der Anfälligkeit des Individuums gegenüber einer Reihe von Erkrankungen, die durch CD4+ T-Zellen vermittelt werden, darunter vor allem Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM) [Davies et al., (1994), Nature 371: 130–136]. Es ist wichtig, dass die CD4+ T-Zellen, welche diese Erkrankungen vermitteln, definiert werden müssen, um wirksame therapeutische und/oder prophylaktische Produkte und Protokolle zu entwickeln.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Durch die Erfindung werden Verfahren zur Identifizierung von Peptidepitopen bereitgestellt, welche Antworten von CD4+ T-Lymphozyten aktivieren, die an der Initiierung, Förderung, oder Verschlimmerung bestimmter Erkrankungen beteiligt sind, insbesondere solcher Erkrankungen, bei denen die Anfälligkeit durch die Expression definierter Klasse-II-MHC-Moleküle bestimmt wird. Die Verfahren basieren auf der Erkenntnis, dass das künstliche Binden eines Polypeptidmoleküls an die Zellmembran einer APC den Transport des Moleküls zu den Antigen prozessierenden Organellen der APC erleichtert. Die Erfindung umfasst Peptide, die über ein solches Verfahren vom Diabetes-Autoantigen, IA-2, abgeleitet sind. Es werden hier veränderte Peptidliganden (APL) beschrieben, die variante Peptide darstellen, in denen 1 bis 6 Aminosäurereste sich von den entsprechenden Resten des Wildtyp-Peptids unterscheiden, die jedoch noch an die gleichen Klasse-II-MHC-Peptide wie die Wildtyp-Peptide binden, ebenso wie Verfahren zur Therapie und Prophylaxe, welche die Verwendung von APL beinhalten. APL sind dazu in der Lage, Muster der Zytokin-Produktion in den CD4 T-Zellen auszulösen, die sich von den Mustern unterscheiden, die durch die Wildtyp-Peptide ausgelöst werden, von denen sie abgeleitet sind. Während somit beispielsweise ein Wildtyp-Peptid die Produktion von Th1-Zytokinen induzieren kann, kann ein davon abgeleiteter APL Th2-Zytokine hervorrufen. Alternativ mag das Wildtyp-Peptid die Produktion von Th2-Zytokinen stimulieren und ein entsprechender APL die Produktion von Th1-Zytokinen auslösen.
  • Die Erfindung umfasst insbesondere ein in vitro-Verfahren zur Identifizierung eines Klasse-II-MHC-Bindungsfragments eines Polypeptids, wobei man bei diesem Verfahren: (a) einen Liganden, konjugiert mit einem ersten Biotinmolekül bereitstellt; (b) das mit einem zweiten Biotinmolekül konjugierte Polypeptid bereitstellt; (c) eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) eines Säugers bereitstellt, die ein Klasse-II-MHC-Molekül und einen Zelloberflächenrezeptor, der den Liganden bindet, exprimiert; (d) die APC mit dem Biotin-konjugierten Liganden aus (a), dem Biotin-konjugierten Polypeptid aus (b) und Avidin in Kontakt bringt, um einen Komplex zu bilden, der an den Zelloberflächenrezeptor bindet; (e) die APC unter Bedingungen hält, welche die Internalisierung des Komplexes durch die APC erlauben; (f) aus der APC ein Klasse-II-MHC-Molekül, gebunden an ein Peptid isoliert; und (g) das Peptid von dem Klasse-II-MHC-Molekül eluiert, wobei das Peptid ein Klasse-II-MHC-Bindungsfragment des Polypeptids ist. Das Verfahren kann weiterhin den Schritt der Identifizierung der Aminosäuresequenz des Peptids umfassen. Das Verfahren kann angewendet werden für die Identifizierung eines Peptids, dessen Präsentation durch ein Klasse-II-MHC-Molekül auf einer APC eines Säugers entweder mit der Pathologie einer Säuger-Erkrankung oder mit dem Schutz vor einer Säuger-Erkrankung assoziiert ist. Geeignete Erkrankungen umfassen Autoimmunerkrankungen (z. B. insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM), Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Myasthenia gravis, systemischen Lupus erythematosus, autoimmun induzierte vorzeitige Ovarialinsuffizienz, Graves-Thyroiditis, Hashimoto-Thyroiditis, primären Hypothyroidismus, Zöliakie, primäre Gallenzirrhose, Autoimmun-Hepatitis, Addison-Erkrankung, Vitiligo, systemische Sklerose oder antiglomeruläre Basalmembran-Erkrankung), infektiöse Erkrankungen (z. B. eine bakterielle Erkrankung wie beispielsweise Lepra, eine virale Erkrankung oder eine parasitäre Erkrankung), oder Krebs. Wenn die Autoimmunerkrankung IDDM ist, kann das Polypeptid Preproinsulin, Proinsulin, Insulin, Glutaminsäuredecarboxylase (GAD65), IA-2-Tyrosinphosphatase (IA-2) oder Phogrin (IA-2β) sein. Die bei dem Verfahren verwendete APC kann eine dendritische Zelle, ein Makrophage, ein Monocyt oder ein B-Lymphozyt sein. Der verwendete Ligand kann ein Lectinmolekül (z. B. das Pokeweed-Mitogen aus Phytolacca americana) sein, das an einen Zelloberfächenrezeptor (z. B. ein Oberflächen-Immunglobulinmolekül) auf einer APC bindet. Der Zelloberflächenrezeptor, der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Ziel darstellt, kann ein Zelloberflächenmolekül sein (z. B. ein Immunglobulinmolekül), das von der APC internalisiert werden kann, und der Ligand kann ein Antikörpermolekül sein, das an das Zelloberflächenmolekül bindet. Der Säuger, von dem die APC stammt, kann ein Mensch sein, und das Klasse-II-MHC-Molekül kann ein DR-Molekül mit einer β-Kette sein, die von einem DRB1·0401-, einem DRB1·0405- oder einem DRB1·0101-Gen kodiert wird. Alternativ kann das Klasse-II-MHC-Molekül ein DQ-Molekül mit einer α-Kette sein, die von einem DQA1·0501- oder einem DQA1·0301-Gen kodiert wird, und einer β-Kette, die von einem DQB1·0302-, einem DQB1·0201- oder einem DQB1·0501-Gen kodiert wird.
  • Das beschriebene Verfahren kann zusätzliche Schritte umfassen, wobei man (h) CD4-Lymphozyten aus einem Individuum bereitstellt, von dem man vermutet, dass es für einen Zustand suszeptibel ist, der mit der Präsentation des Peptids durch das Klasse-II-MHC-Molekül assoziiert ist, worin die APCs des Individuums das Klasse-II-MHC-Molekül tragen; (i) eine Population von APCs bereitstellt, welche das Klasse-II-MHC-Molekül mit dem daran gebundenen Peptid tragen; (j) die Population von APCs aus (i) mit den CD4-Lymphozyten aus (h) in Kontakt bringt; und (k) bestimmt, ob die CD4-Lymphozyten das Klasse-II-MHC-gebundene Peptid erkennen. Die Präsentation des Peptids kann entweder in einer pathologischen Antwort von CD4+ T-Lymphozyten oder in einer protektiven Antwort von CD4+ T-Lymphozyten resultieren.
  • Die Erfindung umfasst weiterhin ein isoliertes Peptid mit einer Länge von weniger als 26 Aminosäureresten, umfassend eine Sequenz VSSQFSDAAQASP (SEQ ID NO: 47), z. B. VSSQFSDAAQASPSS (SEQ ID NO: 1); SVSSQFSDAAQASPS (SEQ ID NO: 2); SSVSSQFSDAAQASP (SEQ ID NO: 3); SVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 4); SRVSSVSSQFSDAAQASPSSHSST (SEQ ID NO: 5); SVSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWC (SEQ ID NO: 6); VSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWCE (SEQ ID NO: 7) oder VSSVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 8). Weiterhin offenbart werden isolierte Peptide mit einer Länge von weniger als 26 Aminosäureresten, umfassend eine Sequenz TQETRTL (SEQ ID NO: 48), z. B. TQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 9); YLKNVQTQETRTL (SEQ ID NO: 10); VQTQETRTLTQFHT (SEQ ID NO: 11); LKNVQTQETRTLTQF (SEQ ID NO: 12); YLKNVQTQETRTLTQ (SEQ ID NO: 13); KNVQTQETRTLTQFH (SEQ ID NO: 14); SFYLKNVQTQETRTLTQFH (SEQ ID NO: 15); oder FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 16). Weiterhin offenbart wird ein isoliertes Peptid mit einer Länge von weniger als 26 Aminosäureresten, umfassend eine Sequenz AYQAEPNT (SEQ ID NO: 49), eine Sequenz CTVIVMLT (SEQ ID NO: 51), FEFALTAVAEE (SEQ ID NO: 50), oder eine Sequenz KVESSPSRSDY (SEQ ID NO: 52). Beispiele für solche Peptide sind AYQAEPNTCATAQ (SEQ ID NO: 17); LCAYQAEPNTCATAQC (SEQ ID NO 18); LAKEWQALCAYQAEPNT (SEQ ID NO: 19); AYQAEPNTCATAQGEGNIK (SEQ ID NO: 20); WQALCAYQAEPNTCATAQ (SEQ ID NO: 21); LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (SEQ ID NO: 22); DQFEFALTAVAEE (SEQ ID NO: 33); DQFEFALTAVAEEVNAI (SEQ ID NO: 34); FEFALTAVAEEVNAILKA (SEQ ID NO: 35); SKDQFEFALTAVAEEVNA (SEQ ID NO: 36); SKDQFEFALTAVAEEVNAILK (SEQ ID NO: 37); GCTVIVMLTPLVED (SEQ ID NO: 23); CTVIVMLTPLVEDG (SEQ ID NO: 24); ESGCTVIVMLTPLVEDG (SEQ ID NO: 25); MVWESGCTVIVMLTPL (SEQ ID NO: 26); SGCTVIVMLTPLVEDGVK (SEQ ID NO: 27); ESGCTVIVMLTPLVEDGV (SEQ ID NO: 28); WQMVWESGCTVIVMLT (SEQ ID NO: 29); DFWQMVWESGCTVIVMLT (SEQ ID NO: 30); FWQMVWESGCTVIVMLTPLV (SEQ ID NO: 31); MVWESGCTVIVMLTPLVEDGV (SEQ ID NO: 32); KVESSPSRSDYI (SEQ ID NO: 38); LKVESSPSRSDY (SEQ ID NO: 39); KLKVESSPSRSDYINAS (SEQ ID NO: 40); KVESSPSRSDYINASPIIEHDP (SEQ ID NO: 41); und LKVESSPSRSDYINASPII (SEQ ID NO: 42).
  • Weiterhin offenbart wird ein Verfahren zum Schützen eines Individuums vor IDDM oder den pathogenen Symptomen von IDDM. Es wird davon ausgegangen, dass das Schützen eine Linderung (oder Verringerung) so wie auch die Beseitigung der pathogenen Symptome in einem Individuum umfasst. Das Verfahren umfasst die Verabreichung eines beliebigen der oben angegebenen erfindungsgemäßen Peptide über einen beliebigen der hier offenbarten Wege an das Individuum.
  • Weiterhin offenbart werden veränderte Peptidliganden, deren Aminosäuresequenz mit Ausnahme von 1 bis 6 Aminosäuresubstitutionen identisch ist zu einem Fragment von IA-2, wobei das Fragment eine Länge von weniger als 26 Aminosäureresten aufweist und eine Sequenz AYQAEPNT (SEQ ID NO: 49); VSSQFSDAAQASP (SEQ ID NO: 47); TQETRTL (SEQ ID NO: 48), CTVIVMLT (SEQ ID NO: 44); FEFALTAVAEE (SEQ ID NO: 43); oder KVESSPSRSDY (SEQ ID NO: 52) umfasst. In den veränderten Peptidliganden sind wenigstens eine, jedoch nicht mehr als 30% der Aminosäurereste des Fragments durch unterschiedliche Aminosäurereste substituiert. Die Sequenzen der Fragmente, aus denen die veränderten Peptidliganden abgeleitet werden können, umfassen: AYQAEPNTCATAQ (SEQ ID NO: 17); LCAYQAEPNTCATAQG (SEQ ID NO: 18); LAKEWQALCAYQAEPNT (SEQ ID NO: 19); AYQAEPNTCATAQGEGNIK (SEQ ID NO: 20); WQALCAYQAEPNTCATAQ (SEQ ID NO: 21); LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (SEQ ID NO: 22); VSSQFSDAAQASPSS (SEQ ID NO: 1); SVSSQFSDAAQASPS (SEQ ID NO: 2); SSVSSQFSDAAQASP (SEQ ID NO: 3); SVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 4); SRVSSVSSQFSDAAQASPSSHSST (SEQ ID NO: 5); SVSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWC (SEQ ID NO: 6); VSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWCE (SEQ ID NO: 7); VSSVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 8); TQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 9); YLKNVQTQETRTL (SEQ ID NO: 10); VQTQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 11); LKNVQTQETRTLTQF (SEQ ID NO: 12); YLKNVQTQETRTLTY (SEQ ID NO: 13); KNVQTQETRTLTQFH (SEQ ID NO: 14); SFYLKNVQTQETRTLTQFH (SEQ ID NO: 15); FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 16); GCTVIVMLTPLVED (SEQ ID NO: 23); CTVIVMLTPLVEDG (SEQ ID NO: 24); ESGCTVIVMLTPLVEDG (SEQ ID NO: 25); MVWESGCTVIVMLTPL (SEQ ID NO: 26); SGCTVIVMLTPLVEDGVK (SEQ ID NO: 27); ESGCTVIVMLTPLVEDGV (SEQ ID NO: 28); WQMVWESGCTVIVMLT (SEQ ID NO: 29); DFWQMVWESGCTVIVMLT (SEQ ID NO: 30); FWQMVWESGCTVIVMLTPLV (SEQ ID NO: 31); MVWESGCTVIVMLTPLVEDGV (SEQ ID NO: 32); DQFEFALTAVAEE (SEQ ID NO: 33); DQFEFALTAVAEEVNAI (SEQ ID NO: 34); FEFALTAVAEEVNAILKA (SEQ ID NO: 35); SKDQFEFALTAVAEEVNA (SEQ ID NO: 36); SKDQFEFALTAVAEEVNAILK (SEQ ID NO: 37); KVESSPSRSDYI (SEQ ID NO: 38); LKVESSPSRSDY (SEQ ID NO: 39); KLKVESSPSRSDYINAS (SEQ ID NO: 40); KVESSPSRSDYINASPIIEHDP (SEQ ID NO: 41); und LKVESSPSRSDYINASPII (SEQ ID NO: 42).
  • Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung eines veränderten Peptidliganden (APL) offenbart, wobei man: (a) das oben beschriebene Verfahren zur Identifizierung eines Klasse-II-MHC-Bindungsfragments eines Polypeptids, einschließlich des Schrittes der Identifizierung der Aminosäuresequenz des von dem MHC-Klasse-Moleküls eluierten Peptids, durchführt, und (b) einen APL synthetisiert, der aus einer Sequenz besteht, die mit Ausnahme von Aminosäuresubstitutionen an 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Positionen in dem Peptid identisch ist zu der des eluierten Peptids. Das Verfahren kann durchgeführt werden unter Verwendung der Polypeptide Insulin, Proinsulin, Preproinsulin, IA-2, IA-2β oder GAD65.
  • Weiterhin offenbart wird ein Verfahren zur Verringerung der T-Zell-Autoreaktivität in einem Säuger, wobei man: (a) einen APL bereitstellt, dessen Sequenz mit Ausnahme von Aminosäuresubstitutionen an 1 bis 6 Position identisch ist zu der eines natürlich prozessierten, mit Diabetes assoziierten Peptidfragments von Insulin, Proinsulin, Preproinsulin, IA-2, IA-2β oder GAD65, wobei der APL die Eigenschaft aufweist, an ein Klasse-II-MHC-Molekül des Säugers zu binden; und (b) den APL, oder eine den APL kodierende DNA, dem Säuger verabreicht.
  • Durch die Erfindung wird weiterhin ein in vitro-Verfahren zur Identifizierung eines Klasse-II-MHC-Bindungsfragments eines Polypeptids bereitgestellt, wobei man bei diesem Verfahren: (a) einen Liganden, konjugiert mit einem Biotinmolekül, bereitstellt; (b) das mit einem Avidinmolekül konjugierte Polypeptid bereitstellt; (c) eine APC eines Säugers bereitstellt, die ein Klasse-II-MHC-Molekül und einen Zelloberflächenrezeptor, der den Liganden bindet, exprimiert; (d) die APC mit dem Biotin-konjugierten Liganden aus (a) und dem Avidin-konjugierten Polypeptid aus (b) in Kontakt bringt, um einen Komplex zu bilden, der an den Zelloberflächenrezeptor bindet; (e) die APC unter Bedingungen hält, welche die Internalisierung des Komplexes durch die APC erlauben; (f) aus der APC das Klasse-II-MHC-Molekül, gebunden an ein Peptid isoliert; und (g) das Peptid von dem Klasse-II-MHC-Molekül eluiert, wobei das Peptid ein Klasse-II-MHC-Bindungsfragment des Polypeptids ist. Dieses Verfahren kann die folgenden zusätzlichen Schritte umfassen: (h) die Bereitstellung von CD4-Lymphozyten aus einem Individuum, von dem man vermutet, dass es für einen Zustand suszeptibel ist, der mit der Präsentation des Peptids durch dieses Klasse-II-MHC-Molekül assoziiert ist, worin die APCs des Individuums das Klasse-II-MHC-Molekül tragen; (i) die Bereitstellung einer Population von APCs, welche das Klasse-II-MHC-Molekül mit dem daran gebundenen Peptid tragen; (j) das Inkontaktbringen der APCs aus (i) mit den CD4-Lymphozyten aus (h); und (k) die Bestimmung, ob die CD4-Lymphozyten das Klasse-II-MHC-gebundene Peptid erkennen, als Indikation dafür, dass das Peptid mit dem Zustand des Individuums assoziiert ist. Die Präsentation des Peptids kann entweder in einer pathologischen Antwort von CD4+ T-Lymphozyten oder einer protektiven Antwort von CD4+ T-Lymphozyten resultieren. Natürlich könnte das Verfahren durchgeführt werden durch Konjugieren des Liganden mit Avidin und des Polypeptids mit Biotin.
  • Weiterhin wird ein Diagnoseverfahren offenbart, wobei man: (a) CD4+ T-Lymphozyten aus einem Individuum bereitstellt, von dem man vermutet, dass es IDDM hat oder für IDDM suszeptibel ist; (b) eine Population von APCs bereitstellt, die auf ihrer Oberfläche ein Klasse-II-MHC-Molekül eines Allels tragen, das identisch ist zu einem von dem Individuum exprimierten Allel, wobei die Population von APCs mit einem IA-2-Peptid und dem Klasse-II-MHC-Molekül der APCs, das an das IA-2-Peptid gebunden ist, in Kontakt gebracht wurden; (c) die Population von APCs aus (b) mit den CD4-Lymphozyten aus (a) in Kontakt bringt; und (d) bestimmt, ob die CD4-Lymphozyten das Klasse-II-MHC-gebundene Peptid erkennen, als Indikation dafür, dass das Individuum IDDM hat oder dafür suszeptibel ist. Das bei dem Verfahren verwendete IA-2-Peptid kann die Aminosäuresequenz: VSSQFSDAAQASPSS (SEQ ID NO: 1); SVSSQFSDAAQASPS (SEQ ID NO: 2); SSVSSQFSDAAQASP (SEQ ID NO: 3); SVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 4); SRVSSVSSQFSDAAQASPSSHSST (SEQ ID NO: 5); SVSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWC (SEQ ID NO: 6); VSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWCE (SEQ ID NO: 7); VSSVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 8); TQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 9); YLKNVQTQETRTL (SEQ ID NO: 10); VQTQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 11); LKNVQTQETRTLTQF (SEQ ID NO: 12); YLKNVQTQETRTLTY (SEQ ID NO: 13); KNVQTQETRTLTQFH (SEQ ID NO: 14); SFYLKNVQTQETRTLTQFH (SEQ ID NO: 15); FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 16); AYQAEPNTCATAQ (SEQ ID NO: 17); LCAYQAEPNTCATAQG (SEQ ID NO: 18); LAKEWQALCAYQAEPNT (SEQ ID NO: 19); AYQAEPNTCATAQGEGNIK (SEQ ID NO: 20); WQALCAYQAEPNTCATAQ (SEQ ID NO: 21); LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (SEQ ID NO: 22); GCTVIVMLTPLVED (SEQ ID NO: 23); CTVIVMLTPLVEDG (SEQ ID NO: 24); ESGCTVIVMLTPLVEDG (SEQ ID NO: 25); MVWESGCTVIVMLTPL (SEQ ID NO: 26); SGCTVIVMLTPLVEDGVK (SEQ ID NO: 27); ESGCTVIVMLTPLVEDGV (SEQ ID NO: 28); WQMVWESGCTVIVMLT (SEQ ID NO: 29); DFWQMVWESGCTVIVMLT (SEQ ID NO: 30); FWQMVWESGCTVIVMLTPLV (SEQ ID NO: 31); MVWESGCTVIVMLTPLVEDGV (SEQ ID NO: 32); DQFEFALTAVAEE (SEQ ID NO: 33); DQFEFALTAVAEEVNAI (SEQ ID NO: 34); FEFALTAVAEEVNAILKA (SEQ ID NO: 35); SKDQFEFALTAVAEEVNA (SEQ ID NO: 36); SKDQFEFALTAVAEEVNAILK (SEQ ID NO: 37); KVESSPSRSDYI (SEQ ID NO: 38); LKVESSPSRSDY (SEQ ID NO: 39); KLKVESSPSRSDYINAS (SEQ ID NO: 40); KVESSPSRSDYINASPIIEHDP (SEQ ID NO: 41); oder LKVESSPSRSDYINASPII (SEQ ID NO: 42) aufweisen.
  • Ein „isoliertes" erfindungsgemäßes Polypeptid ist ein Peptid, das entweder kein natürlich vorkommendes Gegenstück (wie beispielsweise ein APL) hat, oder von Bestandteilen, in deren Begleitung es natürlicherweise auftritt, z. B. in Geweben wie beispielsweise der Bauchspeicheldrüse, der Leber, der Milz, dem Eierstock, dem Hoden, dem Muskel, dem Gelenkgewebe, dem neuronalen Gewebe, dem gastrointestinalen Gewebe, oder Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Blut, Serum oder Urin, abgetrennt oder gereinigt wurde. Das Peptid wird typischerweise als „isoliert" betrachtet, wenn es zu wenigstens 70%, bezogen auf das Trockengewicht, frei ist von den Proteinen und natürlicherweise auftretenden organischen Molekülen, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. Eine erfindungsgemäße Peptidpräparation ist vorzugsweise zu wenigstens 80%, besonders bevorzugt zu wenigstens 90%, und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 99%, bezogen auf das Trockengewicht, das erfindungsgemäße Peptid. Somit besteht beispielsweise eine Präparation eines Peptids x zu wenigstens 80%, bevorzugt zu wenigstens 90%, und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 99%, bezogen auf das Trockengewicht, aus dem Peptid x. Da ein chemisch synthetisiertes Peptid naturgemäß von den Bestandteilen, in deren Begleitung es natürlicherweise auftritt, abgetrennt ist, ist das synthetische Peptid „isoliert".
  • Ein erfindungsgemäßes isoliertes Peptid kann beispielsweise erhalten werden durch Extraktion aus einer natürlichen Quelle (z. B. aus menschlichem Geweben oder Körperflüssigkeiten); durch Expression einer das Peptid kodierenden rekombinanten Nukleinsäure; oder durch chemische Synthese. Ein Peptid, das in einem zellulären System hergestellt wird, welches unterschiedlich ist von der Quelle, aus der es natürlicherweise stammt, ist „isoliert", da es getrennt sein wird von Bestandteilen, die es natürlicherweise begleiten. Der Grad der Isolierung oder der Reinheit kann über jedes beliebige geeignete Verfahren gemessen werden, z. B. Säulenchromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese, oder HPLC-Analyse.
  • „Schutz vor einer Säuger-Erkrankung" bedeutet hier das Verhindern des Ausbrechens einer Säuger-Erkrankung oder Abmildern der Schwere einer in einem Säuger vorliegenden Krankheit. „Schutz" kann eine Verzögerung des Ausbrechens sowie auch eine teilweise oder vollständige Blockierung des Verlaufs der Krankheit bedeuten.
  • Ein „natürlich prozessiertes, mit Diabetes assoziiertes Peptidfragment" bedeutet hier ein Fragment, das hergestellt ist durch proteolytischen Abbau eines Proteins (z. B. Insulin, Proinsulin, Preproinsulin, IA-2, IA-2β, oder GAD65) in einer Antigen präsentierenden Zelle eines Säugers. Die Erkennung eines solchen Peptids durch CD4 T-Zellen eines Säugers ist eine Indikation für das Vorliegen, oder das zukünftige Ausbrechen, von Diabetes in dem Säuger.
  • Soweit nicht anderweitig definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, die vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem die vorliegende Erfindung gehört, üblicherweise verstanden wird. Im Fall von Widersprüchen gilt das vorliegende Dokument einschließlich der dort gegebenen Definitionen. Bevorzugte Verfahren und Materialien sind nachfolgend beschrieben, wenngleich Verfahren oder Materialien, die den hier beschriebenen ähneln oder zu diesen äquivalent sind, bei der Durchführung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Soweit nicht anders angegeben, dienen diese Materialien und Verfahren nur der Veranschaulichung und sind nicht als Beschränkung aufzufassen. Alle hier erwähnten Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und anderen Literaturnachweise dienen lediglich der Veranschaulichung und sind nicht als Beschränkung aufzufassen.
  • Weitere Merkmale und Vorteile, z. B. Verfahren zur Identifizierung von Peptiden, die pathogene CD4+ T-Lymphozyten-Antworten aktivieren, werden aus der nachfolgenden Beschreibung, den Figuren und den Ansprüchen ersichtlich.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist ein Histogramm, das die Profile in der fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrie von Priess-Zellen zeigt, die mit Tetanustoxoid-spezifischem Kaninchenantikörper und FITC-konjugiertem, für Kaninchen-Immunglobulin spezifischem Ziegen-Antikörper zu verschiedenen Zeitpunkten nach Kontakt mit dem Antigentransportsystem („Antigen Delivery System") (ADS) unter Verwendung von Tetanustoxoid als Peptidantigen gefärbt wurden.
  • 2 ist ein Diagramm, das 2 in geeigneter Weise ausgerichtete MALDI-TOF-Spektren zeigt, die von 2 Gemischen von Peptiden stammen, welche durch IMF-Verfahren erhalten wurden, bei denen getrennte Aliquots von Priess-Zellen entweder mit allen Schritten des Immunologischen Massen-Fingerabdruck-Verfahrens („Immunological Mass Fingerprinting") (IMF-Verfahren), einschließlich des Kontakts mit biotinyliertem IA-2ic, oder mit allen Schritten des IMF-Verfahrens, mit Ausnahme des Kontakts mit biotinyliertem IA-2ic, behandelt wurden.
  • 3 ist eine Serie von Liniengraphen, welche die relative Fähigkeit von 6 Peptiden (wobei die 6 Kernregionen von IA-2, die über IMF identifiziert wurden, die Grundlage der Aminosäuresequenzen bilden) zur Inhibierung der Bindung eines invarianten Ketten-(Ii)-Peptids an isolierte HLA DR4-Moleküle zeigt.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Die vorliegenden Erfindung basiert auf der neuen Erkenntnis, dass bei künstlicher Bindung eines Polypeptids von Interesse (PPI) an die Zellmembran einer APC die APCdas PPI zu einem der Antigen prozessierenden Organellen innerhalb der Zelle transportieren, z. B. Endosomen, Lysosomen und als „MHC-Klasse-II-Kompartimente" (MIIC) bezeichnete Strukturen, die lysosomale Eigenschaften aufweisen und eine Anreicherung hinsichtlich Klasse-II-MHC-Molekülen aufweisen, wobei jedoch Klasse-I-MHC-Moleküle im Wesentlichen fehlen [Peter et al., (1991), Nature 349: 669–676]. Das PPI wird anschließend durch proteolytische Enzyme in Peptidfragmente abgebaut. Wenn irgendeines dieser Peptidfragmente dazu in der Lage ist, an eines der Klasse-II-MHC-Moleküle zu binden, die von dem Individuum, von dem die APC stammt, exprimiert werden, so wird es dies in dem Antigen prozessierenden Organell tun. Der erhaltene molekulare Komplex aus Peptid-Klasse-II-MHC wird anschließend zur Zellmembran transportiert, wo er für die Interaktion mit CD4+ T-Zellen verfügbar wird, welche antigenspezifische Rezeptoren tragen, die diesen speziellen Peptid-Klasse-II-MHC-Komplex spezifisch erkennen. Durch Elution von Peptiden von Klasse-II-MHC-Molekülen, die von diesen APCs isoliert sind, erhält man einen Satz natürlich prozessierter Peptide, die vom PPI abgeleitet sind, ebenso wie von anderen Polypeptiden intrazellulären oder extrazellulären Ursprungs. Die Peptide, die spezifisch sind für die speziellen Klasse-II-MHC-Moleküle, die von den APCs exprimiert werden, werden dann chemisch abgetrennt und ihre Aminosäuresequenzen werden bestimmt. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Peptide mit der Sequenz des PPI ist es möglich, diejenigen zu identifizieren, die vom PPI abgeleitet sind. Dementsprechend wird durch diese Erkenntnis ein Verfahren zur Identifizierung von Peptidfragmenten, die von APCs natürlich prozessiert sind und eine intrinsische Bindungsaffinität für die relevanten Klasse-II-MHC-Moleküle aufweisen, bereitgestellt. Das Verfahren kann von unschätzbarem Wert sein für die Identifizierung von Peptiden, die von einem Polypeptid abgeleitet sind, von dem man vermutet, dass es ein Antigen ist, das CD4+ T-Zellen aktiviert, die beteiligt sind an entweder (a) der Pathogenese (Pathologie) einer Erkrankung, insbesondere einer Erkrankung, bei der die Suszeptibilität oder der Schutz assoziiert ist mit der Expression einer bestimmten Art von Klasse-II-MHC-Molekül, oder (b) dem Schutz vor oder der Verringerung der Symptome einer Erkrankung, insbesondere einer Erkrankung, bei der ein Schutz oder eine Verringerung des Schweregrads assoziiert ist mit der Expression einer bestimmten Art von Klasse-II-MHC-Molekül. Das Verfahren wird als „Immunologisches Massen-Fingerabdruck-Verfahren" („Immunological Mass Fingerprinting") bezeichnet.
  • Durch das beschriebene Verfahren wird sichergestellt, dass die identifizierten Peptide solche Peptide sind, die sowohl (i) in vivo von der APC natürlich prozessiert werden, als auch (ii), in der APC, mit den relevanten Klasse-II-MHC-Molekülen assoziiert werden.
  • Weiterhin erfolgt durch das vorliegende Verfahren eine Kontrolle hinsichtlich des Klasse-II-MHC-Typs, ein wichtiger Aspekt, der wesentlich dafür ist, ein beliebiges vorliegendes Peptid mit einer bestimmten CD4+ T-Zell-vermittelten Erkrankung in einem bestimmten Individuum in Verbindung zu bringen, jedoch besonders wichtig ist bei Störungen, bei denen der Klasse-II-MHC-Typ die Suszeptibiliät oder die Widerstandskraft gegenüber der Erkrankung bestimmt.
  • Jedes natürlich prozessierte Peptid mit einer Sequenz, die einem Fragment des PPI entspricht, und das an ein Klasse-II-MHC-Molekül bindet, welches mit der Erkrankung von Interesse assoziiert ist, könnte ein Peptid sein, das CD4+ T-Zellen aktiviert, welche entweder die Erkrankung initiieren, fördern oder verschlimmern, oder Immunität gegen die Erkrankung vermitteln. Um bestätigende Beweise für diese Möglichkeit zu erhalten, können Test-CD4+ T-Zellen von Individuen, welche die relevanten Klasse-II-MHC-Moleküle exprimieren, auf das Ansprechen auf ein erfindungsgemäß identifiziertes Peptid untersucht werden. Kontroll-CD4+ T-Zellen können von Individuen stammen, die das Klasse-II-MHC-Molekül ebenfalls exprimieren, jedoch keine Symptome der Erkrankung aufweisen. Eine signifikante Antwort der Test-CD4+ T-Zellen und eine ausbleibende Antwort der Kontroll-CD4+ T-Zellen wäre ein Anzeichen dafür, dass das relevante Peptid am Erkrankungsprozess (der Pathologie der Erkrankung) oder an der Immunität gegenüber der Erkrankung beteiligt ist. Diese zelluläre Antwortphase des Verfahrens wird als „Epitopverifizierung" („EV") bezeichnet.
  • Durch Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren auf den intrazellulären Teil des Diabetes-Autoantigens IA-2 wurden IA-2-abgeleitete Peptide als Epitope identifiziert, die an der Pathogenese von Diabetes in menschlichen IDDM-Patienten, welche das DR4 Klasse-II-MHC-Allel exprimieren, beteiligt sein könnten. Auf der Grundlage ihre Aminosäuresequenzen fallen diese Peptide in 6 miteinander verbundene Gruppen. Ein Konsensus-Peptid, das der Kernregion jeder verbundenen Gruppe entspricht, wurde synthetisiert und auf seine Fähigkeit getestet, CD4+ T-Zellen entweder von DR4-exprimierenden IDDM-Patienten oder von DR4-exprimierenden Individuen ohne Erkrankungssymptome zu aktivieren. Signifikante Antworten auf wenigstens 1 von den 6 Peptiden wurden in Lymphozyten des peripheren Blutes von 9/13 DR4-exprimierenden IDDM-Patienten nachgewiesen. T-Zellen keiner der Kontroll-Individuen antworteten auf irgendeines der Peptide, und T-Zellen von 1 aus 8 IDDM-Patienten, die kein DR4 exprimierten, antworteten auf irgendein Peptid. Diese Befunde legen nahe, dass die 6 Peptide, auf welche die DR4-exprimierenden Patienten antworteten, Kernepitope darstellen, die zur Bindung an DR4-Moleküle und zur Aktivierung diabetogener CD4+ T-Zellen in IDDM-Patienten in der Lage sind. Die Fähigkeit aller 6 Peptide zur Bindung an isolierte DR4-Moleküle wurde durch einen in vitro-Bindungsassay bestätigt.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können für die Identifizierung von Peptiden angewendet werden, die an der Pathogenese von oder dem Schutz vor einem breiten Spektrum von Erkrankungen beteiligt sind, insbesondere solchen, bei denen die relative Suszeptibilität oder Widerstandskraft mit der Expression eines bestimmten Klasse-II-MHC-Allels assoziiert wurde, vorausgesetzt, dass die Aminosäuresequenz (oder partielle Aminosäuresequenz) eines vermuteten Polypeptidantigens verfügbar ist. Kandidaten für Erkrankungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, infektiöse Erkrankungen (z. B. Erkrankungen, die verursacht werden durch Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Mycobacterium leprae, M. tuberculosis, Masern-Virus, Hepatitis-C-Virus, menschliches Immundefizienz-Virus, und Plasmodium falciparium), Krebs (z. B. Melanom, Eierstockkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs und B-Zell-Lymphome) [Topalian, S. L. (1994), Curr. Opinion in Immunol. 6: 741–745; Topalian et al., (1996), J. Exp. Med. 183: 1965–1971], und Autoimmunerkrankungen (z. B. IDDM, rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Myasthenia gravis und systemischer Lupus erythematosus).
  • Die Erfindung umfasst weiterhin die unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens von IA-2 abgeleiteten Peptide, wie in Beispiel 1 beschrieben. Ebenfalls offenbart sind APLs, die abgeleitet sind durch Austausch von 1 bis 6 (d. h. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6) Aminosäureresten eines natürlich prozessierten Peptids, das eines Immunantwort aktiviert. Jeder Rest wird durch einen unterschiedliche Rest ersetzt, was zu einem verstärkten Peptid führt, das weiterhin an das gleiche Klasse-II-MHC-Allel bindet, jedoch qualitativ unterschiedliche Antworten in CD4+ T-Zellen hervorruft als das Ausgangspeptid, von denen das APL abgeleitet ist. Dementsprechend haben APLs das Potential, bei Erkrankungen, bei denen die CD4+ T-Zelt-Antwort auf das relevante Ausgangspeptid pathogen wirkt, therapeutisch und/oder prophylaktisch zu wirken. Weiterhin offenbart werden Verfahren zur Therapie und Prophylaxe, welche die Verwendung von APL umfassen; und die Verwendung der mit Erkrankungen in Zusammenhang stehenden Peptide bei der Diagnose von Erkrankungen und der Überwachung von Immuntherapien.
  • 1. Verfahren zur Identifizierung von CD4+ T-Zell-aktivierenden Peptidepitopen, die von Polypeptid-Antigenen abgeleitet sind
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren weisen zwei eigenständige Phasen auf. Die erste wird als „Immunlogischer Massen-Fingerabdruck" (IMF) und die zweite als „Epitopverifizierung" (EV) bezeichnet. Der Zweck des IMF besteht darin, ein Kandidaten-Polypeptid zu irgendeinem der Antigen prozessierenden Kompartimente einer APC zu leiten, wo es in Peptidfragmente abgebaut werden kann. Beliebige Peptide, welche die geeignete Länge (etwa 9 bis 25 Aminosäurereste) und eine spezifische Bindungsaffinität für ein bestimmtes, von der APC exprimiertes Klasse-II-MHC-Molekül aufweisen, werden an dieses Klasse-II-MHC-Molekül in den Antigen prozessierenden Kompartimenten binden. Der Hauptteil dieser Klasse-II-MHC-Molekularkomplexe wandert anschließend zur Zellmembran der APC. Die Komplexe (sowohl die mit der Zellmembran assoziierten als auch die intrazellulären) werden von der APC isoliert und die Peptide von den Komplexen eluiert. Die eluierten Peptide werden anschließend abgetrennt, ihre Aminosäuresequenzen werden bestimmt und die Sequenzen mit der des Kandidaten-Polypeptids verglichen.
  • Das IMF kann allgemein für die Analyse von Peptiden angewendet werden, die von einer definierte Klasse-II-MHC-Moleküle exprimierenden APC produziert werden. Das Verfahren kann solchermaßen brauchbar sein für Untersuchungen in der Grundlagenforschung, z. B. Untersuchungen, die darauf abzielen, Aminsäurereste in einem Polypeptid zu identifizieren, welche die Stellen des „Schneidens" durch proteolytische Antigen-prozessierende Enzyme von APCs bestimmen. Wenn vermutet wird, dass das Polypeptid ein Antigen ist, das CD4+ T-Zellen aktiviert, die eine bestimmte Erkrankung verursachen oder fördern oder Schutz vor einer Erkrankung vermitteln, kann alternativ das IMF dazu verwendet werden, mit einer Erkrankung in Zusammenhang stehende oder protektive Peptidepitope, die von dem Polypeptid abgeleitet sind, zu identifizieren. Diese Information wäre nützlich für die Grundlagenforschung über die Ätiologie der Erkrankung oder als Grundlage für die Entwicklung von Diagnostika, Therapeutika, oder von Impfstoffen gegen die Erkrankung.
  • Ein Peptid, dessen Aminosäuresequenz mit der einer Region des Kandidaten-Polypeptids übereinstimmt, ist wahrscheinlich dasjenige, das an der Pathogenese oder Immunität der betreffenden Erkrankung beteiligte CD4+ T-Zellen aktiviert. Mit einem solchen Peptid kann das EV-Verfahren durchgeführt werden, mit dem dessen Fähigkeit zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen von Test- und Kontrollindividuen untersucht wird. Diejenigen Peptide, die CD4+ T-Zellen von Testindividuen, jedoch nicht solche von Kontrollindividuen aktivieren, werden als Peptide identifiziert, welche die betreffende Erkrankung initiieren, fördern oder verschlimmern können oder einen Schutz vor der Erkrankung oder deren pathogenen Symptomen vermitteln.
  • Sobald ein solches Peptid identifiziert ist, kann es in großen Mengen mit chemischen oder rekombinanten Techniken synthetisiert werden und in diagnostischen Assays, die den unten angeführten EV-Verfahren ähneln, verwendet werden. Relevante Peptide können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Alternativ können Expressionsvektoren, die ein solches Peptid oder eine Kombination solcher Peptide kodieren, verwendet werden, um geeignete APCs zu transfizieren oder zu transduzieren (siehe unten), und diese können in ähnlichen diagnostischen Asssays verwendet werden.
  • Weiterhin können Multimere (z. B. Dimere, Trimere, Tetramere, Pentamere, oder Hexamere) eines Klasse-II-MHC-Moleküls, das ein über das erfindungsgemäße Verfahren definiertes Peptid enthält, bei Konjugation mit einer nachweisbaren Markierung (z. B. einem fluoreszierenden Molekül, einem Radionuklid, oder einem Enzym, das eine Reaktion katalysiert, die zu einem Licht einer definierten Wellenlänge absorbierenden oder emittierenden Produkt führt) verwendet werden, um T-Zellen von einem Individuum (z. B. einem menschlichen Patienten) zu quantifizieren, die Zelloberflächenrezeptoren tragen, welche spezifisch für solche Komplexe sind, und daher an diese binden. Eine relativ hohe Anzahl solcher T-Zellen stellt wahrscheinlich einen diagnostischen Hinweis auf eine betreffende Erkrankung dar, oder ein Anzeichen dafür, dass die T-Zellen an der Immunität gegen die Erkrankung beteiligt sind. Darüber hinaus kann eine kontinuierliche Überwachung der relativen Zahl multimer-bindender T-Zellen nützlich sein für die Bestimmung des Verlaufs einer Erkrankung oder der Wirksamkeit der Therapie. Derartige Assays wurden entwickelt unter Verwendung von Tetrameren von Klasse-I-MHC-Molekülen, die ein HIV-1-abgeleitetes oder ein Influenza-Virus-abgeleitetes Peptid enthielten [Altmann et al., (1996), Science 274: 94–96; Ogg et al., (1998), Science 279: 2103–2106], und es ist zu erwarten, dass entsprechende Klasse-II-MHC-Multimere in ähnlicher Weise brauchbar sind. Solche Komplexe könnten hergestellt werden durch chemische Vernetzung von in Gegenwart eines Peptids von Interesse zusammengebauten, aufgereinigten Klasse-II-MHC-Molekülen, oder durch Modifizierung von bereits etablierten rekombinanten Verfahren zur Herstellung von Klasse-II-MHC-Molekülen, die ein einzelnes definiertes Peptid enthalten [Kazano et al. (1994), Nature 369: 151–154; Gauthier et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95: 11828–11833]. Die Klasse-II-MHC-Molekül-Monomere solcher Multimere können native Moleküle sein, die aus α- und β-Ketten voller Länge bestehen. Alternativ kann es sich dabei um Moleküle handeln, die entweder die extrazellulären Domänen der α- und β-Ketten oder die α- und β-Ketten-Domänen enthalten, welche die „Wände" und den „Boden" der Peptidbindungsspalte bilden.
  • 1.1 IMF
  • Durch die Erfindung werden zwei unterschiedliche IMF-Verfahren, IMF-1 und IMF-2, bereitgestellt.
  • 1.1.1 IMF-1
  • Bei IMF-1 wird die APC mit einem Liganden in Kontakt gebracht, der eine intrinsische Fähigkeit zur Bindung an einen Rezeptor auf der Oberfläche von APCs aufweist. Kandidaten für Rezeptor-Liganden-Paare sind unten beschrieben. Vor dem Inkontaktbringen mit der APC wird der Ligand mit Biotin konjugiert. Wenn der Ligand über rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurde, kann die Biotinylierung in den Zellen (z. B. Bakterien) durchgeführt werden, in denen der Ligand über Verfahren erzeugt wird wie beispielsweise solchen, die zur Biotinylierung der in Beispiel 1 verwendeten Polypeptid-Antigene verwendet wurden. Alternativ kann der isolierte Ligand in vitro über Verfahren biotinyliert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Der Ligand wird mit wenigstens einem Biotin-Molekül pro Molekül konjugiert. Er kann 2, 3, 4, 6 oder 10 Biotin-Reste pro Molekül aufweisen, sofern er die Fähigkeit zur Bindung an den Zelloberflächenrezeptor beibehält.
  • Nach der Bindung des biotinylierten Liganden (b-L) an seinen Rezeptor an der Zelloberfläche wird ungebundenes b-L durch Waschen entfernt und die APC mit Avidin in Kontakt gebracht, einem Polypeptid, das an Biotin bindet. Das Avidin kann Ei-Avidin oder Streptavidin sein. Es kann weiterhin rekombinantes Avidin sein, das wenigstens zwei Biotin-Bindungsdomänen enthält. Natives Avidin enthält 4 Biotin-Bindungsdomänen.
  • Nach der Bindung des Avidins an die (die) Biotinrest(e) auf dem an der Oberfläche der APC gebundenen b-L wird nicht-gebundenes Avidin durch Waschen entfernt und die APC mit einem Polypeptid von Interesse (PPI) in Kontakt gebracht, das zuvor ebenfalls mit Biotin konjugiert wurde. Die Biotinylierung des PPI kann über die gleichen Methoden wie für den Liganden beschrieben durchgeführt werden, und das biotinylierte PPI (b-PPI) kann die gleiche Anzahl von Biotinresten pro Molekül enthalten. Um jedoch eine mögliche Intereferenz mit der Prozessierung zu vermeiden, enthält das PPI vorzugsweise 1 Biotinmolekül pro Molekül.
  • Nach der Bindung des biotinylierten PPI (b-PPI) an das Avidin auf der APC wird nicht-gebundenes b-PPI durch Waschen entfernt, und die APC wird inkubiert. Während das Verfahren bis zu diesem Schritt im Allgemeinen auf Eis durchgeführt wird (d. h. bei etwa 4°C), wird die Inkubation bei 37°C durchgeführt. Alternativ kann die Inkubation bei Raumtemperatur (etwa 25°C) oder bei einer Temperatur zwischen 25°C und 37°C durchgeführt werden. Die Inkubation kann über einen Zeitraum von 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden oder 6 Stunden durchgeführt werden, in Abhängigkeit davon, welcher Zeitraum zu einer optimalen Gewinnung von Peptiden führt. Nach der Inkubation werden die Klasse-II-MHC-Moleküle von Interesse über eines der verschiedenen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert, z. B. über Immunpräzipitation. Vorzugsweise erfolgt die Isolierung über Affinitätschromatographie unter Verwendung eines beschriebenen Verfahrens [Gorga et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 16087–16094].
  • Nicht-kovalent an die isolierten Klasse-II-MHC-Moleküle gebundene Peptide werden anschließend von diesen eluiert. Eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, kann verwendet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Verfahren um ein früher [Chicz et al., (1992), Nature 358: 764–768] und hier in Beispiel 1 beschriebenes Verfahren.
  • Die eluierten Peptide werden über eines einer Vielzahl von möglichen chromatographischen Verfahren getrennt, z. B. über Reverse-Phase-Chromatographie. Alle erhaltenen Fraktionen, die Peptide enthalten, werden anschließend über Matrix-unterstützte Laser-Desorption in Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) analysiert, wobei Einstellungen verwendet werden, bei denen die Peptide nicht fragmentiert werden. Mit den Peptiden, die sämtlichen „Peaks" entsprechen, die im MALDI-TOF-Spektrum erhalten werden, kann anschließend eine individuelle Aminosäuresequenz-Analyse durchgeführt werden. Alternativ kann nur mit solchen Peptiden eine Aminosäuresequenz-Analyse durchgeführt werden, die Peaks entsprechen, die nicht zu beobachten sind in einem Kontrollspektrum, das erzeugt wurde unter Verwendung einer Probe von Peptiden, die über ein identisches Verfahren, jedoch unter Auslassung des Schrittes des Inkontaktbringens der APC mit b-PPI erhalten wurden. Die Sequenzen der einzelnen Peptide können über dem Fachmann bekannte Mittel erhalten werden. Sie können beispielsweise über MALDI-TOF erhalten werden, wobei Instrumenteneinstellungen verwendet werden, die zu einer Fragmentierung der Peptide in kleine Fragmente führen, die vom Massenspektrometer analysiert werden. Die Aminosäuresequenzen der Peptide werden anschließend mit der des PPI verglichen. Diejenigen mit einer Sequenz, die identisch ist zu einer Region des PPI, stellen Kandidaten für die EV dar.
  • Anstelle der Bestimmung der Aminosäuresequenzen der eluierten Peptide kann alternativ mit „Standard"-Peptiden, die als mögliche Kandidaten angesehen werden, eine MALDI-TOF-Massenspektrometrie durchgeführt werden. Ein Test-Peptid mit einem Peak an der gleichen Position im Spektrum wie ein Standard-Peptid weist wahrscheinlich die gleiche Sequenz auf wie das Standard-Peptid.
  • 1.1.2 IMF-2
  • Das IMF-2-Verfahren ist identisch mit dem IFM-1-Verfahren, wobei jedoch anstelle des Inkontaktbringens der APC mit b-L-Avidin und anschließend mit b-PPI, das an die APC gebundene b-L in IMF-2 mit dem an Avidin konjugierten PPI (av-PPI) in Kontakt gebracht wird. Alternativ kann der Ligand unter Bildung eines Ligand-Avidin-Komplexes (L-av) chemisch mit Avidin konjugiert werden. Das av-PPI- und das L-av-Konjugat können chemisch über dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden. Alternativ kann ein aus dem PPI und Avidin, oder aus dem Liganden und Avidin bestehendes Fusionsprotein über standardmäßige rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden. In beiden Fällen kann der Avidin-Bestandteil ein Avidin voller Länge oder ein Fragment des Avidinmoleküls sein, das 1, 2, 3 oder alle 4 Biotin-Bindungsdomänen enthält.
  • 1.2. EV
  • Das EV-Verfahren umfasst das Testen der über IMF identifizierten Peptide auf ihre Fähigkeit zur Bindung der Klasse-II-MHC-Moleküle, von denen sie eluiert wurden, und zur Aktivierung verschiedener CD4+ T-Zell-Populationen. Peptide mit Aminosäuresequenzen, die entweder identisch sind zu den über IMF identifizierten oder einer Kernsequenz entsprechen, die von einer verbundenen Gruppe von über das IMF identifizierten Peptiden abgeleitet ist, werden synthetisiert. Die synthetischen Peptide werden anschließend getestet auf ihre Fähigkeit zur Bindung des Klasse-II-MHC, von dem sie eluiert wurden, und auf ihre Fähigkeit zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen von (a) Test-Individuen, die das Klasse-II-MHC-Molekül von Interesse exprimieren und wenigstens ein Symptom der Erkrankung aufweisen; und (b) Kontroll-Individuen, die das Klasse-II-MHC-Molekül von Interesse exprimieren und keine Symptome der Erkrankung aufweisen. Zusätzliche Kontroll-Individuen können solche sein, die Symptome der Erkrankung aufweisen und das Klasse-II-MHC-Molekül von Interesse nicht exprimieren. Bei einigen Erkrankungen (z. B. solchen mit einer Autoimmun-Komponente) liefert das Ansprechen bei den CD+ T-Zellen der Test-Individuen, jedoch nicht bei den in (b) beschriebenen CD4+ T-Zellen der Kontroll-Individuen einen bestätigenden Beweis dafür, dass das relevante Peptid ein Epitop ist, das CD4+ T-Zellen aktiviert, welche die betreffende Erkrankung initiieren, fördern oder verschlimmern können. Bei anderen Erkrankungen (z. B. Krebs oder infektiösen Erkrankungen ohne eine Autoimmun-Komponente) würde ein ähnliches Muster von Ansprechen und Nicht-Ansprechen wie das im vorhergehenden Satz beschriebene anzeigen, dass das relevante Peptid ein Epitop ist, das CD4+ T-Zellen aktiviert, die Immunität gegenüber der Erkrankung oder wenigstens eine Verringerung der Symptome der Erkrankung vermitteln können.
  • Ein Fehlen einer Antwort in Individuen mit Symptomen der Erkrankung, die jedoch das Klasse-II-MHC-Molekül nicht exprimieren, liefert einen weiteren Beweis für die angegebenen Aktivitäten des Peptids. Andererseits würde eine Antwort in einer solchen CD4+ T-Zelle nicht notwendigerweise eine solche Rolle ausschließen, würde jedoch nahe legen, dass das betreffende Peptid in der Lage ist, (i) an einige Klasse-II-MHC-Moleküle, die von dem betreffenden Individuum exprimiert werden, zu binden; und (ii) von CD4+ T-Zellen in Assoziierung mit diesem Klasse-II-MHC-Molekül erkannt zu werden.
  • CD4+ T-Zell-Antworten können über ein Vielzahl von in vitro-Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gemessen werden. Beispielsweise können mononukleare Zellen des peripheren Gesamtbluts (PBMC) mit oder ohne ein synthetisches Kandidaten-Peptid kultiviert werden und deren proliferative Antworten gemessen werden, z. B. über Einbau von [3H]-Thymidin in deren DNA. Dass die proliferierenden T-Zellen CD4+ T-Zellen sind, kann getestet werden entweder durch Eliminierung von CD4+ T-Zellen von den PBMC vor dem Assay oder durch Zugabe von inhibitorischen Antikörpern, die an das CD4+ Molekül auf den T-Zellen binden, wodurch sie deren Proliferation inhibieren. In beiden Fällen wird die proliferative Antwort nur dann inhibiert sein, wenn CD4+ T-Zellen die proliferierenden Zellen sind.
  • Alternativ können CD4+ T-Zellen aus PBMC aufgereinigt und hinsichtlich proliferativer Antworten gegen die Peptide in Gegenwart von APCs getestet werden, welche das geeignete Klasse-II-MHC-Molekül exprimieren. Solche APCs können B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen oder dendritische Zellen, oder Gesamt-PBMCs sein. Die APCs können auch immortalisierte Zelllinien sein, die von B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen oder dendritischen Zellen abgeleitet sind. Die APCs können das Klasse-II-MHC-Molekül von Interesse endogen exprimieren, oder sie können transfizierte Polynukleotide exprimieren, die solche Moleküle kodieren. Wenn die Individuen Menschen sind, können die APCs auch T-Zellen sein, da menschliche T-Zellen in der Lage sind, Klasse-II-MHC-Molekül zu exprimieren. In allen Fällen können die APCs, vor dem Assay, durch Behandlung mit z. B. ionisierender Strahlung oder Mitomycin-C in einen nicht-proliferativen Zustand versetzt werden.
  • Als Alternative zur Messung der Zellproliferation kann die Zytokinproduktion durch die CD4+ T-Zellen über dem Fachmann bekannte Verfahren gemessen werden. Zytokine umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Interleukin-2 (IL-2), IFN-γ, IL-4, IL-5, TNF-α, Interleukin-3 (IL-3), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-12 (IL-12) und transformierenden Wachstumsfaktor β (TGFβ), und Assays zu deren Messung umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, ELISA, und Bioassays, bei denen Zellen, die auf das betreffende Zytokin ansprechen, in Gegenwart einer Testprobe auf ihr Ansprechen (z. B. Proliferation) getestet werden. Alternativ kann die Zytokinproduktion durch CD4+ Lymphozyten durch intrazelluläre Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie direkt sichtbar gemacht werden.
  • Nach der Identifizierung von Peptideptopen, die mit einer betimmten Erkrankung assoziiert sind, kann das oben beschriebene EV als diagnostischer Test für die Erkrankung verwendet werden. Dementsprechend können Lymphozyten von einem Individuum, von dem man vermutet, dass es die Krankheit hat oder für die Krankheit suszeptibel ist, über irgendeines der beschriebenen Verfahren hinsichtlich der CD4 T-Lymphozyten-Antwort auf eines oder mehr (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, oder 20) geeignete Peptide getestet werden. Wenn eine signifikante CD4 T-Lymphozyten-Antwort nachgewiesen wird, so ist es wahrscheinlich, dass das Individuum die Erkrankung aufweist oder entwickeln wird. Die Erkrankung kann, beispielsweise, IDDM sein, und die Peptide können abgeleitet sein von, beispielsweise, Insulin, Proinsulin, Preproinsulin, GAD65, IA-2 oder Phogrin. Geeignete Peptide können, beispielsweise, beliebige der unten angegebenen Peptide sein (z. B. solche mit den SEQ ID NOs. 1–42).
  • Darüber hinaus können Peptide, die als mit einer beliebigen der hier angegebenen Erkrankungen (z. B. einer Autoimmunerkrankung wie beispielsweise IDDM, MS oder RA) assoziiert identifiziert wurden, dafür verwendet werden, eine immunologische Toleranz in Lymphozyten (z. B. CD4+ T-Lymphozyten) zu induzieren, die mit der Initiierung, dem Fortschreiten oder den pathologischen Symptomen der Erkrankung assoziiert sind. Die Toleranzinduktion bei diesen Lymphozyten kann brauchbar sein für die Prophylaxe gegen die Erkrankung und/oder die Therapie der Erkrankung. Die Toleranzinduktion kann erreicht werden durch Verabreichung eines geeigneten Peptids an ein Individuum, z. B. ein Individuum, das eine beliebige der hier beschriebenen Autoimmunerkrankungen, z. B. IDDM, MS oder RA, aufweist, oder von dem man vermutet, dass es für eine beliebige der hier beschriebenen Autoimmunerkrankungen, z. B. IDDM, MS oder RA, aufweist, oder für eine beliebige der hier beschriebenen Autoimmunerkrankungen, z. B. IDDM, MS oder RA, suszeptibel ist. Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Peptids bei der Induzierung von Toleranz, Verabreichungsverfahren und -wege, und zu verabreichende Dosen sind im Wesentlichen dieselben wie unten für APL beschrieben. Die Peptide können Fragmente jeder beliebigen, hier offenbarten Polypeptide sein, z. B. Insulin, Proinsulin, Preproinsulin, GAD65, IA-2 oder Phogrin. Sie können, beispielsweise, solche mit den SEQ ID NOs: 1–42 sein.
  • Als Alternative zu dem oben beschriebenen EV können über das IMF identifizierte Peptide auf ihre Fähigkeit zur Bindung an ein geeignetes Klasse-II-MHC-Molekül über dem Fachmann bekannte Verfahren getestet werden, beispielsweise unter Verwendung von isolierten Klasse-II-MHC-Moleküle oder von Zellen, die mit diese kodierenden Nukleinsäuren transfiziert sind. Ein solches Verfahren ist in Beispiel 2 beschrieben. Diese Bindungsassays können auch dafür verwendet werden, die Fähigkeit von Peptiden zur Bindung an alternative Klasse-II-MHC-Moleküle zu testen, d. h. Klasse-II-MHC-Moleküle, die sich von denen unterscheiden, von denen sie unter Verwendung des erfindungsgemäßen IMF-Verfahrens eluiert wurden. Das hier offenbarte diagnostische Verfahren unter Verwendung solcher Peptide und therapeutische Verfahren, die entweder die Peptide oder davon abgeleitete APLs verwenden, können bei Individuen angewendet werden, die solche alternative Klasse-II-MHC-Moleküle exprimieren.
  • 1.3 Erkrankungen und deren Assoziierungen mit Klasse-II-MHC-Genen
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können für die Analyse von Peptiden verwendet werden, die an Erkrankungen beteiligt sind, welche mit der Expression definierter Klasse-II-MHC-Moleküle assoziiert sind und bei denen die Pathologie oder der Schutz auf der Aktion aktivierter CD4+ T-Zellen beruht. Solche Erkrankungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, bestimmte infektiöse Erkrankungen, Krebs und Autoimmunerkrankungen.
  • Ein Beispiel für eine infektiöse Erkrankung, welche die oben angegebenen Kriterien erfüllt, ist Lepra beim Menschen, die durch Mycobacterium leprae verursacht wird. Die Bakterien infizieren periphere Schwann-Zellen und Makrophagen und wachsen darin. Die Erkrankung weist als charakteristisches Merkmal eine unterdrückte zelluläre Immunität, jedoch normale Antikörper-Antworten auf. Lepra wurde assoziiert mit der Expression von DRB1 Klasse-II-MHC-Molekülen, bei denen das Kodon 13 Arg kodiert oder die Kodons 70 und 71 Arg kodieren [Zerva et al., (1996), J. Exp. Med. 183: 829–836]. Weiterhin ist die Fähigkeit zur spontanen Beseitigung von Hepatitis C-Virus mit der Expression von DQB1·0301-Molekülen assoziiert, und, da DQB1·0302 in Hepatitis C-Virus-infizierten Individuen unterrepräsentiert ist, können DQB1·0302 exprimierende Individuen vor einer Infektion mit dem Virus geschützt sein [Cramp et al. (1989), J. Hepatol. 29: 207–213]. Weiterhin erkennen für Melanomzellen spezifische CD4+ T-Zellen, die an der schützenden Antwort gegen malignes Melanom beteiligt sein können, Tyrosinase-Epitope erkennen, die von HLA-DRB1·0401 Klasse-II-MHC-Molekülen präsentiert werden [Topalian et al., (1996), supra]. Weitere Klasse-II-MHC-Molekül-assoziierte Erkrankungen sind oben angegeben.
  • Beispiele für Autoimmunerkrankungen, bei denen die erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, IDDM, rheumatoide Arthritis (RA), Multiple Sklerose (MS), systemischen Lupus erythematosus (SLE), und Myasthenia gravis (MG). RA ist assoziiert mit der Expression von DRB1-Allelen, welche die Motive QKRAA (SEQ ID NO: 53), QRRAA (SEQ ID NO: 54) oder RRRAA (SEQ ID NO: 55) an den Aminosäureresten 70–74 (DRB1·0101, 0401, 0403, 0405) kodieren. MS ist assoziiert mit der Expression von DRB1·1501-, DQA1·0102- und DQB1·0602-Allelen. SLE ist assoziiert mit der Expression von DRB1·03-, DRB1·1501-, DQA1·0501- und DQ61·0602-Allelen. MG ist assoziiert mit der Expression von DR3- und DQ2-Allelen (DQA1·0501-DQB1·0201 und DQA1·0201-DQB1·0201). Autoimmun induzierte Ovarialinsuffizienz ist assoziiert mit DQB1-Genen, die Asp an der Position 57 kodieren. Graves-Thyroiditis, Hashimoto-Thyroiditis und primärer Hypothyroidismus zeigen alle eine schwache Assoziation mit der Expression der DR5- und DR3-Allele. Zöliakie ist assoziiert mit der Expression von HLA-DQA1·0501- und DQB1·0201-Allelen. Primäre Gallenzirrhose ist assoziiert mit der Expression von DRB1·0801-DQA1·0401/0601-DQB1·04-Allelen. Autoimmun-Hepatitis ist assoziiert mit der Expression von DRB3·0101- oder DRB1·0401-Allelen. Addison-Erkrankung ist assoziiert mit der Expression von DRB1·03-, DQA1·0501- und DQB1·0201-Allelen. Vitiligo ist assoziiert mit der Expression von DRB1·0701- und DQ2-Allelen. Antiglomuläre Basalmembran-Erkrankung (Goodpasture's Syndrom) ist assoziiert mit der Expression von DR15- und DR4-Allelen.
  • Man nimmt an, das die Pathologie bei RA, MS und IDDM vorwiegend auf CD4+ T-Zell-abhängige, zellvermittelte Autoimmunantworten zurückzuführen ist, während die Pathologie bei SLE und MG vorwiegend auf CD4+ T-Zelt-abhängigen antikörpervermittelte Autoimmunantworten zurückzuführen ist. Bei RA ist die durch die aktivierten CD4+ T-Zellen induzierte inflammatorische Antwort auf die Gelenk-Synovia fokusiert, bei MS auf neurale Myelinscheiden, und bei IDDM auf β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, die in den Langerhans-Inseln lokalisiert sind. SLE ist eine systemisch Autoimmunerkrankung, die mehrere Organe umfasst. Die bei MG beobachtete Muskelermüdung beruht auf der Bildung von Antikörpern im Patienten, die an den Acetylcholin-Rezeptor in den neuromuskulären Verbindungen binden.
  • 1.3.1 IDDM
  • Diabetes ist ein Syndrom, bei dem die Konzentrationen von Glukose im Blut abnormal hoch sind. Die Konzentrationen von Glukose im Blut werden normalerweise durch die Freisetzung des Hormons Insulin aus β-Zellen kontrolliert, die in den Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse lokalisiert sind. Typ 1-Diabetes (IDDM), die Klasse von Diabetes, die für die vorliegende Erfindung relevant ist, beruht auf der Zerstörung von β-Zellen. Die resultierenden hohen Konzentration von Glukose im Blut führt, falls sie nicht kontrolliert wird, zu Dehydrierung, Säure-/Basen-Störungen im Blut, Gehirnschwellung, Koma und zum Tod. Eine Behandlung mit Injektionen von synthetischem menschlichem Insulin stellt die Glukosekontrolle wieder her. Sobald sie jedoch einmal initiiert wurde, ist diese Behandlung lebenslang erforderlich, da β-Zellen sich nicht regenerieren. Sobald Diabetes einmal etabliert ist, stellt er eine wesentliche Belastung für den Patienten, die Familie des Patienten, und für die Gesellschaft dar. Obwohl moderne Dosierungen und Präparationen von Insulin die Glukose im Blut innerhalb vernünftiger Grenzen halten können, kommt es im Verlauf mehrerer Jahre unvermeidlich zu Komplikationen der Erkrankung. Die häufigsten schweren Komplikationen von Diabetes sind Nierenversagen, Erblinden und Verlust der Nervenfunktion. In entwickelten Ländern ist Diabetes der Haupteinzelgrund für chronisches Nierenversagen, das eine lebenslange Dialyse oder eine Transplantation erforderlich macht. Die Lebensdauer eines Diabetes-Patienten ist durchschnittlich um 10 Jahre verkürzt. Als relativ weit verbreitete Erkrankung (IDDM betrifft 1/200–1/400 der Bevölkerung) verbraucht sie große Ressourcen; es wird geschätzt, dass in den entwickelten Ländern die Kosten der Diabetesbehandlung 8% des Budgets für akute Gesundheitsleistungen beträgt.
  • Angesichts dieses Hintergrunds ist es wichtig zu überlegen, ob es Wege gibt, mit denen verhindert werden kann, dass IDDM sich entwickelt. Erstens verläuft die Zerstörung von β-Zellen über viele Monate oder Jahre, bis es zu wenig Zellen gibt, die Insulin synthetisieren (etwa 10% des Normalwerts), um eine Normoglykämie aufrecht zu erhalten und Diabetes beim Patienten diagnostiziert wird. Wenn der Prozess der Schädigung von β-Zellen aufgehalten werden könnte, würde sich keine IDDM entwickeln. Zweitens ist es mittlerweile möglich, über einfache Bluttest mit einem hohen Empfindlichkeitsgrad (d. h. mit einer hohen „Erfassungsrate") und einer hohen Spezifität (einer niedrigen falsch-positiven Rate) vorherzusagen, wer in der Zukunft Diabetes entwickeln wird. Drittens scheint es so zu sein, dass β-Zellen als Teil einer unbeabsichtigten Immunantwort zerstört werden, in deren Verlauf normale Bestandteile der Zelle (als Autoantigene bezeichnete Proteine) das Ziel einer Autoimmunattacke werden. Mehrere der Haupt-Autoantigene von β-Zellen wurden identifiziert (siehe unten). Eine andere Schlüsseleigenschaft von IDDM ist der starke genetische Einfluss auf die Entwicklung der Erkrankung. Obwohl mehrere Gene beteiligt sind, sind die dominierendsten die Klasse-II-Gene des menschlichen MHC, d. h. die menschlichen Leukozyten-Antigen-(HLA)-Gene. Diese Gene üben eine dominante Kontrolle über die Immunantwort aus, indem sie die Peptidsegmente (Epitope) innerhalb der Autoantigene auswählen, auf die das Immunsystem eines jeweiligen Individuums seinen Angriff fokusiert. Durch Identifizierung dieser Epitope wird es möglich sein, Strategien zu entwickeln, um bei der Entwicklung der Krankheit in einem vorklinischen Stadium einzugreifen. Die vorliegende Erfindung umfasst ein neues Verfahren zur genauen Identifizierung solcher Epitope.
  • Der menschliche HLA-Genkomplex ist der am meisten polymorphe im menschlichen Genom, so dass die Möglichkeit dafür, dass ein Individuum unterschiedliche HLA-Moleküle exprimiert, hoch ist. Jedoch ist in Patienten mit IDDM ein sehr begrenzter Satz der Klasse-II-HLA-Gene stark mit der Entwicklung der Erkrankung assoziiert. Als Ergebnis davon sind, innerhalb einer auf der Basis von Rassenaspekten definierten Population, bestimmte Klasse-II-HLA-Gene bei Diabetikern im Vergleich mit der Gesamtpopulation viel häufiger. Unten angegeben sind Beispiele von HLA-Klasse-II-Genen, die häufiger in IDDM-Patienten aus Nordamerika und Nordeuropa anzutreffen sind, und die deshalb wahrscheinlich einen starken Beitrag zur Entwicklung der Erkrankung leisten:
    Klasse-II HLA-DR-Typen: DRB1·0401, 0405
    Klasse-II HLA-DQ-Typen: DQB1·0302, 0201, 0501;
    DQA1·0501, 0301.
  • Suszeptibilitäts-Genotypen bei Kaukasiern, der schwarzen Bevölkerung, und Japanern sind nachfolgend angegeben:
  • Kaukasier:
    • DRB1·04, DQA1·0301, DQB1·0302 DRB1·04, DQA1·0301, DQB1·0201 DRB1·03, DQA1·0501, DQB1·0201
  • Zusätzliche Suszeptibilitäts-Genotypen bei der schwarzen Bevölkerung:
    • DRB1·09; DRB1·07, DQA1·0301, DQB1·0201
  • Zusätzliche Suszeptibilitäts-Genotypen bei Japanern:
    • DRB1·08, DQA1·0301, DQB1·0302 DRB1·09, DQA1·0301, DQB1·0303
  • Eine wesentliche Frage lautet: Wie unterscheiden sich HLA Klasse-II-Moleküle hinsichtlich ihrer Funktion bei einem Diabetiker mit HLA-DQA1·0301/DQB1·0302 (DQ8) und einem Nicht-Diabetiker mit HLA-DQA1·0102/DQB1·0602 (DQ6), die protektiv für IDDM zu sein scheinen? Es ist bekannt, dass die verschiedenen HLA Klasse-II-Moleküle unterschiedliche Peptidepitope auswählen und den T-Zellrezeptoren präsentieren. Somit ist es wahrscheinlich, dass ein „Diabetes förderndes" HLA Klasse-II-Molekül ein Peptidepitop auf irgendeine Weise auswählt, die eine gefährliche Autoimmunantwort initiiert oder unterstützt.
  • Bei nordamerikanischen und nordeuropäischen IDDM-Patienten ist HLA-DRB1·0401 mäßig mit IDDM assoziiert, während der DRB1·0405-Typ einen stärkeren Einfluss auf die Entwicklung der Erkrankung ausübt. Eine besondere Gruppe von HLA-DQ-Molekülen trägt jedoch zur stärksten Suszeptibilität bei. In dieser Gruppe befinden sich HLA-DQ-Moleküle, die eine α-Polypeptidkette mit der Aminosäure Arginin an Position 52 (arg52α), und eine β-Polypeptidkette mit jeder beliebigen Aminosäure mit Ausnahme von Aspartat an Position 57 (nicht-asp57β) enthalten. Darunter ist eines der am besten charakterisierten HLA-DQ8 (siehe oben), das typischerweise verbunden ist mit HLA DRB1·0401 (d. h. die zwei Gene sind oft zusammen auf demselben Chromosom zu finden). Diese Gene verleihen das höchste Risiko für IDDM [Khalil et al. (1992), Diabetes 41: 378–384]. Es wird geschätzt, dass ein arg52α/nicht-asp57β HLA-DQ-Molekül exprimierendes Individuum, das einen Verwandten ersten Grades mit IDDM hat, ein Risiko von 1:4 hat, selbst IDDM zu entwickeln; dies ist das 100-fache des Risikos der Bevölkerung [Nepom, G. T. (1995), Annu. Rev. Med. 46: 17–25].
  • 1.4 Arten
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können auf Erkrankungen mit den beschriebenen Eigenschaften innerhalb eines breiten Spektums von Säugerarten angewendet werden, z. B. Menschen, nicht-menschlichen Primaten, Pferden, Rindern, Schweinen, Schafen, Ziegen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Meerschweinchen, Hamstern, Ratten und Mäusen. Vorzugsweise werden sie bei Erkrankungen des Menschen angewendet.
  • Es ist beispielsweise bekannt, dass bestimmte Mausstämme für murine Formen von RA, MS, IDDM und SIE suszeptibel sind. Darüber hinaus ist in diesen Mäusen die Suszeptibilität assoziiert mit der Expression bestimmter Klasse-II-MHC-Gene, und der Gewebeschaden beruht auf der Wirkung aktivierter CD4+ T-Zellen oder CD4+ T-Zellabhängiger Antikörper-Antworten. Beispielsweise exprimiert die nicht-adipöse diabetische (NOD) Maus, die für spontanen IDDM suszeptibel ist, das H-2Ag7-Molekül, und die Suszeptibilität der NOD-Mäuse gegenüber IDDM wurde mit dem H-2Ag7-Gen in Verbindung gebracht. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Gewebezerstörung in NOD IDDM durch CD4+ T-Zellen vermittelt wird. Zusätzlich wurde die Suszeptibilität gegenüber Kollagen-induzierter Arthritis (CIA) in Mäusen mit der Expression von H-2Aa-, H-2Ar-, H-2Aw3- und H-2Aw17- Klasse-II-MHC-Molekülen assoziiert, und man nimmt allgemein an, dass die Gelenkpathologie bei CIA von CD4+ T-Lymphozyten vermittelt wird.
  • Was Krebsarten betrifft, so hängen die Retikularzell-Sarkome von SJL-Mäusen hinsichtlich ihres Wachstums von Zytokinen ab, die von aktivierten CD4+ T-Zellen produziert werden, und benötigen die Expression bestimmter Klasse-II-MHC-Moleküle.
  • 1.5 Klasse-II-MHC-Moleküle
  • Klasse-II-MHC-Moleküle wurden in mehreren Säugerarten identifiziert. In einigen dieser Arten wurde die Expression eines bestimmten Klasse-II-MHC-Moleküls mit bestimmten CD4+ T-Zell-vermittelten Erkrankungen assoziiert (siehe oben). Beispielsweise werden beim Menschen die Klasse-II-MHC-Moleküle als HLA-DR, HLA-DQ und HLA-DP bezeichnet, und bei Mäusen als H-2A und H-2E. In allen Arten existieren mehrere Allele jedes Gens.
  • 1.6 Antigen präsentierende Zellen (APC)
  • APCs, die für die erfindungsgemäßen IMF-Verfahren verwendet werden können, sind solche, die oben zur Verwendung beim EV angegeben sind, d. h. B-Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten, dendritische Zellen und, beim Menschen, T-Zellen. Alternativ können immortalisierte Linien solcher Zellen verwendet werden.
  • Liganden, die mit B-Lymhozyten-APCs verwendet werden könnten, umfassen Lectine wie beispielsweise das Pokeweed-Mitogen (PWM); Antikörper (oder funktionale Fragmente von Antikörpern wie beispielsweise Fab-, F(ab')2 oder Fv-Fragmente), die an APC-Oberflächenrezeptoren binden, welche Bestandteile der zellulären Maschinerie für die Internalisierung und Präsentation von Antigen sind, oder die an der Signalübertragung für die Internalisierung von Antigen beteiligt sind, z. B. Komplementrezeptoren (CD21, CD35, CD11b/CD18, CD11c/CD18), der B-Zellrezeptor-Komplex (einschließlich Immunglobulinmoleküle), Mannoserezeptoren, CD19, CD22, CD40, CD20 und CD45; Liganden für die oben angegebenen Rezeptoren auf B-Zellen (z. B. löslicher CD40-Ligand) und weiteren APCs; und vollständige Ig-Moleküle von entweder irrelevanter Spezifität oder mit der Fähigkeit zur Bindung an das PPI oder einen mit dem PPI konjugierten Tag (z. B. ein Peptid oder Hapten), oder Fragmente solcher Moleküle, welche den Fc-Teil umfassen und somit an Fc-Rezeptoren in APC-Zellmembranen binden können.
  • Rezeptoren, an welche die oben genannten Liganden binden können, sind folgende. PWM, das aus Phytolacca americana stammt, bindet an eine Reihe von Kohlenhydrat-Molekülen. Es bindet selektiv an Disulfid-verknüpfte Angehörige der Ig-Familie von Proteinen, z. B. die Oberflächen-Ig-Moleküle, welche die antigenspezifischen Rezeptoren von B-Lymphozyten darstellen. Jedes beliebige Molekül auf der Oberfläche von B-Zellen, an das PWM binden kann, stellt einen Rezeptor für PWM dar. Lectine, die anstelle von PWM verwendet werden könnten, umfassen die folgenden Kohlenhydrat bindenden Moleküle: Erbsen-Lectin, Concanavalin A, Linsen-Lectin, Phytohämagglutinin (PHA) aus Phaseolus vulgaris, Erdnuss-Agglutinin, Sojabohnen-Agglutinin, Ulex europaeus-Agglutinin-I, Dolichos biflorus-Agglutinin, Vicia villosa-Agglutinin und Sophora japonica-Agglutinin. Die Rezeptoren für Antikörper oder Liganden, die APC-Oberflächenrezeptoren binden, sind, per Definition, die Rezeptoren selbst, für welche Beispiele oben angegeben sind. Rezeptoren für Ig-Moleküle irrelevanter Spezifität oder mit der Fähigkeit zur Bindung an das PPI oder an einen Tag, der mit dem PPI konjugiert ist, oder Fragmente solcher Moleküle, die Fc-Teile umfassen, sind Fc-Rezeptoren auf B-Lymphozyten, Makrophagen, und Monozyten.
  • 1.7 Polypeptid-Antigene
  • Polypeptid-Antigene, die mit den IMF-Verfahren verwendet werden können, können solche mit einer bekannten Aminosäuresequenz sein, oder solche, bei denen wenigstens ein Teil der Aminosäuresequenz bekannt ist. Sie können Polypeptide sein, von denen selbst bekannt ist oder vermutet wird, dass sie am Erkrankungsprozess beteiligt sind (z. B. IA-2 bei IDDM), oder sie können aus mikrobiellen Organismen stammen, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie am Erkrankungsprozess beteiligt sind (z. B. M. leprae bei der Lepra). Beispiele für weitere Polypeptid-Antigene umfassen die Kern- und viralen Hüllproteine von Viren wie beispielsweise Hepatitis C-Virus, die Hitzeschock-Proteine von Mycobakterien, und Tyrosinase beim Melanom. Weiterhin kann das Polypeptid-Antigen das Protein voller Länge sein, oder es kann ein Fragment des Proteins sein, von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass es am Erkrankungsprozess beteiligt ist (z. B. der intrazelluläre Teil von IA-2 bei IDDM).
  • Beispiele für Polypeptide, von denen man vermutet, dass sie Autoantigene bei MS (einschließlich muriner experimenteller Autoimmun-Enzephalomyelitis) sind, sind das Myelin-basische Protein (MBP), das Proteolipid-Protein (PLP), das Myelin-Oligodendrozyten-Protein (MOG) und das alpha-B-Kristallin. Kollagen wird für ein Autoantigen bei RA gehalten, der Acetylcholin-Rezeptor bei MG, und Smith-Protein, RNP-Ribonukleoprotein und SS-A- und SS-B-Proteine bei SLE. Weitere Autoimmunerkrankungen und Polypeptide, die als Autoantigene bei deren Genese in Spiel gebracht wurden, sind unten angegeben:
    Autoimmun-Ovarialinsuffizienz: 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase
    Graves-Thyroiditis: Thyroglobulin, Thyroid-Peroxidase, und Thyroidstimulierendes Hormon-Rezeptor
    Hashimoto-Thyroiditis: Thyroglobulin und Thyroid-Peroxidase
    primärer Hypothyroidismus: Thyroglobulin und Thyroid-Peroxidase
    Zöliakie: Transglutaminase
    Primäre Gallenzirrhose: Pyruvat-Dehydrogenase
    Autoimmun-Hepatitis: Cytochrom P4502D6
    Addison-Erkrankung: 21α-Hydroxylase
    Vitiligo: Tyrosinase
    antiglomuläre Basalmembran-Erkrankung (Goodpasture's Syndrom): Typ-IV-Kollagen
    Systemische Sklerose: Scl-70
  • Eine detailliertere Beschreibung von Autoantigenen, von denen man vermutet, dass sie an der IDDM beteiligt sind, wird unten gegeben.
  • Die unangemessene Autoimmunantwort, die zu IDDM führt, richtet sich gegen Proteine in der β-Zelle der Bauchspeicheldrüse. Es gibt mehrere Autoantigene, die mit IDDM assoziiert wurden, von denen 3 als die hauptsächlichen Autoantigene angesehen werden: Insulin/Proinsulin; Glutaminsäuredecarboxylase (65 kD-Isoform; GAD-65); und IA-2. Der Begriff „hauptsächlich" wird hier verwendet, um die Tatsache zu bezeichnen, dass: (a) die meisten (d. h. 80.90%) der IDDM-Patienten eine Immunantwort gegen wenigstens eines dieser 3 richten; und (b) bei der Vorhersage von IDDM bei Individuen mit hohem Risiko eine Immunantwort gegen alle 3 Autoantigen ein sehr hohes Risiko für einen zukünftigen IDDM birgt.
  • Insulin wird anfänglich als Preproinsulin (106 Aminosäuren) synthetisiert, und das aus der Abspaltung der Leader-Sequenz resultierende Protein wird als Proinsulin bezeichnet. Proinsulin (82 Aminosäuren) ist ein einzelnes Polypeptid, das durch 2 intra-Ketten-Disulfidbindungen auf sich selbst zurückgefaltet ist. Die C-Kette (auch als C-Peptid bezeichnet, 31 Aminolsäuren) von Proinsulin wird gespalten, wodurch die sekretierte Form von Insulin erhalten wird, die zwei Ketten (A, 30 Aminosäuren lang, und B, 21 Aminosäure lang) umfasst, welche durch 2 Disulfidbindungen verbunden sind.
  • Spontan auftretende Antikörper gegen Insulin (Insulin-Autoantikörper, IAA) wurden erstmals in unbehandelten, neu mit Diabetes diagnostizierten Patienten im Jahr 1983 identifiziert [Palmer et la., (1983), Science 222: 1337–1339]. Typischerweise weisen 40–50% junger IDDM- oder prä-IDDM-Patienten IAA auf, während diese in Heranwachsenden oder Erwachsenen seltener vorkommen. Es wurde gezeigt, dass Insulin-Autoantikörper gleichermaßen gut mit Insulin des Menschen, des Schweins, des Rindes, der Ratte, des Schafes und des Huhns, jedoch nicht mit isolierten A- oder B-Ketten von Insulin reagieren [Castano, L. und Eisenbarth, G. S. (1990), Annu. Rev. Immunol. 8: 647–79], was nahe legt, dass beide Ketten zur Bildung des Epitops (der Epitope) dieser Autoantikörper beitragen. Neuere Untersuchung lieferten mehr Beweise für die Beteiligung sowohl der A- als auch der B-Kette bei der Bildung der Epitope, wobei nahe gelegt wurde, das eine Sequenz von 6 Aminosäuren in der A-Kette und von 3 Aminosäuren in der B-Kette in den Epitopen enthalten sind, die von den Insulin-Autoantikörpern erkannt werden; diese Region unterscheidet sich von der Insulinrezeptor-Bindungsdomäne [Castano et al., (1983), Diabetes 42: 1202–1209]. Autoantikörper gegen Proinsulin können in 22% prä-diabetischer Patienten vor dem Ausbruch von Typ 1-Diabetes nachgewiesen werden [Kuglin et al. (1990), Diabet. Med. 7: 310–314].
  • Baekkeskov und seine Mitarbeiter zeigten, dass mehr als 80% neu diagnostizierter diabetischer Kinder Autoantikörper gegen ein β-Zell-Autoantigen mit einer relativen molekularen Masse von 64 kDa aufwiesen [Baekkeskov et al. (1982), Nature 298: 167–169], und Autoantikörper lagen auch in Verwandten mit einem hohen Risiko für einen zukünftigen Ausbruch von Diabetes vor [Baekkeskov et al. (1987), J. Clin. Invest. 79: 926–934; Atkinson et al., (1990), Lancet 335: 1357–60]. Die molekulare Identifizierung des 64 kDa-Antigens als GAD erfolgte im Jahr 1990 [Baekkeskov et al. 1990), Nature 347: 151–156]. GAD ist ein Enzym, das an der Synthese des inhibitorischen Neurotransmitters γ-Aminobuttersäure beteiligt ist und möglicherweise eine Rolle im Signalweg für die Freisetzung von Insulin spielt. Es gibt zwei Isoformen des Enzyms: GAD65 und GAD67. Der bei weitem hauptsächlich vorliegende Vertreter in Langerhans-Inseln des Menschen ist GAD65.
  • Autoantikörper gegen GAD65 liegen im Serum von 70–80% der Patienten vor, bei denen IDDM neu ausbricht [Petersen et al. (1994), Diabetes 43: 459–467]. Wie IAA sind GAD-Autoantikörper ein früher Marker für die Vorhersage der Erkrankung, die mit einem hohen Risiko für die Entwicklung von IDDM assoziiert sind. Sie liegen in mehr als 80% der Individuen vor, für die aufgrund ihrer Familiengeschichte und des Vorliegens von Immunmarkern ein hohes Risiko bekannt ist [De Aizpurua et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 9841–9845; Seissler et al. (1993), J. Clin. Invest. 92: 1394–1399].
  • In frühen Immunpräzipitationsexperimenten führte eine milde Trypsinbehandlung eines 64 kDa-Proteins von Insel-Zellen zur Bildung von 40 kDA- und 37 kDa-Proteinfragmenten, die in den Seren von Patienten mit IDDM vorkommende Autoantikörper binden [Christie et al. (1990), J. Exp. Med. 172: 789–794]. Als wichtigster Aspekt wurde gezeigt, dass diese Fragmente eine hohe Vorhersagekraft für IDDM in gefährdeten Individuen hatten [Christie et al. (1994), Diabetes 43: 1254–1259]. Die molekularen Ziele dieser Autoantikörper wurden nun identifiziert. Das 40 kDa-Fragment ist ein Bestandteil von IA-2, das in zu Verwirrung führender Weise auch als ICA512 bezeichnet wird [Payton et al. (1995), J. Clin. Invest. 96: 1506–1511; Bonifacio et al. (1995), J. Immunol. 155: 5419–5426; und Rabin et al. (1994), J. Immunol. 152: 3183–3188]. Anschließend wurde das 37 kDa-Fragment als Phogrin (IA-2β) identifiziert, eine Tyrosinphosphatase, die eine Homologie von 85% zu IA-2 aufweist. Autoantikörper gegen IA-2 und Phogrin tauchen während der prädiabetischen Phase auf [Bonifacio et al. (1998), J. Immunol. 161: 2648–2654] und haben eine hohe Vorhersagekraft hinsichtlich der Entwicklung von IDDM in Risiko-Individuen. IA-2 wird als ein großes Protein mit 106 kDa synthetisiert, das eine intrazelluläre Domäne an den Resten 603–1055 aufweist. Die extrazelluläre Domäne von IA-2 ist das Ziel fast der gesamten Autoantikörper-Reaktivität gegen IA-2 [Kawasaki et al. (1997), J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 375–80].
  • 2. Peptide
  • Hier offenbarte Peptide umfassen Peptide, die an Klasse-II-MHC-Moleküle binden und CD4+ T-Zellen aktivieren, welche am Erkrankungsprozess oder am Schutz vor einer Erkrankung beteiligt sind. Das Klasse-II-MHC-Molekül kann ein Klasse-II-MHC-Molekül sein, das mit hoher Suszeptibilität auf oder mit Widerstandskraft gegen eine Erkrankung assoziiert ist. Erkrankungen können beliebige der hier angesprochenen Erkrankungen sein, und die Art, von der die Peptide erhalten werden, können beliebige der hier angesprochenen Arten sein. Die Klasse-II-MHC-Moleküle sind vorzugsweise menschliche Klasse-II-HLA-Moleküle, d. h. DR-, DP- oder DQ-Moleküle. Es kann sich dabei beispielsweise um Peptide handeln, die an DR4- oder DR8-Moleküle binden. Die Polypeptide, von denen die Peptide abgeleitet sind, können beliebige der hier angesprochenen sein. Die Peptide weisen im Allgemeinen eine Länge von 9 bis 30 (z. B. 13 bis 25) Aminosäuren auf. Polypeptide und Klasse-II-MHC-Moleküle können von jeder der hier aufgeführten Arten stammen, und die Erkrankung kann eine Erkrankung jeder dieser Arten sein.
  • Die Peptide können beispielsweise von IA-2 abgeleitet sein und and HLA-DR4-Moleküle binden. Die Peptide können beispielsweise jedes der folgenden Peptide sein:
    VSSQFSDAAQASPSS (SEQ ID NO: 1); SVSSQFSDAAQASPS (SEQ ID NO: 2); SSVSSQFSDAAQASP (SEQ ID NO: 3); SVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 4); SRVSSVSSQFSDAAQASPSSHSST (SEQ ID NO: 5); SVSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWC (SEQ ID NO: 6); VSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWCE (SEQ ID NO: 7), VSSVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 8), TQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 9); YLKNVQTQETRTL (SEQ ID NO: 10); VQTQETRTLTQFHT (SEQ ID NO: 11); LKNVQTQETRTLTQTF (SEQ ID NO: 12); YLKNVQTQETRTLTQ (SEQ ID NO: 13); KNVQTQETRTLTQFH (SEQ ID NO: 14); SFYLKNVQTQETRTLTQFH (SEQ ID NO: 15); FYLKNVQTQETRTLTQFHF (SEQ ID NO: 16); AYQAEPNTCATAQ (SEQ ID NO: 17); LCAYQAEPNTCATAQC (SEQ ID NO: 18); LAKEWQALCAYQAEPNT (SEQ ID NO: 19); AYQAEPNTCATAQGEGNIK (SEQ ID NO: 20); WQALCAYQAEPNTCATAQ (SEQ ID NO: 21); LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (SEQ ID NO: 22); GCTVIVMLTPLVED (SEQ ID NO: 23); CTVIVMLTPLVEDG (SEQ ID NO: 24); ESGCTVIVMLTPLVEDG (SEQ ID NO: 25); MVWESGCTVIVMLTPL (SEQ ID NO: 26); SGCTVIVMLTPLVEDGVK (SEQ ID NO: 27); ESGCTVIVMLTPLVEDGV (SEQ ID NO: 28); WQMVWESGCTVIVMLT (SEQ ID NO: 29); DFWQMVWESGCTVIVMLT (SEQ ID NO: 30); FWQMVWESGCTVIVMLTPLV (SEQ ID NO: 31); MVWESGCTVIVMLTPLVEDGV (SEQ ID NO: 32); DQFEFALTAVAEE (SEQ ID NO: 33); DQFEFALTAVAEEVNAI (SEQ ID NO: 34); FEFALTAVAEEVNAILKA (SEQ ID NO: 35); SKDQFEFALTAVAEEVNA (SEQ ID NO: 36); SKDQFEFALTAVAEEVNAILK (SEQ ID NO: 37); KVESSPSRSDYI (SEQ ID NO: 38); LKVESSPSRSDY (SEQ ID NO: 39); KLKVESSPSRSDYINAS (SEQ ID NO: 40); KVESSPSRSDYINASPIIEHDP (SEQ ID NO: 41); und LKVESSPSRSDYINASPII (SEQ ID NO: 42).
  • Die Peptide können unter Verwendung der beschriebenen IMF-Verfahren hergestellt werden. Kleinere Peptide (mit einer Länge von weniger als 50 Aminosäuren) können auf einfache Weise über übliche chemische Mittel synthetisiert werden. Weiterhin können sowohl Polypeptide als auch Peptide über übliche in vitro-Techniken rekombinanter DNA, synthetische Techniken, und in vivo-Rekombination/genetische Rekombination, unter Verwendung der die jeweiligen Polypeptide oder Peptide kodierenden Nukleotidsequenzen, hergestellt werden. Verfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, können für die Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die relevante kodierende Sequenzen und geeignete Kontrollsignale für Transkription/Translation enthalten. Siehe beispielsweise die Techniken, die beschrieben sind in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual [Cold Spring Harbor Laborstory, N. Y., 1989], und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, [Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., 1989].
  • Eine Vielzahl von Wirts-Expressionsvektor-Systemen kann für die Expression der Peptide und Polypeptide verwendet werden. Solche Wirts-Expressionsysteme stellen Vehikel dar, über welche die Polypeptide von Interesse hergestellt und anschließend aufgereinigt werden können, sie stellen jedoch auch Zellen dar, welche die entsprechenden Peptide oder Polypeptide in situ herstellen können, wenn sie mit den geeigneten kodierenden Nukleotidsequenzen transformiert oder transfiziert sind. Diese umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, z. B. E. coli oder B. subtilis, die transformiert sind mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA-, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, die TR1-41-Peptid-kodierende Sequenzen enthalten; Hefe, z. B. Saccharomyces oder Pichia, transformiert mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren, welche die geeigneten kodierenden Sequenzen enthalten; Insektenzell-Systemen, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren infiziert sind, z. B. Baculovirus; Pflanzenzell-Systemen, die mit rekombinanten Virusexpressionssystemen infiziert sind, z. B. Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) oder Tabakmosaikvirus (TMV), oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren transformiert sind, z. B. Ti-Plasmiden, welche die geeigneten kodierenden Sequenzen enthalten; oder Säuger-Zellsysteme, z. B. COS, CHO, BHK, 293 oder 3T3, welche rekombinante Expressionskonstrukte tragen, die Promotoren enthalten, die abgeleitet sind aus dem Genom von Säugerzellen, z. B. Metallothionein-Promotor, oder aus Säuger-Viren, z. B. den späten Adenovirus-Promotor oder den Vacciniavirus-7,5K-Promotor.
  • 3. APL
  • Ein veränderter Peptidligand (APL) ist ein variantes Peptid, bei dem 1–6 (d. h. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6) Aminosäurereste eines Wildtyp-Ausgangspeptids, das eine Antwort bei CD4+ T-Zellen aktiviert, verändert wurden. In einem APL können weniger als 50%, weniger als 40%, weniger als 30%, weniger als 25%, weniger als 20%, weniger als 15%, weniger als 10%, oder weniger als 5% der Aminosäurereste des vorliegenden Wildtyp-Peptids verändert sein. Dementsprechend sind beispielsweise ein einem APL, der von einem Wildtyp-Peptid mit einer Länge von 20 Aminosäuren abgeleitet ist und sich vom Wildtyp-Peptid in 6 Positionen unterscheidet, 30% der Aminosäuren des Wildtyp-Peptids verändert. Alternativ sind in einem APL, der von einem Wildtyp-Peptid mit einer Länge von 15 Aminosäure abgeleitet ist und sich von dem Wildtyp-Peptid in 3 Positionen unterscheidet, 20% der Aminosäuren des Wildtyp-Peptids verändert.
  • Ein APL behält wenigstens eine gewisse Fähigkeit bei zur Bindung an das Klasse-II-MHC-Molekül, an welches das Ausgangspeptid bindet, und wenigstens eine gewisse Fähigkeit dafür, von dem (den) antigenspezifischen T-Lymphozyten-Rezeptoren) der CD4+ T-Zelle(n), welche das an das geeignete Klasse-II-MHC-Molekül gebundene Ausgangspeptid erkennt (erkennen), gebunden zu werden. Der APL aktiviert jedoch eine Antwort in den CD4+ T-Zellen, die sich qualitativ von der durch das Ausgangspeptid aktivierten Antwort unterscheidet. Wenn das Ausgangspeptid beispielsweise eine Helfer-T-Zell-1-Typ (Th1-Typ)-Antwort aktivieren kann, bei der die Zytokine Interleukin-2 (IL-2), Interferon-γ (IFN-γ), und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) von den aktivierten CD4+ T-Zellen produziert werden, so könnte ein von diesem Ausgangspeptid abgeleiteter APL stattdessen eine Helfer-T-Zell-2-Typ-(Th2-)-Antwort in den CD4+ T-Zellen aktivieren. Bei einer Th2-Antwort werden die Zytokine Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), und Interleukin-10 (IL-10) von den aktivierten CD4+ T-Zellen produziert. Wenn alternativ ein bestimmtes Ausgangspeptid eine Th2-Antwort in einer bestimmten CD4+ T-Zelle auslöst, so könnte ein vom Ausgangspeptid abgeleiteter APL eine Th1-Antwort in der T-Zelle aktivieren. Für einige APLs wurde gezeigt, dass sie eine Th1-Antwort in eine Th0-Antwort umschalten, bei der sowohl Zytokine vom Th1-Typ als auch Zytokine vom Th2-Typ produziert werden. Weiterhin könnte ein APL eine CD4+ T-Zell-Antwort hin zu einer Th3-Typ-Antwort umleiten, bei der das überwiegend produzierte Zytokin transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β) ist. Von TGF-β wurde gezeigt, dass er ein breites Spektrum von Immunantworten supprimiert.
  • Im Allgemeinen sind Th1-Antworten mit zellvermittelten Immunantworten und Th2-Antworten mit antikörpervermittelten (d. h. B-Zell-vermittelten) Immunantworten assoziiert. Dementsprechend bestimmt die relative Anzahl von CD4+ T-Zellen, die auf eine Th1-Typ-Weise, gegenübergestellt einer Th2-Typ-Weise, antwortet, die Natur (zellvermittelt im Gegensatz zu antikörpervermittelt) der Immunantwort, die von einem Antigen in einem bestimmten Individuum hervorgerufen wird.
  • Es wurde gezeigt, dass einige Zustände, und insbesondere Autoimmunerkrankungen (z. B. RA, IDDM, und MS) auf zellulären Immunantworten beruhen und somit von Th1 CD4+ T-Zell-Antworten abhängen. Für andere Erkrankungen (z. B. MG und SIE) wurde gezeigt, dass sie von Antikörperantworten (d. h. B-Zell-Antworten) vermittelt werden, und somit von Th2 CD4+ T-Zell-Antworten abhängen. Dementsprechend kann ein APL, der dazu dient, eine CD4+ T-Zell-Antwort von einer Th1- zu einer Th2-Antwort umzuleiten, brauchbar sein bei der Behandlung oder Vorbeugung der ersten Kategorie von Erkrankungen, und ein APL, der dazu dient, eine CD4+ T-Zell-Antwort in eine Richtung von Th2 zu Th1 umzuleiten, brauchbar sein bei der Behandlung oder Vorbeugung der zweiten Kategorie von Erkrankungen.
  • Die Aminosäuresubstitutionen bei APLs können radikaler Natur sein. Beispielsweise kann eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette (z. B. Lysin) durch eine Aminosäure mit einer negativ geladenen Seitenkette (z. B. Asparaginsäure) oder einer hydrophoben Seitenkette (z. B. Isoleucin) ersetzt werden und umgekehrt. Weiterhin kann eine Aminosäure mit sperriger Seitenkette (z. B. Tryptophan) durch eine Aminosäure mit kleiner Seitenkette (z. B. Glycin oder Alanin) ersetzt werden und umgekehrt. Alternativ können die Substitutionen konservativer Natur sein. Beispielsweise kann eine negativ geladene Aminosäure durch eine andere negativ geladene Aminosäure ersetzt werden (z. B. Asparaginsäure durch Glutaminsäure), oder eine hydrophobe Aminosäure durch eine andere hydrophobe Aminosäure (z. B. Leucin durch Valin oder Isoleucin).
  • Verfahren zum Testen, ob ein bestimmter APL überwiegend eine Th1-, Th2-, Th3- oder Th0-Antwort auslöst, sind dem Fachmann bekannt. Kurz beschrieben kann ein APL von Interesse über eine Vielzahl von Wegen, z. B. intramuskulär, intravenös, subkutan, intradermal, intraperitoneal, intrarektal, intravaginal, intranasal, intragastrisch, intratracheal, oder intrapulmonal, einem Testindividuum (z. B. einer Maus), das ein Klasse-II-MHC-Molekül von Interesse exprimiert (z. B. ein menschliches Klasse-II-MHC-Molekül), verabreicht werden. Weiterhin kann die Verabreichung oral oder transdermal erfolgen, wobei ein Durchdringungsmittel wie beispielsweise ein Gallensalz, Fusidinsäure oder ein anderes Detergens verwendet wird. Die Injektionen können einzelne oder mehrfache (z. B. 2-, 3-, 4-, 6-, 8- oder 10-fache) Injektionen sein. Das Peptid kann in einer physiologisch akzeptablen Lösung (z. B. einer Kochsalzlösung) verabreicht werden, und kann mit oder ohne ein Adjuvans (z. B. Freund's komplettes oder unvollständiges Adjuvans oder Cholera-Toxin) verabreicht werden. Nach der Immunisierung kann das Tier mit dem APL stimuliert werden, entweder in vivo oder in vitro, wobei Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, und die Konzentrationen einzelner produzierter Zytokine können gemessen werden. Im Fall einer in vivo-Stimulierung kann das Zytokin, das in das Blut oder in eine andere Körperflüssigkeit (z. B. Urin, Speichel, oder Samen) oder eine Lavage (z. B. nasale, pulmonale, rektale, gastrische oder vaginale Lavage) sezerniert wird, gemessen werden. Alternativ können lymphatische Zellen nach der Stimulierung aus dem Tier isoliert werden und die Konzentrationen von Zytokinen, die von den Zellen produziert werden, können getestet werden, z. B. durch Kultivierung und Messung von Zytokinkonzentrationen im Kulturüberstand durch z. B. ELISA. Isolierte lymphatische Zellen können auch über Assays wie beispielsweise den ELISPOT-Assay oder über Fluoreszenzanalyse nach intrazellulärer Färbung mit einem oder mehreren Zytokin bindenden Antikörpern, von denen jeder mit einem unterschiedlichen Fluorophor konjugiert ist, das Licht einer bestimmten Wellenlänge emittiert, mit Hinblick auf die relative Anzahl von Zellen, welche die Zytokine produzieren, getestet werden. Fluorophore, die bei verschiedenen Wellenlängen (d. h. Farben) fluoreszieren, sind dem Fachmann bekannt. Unter Verwendung solcher Fluoreszenzassays ist es möglich, das Spektrum von Zytokinen, die von einer einzelnen Zelle produziert werden, zu bestimmen. Wenn die lymphatische Zellen in vitro stimuliert werden, können Assays wie beispielsweise der ELISPOT-Assay oder der ELISA ebenfalls verwendet werden. Sollte die Immunisierung und die Stimulierung mit einem APL zu relativ niedrigen Konzentrationen von IL-2, IFN-γ, und TNF-α und zu relativ hohen Konzentrationen von IL-4, IL-5, und I1-10 führen, während die Immunisierung und Stimulierung mit dem Ausgangspeptid zu einem umgekehrten Muster führt, so würde die Schlussfolgerung lauten, dass der APL dafür brauchbar ist, eine Antwort von einem Th1-Muster der Zytokin-Produktion auf ein Th2-Muster der Zytokin-Produktion umzuschalten. Wenn die Th1-Antwort pathogen ist, kann die Behandlung mit dem APL therapeutisch oder prophylaktisch sein. In ähnlicher Weise können APLs und deren Ausgangspeptide auf ihre relativen Fähigkeiten getestet werden, eine Antwort von einem Th2-Typ hin zu einem Th1-Typ, oder von einem Th1-Typ hin zu einem Th0- oder einem Th3-Typ zu verschieben.
  • APLs können auch über jedes beliebige der Protokolle bei menschlichen Freiwilligen getestet werden. Alternativ könnten lymphatische Zellen aus einem Individuum (z. B. einem Menschen) isoliert in vitro sowohl immunisiert als auch stimuliert werden. Weiterhin können APLs „SCID-Hu"-Mäusen verabreicht werden, bei denen es sich um Mäuse handelt, die hinsichtlich muriner T- und B-Lymphozyten genetisch defizient sind und mit menschlichen lymphatischen Zellen rekonstituiert sind. Aufgrund der inhärenten immunologischen Defizienz in diesen Tieren werden die menschlichen lymphatischen Zellen nicht abgestoßen und lassen sich einpflanzen. Nach Immunisierung und Stimulierung dieser Mäuse mit einem APL (unter Verwendung irgendeiner der oben beschriebenen Vorgehensweisen) können deren Zytokin-Antworten über irgendeines der oben beschriebenen Verfahren gemessen werden. Um sicherzustellen, dass die in den Assays nachgewiesenen Zytokine menschlichen Ursprungs sind, können Reagenzien, die für die menschliche Art spezifisch sind (z. B. Antikörper) für die Assays (z. B. ELISA oder ELISPOT) verwendet werden. Um auszuschließen, dass der APL menschlichen CD4+ T-Zellen durch murine Klasse-II-MHC-Moleküle präsentiert wird, könnten weiterhin SCID-Mäuse mit Klasse-II-MHC-„knockout"-Mäusen gekreuzt werden, um Mäuse zu erzeugen, die sowohl hinsichtlich Lymphozyten als auch Klasse-II-MHC-Moleküle defizient sind. Durch Rekonstituieren der erhaltenen Mäuse mit menschlichen lymphatischen Zellen wird eine SCID-Hu-Maus bereitgestellt, in der im Wesentlichen die einzigen CD4+ T-Zellen, die zur Antwort in der Lage sind, menschliche CD4+ T-Zellen sind, und die einzigen Klasse-II-MHC-Moleküle, die zur Präsentation des APL in der Lage sind, menschliche Klasse-II-MHC-Moleküle auf der Oberfläche von menschlichen lymphatischen Zellen sind. Alternativ könnte der Empfänger von menschlichen Lymphzellen lymphatischen Zellen eine Hybridmaus sein, die abgeleitet ist durch Kreuzen von SCID-Mäusen mit DR- (z. B. DR4) oder DQ- (z. B. DQ8) transgenen Mäusen, die in einem Klasse-II-MHC-knockout-Hintergrund hergestellt sind. Die einzigen vorliegenden Klasse-II-MHC-Moleküle wären wiederum die menschlichen DR- oder DQ-Moleküle, die von den transgenen Elternmäusen beigesteuert sind.
  • RAG-1-defiziente Mäuse können anstelle der SCID-Mäuse für die Erzeugung der beschriebenen Mensch-Maus-chimären Tiere verwendet werden. RAG-1-defiziente Mäusen fehlen, wie auch SCID-Mäusen, T- und B-Lymphozyten, sie weisen jedoch den Vorteil auf, dass die relevante Mutation nicht „leaky” ist. Während SCID-Mäuse spät in ihrem Leben eine geringe Anzahl von Lymphozyten hervorbringen können, kann dies somit in RAG-1-defizienten Mäusen nicht vorkommen.
  • Der APL kann über ein beliebiges der oben für Peptide und Polypeptide beschriebenen Verfahren erhalten werden. APLs umfassen weiterhin die oben beschriebenen, die jedoch für die Verwendung in vivo modifiziert sind durch das Hinzufügen eines blockierenden Agens, entweder an einem der Amino- oder Carboxyl-ständigen Enden oder an beiden, um das Überleben des jeweiligen Peptids in vivo zu erleichtern. Dies kann nützlich sein in solchen Situationen, in denen ein Neigung dafür besteht, dass die Peptidenden vor der zellulären oder mitochondrialen Aufnahme durch Proteasen abgebaut werden. Solche blockierenden Agenzien können, ohne darauf beschränkt zu sein, zusätzliche verwandte oder nicht verwandte Peptidsequenzen umfassen, die an den Resten am Amino- und/oder Carboxylende des zu verabreichenden Peptids angehängt sind. Dies kann entweder chemisch während der Synthese des Peptids oder durch rekombinante DNA-Technologie über Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann geläufig sind, erfolgen.
  • Alternativ können blockierende Agenzien wie beispielsweise Pyroglutaminsäure oder andere dem Fachmann bekannte Moleküle an die Reste am Amino- und/oder Carboxylende angehängt werden, oder die Aminogruppe am Amino-Terminus oder die Carboxylgruppe am Carboxyl-Terminus kann durch eine unterschiedliche Gruppe ersetzt werden. Die Peptide können gleichermaßen vor der Verabreichung kovalent oder nicht-kovalent mit pharmazeutisch akzeptablen „Träger"-Proteinen gekoppelt werden.
  • Ebenfalls von Interesse sind peptidomimetische Verbindungen, die auf der Grundlage der Aminosäuresequenzen des APL entworfen sind. Peptidomimetische Verbindungen sind synthetische Verbindungen mit einer dreidimensionalen Konformation (d. h. einem „Peptidmotiv"), die im Wesentlichen die gleiche ist wie die dreidimensionale Konformation eines ausgewählten Peptids. Das Peptidmotiv verleiht der peptidomimetischen Verbindung die Fähigkeit, CD4+ T-Zellen auf eine Weise zu aktivieren, die qualitativ identisch ist zu der des APL, von dem das Peptidomimetikum abgeleitet wurde. Peptidomimetische Verbindungen können zusätzliche Eigenschaften aufweisen, die ihre therapeutische Brauchbarkeit erhöhen, beispielsweise eine gesteigerte Zellpermeabilität und einer verlängerte biologische Halbwertszeit.
  • Die Peptidomimetika weisen typischerweise ein Rückgrat auf, das teilweise oder vollständig nicht-peptidischer Natur ist, jedoch Seitengruppen hat, die identisch sind zu den Seitengruppen der Aminosäurereste, die in dem Peptid vorkommen, das die Grundlage für das Peptidomimetikum bildet. Dem Fachmann sind mehrere Arten von chemischen Bindungen, z. B. Ester-, Thioester-, Thioamid-, Retroamid, reduzierte Carbonyl-, Dimethylen- und Ketomethylenbindungen, als im Allgemeinen brauchbarer Ersatz für Peptidbindungen bei der Konstruktion von proteaseresistenten Peptidomimetika bekannt.
  • 4. Therapieverfahren unter Verwendung von APL
  • Ein APL mit der Fähigkeit, eine Zytokin-Antwort in CD4+ T-Zellen auszulösen, die nicht-pathogen und/oder suppressiv in Bezug auf eine durch das Ausgangspeptid des APL ausgelöste CD4+ T-Zell-Zytokin-Antwort ist, könnte brauchbar sein bei der Therapie, Linderung oder Prophylaxe einer Erkrankung, die versacht wird durch die pathogene CD4+ T-Lymphozyten-Antwort gegen das Ausgangspeptid.
  • Wenn beispielsweise das „Peptid x" eine starke diabetogene Antwort vom Th1-Typ in CD4+ T-Zellen in einem Patienten mit einem HLA-DR4, DQ8-Haplotyp auslöst, so kann die Behandlung des Patienten mit einem vom Peptid x abgeleiteten APL, der eine Th2 CD4+ T-Zell-Antwort auslöst, in diesem Patienten therapeutisch oder lindern wirken. Alternativ könnte, falls der Patient prä-diabetisch ist, eine Behandlung mit dem APL das Einsetzen einer klinischen Erkrankung verhindern oder verzögern.
  • Diese Verfahren fallen in 2 grundlegende Klassen, d. h. solche, bei denen in vivo-Ansätze verwendet werden, und solche, bei denen ex vivo-Ansätze verwendet werden.
  • 4.1 In vivo-Ansätze
  • Bei einem in vivo-Ansatz wird der APL (Peptid oder Peptidomimetikum) selbst dem Individuum über einen der oben aufgeführten Wege verabreicht. Vorzugsweise wird er direkt an ein lymphatisches Gewebe (z. B. Milz, Lymphknoten, oder Mukosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe (MALT) gebracht.
  • Die erforderliche Dosierung hängt ab von der Wahl des APL, dem Verabreichungsweg, der Art der Formulierung, der Art der Erkrankung des Patienten, und der Einschätzung des behandelnden Arztes. Geeignete Dosierungen liegen im Bereich von 0,1–100,0 μg/kg. Angesichts der Vielzahl von verfügbaren APLs und den unterschiedlichen Wirksamkeiten verschiedener Verabreichungswege sind große Variationen mit Hinblick auf die erforderlichen Dosierungen zu erwarten. Beispielsweise wäre zu erwarten, dass bei einer oralen Verabreichung höhere Dosierungen erforderlich sind als bei i. v.-Injektion. Wie dem Fachmann geläufig ist, können Variationen dieser Dosierungsgrade unter Verwendung üblicher empirischer Routinemaßnahmen für die Optimierung erfolgen.
  • Alternativ kann ein Polynukleotid, das ein den APL kodierendes „Minigen" enthält, einer geeignete Zelle des Tieres verabreicht werden. Die Expression des Minigens wird vorzugsweise auf das lymphatische Gewebe des Individuums gerichtet sein, beispielsweise durch Transport des Polynukleotids zum lymphatischen Gewebe. Dies kann beispielsweise erreicht werden durch die Verwendung eines polymeren, biologisch abbaubaren Mikropartikel- oder Mikrokapsel-Transportvehikels, das hinsichtlich seiner Größe so gestaltet ist, dass die Phagozytose durch phagozytische Zellen wie beispielsweise Makrophagen optimiert ist. Beispielsweise können PLGA-Mikropartikel (Poly-lacto-co-glycolid-Mikropartikel) mit einem Durchmesser von etwa 1–10 μm verwendet werden. Das Polynukleotid ist in diesen Mikropartikeln eingekapselt, die von den Makrophagen aufgenommen und in der Zelle allmählich abgebaut werden, wodurch das Polynukleotid freigesetzt wird. Sobald die DNA freigesetzt ist, wird sie in der Zelle exprimiert. Eine zweite Art von Mikropartikel ist dafür gedacht, nicht von der Zelle direkt aufgenommen zu werden, sondern vielmehr in erster Linie als Reservoir mit langsamer Freisetzung von Nukleinsäure zu dienen, die von Zellen nur nach Freisetzung aus dem Mikropartikel durch biologischen Abbau aufgenommen wird. Diese polymeren Partikel sollten deshalb groß genug sein, um eine Phagozytose auszuschließen (d. h. größer als 5 μm und vorzugsweise größer als 20 μm). Mikropartikel, die für den Transport von Nukleinsäure brauchbar sind, Verfahren zu deren Herstellung, und Verfahren zu deren Verwendung sind detaillierter beschrieben im US-Patent Nr. 5,783,567 .
  • Ein weiterer Weg für das Erreichen einer Aufnahme durch APCs besteht in der Verwendung von Liposomen, die über Standardverfahren hergestellt sind. Die Vektoren können in diese Transportvehikel alleine oder zusammen mit gewebespezifischen Antikörpern eingebaut werden. Alternativ kann ein molekulares Konjugat hergestellt werden, das aus einem Plasmid oder einem anderen Vektor zusammengesetzt ist, das über elektrostatische oder kovalente Kräfte mit Poly-L-Lysin verbunden ist. Poly-L-Lysin bindet an einen Liganden, der an einen Rezeptor an Zielzellen binden kann [Cristiano et al. (1995), J. Mol. Med. 73: 479]. Alternativ kann ein für das lymphatische Gewebe spezifisches Ansteuern durch Verwendung von für lymphatisches Gewebe spezifischen, transkriptionalen, regulatorischen Elementen (TRE), wie beispielsweise für B-Lymphozyten-, für T-Lymphozyten, oder, optimalerweise, für dendritische Zellen spezifische TREs, erreicht werden. Für lymphatisches Gewebe spezifische TREs sind bekannt [Thompson et al., (1992), Mol. Cell. Biol. 12: 1043–1053; Todd et al., (1993), J. Exp. Med. 177: 1663–1674; Penix et al. (1993), J. Exp. Med. 178: 1483–1496].
  • Bei den jeweiligen Polynukleotiden (z. B. Expressionsvektoren) ist die Nukleinsäuresequenz, die einen APL von Interesse mit einem Initiations-Methionin und optional mit einer Sequenz zur Weiterleitung kodiert, mit einer Promotor- oder Enhancer-Promotor-Kombination operativ verknüpft.
  • Kurze Aminosäuresequenzen können als Signale fungieren, um Proteine zu bestimmten intrazellulären Kompartimenten zu leiten. Beispielsweise sind hydrophobe Signalpeptide (z. B. MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA (SEQ ID NO: 43)) am Amino-Terminus von Proteinen zu finden, deren Bestimmung das ER ist. Während bekannt ist, dass die Sequenz KFERQ (SEQ ID NO: 44) (und weitere nahe verwandte Sequenzen) intrazelluläre Proteine zu Lysosomen leiten, leiten andere Sequenzen (z. B. MDDQRDLISNNEQLP (SEQ ID NO: 45) Ziel-Polypeptide zu Endosomen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Peptidsequenz KDEL (SEQ ID NO: 46) als Retentionssignal für das ER fungiert. Jedes dieser Signalpeptide, oder eine Kombination davon, kann verwendet werden, um eine Weiterleitung des erfindungsgemäßen APL je nach Wunsch herbeizuführen. Beispielsweise würde ein Konstrukt, das einen bestimmten APL, der mit einem zum ER leitenden Signalpeptid verknüpft ist, das Peptid zum ER leiten, wo es bei dessen Zusammenbau an das Klasse-II-MHC-Molekül binden würde, wodurch die Bindung einer intakten Invarianten Kette (li), die für die Weiterleitung wesentlich ist, verhindert wird. Alternativ kann ein Konstrukt hergestellt werden, bei dem ein ER-Retentionssignal auf dem APL dazu beitragen würde zu verhindern, dass das Klasse-II-MHC-Molekül das ER jemals verlassen würde. Wenn stattdessen ein erfindungsgemäßer APL zum endosomalen Kompartiment geleitet wird, würde dadurch sichergestellt werden, dass große Mengen des APL bei Ersatz durch prozessierte Peptide vorliegen, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht würde, dass das in den Klasse-II-MHC-Komplex eingebaute Peptid der APL und nicht ein anderes, natürlicherweise vorkommendes, irrelevantes Peptid ist. Die Wahrscheinlichkeit dafür, dass ein APL für den Einbau in Klasse-II-MHC verfügbar ist, kann durch Verknüpfen des APL mit einer intakten li-Polypeptid-Sequenz gesteigert werden. Da bekannt ist, dass li Klasse-II-MHC-Moleküle zu den Endosomen leitet, würde das Hybrid-li ein oder mehrere Kopien des APL zusammen mit dem Klasse-II-MHC-Molekül tragen; sobald es im Endosom wäre, würde das Hybrid-li über normale endosomale Prozesse unter Freisetzung von sowohl mehreren Kopien des APL oder dazu ähnlichen Molekülen und einer offenen Klasse-II-MHC-Peptid-Bindungsspalte abgebaut werden. DNAs, die Zielsignale enthaltende APLs kodieren, werden über PCR oder anderes standardmäßiges „genetic engineering" oder standardmäßige synthetische Techniken erzeugt. Leitende Sequenzen sind detaillierter beschrieben im US-Patent Nr. 5,827,516 .
  • Ein Promotor ist ein TRE, der aus einer Region eines DNA-Moleküls, typischerweise innerhalb eines Bereichs von 100 Nukleotidpaaren stromaufwärts von dem Punkt, an dem die Transkription beginnt, besteht. Durch Enhancer wird Expressionsspezifität im Sinne von Zeit, Ort und Grad bereitgestellt. Anders als ein Promotor kann ein Enhancer wirksam sein, wenn er sich in verschiedenen Entfernungen von der Stelle der Transkription befindet, vorausgesetzt, dass ein Promotor vorhanden ist. Ein Enhancer kann sich auch stromabwärts von der Stelle der Initiierung der Transkription befinden. Die kodierende Sequenz des Expressionsvektors ist operativ verknüpft mit einer die Transkription beendenden Region. Um eine kodierende Sequenz unter die Kontrolle eines Promotors zu bringen, ist es erforderlich, die Translationsinitiierungsstelle des translationalen Leserahmens des Peptids oder Polypeptids zwischen einem und etwa fünfzig Nukleotiden stromabwärts (3') vom Promotor anzuordnen.
  • Geeignete Expressionsvektoren umfassen Plasmide und virale Vektoren, wie beispielsweise unter anderem Herpesviren, Retroviren, Vacciniaviren, attenuierte Vacciniaviren, Kanarienpockenviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren.
  • Polynukleotide können in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht werden. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind biologisch verträgliche Vehikel, die für die Verabreichung an den Menschen geeignet sind, z. B. physiologische Kochsalzlösung. Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge eines Polynukleotids, die in der Lage ist, ein medizinisch erwünschtes Ergebnis in einem behandelten Tier hervorzurufen. Wie in der Medizin allgemein bekannt ist, hängt die Dosierung für einen beliebigen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, der Ausdehnung der Körperoberfläche, dem Alter, der bestimmten Verbindung, die verabreicht werden soll, dem Geschlecht, dem Zeitpunkt und dem Weg der Verabreichung, dem allgemeinen Gesundheitszustand, und anderen gleichzeitig zu verabreichenden Wirkstoffen. Bei den Dosierungen gibt es Variationen, jedoch reicht eine bevorzugte Dosierung für die Verabreichung von Polynukleotid von etwa 106 bis 1012 Kopien des Polynukleotidmoleküls. Diese Dosierung kann, je nach Bedarf, wiederholt verabreicht werden. Die Verabreichungswege können beliebige der oben aufgeführten Verabreichungswege sein.
  • 4.2. Ex vivo-Ansätze
  • Gemäß einem ex vivo-Ansatz werden lymphatische Zellen, einschließlich CD4+ T-Lymphozyten, aus dem Individuum isoliert und mit dem APL in vitro in Kontakt gebracht. Die lymphatischen Zellen können einmal oder mehrmals (z. B. 2, 3, 4, 6, 8 oder 10 Mal) in Kontakt gebracht werden. Das Muster der Zytokin-Produktion durch die lymphatischen Zellen kann nach einem oder mehreren Kontakten getestet werden. Sobald die gewünschten Zyotokine von den lymphatischen Zellen produziert werden, werden diese über irgendeinen der hier aufgeführten Wege zurück in das Individuum eingeführt. Die therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit dieses ex vivo-Ansatzes hängt ab von der Fähigkeit der ex vivo APL-aktivierten Lymphozyten, eine pathogene CD4+ T-Zell-Antwort auf das Wildtyp-Ausgangspeptid zu supprimieren. Der potentielle Wert eines solchen Ansatzes wird durch Experimente angezeigt, in denen CD4+ T-Zellen, die Zytokine vom Th2-(oder Th0- oder Th3-)Typ produzierten, im Verlauf befindliche Th1-Antworten und durch solche Th1-Antworten verursachte Erkrankungen aktiv supprimierten [Nicholson und Kuchroo, Curr. Opinion in Immunol. 8: 837–842, (1996)].
  • Eine alternative ex vivo-Strategie kann die Transfektion oder Transduktion von Zellen, die von dem Individuum gewonnen wurden, mit einem Polynukleotid beinhalten, das die oben beschriebenen, APL kodierenden Minigene enthält. Die tranfizierten oder transduzierten Zellen werden anschließend in das Individuum zurückgeführt. Während derartige Zellen vorzugsweise lymphatische Zellen sind, können sie auch beliebige Zellen aus einem breiten Spektrum von Typen sein, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Fibroblasten, Knochenmarkszellen, Makrophagen, Monozyten, dendritische Zellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Keratinozyten, oder Muskelzellen, in denen sie als Quelle für den APL fungieren, solange sie in dem Individuum überleben. Die Verwendung von lymphatischen Zellen wäre besonders vorteilhaft, da zu erwarten wäre, dass solche Zellen lymphatisches Gewebe ansteuern (z. B. Lymphknoten oder Milz) und dementsprechend APLs in hohen Konzentrationen an der Stelle produziert würden, an der sie ihre Wirkung entfalten, d. h. die Aktivierung einer Immunantwort. Durch Verwendung dieses Ansatzes wird, wie bei dem oben beschriebenen in vivo-Ansatz unter Verwendung von APL kodierenden Polynukleotiden, eine aktive in vivo-Immunisierung mit dem APL erreicht. Für diese ex vivo- Strategie können die gleichen genetischen Konstrukte und Leitsequenzen wie für den in vivo-Ansatz beschrieben verwendet werden.
  • Die ex vivo-Verfahren umfassen die Schritte des Erntens von Zellen von einem Individuum, der Kultivierung der Zellen, deren Transduktion mit einem Expressionsvektor, und des Haltens der Zellen unter Bedingungen, die für die Expression des APL geeignet sind. Diese Methoden sind auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt. Der Transduktionsschritt wird durch jedes beliebige, für eine ex vivo-Gentherapie verwendete Standardmittel bewerkstelligt, einschließlich Calciumphosphat, Lipofektion, Elektroporation, virale Infektion, und biolistischen Gentransfer. Alternativ können Liposomen oder polymere Mikropartikel verwendet werden. Zellen, die erfolgreich transduziert wurden, werden anschließend selektiert, beispielsweise auf die Expression des Minigens oder eines Wirkstoffresistenzgens. Die Zellen können anschließend (falls erwünscht) lethal bestrahlt werden und in den Patienten injiziert oder implantiert werden.
  • Diese erfindungsgemäßen Verfahren können auf jede beliebige der hier aufgeführten Erkrankungen und Arten angewendet werden. Verfahren zum Testen, ob ein APL therapeutisch für oder prophylaktisch gegen eine bestimmte Erkrankung ist, können einfache Modifikationen der oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung des Typs der durch einen bestimmten APL ausgelösten CD4+ T-Lymphozyten-Antwort sein. Wenn eine therapeutische Wirkung getestet wird, wird eine Testpopulation, die Symptome der Erkrankung zeigt (z. B. IDDM-Patienten) mit einem Test-APL behandelt, wobei eine beliebige der oben beschriebenen Strategien verwendet wird. Eine Kontrollpopulation, die ebenfalls Symptome der Erkrankung zeigt, wird unter Verwendung des gleichen methodischen Ansatzes mit einem Placebo behandelt. Ein Verschwinden oder eine Abnahme der Erkrankungssymptome in dem Testindividuum würde anzeigen, dass der APL ein wirksames therapeutisches Agens ist.
  • Durch Anwendung der gleichen Strategien bei Individuen vor dem Einsetzen von Erkrankungssymptome (z. B. prä-diabetischen Patienten, die für wahrscheinliche Kandidaten für die Entwicklung von IDDM gehalten werden, oder experimentellen Tiere, bei denen eine geeignete Erkrankung willkürlich induziert werden kann, z. B. experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis), können die APLs auf ihre Wirksamkeit als prophylaktische Agenzien, d. h. Vakzine, getestet werden. In dieser Situation wird das Vorbeugen hinsichtlich des Einsetzens von Erkrankungssymptomen getestet.
  • Die folgenden Beispiels dienen der Veranschaulichung der Erfindung, nicht deren Beschränkung.
  • BEISPIELE
  • Materialien und Methoden
  • Kultivierung von B-Zelllinien, die mit Epstein-Barr-Virus (EBV) infiziert sind Um hohe Volumina an Zellen zu erreichen, wurden EBV-transformierte B-Lymphozyten-Linien in 50–100 175 cm2-Kulturflaschen in RPMI 1640-Medium vermehrt, das mit Glutamin, Penicillin/Streptomycin und 10% fötalem Kälberserum supplementiert war. Die verwendeten EBV-transformierten Zellen waren Priess-Zellen, die homozygot sind für den IDDM-permissiven DRB1·0401, DRB4·0101 [DR4/DRw53], DQA1·0301/DQB1·0302[DQ8] HLA-Haplotyp. Etwa 50% der Zellen wurden alle 2–3 Tage durch Pelletieren geerntet, mit Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen, gezählt, in HBSS resuspendiert, und für das IMF-Verfahren verwendet.
  • Biotinylierte Polypeptid-Antigene
  • Rekombinante Antigene wurden in E. coli erzeugt. Der intrazelluläre Teil von IA-2 (IA-2ic) wurde unter Verwendung des Pinpoint-Vektors (Promega, Madison, WI) erzeugt, der Fusionsproteine produziert, die am N-Terminus an eine Leader-Sequenz gekoppelt sind, die an einem einzelnen Lysinrest biotinyliert ist. Dies ermöglichte die Aufreinigung unter Verwendung von monomeren Avidin-Säulen, und führte weiterhin zur Produktion der biotinylierten Form des Antigens von Interesse zur Verwendung im Antigen-Transportsystem (ADS) (siehe unten). Der Pinpoint-Vektor, der IA-2ic kodierende cDNA enthielt, wurde freundlicherweise von Dr. M. Christie, King's College London [Payton et al. (1995), J. Clin. Invest. 96: 1506–1511] zur Verfügung gestellt. Die Bedingungen für die Aufreinigung entsprachen den vormals festgelegten Bedingungen [Payton et al. (1995), supra]. Kurz zusammengefasst, wurden E. coli-Zellen vom Stamm JM109 mit dem Pinpoint-Vektor transformiert, der die IA-2ic-cDNA enthielt. Kolonien wurden auf Minimalmedium/Agarose-Platten subkultiviert, und einzelne Kolonien wurden gepickt und über Nacht unter Schütteln bei 37°C in Minimalmedium kultiviert, das 2 μM d-Biotin und 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Sobald die Kultur einen A600-Wert von 0,5 erreicht hatte, wurde sie (1:10-Verdünnung) in LB-Medium überführt, das 2 μM d-Biotin enthielt, und eine Stunde unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Proteinexpression wurde in der logarithmischen Wachstumsphase unter Verwendung von 100 μM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Die Zellen wurden nach 3 bis 5-ständigem Schütteln bei 37°C geerntet, indem sie mit 8.000 g bei 4°C zentrifugiert wurden. Das Zellpellet wurde in Zellpellet-Puffer (CPB; 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, der 10 mM Benzamidin und 1 mM Phanylmethylsulfonylfluorid enthielt) resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend auf Eis lysiert und lösliche Protein durch eine Kombination von Lysozym-Behandlung (1 mg/ml), Triton X-100-Behandlung (0,1%) und Deoxyribunuklease-Behandlung (200 U/ml) freigesetzt. Nach Entfernen der Zelltrümmer durch Zentrifugation (14.000 g über einen Zeitraum von 15 Minuten bei 4°C) wurde das biotinylierte Fusionsprotein aus dem Überstand durch Durchleiten mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/Stunde durch eine Avidin-Harz-Säule (SoftLink, Promega, Madison, WI), die gemäß den Herstelleranweisungen hergestellt und in CPB äquilibriert war, aufgereinigt. Nach ausgiebigem Waschen der Säule wurde das biotinylierte Fusionsprotein mit einem Überschuss an 5 μM d-Biotin eluiert, unter Verwendung einer G-25-Säule (Pharmacia) von freiem d-Biotin abgetrennt, und unter Verwendung eines Amicon B15-Konzentrators mit einem molekularen Ausschlussgewicht („cutoff”) von 15 kDa aufkonzentriert. Die Reinheit, die typischerweise > 90% war, wurde über SDS-PAGE und Western Blot-Analyse, bei der im Entwicklungsschritt Avidin-Peroxidase verwendet wurde, bestimmt.
  • cDNA von GAD65, die erhalten wurde aus RNA, die aus menschlichen Bauchspeicheldrüsen-Inseln extrahiert war, wurde in den pET 12-Vektor (Stratagene) kloniert, in dem die Expression kontrolliert wird durch den T7-Promotor stromabwärts von einer Biotinylierungs-Tag-Sequenz und einem Histidin-Aufreinigungs-Tag, entworfen auf der Grundlage des Pinpoint-Vektors. Dieses pET 12-Vektorsystem weist den Vorteil auf, dass die Expression eines Fusionsproteins in dem proteasedefizienten Stamm E. coli, BLR (DE3) pLysS induziert werden kann.
  • GAD65 wurde auf folgende Weise erzeugt. BLR (DE3) pLysS-Bakterien wurden transformiert mit einem GAD65 cDNA enthaltenden Vektor, und eine Kolonie wurde gepickt und damit LB beimpft und bei 37°C unter Schütteln mit 225 U/min kultiviert, bis ein A600-Wert von 0,6–1,0 erreicht wurde. Die Zellen wurden anschließend in frischem LB resuspendiert, in einer Verdünnung von 1:25 ausgesät, unter den gleichen Bedingungen bis zu einem A600-Wert von 0,4 kultiviert, und bei 30°C mit 2 mM IPTG 3 Stunden induziert. Ein Bakterienpellet, das durch Zentrifugation erhalten wurde, wurde in 8 M Guanidinhydrochlorid (GuHCl), 50 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 0,1% Triton X-100, 50 mM 2-Mercaptoethanol (2-ME), pH 8,0, resuspendiert; sonifiziert; und 1 Stunde bei 4°C mit 40.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gegen einen 10-fachen Überschuss des 8 M GuHCl-Puffers ohne 2-ME dialysiert und anschließend 1 Stunde einer 50% Nickel-Harz-Aufschlämmung zugegeben, wobei bei Raumtemperatur geschüttelt wurde. Das Nickel-Harz wurde in einer Säule resuspendiert und mit Harnstoffpuffern gewaschen, die von den Herstellern des Nickel-Harzes bereitgestellt wurden (Qiagen, Deutschland), jedoch mit 5 mM 2-ME und 0,1% Triton X-100 supplementiert waren. Proteine wurden unter Verwendung von Harnstoffpuffer mit pH-Werten von 5,9 und 4,5 eluiert und gegen 4 M Harnstoff dialysiert, der 50 μM Pyridoxalphosphat, 20 mM Natriumglutamat, 0,05% Triton X-100, 5 mM 2-ME und 2 M L-Arginine enthielt. Die Präparation wurden anschließend gegen Natriumdodecylsulfat (SDS) (0,1%) Gel-Laufpufffer dialysiert, der 2,5 mM Glutathion, 50 μM Pyridoxalphosphat enthielt.
  • Die Dialyse wurde gegenüber einem identischen Puffer wiederholt, der eine 10-fach niedrigere SDS-Konzentration enthielt. Anschließend wurde ein Dialyse gegen eine Lösung durchgeführt, die 4 mM Hepes, 20 mM Natriumglutamat, 50 μM Pyridoxalphosphat, 2,5 mM Glutathion enthielt. Eine letzte Dialyse erfolgte gegen den gleichen Puffer ohne Natriumglutamat. In dieser Stufe wurde das gelbe, biotinylierte GAD65 bei 4°C aufgewahrt oder lyophilisiert.
  • cDNA von menschlichem Pre-Proinsulin wurde freundlicherweise von Dr. D. Steiner bereitgestellt und wurde wie oben für GAD65 beschrieben kloniert. Biotinyliertes Pre-Proinsulin wurde unter ähnlichen Bedingungen wie denen für die Herstellung und Aufreinigung von GAD65 hergestellt und aufgereinigt.
  • Antigen-Transport-System (ADS)
  • Für das ADS wurden geerntete und gewaschene Priess-Zellen in einer Konzentration von 5 × 107/ml in kaltem HBSS, das mit b-PMW (300 ng/ml) supplementiert war, suspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach Waschen in HBSS wurden die Zellen mit einer Konzentration von 5 × 107/ml in 0,5 mg/ml Avidin enthaltendem HBSS resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach Waschen wurden die Zellen in HBSS, das mit 10–40 μg/ml biotinyliertem IA-2ic supplementiert war, resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach Waschen wurden die Zellen in vorgewärmtem RPMI 1640/10% FCS resuspendiert (1 × 106/ml) und 6 Stunden bei 37°C in 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden pelletiert und bei –80°C aufbewahrt, bis die HLA-Molekül-Aufreinigung durchgeführt wurde.
  • HLA-Klasse-II-Aufreinigung
  • Die DR4-Molekül-Aufreinigung wurde wie früher beschrieben durchgeführt [Gorga et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 16087–16094]. Von dem ADS erhaltene und bei –80°C aufbewahrte Zellpellets wurden aufgetaut und in hypotonischem Puffer homogenisiert. Eine Rohmembranfraktion wurde über Hochgeschwindigkeitszentrifugation hergestell und in NP40 solubiliert. Die Detergens-lösliche Fraktion wurde über eine Serie von Immunaffinitätssäulen geleitet, die Protein A-Sepharose oder AffiGel10-Matrixmaterial enthielten, das mit monoklonalen Antikörpern (mAb) konjugiert war, die an MHC-Klasse-I-Moleküle (mAb W6/32), DR-Moleküle (mAb LB3.1 oder mAb 1243) beziehungsweise DQ3-Familie-Moleküle (mAb IVD12) binden. Jeder dieser mAbs erkennt die native Dimer-Konformation der HLA-Klasse-I- oder Klasse-II-Moleküle auf Zellen der angegebenen B-Lymphozytenlinien. Die Immunaffinitätssäulen wurden mit 50 mM Glycin, pH 11,5/0,1% Natriumdeoxycholat, eluiert und sofort neutralisiert und gegen 10 mM Tris, pH 8,0/0,1% Natriumdeoxycholat dialysiert. Die Proteinreinheit wurde über SDS-PAGE bestimmt und über den BCA-Assay quantifiziert.
  • Peptidanalyse
  • Alle Proben von HLA-Klasse-II-Proteinen wurden vor der Peptidextraktion unter Vewendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon Centricon 10) auf 100 μl aufkonzentriert. Natürlich prozessierte Peptidrepertoire wurden mit Säure durch Zugabe von 800 μl 10% Essigsäure von HLA-Klasse-II-Molekülen eluiert und, wie beschrieben [Chicz et al. (1993), J. Exp. Med. 178: 24–47] 15 Minuten bei 70°C inkubiert. Die Peptide wurden vom übrigen HLA-Protein durch Ultrafiltration mit der Centricon 10-Vorrichtung abgetrennt. Die „Durchfluss"-Fraktion, welche die säureextrahierten Peptide enthielt, wurde auf einer Savant SpeedVac auf ein Volumen von etwa 20–30 μl aufkonzentriert und bei –80°C aufbewahrt. Die säureextrahierten Peptidgemische wurden anschließend durch Reverse-Phase-Chromatographie wie früher beschrieben [Chicz et al. (1993), supra] getrennt, wobei jedoch geringe Modifizierungen vorgenommen wurden. Kurz zusammengefasst wurden die Trennungen unter Verwendung einer „microbore" C18-Säule (1,0 × 250 mm; Vydac, Hesperia, CA) mit einer Fließgeschwindigkeit von 50 μl/Minute durchgeführt. Der Säulenausfluss wurde so aufgespalten, dass 2% unmittelbar auf eine Probenplatte für Matrix-unterstützte Laser-Desorption in Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie geladen wurden, und die verbleibenden 98% für eine Aufbewahrung bei –20°C gesammelt wurden. Man bereitete die Proben für die Massenspektrometrie-Analyse durch Zugabe von 0,4 μL Matrix (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, 10 mg/ml in 50% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure) vor und ließ sie an der Luft trocknen. Massenspektren wurden bei optimalen Laserintensitäten aufgenommen, indem Mittelwerte von Ionensignalen aus 128 einzelnen Scans sowohl im linearen als auch im Reflektormodus unter Verwendung eines „single stage extended length reflector time-of-flight"-Massenspektrometers (Voyager Elite XL, PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) gebildet wurden. Die Umwandlung von Zeit zu Masse wurde durch externe Kalibrierung unter Verwendung von synthetischen Peptiden durchgeführt.
  • Ein automatisierter Mikrokapillar-Flüssigchromatographie-Massenspektroskopie (LCMS)-Ansatz mit datenabhängiger kollisionsunterstützter Dissoziation (CAD) für das Sequenzieren von niedrigen Konzentrationen natürlich prozessierter HLA-assoziierter Peptide wurde entwickelt, um direkt die Zielpeptidmassen, die durch den zuvor beschriebenen MALDI-TOF-Ansatz bestimmt wurden, zu sequenzieren. Durch Reverse-Phase-Chromatographie aufgetrennte Peptidfraktionen werden auf ein Endvolumen von 5–20 μl verdünnt, um die Handhabung zu unterstützen und die Verwendung von Reverse-Phase-Trennungen in einer zweiten Dimension zu ermöglichen. Die erhaltene Peptidlösung kann anschließend durch Einfangen der Peptide unter Verwendung eines kleinen Bettes (0,5–1,0 μL) eines polymeren Reverse-Phase-Trägers vorkonzentriert werden. Dies erleichtert auch das Entfernen von hydrophilen Verunreinigungen durch Waschen der Falle mit einer wässrigen Lösung. Anschließend werden die Peptide von der einfangenden Phase auf die Mikrokapillare (mit einem Innendurchmesser von 75 μm und einer Packung mit 5–15 cm von 1–7 μm 100–200 Å C18 oder nicht-porösem Material) zurückgespült und die Trennung erfolgt unter Verwendung eines nicht-linearen Gradienten. Eine Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase von ~ 0,5 μL/min wird durch Auftrennen des Flusses von der Pumpe und Verwendung einer Balanciersäule erreicht. Der Peptidnachweis erfolgt über μ-Elektrospray-MS. Die Spannung, die erforderlich ist, um das Elektrospray voranzutreiben, wird am Kopf der Mikrokapillarsäule angelegt und die Peptide werden durch Elektrosprühen direkt so, wie sie aus der Kapillare eluieren, in den Massenanalysator eingebracht. CAD-Experimente werden in einem datenabhängigen Modus ausgelöst, wobei Ionen verwendet werden, die zahlreicher vorkommen als es einem durch den Benutzer gewählten Schwellenwert entspricht. Dynamischer Ausschluss wird verwendet, um eine maximale Peptiderfassung sicherzustellen (d. h. unbedeutendere Antworten werden nachfolgend auf eine durch den Anwender bestimmte Anzahl von CAD-Experimenten einer einzelnen Peptidantwort analysiert), in dem während des Assay-Verlaufs eine Ausschlussliste geschrieben wird, so dass ein bestimmtes Ion nicht durch mehrere CAD-Experimente analysiert wird. Die Zeit, die ein bestimmtes Ion auf der Ausschlussliste verbleibt, hängt ab von der Qualität der chromatographischen Trennungen. Dies muss experimentell bestimmt werden. Auf diese Weise können getrennte isobare Antworten analysiert werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Empfindlichkeit der Peptidsequenzierung von weniger als 1 fmol erreicht werden.
  • Epitopverifizierung (EV)
  • Um zu bestimmen, dass die identifizierten Peptidepitope für IDDM relevant sind (d. h. dass sie von CD4+ T-Zellen von Patienten mit IDDM oder Prä-IDDM, die das DR4-Molekül exprimieren, erkannt werden, jedoch nicht von nicht-diabetischen Kontrollen, die ebenfalls das DR4-Molekül exprimieren), wurden T-Zell-Proliferationsassays unter Verwendung von snythetischen Peiltiden durchgeführt, die Aminosäuresequenzen aufwiesen auf der Grundlage der durch Massenspektrometrie identifizierten Peptide, abgeleitet von IA-2ic. Die Peptide wurden unter Einsatz von Fmoc-Chemie mit einem Applied Biosystems SYNERGY Peptidsyntheseapparat synthetisiert und über präparative RP-HPLC auf einem Water 2690 Alliance-System aufgereinigt, das mit einem Radial-Kompressionsmodul ausgestattet war. Die Aminosäuresequenzen und Reinheiten von mehr als 90% für alle synthetischen Peptide wurden durch MALDI-TOF und analytische HPLC bestätigt. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes von Patienten mit kürzlichem Ausbruch von IDDM (< 6 Monate seit der Diagnose) und gesunden Kontrollen, welche die geeigneten HLA DRr-Moleküle exprimierten, wurden über Dichtegradientenzentrifugation getrennt und zusammen mit Peiltiden in einer Konzentration von 10 μg/ml 5 Tage in 150 μl RPMI 1640/10% vereinigtem normalem AB- Serum in Wells von 96-Well-Platten mit U-Boden kultiviert, woraufhin mit 0,5 μCi [3H]-Thymidin/Well gepulst wurde und für die Radioaktivitätszählung, gemessen in Zählereignis pro Minute (cpm), auf Filter geerntet wurde. Pro Testgruppe lagen zwölf Wiederholungs-Wells vor. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als ein Stimulationsindex (SI), der das Verhältnis der cpm aus Peptid enthaltenden Kulturen zu den cpm aus Kulturen ohne Peptid darstellt (Mittelwert von 12 Wells in jedem Fall). Die Daten wurden auch hinsichtlich des Anteils der „positiven Kultur-Wells" analysiert. Ein positives Kultur-Well ist ein solches, das Peptid enthielt und zu einem cpm > cpm-Mittelwert + 2 Standardabweichungen von Kulturen ohne Peptid führte. T-Zell-Antworten als signifikant erachtet, wenn der SI > 2,0 war und > 40% der Well positiv waren.
  • Bindungsassay
  • Synthetische Peptide mit Aminosäuresequenzen auf der Grundlage der 6 durch das IMF identifizierten Kernregionen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, in einem Bindungs-Inhibitions-Assay, der im Wesentlichen wie früher beschrieben [Chicz et al. (1997), J. Immunol. 159: 4935–4942] durchgeführt wurde, an isolierte HLA-DR4-Moleküle zu binden. Kurz zusammengefasst, wurden Aliquots von immungereinigter Präparation von HLA-DR4 (Endkonzentration 10 μg/ml) mit einem biotinylierten HLA-DR4 bindenden Peptid (bestehend aus den Resten 98–117 der invarianten Kette von Klasse-II-MHC) („das Indikatorpeptid") (1 μM) und verschiedenen Konzentrationen der Test-Peptide in 0,2 ml-Röhrchen inkubiert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde der Inhalt jedes Röhrchens in ein Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte aus Plastik überführt, die mit anti-HLA-DR4-Antikörper vorbeschichtet war. Die Mikrotiterplatten wurden 60 min bei Raumtemperatur geschüttelt und nicht gebundenes Material wurde durch starkes Waschen entfernt. Die relative Menge an gebundenem Standardpeptid in jedem Well wurde durch Messung der Farbentwicklung nach Zugabe von Streptavidin-konjugierter Alkalischer Phosphatase, Waschen, und Zugabe eines chromogenen Substrats für Alkalische Phosphatase bestimmt.
  • Beispiel 1. Analyse von HLA DR4-bindenden Peptiden, abgeleitet durch natürliches Prozessieren von IA-2ic durch B-Lymphozyten
  • Um zu bestimmen, ob das beschriebene ADS zur Erzeugung von Peptiden (gebunden an HLA-II-Moleküle auf der Oberfläche) ähnlich den von APC produzierten nach natürlicher Aufnahme eines Ausgangspeptids führt, wurde eine Tetanustoxoid-spezifische (TT-spezifische) CD4+ T-Zelllinie (NG2) erzeugt. Bei Kultivierung zusammen mit APC, in denen biotinyliertes TT unter Verwendung des beschriebenen ADS zu den antigenprozessierenden Organellen geleitet wurde, zeigten NG2-Zellen ähnlich hohe Raten von [3H]-Thymidin-Einbau (Mittelwert cpm = 7750 nach dreitägiger Kultivierung) als bei Kultivierung mit normalen APCs und TT (Mittelwert cpm = 8427). Der Hintergrundwert, der durch Verwendung von APC ohne TT erhalten wurde, betrug 2528 cpm. Nach Durchführung des ADS wurden Aliquots der Priess-Zellen bei 37°C 0, 1, 3 oder 6 Stunden inkubiert und anschließend auf das Vorhandensein von TT auf deren Oberflächen durch aufeinanderfolgende Behandlung mit Kaninchen-anti-TT-Antiserum („anti-TT-Antiserum") und FITC-Ziege-anti-Kaninchen-Ig („FARIG"), und anschließende Durchflusszytometrieanalyse getestet (1). Im Vergleich mit den Hintergrundproben, die mit FARIG und nicht mit anti-TT (–) behandelt waren, war die Oberflächenexpression von TT zum Zeitpunkt 0 Stunden (••••) hoch, zum Zeitpunkt 1 Stunde (-•-) und zum Zeitpunkt 3 Stunden (---) verringert, und fehlte zum Zeitpunkt 6 Stunden (•••) vollständig. Dieses Experiment zeigte, dass über das ADS bereitgestellte Proteine schnell internalisiert und zum HLA-Klasse-II-Antigenprozessierungsweg geleitet werden, und dass relevante Peptidepitope responsiven CD4+ T-Lymphozyten präsentiert werden.
  • Das Insel-Autoantigen IA-2ic wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Antigen-Transport-Systems (ADS) an die Oberfläche von EBV-transformierten Priess-B-Lymphozyten geleitet. Im ersten Schritt wurden 5–10 × 107 EBV-transformierte Priess-B-Zellen mit b-PWM inkubiert. Nach Abwaschen von nicht gebundenem b-PWM wurde der Zellsuspension Avidin zugegeben, um eine Brücke zwischen dem b-PWM und dem b-IA-2ic bereitzustellen.
  • Nach Gabe eines Pulses mit dem biotinylierten IA-2ic wurden die Zellen 1–6 Stunden bei 37°C inkubiert, im eine Internalisierung, ein Prozessieren und eine Präsentation zu ermöglichen. Eine Kontrollpopulation von Zellen wurde nur mit b-PWM und Avidin gepulst. HLA-DR4 (0401)-Moleküle wurde aus jedem Zellpellet aufgereinigt, gebundene Peptide wurden eluiert und über RP-HPLC abgetrennt, und jede von 100 Fraktionen wurden über MALDI-TOF analysiert. Die RP-HPLC-Analyse war in hohem Maße reproduzierbar, wobei die chromatographischen Spuren der IA-2ic-gepulsten und der Kontroll-HLA-DR4-Präparationen einen Ähnlichkeitsindex von 96–99% aufwiesen. Zur Identifizierung von IA-2ic-abgeleiteten Peptiden wurde ein Subtraktionsansatz verwendet. Massenspektren von äquivalenten PR-HPLC-Fraktionen aus Präparationen, die mit biotinlyiertem IA-2ic gepulst waren, und aus Kontrollpräparationen wurden übereinander gelegt und Massen, die in beiden vorkamen, wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Ein Beispiel für ein solches Profil ist in 2 gezeigt. Die Massenspektren für das aus IA-2ic-gepulsten Priess-Zellen isolierte HLA-DR4(0401)-Peptidrepertoire wurden mit den Spektren für das aus Kontroll-Priess-Zellen isolierte Peptidrepertoire verglichen, um neue m/z-(Verhältnis Masse zu Ladung)-Werte zu identifizieren, die von IA-2ic abgeleiteten Peptiden entsprachen (2). Während Peaks mit m/z-Werten von etwa 1747 und 1822 in Spektren zu sehen waren, die aus Peptidgemischen sowohl von gepulsten als auch von Kontroll-Priess-Zellen erhalten wurden, waren Peaks mit m/z-Werten von 1779,75 und 1935,8 nur in den Spektren zu sehen, die mit dem Peptidgemisch von IA-2ic-gepulsten Priess-Zellen erhalten wurden.
  • Das Experiment wurde in dreifacher Wiederholung durchgeführt. Von den etwa 3000 beobachteten m/z-Werten wurden 85 neue Massen anfänglich als potentielle natürlich prozessierte Peptide von IA-2ic identifiziert. Darauf folgende Massenanalyse mit höherer Auflösung und einer stringenteren Massengenauigkeit zeigte, dass 24 m/z-Werte Massen aufwiesen, die von IA-2ic abgeleiteten synthetischen Kandidatenpeptiden entsprachen. Mit diesen synthetischen Peptiden wurde Massenspektrometrie durchgeführt. Die Massenidentifizierung war in hohem Maße reproduzierbar, wobei die gleichen 24 Massen in drei getrennten B-Zell-Präparationen und 3 getrennten RP-HPLC-Trennungen identifiziert wurden. Die gleichen Massen waren zu beobachten, wenn man B-Zellen Antigen 1 Stunde und 6 Stunden internalisieren, prozessieren und präsentieren ließ, wenngleich eine bessere Peptidbeladung von DR4-Molekülen bei einer Stunde zu beobachten war. Die Sequenzen der Massen sind in Tabelle 1 gezeigt. Jede der Sequenzen war ein Vertreter eines von 6 verbundenen Peptidsätzen. Verbundene Sätze sind Gruppen von Peptiden auf der Grundlage der gleichen Kernregion, die jedoch an den N- und C-Termini variabel gekürzt oder verlängert sind. Alle 6 Kernregionen enthielten Aminosäuren, die als für die Bindung von HLA-DR4 (0401) bevorzugt bekannt sind. Die Sequenzen der Peptide mit der SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 25 wurden bestätigt unter Verwendung der oben beschriebenen CAD-Vorgehensweise, die auf Proben des entsprechenden, durch MALDI-TOF getrennten Materials angewendet wurde. Teilsequenzen, die mehreren Peptiden von jeder der zuvor beschriebenen Kernregionen entsprechen, wurden ebenfalls erhalten.
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Sechs synthetische Peptide mit Aminosäuresequenzen auf der Grundlage der 6 Kernregionen von IA-2ic wurden verwendet, um die Antworten von T-Zellen des peripheren Blutes in IDDM-Patienten (die HLA-DR4 exprimierten oder nicht exprimierten) und gesunden Kontrollindividuen, die HLA-DR4 exprimierten), zu untersuchen (Tabelle 2). Von 13 HLA-DR4-IDDM-Patienten wiesen 9 Patienten T-Zellen auf, die signifikante („POS” in Tabelle 2) proliferative Antworten gegenüber wenigstens einem der 6 Peptide zeigten. Elf der DR4-Patienten exprimierten das 0401-Allel und zwei exprimierten sowohl das 0403- als auch das 0405-Allel. Die 0401-, 0403- und 0405-Gene kodieren ähnliche DRβ-Ketten, die sich nur an den Positionen 57 (0405 S für D), 71 (0403 und 0405 R für K), 74 (0403 E für A) und 86 (0403 V für G) unterscheiden [Marsh, S. G., Tissue Antigens 51: 467–507, (1998)]. Die Peptidbindungsmotive dieser HLA-DR4-Typen sind bekannt und sind ähnlich, und für alle wird eine Bindung an die 6 IA-2ic-Kernpeptidregionen vorhergesagt. T-Zellen von nur 1/8 nicht-DR4 IDDM-Patienten proliferierten bei Kontakt mit irgendeinem der Peptide, und keine von solchen aus den Kontrollindividuen (alle 0401) sprachen auf irgendeines der Peptide an. Peptide von allen 6 der 6 Kernregionen lösten T-Zelt-Antworten aus, und T-Zellen aus den meisten ansprechenden Patienten proliferierten als Antwort auf ein einzelnes Peptid.
  • In toto zeigen diese Daten, dass das auf die Analyse von über natürliches Prozessieren von IA-2ic produzierten Peptiden angewendete IMF-Verfahren zu einer Charakterisierung von Peptiden führte, die von CD4+ T-Lymphozyten spezifisch von HLA-DR4-exprimierenden IDDM-Patienten erkannt werden, und somit am IDDM-Erkrankungsprozess beteiligt sein können. Diese Erkenntnis stellt einen signifikanten Fortschritt hinsichtlich des Wissens in Bezug auf die Ätiologie von IDDM dar und stellt die Grundlage für die Entwicklung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Agenzien für IDDM dar, z. B. APL. Es ist zu erwarten, dass analoge Vorgehensweisen bei der Identifizierung von Peptiden, die an der CD4+ T-Lymphozyten-vermittelten Pathogenese weiterer Erkrankungen (siehe oben), bei denen die Suszeptibilitiät mit der Expression eines bestimmten Klasse-II-MHC-Moleküls verbunden ist, ähnlich erfolgreich sein kann. Tabelle 2. Antwort von T-Zellen von Patienten mit IDDM und Kontrollindividuen auf eluierte IA-2-Peptide
    Fall Alter (Jahre) Dauer (Wochen) DRB1-Genotyp IA-2-Autoantikörper T-Zell-Antwortauf IA-2-Peptid
    654–674 709–732 955–975 797–817 854–872
    HLA-DR4 IDDM-Patienten
    S(G) 17 8 0401, 0101 + POS
    G(G) 26 12 0401, 1301 + POS
    K(G) 28 28 0401, 1101 + POS
    ML 29 3 0401, 0403 – POS
    EW(B) 29 16 0401/0401 + POS
    RW(B) 20 4 0401/0401 + POS
    TH(B) 19 4 0401/0301 – POS
    DC(I) 6 4 0403, 0405 + POS
    GR 13 < 1 0403, 0405 + POS POS POS
    NC(B) 36 16 0401/0404 +
    HW 15 12 0401/0401
    LG(G) 16 4 0401, 0301 +
    RM 24 1 0401, 1302
    IDDM-Patienten (nicht-DR4)
    JD 28 4 0102, 0301 – POS POS POS
    PQ 20 25 0301 –
    MI 16 12 1201, 1301 +
    ML(I) 10 12 0101, 1101 –
    ST(I) 13 2 0301, 1301 +
    OA 23 1 1101, 1301 –
    RM 24 25 0301, 0901 –
    JH(B) 33 20 0301/08 –
    HLA-DR4 Kontrollen
    TL(G) 36 – 0401, 0101 –
    JB 17 – 0401/0101 –
    B(G) 30 – 0401, 1302 –
    MR 24 – 0401, 1501 –
    PH 40 – 0401, 14 –
    VB 16 – 0401, 0403 –
    AZ 24 – 0401, 02 –
    CF(G) 30 – 0401, 0701 –
  • Beispiel 2. Bindung von Konsensus-Peptiden an isolierte HLA-DR4-Moleküle
  • Um die Fähigkeiten der 6 Konsensus-Peptide, welche die 6 Kernregionen repräsentieren, die durch das IMF in Beispiel 1 beschrieben wurden, wurde ein Bindungsinhibitionstest durchgeführt (3). R1 war das Peptid, das aus den Resten 797–817 von IA-2 bestand; R2 war das Peptid, das aus den Resten 854–872 von IA-2 bestand; R3 war das Peptid, das aus den Resten 753–771 von IA-2 bestand; R4 war das Peptid, das aus den Resten 654–674 von IA-2 bestand; R5 war das Peptid, das aus den Resten 709–732 von IA-2 bestand; R6 war das Peptid, das aus den Resten 955–975 von IA-2 bestand; und R6 war das Peptid, das aus den Resten 955–975 von IA-2 bestand; und li-c war das gleiche wie das Indikatorpeptid (d. h. ein aus den Resten 98–117 der invarianten Kette von Klasse-II-MHC bestehendes Peptid). Die in 3 gezeigten Daten zeigen, dass: R4 und R5 stark an HLA-DR4-Moleküle binden; li-c, R1 und R6 mit mittlerer Avidität binden, und R2 und R3 schwach binden. Diese Ergebnisse bestätigen, dass, wie durch die in Beispiel 1 beschriebenen IMF- und EV-Verfahren vorhergesagt, die sechs Konsensus-Peptide (R1, R2, R3, und R4-R6) alle an DR4-Moleküle binden. Dementsprechend können diese Art von Bindungsassay oder andere, die dem Fachmann bekannt sind (z. B. direkte Bindungsassays statt Bindungsinibitionsassays) als zusätzliche oder ersetzende EV-Verfahren in Bezug auf das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren verwendet werden.

Claims (29)

  1. In vitro-Verfahren zur Identifizierung eines Klasse-II-MHC-Bindungsfragments eines Polypeptids, wobei man bei diesem Verfahren: (a) einen Liganden, konjugiert mit einem ersten Biotinmolekül bereitstellt; (b) das mit einem zweiten Biotinmolekül konjugierte Polypeptid bereitstellt; (c) eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) eines Säugers bereitstellt, die ein Klasse-II-MHC-Molekül und einen Zelloberflächenrezeptor, der den Liganden bindet, exprimiert; (d) die APC mit dem Biotin-konjugierten Liganden aus (a), dem Biotin-konjugierten Polypeptid aus (b) und Avidin in Kontakt bringt, um einen Komplex zu bilden, der an den Zelloberflächenrezeptor bindet; (e) die APC unter Bedingungen hält, welche die Internalisierung des Komplexes durch die APC erlauben; (f) aus der APC ein Klasse-II-MHC-Molekül, gebunden an ein Peptid isoliert; (g) das Peptid von dem Klasse-II-MHC-Molekül eluiert, wobei das Peptid ein Klasse-II-MHC-Bindungsfragment des Polypeptids ist.
  2. In vitro-Verfahren zur Identifizierung eines Klasse-II-MHC-Bindungsfragments eines Polypeptids, wobei man bei diesem Verfahren: (a) einen Liganden, konjugiert mit einem Biotinmolekül, bereitstellt; (b) das Polypeptid, konjugiert mit einem Avidinmolekül, bereitstellt; (c) eine Säuger-APC bereitstellt, welche ein Klasse-II-MHC-Molekül und einen Zelloberflächenrezeptor, der den Liganden bindet, exprimiert; (d) die APC mit dem Biotin-konjugierten Liganden aus (a) und dem Avidin-konjugierten Polypeptid aus (b) in Kontakt bringt, um einen Komplex zu bilden, der an den Zelloberflächenrezeptor bindet; (e) die APC unter Bedingungen hält, welche die Internalisierung des Komplexes durch die APC erlauben; (f) aus der APC das Klasse-II-MHC-Molekül, gebunden an ein Peptid isoliert; (g) von dem Klasse-II-MHC-Molekül das Peptid eluiert, wobei das Peptid ein Klasse-II-MHC-Bindungsfragment des Polypeptids ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, zusätzlich umfassend den Schritt der Identifizierung der Aminosäuresequenz des Peptids.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Präsentation des Peptids durch ein Klasse-II-MHC-Molekül auf einer APC eines Säugers mit der Pathologie einer Säuger-Erkrankung assoziiert ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Präsentation des Peptids durch ein Klasse-II-MHC-Molekül auf einer APC eines Säugers mit dem Schutz vor einer Säuger-Erkrankung assoziiert ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Erkrankung eine Autoimmunerkrankung ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Erkrankung eine infektiöse Erkrankung oder Krebs ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die infektiöse Erkrankung eine bakterielle Erkrankung, eine virale Erkrankung oder eine parasitäre Erkrankung ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die infektiöse Erkrankung Leprose ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Myasthenia gravis, systemischer Lupus erythematosus, autoimmun induzierte vorzeitige Ovarialinsuffizienz, Graves-Thyroiditis, Hashimoto-Thyroiditis, primärer Hypothyroidismus, Zöliakie, primäre Gallenzirrhose, Autoimmun-Hepatitis, Addison-Erkrankung, Vitiligo, systemische Sklerose oder eine antiglomeruläre Basalmembran-Erkrankung ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Autoimmunerkrankung insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Polypeptid Preproinsulin, Proinsulin oder Insulin ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Polypeptid Glutaminsäuredecarboxylase (GAD65) ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Polypeptid IA-2-Tyrosinphosphatase (IA-2) oder Phogrin (IA-2β) ist.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die APC eine dendritische Zelle ist.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die APC ein Makrophage oder Monocyt ist.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die APC ein B-Lymphocyt ist.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin der Ligand ein Lectinmolekül ist, welches an den Zelloberflächenrezeptor auf einer APC bindet.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, worin das Lectinmolekül das Pokeweed-Mitogen aus Phytolacca americana ist.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin der Zelloberflächenrezeptor ein Zelloberflächenmolekül ist, das durch die APC internalisiert werden kann und der Ligand ein Antikörpermolekül ist, welches an das Zelloberflächenmolekül bindet.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Zelloberflächenmolekül ein Immunglobulinmolekül ist.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin der Säuger ein Mensch ist.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin das Klasse-II-MHC-Molekül ein DR-Molekül mit einer β-Kette ist, kodiert durch ein Gen, ausgewählt unter DRB1·0401, DRB1·0405 und DRB1·0101.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin das Klasse-II-MHC-Molekül ein DQ-Molekül ist, mit (a) einer α-Kette, kodiert von einem Gen, ausgewählt unter DQA1·0501 und DQA1·0301 und (b) einer β-Kette, kodiert von einem Gen, ausgewählt unter DQB1·0302, DQB1·0201 und DQB1·0501.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei man zusätzlich: (h) eine Population von APCs bereitstellt, welche das Klasse-II-MHC-Molekül mit dem daran gebundenen Peptid tragen; (i) die Population von APCs aus (h) mit CD4-Lymphozyten aus einem Individuum in Kontakt bringt, von dem man vermutet, dass es für einen Zustand suszeptibel ist, der mit der Präsentation des Peptids durch dieses Klasse-II-MHC-Molekül assoziiert ist, worin die APCs des Individuums das Klasse-II-MHC-Molekül tragen; und (j) bestimmt, ob die CD4-Lymphozyten das Klasse-II-MHC-gebundene Peptid erkennen, als Indikation dafür, dass das Peptid mit dem Zustand des Individuums assoziiert ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, worin die genannte Präsentation in einer pathologischen Antwort von CD4+ T-Lymphozyten resultiert.
  27. Verfahren nach Anspruch 25, worin die genannte Präsentation in einer protektiven Antwort von CD4+ T-Lymphozyten resultiert.
  28. Isoliertes Peptid mit einer Länge von weniger als 26 Aminosäuren, umfassend eine Sequenz VSSQFSDAAQASP (SEQ ID NO: 47).
  29. Isoliertes Peptid nach Anspruch 28 mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt unter VSSQFSDAAQASPSS (SEQ ID NO: 1); SVSSQFSDAAQASPS (SEQ ID NO: 2); SSVSSQFSDAAQASP (SEQ ID NO: 3); SVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 4); SRVSSVSSQFSDAAQASPSSHSST (SEQ ID NO: 5); SVSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWC (SEQ ID NO: 6); VSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWCE (SEQ ID NO: 7) und VSSVSSQFSDAAQASPSSHSS (SEQ ID NO: 8).
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