DE60026332T2 - Diagnose von einheimischer sprue/zöliakie mit hilfe von gliadinepitopen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Diagnose und Therapie von Bauchhöhlenerkrankungen bzw. Zöliakie und ein Gliadinprotein, welches nicht Zöliakie verursacht.
  • Eine Immunreaktion gegen Gliadin (eine Komponente von Gluten) in der Nahrung verursacht Zöliakie. Es ist bekannt, daß Immunantworten im Darmgewebe präferentiell auf Gliadin ansprechen, welches von einer Darm-Transglutaminase modifiziert worden ist. Zöliakie wird durch Detektion von Anti-Endomysium-Antikörpern diagnostiziert, aber dies erfordert eine Bestätigung durch das Aufspüren einer lymphozytischen Entzündung in Darmbiopsien. Die Entnahme einer derartigen Biopsie ist für den Patienten unangenehm.
  • Früher haben Forscher angenommen, daß nur intestinale T-Zell-Antworten eine akkurate Anzeige der Immunantwort gegen Gliadine bereitstellen. Deshalb haben sie sich auf die Untersuchung von T-Zell-Antworten in Darmgewebe konzentriert1. Zum Beispiel offenbart das EP 0 905 518 T-Zell-Epitope aus Glutenin und Gliadin. Diese werden spezifisch von intestinal abgeleiteten Gluten-spezifischen oder -empfindlichen T-Zellen erkannt. Die Peptide besitzen die Sequenzen SGQGSFQPSQQ (Gliadin 206–216; SEQ ID NR.: 4) und GQQGYYPTSPQQSGQ (Glutenin; SEQ ID NR.: 5). Gliadin-Epitope, welche eine Transglutaminase-Modifikation erfordern, (bevor sie von dem Immunsystem erkannt werden) sind bekannt2.
  • Die Erfinder haben das immundominante T-Zell-Epitop gefunden, welches vom Immunsystem bei Zöliakie erkannt wird, und haben gezeigt, daß dieses durch T-Zellen im peripheren Blut von Individuen mit Zöliakie erkannt wird. Solche T-Zellen waren festgestelltermaßen bei Häufigkeiten vorhanden, welche hoch genug waren, um ohne erneute Stimulation nachweisbar zu sein (d. h. ein "frisches Antwort"-Detektionssystem konnte angewandt werden). Das Epitop wurde unter Verwendung einer Nicht-T-Zell-Klonierung-basierenden Methode identifiziert, welche eine genauere Reflexion der Epitope, welche erkannt werden, vorsah. Das immundominante Epitop erfordert eine Transglutaminase-Modifikation (welche die Substitution eines besonderen Glutamins zu Glutamat verursacht) vor der Immunsystem-Erkennung.
  • Basierend auf dieser Arbeit haben die Erfinder einen Test entwickelt, welcher verwendet werden kann, um Zöliakie in einem frühen Stadium zu diagnostizieren. Der Test kann an einer Probe aus peripherem Blut durchgeführt werden, und deshalb wird eine Darm-Biopsie nicht erfordert. Der Test ist empfindlicher als die Antikörpertests, welche derzeitig verwendet werden.
  • Die Erfindung sieht somit ein Verfahren zum Diagnostizieren von Zöliakie, oder Anfälligkeit für Zöliakie, in einem Individuum vor, welches folgendes umfaßt:
    • (a) in Kontakt bringen einer Probe von dem Wirt mit einem Mittel, gewählt aus (i) der Epitopumfassenden Sequenz, bei welcher es sich handelt um SEQ ID NR.: 1 oder 2 oder eine äquivalente Sequenz aus einem natürlich vorkommenden Homolog des Gliadins, das durch SEQ ID NR.: 3 repräsentiert wird, (ii) einer Epitop-umfassenden Sequenz, umfassend: SEQ ID NR.: 1 oder eine äquivalente Sequenz aus einem natürlich vorkommenden Homolog des Gliadins, welches durch SEQ ID NR.: 3 repräsentiert wird, wobei das Epitop ein aus einem Gliadinprotein abgeleitetes isoliertes Oligopeptid ist, (iii) einem Analog von (i) oder (ii), welches in der Lage ist, von einem T-Zell-Rezeptor erkannt zu werden, der (i) oder (ii) erkennt, welches im Falle eines Peptidanalogs eine Länge von nicht mehr als 50 Aminosäuren aufweist, oder (iv) einem Produkt, umfassend zwei oder mehr Mittel, wie definiert in (i), (ii) oder (iii), und
    • (b) Bestimmen in vitro, ob T-Zellen in der Probe das Mittel erkennen, wobei die Erkennung durch die T-Zellen anzeigt, daß das Individuum Zöliakie aufweist oder dieser gegenüber empfindlich ist.
  • Die Erfindung sieht des Weiteren die Verwendung des Mittels zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Verwendung in einem Verfahren der Diagnose von Zöliakie oder Empfindlichkeit gegenüber Zöliakie in einem Individuum vor, wobei das Verfahren das Bestimmen umfaßt, ob T-Zellen des Individuums das Mittel erkennen, wobei die Erkennung durch die T-Zellen anzeigt, daß das Individuum Zöliakie aufweist oder ihr gegenüber empfindlich ist.
  • Das Ermitteln eines immundominanten Epitops, welches von Transglutaminase modifiziert wird, ermöglicht auch die Diagnose von Zöliakie auf Basis der Bestimmung, ob andere Typen an Immunantwort gegen dieses Epitop vorhanden sind. Somit sieht die Erfindung auch ein Verfahren der Diagnose von Zöliakie oder Anfälligkeit gegenüber Zöliakie in einem Individuum vor, welches das Bestimmen der Gegenwart eines Antikörpers, welcher an das Epitop bindet, in einer Probe aus dem Individuum umfaßt, wobei die Gegenwart des Antikörpers anzeigt, daß das Individuum Zöliakie aufweist oder dafür anfällig ist.
  • Die Erfindung sieht zusätzlich das Mittel bzw. Agens, gegebenenfalls in Assoziation mit einem Träger, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Zöliakie durch Tolerisierung von T-Zellen, welche das Mittel erkennen, vor. Ebenfalls vorgesehen wird ein Antagonist einer T-Zelle, welche einen T-Zell-Rezeptor aufweist, der (i) oder (ii) erkennt, gegebenenfalls in Assoziation mit einem Träger, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Zöliakie durch Antagonisieren derartiger T-Zellen. Weiterhin vorgesehen wird das Mittel oder ein Analog, welches einen Antikörper (der das Mittel bindet) bindet, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Zöliakie in einem Individuum durch Tolerisierung des Individuums, um die Herstellung eines derartigen Antikörpers zu verhindern.
  • Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Bestimmen vor, ob eine Zusammensetzung in der Lage ist, Zöliakie zu verursachen, umfassend das Bestimmen, ob ein Protein, welches fähig ist, durch eine Transglutaminase zu einer Oligopeptid-Sequenz, wie obenstehend definiert, modifiziert zu werden, in der Zusammensetzung vorhanden ist, wobei das Vorhandensein des Proteins anzeigt, daß die Zusammensetzung in der Lage ist, Zöliakie zu verursachen.
  • Die Erfindung stellt des Weiteren ein Mutanten-Gliadinprotein bereit, dessen Wildtypsequenz durch eine Transglutaminase zu einer Sequenz modifiziert werden kann, welche eine wie obenstehend definierte Epitop-umfassende Sequenz umfaßt, wobei jedoch dieses Mutanten-Gliadinprotein auf eine solche Weise modifiziert worden ist, daß es keine Sequenz enthält, welche durch eine Transglutaminase zu einer Sequenz modifiziert werden kann, die eine solche Epitop-umfassende Sequenz umfaßt; oder ein Fragment eines derartigen Mutanten-Gliadinproteins, welches mindestens 15 Aminosäuren lang ist und welches Sequenz umfaßt, die auf besagte Weise modifiziert worden ist.
  • Die Erfindung sieht auch ein Protein vor, welches eine Sequenz umfaßt, die in der Lage ist, an einen T-Zell-Rezeptor zu binden, wobei der T-Zell-Rezeptor das Mittel erkennt, und wobei die Sequenz in der Lage ist, einen Antagonismus einer T-Zelle, welche einen solchen T-Zell-Rezeptor trägt, zu verursachen.
  • Weiterhin sieht die Erfindung ein Nahrungsmittel vor, welches die obenstehend definierten Proteine umfaßt.
  • Die Erfindung wird durch die begleitenden Zeichnungen veranschaulicht, worin:
  • die 1 die von frisch isolierten PBMC (mononukleare Zellen aus peripherem Blut) hervorgebrachten IFNγ-ELISPOT-Antworten (vertikale Achse zeigt "Spot-Forming-Cells" pro 106 PBMC) auf Transglutaminase(tTG)-behandelten und unbehandelten Peptidpool 3 (jedes Peptid 10 μg/ml), einschließlich fünf überlappenden 15meren, welche A-Gliadin 51–85 (siehe Tabelle 1) überspannen, und einem Chymotrypsin-verdauten Gliadin (40 μg/ml), im Zöliakie-Subjekt 1, anfangs bei Remission im Anschluß an eine glutenfreie Diät, dann bei Herausforderung mit 200 g Brot täglich während drei Tagen vom Tag 1 an, zeigt (a). PBMC-IFNγ-ELISPOT-Antworten von Subjekt 2 auf tTG-behandelte A-Gliadin-Peptidpools 1–10, überspannend das vollständige A-Gliadin-Protein, während einer zehn Tage langen Brot-Herausforderung (b). Die horizontale Achse zeigt die Tage nach dem Beginn mit Brot an.
  • Die 2 zeigt PBMC-IFNγ-ELISPOT-Antworten auf den tTG-behandelten Peptidpool 3 (überspannend A-Gliadin 51–85) in 7 individuellen Zöliakie-Subjekten (die vertikale Achse zeigt "Spot-Forming-Cells" pro 106 PBMC), anfangend in der Remission nach Gluten-freier Diät, bei Herausforderung mit Brot während drei Tagen (Tage 1 bis 3). Die horizontale Achse zeigt die Tage nach dem Beginn mit Brot an. (a). PBMC-IFNg-Elispot-Antworten auf tTg-behandelte überlappende 15mer-Peptide, welche im Pool 3 eingeschlossen waren; die Balken repräsentieren die durchschnittliche Antwort (± Standardabweichung bzw. SEM) auf individuelle Peptide (10 μg/ml) in 6 Zöliakie-Subjekten am Tag 6 oder 7 (b). (In individuellen Subjekten wurden die ELISPOT-Antworten auf Peptide als ein Prozentsatz der Antwort, welche von Peptid 12 hervorgerufen wurde, berechnet – wie durch die vertikale Achse gezeigt wird).
  • Die 3 zeigt PBMC-IFNγ-ELISPOT-Antworten auf tTG-behandelte Trunkierungen von A-Gliadin 56–75 (0,1 μM). Die Balken repräsentieren den Mittelwert (± SEM) in 5 Zöliakie-Subjekten (in den individuellen Subjekten wurden die Antworten als der Prozentsatz der maximalen Antwort berechnet, welche von einem beliebigen der getesteten Peptide hervorgerufen wurde).
  • Die 4 zeigt, wie die Minimalstruktur des dominanten A-Gliadin-Epitops unter Verwendung von tTG-behandelten 7–17meren A-Gliadin-Peptiden (0,1 μM), welche die Sequenz PQPQLPY einschlossen (A-Gliadin 62–68) (a), sowie der gleichen Peptide ohne tTG-Behandlung, aber mit der Substitution Q→E65 (b), kartiert wurde. Jede Linie repräsentiert PBMC-IFNg-ELISPOT-Antworten in jedem von drei Zöliakie-Subjekten an Tag 6 oder 7, nachdem Brot an den Tagen 1–3 aufgenommen wurde. (In individuellen Subjekten wurden ELISPOT-Antworten als ein Prozentsatz der Antwort berechnet, welche von dem 17mer A-Gliadin 57–73 hervorgerufen wurde).
  • Die 5 zeigt die Aminosäuren, welche durch tTG desamidiert wurden. A-Gliadin 56–75 (LQLQPFPQPQLPYPQPQSFP) (0,1 μM) wurde 2 Stunden lang bei 37°C mit tTG (50 μg/ml) inkubiert. Ein einzelnes Produkt wurde identifiziert und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Eine Aminosäureanalyse ermöglichte die Berechnung der % Desamidierung (Q→E) jedes Gln-Restes in A-Gliadin 56–75, welche auf tTG zurückführbar war, (vertikale Achse).
  • Die 6 zeigt den Effekt der Substitution Q→E in A-Gliadin 57–73 an anderen Positionen zusätzlich zu Q65 unter Verwendung der 17mere: QLQPFPQPELPYPQPES (E57, 65), QLQPFPQPELPYPQPES (E65, 72), ELQPFPQPELPYPQPES (E57, 65, 72) und QLQPFPQPELPYPQPQS (E65) in drei Zöliakie-Subjekten am Tag 6 oder 7, nachdem Brot an den Tagen 1–3 aufgenommen wurde. Die vertikale Achse zeigt den Prozentsatz der E65-Antwort.
  • Die 7 zeigt, daß tTG-behandeltes A-Gliadin 56–75 (0,1 μM) IFN-g-ELISPOT-Antworten in (a) mittels magnetischen Kügelchen CD4- und CD8-depletierten PBMC hervorrief (die Säulen repräsentieren CD4-depletierte PBMC-Antworten als Prozentsatz von CD8-depletierten PBMC-Antworten; Spot-Forming-Cells pro Million CD8-depletierten PBMC beliefen sich auf: Subjekt 4: 29, und Subjekt 6: 535). (b) PBMC-IFNγ-ELISPOT-Antworten (Fleck-bildende Zellen/Million PBMC) nach Inkubation mit monoklonalen Antikörpern gegen HLA-DR (L243), -DQ (L2) und -DP (B7.21) (10 μg/ml) 1 Stunde vor tTG-behandeltem 56–75 (0,1 μM) in zwei Zöliakie-Subjekten, welche bezüglich HLA-DQ a1·0501, b1·0201 homozygot waren.
  • Die 8 zeigt den Effekt des Substituierens von Glu an der Position 65 für andere Aminosäuren in dem immundominanten Epitop. Die vertikale Achse zeigt die % Antwort in den 3 Subjekten in Bezug auf das immundominante Epitop.
  • Die 9 zeigt die Immunreaktivität von natürlich vorkommenden Gliadinpeptiden (wobei Antworten von 3 Subjekten gemessen werden), welche die Sequenz PQLPY enthalten, mit (schattiert) und ohne (hell) Transglutaminase-Behandlung.
  • Die 10 zeigt die CD8-, CD4-, β7- und αE-spezifische Depletion mittels immunmagnetischen Kügelchen von mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus zwei Zöliakie-Subjekten 6 Tage nach Beginnen der Gluten-Herausforderung, gefolgt von Interferon- Gamma-ELISpot. A-Gliadin 57–73 QE65 (25 mcg/ml), tTG-behandeltes Chymotrypsinverdautes Gliadin (100 mcg/ml) oder PPD (10 mcg/ml) wurden als Antigene verwendet.
  • Die 11 zeigt die optimale T-Zell-Epitop-Länge.
  • Die 12 zeigt einen Vergleich von A-Gliadin 57–73 QE65 mit anderen Peptiden in einer Dosis-Antwort-Untersuchung.
  • Die 13 zeigt einen Vergleich von für Gliadin und A-Gliadin 57–73 QE65 spezifischen Antworten.
  • Die 14 zeigt die Bioaktivität von Gliadin-Polymorphismen in Zöliakie-Subjekten.
  • Die 15 und 16 zeigen das Eingrenzen der Kern-Epitop-Sequenz.
  • Die 17 bis 27 zeigen die Agonistenaktivität von A-Gliadin 57–73 QE65-Varianten.
  • Die 28 zeigt Antworten in verschiedenen Patientengruppen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Der Begriff "Zöliakie" beinhaltet ein Spektrum von Leiden, welche von variierenden Graden der Gluten-Empfindlichkeit verursacht werden, einschließlich einer schweren Form, welche durch eine flache Dünndarm-Mukosa (hyperplastische villöse Atrophie) gekennzeichnet ist, und anderen Formen, welche durch mäßigere Symptome gekennzeichnet sind.
  • Das obenstehend (im Zusammenhang mit Diagnose oder Therapie) erwähnte Individuum ist menschlich. Sie können Zöliakie (symptomatisch oder asymptomatisch) aufweisen oder im Verdacht stehen, selbige aufzuweisen. Sie können eine Gluten-freie Diät befolgen. Sie können eine Antwort in der akuten Phase aufweisen (zum Beispiel können sie Zöliakie aufweisen, aber nur Gluten in den letzten 24 Stunden aufgenommen haben, wobei sie zuvor 14 bis 28 Tage lang auf einer Gluten-freien Diät gehalten wurden).
  • Das Individuum kann gegenüber Zöliakie empfindlich sein, wie z. B. eine genetische Anfälligkeit aufweisen (ermittelt beispielsweise dadurch, daß das Individuum Verwandte mit Zöliakie hat, oder Gene besitzt, welche eine Prädisposition für Zöliakie verursachen).
  • Das Mittel
  • Das Mittel ist typischerweise ein Peptid, beispielsweise mit einer Länge von 7 bis 50 Aminosäuren, wie 10 bis 40 oder 15 bis 30 Aminosäuren Länge.
  • SEQ ID NR.: 1 ist PQPELPY. SEQ ID NR.: 2 ist QLQPFPQPELPYPQPQS. SEQ ID NR.: 3 wird in der Tabelle 1 gezeigt und ist die Sequenz eines vollständigen A-Gliadins. Das Glutamat an der Position 4 von SEQ ID NR.: 1 (äquivalent zur Position 9 von SEQ ID NR.: 2) wird durch Transglutaminase-Behandlung von A-Gliadin erzeugt.
  • Das Mittel kann das Peptid sein, welches von SEQ ID NR.: 1 oder 2 repräsentiert wird, oder eine Epitop-umfassende Sequenz, die SEQ ID NR.: 1 umfaßt, welches ein isoliertes Oligopeptid ist, das aus einem Gliadinprotein abgeleitet ist; oder ein Äquivalent dieser Sequenzen aus einem natürlich vorkommenden Gliadinprotein, welches ein Homolog von SEQ ID NR.: 3 ist. Somit kann das Epitop ein Derivat des Proteins sein, welches von SEQ ID NR.: 3 repräsentiert wird. Ein solches Derivat ist typischerweise ein Fragment des Gliadins oder ein mutiertes Derivat des Gesamtproteins oder Fragmentes. Deshalb schließt das Epitop der Erfindung nicht dieses natürlich vorkommende gesamte Gliadinprotein ein und schließt nicht andere natürlich vorkommende gesamte Gliadine ein.
  • Das Epitop kann somit ein Fragment von A-Gliadin (z. B. SEQ ID NR.: 3) sein, welches die Sequenz von SEQ ID NR.: 1 umfaßt, erhältlich durch (vollständiges oder teilweises) Behandeln mit Transglutaminase, d. h. wobei 1, 2, 3 oder mehr Glutamine zu Glutamaten substituiert wurden (einschließlich der Substitution innerhalb von SEQ ID NR.: 1).
  • Solche Fragmente können die Sequenzen sein, oder selbige einschließen, welche durch die Positionen 55 bis 70, 58 bis 73, 61 bis 77 von SEQ ID NR.: 3, welche in Tabelle 1 gezeigt wird, repräsentiert werden. Typischerweise werden derartige Fragmente von T-Zellen wenigstens zu demselben Ausmaß erkannt, zu welchem die von SEQ ID NR.: 1 oder 2 repräsentierten Peptide in irgendeinem der hierin beschriebenen Assays erkannt werden, wobei Proben aus Zöliakie-Patienten verwendet werden.
  • In dem Fall, worin das Epitop eine Sequenz umfaßt, äquivalent zu den obenstehenden Epitopen (einschließlich Fragmenten) aus einem anderen Gliadinprotein (z. B. irgendeines der hierin erwähnten Gliadinproteine oder jedwede Gliadine, welche Zöliakie verursachen), werden derartige äquivalenten Sequenzen einem Fragment eines Gliadinproteins entsprechen, welches typischerweise (partiell oder vollständig) mit Transglutaminase behandelt worden ist. Solche äquivalenten Peptide können durch Alignieren der Sequenzen von anderen Gliadinproteinen mit der SEQ ID NR.: 3 (beispielsweise unter Verwendung irgendeines der hierin erwähnten Programme) bestimmt werden. Transglutaminase ist kommerziell erhältlich (z. B. Sigma T-5398). Die Tabelle 4 gibt Beispiele von geeigneten äquivalenten Sequenzen.
  • Das Mittel, welches ein Analog ist, kann von einem TCR erkannt werden, welcher (i) oder (ii) erkennt. Wenn das Analog zu T-Zellen in Gegenwart von (i) oder (ii) zugesetzt wird, typischerweise ebenfalls in Gegenwart einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) (wie einer beliebigen der hierin erwähnten APCs), inhibiert deshalb im allgemeinen das Analog die Erkennung von (i) oder (ii), d. h. das Analog ist in der Lage, mit (i) oder (ii) in einem solchen System zu kompetieren.
  • Das Analog kann ein solches sein, welches in der Lage ist, den TCR zu binden, welcher (i) oder (ii) erkennt. Eine solche Bindung kann durch Standardtechniken getestet werden. Solche TCRs können aus T-Zellen isoliert werden, von welchen gezeigt wurde, (i) oder (ii) zu erkennen (z. B. unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung). Eine Demonstration der Bindung des Analogs an die TCRs kann dann gezeigt werden durch Bestimmen, ob die TCRs die Bindung des Analogs an eine Substanz, welche das Analog bindet, z. B. einen Antikörper gegen das Analog, inhibieren. Typischerweise wird das Analog in einem derartigen Bindungs-Inhibitions-Assay an ein Klasse II-MHC-Molekül (z. B. HLA-DQ2) gebunden.
  • Typischerweise inhibiert das Analog die Bindung von (i) oder (ii) an einen TCR. In diesem Fall wird die Menge an (i) oder (ii), welche den TCR in Gegenwart des Analogs binden kann, verringert. Dies beruht darauf, daß das Analog in der Lage ist, den TCR zu binden, und deshalb mit (i) oder (ii) um die Bindung an den TCR kompetiert.
  • T-Zellen zur Verwendung in den obenstehenden Bindungsexperimenten können aus Patienten mit Zöliakie isoliert werden, beispielsweise mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung. Andere Bindungs-Charakteristika des Analogs können ebenfalls dieselben wie von (i) oder (ii) sein, und somit bindet das Analog typischerweise an dasselbe MHC-Klasse II-Molekül, an welches das Peptid bindet (HLA-DQ). Das Analog bindet typischerweise an für (i) oder (ii) spezifische Antikörper und inhibiert somit die Bindung von (i) oder (ii) an derartige Antikörper.
  • Das Analog ist typischerweise ein Peptid. Es kann Homologie mit (i) oder (ii), typischerweise mindestens 70 % Homologie, vorzugsweise mindestens 80, 90 %, 95 %, 97 % oder 99 % Homologie mit (i) oder (ii) aufweisen, zum Beispiel über eine Region von mindestens 15 weiteren benachbarten Aminosäuren hinweg (wie die gesamte Länge von dem Analog und/oder von (i) oder (ii) oder über die Region hinweg, welche den TCR kontaktiert oder das von (i) oder (ii) oder über die Region hinweg, welche den TCR kontaktiert oder das MHC-Molekül bindet). Verfahren zum Messen von Proteinhomologie sind im Fachgebiet gut bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, daß im vorliegenden Zusammenhang Homologie auf der Grundlage von Aminosäureidentität berechnet wird (was manchmal als "harte Homologie" bezeichnet wird).
  • Zum Beispiel stellt das UWGCG-Paket das BESTFIT-Programm bereit, welches zum Berechnen von Homologie verwendet werden kann (zum Beispiel bei Verwendung mit seinen Standardeinstellungen) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, S. 387–395). Die Algorithmen PILEUP und BLAST können verwendet werden, um Homologie zu berechnen oder Sequenzen aufzulisten (typischerweise bei ihren Standardeinstellungen), zum Beispiel wie beschrieben in Altschul, S. F. (1993) J. Mol. Evol. 36: 290–300; Altschul, S. F., et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10.
  • Software zum Durchführen von BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnologie Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich erhältlich. Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren eines hoch bewerteten Sequenzpaares (HSPs) durch Identifizieren von kurzen Wörtern der Länge W in der Suchsequenz, welche entweder einem positiv bewerteten Schwellenwert T entsprechen oder diesen erfüllen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz aligniert werden. T wird als die Nachbarschafts-Wort-Bewertungsschwelle bezeichnet (Altschul et al., siehe oben). Diese anfänglichen Nachbarschafts-Worttreffer fungieren als Ausgangspunkte für das Beginnen von Suchprozessen, um HSPs zu finden, welche diese enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz so weit verlängert, wie die kumulative Alignierungs-Bewertung erhöht werden kann. Die Verlängerungen für die Worttreffer in jeder Richtung werden angehalten wenn: die kumulative Alignierungs-Bewertung um die Größe X von ihrem maximal erzielten Wert abfällt; die kumulative Bewertung aufgrund der Akkumulierung von einer oder mehreren negativ bewerteten Rest-Alignierungen gleich Null oder niedriger wird; oder wenn das Ende von einer der beiden Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Alignierung. Das BLAST-Programm verwendet als Standard eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62-Bewertungsmatrix (siehe Henikoff und Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915–10919), Alignierungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge.
  • Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch; siehe z. B. Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873– 5787. Ein Maß der Ähnlichkeit, welches von dem BLAST-Algorithmus vorgesehen wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), welche eine Anzeige der Wahrscheinlichkeit liefert, mit welcher eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Zum Beispiel wird eine Sequenz als ähnlich zu einer anderen Sequenz betrachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit im Vergleich der ersten Sequenz zu der zweiten Sequenz geringer als etwa 1, vorzugsweise geringer als etwa 0,1, weiter bevorzugt geringer als etwa 0,01 und am stärksten bevorzugt geringer als etwa 0,001 ist.
  • Die homologen Peptidanaloge unterscheiden sich typischerweise von (i) oder (ii) um 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder mehr Mutation (welche Substitutionen, Deletionen oder Insertionen sein können). Diese Mutationen können über irgendeine der obenstehend in Bezug auf die Berechnung der Homologie erwähnten Regionen hinweg gemessen werden. Die Substitutionen sind vorzugsweise "konservativ". Diese sind gemäß der nachfolgenden Tabelle definiert. Aminosäuren im selben Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in derselben Zeile in der dritten Spalte können füreinander substituiert werden.
  • Figure 00100001
  • Typischerweise sind die Aminosäuren in dem Analog an den äquivalenten Positionen zu Aminosäuren in (i) oder (ii), welche zur Bindung des MHC-Moleküls beitragen oder für die Erkennung durch den TCR verantwortlich sind, gleich oder sind konserviert.
  • Typischerweise umfaßt das Analogpeptid eine oder mehrere Modifikationen, welche natürliche Post-Translations-Modifikationen oder künstliche Modifikationen sein können. Die Modifikation kann eine chemische Einheit (typischerweise durch Substitution eines Wasserstoffs, z. B. einer C-H-Bindung), wie eine Amino-, Acetyl-, Hydroxy- oder Halogen-Gruppe (z. B. Fluor) oder eine Kohlenhydratgruppe bereitstellen. Typischerweise ist die Modifikation auf dem N- oder C-Terminus vorhanden.
  • Das Analog kann eine oder mehrere nicht-natürliche Aminosäuren, zum Beispiel Aminosäuren mit einer von natürlichen Aminosäuren verschiedenen Seitenkette, umfassen. Im allgemeinen wird die nicht-natürliche Aminosäure einen N-Terminus und/oder einen C-Terminus aufweisen. Die nicht-natürliche Aminosäure kann eine L- oder eine D-Aminosäure sein.
  • Das Analog besitzt typischerweise eine Gestalt, Größe, Flexibilität oder Elektronen-Konfiguration, welche im wesentlichen ähnlich zu (i) oder (ii) ist. Es ist typischerweise ein Derivat von (i) oder (ii). In einer Ausführungsform ist das Analog ein Fusionsprotein, welches die Sequenz von SEQ ID NR.: 1 oder 2, oder irgendeines der hierin erwähnten anderen Peptide; und eine Nicht-Gliadin-Sequenz umfaßt.
  • In einer Ausführungsform ist das Analog (i) oder (ii), gebunden an ein MHC-Klasse II-Molekül, oder ahmt diese nach. 2, 3, 4 oder mehr derartige Komplexe können assoziiert oder aneinander gebunden sein, zum Beispiel unter Verwendung eines auf Biotin/Streptavidin basierenden Systems, in welchem typischerweise 2, 3 oder 4 Biotin-markierte MHC-Moleküle an eine Streptavidin-Einheit binden. Dieses Analog inhibiert typischerweise die Bindung des (i)- oder (ii)/MHC-Klasse II-Komplexes an einen TCR oder Antikörper, welcher spezifisch für den Komplex ist.
  • Das Analog ist typischerweise ein Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers, wie ein Fab- oder (Fab)2-Fragment. Das Analog kann auf einem festen Träger immobilisiert werden, insbesondere ein Analog, welches ein an ein MHC-Molekül gebundenes Peptid nachahmt.
  • Das Analog wird typischerweise durch Computer-Methoden entworfen und dann unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren synthetisiert. Alternativ dazu kann das Analog aus einer Bibliothek von Verbindungen gewählt werden. Die Bibliothek kann eine kombinatorische Bibliothek oder eine Display-Bibliothek, wie eine Phagen-Display-Bibliothek, sein. Die Bibliothek von Verbindungen kann in der Display-Bibliothek in der Form, an ein MHC-Klasse II-Molekül, wie HLA-DQ, gebunden zu sein, exprimiert werden. Analoge werden im allgemeinen aus der Bibliothek basierend auf ihrer Fähigkeit selektiert, die Bindungscharakteristika von (i) oder (ii) nachzuahmen. Somit können sie basierend auf der Fähigkeit selektiert werden, einen TCR oder Antikörper zu binden, welcher (i) oder (ii) erkennt.
  • Typischerweise werden Analoge von T-Zellen wenigstens zu demselben Ausmaß erkannt, wie irgendeines der Mittel (i) oder (ii), zum Beispiel wenigstens zu dem gleichen Ausmaß wie das äquivalente Epitop und vorzugsweise zu dem gleichen Ausmaß wie das Peptid, welches von SEQ ID NR.: 2 repräsentiert wird, in irgendeinem der hierin beschriebenen Assays erkannt wird, typischerweise unter Verwendung von T-Zellen aus Zöliakie-Patienten. Analoge können zu diesen Ausmaßen in vivo erkannt werden und können somit in der Lage sein, Zöliakie-Symptome zu wenigstens dem gleichen Ausmaß zu induzieren, wie irgendeines der hierin erwähnten Mittel (z. B. in einem humanen Patienten oder einem Tiermodell).
  • Analoge können in einem Verfahren identifiziert werden, umfassend das Bestimmen, ob eine Kandidatensubstanz von einem T-Zell-Rezeptor erkannt wird, welcher ein Epitop der Erfindung erkennt, wobei die Erkennung der Substanz anzeigt, daß die Substanz ein Analog ist. Solche TCRs können beliebige der hierin erwähnten TCRs sein und können auf T-Zellen vorhanden sein. Jedweder hierin erwähnte geeignete Assay kann angewandt werden, um das Analog zu identifizieren. In einer Ausführungsform wird dieses Verfahren in vivo durchgeführt. Wie obenstehend erwähnt, werden bevorzugte Analoge zu wenigsten dem gleichen Ausmaß wie das Peptid SEQ ID NR.: 2 erkannt, und so kann das Verfahren angewandt werden, um Analoge zu identifizieren, welche zu diesem Ausmaß erkannt werden.
  • In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Bestimmen, ob eine Kandidatensubstanz in der Lage ist, die Erkennung eines Epitops der Erfindung zu inhibieren, wobei eine Inhibition der Erkennung anzeigt, daß die Substanz ein Analog ist.
  • Das Mittel kann ein Produkt sein, welches mindestens 2, 5, 10 oder 20 Mittel, wie definiert durch (i), (ii) oder (iii) umfaßt. Typischerweise umfaßt die Zusammensetzung Epitope der Erfindung (oder äquivalente Analoge) aus verschiedenen Gliadinen, wie irgendwelchen der Spezies oder Vielfalt oder Typen an Gliadin, die hierin erwähnt werden. Bevorzugte Zusammensetzungen umfassen mindestens ein Epitop der Erfindung, oder ein äquivalentes Analog, aus allen der Gliadine, welche in irgendeiner der hierin erwähnten Spezies oder Varietät vorhanden sind, oder von 2, 3, 4 oder mehr der hierin erwähnten Spezies (wie aus der Palette von Spezies, welche aus Weizen, Roggen, Gerste, Hafer und Tritikale besteht).
  • Diagnose
  • Wie obenstehend erwähnt, kann das Diagnoseverfahren der Erfindung auf der Detektion von T-Zellen beruhen, welche das Mittel binden, oder auf der Detektion von Antikörpern, welche das Mittel erkennen.
  • Die T-Zellen, welche das Mittel in dem Verfahren erkennen (welches die obenstehend erwähnte Verwendung einschließt), sind im allgemeinen T-Zellen, welche in vivo gegenüber Gliadin vorsensitiviert worden sind. Wie obenstehend erwähnt, ist von derartigen Antigenerfahrenen T-Zellen festgestellt worden, im peripheren Blut vorhanden zu sein.
  • In dem Verfahren können die T-Zellen mit dem Mittel in vitro oder in vivo kontaktiert werden, und die Bestimmung, ob die T-Zellen das Mittel erkennen, kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Somit sieht die Erfindung das Mittel zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose vor, welches am menschlichen Körper ausgeführt wird. Unterschiedliche Mittel werden für simultane, separate oder sequenzielle Verwendung in einem derartigen Verfahren bereitgestellt.
  • Das in vitro-Verfahren wird typischerweise in wäßriger Lösung ausgeführt, in welche das Mittel zugegeben wird. Die Lösung wird auch die T-Zellen (und in bestimmten Ausführungsformen die nachstehend erörterten APCs) umfassen. Der Begriff "Kontaktieren", wie hierin verwendet, schließt das Zugeben der jeweiligen Substanz zu der Lösung ein.
  • Die Bestimmung, ob die T-Zellen das Mittel erkennen, wird im allgemeinen durch Detektieren einer Veränderung im Zustand der T-Zellen in Gegenwart des Mittels oder durch Bestimmen, ob die T-Zellen das Mittel binden, vorgenommen. Die Veränderung im Zustand wird im allgemeinen durch Antigen-spezifische funktionelle Aktivität der T-Zelle verursacht, nachdem der TCR das Mittel bindet. Die Veränderung des Zustands kann innerhalb (z. B. Änderung der intrazellulären Expression von Proteinen) oder außerhalb (z. B. Detektion von sezernierten Substanzen) der T-Zellen gemessen werden.
  • Die Veränderung im Zustand der T-Zelle kann der Beginn oder eine Erhöhung der Sekretion einer Substanz, wie einem Cytokin, speziell IFN-γ, IL-2 oder TFN-α, aus der T-Zelle sein. Die Bestimmung der IFN-γ-Sekretion wird besonders bevorzugt. Die Substanz kann typischerweise detektiert werden, indem ihr gestattet wird, an ein spezifisches Bindungsmittel zu binden, und dann die Gegenwart des spezifischen Bindungsmittel/Substanz-Komplexes gemessen wird. Das spezifische Bindungsmittel ist typischerweise ein Antikörper, wie polyklonale oder monoklonale Antikörper. Antikörper gegen Cytokine sind kommerziell erhältlich oder können unter Anwendung von Standardtechniken hergestellt werden.
  • Typischerweise wird das spezifische Bindungsmittel auf einem festen Träger immobilisiert. Nachdem die Substanz binden gelassen worden ist, kann der feste Träger gegebenenfalls gewaschen werden, um Material zu entfernen, welches nicht spezifisch an das Mittel gebunden ist. Der Mittel/Substanz-Komplex kann durch Verwendung eines zweiten Bindungsmittels detektiert werden, welches den Komplex binden wird. Typischerweise bindet das zweite Mit tel die Substanz an einer Stelle, welche verschieden von der Stelle ist, welche das erste Mittel bindet. Das zweite Mittel ist vorzugsweise ein Antikörper und ist direkt oder indirekt durch eine detektierbare Markierung markiert.
  • Somit kann das zweite Mittel durch ein drittes Mittel detektiert werden, welches typischerweise direkt oder indirekt durch eine detektierbare Markierung markiert ist. Zum Beispiel kann das zweite Mittel eine Biotineinheit umfassen, was eine Detektion durch ein drittes Mittel, welches eine Streptavidin-Einheit und typischerweise alkalische Phosphatase als eine nachweisbare Markierung umfaßt, gestattet.
  • In einer Ausführungsform ist das Detektionssystem, welches angewandt wird, der ex-vivo ELISPOT-Assay, welcher in WO 98/23960 beschrieben ist. In diesem Assay wird aus der T-Zelle sezerniertes IFN-γ von einem ersten IFN-γ-spezifischen Antikörper gebunden, welcher auf einem festen Träger immobilisiert ist. Das gebundene IFN-γ wird dann unter Verwendung eines zweiten IFN-γ-spezifischen Antikörpers detektiert, der mit einer detektierbaren Markierung markiert ist. Ein derartiger markierter Antikörper kann von MABTECH (Stockholm, Schweden) erhalten werden. Andere detektierbare Markierungen, welche verwendet werden können, werden nachstehend erörtert.
  • Bei der Änderung im Zustand der T-Zelle, welche gemessen werden kann, kann es sich um die Erhöhung der Aufnahme von Substanzen durch die T-Zelle handeln, wie bei der Aufnahme von Thymidin. Die Veränderung im Zustand kann eine Erhöhung der Größe der T-Zellen oder eine Proliferation der T-Zellen oder eine Änderung der Zelloberflächenmarker auf der T-Zelle sein.
  • In einer Ausführungsform wird die Änderung des Zustands durch Messen der Änderung der intrazellulären Expression von Proteinen detektiert, beispielsweise der Zunahme der intrazellulären Expression von irgendeinem der obenstehend erwähnten Cytokine. Solche intrazellulären Änderungen können durch Kontaktieren des Inneren der T-Zelle mit einer Einheit detektiert werden, welche die exprimierten Proteine in einer spezifischen Weise bindet und welche das Sortieren der T-Zellen durch Flußcytometrie gestattet.
  • Wenn es den TCR bindet, wird, in einer Ausführungsform, das Mittel an ein MHC-Klasse II-Molekül (typischerweise HLA-DQ2) gebunden, welches typischerweise auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) vorhanden ist. Wie hierin erwähnt, können jedoch andere Mittel einen TCR binden, ohne die Notwendigkeit, ebenfalls ein MHC-Molekül zu binden.
  • Im allgemeinen werden die T-Zellen, welche in dem Verfahren kontaktiert werden, aus dem Individuum in einer Blutprobe entnommen, obwohl andere Typen von Proben, welche T-Zellen enthalten, verwendet werden können. Die Probe kann direkt zu dem Assay zugegeben oder zuerst verarbeitet werden. Typischerweise kann die Verarbeitung das Verdünnen der Probe, zum Beispiel mit Wasser oder Puffer, umfassen. Typischerweise wird die Probe von 1,5- bis 100fach, zum Beispiel 2- bis 50- oder 5- bis 10fach, verdünnt.
  • Die Verarbeitung kann das Trennen von Komponenten der Probe umfassen. Typischerweise werden mononukleare Zellen (MCs) aus den Proben abgetrennt. Die MCs werden die T-Zellen und APCs umfassen. Somit können in dem Verfahren die in den abgetrennten MCs vorhandenen APCs das Peptid an die T-Zellen präsentieren. In einer anderen Ausführungsform können lediglich T-Zellen, wie lediglich CD4-T-Zellen, aus der Probe gereinigt werden. PBMCs, MCs und T-Zellen können aus der Probe unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken getrennt werden, wie denjenigen, die in Lalvani et al. (1997) J. Exp. Med. 186, S. 859–865, beschrieben werden.
  • In einer Ausführungsform liegen die im Assay verwendeten T-Zellen in der Form von unverarbeiteten oder verdünnten Proben vor oder sind frisch isolierte T-Zellen (wie in der Form von frisch isolierten MCs oder PBMCs), welche direkt ex-vivo verwendet werden, d. h. sie werden nicht vor Einsatz in den Verfahren kultiviert. Somit sind die T-Zellen nicht in einer Antigenspezifischen Weise in vitro restimuliert worden. Allerdings können die T-Zellen vor der Verwendung kultiviert werden, zum Beispiel in Gegenwart von einem oder mehreren der Mittel, und im allgemeinen auch von exogenen wachstumsfördernden Cytokinen. Während der Kultivierung sind die(das) Mittel typischerweise auf der Oberfläche von APCs vorhanden, wie den APCs, welche in dem Verfahren verwendet werden. Eine Vor-Kultivierung der T-Zellen kann zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit des Verfahrens führen. Somit können die T-Zellen zu Zelllinien umgewandelt werden, wie Kurzfrist-Zelllinien (zum Beispiel wie beschrieben in Ota et al. (1990) Nature 346, S. 183–187).
  • Die APC, welche typischerweise in dem Verfahren vorhanden ist, kann aus dem gleichen Individuum, wie die T-Zelle, oder aus einem unterschiedlichen Wirt sein. Die APC kann eine natürlich vorkommende APC oder eine künstliche APC sein. Die APC ist eine Zelle, welche in der Lage zum Präsentieren des Peptids an eine T-Zelle ist. Sie ist typischerweise eine B-Zelle, eine dendritische Zeile oder ein Makrophage. Sie wird typischerweise aus derselben Probe wie die T-Zelle abgetrennt und wird typischerweise mit der T-Zelle gemeinsam gereinigt. Somit kann die APC in MCs oder PBMCs vorhanden sein. Die APC ist typischerweise eine frisch isolierte ex vivo-Zelle oder eine kultivierte Zelle. Sie kann in der Form einer Zelllinie, wie einer kurzfristigen oder immortalisierten Zelllinie vorliegen. Die APC kann leere MHC-Klasse II-Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimieren.
  • In dem Verfahren können ein oder mehrere (unterschiedliche) Mittel verwendet werden. Typischerweise können die aus der Probe abgeleiteten T-Zellen mit all den Mitteln in einen Assay eingebracht werden, für die ein Test beabsichtigt wird, oder die T-Zellen können aufgeteilt und in getrennte Assays eingebracht werden, von denen jeder ein oder mehrere der Mittel enthält.
  • Die Erfindung sieht ebenfalls die Mittel, wie zwei oder mehr beliebige der hierin erwähnten Mittel (z. B. die Kombinationen von Mitteln, welche in dem obenstehend erörterten Zusammensetzungsmittel vorhanden sind) zur gleichzeitigen, separaten oder sequenziellen Verwendung vor (z. B. für in vivo-Verwendung).
  • In einer Ausführungsform wird das Mittel an sich direkt in einen Assay zugesetzt, welcher T-Zellen und APCs umfaßt. Wie obenstehend erörtert, könnten die T-Zellen und APCs in einem derartigen Assay in der Form von MCs vorliegen. Wenn Mittel, welche von der T-Zelle ohne die Notwendigkeit für eine Präsentation durch APCs erkannt werden können, verwendet werden, dann sind APCs nicht erdorderlich. Analoge, welche das originale (i) oder (ii), gebunden an ein MHC-Molekül, nachahmen, sind ein Beispiel für ein solches Mittel.
  • In einer Ausführungsform wird das Mittel an die APC in Abwesenheit der T-Zelle zugeführt. Die APC wird dann der T-Zelle zur Verfügung gestellt, typischerweise nachdem ihr gestattet wurde, das Mittel auf ihrer Oberfläche zu präsentieren. Das Peptid kann in das Innere der APC aufgenommen und präsentiert worden sein oder lediglich auf die Oberfläche aufgenommen worden sein, ohne in das Innere der APC eingetreten zu sein.
  • Die Dauer, während der das Mittel mit den T-Zellen kontaktiert wird, wird in Abhängigkeit von dem Verfahren variieren, welches für das Bestimmen der Erkennung des Peptids eingesetzt wird. Typischerweise werden 105 bis 107, vorzugsweise 5 × 105 bis 106 PBMCs in jeden Assay zugesetzt. In dem Fall, worin das Mittel direkt zu dem Assay gegeben wird, beläuft sich seine Konzentration auf 10–1 bis 103 μg/ml, vorzugsweise 0,5 bis 50 μg/ml oder 1 bis 10 μg/ml.
  • Typischerweise beläuft sich die Länge der Zeit, während der die T-Zellen mit dem Mittel inkubiert werden, auf 4 bis 24 Stunden, vorzugsweise 6 bis 16 Stunden. Wenn ex vivo-PBMCs verwendet werden, ist festgestellt worden, daß 0,3 × 106 PBMCs in 10 μg/ml Peptid während 12 Stunden bei 37°C inkubiert werden können.
  • Die Bestimmung der Erkennung des Mittels durch die T-Zellen kann durch Messen der Bindung des Mittels an die T-Zellen erfolgen (dies kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten hierin erörterten Bindungs-Assayformats durchgeführt werden). Typischerweise können T-Zellen, die das Mittel binden, auf Basis dieser Bindung sortiert werden, zum Beispiel unter Verwendung einer FACS-Maschine. Das Vorhandensein von T-Zellen, welche das Mittel erkennen, wird schätzungsweise auftreten, wenn die Häufigkeit von unter Verwendung des Mittels sortierten Zellen überhalb eines "Kontroll"-Wertes liegt. Die Häufigkeit von Antigen-erfahrenen T-Zellen beträgt im allgemeinen 1 von 106 bis 1 von 103, und deshalb kann bestimmt werden, ob die sortierten Zellen Antigen-erfahrene T-Zellen sind, oder nicht.
  • Die Bestimmung der Erkennung des Mittels durch die T-Zellen kann in vivo gemessen werden. Typischerweise wird das Mittel an den Wirt verabreicht, und dann kann eine Antwort gemessen werden, welche die Erkennung des Mittels anzeigt. Das Mittel wird typischerweise intradermal oder epidermal verabreicht. Das Mittel wird typischerweise durch Inkontaktbringen mit der Außenseite der Haut verabreicht und kann mit Hilfe eines Pflasters oder eines Verbandes an der Stelle zurückgehalten werden. Alternativ dazu kann das Mittel per Nadel, wie durch Injektion, verabreicht werden, kann aber auch durch andere Verfahren, wie Ballistik, verabreicht werden (z. B. die Ballistiktechniken, welche verwendet worden sind, um Nukleinsäuren zuzuführen). Die EP-A-0 693 119 beschreibt Techniken, welche typischerweise angewandt werden können, um das Mittel zu verabreichen. Typischerweise werden 0,001 bis 1000 μg, beispielsweise 0,01 bis 100 μg oder 0,1 bis 10 μg Mittel verabreicht.
  • In einer Ausführungsform kann ein Produkt verabreicht werden, welches zum Bereitstellen des Mittels in vivo in der Lage ist. So kann ein Polynukleotid, das fähig zum Exprimieren des Mittels ist, typischerweise auf einem beliebigen der oben für die Verabreichung des Mittels beschriebenen Wege verabreicht werden. Das Polynukleotid bestitzt typischerweise jegliche der Charakteristika des von der Erfindung bereitgestellten Polynukleotides, welches nachstehend erörtert wird. Das Mittel wird von dem Polynukleotid in vivo exprimiert. Typischerweise werden 0,001 bis 1000 μg, zum Beispiel 0,01 bis 100 μg oder 0,1 bis 10 μg Polynukleotid verabreicht.
  • Die Erkennung des an die Haut verabreichten Mittels wird typischerweise durch das Auftreten von Entzündung (z. B. Verhärtung, Rötung oder Ödem) an der Verabreichungsstelle angezeigt. Dies wird im allgemeinen durch visuelle Untersuchung der Stelle gemessen.
  • Das auf der Detektion eines Antikörpers, der das Mittel bindet, basierende Verfahren zur Diagnose wird typischerweise durch in Kontakt bringen einer Probe aus dem Individuum (wie einer beliebigen der hierin erwähnten Proben, die gegebenenfalls in einer beliebigen hierin erwähnten Weise verarbeitet wurde) mit dem Mittel und Bestimmen, ob ein Antikörper in der Probe das Mittel bindet, durchgeführt, wobei eine derartige Bindung anzeigt, daß das Individuum Zöliakie aufweist oder dieser gegenüber empfindlich ist. Jedes geeignete Bindungsassay-Format kann angewandt werden, wie jegliches hierin erwähnte derartige Format.
  • Therapie
  • Die Identifizierung des immundominanten Epitops gestattet die Herstellung der therapeutischen Produkte, welche auf die T-Zellen abzielen, die dieses Epitop erkennen (wobei derartige T-Zellen solche sind, die an der Immunantwort gegen Gliadin teilnehmen). Diese Feststellung ermöglicht auch die Prävention oder Behandlung von Zöliakie durch Unterdrücken (mittels Tolerisierung) einer Antikörper- oder 7-Zell-Antwort auf das Epitop.
  • Bestimmte Mittel der Erfindung binden den TCR, der das Epitop der Erfindung erkennt (wie unter Anwendung eines beliebigen der obenstehend erörteten Bindung-Assays gemessen wird) und verursachen eine Tolerisierung der T-Zelle, welche den TCR trägt. Solche Mittel können, gegebenenfalls in Assoziation mit einem Träger, deshalb verwendet werden, um Zöliakie zu verhindern oder zu behandeln.
  • Im allgemeinen kann eine Tolerisierung durch die selben Peptide verursacht werden, welche (nachdem sie durch den TCR erkannt wurden) eine Antigen-spezifische funktionelle Aktivität der T-Zelle verursachen (wie eine beliebige hierin erwähnte derartige Aktivität, z. B. Sekretion von Cytokinen). Solche Mittel verursachen eine Tolerisierung, wenn sie dem Immunsystem in einem "tolerisierenden" Kontext präsentiert werden.
  • Die Tolerisierung führt zu einer Verringerung der Erkennung eines T-Zell- oder Antikörper-Epitops durch das Immunsystem. Im Fall eines T-Zell-Epitops kann dies durch die Deletion oder das Anergiesieren von T-Zellen verursacht werden, welche das Epitop erkennen. Somit wird die T-Zell-Aktivität (zum Beispiel wie gemessen in hierin erwähnten geeigneten Assays) in Antwort auf das Epitop vermindert. Die Tolerisierung einer Antikörperantwort bedeutet, daß eine verringerte Menge an spezifischem Antikörper gegen das Epitop hergestellt wird, wenn das Epitop verabreicht wird.
  • Verfahren zum Präsentieren von Antigenen an das Immunsystem in einem derartigen Kontext sind bekannt und werden zum Beispiel in Yoshida et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 82, 207–215 (1997), Thurau et al., Clin. Exp. Immunol. 109, 370–6 (1997), und Weiner et al., Res. Immunol. 148, 528–33 (1997), beschrieben. Insbesondere können bestimmte Verabreichungswege, wie orale, nasale oder intraperitoneale Wege, eine Tolerisierung herbeiführen. Besondere Produkte, welche Tolerisierung herbeiführen, können an das Individuum verabreicht werden (z. B. in einer Zusammensetzung, welche auch das Mittel umfaßt). Derartige Produkte schließen Cytokine, wie Cytokine, die eine Th2-Antwort begünstigen (z. B. IL-4, TGF-β oder IL-10) ein. Produkte oder Mittel können bei einer Dosis verabreicht werden, welche eine Tolerisierung verursacht.
  • Die Erfindung sieht ein Protein vor, das eine Sequenz umfaßt, die in der Lage ist, als ein Antagonist der T-Zelle zu wirken (wobei die T-Zelle das Mittel erkennt). Solche Proteine und solche Antagonisten können auch verwendet werden, um Zöliakie zu verhindern oder zu behandeln. Der Antagonist wird eine Verringerung der T-Zell-Antwort verursachen. In einer Ausführungsform bindet der Antagonist den TCR der T-Zelle (im allgemeinen in der Form eines Komplexes mit HLA-DQ2), aber anstatt eine normale funktionelle Aktivierung zu verursachen, wird ein abnormales Signal hervorgerufen, das über die intrazelluläre TCR-Signalleitungs-Kaskade weitergeleitet wird, welches verursacht, daß die T-Zelle eine verringerte Funktions-Aktivität (z. B. in Antwort auf die Erkennung eines Epitops, typischerweise wie gemessen durch einen beliebigen hierin erwähnten geeigneten Assay) aufweist.
  • In einer Ausführungsform konkurriert der Antagonist mit Epitop um die Bindung einer Komponente des MHC-Prozessierungs- und -Präsentationsweges, wie ein MHC-Molekül (typischerweise HLA-DQ2). Somit kann der Antagonist HLA-DQ2 binden (und daher ein Peptid sein, das von diesem MHC-Molekül präsentiert wird), wie das Peptid TP (Tabelle 10) oder ein Homolog davon.
  • Verfahren zur Verursachung von Antagonismus sind im Fachgebiet bekannt. In einer Ausführungsform ist der Antagonist ein Homolog der obenstehend erwähnten Epitope und kann beliebige unter den Sequenz-, Bindungs- oder anderen Eigenschaften des Mittels aufweisen (insbesondere Analoge). Die Antagonisten unterscheiden sich typischerweise von irgendeinem der obenstehenden Epitope (welche in der Lage sind, eine normale antigenspezifische Funktion in der T-Zelle herbeizuführen) durch 1, 2, 3, 4 oder mehr Mutationen (von denen jede eine Substituion, Insertion oder Deletion sein kann). Solche Antagonisten werden im Fachgebiet als abgewandelte Peptid-Liganden bzw. "altered peptide ligands" oder "APL" bezeichnet. Die Mutationen liegen typischerweise an den Aminosäurepositionen, welche den TCR kontaktieren.
  • Der Antagonist kann sich von dem Epitop durch eine Substitution innerhalb der Sequenz unterscheiden, welche äquivalent zu der Sequenz ist, die durch die Aminosäuren 65 bis 67 von A-Gliadin repräsentiert wird (solche Antagonisten werden in der Tabelle 9 gezeigt). Somit besitzt der Antagonist vorzugsweise eine Susbtitution am Äquivalent der Position 64, 65 oder 67. Vorzugsweise handelt es sich bei der Susbtitution um 64W, 67W, 67M oder 65T.
  • Da die T-Zell-Immunantwort auf das Epitop der Erfindung in einem Individuum polyklonal ist, kann es notwendig sein, mehr als einen Antagonisten zu verabreichen, um einen Antagonismus von T-Zellen der Antwort zu verursachen, welche unterschiedliche TCRs aufweisen. Deshalb können die Antagonisten in einer Zusammensetzung verabreicht werden, welche mindestens 2, 4, 6 oder mehr verschiedene Antagonisten umfaßt, welche jeweils verschiedene T-Zellen antagonisieren.
  • Die Erfindung sieht auch ein Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten einer T-Zelle (welche das Mittel erkennt) vor, umfassend das Inkontaktbringen einer Kandidatensubstanz mit der T-Zelle und das Detektieren, ob die Substanz eine Verringerung in der Fähigkeit der T-Zelle verursacht, eine Antigen-spezifische Antwort zu durchlaufen (z. B. unter Anwendung irgendeines geeigneten hierin erwähnten Assays), wobei das Detektieren jeglicher derartiger Verringerung in der Fähigkeit anzeigt, daß die Substanz ein Antagonist ist.
  • In einer Ausführungsform liegen die Antagonisten (einschließlich Kombinationen von Antagonisten gegenüber einem besonderen Epitop) oder tolerisierenden (T-Zell- und Antikörpertolerisierenden) Mittel in einer Zusammensetzung vor, umfassend mindestens 2, 4, 6 oder mehr Antagonisten oder Mittel, welche verschiedene Epitope der Erfindung antagonisieren oder eine Tolerisierung gegenüber diesen hervorrufen, zum Beispiel gegenüber den Kombinationen von Epitopen, welche obenstehend in Bezug auf die Mittel erörtert wurden, welche ein Produkt darstellen, das mehr als eine Substanz umfaßt.
  • Testen des Vermögens einer Zusammensetzung zur Verursachung von Zöliakie
  • Wie obenstehend erwähnt, sieht die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung vor, ob eine Zusammensetzung in der Lage ist, Zöliakie zu verursachen, umfassend das Detektieren der Gegenwart einer Proteinsequenz, welche in der Lage ist, durch eine Transglutaminase zu einer Sequenz modifiziert zu werden, welche das Mittel oder Epitop der Erfindung umfaßt (eine solche Transglutaminaseaktivität kann eine humane Darm-Transglutaminase-Aktivität sein). Typischerweise wird dies unter Verwendung eines Bindungs-Assays durchgeführt, in welchem eine Einheit, die auf spezifische Weise an die Sequenz bindet, mit der Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird und die Bildung des Sequenz/Einheit-Komplexes detektiert und verwendet wird, um die Gegenwart des Mittels festzustellen. Eine derartige Einheit kann jedwede geeignete Substanz (oder Typ von Substanz) sein, welche hierin erwähnt wird, und ist typischerweise ein spezifischer Antikörper. Jedwedes geeignete Format an Bindungs-Assay kann verwendet werden (wie diejenigen, die hierin erwähnt werden).
  • In einer Ausführungsform wird die Zusammensetzung mit mindestens 2, 5, 10 oder mehr Antikörpern kontaktiert, welche für Epitope der Erfindung aus verschiedenen Gliadinen spezifisch sind, zum Beispiel einer Palette von Antikörpern, die zur Erkennung der Kombinationen von Epitopen in der Lage ist, welche obenstehend erörtert wurden in Bezug auf Mittel der Erfindung, bei welchen es sich um ein Produkt handelt, das mehr als eine Substanz umfaßt.
  • Die Zusammensetzung umfaßt typischerweise Material aus einer Pflanze, welche ein Gliadin exprimiert, das zur Erzeugung von Zöliakie in der Lage ist (zum Beispiel ein beliebiges der hierin erwähnten Gliadine oder Pflanzen). Ein solches Material kann ein Pflanzenteil, wie ein geerntetes Produkt (z. B. Samen) sein. Bei dem Material kann es sich um verarbeitete Produkte des Pflanzenmaterials (z. B. ein beliebiges derartiges, hierin erwähntes Produkt) handeln, wie ein Mehl oder ein Nahrungsmittel, welches das Gliadin umfaßt. Die Verarbeitung von Nahrungsmittelmaterial und das Testen in geeigneten Bindungsassays ist eine routinemäßige Angelegenheit, wie zum Beispiel in Kricka, L.J., J. Biolumin. Chemilumin. 13, 189–93 (1998), erwähnt wird.
  • Bindungsassays
  • Die Bestimmung der Bindung zwischen beliebigen zwei, hierin erwähnten, Substanzen kann durch Messen eines Charakteristikums von einer oder beiden Substanzen erfolgen, welches sich nach der Bindung verändert, wie eine spektroskopische Veränderung.
  • Das Bindungsassay-Format kann ein "Banden-Shift"-System sein. Dieses beinhaltet das Bestimmen, ob die Gegenwart einer Substanz (wie einer Kandidatensubstanz) das Fortschreiten der anderen Substanz während einer Gelelektrophorese vorantreibt oder verzögert.
  • Das Format kann ein kompetitives Bindungs-Verfahren sein, welches bestimmt, ob die eine Substanz in der Lage ist, die Bindung der anderen Substanz an ein Mittel zu inhibieren, von welchem bekannt ist, die andere Substanz zu binden, wie ein spezifischer Antikörper.
  • Mutanten-Gliadinproteine
  • Die Erfindung sieht ein Gliadinprotein vor, in welchem eine Epitopsequenz der Erfindung, oder eine Sequenz, welche durch eine Transglutaminase modifiziert werden kann, um eine solche Sequenz vorzusehen, so mutiert worden ist, daß sie nicht länger eine T-Zellantwort, die das Epitop erkennt verursacht, oder von selbiger erkannt wird. In diesem Kontext bezieht sich der Begriff Erkennung auf die TCR-Bindung des Epitops in einer solchen Weise, daß eine normale (nicht antagonistische) Antigen-spezifische funktionelle Aktivität der T-Zelle auftritt.
  • Verfahren zum Identifizieren von äquivalenten Epitopen in anderen Gliadinen sind obenstehend erörtert. Der Wildtyp des mutierten Gliadins ist ein solcher, welcher Zöliakie verursacht. Ein solches Gliadin wird Homologie mit SEQ ID NR.: 3, zum Beispiel zu dem obenstehend erwähnten Ausmaß (in Bezug auf das Analog) über die gesamte SEQ ID NR.: 3 oder über 15, 30, 60, 100 oder 200 benachbarte Aminosäuren von SEQ ID NR.: 3 hinweg aufweisen.
  • Das mutierte Gliadin wird keine Zöliakie verursachen oder wird verringerte Symptome einer Zöliakie verursachen. Typischerweise vermindert die Mutation die Fähigkeit des Epitops, eine T-Zell-Antwort zu induzieren. Das mutierte Epitop kann eine verringerte Bindung an HLA-DQ2, eine verminderte Fähigkeit, durch eine APC präsentiert zu werden, oder eine verminderte Fähigkeit, an T-Zellen, welche das Mittel erkennen, zu binden oder von ihnen erkannt zu werden (d. h. Antigen-spezifische funktionelle Aktivität herbeizuführen) aufweisen. Das mutierte Gliadin oder Epitop wird deshalb keine oder eine verringerte Erkennung in einem beliebigen der hierin in Bezug auf die diagnostischen Aspekte der Erfindung erwähnten Assays zeigen.
  • Bei der Mutation kann es sich um eine oder mehrere Deletionen, Additionen oder Substitutionen mit einer Länge von 1 bis 3, 4 bis 6, 6 bis 10, 11 bis 15 oder mehr in dem Epitop, beispielsweise über die Sequenz SEQ ID NR.: 2 oder ihr Äquivalent hinweg, handeln. Vorzugsweise besitzt das Mutanten-Gliadin mindestens eine Mutation in der Sequenz SEQ ID NR.: 1. Eine bevorzugte Mutation liegt an Position 65 in A-Gliadin (oder in einer äquivalenten Position in anderen Gliadinen). Typischerweise wird das natürlich vorkommende Glutamin an dieser Position durch irgendeine der Aminosäuren substituiert, welche in der Tabelle 3 gezeigt sind, vorzugsweise zu Histidin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Prolin oder Arginin.
  • Die Erfindung sieht somit ebenfalls die Verwendung einer Mutation (wie einer beliebigen der Mutationen in einer beliebigen der hierin erörterten Sequenzen) in einem Epitop eines Gliadinproteins vor, wobei das Epitop ein Epitop der Erfindung ist, um die Fähigkeit des Gliadinproteins, Zöliakie zu verursachen, zu vermindern.
  • In einer Ausführungsform ist die mutierte Sequenz in der Lage, als ein Antagonist zu wirken. Somit sieht die Erfindung ein Protein vor, welches eine Sequenz umfaßt, die in der Lage ist, an einen T-Zell-Rezeptor zu binden, wobei der T-Zell-Rezeptor ein Mittel der Erfindung erkennt, und wobei die Sequenz in der Lage ist, einen Antagonismus einer T-Zelle herbeizuführen, welche einen solchen T-Zell-Rezeptor trägt.
  • Die Erfindung sieht auch Proteine vor, welche Fragmente der obenstehenden Mutanten-Gliadinproteine sind, welche mindestens 15 Aminosäuren lang (z. B. mindestens 30, 60, 100, 150, 200 oder 250 Aminosäuren lang) sind und welche die obenstehend erörterten Mutationen umfassen, welche die Fähigkeit des Gliadins, erkannt zu werden, vermindern. Ein beliebiges der hierin erwähnten Mutantenproteine (einschließlich Fragmenten) kann auch in der Form von Fusionsproteinen, zum Beispiel mit anderen Gliadinen oder mit Nicht-Gliadin-Proteinen, vorhanden sein.
  • Das zu dem mutierten Gliadinprotein äquivalente Wildtyp-Protein stammt typischerweise aus einer Graminaceen-Monokotyledone, wie einer Pflanze der Gattung Triticum, z. B. Weizen, Roggen, Gerste, Hafer oder Tritikale. Das Protein ist typischerweise ein α-, αβ-, β-, γ oder ω-Gliadin. Das Gliadin kann ein A-Gliadin sein.
  • Kits
  • Die Erfindung sieht ebenfalls ein Kit zum Ausführen des Verfahrens vor, umfassend ein oder mehrere Mittel und gegebenenfalls eine Methode bzw. ein Mittel zum Nachweis der Erkennung des Mittels durch die T-Zelle. Typischerweise werden unterschiedliche Mittel für gleichzeitige, separate oder sequenzielle Verwendung vorgesehen. Typischerweise gestattet die Methode zum Nachweis der Erkennung eine Detektion, basierend auf den obenstehend erörterten Techniken, oder unterstützt selbige.
  • Somit kann die Methode den Nachweis einer Substanz gestatten, welche von den T-Zellen nach der Erkennung sezerniert wird. Das Kit kann somit zusätzlich eine spezifische Bindungseinheit für die Substanz, wie einen Antikörper, einschließen. Die Einheit ist typischer weise spezifisch für IFN-γ. Die Einheit ist typischerweise auf einem festen Träger immobilisiert. Dies bedeutet, daß nach der Bindung der Einheit die Substanz in der Nachbarschaft der T-Zelle bleiben wird, welche selbige sezerniert hat. Daher werden "Spots" von Substanz/Einheit-Komplex auf dem Träger gebildet, wobei jeder Spot eine T-Zelle repräsentiert, welche die Substanz sezerniert. Das Quantifizieren der Spots, und typischerweise das Vergleichen gegen eine Kontrolle, gestattet eine Bestimmung der Erkennung des Mittels.
  • Das Kit kann auch ein Mittel zum Nachweisen des Substanz/Einheit-Komplexes umfassen. Eine nachweisbare Veränderung kann in der Einheit selbst nach Bindung der Substanz stattfinden, wie eine Farbveränderung. Alternativ dazu kann zugelassen werden, daß eine für den Nachweis direkt oder indirekt markierte zweite Einheit den Substanz/Einheit-Komplex bindet, um eine Bestimmung der Spots zu gestatten. Wie obenstehend erörtert, kann die zweite Einheit spezifisch für die Substanz sein, bindet aber eine andere Stelle auf der Substanz als die erste Einheit.
  • Der immobilisierte Träger kann eine Platte mit Vertiefungen, wie eine Mikrotiterplatte, sein. Jeder Assay kann daher in einer separaten Vertiefung in der Platte durchgeführt werden.
  • Das Kit kann darüber hinaus Medium für die T-Zellen, Detektions-Einheiten oder Waschpuffer umfassen, welche in den Nachweisschritten zu verwenden sind. Das Kit kann zusätzlich Reagenzien umfassen, die für das Trennen aus der Probe geeignet sind, wie die Trennung von PBMCs oder T-Zellen aus der Probe. Das Kit kann ausgelegt sein, um einen direkten Nachweis der T-Zellen in der Probe ohne Erfordernis irgendeiner Trennung der Komponenten der Probe zu gestatten.
  • Das Kit kann ein Instrument umfassen, welches die Verabreichung des Mittels, wie eine intradermale oder epidermale Verabreichung, gestattet. Typischerweise umfaßt ein solches Instrument ein Pflaster, einen Verband oder eine oder mehrere Nadeln. Das Instrument kann die ballistische Zuführung des Mittels erlauben. Das Mittel in dem Kit kann in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen.
  • Das Kit kann auch Kontrollen, wie Positiv- oder Negativkontrollen, umfassen. Die Positivkontrolle kann ein Testen des Nachweissystems erlauben. Somit ahmt die Positivkontrolle typischerweise die Erkennung des Mittels in einem beliebigen der obenstehenden Verfahren nach. Typischerweise ist, in den Kits, welche ausgelegt sind, um eine Erkennung in vitro zu bestimmen, die Positivkontrolle ein Cytokin. In dem Kit, welches ausgelegt ist, um in vivo- Erkennung des Mittels nachzuweisen, kann die Positivkontrolle ein Antigen sein, auf welches die meisten Individuen antworten sollten.
  • Das Kit kann auch eine Einrichtung umfassen, um eine T-Zellen enthaltende Probe aus dem Wirt zu entnehmen, wie eine Blutprobe. Das Kit kann eine Einrichtung umfassen, um mononukleare Zellen oder T-Zellen aus einer Probe aus dem Wirt zu trennen.
  • Polynukleotide, Zellen, transgene Säugetiere und Antikörper
  • Die Erfindung sieht ebenfalls ein Polynukleotid vor, welches in der Lage zur Expression ist, um das Mittel oder Mutanten-Gliadinproteine bereitzustellen. Typischerweise ist das Polynukleotid DNA oder RNA und ist einzel- oder doppelsträngig. Das Polynukleotid wird vorzugsweise mindestens 50 Basen oder Basenpaare, zum Beispiel 50 bis 100, 100 bis 500, 500 bis 1000 oder 1000 bis 2000 oder mehr Basen oder Basenpaare umfassen. Das Polynukleotid umfaßt daher eine Sequenz, welche die Sequenz von SEQ ID NR.: 1 oder 2 oder irgendeines der hierin erwähnten Mittel kodiert. In Richtung auf 5' und 3' hin von dieser kodierenden Sequenz besitzt das Polynukleotid der Erfindung eine Sequenz oder Codons, welche von der Sequenz oder Codons 5' und 3' zu diesen Sequenzen in dem entsprechenden Gliadingen verschieden sind.
  • 5' und/oder 3' zu der für das Peptid kodierenden Sequenz, weist das Polynukleotid kodierende oder nicht-kodierende Sequenz auf. Sequenz, welche 5' und/oder 3' zur kodierenden Sequenz liegt, kann Sequenzen umfassen, welche die Expression, wie Transkription und/oder Translation der das Mittel kodierenden Sequenz unterstützen. Das Polynukleotid kann in der Lage sein, das Mittel in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle zu exprimieren. In einer Ausführungsform ist das Polynukleotid in der Lage, das Mittel in einer Säugerzelle, wie einer Menschen-, Primaten- oder Nagetier- (z. B. Maus- oder Ratten-) Zelle zu exprimieren.
  • Ein Polynukleotid der Erfindung kann selektiv an ein Polynukleotid, welches SEQ ID NR.: 3 kodiert, bei einem Spiegel signifikant über dem Hintergrund hybridisieren. Eine selektive Hybridisierung wird typischerweise unter Anwendung von Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz erzielt (zum Beispiel 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50°C bis etwa 60°C). Allerdings kann eine solche Hybridisierung unter jedweden geeigneten, im Fachgebiet bekannten Bedingungen ausgeführt werden (siehe Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Wenn zum Beispiel eine hohe Stringenz erfordert wird, schließen geeignete Bedingungen 0,2 × SSC bei 60°C ein. Wenn eine niedrigere Stringenz erfordert wird, schließen geeignete Bedingungen 2 × SSC bei 60°C ein.
  • Mittel oder Proteine der Erfindung können von den hierin beschriebenen Polynukleotiden kodiert werden.
  • Das Polynukleotid kann einen replizierbaren Vektor bilden, oder darin eingebunden werden. Ein derartiger Vektor ist in der Lage, in einer geeigneten Zelle zu replizieren. Der Vektor kann ein Expressionsvektor sein. In einem solchen Vektor ist das Polynukleotid der Erfindung operativ mit einer Kontrollsequenz verbunden, die in der Lage ist, die Expression des Polynukleotids zur Verfügung zu stellen. Der Vektor kann einen selektierbaren Marker, wie das Ampicillin-Resistenzgen, enthalten.
  • Das Polynukleotid oder der Vektor können in einer Zelle vorhanden sein. Eine solche Zelle kann durch das Polynukleotid oder den Vektor transformiert worden sein. Die Zelle kann das Mittel exprimieren. Die Zelle wird gewählt, um mit dem Vektor kompatibel zu sein, und kann zum Beispiel eine prokaryontische (bakterielle), Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle sein. Das Polynukleotid oder der Vektor kann unter Anwendung herkömmlicher Techniken in Wirtszellen eingebracht werden, einschließlich Calciumphosphat-Präzipitation, DEAE-Dextran-Transfektion oder Elektroporation.
  • Die Erfindung sieht Verfahren für die Herstellung der Proteine der Erfindung durch rekombinante Methoden vor. Dies kann umfassen: (a) Kultivieren einer transformierten Zelle, wie obenstehend definiert, unter Bedingungen, welche die Expression des Proteins gestatten; und vorzugsweise (b) Aufreinigen des exprimierten Polypeptids. Gegebenenfalls kann das Polypeptid durch im Fachgbiet bekannte Techniken isoliert und/oder gereinigt werden.
  • Die Erfindung sieht auch TCRs vor, welche das Mittel erkennen (oder binden), oder Fragmente davon, welche zu einer solchen Erkennung (oder Bindung) in der Lage sind. Diese können in irgendeiner hierin erwähnten Form (z. B. Reinheit), welche hierin in Bezug auf das Protein der Erfindung erörtert wurde, vorliegen. Die Erfindung sieht des Weiteren T-Zellen vor, welche derartige TCRs exprimieren, welche in einer beliebigen Form (z. B. Reinheit) vorliegen können, die hierin für die Zellen der Erfindung erörtert wurde.
  • Die Erfindung sieht ebenfalls monoklonale oder polyklonale Antikörper, welche die Mittel (wie ein beliebiges der Epitope der Erfindung) spezifisch erkennen und welche die Mutanten-Gliadinproteine der Erfindung erkennen (und welche typischerweise nicht die äquivalenten Wildtyp-Gliadine erkennen), sowie Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper vor. Antikörper der Erfindung binden spezifisch an diese Substanzen der Erfindung.
  • Für die Zwecke dieser Erfindung schließt der Begriff "Antikörper" Antikörperfragmente, wie Fv-, F(ab)- und F(ab)2-Fragmente, sowie Einzelketten-Antikörper, ein.
  • Ein Verfahren zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers umfaßt das Immunisieren eines geeigneten Wirtstiers, zum Beispiel eines Versuchstieres, mit dem Immunogen und das Isolieren von Immunglobulinen aus dem Serum. Das Tier kann deshalb mit dem Immunogen inokuliert werden, wobei anschließend Blut aus dem Tier entnommen wird und die IgG-Fraktion gereinigt wird. Ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers umfaßt das Immortalisieren von Zellen, welche den gewünschten Antikörper herstellen. Hybridom-Zellen können durch Verschmelzen von Milzzellen aus einem inokulierten Versuchstier mit Tumorzellen hergestellt werden (Kohler und Milstein (1975) Nature 256, 495–497).
  • Eine immortalisierte Zelle, welche den gewünschten Antikörper herstellt, kann durch ein herkömmliches Vorgehen selektiert werden. Die Hybridome können in Kultur herangezüchtet oder intraperitoneal für die Bildung von Aszites-Fluid oder in den Blutstrom eines allogenen Wirtes oder immunkompromitierten Wirtes injiziert werden. Humaner Antikörper kann durch in vitro-Immunisierung mit humanen Lymphozyten, gefolgt von Transformation der Lymphozyten mit Epstein-Barr-Virus hergestellt werden.
  • Für die Herstellung sowohl monoklonaler als auch polyklonaler Antikörper ist das Versuchstier in geeigneter Weise eine Ziege, ein Kaninchen, eine Ratte oder eine Maus. Falls gewünscht, kann das Immunogen als ein Konjugat verabreicht werden, in welchem das Immunogen, beispielsweise über eine Seitenkette von einem der Aminosäurereste, an einen geeigneten Träger gekoppelt ist. Das Trägermolekül ist typischerweise ein physiologisch annehmbarer Träger. Der erhaltene Antikörper kann isoliert und, falls gewünscht, gereinigt werden.
  • Das Polynukleotid, Mittel, Protein oder der Antikörper der Erfindung kann/können eine nachweisbare Markierung tragen. Nachweisbare Markierungen, welche die Detektion der sezernierten Substanz durch visuelle Betrachtung gestatten, gegebenenfalls mit Hilfe einer optischen Vergrößerungsvorrichtung, werden bevorzugt. Ein solches System basiert typischerweise auf einer Enzymmarkierung, welche eine Farbveränderung in einem Substrat verursacht, zum Beispiel alkalische Phosphatase, welche eine Farbänderung in einem Substrat verursacht. Solche Substrate sind kommerziell erhältlich, z. B. von BioRad. Andere geeignete Markierungen schließen andere Enzyme, wie Peroxidase, oder Proteinmarkierungen, wie Biotin; oder Radioisotope, wie 32P oder 35S ein. Die obenstehenden Markierungen können unter Anwendung bekannter Techniken detektiert werden.
  • Polynukleotide, Mittel, Proteine, Antikörper oder Zellen der Erfindung können in im Wesentlichen gereinigter Form vorliegen. Sie können in im Wesentlichen isolierter Form vorliegen, wobei sie in diesem Fall im Allgemeinen mindestens 80 %, z. B. mindestens 90, 95, 97 oder 99 % des Polynukleotids, Peptids, Antikörpers, der Zellen oder der Trockenmasse in der Präparation ausmachen. Das Polynukleotid, Mittel, Protein oder der Antikörper ist typischerweise im Wesentlichen frei von anderen zellulären Komponenten. Das Polynukleotid, Mittel, Protein oder der Antikörper können in einer derartigen, im Wesentlichen isolierten, gereinigten oder freien Form in dem Verfahren verwendet werden oder in solchen Formen in dem Kit vorhanden sein.
  • Die Erfindung sieht des Weiteren ein transgenes Säugetier vor, welches einen TCR der Erfindung exprimiert. Bei diesem kann es sich um jedwedes der hierin erörterten Säugetiere handeln (z. B. in Bezug auf die Herstellung des Antikörpers). Vorzugsweise weist der Säuger eine Zöliakie auf, oder ist dafür anfällig. Der Säuger kann auch HLA-DQ exprimieren, und/oder ihm kann eine Diät, die ein Gliadin umfaßt, gegeben werden, welche Zöliakie hervorruft (z. B. jedwedes der hierin erwähnten Gliadin-Proteine). Somit kann der Säuger als ein Tiermodell für Zöliakie fungieren.
  • Die Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren eines Produkts vor, welches für Zöliakie therapeutisch ist, umfassend das Verabreichen einer Kandidatensubstanz an einen Säuger der Erfindung, der Zöliakie aufweist oder dafür anfällig ist, und das Bestimmen, ob die Substanz Zöliakie in dem Säuger verhindert oder behandelt, wobei die Verhinderung oder Behandlung von Zöliakie anzeigt, daß die Substanz ein therapeutisches Produkt ist. Ein solches Produkt kann verwendet werden, um Zöliakie zu behandeln oder zu verhindern.
  • Die Erfindung sieht therapeutische (einschließlich prophylaktische) Mittel oder diagnostische Substanzen vor (die Mittel, Proteine und Polynukleotide der Erfindung). Diese Substanzen werden für die klinische Verabreichung durch Vermischen derselben mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel formuliert. Zum Beispiel können sie für topische, parenterale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intraokulare, intradermale, epidermale oder transdermale Verabreichung formuliert werden. Die Substanzen können mit jedwedem Vehikel vermischt werden, welches pharmazeutisch annehmbar und geeignet für den gewünschten Weg der Verabreichung ist. Der/das pharmazeutische Träger oder Verdünnungsmittel für eine Injektion kann zum Beispiel eine sterile oder isotonische Lösung, wie Wasser zur Injektion oder physiologische Kochsalzlösung, oder ein Trägerpartikel für ballistische Zuführung sein.
  • Die Dosis der Substanzen kann gemäß verschiedenen Parametern eingestellt werden, insbesondere gemäß des verwendeten Mittels; des Alters, Gewichts und Zustands des zu behandelnden Patienten; des verwendeten Verabreichungsmodus; der Schwere des zu behandelnden Leidens; und dem erforderlichen klinischen Schema. Als eine Richtlinie beläuft sich die durch Injektion verabreichte Menge an Substanz geeigneterweise auf 0,01 mg/kg bis 30 mg/kg, vorzugsweise 0,1 mg/kg bis 10 mg/kg.
  • Die beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sind lediglich als eine Richtlinie beabsichtigt, da ein erfahrener Behandelnder in der Lage sein wird, den optimalen Verabreichungsweg und die optimale Dosierung für jeden besonderen Patienten und jedes besondere Leiden ohne Weiteres zu bestimmen.
  • Die Substanzen der Erfindung können somit in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder in einem diagnostischen Verfahren, welches am menschlichen Körper ausgeführt wird, verwendet werden. Insbesondere können sie in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Zöliakie verwendet werden. Die Erfindung sieht auch die Mittel zur Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung von Zöliakie vor.
  • Das Mittel der Erfindung kann unter Anwendung von standardmäßigen synthetischen chemischen Techniken, wie durch Verwendung eines automatischen Synthesizers, hergestellt werden. Das Mittel kann aus einem längeren Polypeptid, z. B. einem Fusionsprotein, hergestellt werden, wobei dieses Polypeptid typischerweise die Sequenz des Peptids umfaßt. Das Peptid kann aus dem Polypeptid zum Beispiel durch Hydrolysieren des Polypeptids, wie unter Verwendung einer Protease; oder durch physikalisches Zerbrechen des Polypeptids abgeleitet werden. Das Polynukleotid der Erfindung kann unter Anwendung von Standardtechniken, wie durch Verwenden eines Synthesizers, hergestellt werden.
  • Pflanzenzellen und Pflanzen, welche Mutanten-Gliadinproteine exprimieren oder Proteine exprimieren, die Sequenzen umfassen, welche als Antagonisten wirken können
  • Die Zelle der Erfindung kann eine Pflanzenzelle sein, wie eine Zelle einer monokotyledonen Graminaceen-Spezies. Die Spezies kann eine solche sein, deren Wildtypform Gliadine exprimiert, wie irgendeines der hierin erwähnten Gliadinproteine (einschließlich Gliadinen mit einem beliebigen Grad an Homologie zu der hierin erwähnten SEQ ID NR.: 3). Ein solches Gliadin kann Zöliakie beim Menschen hervorrufen. Die Zelle kann von Weizen, Mais, Hafer, Roggen, Reis, Gerste, Tritikale, Sorghum oder Zuckerrohr sein. Typischerweise stammt die Zelle aus der Gattung Triticum, wie aestivum, spelta, polonicum oder monococcum.
  • Die Pflanzenzelle der Erfindung ist typischerweise eine solche, welche nicht ein Wildtyp-Gliadin exprimiert (wie irgendeines der hierin erwähnten Gliadine, welche Zöliakie verursachen können), oder eine solche, welche nicht ein Gliadin exprimiert, das eine Sequenz umfaßt, die von einer T-Zelle, welche das Mittel erkennt, erkannt werden kann. Wenn die Wildtyp-Pflanzenzelle ein derartiges Gliadin exprimieren würde, dann kann sie somit manipuliert werden, um die Expression eines solchen Gliadins zu verhindern oder zu verringern oder um die Aminosäuresequenz des Gliadins so zu verändern, daß es nicht länger Zöliakie hervorruft (typischerweise, indem nicht länger das Epitop der Erfindung exprimiert wird).
  • Dies kann beispielsweise durchgeführt werden, indem Mutationen in 1, 2, 3 oder mehr oder alle solcher Gliadingene in der Zelle eingebracht werden, beispielsweise in kodierende oder nicht-kodierende (z. B. Promotor-)Regionen. Solche Mutationen können beliebige des Typs oder der Länge an Mutationen sein, welche hierin (z. B. in Bezug auf homologe Proteine) erörtert werden. Die Mutationen können in einer gerichteten Weise (z. B. unter Anwendung von ortsgerichteter Mutagenese oder homologen Rekombinationstechniken) oder in einer statistischen Weise (z. B. durch Verwendung eines Mutagens, und dann typischerweise durch Selektieren hinsichtlich mutagenisierten Zellen, welche das Gliadin (oder eine Gliadinsequenz, welche Zöliakie verursacht) nicht länger exprimieren) eingeführt werden.
  • Im Falle von Pflanzen oder Pflanzenzellen, welche ein Protein exprimieren, das eine Sequenz umfaßt, die in der Lage ist, als ein Antagonist zu wirken, kann eine derartige Pflanze oder Pflanzenzelle ein Wildtyp-Gliadinprotein (z. B. ein solches, welches Zöliakie verursacht) exprimieren. Vorzugsweise werden durch die Gegenwart der Antagonistensequenz verringerte Zöliakie-Symptome (wie etwa gar keine Symptome) in einem Individuum, welches eine Nahrung aufnimmt, die Protein aus der Pflanze oder Pflanzenzelle umfaßt, verursacht.
  • Das Polynukleotid, welches in der Pflanzenzelle vorhanden ist (oder welches in selbige hinein transformiert wurde), wird im Allgemeinen einen Promotor umfassen, der zum Exprimieren des Mutanten-Gliadinproteins in der Pflanzenzelle in der Lage ist. Abhängig vom gewünschten Expressionsmuster kann der Promotor konstitutiv, Gewebe- oder Stadium-spezifisch und/oder induzierbar sein. Beispielsweise kann eine starke konstitutive Expression in Pflanzen mit den CAMV-35S-, Rubisco-ssu- oder Histon-Promotoren erhalten werden. Des Weiteren können gewebespezifische oder stadiumspezifische Promotoren verwendet werden, um die Expression von Protein der Erfindung auf bestimmte Gewebe in einer transgenen Pflanze oder auf bestimmte Stadien in ihrer Entwicklung zu lenken. Somit können beispielsweise samenspezifische, wurzelspezifische, blattspezifische, blütenspezifische etc. Promotoren verwendet werden. Samenspezifische Promotoren schließen diejenigen ein, welche von Dalta et al. (Biotechnology Ann. Rev. (1997), 3, S. 269–296) beschrieben wurden. Besondere Beispiele von samenspezifischen Promotoren sind Napin-Promotoren (EP-A-0 255 378), Phaseolin-Promotoren, Glutenin-Promotoren, Helianthenin-Promotoren (WO92/17580), Albumin-Promotoren (WO 98/45460), Oleosin-Promotoren (WO98/45461) und ATS1- und ATS3-Promotoren (PCT/US98/06798).
  • Die Zelle kann in einer beliebigen Form vorliegen. Beispielsweise kann sie eine isolierte Zelle, z. B. ein Protoplast, sein oder sie kann ein Teil eines Pflanzengewebes, z. B. ein Callus, oder ein Gewebe sein, welches aus einer Pflanze herausgeschnitten wurde, oder sie kann Teil einer ganzen Pflanze sein. Die Zelle kann von jedwedem Typ (z. B. von jeglichem Typ an Pflanzenteil) sein, beispielsweise eine undifferenzierte Zelle, wie eine Callus-Zelle; oder eine differenzierte Zelle, wie eine Zelle eines Typs, welcher in Embryonen, Pollen, Wurzeln, Keimlingen oder Blättern gefunden wird. Pflanzenteile schließen Wurzeln; Keimlinge; Blätter; und Teile, die an der Reproduktion beteiligt sind, wie Pollen, Eierzellen, Staubblätter, Antheren, Petalen, Sepalen und andere Blütenteile, ein.
  • Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Erhalten einer transgenen Pflanzenzelle vor, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Polynukleotid oder Vektor der Erfindung, um eine transgene Pflanzenzelle zu erhalten. Jedwedes geeignete Transformationsverfahren kann angewandt werden (im Falle von Weizen können die Techniken, welche offenbart wurden in Vasil, V., et al., Biotechnology 10, 667–674 (1992), angewandt werden). Bevorzugte Transformationstechniken schließen die Elektroporation von Pflanzenprotoplasten und Partikel-Beschuss ein. Die Transformation kann somit zu einem chimären Gewebe oder einer chimären Pflanze führen, in welcher/welchem einige Zellen transgen sind und einige nicht.
  • Die Zelle der Erfindung oder so erhaltene Zelle kann durch im Fachgebiet bekannte Techniken zu einer transgenen Pflanze regeneriert werden. Diese können die Verwendung von Pflanzenwachstumssubstanzen, wie Auxinen, Giberellinen und/oder Cytokininen einschließen, um das Wachstum und/oder die Teilung der transgenen Zelle zu stimulieren. In ähnlicher Weise können Techniken, wie somatische Embryogenese und Meristem-Kultur angewandt werden. Regenerationstechniken sind im Fachgebiet gut bekannt, und Beispiele können gefunden werden z. B. in US 4 459 355 , US 4 536 475 , US 5 464 763 , US 5 177 010 , US 5 187 073 , EP 267 195 , EP 604 662 , EP 672 752 , US 4 945 050 , US 5 036 006 , US 5 100 792 , US 5 371 014 , US 5 478 744 , US 5 179 022 , US 5 565 346 , US 5 484 956 , US 5 508 468 , US 5 538 877 , US 5 554 798 , US 5 489 520 , US 5 510 318 , US 5 204 253 , US 5 405 765 , EP 442 174 , EP 486 233 , EP 486 234 , EP 539 563 , EP 674 725 , WO 91/02071 und WO 95/06128.
  • In vielen derartigen Techniken ist ein Schritt die Bildung eines Callus, d. h. eines Pflanzengewebes, welches sich vermehrende und/oder teilende Zellen umfaßt. Derartige Calli sind ein weiterer Aspekt der Erfindung, wie es auch andere Typen von Pflanzenzellkulturen und Pflanzenteilen sind. So sieht die Erfindung beispielsweise transgene Pflanzengewebe und -teile vor, einschließlich Embryonen, Meristemen, Samen, Keimlingen, Wurzeln, Stengeln, Blättern und Blütenteilen. Diese können in dem Sinn chimär sein, daß einige ihrer Zellen Zellen der Erfindung sind und einige nicht. Transgene Pflanzenteile und -gewebe, Pflanzen und Samen der Erfindung können von jedweder der hierin erwähnten Pflanzenspezies sein.
  • Regenerationsvorgehensweisen werden typischerweise die Selektion von transformierten Zellen mittels Markergenen beinhalten.
  • Der Regenerationsschritt führt zur Entstehung einer transgenen Pflanze der ersten Generation. Die Erfindung sieht ebenfalls Verfahren zum Erhalten von transgenen Pflanzen von weiteren Generationen aus dieser Pflanze der ersten Generation vor. Diese sind als transgene Nachkommenschafts-Pflanzen bekannt. Nachkommen-Pflanzen der zweiten, dritten, vierten, fünften, sechsten und weiteren Generationen können aus der transgenen Pflanze der ersten Generation durch jedwede im Fachgebiet bekannte Methode erhalten werden.
  • Somit sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalten einer transgenen Nachkommenschafts-Pflanze vor, umfassend das Erhalten einer transgenen Nachkommenschafts-Pflanze der zweiten Generation aus einer transgenen Pflanze der ersten Generation der Erfindung, und gegebenenfalls das Erhalten von transgenen Pflanzen von einer oder mehreren weiteren Generationen aus der so erhaltenen Nachkommenschafts-Pflanze der zweiten Generation.
  • Nachkommenschafts-Pflanzen können aus ihren Vorfahren von früheren Generationen durch jedwede bekannte Technik hergestellt werden. Insbesondere können Nachkommenschafts-Pflanzen hergestellt werden durch:
    Erhalten eines transgenen Samens aus einer transgenen Pflanze der Erfindung, welche einer früheren Generation angehört, danach Erhalten einer transgenen Nachkommen-Pflanze der Erfindung, welche einer neuen Generation angehört, durch Aufziehen des transgenen Samens; und/oder
    klonale Vermehrung einer transgenen Pflanze der Erfindung, welche einer früheren Generation angehört, wodurch eine transgene Nachkommenschafts-Pflanze der Erfindung erhalten wird, welche einer neuen Generation angehört; und/oder
    Kreuzen einer transgenen Erstgenerations-Pflanze der Erfindung, welche einer früheren Generation angehört, mit einer anderen kompatiblen Pflanze, wodurch durch eine transgene Nachkommenschafts-Pflanze der Erfindung erhalten wird, welche einer neuen Generation angehört; und gegebenenfalls
    Erhalten von transgenen Nachkommenschafts-Pflanzen von einer oder mehreren weiteren Generationen aus der so erhaltenen Nachkommenschafts-Pflanze.
  • Diese Techniken können in einer beliebigen Kombination eingesetzt werden. Zum Beispiel können klonale Vermehrung und sexuelle Vermehrung an verschiedenen Punkten in einem Verfahren angewandt werden, welches zur Entstehung einer zur Kultivierung geeigneten transgenen Pflanze führt. Insbesondere kann eine wiederholte Rückkreuzung mit einem Pflanzen-Taxon mit landwirtschaftlich wünschenswerten Merkmalen vorgenommen werden. Weitere Schritte der Entfernung von Zellen aus einer Pflanze und der Regeneration neuer Pflanzen daraus können ebenfalls ausgeführt werden.
  • Des Weiteren können weitere wünschenswerte Merkmale durch Transformieren der Zellen, Pflanzengewebe, Pflanzen oder Samen, an jedem geeigneten Stadium im oben stehenden Verfahren eingeführt werden, um wünschenswerte kodierende Sequenzen einzubringen, welche von den Polynukleotiden der Erfindung verschieden sind. Dies kann durch die hierin beschriebenen Techniken für die Einbringung von Polynukleotiden der Erfindung durchgeführt werden.
  • Zum Beispiel können weitere Transgene unter denjenigen ausgewählt werden, welche für andere Herbizidresistenz-Merkmale kodieren, z. B. Toleranz gegenüber: Glyphosat (z. B. unter Verwendung eines EPSP-Synthase-Gens (z. B. EP-A-0 293 358) oder eines Gens für Glyphosat-Oxidoreduktase (WO 92/000377)); oder Toleranz gegen Fosametin; ein Dihalogenbenzonitril; Glufosinat, z. B. unter Verwendung eines Gens für Phosphinothrycin-Acetyltransferase (PAT) oder Glutamin-Synthase (vgl. EP-A-0 242 236); Asulam, z. B. unter Verwendung eines Dihydropteroat-Synthase-Gens (EP-A-0 369 367); oder einen Sulphonylharnstoff, z. B. unter Verwendung eines ALS-Gens); Diphenylether, wie Verwendung eines ALS-Gens); Diphenylether, wie Acifluorfen oder Oxyfluorfen, z. B. unter Verwendung eines Protoporphyrogen-Oxidase-Gens); ein Oxadiazol, wie Oxdiazon; ein zyklisches Imid, wie Chlorophthalim; ein Phenylpyrazol wie TNP, oder ein Phenopylat- oder Carbamatanalog davon.
  • In ähnlicher Weise können Gene für nützliche Eigenschaften, welche von Herbizidtoleranz verschieden sind, eingeführt werden. Zum Beispiel können Gene für Insektenresistenz eingeführt werden, insbesondere Gene, welche Bacillus thuringiensis (Bt)-Toxine kodieren. In gleicher Weise können Gene für Krankheitsresistenz eingeführt werden, z. B. wie in WO 91/02701 oder WO 95/06128.
  • Typischerweise wird ein Protein der Erfindung in einer Pflanze der Erfindung exprimiert. Abhängig vom verwendeten Promotor kann diese Expression konstitutiv oder induzierbar sein. In ähnlicher Weise kann sie gewebe- oder stadiumspezifisch sein, d. h. auf ein besonderes Pflanzengewebe (wie irgendeines der hierin erwähnten Gewebe) oder Stadium in der Pflanzenentwicklung gerichtet sein.
  • Die Erfindung sieht ebenfalls Verfahren zum Erhalten von Getreideprodukten durch Ernten und gegebenenfalls weitere Verarbeitung von transgenen Pflanzen der Erfindung vor. Mit Getreideprodukt ist jedwedes nützliche Produkt gemeint, welches aus einer Getreidepflanze erhältlich ist.
  • Produkte welche Mutanten-Gliadinproteine oder Proteine enthalten, welche Sequenz umfassen, die zur Wirkung als ein Antagonist in der Lage ist
  • Die Erfindung sieht ein Produkt vor, welches die Mutanten-Gliadinproteine oder Protein, welches eine Sequenz umfaßt, die zur Wirkung als ein Antagonist in der Lage ist, umfaßt. Dieses wird typischerweise aus Pflanzenteilen von hierin erwähnten Pflanzen, welche solche Proteine exprimieren, abgeleitet oder besteht daraus. Ein solches Produkt kann direkt durch Ernten oder indirekt durch Ernten und weitere Verarbeitung der Pflanze der Erfindung erhältlich sein. Direkt erhältliche Produkte schließen Körner ein. Alternativ dazu kann ein solches Produkt indirekt durch Ernten und weiteres Verarbeiten erhältlich sein. Beispiele von Produkten, welche durch weiteres Verarbeiten erhältlich sind, sind Mehl oder destillierte alkoholische Getränke; Nahrungsmittelprodukte, hergestellt aus direkt erhaltenem oder weiterverarbeitetem Material, z. B. gebackene Produkte (z. B. Brot), welche aus Mehl hergestellt werden. Typischerweise handelt es sich um solche Nahrungsmittelprodukte, welche von menschlichen Individuen verzehrbar und verdaubar sind (d. h. nicht-toxisch sind und Nährstoffwert besitzen).
  • Im Falle von Nahrungsmittelprodukten, welche das Protein umfassen, das eine Antagonistensequenz umfaßt, kann das Nahrungsmittelprodukt auch Wildtyp-Gliadin umfassen, aber vorzugsweise ist der Antagonist in der Lage, eine (z. B. vollständige) Reduktion der Zölakie-Symptome hervorzurufen, nachdem ein solches Nahrungsmittel verzehrt worden ist.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
  • Beispiel 1
  • Wir führten eine Epitop-Kartierung bei Zöliakie durch Verwendung eines Satzes von 51 synthetischen 15mer-Peptiden durch, welche die vollständige Sequenz eines vollständig charakterisierten a-Gliadins, "A-Gliadin", überspannen (siehe Tabelle 1). A-Gliadin-Peptide wurden auch individuell mit tTG behandelt, um Produkte zu erzeugen, welche diejenigen nachahmen könnten, die in vivo3 hergestellt werden. Wir bemühten uns ebenfalls, Zöliakie-Patienten am Punkt der Initiation des Krankheits-Rückfalls zu untersuchen, um die Möglichkeit zu vermeiden, daß Epitop-"Spreading" oder -"Erschöpfung" stattgefunden haben könnte, wie es bei experimentellen Infektions- und Autoimmunkrankheiten beschrieben wurde.
  • Klinische und A-Gliadin-spezifische T-Zell-Antworten bei einer 3- und 10-tägigen Brot-Herausforderung
  • In einer Pilotuntersuchung erhielten zwei Subjekte mit nachlassender Zöliakie, definiert durch Abwesenheit von Serum-Anti-Endomysium-Antikörper (EMA), bei einer glutenfreien Diät täglich vier Scheiben standardmäßiges glutenhaltiges Weißbrot zusätzlich zu ihrer üblichen glutenfreien Ernährung zum Essen. Das Subjekt 1 lehnte Brot aufgrund von Unterleibschmerzen, Mundgeschwüren und mäßigem Durchfall nach drei Tagen ab, aber Subjekt 2 fuhr damit 10 Tage lang bei einer lediglich mäßigen Übelkeit nach einer Woche fort. Der EMA wurde in Subjekt 2 eine Woche nach der Brot-Herausforderung positiv, was anzeigte, daß das verwendete Brot einen Zöliakie-Rückfall verursacht hatte. In Subjekt 1 jedoch blieb der EMA bis zu zwei Monaten nach der Brot-Herausforderung negativ. In beiden Subjekten verschwanden die Symptome, welche mit der Brot-Herausforderung auftraten, innerhalb von zwei Tagen nach Rückkehr zu einer glutenfreien Ernährung.
  • PBMC-Antworten in IFNγ-ELISPOT-Assays auf A-Gliadin-Peptide wurden nicht vor oder während der Brot-Herausforderung gefunden. Vom Tag nach dem Brot-Entzug aber (Tag 4) zeigte in Subjekt 1 ein einzelner Pool von 5 überlappenden Peptiden, welche mit tTG behandeltes A-Gliadin 51–85 überspannten (Pool 3), potente IFNg-Antworten (siehe Figur deltes A-Gliadin 51–85 überspannten (Pool 3), potente IFNg-Antworten (siehe 1a). In Subjekt 1 blieb die PBMC-IFNg-Antwort auf A-Gliadin-Peptid allein auf den Pool 3 gerichtet und war am Tag 8 maximal. Die Dynamik und Größe der Antwort auf Pool 3 war ähnlich zu derjenigen, welche von α-Chymotrypsin-verdautem Gliadin hervorgerufen wurde. PBMC-IFNγ-Antworten auf tTG-behandelten Pool 3 waren durchweg 5- bis 12-mal größer als bei nicht mit tTG behandeltem Pool 3, und die Antworten auf mit α-Chymotrypsin verdautes Gliadin waren 3- bis 10-mal größer, wenn mit tTG behandelt worden war. In Subjekt 2 war mit tTG behandelter Pool 3 ebenfalls der einzige immunogene Satz an A-Gliadin-Peptiden am Tag 8, aber diese Antwort war schwächer als bei Subjekt 1, wurde am Tag 4 nicht beobachtet, und ab Tag 11 war die Antwort auf Pool 3 vermindert, und andere tTG-behandelte Pools von A-Gliadin-Peptiden riefen stärkere IFNα-Antworten hervor (siehe 1b).
  • Die Pilotuntersuchung zeigte, daß die anfängliche T-Zell-Antwort in diesen Zöliakie-Subjekten gegen einen einzigen tTG-behandelten A-Gliadin-Pool von fünf Peptiden gerichtet war und ohne Weiteres im peripheren Blut gemessen wurde. Wenn die Antigen-Exposition aber zehn anstatt drei Tage lang fortgesetzt wird, erscheinen T-Zell-Antworten gegen andere A-Gliadin-Peptide, was konsistent mit einer Epitop-Ausbreitung bzw. einem Epitop-Spreading ist.
  • Zöliakie-spezifische IFN-g-Induktion durch tTG-behandelte A-Gliadin-Peptide
  • In fünf von sechs weiteren Zöliakie-Subjekten auf glutenfreier Diät (siehe Tabelle 1) identifizierte eine Brot-Herausforderung während drei Tagen tTG-behandelte Peptide in Pool 3 und insbesondere Peptide, entsprechend 56–70 (12) und 60–75 (13), als die einzigen A-Gliadin-Komponenten, welche IFNγ aus PBMC hervorriefen (siehe 2). IL-10-ELISPOT-Assays, welche parallel zu IFNγ-ELISPOT durchgeführt wurden, zeigten keine IL-10-Antwort auf die tTG-behandelten Peptide 12 oder 13. In einem Subjekt gab es keine IFNγ-Antworten auf irgendein A-Gliadin-Peptid oder mit α-Chymotrypsin verdautes Gliadin vor, während oder bis zu vier Tage nach der Brot-Herausforderung. In keinem dieser Zöliakie-Subjekte wich der EMA-Zustand von der Basislinie ab, als bis zu zwei Monate lang nach der Brot-Herausforderung gemessen wurde.
  • PBMC aus vier gesunden EMA-negativen Subjekten mit den HLA-DQ-Allelen α1·0501, β1·0201 (Alter 28–52, zwei Frauen), welche drei Tage lang mit Brot nach Befolgung einer glutenfreien Diät während eines Monats herausgefordert worden waren, zeigten keine IFNγ-Antworten überhalb der Negativkontrolle auf jedwedes der A-Gliadin-Peptide mit oder ohne tTG-Behandlung. Somit war die Induktion von IFNγ in PBMC gegen tTG-behandelte Pool3- und A-Gliadin-Peptide 56–70 (12) und 60–75 (13) Zöliakie-spezifisch (7/8 gegen 0/4, p < 0,01 mittels Chi-Quadrat-Analyse).
  • Feinkartierung des minimalen A-Gliadin-T-Zell-Epitops
  • tTG-behandelte Peptide, welche Trunkierungen von A-Gliadin 56–75 repräsentieren, enthüllten, daß die gleiche Kernpeptidsequenz (QPQLP) für die Antigenität in allen der fünf untersuchten Zöliakie-Subjekten essentiell war (siehe 3). PBMS-IFNγ-Antworten auf tTG-behandelte Peptide, welche diese Kernsequenz überspannten, beginnend mit dem 7-mer PQPQLPY und mit zunehmender Länge, zeigten, daß das tTG-behandelte 17-mer QLQPFPQPQLPYPQPQS (A-Gliadin 57–73) eine optimale Aktivität in dem IFNγ-ELISPOT besaß (siehe 4).
  • Desamidierung-von Q65 durch tTG erzeugt das immundominante T-Zell-Epitop in A-Gliadin
  • Eine HPLC-Analyse demonstrierte, daß die tTG-Behandlung von A-Gliadin 56–75 ein einziges Produkt erzeugte, welches geringfügig später als das Stammform-Peptid eluierte. Eine Aminosäuresequenzierung zeigte, daß von den sechs in A-Gliadin 56–75 enthaltenen Glutamin(Q)-Resten Q65 präferenziell durch tTG desamidiert wurde (siehe 5). Die Bioaktivität von Peptiden, welche seriellen Verlängerungen von der A-Gliadin-62-68-Kernsequenz aus entsprachen, in welchen Glutamat (E) das Q65 ersetzte, war äquivalent zu den gleichen Peptiden mit Q65 nach tTG-Behandlung (siehe 4a). Die Ersetzung von Q57 und Q72 durch E, zusammen oder allein, mit E65 verstärkte nicht die Antigenität des 17-mers in den drei untersuchten Zöliakie-Subjekten (siehe 6). Q57 und Q72 wurden untersucht, weil Glutaminreste, denen ein Prolin folgt, in Gliadinpeptiden nicht in vitro durch tTG desamidiert werden (W. Vader et al., Proceedings 8th International Symposium Coeliac Disease). Deshalb wurde das immundominante T-Zell-Epitop auf QLQPFPQPELPYPQPQS eingegrenzt.
  • Die immundominante T-Zell-Epitop-Antwort ist DQ2-restringiert und CD4-abhängig
  • In zwei Zöliakie-Subjekten, welche für HLA-DQ α1·0501, β1·0201 homozygot waren, blockierte monoklonaler Anti-DQ-Antikörper die ELISPOT-IFNγ-Antwort auf tTG-behandeltes A-Gliadin 56–75, aber bei Anti-DP und -DR-Antikörpern war dies nicht der Fall (siehe 7). Eine mittels Anti-CD4- und Anti-CD8-Magnetkügelchen erfolgende Depletion von PBMC aus zwei Zöliakie-Subjekten zeigte, daß die IFNγ-Antwort auf tTG-behandeltes A-Gliadin 56–75 CD4-T-Zell-vermittelt ist.
  • Diskussion
  • In dieser Untersuchung beschreiben wir eine ziemlich simple nahrungsmäßige Antigen-Herausforderung unter Einsatz von standardmäßigem Weißbrot, um eine vorübergehende Population von CD4-T-Zellen im peripheren Blut von Zöliakie-Subjekten hervorzurufen, die auf ein tTG-behandeltes A-Gliadin-l7-mer mit der Sequenz: QLQPFPQPELPYPQPQS (Reste 57–73) antwortfähig sind. Die Immunantwort auf A-Gliadin 56–75 (Q→E65) ist auf das Zöliakie-assoziierte HLA-Allel DQ α1·0501, β1·0201 restringiert. Die Wirkung von Gewebe-Transglutaminase in vitro desamidiert selektiv Q65. Hervorgerufene Periphere-Blut-IFNg-Antworten auf synthetische A-Gliadinpeptide mit der Substitution Q→E65 sind äquivalent zu tTG-behandelten Q65-A-Gliadinpeptiden; beide stimulieren bis zu zehnmal mehr T-Zellen im IFNg-ELISPOT als unmodifizierte Q65-A-Gliadinpeptide.
  • Wir haben dieses Zöliakie-spezifische T-Zell-Epitop absichtlich unter Anwendung von in vivo-Antigenherausforderung und kurzfristigen ex vivo-Immunassays eingegrenzt, um die Möglichkeit methodischer Artefakte zu vermeiden, welche bei der Verwendung von T-Zell-Klonen in einer Epitopkartierung auftreten können. Unsere Feststellungen zeigen, daß Antworten von T-Zellen aus peripherem Blut auf den Verzehr von Gluten rasch aber kurzlebig sind und für eine Epitopkartierung verwendet werden können. Die in vivo-Antigen-Herausforderung hat ebenfalls gezeigt, daß es eine zeitliche Hierarchie von Immunantworten auf A-Gliadinpeptide gibt; mittels tTG modifiziertes A-Gliadin 57–73 ruft nicht nur die stärkste IFNg-Antwort in PBMC hervor, sondern es handelt sich dabei auch um die erste IFNg-Antwort, welche auftritt.
  • Weil wir nur Peptide, welche A-Gliadin überspannen, untersucht haben, kann es andere Epitope in anderen Gliadinen von gleicher oder größerer Bedeutung in der Pathogenese von Zöliakie geben. Tatsächlich ist die Peptidsequenz am Kern des Epitops in A-Gliadin, welche wir identifiziert haben (PQPQLPY), mehreren anderen Gliadinen gemeinsam (SwissProt- und Trembl-Zugangsnummern: P02863, Q41528, Q41531, Q41533, Q9ZP09, P04722, P04724, P18573). Allerdings riefen A-Gliadinpeptide, von denen früher gezeigt wurde, Bioaktivität bei Biopsie-Herausforderung und in vivo-Untersuchungen zu besitzen (zum Beispiel: 31–43, 44–55 und 206–217)4, 5, keine IFNg-Antworten in PBMC im Anschluss an eine drei Tage lange Brot-Herausforderung in Zöliakie-Subjekten hervor. Diese Peptide können "sekundäre" T-Zell-Epitope sein, welche mit der Ausweitung der Immunantwort zustande kommen.
  • Beispiel 2
  • Der Effekt von Substitutionen im immundominanten Epitop auf die T-Zell-Erkennung
  • Der Effekt des Substituierens des Glutamats an der Position 65 im 57-73-A-Gliadin-Epitop wurde durch Messen der Peripheren-Blut-Antworten gegen die substitutierten Epitope in einem IFNγ-ELISPOT-Assay unter Verwendung von synthetischen Peptiden (bei 50 μg/ml) bestimmt. Die Antworten wurden in 3 Zöliakie-Subjekten 6 Tage nach Beginnen der Gluten-Herausforderung (4 Scheiben Brot täglich während 3 Tagen) gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 und der 8 gezeigt. Wie ersehen werden kann, stimulierte die Substitution des Glutamats zu Histidin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Prolin oder Arginin eine Antwort, deren Größe geringer als 10% der Größe der Antwort auf das immundominante Epitop war. Somit konnte die Mutation von A-Gliadin an dieser Position verwendet werden, um ein Mutantengliadin mit verringerter oder fehlender Immunreaktivität herzustellen.
  • Beispiel 3
  • Testen der Immunreaktivität von äquivalenten Peptiden aus anderen natürlich vorkommenden Gliadinen
  • Die Immunreaktivität von äquivalenten Peptiden aus anderen natürlich vorkommenden Weizen-Gliadinen wurde unter Verwendung von synthetischen Peptiden, entsprechend den natürlich vorkommenden Sequenzen, welche dann mit Transglutaminase behandelt wurden, untersucht. Diese Peptide wurden in einem ELISPOT auf die gleiche Weise und mit PBMCs aus den gleichen Subjekten getestet, wie in Beispiel 2 beschrieben. Mindestens fünf der Peptide zeigen eine Immunreaktivität, welche mit dem Peptid A-Gliadin 57–73 E65 (nach Transglutaminase-Behandlung) vergleichbar war, was anzeigt, daß es wahrscheinlich ist, daß auch andere Gliadinproteine in Weizen diese Zöliakie-spezifische Immunantwort induzieren (Tabelle 4 und 9).
  • Methoden
    • Subjekte: Die in der Untersuchungen verwendeten Patienten besuchten eine Zöliakie-Klinik in Oxford in Großbritannien. Zöliakie wurde auf der Grundlage der typischen Dünndarm-Histologie sowie der Normalisierung der Symptome und der Dünndarm-Histologie mit Gluten-freier Diät, diagnostiziert.
    • Gewebe-Typisierung: Die Gewebe-Typisierung wurde unter Verwendung von DNA durchgeführt, die aus EDTA-antikoagulierten peripherem Blut extrahiert worden war. Die HLA- DQA und -DQB-Genotypierung wurde mittels PCR unter Verwendung von sequenzspezifischen Primermischungen6–8 durchgeführt.
    • Anti-Endomysium-Antikörper-Assay: EMA wurden durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Patientenserum, welches 1:5 mit Affen-Oesophagus verdünnt worden war, gefolgt von FITC-konjugiertem Ziege-Anti-Mensch-IgA, nachgewiesen. Das IgA wurde vor EMA quantifiziert, und keines der Subjekte war IgA-defizient.
    • Antigen-Herausforderung: Im Anschluss an eine glutenfreie Diät konsumierten Zöliakie-Subjekte 4 Scheiben glutenhaltiges Brot (50 g/Scheibe, Sainsbury's "standard white sandwich bread") täglich 3 oder 10 Tage lang. EMA wurde die Woche vor und bis zu zwei Monate nach Beginn der Brotherausforderung untersucht. Gesunde Subjekte, welche vier Wochen lang eine glutenfreien Diät befolgt hatten, verzehrten ihre übliche Diät einschließlich vier Scheiben glutenhaltigem Brot während drei Tagen und kehrten dann weitere sechs Tage lang zur glutenfreien Diät zurück.
    • IFNγ- und IL-10-ELISPOT: PBMC wurden aus 50–100 ml venösem Blut durch Ficoll-Hypaque-Dichtezentrifugation präpariert. Nach drei Waschungen wurden PBMC in vollständigen RPMI resuspendiert, welches 10% hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum enthielt. ELI-SPOT-Assays auf Einzelzell-Sekretion von IFNγ und IL-10 wurden unter Verwendung kommerzieller Kits (Mabtech; Stockholm, Schweden) mit 96-Vertiefungs-Platten (MAIP-S-45; Millipore, Bedford, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers (wie anderorts9 beschrieben) mit 2 – 5 × 105 (IFNγ) oder 0,4 – 1 × 105 (IL-10) PBMC in jeder Vertiefung durchgeführt. Die Peptide wurden in Doppelausfertigungs-Vertiefungen getestet, und gereinigtes Proteinderivat aus Mycobacterium tuberculosis (PPD RT49) (Serum Institute; Kopenhagen, Dänemark) (20 μg/ml) wurde in allen Assays als Positivkontrolle eingeschlossen.
    • Peptide: Synthetische Peptide wurden von Research Genetics (Huntsville, Alabama) erworben. Massenspektroskopie und HPLC bestätigten die Authentizität der Peptide und eine Reinheit von > 70%. Der Verdau von Gliadin (Sigma; G-3375) (100 mg/ml) mit α-Chymotrypsin (Sigma; C-3142), 200:1 (w/w), wurde bei Raumtemperatur in 0,1 M NH4HCO3 mit 2 M Harnstoff durchgeführt und nach 24 Stunden durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 98°C angehalten. Nach Zentrifugation (13000 g, 10 Minuten) wurde der Gliadinverdau-Überstand sterilfiltriert (0,2 mm). Der Verdau von Gliadin wurde mittels SDS-PAGE bestätigt und die Proteinkonzentration wurde ermittelt. α-Chymotrypsin-verdautes Gliadin (640 μg/ml) und synthetische Gliadinpeptide (15-mere: 160 μg/ml, andere Peptide: 0,1 mM) wurden individuell 2 Stunden lang mit tTG (Sigma; T-5398) (50 μg/ml) in PBS + CaCl2, 1 mM, bei 37°C be handelt. Peptide und Peptidpools wurden in sterile 96-Vertiefungs-Platten aliquotiert und bei –20°C bis zur Verwendung gefroren aufbewahrt.
    • Aminosäuresequenzierung von Peptiden: Umkehrphasen-HPLC wurde angewandt, um das Peptid zu reinigen, welches aus der tTG-Behandlung von A-Gliadin 56–75 resultierte. Ein einzelnes Produkt wurde identifiziert und einer Aminosäuresequenzierung unterzogen (automatischer Sequenzierer vom Modell 494A, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien). Die Sequenz von unmodifiziertem G56-75 wurde als: LQLQPFPQPQLPYPQPQSFP bestätigt, und tTG-behandeltes G56-75 wurde identifiziert als: LQLQPFPQPELPYPQPQSFP. Die Desamidierung von Glutamylresten wurde als die Menge (pmol) an gewonnenem Glutamat definiert, ausgedrückt als ein Prozentsatz der vereinigten Menge an Glutamin und Glutamat, welche in den Zyklen 2, 4, 8, 10, 15 und 17 der Aminosäuresequenzierung gewonnen wurde. Die auf tTG zurückzuführende Desamidierung wurde definiert als (% Desamidierung von Glutamin in dem tTG-behandelten Peptid – % Desamidierung in dem unbehandelten Peptid)/(100 – % Desamidierung in dem unbehandelten Peptid.
    • CD4/CD8- und HLA-Klasse II-Restriktion: Magnetische Anti-CD4- oder Anti-CD8-beschichtete Kügelchen (Dynal, Oslo, Norwegen) wurden viermal mit RPMI gewaschen und dann 30 Minuten lang mit PBMC in komplettem RPMI, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum (5 × 106 Zellen/ml), auf Eis inkubiert. Die Kügelchen wurden unter Verwendung eines Magneten entfernt, und die verbleibenden Zellen wurden ausgezählt. Die in vivo-HLA-Klasse-II-Restriktion der Immunantwort auf tTG-behandeltes A-Gliadin 56–75 wurde durch Inkubieren von PBMC (5 × 106 Zellen/ml) mit monoklonalen Anti-HLA-DR- (L243), -DQ- (L2) und -DP- (B7.21) -Antikörpern (10 μg/ml) bei Raumtemperatur während einer Stunde vor der Zugabe von Peptid festgestellt.
  • Beispiel 4
  • Mucosale Integrin-Expression durch Gliadin-spezifische Lymphozyten des peripheren Blutes
  • Die Wechselwirkung zwischen endothelialen und Lymphozyten-Adressinen erleichtert das "Homing" bzw. "gerichtete Einnisten" von organspezifischen Lymphozyten. Es sind viele Adressine bekannt. Das Heterodimer α4β7 ist spezifisch für die Lamina propria des Darms sowie andere mucosale Lymphozyten, und αEβ7 ist spezifisch für intra-epitheliale Lymphozyten in Darm und Haut. Ungefähr 30 % der CD4-T-Zellen des peripheren Blutes exprimieren α4β7 und befinden sich angenommermaßen im Übergang zu einer mukosalen Stelle, wohingegen 5 % der T-Zellen des peripheren Blutes αEβ7 exprimieren. Immunomagnetische Kügelchen, welche mit für αE oder β7 spezifischem Antikörper beschichtet sind, depletieren PBMC von Zellen, welche jeweils αEβ7 oder αEβ7 und α4β7 exprimieren. In Kombination mit dem ELISpot-Assay ermöglicht die Depletion mittels immunomagnetischen Kügelchen eine Bestimmung der Adressin-Expression gliadinspezifischer T-Zellen, welche diese Zellen als ein Mukosa-Oberflächen-Homing aufweisend identifizieren kann. Interessanterweise ist eine Gluten-Herausforderung in vivo mit dem raschen Eintreten von CD4-T-Zellen in die Lamina propria des Dünndarms (nicht-intraepitheliale Stellen) assoziiert, wo über 90% der Lymphozyten α4β7 exprimieren.
  • Immunomagnetische Kügelchen wurden hergestellt und verwendet, um PBMC aus Zöliakie-Subjekten am Tag 6 oder 7 nach Beginnen der dreitägigen Glutenherausforderung zu depletieren. Eine FACS-Analyse zeigte, daß αE-Kügelchen ungefähr 50 % der positiven CD4-T-Zellen depletierten bzw. herausfingen, wohingegen β7-Kügelchen alle β7-positiven CD4-T-Zellen depletierten. Die Depletion von PBMC unter Verwendung von CD4- oder β7-Kügelchen, aber nicht CD8- oder αE-Kügelchen, eliminierte die Antworten im Interferon-Gamma-ELISpot. tTG-Gliadin- und PPD-Antworten wurden durch CD4-Depletion eliminiert, aber durchwegs mittels Depletion mit Integrin-spezifischen Kügelchen beeinflusst.
  • Somit exprimieren für A-Gliadin 57–73 QE65 spezifische T-Zellen, welche nach der Gluten-Herausforderung bei Zöliakie induziert werden, das Integrin α4β7, welches auf Laminapropria-CD4-T-Zellen im Dünndarm vorhanden ist.
  • Beispiel 5
  • Optimale Länge des T-Zell-Epitops
  • Frühere Daten aus Tests von Peptiden mit 7 bis 17 Aminosäuren Länge, welche den Kern des dominanten T-Zell-Epitops in A-Gliadin überspannten, wiesen darauf hin, daß das 17mer, A-Gliadin 57–73 QE65, maximale Antworten im Interferon-Gamma-Elispot unter Anwendung von mononuklearen Zellen aus peripherem Blut (PBMC) aus Zöliakie-Freiwilligen 6 Tage nach dem Beginn einer dreitägigen Gluten-Herausforderung induzierte.
  • Peptide, welche Erweiterungen von der Kernsequenz des dominanten T-Zell-Epitops in A-Gliadin repräsentierten, wurden in dem IFN-Gamma-ELISPOT unter Verwendung von mononuklearen Zellen aus peripherem Blut (PBMC) von Zöliakie-Freiwilligen 6 Tage nach Beginn einer 3-tägigen Gluten-Herausforderung bewertet (n = 4). Peptid 13: A-Gliadin 59–71 QE65 (13mer), Peptid 15: 58–72 QE65 (15mer), ..., Peptid 27: 52–78 QE65 (27mer).
  • Wie in der 11 gezeigt, verstärkt die Erweiterung der A-Gliadin 57–73 QE65-Sequenz die Antwort im IFNgamma-Elispot nicht wesentlich. Die nachfolgende Beispiele charakterisieren die Agonisten- und Antagonisten-Aktivität von A-Gliadin 57–73 QE65 unter Verwendung von 17mer-Peptiden.
  • Beispiel 6
  • Vergleich von A-Gliadin 57–73 QE65 mit anderen DQ2-restringierten T-Zell-Epitopen bei Zöliakie
  • Dosis-Antwort-Untersuchungen wurden unter Verwendung von Peptiden durchgeführt, entsprechend unmodifizierten und Transglutaminase-behandelten Peptiden, welche T-Zell-Epitopen von Gluten-spezifischen T-Zell-Klonen und -Linien aus Darm-Biopsien von Zöliakie-Subjekten entsprachen. Die Antworten auf die Peptide wurden als Prozentsatz der Antwort auf A-Gliadin 57–73 QE65 ausgedrückt. Alle Subjekte waren HLA-DQ2+ (keines war DQ8+).
  • Die Untersuchungen zeigen, daß A-Gliadin 57–73 QE65 das wirkungsvollste Gliadinpeptid für eine Induktion von Interferon-Gamma im ELISpot-Assay unter Verwendung von Zöliakie-PBMC nach Gluten-Herausforderung ist (siehe 12a–h und die Tabellen 5 und 6). Die zweiten und dritten Epitope sind suboptimale Fragmente von größeren Peptiden, d. h. A-Gliadin 57–73 QE65 und GDA4_WHEAT P04724-84-100 QE92. Das Epitop ist nur mäßig bioaktiv (ungefähr ein Zwanzigstel so aktiv wie A-Gliadin 57–73 QE65, nach Subtrahieren des Leerwertes).
  • A-Gliadin 57–73 QE65 ist wirksamer als andere bekannte T-Zell-Epitope bei Zöliakie. Es gibt 16 Polymorphismen von A-Gliadin 57–73 (einschließend die Sequenz PQLPY) unter sequenzierten Gliadin-Genen, und deren Bioaktivität wird als Nächstes überprüft.
  • Beispiel 7
  • Vergleich von für Gliadin und A-Gliadin 57–73 QE65 spezifischen Antworten in peripherem Blut
  • Der relative Beitrag des dominanten Epitops, A-Gliadin 57–73 QE65, zur gesamten T-Zell-Antwort auf Gliadin bei Zöliakie ist ein kritischer Punkt. Pepsin-Trypsin- und Chymotrypsinverdautes Gliadin sind herkömmlicherweise als Antigen für die Entwicklung von T-Zell-Linien und -Klonen bei Zöliakie verwendet worden. Es ist jedoch möglich, daß diese Proteasen durch bestimmte Peptidepitope schneiden. Tatsächlich erzeugt ein Chymotrypsin-Verdau von rekombinantem α9-Gliadin das Peptid QLQPFPQPELPY, welches eine Trunkierung der optimalen Epitopsequenz QLQPFPQPELPYPQPQS (siehe oben) ist. Die Transglutaminase-Behandlung erhöht wesentlich die Wirksamkeit von Chymotrypsin-verdautem Gliadin in Proliferations-Assays von Gliadin-spezifischen T-Zell-Klonen und -Linien. So kann Transglutaminase-behandeltes, mit Chymotrypsin verdautes Gliadin (tTG-Gliadin) nicht ein ideales Antigen sein, aber Antworten gegen diese Mischung können die "gesamte" Zahl an Lymphozyten des peripheren Blutes, welche für Gliadin spezifisch sind, approximieren bzw. näherungsweise angeben. Der Vergleich von Antworten gegen A-Gliadin 57–73 QE65 und tTG-Gliadin im ELISpot-Assay gibt eine Anzeige des Beitrags dieses dominanten Epitops zur insgesamten Immunantwort auf Gliadin bei Zöliakie und ist auch ein Maß des Epitop-Spreading.
  • PBMC, welche am Tag 6 oder 7 nach Beginnen einer Gluten-Herausforderung in 4 Zöliakie-Subjekten gesammelt wurden, wurden in Dosis-Antwort-Untersuchungen unter Verwendung von Chymotrypsin-verdautem Gliadin +/– tTG-Behandlung untersucht und mit ELISpot-Antworten auf eine optimale Konzentration an A-Gliadin 57–73 QE65 (25 mcg/ml) verglichen. Die tTG-Behandlung von Gliadin verstärkte PBMC-Antworten im ELISpot ungefähr 10fach (tTG war vergleichbar zum Leerwert, wenn es allein getestet wurde) (siehe 13a–c). In den vier untersuchten Zöliakie-Subjekten rief A-Gliadin 57–73 QE65 (25 mcg/ml) Antworten zwischen 14 und 115 % von denjenigen von tTG-Gliadin (500 mcg/ml) hervor, und, umso größer die Antwort auf A-Gliadin 57–73 QE65 ist, desto größer ist der Anteil, den sie an der tTG-Gliadin-Antwort repräsentierte.
  • Verhältnismäßig beschränkte bzw. wenige Daten legen nahe, daß A-Gliadin 57–73 QE65-Antworten in einigen Subjekten vergleichbar zu tTG-Gliadin wären. Das Epitop-Spreading, welches mit fortgeschritteneren Anti-Gliadin-T-Zell-Antworten assoziiert ist, kann für den kleineren Beitrag von A-Gliadin 57–73 QE65 an "gesamten" Gliadin-Antworten im peripheren Blut in manchen Individuen verantwortlich sein. Das Epitop-Spreading kann in Individuen mit weniger strengen glutenfreien Diäten aufrechterhalten bleiben.
  • Beispiel 8
  • Definition von Gliadinpeptiden, welche bei Zöliakie bioaktiv sind: Polymorphismen von A-Gliadin 57–73
  • Überlappende 15mer-Peptide, überspannend die vollständige Sequenz von A-Gliadin, wurden überprüft, um die immundominante Sequenz bei Zöliakie zu identifizieren. A-Gliadin war das erste vollständig sequenzierte Alpha-Gliadin-Protein und -Gen, aber ist eines von ungefähr 30–50 verwandten Alpha-Gliadin-Proteinen in Weizen. Fünfundzwanzig verschiedene Alpha- Gliadin-Gene sind mittels Durchsuchen von Proteindatenbanken, Swiss-Prot und TREMBL, identifiziert worden, wobei weitere 8 Alpha-Gliadine beschrieben wurden. Innerhalb dieser 25 Alpha-Gliadine sind 16 unterschiedliche Polymorphismen der Sequenz, welche A-Gliadin 57–73 entspricht, enthalten (siehe Tabelle 7).
  • Synthetische Peptide, welche diesen 16 Polymorphismen entsprechen, in einer unmodifizierten Form, nach Behandlung mit Transglutaminase in vitro, sowie mit an der Position 10 substituiertem Glutamat (äquivalent zu QE65 in A-Gliadin 57–73), wurden unter Verwendung von PBMC aus Zöliakie-Subjekten, normalerweise im Anschluss an eine glutenfreie Diät, am Tag 6 oder 7 nach Glutenherausforderung in Interferon-Gamma-ELISpot-Assays untersucht. Glutamat-substituierte Peptide wurden bei drei Konzentrationen verglichen (2,5, 25 und 250 mcg/ml), unmodifiziertes Peptid und Transglutaminase-behandelte Peptide wurden nur bei 25 mcg/ml untersucht. Die Bioaktivität wurde ausgedrückt als Prozentsatz der Antwort, assoziiert mit A-Gliadin 57–73 QE65, 25 mcg/ml, in individuellen Subjekten (n = 4) (siehe 14).
  • Die Bioaktivität von "Wildtyp"-Peptiden wurde durch Behandlung mit Transglutaminase wesentlich erhöht (> 5fach). Die Transglutaminase-Behandlung von Wildtyp-Peptiden führte zu einer ähnlichen Bioaktivität wie jener der gleichen Peptide, welche mit Glutamat an Position 10 substituiert waren. Die Bioaktivitäten von fünf Glutamant-substituierten Peptiden (B, C, K, L, M) waren > 70 % von derjenigen von A-Gliadin 57–73 QE65 (A), aber keines war signifikant mehr bioaktiv als A-Gliadin 57–73 QE65. PBMC-Antworten auf Glutamat-substituierte Peptide bei Konzentrationen von 2,5 und 250 mcg/ml waren zu denjenigen bei 25 mcg/ml vergleichbar. Sechs Glutamat-substituierte Gliadinpeptide (H, I, J, N, O, P) waren < 15 % so bioaktiv wie A-Gliadin 57–73 QE65. Die anderen Peptide wiesen eine intermediäre Bioaktivität auf.
  • Mindestens sechs Gliadin-abgeleitete Peptide sind hinsichtlich der Wirksamkeit gleichwertig zu A-Gliadin 57–73 QE65 nach Modifikation durch Transglutaminase. Relativ nicht-bioaktive Polymorphismen von A-Gliadin 57–73 existieren ebenfalls. Diese Daten zeigen, daß eine Transglutaminase-Modifikation von Peptiden aus mehreren Gliadinen von Tricetum aestivum, T. uartu und T. spelta zum Hervorbringen des immundominanten T-Zell-Epitops bei Zöliakie in der Lage sein können.
  • Die genetische Modifikation von Weizen, um einen nicht-zöliakisch-toxischen Weizen zu erzeugen, erfordert wahrscheinlich die Entfernung oder Modifikation von mehreren Gliadin-Genen. Die Erzeugung von Weizen, welcher Gliadine oder andere Proteine oder Peptide enthält, welche Sequenzen beinhalten, die "abgewandelte Peptidligand"-Antagonisten von A-Gliadin 57–73 definieren, ist eine alternative Strategie zur Erzeugung von genetisch modifiziertem Weizen, welcher eher therapeutisch als "nicht-toxisch" bei Zöliakie-Erkrankung ist.
  • Beispiel 9
  • Eingrenzen der Kern-Epitop-Sequenz:
  • Der Vergleich von Peptiden, welche Trunkierungen von A-Gliadin 56–75 vom N- und C-Terminus aus entsprachen, wies darauf hin, daß die Kernsequenzen des T-Zell-Epitops PELPY ist (A-Gliadin 64–68). Versuche, Nicht-Agonisten und Antagonisten zu definieren, werden sich auf Varianten von A-Gliadin konzentrieren, welche an Resten substituiert sind, die wesentlich zu seiner Bioaktivität beitragen.
  • Peptide, welche A-Gliadin 57–73 QE65 entsprechen, bei welchem Alanin (15) oder Lysin (16) für die Reste 57 bis 73 substituiert ist, wurden im IFN-gamma-ELISPOT unter Verwendung von mononuklearen Zellen aus peripherem Blut (PBMC) aus Zöliakie-Freiwilligen 6 Tage nach Beginn einer dreitägigen Glutenherausforderung verglichen (n = 8) [BL steht für Leerprobe, E ist A-Gliadin 57–73 QE65: QLQPFPQPELPYPQPQS].
  • Es wurde festgestellt, daß Reste, welche A-Gliadin 60–70 QE65 (PFPQPELPYPQ entsprachen, wesentlich zur Bioaktivität in A-Gliadin 57–73 QE65 beitragen. Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65, welche an den Positionen 60–70 substituiert sind, werden in einem 2-Schritt-Vorgehen untersucht. Anfänglich wird A-Gliadin 57–73 QE65, welches an den Positionen 60–70 unter Verwendung von 10 verschiedenen Aminosäuren mit gegensätzlichen Eigenschaften substituiert ist, überprüft. Eine zweite Gruppe von A-Gliadin 57–73 QE65-Varianten (substituiert mit allen anderen natürlich vorkommenden Aminosäuren außer Cystein an Positionen, welche sich als gegenüber Modifikation empfindlich erweisen) werden in einer zweiten Runde überprüft.
  • Beispiel 10
  • Agonisten-Aktivität von substituierten Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65
  • A-Gliadin 60–70 QE65 ist die Kernsequenz des dominanten T-Zell-Epitops in A-Gliadin. Antagonisten- und Nicht-Agonisten-Peptidvarianten dieses Epitops werden mit hoher Wahrscheinlichkeit durch Modifikation dieser Kernsequenz erzeugt. Zu Anfang wird A-Gliadin 57–73 QE65, welches an den Positionen 60–70 unter Verwendung von 10 unterschiedlichen Aminosäuren mit gegensätzlichen Eigenschaften substituiert ist, im IFN-gamma-ELISPOT unter Verwendung von PBMC aus Zöliakie-Subjekten 6 Tage nach Beginnen einer 3-tägigen Glutenherausforderung getestet. Eine zweite Gruppe von A-Gliadin tenherausforderung getestet. Eine zweite Gruppe von A-Gliadin 57–73 QE65-Varianten (substituiert mit allen anderen natürlich vorkommenden Aminosäuren, außer Cystein) an den Positionen 61–70 wurde ebenfalls überprüft. Beide Gruppen von Peptiden (alle bei 50 mcg/ml, in zweifacher Ausfertigung) wurden unter Verwendung von PBMC aus 8 Subjekten untersucht und mit dem unmodifizierten Peptid verglichen (20 Wiederholungsansätze je Assay). Frühere Untersuchungen zeigen, daß die optimale Konzentration für A-Gliadin 57–73 QE65 in diesem Assay zwischen 10 und 100 mcg/ml liegt.
  • Die Ergebnisse werden als mittlere Antwort in "Spot-Forming-Cells" (95 % Konfidenz-Intervall) als Prozentsatz der mittleren A-G 57–73 QE65-Antwort in jedem Individuum ausgedrückt. Ungepaarte t-Tests werden verwendet, um die ELISPOT-Antworten von modifizieren Peptiden mit A-G 57–73 QE65 zu vergleichen. Super-Agonisten wurden als bei einem Signifikanzniveau von p < 0,01 eine größere Antwort denn A-G 57–73 QE65 aufweisend; partielle Agonisten als bei einem Signifikanzniveau von p < 0,01 eine geringere Antwort denn A-G 57–73 QE65 aufweisend, und Nicht-Agonisten als nicht signifikant unterschiedlich (p > 0,01) vom Leerwert (Puffer ohne Peptid) definiert. Peptide mit einer Agonistenaktivität von 30 % oder weniger von derjenigen von A-Gliadin 57–73 QE65 wurden als "geeignete" partielle oder Nicht-Agonisten zur Untersuchung hinsichtlich antagonistischer Aktivität betrachtet (siehe Tabelle 8 und 17–27).
  • Die IFNgamma-ELISPOT-Antwort von PBMC auf A-Gliadin 57–73 QE65 ist auf molekularer Ebene hochspezifisch. Prolin an der Position 64 (P64), Glutamtat bei 65 (E65) und Leucin an der Position 66 (L66), und zu einem geringeren Ausmaß Q63, P67, Y68 und P69, sind besonders empfindlich gegenüber Modifikation. Die Substitutionen Y61 und Y70 erzeugen beide Super-Agonisten mit einer um 30 % größeren Bioaktivität als das Elternpeptid, wahrscheinlich durch Verstärkung der Bindung an HLA-DQ2, da das Motiv für dieses HLA-Molekül eine Präferenz für sperrige hydrophobe Reste an den Positionen 1 und 9 zeigt. Achtzehn Nicht-Agonisten-Peptide wurden identifiziert. Die Bioaktivitäten der Varianten (50 mcg/ml): P65, K64, K65 und Y65 (Bioaktivität 7–8 %) waren vergleichbar zum Leerwert (7 %). Insgesamt 57 mutierte Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65 waren 30 % oder weniger so bioaktiv wie A-Gliadin 57–73 QE65.
  • Die molekulare Spezifität der Peripheres-Blut-Lymphozyten(PBL)-T-Zell-Antwort auf das dominante Epitop, A-Gliadin 57–73 QE65, ist unter HLA-DQ2+-Zöliakie-Subjekten durchweg reproduzierbar und ist für eine begrenzte Zahl an Aminosäuren in den 7 Kern-Aminosäuren hochspezifisch. Bestimmte Einzel-Aminosäure-Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65 sind in konsistenter Weise Nicht-Agonisten in allen HLA-DQ2+-Zöliakie-Subjekten.
  • Beispiel 11
  • Antagonisten-Aktivität von substituierten Varianten
  • Die Homogenität der PBL-T-Zell-Antwort auf A-Gliadin 57–73 QE65 bei HLA-DQ2+-Zöliakie legt nahe, daß abgewandelte Peptid-Liganden (APL), welche zum Antagonismus in PBMC ex vivo fähig sind, existieren können, selbst obwohl es wahrscheinlich ist, daß die PBL-T-Zell-Antwort poly- oder oligoklonal ist. APL-Antagonisten sind im Allgemeinen schwache Agonisten. 57 Einzel-Aminosäure-substituierte Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65 mit einer Agonistenaktivität von 30 % oder weniger sind identifiziert worden und sind geeignete Kandidaten als APL-Antagonisten. Darüber hinaus sind auch bestimmte schwachbioaktive natürlich vorkommende Polymorphismen von A-Gliadin 57–73 QE65 identifiziert worden (siehe unten stehend) und können "natürlich vorkommende" APL-Antagonisten sein. Es ist ebenfalls vorgeschlagen worden, daß eine Kompetition um die Bindung von MHC gleichfalls die antigen-spezifische T-Zell-Immunantwort antagonisieren kann. Somit können Nicht-Gliadin-Peptide, welche keine IFNgamma-Antworten in zöliakischen PBMC nach Glutenherausforderung induzieren aber bekanntermaßen an HLA-DQ2 binden, in der Lage zum Reduzieren von T-Zell-Antworten sein, welche durch A-Gliadin 57–73 QE65 hervorgerufen wurden. Zwei Peptide, welche stark an HLA-DQ2 binden, sind HLA-Klasse 1 α 46–60 (HLA 1a) (PRAPWIEQEGPEYW) und Thyroid-Peroxidase (tp) 632–645Y (IDVWLGGLLAENFLPY).
  • Eine gleichzeitige Zugabe von Peptid (50 μg/ml) oder Puffer und A-Gliadin 57–73 QE65 (10 μg/ml) in IFNgamma-ELISPOT unter Verwendung von PBMC aus Zöliakie-Freiwilligen 6 Tage nach Beginnen einer 3-tägigen Glutenherausforderung (n = 5) wurde durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Antwort mit Peptid plus A-G 57–73 QE65 (Mittelwert von zweifachen Ausfertigungen) als Prozentsatz der Antwort mit Puffer plus A-G 57–73 QE65 (Mittelwert von 20 Wiederholungsansätzen) ausgedrückt (siehe Tabelle 9).
  • Vier Einzelaminosäure-substituierte Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65 verringern die Interferon-gamma-PBMC-ELISPOT-Antwort auf A-Gliadin 57–73 QE65 (p < 0,01) um zwischen 25 % und 28 %, 13 andere Peptidevarianten verringern die ELISPOT-Antwort um zwischen 18 % und 24 % (p < 0,06). Der HLA-DQ2-Binder Thyroid-Peroxidase (tp) 632–645Y verringert PBMC-Interferon-gamma-Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 um 31 % (p < 0,0001), aber der andere HLA-DQ2-Binder, HLA-Klasse 1 α 46–60, verändert die Antworten nicht (siehe Tabelle 9). Das Peptid, welches einem Transglutaminase-modifizierten Polymorphismus von A-Gliadin 57–73 entspricht, SwissProt-Zugangsnummer: P04725 82–98 QE90 (PQPQPFPPELPYPQPQS), verringert die Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 um 19 % (p < 0,009) (siehe Tabelle 11).
  • Die Interferon-Gamma-Antworten von PBMC auf A-Gliadin 57–73 QE65 in ELISPOT-Assays werden durch Co-Verabreichung von bestimmten Einzelaminosäure-A-Gliadin 57–73 QE65-Varianten, einem Polymorphismus von A-Gliadin 57–73 QE65 und einem nichtverwandten Peptid, welches bekanntermaßen HLA-DQ2 bindet, im fünffachen Überschuss, verringert. Diese Feststellung legt nahe, daß abgewandelte Peptid-Ligand-Antagonisten von A-Gliadin 57–73 QE65 existieren. Nicht nur vermeintliche APL-Antagonisten sondern auch bestimmte Peptide, welche HLA-DQ2 binden, verringern effektiv die PBL-T-Zell-Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65.
  • Diese Feststellungen unterstützen zwei Strategien zur Unterbrechung der T-Zell-Antwort auf das dominante A-Gliadin-Epitop bei HLA-DQ2+-Zöliakie.
    • 1. Optimierung von APL-Antagonisten durch Substituieren von Aminosäuren an mehr als einer Position (64–67) zur Verwendung als "traditionelle" Peptid-Pharmazeutika oder für die spezifische genetische Modifikation von Gliadin-Genen in Weizen.
    • 2. Verwendung von Hochaffinitäts-HLA-DQ2-Bindungspeptiden zur kompetitiven Inhibierung der Präsentation von A-Gliadin 57–73 QE65 in Assoziation mit HLA-DQ2.
  • Diese zwei Vorgehensweisen können wechselseitig kompatibel sein. Super-Agonisten wurden durch Ersetzen von F6l und Q70 durch Tyrosinreste erzeugt. Es ist wahrscheinlich, daß diese Super-Agonisten eher aus einer verbesserten Bindung an HLA-DQ2 resultierten als aus dem verstärkten Kontakt mit dem T-Zell-Rezeptor. Durch Kombinieren dieser Modifikationen mit anderen Substitutionen, welche mäßig effektive APL-Antagonisten erzeugen, könnte man den inhibitorischen Effekt von substituierten A-Gliadin 57–73 QE65-Varianten wesentlich verstärken.
  • Beispiel 12
  • Entwicklung von Interferon-gamma-ELISpot unter Verwendung von PBMC und A-Gliadin 57–73 QE65 und P04724 84–100 QE92 als Diagnose für Zöliakie: Definition von Immun-Resnonsivität bei neu diagnostizierter Zöliakie
  • Die Induktion der Responsivität gegenüber dem dominanten A-Gliadin-T-Zell-Epitop in PBMC, welche im Interferon-gamma-ELISpot gemessen wird, folgt auf eine Glutenherausforderung in fast allen DQ2+-Zöliakie-Subjekten, welche eine strenge langfristige glutenfreie Diät (GFD) befolgten, aber nicht in gesunden DQ2+-Subjekten nach 4 Wochen langem Befolgen einer strengen GFD. Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 sind in PBMC von Zöliakie-Subjekten vor der Glutenherausforderung nicht messbar, und Pilot-Daten haben nahegelegt, daß diese Antworten in PBMC von unbehandelten Zöliakie-Patienten nicht gemessen werden konnten. Diese Daten legen nahe, daß bei Zöliakie die Immunresponsivität gegenüber A-Gliadin 57–73QE65 im Anschluss an Antigen-Ausschluss (GFD) wiederhergestellt wird. Wenn ein diagnostischer Test unter Verwendung des ELISpot-Assays und von PBMC entwickelt werden soll, ist es wünschenswert, die Dauer einer GFD zu definieren, welche erforderlich ist, bevor die Glutenherausforderung in der Lage ist, Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 und andere immunreaktive Gliadinpeptide im Blut zu induzieren.
  • Neu diagnostizierte DQ2+-Zöliakie-Subjekte wurden aus dem ambulanten Gastroenterologie-Service rekrutiert. PBMC wurden präpariert und in Interfon-gamma-ELISpot-Assays getestet, bevor bei den Subjekten mit einer GFD begonnen wurde, sowie eine oder zwei Wochen nach Beginnen der GFD. Darüber hinaus wurde eine Glutenherausforderung (3 Tage lang Verzehr von 4 Scheiben standardmäßigem Weißbrot, 200 g/Tag) eine oder zwei Wochen nach Beginn der GFD durchgeführt. PBMC wurden präpariert und am Tag 6 nach Beginn der Glutenherausforderung getestet. A-Gliadin 57–73 QE65 (A), P04724 84–100 QE92 (B) (allein und kombiniert) und A-Gliadin 57–73 QP65 (P65) (nicht-bioaktive Variante, siehe oben) (alle 25 mcg/ml) wurden untersucht.
  • Alle außer einem neu diagnostizierten Zöliakie-Patienten waren DQ2+ (einer war DQ8+) (n = 11). PBMC aus neu diagnostizierten Zöliakie-Patienten, welche unbehandelt waren, oder nach 1 oder 2 Wochen im Anschluss an GFD, zeigten keine Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 und P04724 84–100 QE92 (allein oder kombiniert), welche nicht signifikant unterschiedlich zu Leerprobe oder A-Gliadin 57–73 QP65 waren (n = 9) (siehe 28). Eine Glutenherausforderung in Zöliakie-Patienten, welche lediglich eine Woche lang einer GFD folgten, verstärkte die Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 oder P04724 84–100 QE92 (allein oder kombiniert) nicht wesentlich. Eine Glutenherausforderung 2 Wochen nach Beginnen der GFD jedoch induzierte Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 und P04724 84–100 QE92 (allein oder kombiniert), welche signifikant größer als bei der nicht-bioaktiven Variante A-Gliadin 57–73 QP65 und der Leerprobe waren. Obwohl diese Antworten nach Glutenherausforderung nach 2 Wochen substanziell waren, erschienen sie geringer zu sein als in Subjekten > 2 Monate nach Beginn der GFD. Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 allein waren äquivalent oder größer als Antworten auf P04724 84–100 QE92 allein oder bei Vermischung mit A-Gliadin 57–73 QE65. Keines der Subjekte erlitt problematische Symptome bei der Glutenherausforderung.
  • Die Immun-Responsivität (wie gemessen in PBMC nach Glutenherausforderung) gegenüber A-Gliadin wird 2 Wochen nach Beginnen der GFD partiell wiederhergestellt, was impliziert, daß eine "Immun-Nicht-Responsivität" gegenüber diesem dominanten T-Zell-Epitop bei unbehandelter Zöliakie und mindestens eine Woche lang nach Beginn der GFD vorherrscht. Der optimale Zeitpunkt eines diagnostischen Tests für Zöliakie unter Anwendung von Glutenherausforderung und Messung von Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 im ELISpot-Assay liegt bei mindestens 2 Wochen nach dem Beginnen einer GFD.
  • Interferon-gamma-sezernierende-T-Zellen, welche für A-Gliadin 57–73 QE65 spezifisch sind, können nicht im peripheren Blut in unbehandelten Zöliakiepatienten gemessen werden und können nur durch Glutenherausforderung nach mindestens 2 Wochen GFD (Antigenausschluss) induziert werden. Deshalb ist die Zeitgebung eines diagnostischen Tests unter Anwendung dieser Methodik ausschlaggebend, und weitere Untersuchungen werden für seine Optimierung benötigt. Diese Feststellungen sind konsistent mit einer funktionellen Anergie von T-Zellen, welche für das dominante Epitop A-Gliadin 57–73 QE65 spezifisch sind, welche durch Antigenausschluss (GFD) rückgängig gemacht wird. Dieses Phänomen ist zuvor nicht bei einer Krankheit des Menschen aufgezeigt worden und spricht für die Möglichkeit, daß bei Zöliakie eine T-Zell-Anergie mit einer Peptidtherapie induzierbar sein kann.
  • Literaturbezugsstellen
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  • Tabelle 1. Proteinsequenz von A-Gliadin (basierend auf Aminosäure-Sequenzierung)
    Figure 00520001
  • Tabelle 3
    Figure 00530001
  • Tabelle 4
    Figure 00530002
  • Tabelle 5. T-Zell-Epitope, welche bei Zöliakie beschrieben wurden
    Figure 00540001
    • NS: in Originalveröffentlichung nicht angegeben, iTCC: intestinaler T-Zell-Klon, iTCL: intestinale polyklonale T-Zellinie, bTCC: T-Zell-Klon aus peripherem Blut
    • * Alle Peptide sind die Produkte aus Transglutaminase-Modifizierung von Wildtyp-Gluten-Peptiden, außer dem vierten und sechsten Peptid.
  • Tabelle 6. Relative Bioaktivität von Gliadin-T-Zell-Epitopen in Zöliakie-PBMC nach Gluten-Herausforderung
    Figure 00540002
    • * Sequenz bezieht sich auf diejenige von Transglutaminase-modifiziertem Peptid und das T-Zell-Epitop. Wildtyp ist das unmodifizierte Gliadinpeptid. Daten aus 4 Patienten. Die Leerprobe war 5 (1) %.
  • Tabelle 7. Polymorphismen von A-Gliadin 57–73 A. Sequenzen, abgeleitet aus "Nordic Autumn"-Weizenstamm Mjoelner
    Figure 00550001
  • B. SWISSPROT und TREMBL-Scan (10.12.99) nach Gliadinen, welche die Sequenz XXXXXXXPQLPYXXXXX enthalten
    Figure 00550002
  • Tabelle 8. Bioaktivität von substituierten Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65 (Subst) im Vergleich zu unmodifiziertem A-Gliadin 57–73 QE65 (G) (Mittelwert 100 %, CI 97–104) und Leerprobe (kein Peptid, b1) (Mittelwert 7,1 %, CI: 5,7–8,5)
    Figure 00560001
  • Tabelle 9. Antagonismus der Interferon-gamma-ELISPOT-Antwort auf A-Gliadin 57–73 QE65 durch substituierte Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65 (Subst) (P ist das Signifikanzniveau im ungepaarten t-Test). Die Agonisten-Aktivität (% Agonist) von Peptiden im Vergleich zu A-Gliadin 57–73 QE65 ist ebenfalls gezeigt.
    Figure 00570001
  • Tabelle 10. Inhibition der Interferon-gamma-ELISPOT-Antwort auf A-Gliadin 57–73 QE65 durch Peptide, welche bekanntermaßen HLA-DQ2 binden (P ist das Signifikanzniveau im ungepaarten t-Test).
    Figure 00570002
  • Tabelle 11. Antagonismus der Interferon-gamma-ELISPOT-Antwort auf A-Gliadin 57–73 QE65 durch natürlich vorkommende Polymorphismen von A-Gliadin 57–73 QE65 (P ist das Signifikanzniveau in einem ungepaartem t-Test).
    Figure 00580001
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Figure 00770001
  • Figure 00780001

Claims (55)

  1. Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz PQPELPY (SEQ ID NO: 1).
  2. Protein, umfassend (a) die Aminosäuresequenz PQPELPY (SEQ ID NO: 1) und (b) andere Gliadin oder nicht-Gliadinsequenz.
  3. Peptid nach Anspruch 1, oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 2, das nicht länger als 50 Aminosäuren ist.
  4. Peptid nach Anspruch 3, das 10–40 Aminosäuren lang ist.
  5. Peptid oder Fusionsprotein nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend die Aminosäuresequenz QLQPFPQPELPYPQPQS (SEQ ID NO: 2).
  6. Fusionsprotein nach Anspruch 2, wobei die Gliadinsequenz von Weizen, Roggen, Gerste, Hafer oder Tritikale ist.
  7. Fusionsprotein nach Anspruch 2, wobei (b) eine nicht-Gliadinsequenz ist.
  8. Zusammensetzung, umfassend zwei oder mehr der Peptide oder Fusionsproteine nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, umfassend (a) mindestens ein Peptid nach Anspruch 1, und (b) ein Gliadin-Epitop von mindestens einem von Weizen, Roggen, Gerste, Hafer und Tritikale.
  11. Peptid oder Fusionsprotein wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert oder eine pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 9 oder 10 definiert, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen der Bauchhöhle.
  12. Peptid, Fusionsprotein oder pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 11 definiert, wobei die Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen der Bauchhöhle durch Tolerierung erfolgt.
  13. Verfahren zur Diagnose von Bauchhöhlenerkrankungen oder der Empfindlichkeit gegenüber Bauchhöhlenerkrankungen in einem Individuum, umfassend: (a) in Kontakt bringen einer Probe von dem Wirt mit einem Peptid oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und (b) Bestimmen in vitro, ob T-Zellen in der Probe das Peptid oder Fusionsprotein erkennen; wobei die Erkennung durch die T-Zellen anzeigt, daß das Individuum eine Bauchhöhlenerkrankung aufweist oder dieser gegenüber empfindlich ist.
  14. Verwendung eines Peptids oder Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Verwendung in einem Verfahren der Diagnose von Bauchhöhlenerkrankungen oder Empfindlichkeit gegenüber Bauchhöhlenerkrankungen in einem Individuum, wobei das Verfahren ein Bestimmen umfallt, ob T-Zellen des Individuums das Peptid erkennen, wobei die Erkennung durch die T-Zellen anzeigt, daß das Individuum eine Bauchhöhlenerkrankung aufweist oder ihr gegenüber empfindlich ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Verfahren eine Verabreichung des Peptids oder Fusionsproteins auf die Haut eines Individuums und Nachweisen der Anwesenheit von Entzündung an der Stelle der Verabreichung umfaßt, wobei der Nachweis von Entzündung anzeigt, daß die T-Zellen des Individuums das Peptid oder Fusionsprotein erkennen.
  16. Verfahren nach Anspruch 13 oder eine Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Probe eine Blutprobe ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 13 oder 16 oder die Verwendung nach Anspruch 14, wobei die T-Zellen vor der Bestimmung nicht in vitro auf Antigen spezifische Beweise re-stimuliert werden
  18. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 13–17, wobei die Erkennung des Peptids oder Fusionsproteins durch die T-Zellen durch die Sekretion eines Zytokins aus den T-Zellen nachgewiesen wird.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Zytokin IFN-γ ist.
  20. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei das Zytokin durch Ermöglichen des Zytokins, an einen immobilisierten Antikörper zu binden, der für das Zytokin spezifisch ist, und dann Nachweisen der Anwesenheit des Antikörper-/Zytokinkomplexes nachgewiesen wird.
  21. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 13–17, wobei die Bestimmung durch Messen durchgeführt wird, ob das Peptid oder Fusionsprotein den T-Zell Rezeptor bindet.
  22. Verfahren zur Diagnose von Bauchhöhlenerkrankung oder einer Empfindlichkeit gegenüber dieser Bauchhöhlenerkrankung in einem Individuum, umfassend Bestimmen der Anwesenheit des Antikörpers, der an die Aminosäuresequenz PQPELPY (SEQ ID NO: 1) in der Probe eines Individuums bindet, wobei die Anwesenheit des Antikörpers anzeigt, daß das Individuum eine Bauchhöhlenerkrankung aufweist oder dieser gegenüber empfindlich ist.
  23. Verfahren zur Bestimmung, ob eine Zusammensetzung in der Lage ist, eine Bauchhöhlenerkrankung zu verursachen, umfassend Bestimmen, ob eine Sequenz in der Zusammensetzung vorhanden ist, die in der Lage ist, durch eine Transglutaminase in ein Peptid wie in Anspruch 1 definiert modifiziert zu werden, wobei die Anwesenheit der Sequenz anzeigt, daß die Zusammensetzung in der Lage ist, eine Bauchhöhlenerkrankung zu verursachen.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Bestimmen durch in Kontakt bringen der Zusammensetzung mit einem Antikörper durchgeführt wird, der für Sequenz spezifisch ist, die in der Lage ist, zu der Peptidsequenz modifiziert zu werden, wobei eine Bindung des Anti körpers an ein Protein in der Zusammensetzung anzeigt, daß die Zusammensetzung in der Lage ist, eine Bauchhöhlenerkrankung zu verursachen.
  25. Kit zur Durchführung eines Verfahrens oder der Verwendung nach einem der Ansprüche 13–21, umfassend ein Peptid oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–25 und ein Mittel zum Nachweis der Erkennung des Peptids oder Fusionsproteins durch die T-Zelle.
  26. Kit nach Anspruch 25, wobei das Mittel zum Nachweisen der Erkennung einen Antikörper gegen IFN-γ umfaßt.
  27. Kit nach Anspruch 26, wobei der Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert ist und gegebenenfalls das Kit auch ein Mittel umfaßt, um den Aatikörper-/IFN-γ-Komplex nachzuweisen.
  28. Verwendung eines Peptids oder Fusionsproteins wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, um einen gegen das Peptid spezifischen Antikörper herzustellen.
  29. Polynukleotid, das eine kodierende Sequenz umfaßt, die ein Peptid oder Fusionsprotein wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert kodiert.
  30. Polynukleotid nach Anspruch 29. wobei die Sequenz 5' und/oder 3' zu der kodierenden Sequenz Sequenzen umfaßt, die bei der Expression der Sequenz helfen, die für das Peptid oder Fusionsprotein kodieren.
  31. Polynukleotid nach Anspruch 30, wobei das Polynukleotid in der Lage ist, das Peptid oder Fusionsprotein in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle zu exprimieren.
  32. Polynukleotid nach Anspruch 31, wobei die eukaryontische Zelle eine Säugerzelle ist.
  33. Expressionsvektor, umfassend ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei das Polyonukleotid operativ mit einer Kontrollsequenz verbunden ist, die in der Lage ist, die Expression des Polynukleotids zur Verfügung zu stellen.
  34. Zelle, umfassend ein Polynukleotid oder Expressionsvektor, wie in einem der Ansprüche 29 bis 33 defniert oder die mit solch einem Polynukleotid oder Expressionsvektor transformiert wurde.
  35. Zelle nach Anspruch 34, die eine prokaryontische Zelle oder eine Säugerzelle ist.
  36. Prtein, umfassend: (a) ein Mutanten-Gliadinprotein mit mindestens einer Mutation in dem Epitop 62PQPQLPY68, wobei die Mutation die Fähigkeit des Epitops verringert, eine T-Zell Antwort zu induzieren; oder (b) ein Fragment des Mutantenproteins von (a), wobei das Fragment mindestens 15 Aminosäuren lang ist und die mutierte PQPQLPY Sequenz umfaßt.
  37. Protein nach Anspruch 36, wobei die Mutation an Position 65 in A-Gliadin vorliegt oder in einer äquivalenten Position in anderen Gliadinen.
  38. Protein nach Anspruch 37, wobei der Glutaminrest an Position 65 durch einen Histidin-, Tyrosin-, Tryptophan-, Lysin-, Prolin- oder Argininrest substituiert ist.
  39. Polynukleotid, das eine kodierende Sequenz umaßt, die für ein Protein wie in einem der Ansprüche 36 bis 38 definiert kodiert.
  40. Polynukleotid nach Anspruch 39, das zusätzlich eine oder mehrere regulatorische Sequenzen umfaßt, die operativ mit der kodierenden Sequenz verbunden sind, wobei die regulatorischen Sequenzen in der Lage sind, die Expression der kodierenden Sequenz in einer Zelle sicher zu stellen.
  41. Polynukleotid nach Anspruch 39 oder 40, das ein Vektor ist oder das in Form eines Vektors vorliegt.
  42. Zelle, umfassend ein Polynukleotid wie definiert in einem der Ansprüche 39 bis 41 oder die mit solch einem Polynukleotid transformiert wurde.
  43. Zelle nach Anspruch 42, die eine Zelle einer Graminaceen-monokotyledonen Spezies ist.
  44. Zelle nach Anspruch 43, die eine Zelle von Weizen, Mais, Hafer, Roggen, Reis, Gerste, Tritikale, Sorghum oder Zuckerrohr ist.
  45. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch eine kodierende Sequenz wie in Anspruch 39 definiert kodiert wird, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Kultivieren einer Zelle nach einem der Ansprüche 42 bis 44 unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben; und gegebenenfalls (b) Aufreinigen des exprimierten Proteins.
  46. Verfahren zum Erhalt einer transgenen Pflanzenzelle, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Vektor nach Anspruch 41, um eine transgene Pflanzenzelle zu ergeben.
  47. Transgene Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 46,
  48. Transgene Pflanze oder Pflanzensamen, umfassend Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 42 bis 44.
  49. Transgener Pflanzenzellkallus, umfassend Pflanzenzellen nach Anspruch 43 oder 44, erhältlich von einer transgenen Pflanzenzelle, wie in Anspruch 43, 44 und 47 definiert.
  50. Pflanze oder Kallus nach Anspruch 48 oder 49, die eine Spezies wie in Anspruch 43 oder 44 definiert ist.
  51. Verfahren zum Inhalt eines Getreideprodukts, umfassend Ernten eines Getreideprodukts von einer Pflanze nach Anspruch 48 oder 50, und gegebenenfalls weitere Verarbeitung des geernteten Produkts.
  52. Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Pflanze eine Weizenpflanze ist und das geerntete Getreideprodukt Körner sind, gegebenenfalls weiterverarbeitet in Mehl oder ein anderes Körnerprodukt.
  53. Getreideprodukt, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 51 oder 52.
  54. Nahrungsmittel, das ein Protein wie in einem der Ansprüche 36 bis 38 definiert umfaßt.
  55. Nahrungsmittel nach Anspruch 54, wobei ein Protein wie in einem der Ansprüche 36 bis 38 an Stelle eines Wildtyp Gliadins verwendet wird.
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