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Die
Erfindung betrifft die Diagnose und Therapie von Bauchhöhlenerkrankungen
bzw. Zöliakie
und ein Gliadinprotein, welches nicht Zöliakie verursacht.
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Eine
Immunreaktion gegen Gliadin (eine Komponente von Gluten) in der
Nahrung verursacht Zöliakie. Es
ist bekannt, daß Immunantworten
im Darmgewebe präferentiell
auf Gliadin ansprechen, welches von einer Darm-Transglutaminase
modifiziert worden ist. Zöliakie
wird durch Detektion von Anti-Endomysium-Antikörpern diagnostiziert, aber
dies erfordert eine Bestätigung
durch das Aufspüren
einer lymphozytischen Entzündung
in Darmbiopsien. Die Entnahme einer derartigen Biopsie ist für den Patienten
unangenehm.
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Früher haben
Forscher angenommen, daß nur
intestinale T-Zell-Antworten eine akkurate Anzeige der Immunantwort
gegen Gliadine bereitstellen. Deshalb haben sie sich auf die Untersuchung
von T-Zell-Antworten in Darmgewebe konzentriert
1.
Zum Beispiel offenbart das
EP
0 905 518 T-Zell-Epitope aus Glutenin und Gliadin. Diese
werden spezifisch von intestinal abgeleiteten Gluten-spezifischen
oder -empfindlichen T-Zellen erkannt. Die Peptide besitzen die Sequenzen
SGQGSFQPSQQ (Gliadin 206–216;
SEQ ID NR.: 4) und GQQGYYPTSPQQSGQ (Glutenin; SEQ ID NR.: 5). Gliadin-Epitope,
welche eine Transglutaminase-Modifikation erfordern, (bevor sie
von dem Immunsystem erkannt werden) sind bekannt
2.
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Die
Erfinder haben das immundominante T-Zell-Epitop gefunden, welches
vom Immunsystem bei Zöliakie
erkannt wird, und haben gezeigt, daß dieses durch T-Zellen im
peripheren Blut von Individuen mit Zöliakie erkannt wird. Solche
T-Zellen waren festgestelltermaßen
bei Häufigkeiten
vorhanden, welche hoch genug waren, um ohne erneute Stimulation
nachweisbar zu sein (d. h. ein "frisches
Antwort"-Detektionssystem
konnte angewandt werden). Das Epitop wurde unter Verwendung einer
Nicht-T-Zell-Klonierung-basierenden Methode identifiziert, welche
eine genauere Reflexion der Epitope, welche erkannt werden, vorsah.
Das immundominante Epitop erfordert eine Transglutaminase-Modifikation
(welche die Substitution eines besonderen Glutamins zu Glutamat
verursacht) vor der Immunsystem-Erkennung.
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Basierend
auf dieser Arbeit haben die Erfinder einen Test entwickelt, welcher
verwendet werden kann, um Zöliakie
in einem frühen
Stadium zu diagnostizieren. Der Test kann an einer Probe aus peripherem
Blut durchgeführt
werden, und deshalb wird eine Darm-Biopsie nicht erfordert. Der
Test ist empfindlicher als die Antikörpertests, welche derzeitig
verwendet werden.
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Die
Erfindung sieht somit ein Verfahren zum Diagnostizieren von Zöliakie,
oder Anfälligkeit
für Zöliakie, in
einem Individuum vor, welches folgendes umfaßt:
- (a)
in Kontakt bringen einer Probe von dem Wirt mit einem Mittel, gewählt aus
(i) der Epitopumfassenden Sequenz, bei welcher es sich handelt um
SEQ ID NR.: 1 oder 2 oder eine äquivalente
Sequenz aus einem natürlich
vorkommenden Homolog des Gliadins, das durch SEQ ID NR.: 3 repräsentiert
wird, (ii) einer Epitop-umfassenden Sequenz, umfassend: SEQ ID NR.:
1 oder eine äquivalente
Sequenz aus einem natürlich vorkommenden
Homolog des Gliadins, welches durch SEQ ID NR.: 3 repräsentiert
wird, wobei das Epitop ein aus einem Gliadinprotein abgeleitetes
isoliertes Oligopeptid ist, (iii) einem Analog von (i) oder (ii),
welches in der Lage ist, von einem T-Zell-Rezeptor erkannt zu werden,
der (i) oder (ii) erkennt, welches im Falle eines Peptidanalogs
eine Länge
von nicht mehr als 50 Aminosäuren
aufweist, oder (iv) einem Produkt, umfassend zwei oder mehr Mittel,
wie definiert in (i), (ii) oder (iii), und
- (b) Bestimmen in vitro, ob T-Zellen in der Probe das Mittel
erkennen, wobei die Erkennung durch die T-Zellen anzeigt, daß das Individuum
Zöliakie
aufweist oder dieser gegenüber
empfindlich ist.
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Die
Erfindung sieht des Weiteren die Verwendung des Mittels zur Herstellung
eines diagnostischen Mittels zur Verwendung in einem Verfahren der
Diagnose von Zöliakie
oder Empfindlichkeit gegenüber
Zöliakie in
einem Individuum vor, wobei das Verfahren das Bestimmen umfaßt, ob T-Zellen
des Individuums das Mittel erkennen, wobei die Erkennung durch die
T-Zellen anzeigt,
daß das
Individuum Zöliakie
aufweist oder ihr gegenüber
empfindlich ist.
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Das
Ermitteln eines immundominanten Epitops, welches von Transglutaminase
modifiziert wird, ermöglicht
auch die Diagnose von Zöliakie
auf Basis der Bestimmung, ob andere Typen an Immunantwort gegen dieses
Epitop vorhanden sind. Somit sieht die Erfindung auch ein Verfahren
der Diagnose von Zöliakie
oder Anfälligkeit
gegenüber
Zöliakie
in einem Individuum vor, welches das Bestimmen der Gegenwart eines
Antikörpers,
welcher an das Epitop bindet, in einer Probe aus dem Individuum
umfaßt,
wobei die Gegenwart des Antikörpers
anzeigt, daß das
Individuum Zöliakie
aufweist oder dafür
anfällig
ist.
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Die
Erfindung sieht zusätzlich
das Mittel bzw. Agens, gegebenenfalls in Assoziation mit einem Träger, zur
Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von
Zöliakie
durch Tolerisierung von T-Zellen, welche das Mittel erkennen, vor.
Ebenfalls vorgesehen wird ein Antagonist einer T-Zelle, welche einen
T-Zell-Rezeptor aufweist, der (i) oder (ii) erkennt, gegebenenfalls
in Assoziation mit einem Träger,
zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung
von Zöliakie
durch Antagonisieren derartiger T-Zellen. Weiterhin vorgesehen wird das
Mittel oder ein Analog, welches einen Antikörper (der das Mittel bindet)
bindet, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung
von Zöliakie
in einem Individuum durch Tolerisierung des Individuums, um die
Herstellung eines derartigen Antikörpers zu verhindern.
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Die
Erfindung sieht ein Verfahren zum Bestimmen vor, ob eine Zusammensetzung
in der Lage ist, Zöliakie
zu verursachen, umfassend das Bestimmen, ob ein Protein, welches
fähig ist,
durch eine Transglutaminase zu einer Oligopeptid-Sequenz, wie obenstehend
definiert, modifiziert zu werden, in der Zusammensetzung vorhanden
ist, wobei das Vorhandensein des Proteins anzeigt, daß die Zusammensetzung
in der Lage ist, Zöliakie
zu verursachen.
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Die
Erfindung stellt des Weiteren ein Mutanten-Gliadinprotein bereit,
dessen Wildtypsequenz durch eine Transglutaminase zu einer Sequenz
modifiziert werden kann, welche eine wie obenstehend definierte
Epitop-umfassende Sequenz umfaßt,
wobei jedoch dieses Mutanten-Gliadinprotein
auf eine solche Weise modifiziert worden ist, daß es keine Sequenz enthält, welche
durch eine Transglutaminase zu einer Sequenz modifiziert werden
kann, die eine solche Epitop-umfassende Sequenz umfaßt; oder
ein Fragment eines derartigen Mutanten-Gliadinproteins, welches mindestens
15 Aminosäuren
lang ist und welches Sequenz umfaßt, die auf besagte Weise modifiziert
worden ist.
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Die
Erfindung sieht auch ein Protein vor, welches eine Sequenz umfaßt, die
in der Lage ist, an einen T-Zell-Rezeptor zu binden, wobei der T-Zell-Rezeptor
das Mittel erkennt, und wobei die Sequenz in der Lage ist, einen
Antagonismus einer T-Zelle, welche einen solchen T-Zell-Rezeptor trägt, zu verursachen.
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Weiterhin
sieht die Erfindung ein Nahrungsmittel vor, welches die obenstehend
definierten Proteine umfaßt.
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Die
Erfindung wird durch die begleitenden Zeichnungen veranschaulicht,
worin:
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die 1 die von frisch isolierten PBMC (mononukleare
Zellen aus peripherem Blut) hervorgebrachten IFNγ-ELISPOT-Antworten (vertikale
Achse zeigt "Spot-Forming-Cells" pro 106 PBMC)
auf Transglutaminase(tTG)-behandelten und unbehandelten Peptidpool
3 (jedes Peptid 10 μg/ml),
einschließlich
fünf überlappenden
15meren, welche A-Gliadin 51–85
(siehe Tabelle 1) überspannen,
und einem Chymotrypsin-verdauten Gliadin (40 μg/ml), im Zöliakie-Subjekt 1, anfangs bei Remission im
Anschluß an
eine glutenfreie Diät,
dann bei Herausforderung mit 200 g Brot täglich während drei Tagen vom Tag 1
an, zeigt (a). PBMC-IFNγ-ELISPOT-Antworten
von Subjekt 2 auf tTG-behandelte A-Gliadin-Peptidpools 1–10, überspannend
das vollständige
A-Gliadin-Protein, während
einer zehn Tage langen Brot-Herausforderung
(b). Die horizontale Achse zeigt die Tage nach dem Beginn mit Brot
an.
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Die 2 zeigt PBMC-IFNγ-ELISPOT-Antworten auf den tTG-behandelten
Peptidpool 3 (überspannend
A-Gliadin 51–85)
in 7 individuellen Zöliakie-Subjekten
(die vertikale Achse zeigt "Spot-Forming-Cells" pro 106 PBMC), anfangend
in der Remission nach Gluten-freier Diät, bei Herausforderung mit
Brot während
drei Tagen (Tage 1 bis 3). Die horizontale Achse zeigt die Tage
nach dem Beginn mit Brot an. (a). PBMC-IFNg-Elispot-Antworten auf
tTg-behandelte überlappende
15mer-Peptide, welche im Pool 3 eingeschlossen waren; die Balken
repräsentieren
die durchschnittliche Antwort (± Standardabweichung bzw.
SEM) auf individuelle Peptide (10 μg/ml) in 6 Zöliakie-Subjekten am Tag 6 oder
7 (b). (In individuellen Subjekten wurden die ELISPOT-Antworten
auf Peptide als ein Prozentsatz der Antwort, welche von Peptid 12
hervorgerufen wurde, berechnet – wie
durch die vertikale Achse gezeigt wird).
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Die 3 zeigt
PBMC-IFNγ-ELISPOT-Antworten
auf tTG-behandelte Trunkierungen von A-Gliadin 56–75 (0,1 μM). Die Balken
repräsentieren
den Mittelwert (± SEM)
in 5 Zöliakie-Subjekten (in den
individuellen Subjekten wurden die Antworten als der Prozentsatz
der maximalen Antwort berechnet, welche von einem beliebigen der
getesteten Peptide hervorgerufen wurde).
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Die 4 zeigt, wie die Minimalstruktur des dominanten
A-Gliadin-Epitops unter Verwendung von tTG-behandelten 7–17meren
A-Gliadin-Peptiden (0,1 μM),
welche die Sequenz PQPQLPY
einschlossen (A-Gliadin 62–68)
(a), sowie der gleichen Peptide ohne tTG-Behandlung, aber mit der Substitution
Q→E65 (b), kartiert
wurde. Jede Linie repräsentiert
PBMC-IFNg-ELISPOT-Antworten in jedem von drei Zöliakie-Subjekten an Tag 6 oder
7, nachdem Brot an den Tagen 1–3
aufgenommen wurde. (In individuellen Subjekten wurden ELISPOT-Antworten
als ein Prozentsatz der Antwort berechnet, welche von dem 17mer
A-Gliadin 57–73 hervorgerufen
wurde).
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Die 5 zeigt
die Aminosäuren,
welche durch tTG desamidiert wurden. A-Gliadin 56–75 (LQLQPFPQPQLPYPQPQSFP)
(0,1 μM)
wurde 2 Stunden lang bei 37°C
mit tTG (50 μg/ml)
inkubiert. Ein einzelnes Produkt wurde identifiziert und durch Umkehrphasen-HPLC
gereinigt. Eine Aminosäureanalyse
ermöglichte
die Berechnung der % Desamidierung (Q→E) jedes Gln-Restes in A-Gliadin
56–75,
welche auf tTG zurückführbar war,
(vertikale Achse).
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Die 6 zeigt
den Effekt der Substitution Q→E
in A-Gliadin 57–73
an anderen Positionen zusätzlich zu
Q65 unter Verwendung der 17mere: QLQPFPQPELPYPQPES
(E57, 65), QLQPFPQPELPYPQPES (E65, 72), ELQPFPQPELPYPQPES (E57, 65, 72) und QLQPFPQPELPYPQPQS (E65) in drei Zöliakie-Subjekten am
Tag 6 oder 7, nachdem Brot an den Tagen 1–3 aufgenommen wurde. Die vertikale
Achse zeigt den Prozentsatz der E65-Antwort.
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Die 7 zeigt, daß tTG-behandeltes A-Gliadin
56–75
(0,1 μM)
IFN-g-ELISPOT-Antworten in (a) mittels magnetischen Kügelchen
CD4- und CD8-depletierten PBMC hervorrief (die Säulen repräsentieren CD4-depletierte PBMC-Antworten
als Prozentsatz von CD8-depletierten
PBMC-Antworten; Spot-Forming-Cells pro Million CD8-depletierten
PBMC beliefen sich auf: Subjekt 4: 29, und Subjekt 6: 535). (b) PBMC-IFNγ-ELISPOT-Antworten
(Fleck-bildende Zellen/Million PBMC) nach Inkubation mit monoklonalen
Antikörpern
gegen HLA-DR (L243), -DQ (L2) und -DP (B7.21) (10 μg/ml) 1 Stunde
vor tTG-behandeltem 56–75 (0,1 μM) in zwei
Zöliakie-Subjekten,
welche bezüglich
HLA-DQ a1·0501,
b1·0201
homozygot waren.
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Die 8 zeigt
den Effekt des Substituierens von Glu an der Position 65 für andere
Aminosäuren
in dem immundominanten Epitop. Die vertikale Achse zeigt die % Antwort
in den 3 Subjekten in Bezug auf das immundominante Epitop.
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Die 9 zeigt
die Immunreaktivität
von natürlich
vorkommenden Gliadinpeptiden (wobei Antworten von 3 Subjekten gemessen
werden), welche die Sequenz PQLPY enthalten, mit (schattiert) und
ohne (hell) Transglutaminase-Behandlung.
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Die 10 zeigt
die CD8-, CD4-, β7- und αE-spezifische Depletion mittels immunmagnetischen
Kügelchen
von mononukleären
Zellen des peripheren Blutes aus zwei Zöliakie-Subjekten 6 Tage nach Beginnen der Gluten-Herausforderung,
gefolgt von Interferon- Gamma-ELISpot.
A-Gliadin 57–73
QE65 (25 mcg/ml), tTG-behandeltes Chymotrypsinverdautes Gliadin
(100 mcg/ml) oder PPD (10 mcg/ml) wurden als Antigene verwendet.
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Die 11 zeigt
die optimale T-Zell-Epitop-Länge.
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Die 12 zeigt einen Vergleich von A-Gliadin
57–73
QE65 mit anderen Peptiden in einer Dosis-Antwort-Untersuchung.
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Die 13 zeigt einen Vergleich von für Gliadin
und A-Gliadin 57–73
QE65 spezifischen Antworten.
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Die 14 zeigt die Bioaktivität von Gliadin-Polymorphismen
in Zöliakie-Subjekten.
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Die 15 und 16 zeigen
das Eingrenzen der Kern-Epitop-Sequenz.
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Die 17 bis 27 zeigen
die Agonistenaktivität
von A-Gliadin 57–73
QE65-Varianten.
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Die 28 zeigt Antworten in verschiedenen Patientengruppen.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Der
Begriff "Zöliakie" beinhaltet ein Spektrum
von Leiden, welche von variierenden Graden der Gluten-Empfindlichkeit
verursacht werden, einschließlich
einer schweren Form, welche durch eine flache Dünndarm-Mukosa (hyperplastische
villöse
Atrophie) gekennzeichnet ist, und anderen Formen, welche durch mäßigere Symptome
gekennzeichnet sind.
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Das
obenstehend (im Zusammenhang mit Diagnose oder Therapie) erwähnte Individuum
ist menschlich. Sie können
Zöliakie
(symptomatisch oder asymptomatisch) aufweisen oder im Verdacht stehen,
selbige aufzuweisen. Sie können
eine Gluten-freie Diät
befolgen. Sie können
eine Antwort in der akuten Phase aufweisen (zum Beispiel können sie
Zöliakie
aufweisen, aber nur Gluten in den letzten 24 Stunden aufgenommen haben,
wobei sie zuvor 14 bis 28 Tage lang auf einer Gluten-freien Diät gehalten
wurden).
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Das
Individuum kann gegenüber
Zöliakie
empfindlich sein, wie z. B. eine genetische Anfälligkeit aufweisen (ermittelt
beispielsweise dadurch, daß das
Individuum Verwandte mit Zöliakie
hat, oder Gene besitzt, welche eine Prädisposition für Zöliakie verursachen).
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Das Mittel
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Das
Mittel ist typischerweise ein Peptid, beispielsweise mit einer Länge von
7 bis 50 Aminosäuren,
wie 10 bis 40 oder 15 bis 30 Aminosäuren Länge.
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SEQ
ID NR.: 1 ist PQPELPY. SEQ ID NR.: 2 ist QLQPFPQPELPYPQPQS. SEQ
ID NR.: 3 wird in der Tabelle 1 gezeigt und ist die Sequenz eines
vollständigen
A-Gliadins. Das Glutamat an der Position 4 von SEQ ID NR.: 1 (äquivalent
zur Position 9 von SEQ ID NR.: 2) wird durch Transglutaminase-Behandlung
von A-Gliadin erzeugt.
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Das
Mittel kann das Peptid sein, welches von SEQ ID NR.: 1 oder 2 repräsentiert
wird, oder eine Epitop-umfassende Sequenz, die SEQ ID NR.: 1 umfaßt, welches
ein isoliertes Oligopeptid ist, das aus einem Gliadinprotein abgeleitet
ist; oder ein Äquivalent
dieser Sequenzen aus einem natürlich
vorkommenden Gliadinprotein, welches ein Homolog von SEQ ID NR.:
3 ist. Somit kann das Epitop ein Derivat des Proteins sein, welches
von SEQ ID NR.: 3 repräsentiert
wird. Ein solches Derivat ist typischerweise ein Fragment des Gliadins oder
ein mutiertes Derivat des Gesamtproteins oder Fragmentes. Deshalb
schließt
das Epitop der Erfindung nicht dieses natürlich vorkommende gesamte Gliadinprotein
ein und schließt
nicht andere natürlich
vorkommende gesamte Gliadine ein.
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Das
Epitop kann somit ein Fragment von A-Gliadin (z. B. SEQ ID NR.:
3) sein, welches die Sequenz von SEQ ID NR.: 1 umfaßt, erhältlich durch
(vollständiges
oder teilweises) Behandeln mit Transglutaminase, d. h. wobei 1,
2, 3 oder mehr Glutamine zu Glutamaten substituiert wurden (einschließlich der
Substitution innerhalb von SEQ ID NR.: 1).
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Solche
Fragmente können
die Sequenzen sein, oder selbige einschließen, welche durch die Positionen
55 bis 70, 58 bis 73, 61 bis 77 von SEQ ID NR.: 3, welche in Tabelle
1 gezeigt wird, repräsentiert
werden. Typischerweise werden derartige Fragmente von T-Zellen wenigstens
zu demselben Ausmaß erkannt,
zu welchem die von SEQ ID NR.: 1 oder 2 repräsentierten Peptide in irgendeinem
der hierin beschriebenen Assays erkannt werden, wobei Proben aus
Zöliakie-Patienten
verwendet werden.
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In
dem Fall, worin das Epitop eine Sequenz umfaßt, äquivalent zu den obenstehenden
Epitopen (einschließlich
Fragmenten) aus einem anderen Gliadinprotein (z. B. irgendeines
der hierin erwähnten
Gliadinproteine oder jedwede Gliadine, welche Zöliakie verursachen), werden
derartige äquivalenten
Sequenzen einem Fragment eines Gliadinproteins entsprechen, welches
typischerweise (partiell oder vollständig) mit Transglutaminase
behandelt worden ist. Solche äquivalenten
Peptide können
durch Alignieren der Sequenzen von anderen Gliadinproteinen mit
der SEQ ID NR.: 3 (beispielsweise unter Verwendung irgendeines der
hierin erwähnten
Programme) bestimmt werden. Transglutaminase ist kommerziell erhältlich (z.
B. Sigma T-5398).
Die Tabelle 4 gibt Beispiele von geeigneten äquivalenten Sequenzen.
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Das
Mittel, welches ein Analog ist, kann von einem TCR erkannt werden,
welcher (i) oder (ii) erkennt. Wenn das Analog zu T-Zellen in Gegenwart
von (i) oder (ii) zugesetzt wird, typischerweise ebenfalls in Gegenwart
einer Antigen-präsentierenden
Zelle (APC) (wie einer beliebigen der hierin erwähnten APCs), inhibiert deshalb
im allgemeinen das Analog die Erkennung von (i) oder (ii), d. h.
das Analog ist in der Lage, mit (i) oder (ii) in einem solchen System
zu kompetieren.
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Das
Analog kann ein solches sein, welches in der Lage ist, den TCR zu
binden, welcher (i) oder (ii) erkennt. Eine solche Bindung kann
durch Standardtechniken getestet werden. Solche TCRs können aus
T-Zellen isoliert werden, von welchen gezeigt wurde, (i) oder (ii)
zu erkennen (z. B. unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung).
Eine Demonstration der Bindung des Analogs an die TCRs kann dann
gezeigt werden durch Bestimmen, ob die TCRs die Bindung des Analogs
an eine Substanz, welche das Analog bindet, z. B. einen Antikörper gegen
das Analog, inhibieren. Typischerweise wird das Analog in einem
derartigen Bindungs-Inhibitions-Assay
an ein Klasse II-MHC-Molekül
(z. B. HLA-DQ2) gebunden.
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Typischerweise
inhibiert das Analog die Bindung von (i) oder (ii) an einen TCR.
In diesem Fall wird die Menge an (i) oder (ii), welche den TCR in
Gegenwart des Analogs binden kann, verringert. Dies beruht darauf, daß das Analog
in der Lage ist, den TCR zu binden, und deshalb mit (i) oder (ii)
um die Bindung an den TCR kompetiert.
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T-Zellen
zur Verwendung in den obenstehenden Bindungsexperimenten können aus
Patienten mit Zöliakie
isoliert werden, beispielsweise mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung.
Andere Bindungs-Charakteristika des Analogs können ebenfalls dieselben wie
von (i) oder (ii) sein, und somit bindet das Analog typischerweise an
dasselbe MHC-Klasse II-Molekül,
an welches das Peptid bindet (HLA-DQ). Das Analog bindet typischerweise
an für
(i) oder (ii) spezifische Antikörper
und inhibiert somit die Bindung von (i) oder (ii) an derartige Antikörper.
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Das
Analog ist typischerweise ein Peptid. Es kann Homologie mit (i)
oder (ii), typischerweise mindestens 70 % Homologie, vorzugsweise
mindestens 80, 90 %, 95 %, 97 % oder 99 % Homologie mit (i) oder
(ii) aufweisen, zum Beispiel über
eine Region von mindestens 15 weiteren benachbarten Aminosäuren hinweg (wie
die gesamte Länge
von dem Analog und/oder von (i) oder (ii) oder über die Region hinweg, welche
den TCR kontaktiert oder das von (i) oder (ii) oder über die
Region hinweg, welche den TCR kontaktiert oder das MHC-Molekül bindet).
Verfahren zum Messen von Proteinhomologie sind im Fachgebiet gut
bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, daß im vorliegenden
Zusammenhang Homologie auf der Grundlage von Aminosäureidentität berechnet
wird (was manchmal als "harte
Homologie" bezeichnet
wird).
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Zum
Beispiel stellt das UWGCG-Paket das BESTFIT-Programm bereit, welches
zum Berechnen von Homologie verwendet werden kann (zum Beispiel
bei Verwendung mit seinen Standardeinstellungen) (Devereux et al.
(1984) Nucleic Acids Research 12, S. 387–395). Die Algorithmen PILEUP
und BLAST können
verwendet werden, um Homologie zu berechnen oder Sequenzen aufzulisten
(typischerweise bei ihren Standardeinstellungen), zum Beispiel wie
beschrieben in Altschul, S. F. (1993) J. Mol. Evol. 36: 290–300; Altschul,
S. F., et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10.
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Software
zum Durchführen
von BLAST-Analysen ist über
das National Center for Biotechnologie Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich
erhältlich.
Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren eines hoch
bewerteten Sequenzpaares (HSPs) durch Identifizieren von kurzen
Wörtern
der Länge
W in der Suchsequenz, welche entweder einem positiv bewerteten Schwellenwert
T entsprechen oder diesen erfüllen,
wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz
aligniert werden. T wird als die Nachbarschafts-Wort-Bewertungsschwelle bezeichnet (Altschul
et al., siehe oben). Diese anfänglichen
Nachbarschafts-Worttreffer fungieren als Ausgangspunkte für das Beginnen
von Suchprozessen, um HSPs zu finden, welche diese enthalten. Die
Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz so
weit verlängert,
wie die kumulative Alignierungs-Bewertung erhöht werden kann. Die Verlängerungen
für die
Worttreffer in jeder Richtung werden angehalten wenn: die kumulative
Alignierungs-Bewertung um die Größe X von ihrem
maximal erzielten Wert abfällt;
die kumulative Bewertung aufgrund der Akkumulierung von einer oder mehreren
negativ bewerteten Rest-Alignierungen gleich Null oder niedriger
wird; oder wenn das Ende von einer der beiden Sequenz erreicht ist.
Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit
und Geschwindigkeit der Alignierung. Das BLAST-Programm verwendet als Standard eine
Wortlänge (W)
von 11, die BLOSUM62-Bewertungsmatrix
(siehe Henikoff und Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
10915–10919),
Alignierungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N =
4 und einen Vergleich beider Stränge.
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Der
BLAST-Algorithmus führt
eine statistische Analyse der Ähnlichkeit
zwischen zwei Sequenzen durch; siehe z. B. Karlin und Altschul (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873– 5787. Ein Maß der Ähnlichkeit,
welches von dem BLAST-Algorithmus vorgesehen wird, ist die kleinste
Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), welche eine Anzeige der Wahrscheinlichkeit
liefert, mit welcher eine Übereinstimmung
zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten
würde.
Zum Beispiel wird eine Sequenz als ähnlich zu einer anderen Sequenz
betrachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit im Vergleich
der ersten Sequenz zu der zweiten Sequenz geringer als etwa 1, vorzugsweise
geringer als etwa 0,1, weiter bevorzugt geringer als etwa 0,01 und
am stärksten
bevorzugt geringer als etwa 0,001 ist.
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Die
homologen Peptidanaloge unterscheiden sich typischerweise von (i)
oder (ii) um 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder mehr Mutation (welche Substitutionen,
Deletionen oder Insertionen sein können). Diese Mutationen können über irgendeine
der obenstehend in Bezug auf die Berechnung der Homologie erwähnten Regionen hinweg
gemessen werden. Die Substitutionen sind vorzugsweise "konservativ". Diese sind gemäß der nachfolgenden
Tabelle definiert. Aminosäuren
im selben Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in derselben Zeile
in der dritten Spalte können
füreinander
substituiert werden.
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Typischerweise
sind die Aminosäuren
in dem Analog an den äquivalenten
Positionen zu Aminosäuren in
(i) oder (ii), welche zur Bindung des MHC-Moleküls beitragen oder für die Erkennung
durch den TCR verantwortlich sind, gleich oder sind konserviert.
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Typischerweise
umfaßt
das Analogpeptid eine oder mehrere Modifikationen, welche natürliche Post-Translations-Modifikationen
oder künstliche
Modifikationen sein können.
Die Modifikation kann eine chemische Einheit (typischerweise durch
Substitution eines Wasserstoffs, z. B. einer C-H-Bindung), wie eine
Amino-, Acetyl-, Hydroxy- oder Halogen-Gruppe (z. B. Fluor) oder
eine Kohlenhydratgruppe bereitstellen. Typischerweise ist die Modifikation
auf dem N- oder C-Terminus vorhanden.
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Das
Analog kann eine oder mehrere nicht-natürliche Aminosäuren, zum
Beispiel Aminosäuren
mit einer von natürlichen
Aminosäuren
verschiedenen Seitenkette, umfassen. Im allgemeinen wird die nicht-natürliche Aminosäure einen
N-Terminus und/oder einen C-Terminus aufweisen. Die nicht-natürliche Aminosäure kann
eine L- oder eine D-Aminosäure
sein.
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Das
Analog besitzt typischerweise eine Gestalt, Größe, Flexibilität oder Elektronen-Konfiguration, welche
im wesentlichen ähnlich
zu (i) oder (ii) ist. Es ist typischerweise ein Derivat von (i)
oder (ii). In einer Ausführungsform
ist das Analog ein Fusionsprotein, welches die Sequenz von SEQ ID
NR.: 1 oder 2, oder irgendeines der hierin erwähnten anderen Peptide; und
eine Nicht-Gliadin-Sequenz umfaßt.
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In
einer Ausführungsform
ist das Analog (i) oder (ii), gebunden an ein MHC-Klasse II-Molekül, oder ahmt
diese nach. 2, 3, 4 oder mehr derartige Komplexe können assoziiert
oder aneinander gebunden sein, zum Beispiel unter Verwendung eines
auf Biotin/Streptavidin basierenden Systems, in welchem typischerweise
2, 3 oder 4 Biotin-markierte MHC-Moleküle an eine Streptavidin-Einheit
binden. Dieses Analog inhibiert typischerweise die Bindung des (i)-
oder (ii)/MHC-Klasse II-Komplexes an einen TCR oder Antikörper, welcher spezifisch
für den
Komplex ist.
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Das
Analog ist typischerweise ein Antikörper oder ein Fragment eines
Antikörpers,
wie ein Fab- oder (Fab)2-Fragment. Das Analog
kann auf einem festen Träger
immobilisiert werden, insbesondere ein Analog, welches ein an ein
MHC-Molekül
gebundenes Peptid nachahmt.
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Das
Analog wird typischerweise durch Computer-Methoden entworfen und
dann unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren synthetisiert.
Alternativ dazu kann das Analog aus einer Bibliothek von Verbindungen
gewählt
werden. Die Bibliothek kann eine kombinatorische Bibliothek oder
eine Display-Bibliothek, wie eine Phagen-Display-Bibliothek, sein.
Die Bibliothek von Verbindungen kann in der Display-Bibliothek in
der Form, an ein MHC-Klasse
II-Molekül,
wie HLA-DQ, gebunden zu sein, exprimiert werden. Analoge werden
im allgemeinen aus der Bibliothek basierend auf ihrer Fähigkeit
selektiert, die Bindungscharakteristika von (i) oder (ii) nachzuahmen.
Somit können
sie basierend auf der Fähigkeit
selektiert werden, einen TCR oder Antikörper zu binden, welcher (i)
oder (ii) erkennt.
-
Typischerweise
werden Analoge von T-Zellen wenigstens zu demselben Ausmaß erkannt,
wie irgendeines der Mittel (i) oder (ii), zum Beispiel wenigstens
zu dem gleichen Ausmaß wie
das äquivalente
Epitop und vorzugsweise zu dem gleichen Ausmaß wie das Peptid, welches von
SEQ ID NR.: 2 repräsentiert
wird, in irgendeinem der hierin beschriebenen Assays erkannt wird,
typischerweise unter Verwendung von T-Zellen aus Zöliakie-Patienten.
Analoge können
zu diesen Ausmaßen
in vivo erkannt werden und können
somit in der Lage sein, Zöliakie-Symptome zu wenigstens
dem gleichen Ausmaß zu
induzieren, wie irgendeines der hierin erwähnten Mittel (z. B. in einem
humanen Patienten oder einem Tiermodell).
-
Analoge
können
in einem Verfahren identifiziert werden, umfassend das Bestimmen,
ob eine Kandidatensubstanz von einem T-Zell-Rezeptor erkannt wird,
welcher ein Epitop der Erfindung erkennt, wobei die Erkennung der
Substanz anzeigt, daß die
Substanz ein Analog ist. Solche TCRs können beliebige der hierin erwähnten TCRs
sein und können
auf T-Zellen vorhanden sein. Jedweder hierin erwähnte geeignete Assay kann angewandt
werden, um das Analog zu identifizieren. In einer Ausführungsform
wird dieses Verfahren in vivo durchgeführt. Wie obenstehend erwähnt, werden
bevorzugte Analoge zu wenigsten dem gleichen Ausmaß wie das
Peptid SEQ ID NR.: 2 erkannt, und so kann das Verfahren angewandt
werden, um Analoge zu identifizieren, welche zu diesem Ausmaß erkannt
werden.
-
In
einer Ausführungsform
umfaßt
das Verfahren das Bestimmen, ob eine Kandidatensubstanz in der Lage
ist, die Erkennung eines Epitops der Erfindung zu inhibieren, wobei
eine Inhibition der Erkennung anzeigt, daß die Substanz ein Analog ist.
-
Das
Mittel kann ein Produkt sein, welches mindestens 2, 5, 10 oder 20
Mittel, wie definiert durch (i), (ii) oder (iii) umfaßt. Typischerweise
umfaßt
die Zusammensetzung Epitope der Erfindung (oder äquivalente Analoge) aus verschiedenen
Gliadinen, wie irgendwelchen der Spezies oder Vielfalt oder Typen
an Gliadin, die hierin erwähnt
werden. Bevorzugte Zusammensetzungen umfassen mindestens ein Epitop
der Erfindung, oder ein äquivalentes
Analog, aus allen der Gliadine, welche in irgendeiner der hierin
erwähnten
Spezies oder Varietät
vorhanden sind, oder von 2, 3, 4 oder mehr der hierin erwähnten Spezies
(wie aus der Palette von Spezies, welche aus Weizen, Roggen, Gerste,
Hafer und Tritikale besteht).
-
Diagnose
-
Wie
obenstehend erwähnt,
kann das Diagnoseverfahren der Erfindung auf der Detektion von T-Zellen beruhen,
welche das Mittel binden, oder auf der Detektion von Antikörpern, welche
das Mittel erkennen.
-
Die
T-Zellen, welche das Mittel in dem Verfahren erkennen (welches die
obenstehend erwähnte
Verwendung einschließt),
sind im allgemeinen T-Zellen, welche in vivo gegenüber Gliadin
vorsensitiviert worden sind. Wie obenstehend erwähnt, ist von derartigen Antigenerfahrenen
T-Zellen festgestellt worden, im peripheren Blut vorhanden zu sein.
-
In
dem Verfahren können
die T-Zellen mit dem Mittel in vitro oder in vivo kontaktiert werden,
und die Bestimmung, ob die T-Zellen das Mittel erkennen, kann in
vitro oder in vivo durchgeführt
werden. Somit sieht die Erfindung das Mittel zur Verwendung in einem
Verfahren zur Diagnose vor, welches am menschlichen Körper ausgeführt wird.
Unterschiedliche Mittel werden für
simultane, separate oder sequenzielle Verwendung in einem derartigen
Verfahren bereitgestellt.
-
Das
in vitro-Verfahren wird typischerweise in wäßriger Lösung ausgeführt, in welche das Mittel zugegeben
wird. Die Lösung
wird auch die T-Zellen (und in bestimmten Ausführungsformen die nachstehend
erörterten
APCs) umfassen. Der Begriff "Kontaktieren", wie hierin verwendet,
schließt
das Zugeben der jeweiligen Substanz zu der Lösung ein.
-
Die
Bestimmung, ob die T-Zellen das Mittel erkennen, wird im allgemeinen
durch Detektieren einer Veränderung
im Zustand der T-Zellen in Gegenwart des Mittels oder durch Bestimmen,
ob die T-Zellen das Mittel binden, vorgenommen. Die Veränderung
im Zustand wird im allgemeinen durch Antigen-spezifische funktionelle
Aktivität
der T-Zelle verursacht, nachdem der TCR das Mittel bindet. Die Veränderung
des Zustands kann innerhalb (z. B. Änderung der intrazellulären Expression
von Proteinen) oder außerhalb
(z. B. Detektion von sezernierten Substanzen) der T-Zellen gemessen
werden.
-
Die
Veränderung
im Zustand der T-Zelle kann der Beginn oder eine Erhöhung der
Sekretion einer Substanz, wie einem Cytokin, speziell IFN-γ, IL-2 oder
TFN-α, aus
der T-Zelle sein. Die Bestimmung der IFN-γ-Sekretion wird besonders bevorzugt.
Die Substanz kann typischerweise detektiert werden, indem ihr gestattet wird,
an ein spezifisches Bindungsmittel zu binden, und dann die Gegenwart
des spezifischen Bindungsmittel/Substanz-Komplexes gemessen wird.
Das spezifische Bindungsmittel ist typischerweise ein Antikörper, wie polyklonale
oder monoklonale Antikörper.
Antikörper
gegen Cytokine sind kommerziell erhältlich oder können unter
Anwendung von Standardtechniken hergestellt werden.
-
Typischerweise
wird das spezifische Bindungsmittel auf einem festen Träger immobilisiert.
Nachdem die Substanz binden gelassen worden ist, kann der feste
Träger
gegebenenfalls gewaschen werden, um Material zu entfernen, welches
nicht spezifisch an das Mittel gebunden ist. Der Mittel/Substanz-Komplex
kann durch Verwendung eines zweiten Bindungsmittels detektiert werden,
welches den Komplex binden wird. Typischerweise bindet das zweite
Mit tel die Substanz an einer Stelle, welche verschieden von der
Stelle ist, welche das erste Mittel bindet. Das zweite Mittel ist
vorzugsweise ein Antikörper
und ist direkt oder indirekt durch eine detektierbare Markierung
markiert.
-
Somit
kann das zweite Mittel durch ein drittes Mittel detektiert werden,
welches typischerweise direkt oder indirekt durch eine detektierbare
Markierung markiert ist. Zum Beispiel kann das zweite Mittel eine
Biotineinheit umfassen, was eine Detektion durch ein drittes Mittel,
welches eine Streptavidin-Einheit und typischerweise alkalische
Phosphatase als eine nachweisbare Markierung umfaßt, gestattet.
-
In
einer Ausführungsform
ist das Detektionssystem, welches angewandt wird, der ex-vivo ELISPOT-Assay,
welcher in WO 98/23960 beschrieben ist. In diesem Assay wird aus
der T-Zelle sezerniertes
IFN-γ von
einem ersten IFN-γ-spezifischen
Antikörper
gebunden, welcher auf einem festen Träger immobilisiert ist. Das
gebundene IFN-γ wird
dann unter Verwendung eines zweiten IFN-γ-spezifischen Antikörpers detektiert, der
mit einer detektierbaren Markierung markiert ist. Ein derartiger
markierter Antikörper
kann von MABTECH (Stockholm, Schweden) erhalten werden. Andere detektierbare
Markierungen, welche verwendet werden können, werden nachstehend erörtert.
-
Bei
der Änderung
im Zustand der T-Zelle, welche gemessen werden kann, kann es sich
um die Erhöhung
der Aufnahme von Substanzen durch die T-Zelle handeln, wie bei der
Aufnahme von Thymidin. Die Veränderung
im Zustand kann eine Erhöhung
der Größe der T-Zellen
oder eine Proliferation der T-Zellen oder eine Änderung der Zelloberflächenmarker
auf der T-Zelle
sein.
-
In
einer Ausführungsform
wird die Änderung
des Zustands durch Messen der Änderung
der intrazellulären
Expression von Proteinen detektiert, beispielsweise der Zunahme
der intrazellulären
Expression von irgendeinem der obenstehend erwähnten Cytokine. Solche intrazellulären Änderungen
können
durch Kontaktieren des Inneren der T-Zelle mit einer Einheit detektiert
werden, welche die exprimierten Proteine in einer spezifischen Weise
bindet und welche das Sortieren der T-Zellen durch Flußcytometrie
gestattet.
-
Wenn
es den TCR bindet, wird, in einer Ausführungsform, das Mittel an ein
MHC-Klasse II-Molekül (typischerweise
HLA-DQ2) gebunden, welches typischerweise auf der Oberfläche einer
Antigen-präsentierenden
Zelle (APC) vorhanden ist. Wie hierin erwähnt, können jedoch andere Mittel einen
TCR binden, ohne die Notwendigkeit, ebenfalls ein MHC-Molekül zu binden.
-
Im
allgemeinen werden die T-Zellen, welche in dem Verfahren kontaktiert
werden, aus dem Individuum in einer Blutprobe entnommen, obwohl
andere Typen von Proben, welche T-Zellen enthalten, verwendet werden können. Die
Probe kann direkt zu dem Assay zugegeben oder zuerst verarbeitet
werden. Typischerweise kann die Verarbeitung das Verdünnen der
Probe, zum Beispiel mit Wasser oder Puffer, umfassen. Typischerweise
wird die Probe von 1,5- bis 100fach, zum Beispiel 2- bis 50- oder
5- bis 10fach, verdünnt.
-
Die
Verarbeitung kann das Trennen von Komponenten der Probe umfassen.
Typischerweise werden mononukleare Zellen (MCs) aus den Proben abgetrennt.
Die MCs werden die T-Zellen
und APCs umfassen. Somit können
in dem Verfahren die in den abgetrennten MCs vorhandenen APCs das
Peptid an die T-Zellen präsentieren.
In einer anderen Ausführungsform
können
lediglich T-Zellen, wie lediglich CD4-T-Zellen, aus der Probe gereinigt
werden. PBMCs, MCs und T-Zellen können aus der Probe unter Anwendung
von im Fachgebiet bekannten Techniken getrennt werden, wie denjenigen,
die in Lalvani et al. (1997) J. Exp. Med. 186, S. 859–865, beschrieben
werden.
-
In
einer Ausführungsform
liegen die im Assay verwendeten T-Zellen in der Form von unverarbeiteten oder
verdünnten
Proben vor oder sind frisch isolierte T-Zellen (wie in der Form
von frisch isolierten MCs oder PBMCs), welche direkt ex-vivo verwendet
werden, d. h. sie werden nicht vor Einsatz in den Verfahren kultiviert. Somit
sind die T-Zellen nicht in einer Antigenspezifischen Weise in vitro
restimuliert worden. Allerdings können die T-Zellen vor der Verwendung
kultiviert werden, zum Beispiel in Gegenwart von einem oder mehreren
der Mittel, und im allgemeinen auch von exogenen wachstumsfördernden
Cytokinen. Während
der Kultivierung sind die(das) Mittel typischerweise auf der Oberfläche von
APCs vorhanden, wie den APCs, welche in dem Verfahren verwendet
werden. Eine Vor-Kultivierung der T-Zellen kann zu einer Erhöhung der
Empfindlichkeit des Verfahrens führen.
Somit können
die T-Zellen zu
Zelllinien umgewandelt werden, wie Kurzfrist-Zelllinien (zum Beispiel
wie beschrieben in Ota et al. (1990) Nature 346, S. 183–187).
-
Die
APC, welche typischerweise in dem Verfahren vorhanden ist, kann
aus dem gleichen Individuum, wie die T-Zelle, oder aus einem unterschiedlichen
Wirt sein. Die APC kann eine natürlich
vorkommende APC oder eine künstliche
APC sein. Die APC ist eine Zelle, welche in der Lage zum Präsentieren
des Peptids an eine T-Zelle ist. Sie ist typischerweise eine B-Zelle, eine dendritische
Zeile oder ein Makrophage. Sie wird typischerweise aus derselben
Probe wie die T-Zelle abgetrennt und wird typischerweise mit der
T-Zelle gemeinsam gereinigt. Somit kann die APC in MCs oder PBMCs
vorhanden sein. Die APC ist typischerweise eine frisch isolierte
ex vivo-Zelle oder eine kultivierte Zelle. Sie kann in der Form
einer Zelllinie, wie einer kurzfristigen oder immortalisierten Zelllinie
vorliegen. Die APC kann leere MHC-Klasse II-Moleküle auf ihrer
Oberfläche
exprimieren.
-
In
dem Verfahren können
ein oder mehrere (unterschiedliche) Mittel verwendet werden. Typischerweise
können
die aus der Probe abgeleiteten T-Zellen mit all den Mitteln in einen
Assay eingebracht werden, für die
ein Test beabsichtigt wird, oder die T-Zellen können aufgeteilt und in getrennte
Assays eingebracht werden, von denen jeder ein oder mehrere der
Mittel enthält.
-
Die
Erfindung sieht ebenfalls die Mittel, wie zwei oder mehr beliebige
der hierin erwähnten
Mittel (z. B. die Kombinationen von Mitteln, welche in dem obenstehend
erörterten
Zusammensetzungsmittel vorhanden sind) zur gleichzeitigen, separaten
oder sequenziellen Verwendung vor (z. B. für in vivo-Verwendung).
-
In
einer Ausführungsform
wird das Mittel an sich direkt in einen Assay zugesetzt, welcher
T-Zellen und APCs
umfaßt.
Wie obenstehend erörtert,
könnten
die T-Zellen und APCs in einem derartigen Assay in der Form von
MCs vorliegen. Wenn Mittel, welche von der T-Zelle ohne die Notwendigkeit
für eine
Präsentation durch
APCs erkannt werden können,
verwendet werden, dann sind APCs nicht erdorderlich. Analoge, welche das
originale (i) oder (ii), gebunden an ein MHC-Molekül, nachahmen,
sind ein Beispiel für
ein solches Mittel.
-
In
einer Ausführungsform
wird das Mittel an die APC in Abwesenheit der T-Zelle zugeführt. Die
APC wird dann der T-Zelle zur Verfügung gestellt, typischerweise
nachdem ihr gestattet wurde, das Mittel auf ihrer Oberfläche zu präsentieren.
Das Peptid kann in das Innere der APC aufgenommen und präsentiert
worden sein oder lediglich auf die Oberfläche aufgenommen worden sein,
ohne in das Innere der APC eingetreten zu sein.
-
Die
Dauer, während
der das Mittel mit den T-Zellen kontaktiert wird, wird in Abhängigkeit
von dem Verfahren variieren, welches für das Bestimmen der Erkennung
des Peptids eingesetzt wird. Typischerweise werden 105 bis
107, vorzugsweise 5 × 105 bis
106 PBMCs in jeden Assay zugesetzt. In dem
Fall, worin das Mittel direkt zu dem Assay gegeben wird, beläuft sich
seine Konzentration auf 10–1 bis 103 μg/ml, vorzugsweise
0,5 bis 50 μg/ml
oder 1 bis 10 μg/ml.
-
Typischerweise
beläuft
sich die Länge
der Zeit, während
der die T-Zellen mit dem Mittel inkubiert werden, auf 4 bis 24 Stunden,
vorzugsweise 6 bis 16 Stunden. Wenn ex vivo-PBMCs verwendet werden,
ist festgestellt worden, daß 0,3 × 106 PBMCs
in 10 μg/ml
Peptid während
12 Stunden bei 37°C
inkubiert werden können.
-
Die
Bestimmung der Erkennung des Mittels durch die T-Zellen kann durch
Messen der Bindung des Mittels an die T-Zellen erfolgen (dies kann
unter Verwendung eines beliebigen geeigneten hierin erörterten
Bindungs-Assayformats durchgeführt
werden). Typischerweise können
T-Zellen, die das Mittel binden, auf Basis dieser Bindung sortiert
werden, zum Beispiel unter Verwendung einer FACS-Maschine. Das Vorhandensein von
T-Zellen, welche das Mittel erkennen, wird schätzungsweise auftreten, wenn
die Häufigkeit
von unter Verwendung des Mittels sortierten Zellen überhalb
eines "Kontroll"-Wertes liegt. Die
Häufigkeit
von Antigen-erfahrenen T-Zellen beträgt im allgemeinen 1 von 106 bis 1 von 103,
und deshalb kann bestimmt werden, ob die sortierten Zellen Antigen-erfahrene
T-Zellen sind, oder nicht.
-
Die
Bestimmung der Erkennung des Mittels durch die T-Zellen kann in
vivo gemessen werden. Typischerweise wird das Mittel an den Wirt
verabreicht, und dann kann eine Antwort gemessen werden, welche
die Erkennung des Mittels anzeigt. Das Mittel wird typischerweise
intradermal oder epidermal verabreicht. Das Mittel wird typischerweise
durch Inkontaktbringen mit der Außenseite der Haut verabreicht
und kann mit Hilfe eines Pflasters oder eines Verbandes an der Stelle
zurückgehalten
werden. Alternativ dazu kann das Mittel per Nadel, wie durch Injektion,
verabreicht werden, kann aber auch durch andere Verfahren, wie Ballistik,
verabreicht werden (z. B. die Ballistiktechniken, welche verwendet
worden sind, um Nukleinsäuren
zuzuführen).
Die EP-A-0 693 119 beschreibt Techniken, welche typischerweise angewandt
werden können,
um das Mittel zu verabreichen. Typischerweise werden 0,001 bis 1000 μg, beispielsweise
0,01 bis 100 μg
oder 0,1 bis 10 μg Mittel
verabreicht.
-
In
einer Ausführungsform
kann ein Produkt verabreicht werden, welches zum Bereitstellen des
Mittels in vivo in der Lage ist. So kann ein Polynukleotid, das
fähig zum
Exprimieren des Mittels ist, typischerweise auf einem beliebigen
der oben für
die Verabreichung des Mittels beschriebenen Wege verabreicht werden.
Das Polynukleotid bestitzt typischerweise jegliche der Charakteristika
des von der Erfindung bereitgestellten Polynukleotides, welches
nachstehend erörtert
wird. Das Mittel wird von dem Polynukleotid in vivo exprimiert.
Typischerweise werden 0,001 bis 1000 μg, zum Beispiel 0,01 bis 100 μg oder 0,1
bis 10 μg
Polynukleotid verabreicht.
-
Die
Erkennung des an die Haut verabreichten Mittels wird typischerweise
durch das Auftreten von Entzündung
(z. B. Verhärtung,
Rötung
oder Ödem)
an der Verabreichungsstelle angezeigt. Dies wird im allgemeinen
durch visuelle Untersuchung der Stelle gemessen.
-
Das
auf der Detektion eines Antikörpers,
der das Mittel bindet, basierende Verfahren zur Diagnose wird typischerweise
durch in Kontakt bringen einer Probe aus dem Individuum (wie einer
beliebigen der hierin erwähnten
Proben, die gegebenenfalls in einer beliebigen hierin erwähnten Weise
verarbeitet wurde) mit dem Mittel und Bestimmen, ob ein Antikörper in
der Probe das Mittel bindet, durchgeführt, wobei eine derartige Bindung
anzeigt, daß das
Individuum Zöliakie
aufweist oder dieser gegenüber
empfindlich ist. Jedes geeignete Bindungsassay-Format kann angewandt
werden, wie jegliches hierin erwähnte
derartige Format.
-
Therapie
-
Die
Identifizierung des immundominanten Epitops gestattet die Herstellung
der therapeutischen Produkte, welche auf die T-Zellen abzielen,
die dieses Epitop erkennen (wobei derartige T-Zellen solche sind,
die an der Immunantwort gegen Gliadin teilnehmen). Diese Feststellung
ermöglicht
auch die Prävention
oder Behandlung von Zöliakie
durch Unterdrücken
(mittels Tolerisierung) einer Antikörper- oder 7-Zell-Antwort auf
das Epitop.
-
Bestimmte
Mittel der Erfindung binden den TCR, der das Epitop der Erfindung
erkennt (wie unter Anwendung eines beliebigen der obenstehend erörteten Bindung-Assays
gemessen wird) und verursachen eine Tolerisierung der T-Zelle, welche
den TCR trägt.
Solche Mittel können,
gegebenenfalls in Assoziation mit einem Träger, deshalb verwendet werden,
um Zöliakie
zu verhindern oder zu behandeln.
-
Im
allgemeinen kann eine Tolerisierung durch die selben Peptide verursacht
werden, welche (nachdem sie durch den TCR erkannt wurden) eine Antigen-spezifische
funktionelle Aktivität
der T-Zelle verursachen (wie eine beliebige hierin erwähnte derartige
Aktivität,
z. B. Sekretion von Cytokinen). Solche Mittel verursachen eine Tolerisierung,
wenn sie dem Immunsystem in einem "tolerisierenden" Kontext präsentiert werden.
-
Die
Tolerisierung führt
zu einer Verringerung der Erkennung eines T-Zell- oder Antikörper-Epitops durch das
Immunsystem. Im Fall eines T-Zell-Epitops kann dies durch die Deletion
oder das Anergiesieren von T-Zellen verursacht werden, welche das
Epitop erkennen. Somit wird die T-Zell-Aktivität (zum Beispiel wie gemessen
in hierin erwähnten
geeigneten Assays) in Antwort auf das Epitop vermindert. Die Tolerisierung
einer Antikörperantwort
bedeutet, daß eine
verringerte Menge an spezifischem Antikörper gegen das Epitop hergestellt
wird, wenn das Epitop verabreicht wird.
-
Verfahren
zum Präsentieren
von Antigenen an das Immunsystem in einem derartigen Kontext sind
bekannt und werden zum Beispiel in Yoshida et al., Clin. Immunol.
Immunopathol. 82, 207–215
(1997), Thurau et al., Clin. Exp. Immunol. 109, 370–6 (1997),
und Weiner et al., Res. Immunol. 148, 528–33 (1997), beschrieben. Insbesondere
können
bestimmte Verabreichungswege, wie orale, nasale oder intraperitoneale
Wege, eine Tolerisierung herbeiführen.
Besondere Produkte, welche Tolerisierung herbeiführen, können an das Individuum verabreicht
werden (z. B. in einer Zusammensetzung, welche auch das Mittel umfaßt). Derartige
Produkte schließen
Cytokine, wie Cytokine, die eine Th2-Antwort begünstigen (z. B. IL-4, TGF-β oder IL-10)
ein. Produkte oder Mittel können
bei einer Dosis verabreicht werden, welche eine Tolerisierung verursacht.
-
Die
Erfindung sieht ein Protein vor, das eine Sequenz umfaßt, die
in der Lage ist, als ein Antagonist der T-Zelle zu wirken (wobei
die T-Zelle das Mittel erkennt). Solche Proteine und solche Antagonisten
können auch
verwendet werden, um Zöliakie
zu verhindern oder zu behandeln. Der Antagonist wird eine Verringerung der
T-Zell-Antwort verursachen. In einer Ausführungsform bindet der Antagonist
den TCR der T-Zelle (im allgemeinen in der Form eines Komplexes
mit HLA-DQ2), aber anstatt eine normale funktionelle Aktivierung
zu verursachen, wird ein abnormales Signal hervorgerufen, das über die
intrazelluläre
TCR-Signalleitungs-Kaskade
weitergeleitet wird, welches verursacht, daß die T-Zelle eine verringerte
Funktions-Aktivität
(z. B. in Antwort auf die Erkennung eines Epitops, typischerweise
wie gemessen durch einen beliebigen hierin erwähnten geeigneten Assay) aufweist.
-
In
einer Ausführungsform
konkurriert der Antagonist mit Epitop um die Bindung einer Komponente
des MHC-Prozessierungs- und -Präsentationsweges,
wie ein MHC-Molekül
(typischerweise HLA-DQ2). Somit kann der Antagonist HLA-DQ2 binden
(und daher ein Peptid sein, das von diesem MHC-Molekül präsentiert wird),
wie das Peptid TP (Tabelle 10) oder ein Homolog davon.
-
Verfahren
zur Verursachung von Antagonismus sind im Fachgebiet bekannt. In
einer Ausführungsform ist
der Antagonist ein Homolog der obenstehend erwähnten Epitope und kann beliebige
unter den Sequenz-, Bindungs- oder anderen Eigenschaften des Mittels
aufweisen (insbesondere Analoge). Die Antagonisten unterscheiden
sich typischerweise von irgendeinem der obenstehenden Epitope (welche
in der Lage sind, eine normale antigenspezifische Funktion in der
T-Zelle herbeizuführen)
durch 1, 2, 3, 4 oder mehr Mutationen (von denen jede eine Substituion,
Insertion oder Deletion sein kann). Solche Antagonisten werden im
Fachgebiet als abgewandelte Peptid-Liganden bzw. "altered peptide ligands" oder "APL" bezeichnet. Die Mutationen
liegen typischerweise an den Aminosäurepositionen, welche den TCR
kontaktieren.
-
Der
Antagonist kann sich von dem Epitop durch eine Substitution innerhalb
der Sequenz unterscheiden, welche äquivalent zu der Sequenz ist,
die durch die Aminosäuren
65 bis 67 von A-Gliadin repräsentiert wird
(solche Antagonisten werden in der Tabelle 9 gezeigt). Somit besitzt
der Antagonist vorzugsweise eine Susbtitution am Äquivalent
der Position 64, 65 oder 67. Vorzugsweise handelt es sich bei der
Susbtitution um 64W, 67W, 67M oder 65T.
-
Da
die T-Zell-Immunantwort auf das Epitop der Erfindung in einem Individuum
polyklonal ist, kann es notwendig sein, mehr als einen Antagonisten
zu verabreichen, um einen Antagonismus von T-Zellen der Antwort
zu verursachen, welche unterschiedliche TCRs aufweisen. Deshalb
können
die Antagonisten in einer Zusammensetzung verabreicht werden, welche
mindestens 2, 4, 6 oder mehr verschiedene Antagonisten umfaßt, welche
jeweils verschiedene T-Zellen antagonisieren.
-
Die
Erfindung sieht auch ein Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten
einer T-Zelle (welche das Mittel erkennt) vor, umfassend das Inkontaktbringen
einer Kandidatensubstanz mit der T-Zelle und das Detektieren, ob
die Substanz eine Verringerung in der Fähigkeit der T-Zelle verursacht,
eine Antigen-spezifische Antwort zu durchlaufen (z. B. unter Anwendung
irgendeines geeigneten hierin erwähnten Assays), wobei das Detektieren
jeglicher derartiger Verringerung in der Fähigkeit anzeigt, daß die Substanz
ein Antagonist ist.
-
In
einer Ausführungsform
liegen die Antagonisten (einschließlich Kombinationen von Antagonisten
gegenüber
einem besonderen Epitop) oder tolerisierenden (T-Zell- und Antikörpertolerisierenden)
Mittel in einer Zusammensetzung vor, umfassend mindestens 2, 4,
6 oder mehr Antagonisten oder Mittel, welche verschiedene Epitope
der Erfindung antagonisieren oder eine Tolerisierung gegenüber diesen
hervorrufen, zum Beispiel gegenüber
den Kombinationen von Epitopen, welche obenstehend in Bezug auf
die Mittel erörtert
wurden, welche ein Produkt darstellen, das mehr als eine Substanz
umfaßt.
-
Testen des
Vermögens
einer Zusammensetzung zur Verursachung von Zöliakie
-
Wie
obenstehend erwähnt,
sieht die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung vor, ob eine Zusammensetzung
in der Lage ist, Zöliakie
zu verursachen, umfassend das Detektieren der Gegenwart einer Proteinsequenz,
welche in der Lage ist, durch eine Transglutaminase zu einer Sequenz
modifiziert zu werden, welche das Mittel oder Epitop der Erfindung
umfaßt
(eine solche Transglutaminaseaktivität kann eine humane Darm-Transglutaminase-Aktivität sein).
Typischerweise wird dies unter Verwendung eines Bindungs-Assays durchgeführt, in
welchem eine Einheit, die auf spezifische Weise an die Sequenz bindet,
mit der Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird und die Bildung
des Sequenz/Einheit-Komplexes detektiert und verwendet wird, um
die Gegenwart des Mittels festzustellen. Eine derartige Einheit
kann jedwede geeignete Substanz (oder Typ von Substanz) sein, welche
hierin erwähnt
wird, und ist typischerweise ein spezifischer Antikörper. Jedwedes
geeignete Format an Bindungs-Assay kann verwendet werden (wie diejenigen,
die hierin erwähnt werden).
-
In
einer Ausführungsform
wird die Zusammensetzung mit mindestens 2, 5, 10 oder mehr Antikörpern kontaktiert,
welche für
Epitope der Erfindung aus verschiedenen Gliadinen spezifisch sind,
zum Beispiel einer Palette von Antikörpern, die zur Erkennung der
Kombinationen von Epitopen in der Lage ist, welche obenstehend erörtert wurden
in Bezug auf Mittel der Erfindung, bei welchen es sich um ein Produkt
handelt, das mehr als eine Substanz umfaßt.
-
Die
Zusammensetzung umfaßt
typischerweise Material aus einer Pflanze, welche ein Gliadin exprimiert,
das zur Erzeugung von Zöliakie
in der Lage ist (zum Beispiel ein beliebiges der hierin erwähnten Gliadine oder
Pflanzen). Ein solches Material kann ein Pflanzenteil, wie ein geerntetes
Produkt (z. B. Samen) sein. Bei dem Material kann es sich um verarbeitete
Produkte des Pflanzenmaterials (z. B. ein beliebiges derartiges, hierin
erwähntes
Produkt) handeln, wie ein Mehl oder ein Nahrungsmittel, welches
das Gliadin umfaßt.
Die Verarbeitung von Nahrungsmittelmaterial und das Testen in geeigneten
Bindungsassays ist eine routinemäßige Angelegenheit,
wie zum Beispiel in Kricka, L.J., J. Biolumin. Chemilumin. 13, 189–93 (1998),
erwähnt
wird.
-
Bindungsassays
-
Die
Bestimmung der Bindung zwischen beliebigen zwei, hierin erwähnten, Substanzen
kann durch Messen eines Charakteristikums von einer oder beiden
Substanzen erfolgen, welches sich nach der Bindung verändert, wie
eine spektroskopische Veränderung.
-
Das
Bindungsassay-Format kann ein "Banden-Shift"-System sein. Dieses
beinhaltet das Bestimmen, ob die Gegenwart einer Substanz (wie einer
Kandidatensubstanz) das Fortschreiten der anderen Substanz während einer
Gelelektrophorese vorantreibt oder verzögert.
-
Das
Format kann ein kompetitives Bindungs-Verfahren sein, welches bestimmt,
ob die eine Substanz in der Lage ist, die Bindung der anderen Substanz
an ein Mittel zu inhibieren, von welchem bekannt ist, die andere
Substanz zu binden, wie ein spezifischer Antikörper.
-
Mutanten-Gliadinproteine
-
Die
Erfindung sieht ein Gliadinprotein vor, in welchem eine Epitopsequenz
der Erfindung, oder eine Sequenz, welche durch eine Transglutaminase
modifiziert werden kann, um eine solche Sequenz vorzusehen, so mutiert
worden ist, daß sie
nicht länger
eine T-Zellantwort, die das Epitop erkennt verursacht, oder von
selbiger erkannt wird. In diesem Kontext bezieht sich der Begriff
Erkennung auf die TCR-Bindung des Epitops in einer solchen Weise,
daß eine
normale (nicht antagonistische) Antigen-spezifische funktionelle
Aktivität
der T-Zelle auftritt.
-
Verfahren
zum Identifizieren von äquivalenten
Epitopen in anderen Gliadinen sind obenstehend erörtert. Der
Wildtyp des mutierten Gliadins ist ein solcher, welcher Zöliakie verursacht.
Ein solches Gliadin wird Homologie mit SEQ ID NR.: 3, zum Beispiel
zu dem obenstehend erwähnten
Ausmaß (in
Bezug auf das Analog) über
die gesamte SEQ ID NR.: 3 oder über
15, 30, 60, 100 oder 200 benachbarte Aminosäuren von SEQ ID NR.: 3 hinweg
aufweisen.
-
Das
mutierte Gliadin wird keine Zöliakie
verursachen oder wird verringerte Symptome einer Zöliakie verursachen.
Typischerweise vermindert die Mutation die Fähigkeit des Epitops, eine T-Zell-Antwort
zu induzieren. Das mutierte Epitop kann eine verringerte Bindung
an HLA-DQ2, eine
verminderte Fähigkeit,
durch eine APC präsentiert
zu werden, oder eine verminderte Fähigkeit, an T-Zellen, welche
das Mittel erkennen, zu binden oder von ihnen erkannt zu werden
(d. h. Antigen-spezifische funktionelle Aktivität herbeizuführen) aufweisen. Das mutierte
Gliadin oder Epitop wird deshalb keine oder eine verringerte Erkennung
in einem beliebigen der hierin in Bezug auf die diagnostischen Aspekte
der Erfindung erwähnten
Assays zeigen.
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Bei
der Mutation kann es sich um eine oder mehrere Deletionen, Additionen
oder Substitutionen mit einer Länge
von 1 bis 3, 4 bis 6, 6 bis 10, 11 bis 15 oder mehr in dem Epitop,
beispielsweise über
die Sequenz SEQ ID NR.: 2 oder ihr Äquivalent hinweg, handeln.
Vorzugsweise besitzt das Mutanten-Gliadin mindestens eine Mutation
in der Sequenz SEQ ID NR.: 1. Eine bevorzugte Mutation liegt an
Position 65 in A-Gliadin (oder in einer äquivalenten Position in anderen
Gliadinen). Typischerweise wird das natürlich vorkommende Glutamin
an dieser Position durch irgendeine der Aminosäuren substituiert, welche in
der Tabelle 3 gezeigt sind, vorzugsweise zu Histidin, Tyrosin, Tryptophan,
Lysin, Prolin oder Arginin.
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Die
Erfindung sieht somit ebenfalls die Verwendung einer Mutation (wie
einer beliebigen der Mutationen in einer beliebigen der hierin erörterten
Sequenzen) in einem Epitop eines Gliadinproteins vor, wobei das Epitop
ein Epitop der Erfindung ist, um die Fähigkeit des Gliadinproteins,
Zöliakie
zu verursachen, zu vermindern.
-
In
einer Ausführungsform
ist die mutierte Sequenz in der Lage, als ein Antagonist zu wirken.
Somit sieht die Erfindung ein Protein vor, welches eine Sequenz
umfaßt,
die in der Lage ist, an einen T-Zell-Rezeptor zu binden, wobei der
T-Zell-Rezeptor ein Mittel der Erfindung erkennt, und wobei die
Sequenz in der Lage ist, einen Antagonismus einer T-Zelle herbeizuführen, welche
einen solchen T-Zell-Rezeptor trägt.
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Die
Erfindung sieht auch Proteine vor, welche Fragmente der obenstehenden
Mutanten-Gliadinproteine
sind, welche mindestens 15 Aminosäuren lang (z. B. mindestens
30, 60, 100, 150, 200 oder 250 Aminosäuren lang) sind und welche
die obenstehend erörterten
Mutationen umfassen, welche die Fähigkeit des Gliadins, erkannt
zu werden, vermindern. Ein beliebiges der hierin erwähnten Mutantenproteine
(einschließlich Fragmenten)
kann auch in der Form von Fusionsproteinen, zum Beispiel mit anderen
Gliadinen oder mit Nicht-Gliadin-Proteinen, vorhanden sein.
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Das
zu dem mutierten Gliadinprotein äquivalente
Wildtyp-Protein stammt typischerweise aus einer Graminaceen-Monokotyledone,
wie einer Pflanze der Gattung Triticum, z. B. Weizen, Roggen, Gerste,
Hafer oder Tritikale. Das Protein ist typischerweise ein α-, αβ-, β-, γ oder ω-Gliadin. Das Gliadin
kann ein A-Gliadin sein.
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Kits
-
Die
Erfindung sieht ebenfalls ein Kit zum Ausführen des Verfahrens vor, umfassend
ein oder mehrere Mittel und gegebenenfalls eine Methode bzw. ein
Mittel zum Nachweis der Erkennung des Mittels durch die T-Zelle.
Typischerweise werden unterschiedliche Mittel für gleichzeitige, separate oder
sequenzielle Verwendung vorgesehen. Typischerweise gestattet die
Methode zum Nachweis der Erkennung eine Detektion, basierend auf
den obenstehend erörterten
Techniken, oder unterstützt
selbige.
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Somit
kann die Methode den Nachweis einer Substanz gestatten, welche von
den T-Zellen nach der Erkennung sezerniert wird. Das Kit kann somit
zusätzlich
eine spezifische Bindungseinheit für die Substanz, wie einen Antikörper, einschließen. Die
Einheit ist typischer weise spezifisch für IFN-γ. Die Einheit ist typischerweise
auf einem festen Träger
immobilisiert. Dies bedeutet, daß nach der Bindung der Einheit
die Substanz in der Nachbarschaft der T-Zelle bleiben wird, welche
selbige sezerniert hat. Daher werden "Spots" von Substanz/Einheit-Komplex auf dem
Träger
gebildet, wobei jeder Spot eine T-Zelle repräsentiert, welche die Substanz
sezerniert. Das Quantifizieren der Spots, und typischerweise das
Vergleichen gegen eine Kontrolle, gestattet eine Bestimmung der
Erkennung des Mittels.
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Das
Kit kann auch ein Mittel zum Nachweisen des Substanz/Einheit-Komplexes
umfassen. Eine nachweisbare Veränderung
kann in der Einheit selbst nach Bindung der Substanz stattfinden,
wie eine Farbveränderung.
Alternativ dazu kann zugelassen werden, daß eine für den Nachweis direkt oder
indirekt markierte zweite Einheit den Substanz/Einheit-Komplex bindet,
um eine Bestimmung der Spots zu gestatten. Wie obenstehend erörtert, kann
die zweite Einheit spezifisch für
die Substanz sein, bindet aber eine andere Stelle auf der Substanz
als die erste Einheit.
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Der
immobilisierte Träger
kann eine Platte mit Vertiefungen, wie eine Mikrotiterplatte, sein.
Jeder Assay kann daher in einer separaten Vertiefung in der Platte
durchgeführt
werden.
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Das
Kit kann darüber
hinaus Medium für
die T-Zellen, Detektions-Einheiten oder Waschpuffer umfassen, welche
in den Nachweisschritten zu verwenden sind. Das Kit kann zusätzlich Reagenzien
umfassen, die für
das Trennen aus der Probe geeignet sind, wie die Trennung von PBMCs
oder T-Zellen aus der Probe. Das Kit kann ausgelegt sein, um einen
direkten Nachweis der T-Zellen in der Probe ohne Erfordernis irgendeiner Trennung
der Komponenten der Probe zu gestatten.
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Das
Kit kann ein Instrument umfassen, welches die Verabreichung des
Mittels, wie eine intradermale oder epidermale Verabreichung, gestattet.
Typischerweise umfaßt
ein solches Instrument ein Pflaster, einen Verband oder eine oder
mehrere Nadeln. Das Instrument kann die ballistische Zuführung des
Mittels erlauben. Das Mittel in dem Kit kann in der Form einer pharmazeutischen
Zusammensetzung vorliegen.
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Das
Kit kann auch Kontrollen, wie Positiv- oder Negativkontrollen, umfassen.
Die Positivkontrolle kann ein Testen des Nachweissystems erlauben.
Somit ahmt die Positivkontrolle typischerweise die Erkennung des Mittels
in einem beliebigen der obenstehenden Verfahren nach. Typischerweise
ist, in den Kits, welche ausgelegt sind, um eine Erkennung in vitro
zu bestimmen, die Positivkontrolle ein Cytokin. In dem Kit, welches
ausgelegt ist, um in vivo- Erkennung
des Mittels nachzuweisen, kann die Positivkontrolle ein Antigen
sein, auf welches die meisten Individuen antworten sollten.
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Das
Kit kann auch eine Einrichtung umfassen, um eine T-Zellen enthaltende
Probe aus dem Wirt zu entnehmen, wie eine Blutprobe. Das Kit kann
eine Einrichtung umfassen, um mononukleare Zellen oder T-Zellen
aus einer Probe aus dem Wirt zu trennen.
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Polynukleotide, Zellen,
transgene Säugetiere
und Antikörper
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Die
Erfindung sieht ebenfalls ein Polynukleotid vor, welches in der
Lage zur Expression ist, um das Mittel oder Mutanten-Gliadinproteine
bereitzustellen. Typischerweise ist das Polynukleotid DNA oder RNA
und ist einzel- oder doppelsträngig.
Das Polynukleotid wird vorzugsweise mindestens 50 Basen oder Basenpaare, zum
Beispiel 50 bis 100, 100 bis 500, 500 bis 1000 oder 1000 bis 2000
oder mehr Basen oder Basenpaare umfassen. Das Polynukleotid umfaßt daher
eine Sequenz, welche die Sequenz von SEQ ID NR.: 1 oder 2 oder irgendeines
der hierin erwähnten
Mittel kodiert. In Richtung auf 5' und 3' hin von dieser kodierenden Sequenz besitzt
das Polynukleotid der Erfindung eine Sequenz oder Codons, welche
von der Sequenz oder Codons 5' und
3' zu diesen Sequenzen
in dem entsprechenden Gliadingen verschieden sind.
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5' und/oder 3' zu der für das Peptid
kodierenden Sequenz, weist das Polynukleotid kodierende oder nicht-kodierende
Sequenz auf. Sequenz, welche 5' und/oder
3' zur kodierenden
Sequenz liegt, kann Sequenzen umfassen, welche die Expression, wie
Transkription und/oder Translation der das Mittel kodierenden Sequenz
unterstützen.
Das Polynukleotid kann in der Lage sein, das Mittel in einer prokaryontischen
oder eukaryontischen Zelle zu exprimieren. In einer Ausführungsform
ist das Polynukleotid in der Lage, das Mittel in einer Säugerzelle,
wie einer Menschen-, Primaten- oder Nagetier- (z. B. Maus- oder
Ratten-) Zelle zu exprimieren.
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Ein
Polynukleotid der Erfindung kann selektiv an ein Polynukleotid,
welches SEQ ID NR.: 3 kodiert, bei einem Spiegel signifikant über dem
Hintergrund hybridisieren. Eine selektive Hybridisierung wird typischerweise
unter Anwendung von Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz erzielt
(zum Beispiel 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei
etwa 50°C
bis etwa 60°C).
Allerdings kann eine solche Hybridisierung unter jedweden geeigneten,
im Fachgebiet bekannten Bedingungen ausgeführt werden (siehe Sambrook
et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Wenn zum
Beispiel eine hohe Stringenz erfordert wird, schließen geeignete
Bedingungen 0,2 × SSC
bei 60°C
ein. Wenn eine niedrigere Stringenz erfordert wird, schließen geeignete
Bedingungen 2 × SSC
bei 60°C
ein.
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Mittel
oder Proteine der Erfindung können
von den hierin beschriebenen Polynukleotiden kodiert werden.
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Das
Polynukleotid kann einen replizierbaren Vektor bilden, oder darin
eingebunden werden. Ein derartiger Vektor ist in der Lage, in einer
geeigneten Zelle zu replizieren. Der Vektor kann ein Expressionsvektor sein.
In einem solchen Vektor ist das Polynukleotid der Erfindung operativ
mit einer Kontrollsequenz verbunden, die in der Lage ist, die Expression
des Polynukleotids zur Verfügung
zu stellen. Der Vektor kann einen selektierbaren Marker, wie das
Ampicillin-Resistenzgen, enthalten.
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Das
Polynukleotid oder der Vektor können
in einer Zelle vorhanden sein. Eine solche Zelle kann durch das
Polynukleotid oder den Vektor transformiert worden sein. Die Zelle
kann das Mittel exprimieren. Die Zelle wird gewählt, um mit dem Vektor kompatibel
zu sein, und kann zum Beispiel eine prokaryontische (bakterielle), Hefe-,
Insekten- oder Säugerzelle
sein. Das Polynukleotid oder der Vektor kann unter Anwendung herkömmlicher
Techniken in Wirtszellen eingebracht werden, einschließlich Calciumphosphat-Präzipitation,
DEAE-Dextran-Transfektion
oder Elektroporation.
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Die
Erfindung sieht Verfahren für
die Herstellung der Proteine der Erfindung durch rekombinante Methoden
vor. Dies kann umfassen: (a) Kultivieren einer transformierten Zelle,
wie obenstehend definiert, unter Bedingungen, welche die Expression
des Proteins gestatten; und vorzugsweise (b) Aufreinigen des exprimierten
Polypeptids. Gegebenenfalls kann das Polypeptid durch im Fachgbiet
bekannte Techniken isoliert und/oder gereinigt werden.
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Die
Erfindung sieht auch TCRs vor, welche das Mittel erkennen (oder
binden), oder Fragmente davon, welche zu einer solchen Erkennung
(oder Bindung) in der Lage sind. Diese können in irgendeiner hierin
erwähnten
Form (z. B. Reinheit), welche hierin in Bezug auf das Protein der
Erfindung erörtert
wurde, vorliegen. Die Erfindung sieht des Weiteren T-Zellen vor,
welche derartige TCRs exprimieren, welche in einer beliebigen Form
(z. B. Reinheit) vorliegen können,
die hierin für
die Zellen der Erfindung erörtert
wurde.
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Die
Erfindung sieht ebenfalls monoklonale oder polyklonale Antikörper, welche
die Mittel (wie ein beliebiges der Epitope der Erfindung) spezifisch
erkennen und welche die Mutanten-Gliadinproteine
der Erfindung erkennen (und welche typischerweise nicht die äquivalenten
Wildtyp-Gliadine erkennen), sowie Verfahren zur Herstellung solcher
Antikörper
vor. Antikörper
der Erfindung binden spezifisch an diese Substanzen der Erfindung.
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Für die Zwecke
dieser Erfindung schließt
der Begriff "Antikörper" Antikörperfragmente,
wie Fv-, F(ab)- und F(ab)2-Fragmente, sowie
Einzelketten-Antikörper,
ein.
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Ein
Verfahren zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers umfaßt das Immunisieren
eines geeigneten Wirtstiers, zum Beispiel eines Versuchstieres,
mit dem Immunogen und das Isolieren von Immunglobulinen aus dem
Serum. Das Tier kann deshalb mit dem Immunogen inokuliert werden,
wobei anschließend
Blut aus dem Tier entnommen wird und die IgG-Fraktion gereinigt
wird. Ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers umfaßt das Immortalisieren
von Zellen, welche den gewünschten
Antikörper
herstellen. Hybridom-Zellen können
durch Verschmelzen von Milzzellen aus einem inokulierten Versuchstier
mit Tumorzellen hergestellt werden (Kohler und Milstein (1975) Nature
256, 495–497).
-
Eine
immortalisierte Zelle, welche den gewünschten Antikörper herstellt,
kann durch ein herkömmliches
Vorgehen selektiert werden. Die Hybridome können in Kultur herangezüchtet oder
intraperitoneal für
die Bildung von Aszites-Fluid oder in den Blutstrom eines allogenen
Wirtes oder immunkompromitierten Wirtes injiziert werden. Humaner
Antikörper
kann durch in vitro-Immunisierung mit humanen Lymphozyten, gefolgt
von Transformation der Lymphozyten mit Epstein-Barr-Virus hergestellt
werden.
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Für die Herstellung
sowohl monoklonaler als auch polyklonaler Antikörper ist das Versuchstier in
geeigneter Weise eine Ziege, ein Kaninchen, eine Ratte oder eine
Maus. Falls gewünscht,
kann das Immunogen als ein Konjugat verabreicht werden, in welchem
das Immunogen, beispielsweise über
eine Seitenkette von einem der Aminosäurereste, an einen geeigneten
Träger
gekoppelt ist. Das Trägermolekül ist typischerweise ein
physiologisch annehmbarer Träger.
Der erhaltene Antikörper
kann isoliert und, falls gewünscht,
gereinigt werden.
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Das
Polynukleotid, Mittel, Protein oder der Antikörper der Erfindung kann/können eine
nachweisbare Markierung tragen. Nachweisbare Markierungen, welche
die Detektion der sezernierten Substanz durch visuelle Betrachtung
gestatten, gegebenenfalls mit Hilfe einer optischen Vergrößerungsvorrichtung,
werden bevorzugt. Ein solches System basiert typischerweise auf
einer Enzymmarkierung, welche eine Farbveränderung in einem Substrat verursacht,
zum Beispiel alkalische Phosphatase, welche eine Farbänderung
in einem Substrat verursacht. Solche Substrate sind kommerziell
erhältlich,
z. B. von BioRad. Andere geeignete Markierungen schließen andere
Enzyme, wie Peroxidase, oder Proteinmarkierungen, wie Biotin; oder
Radioisotope, wie 32P oder 35S
ein. Die obenstehenden Markierungen können unter Anwendung bekannter
Techniken detektiert werden.
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Polynukleotide,
Mittel, Proteine, Antikörper
oder Zellen der Erfindung können
in im Wesentlichen gereinigter Form vorliegen. Sie können in
im Wesentlichen isolierter Form vorliegen, wobei sie in diesem Fall
im Allgemeinen mindestens 80 %, z. B. mindestens 90, 95, 97 oder
99 % des Polynukleotids, Peptids, Antikörpers, der Zellen oder der
Trockenmasse in der Präparation
ausmachen. Das Polynukleotid, Mittel, Protein oder der Antikörper ist
typischerweise im Wesentlichen frei von anderen zellulären Komponenten.
Das Polynukleotid, Mittel, Protein oder der Antikörper können in
einer derartigen, im Wesentlichen isolierten, gereinigten oder freien
Form in dem Verfahren verwendet werden oder in solchen Formen in
dem Kit vorhanden sein.
-
Die
Erfindung sieht des Weiteren ein transgenes Säugetier vor, welches einen
TCR der Erfindung exprimiert. Bei diesem kann es sich um jedwedes
der hierin erörterten
Säugetiere
handeln (z. B. in Bezug auf die Herstellung des Antikörpers).
Vorzugsweise weist der Säuger
eine Zöliakie
auf, oder ist dafür
anfällig.
Der Säuger
kann auch HLA-DQ exprimieren, und/oder ihm kann eine Diät, die ein
Gliadin umfaßt,
gegeben werden, welche Zöliakie
hervorruft (z. B. jedwedes der hierin erwähnten Gliadin-Proteine). Somit
kann der Säuger
als ein Tiermodell für
Zöliakie
fungieren.
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Die
Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren eines
Produkts vor, welches für
Zöliakie therapeutisch
ist, umfassend das Verabreichen einer Kandidatensubstanz an einen
Säuger
der Erfindung, der Zöliakie
aufweist oder dafür
anfällig
ist, und das Bestimmen, ob die Substanz Zöliakie in dem Säuger verhindert oder
behandelt, wobei die Verhinderung oder Behandlung von Zöliakie anzeigt,
daß die
Substanz ein therapeutisches Produkt ist. Ein solches Produkt kann
verwendet werden, um Zöliakie
zu behandeln oder zu verhindern.
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Die
Erfindung sieht therapeutische (einschließlich prophylaktische) Mittel
oder diagnostische Substanzen vor (die Mittel, Proteine und Polynukleotide
der Erfindung). Diese Substanzen werden für die klinische Verabreichung
durch Vermischen derselben mit einem pharmazeutisch annehmbaren
Träger
oder Verdünnungsmittel
formuliert. Zum Beispiel können
sie für
topische, parenterale, intravenöse,
intramuskuläre,
subkutane, intraokulare, intradermale, epidermale oder transdermale
Verabreichung formuliert werden. Die Substanzen können mit
jedwedem Vehikel vermischt werden, welches pharmazeutisch annehmbar
und geeignet für
den gewünschten
Weg der Verabreichung ist. Der/das pharmazeutische Träger oder
Verdünnungsmittel
für eine Injektion
kann zum Beispiel eine sterile oder isotonische Lösung, wie
Wasser zur Injektion oder physiologische Kochsalzlösung, oder
ein Trägerpartikel
für ballistische
Zuführung
sein.
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Die
Dosis der Substanzen kann gemäß verschiedenen
Parametern eingestellt werden, insbesondere gemäß des verwendeten Mittels;
des Alters, Gewichts und Zustands des zu behandelnden Patienten;
des verwendeten Verabreichungsmodus; der Schwere des zu behandelnden
Leidens; und dem erforderlichen klinischen Schema. Als eine Richtlinie
beläuft
sich die durch Injektion verabreichte Menge an Substanz geeigneterweise
auf 0,01 mg/kg bis 30 mg/kg, vorzugsweise 0,1 mg/kg bis 10 mg/kg.
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Die
beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sind lediglich
als eine Richtlinie beabsichtigt, da ein erfahrener Behandelnder
in der Lage sein wird, den optimalen Verabreichungsweg und die optimale Dosierung
für jeden
besonderen Patienten und jedes besondere Leiden ohne Weiteres zu
bestimmen.
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Die
Substanzen der Erfindung können
somit in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen
Körpers
oder in einem diagnostischen Verfahren, welches am menschlichen
Körper
ausgeführt wird,
verwendet werden. Insbesondere können
sie in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Zöliakie verwendet
werden. Die Erfindung sieht auch die Mittel zur Verwendung in einem
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder
Verhinderung von Zöliakie
vor.
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Das
Mittel der Erfindung kann unter Anwendung von standardmäßigen synthetischen
chemischen Techniken, wie durch Verwendung eines automatischen Synthesizers,
hergestellt werden. Das Mittel kann aus einem längeren Polypeptid, z. B. einem
Fusionsprotein, hergestellt werden, wobei dieses Polypeptid typischerweise
die Sequenz des Peptids umfaßt.
Das Peptid kann aus dem Polypeptid zum Beispiel durch Hydrolysieren
des Polypeptids, wie unter Verwendung einer Protease; oder durch
physikalisches Zerbrechen des Polypeptids abgeleitet werden. Das
Polynukleotid der Erfindung kann unter Anwendung von Standardtechniken, wie
durch Verwenden eines Synthesizers, hergestellt werden.
-
Pflanzenzellen und Pflanzen,
welche Mutanten-Gliadinproteine exprimieren oder Proteine exprimieren,
die Sequenzen umfassen, welche als Antagonisten wirken können
-
Die
Zelle der Erfindung kann eine Pflanzenzelle sein, wie eine Zelle
einer monokotyledonen Graminaceen-Spezies. Die Spezies kann eine
solche sein, deren Wildtypform Gliadine exprimiert, wie irgendeines
der hierin erwähnten
Gliadinproteine (einschließlich
Gliadinen mit einem beliebigen Grad an Homologie zu der hierin erwähnten SEQ
ID NR.: 3). Ein solches Gliadin kann Zöliakie beim Menschen hervorrufen.
Die Zelle kann von Weizen, Mais, Hafer, Roggen, Reis, Gerste, Tritikale,
Sorghum oder Zuckerrohr sein. Typischerweise stammt die Zelle aus
der Gattung Triticum, wie aestivum, spelta, polonicum oder monococcum.
-
Die
Pflanzenzelle der Erfindung ist typischerweise eine solche, welche
nicht ein Wildtyp-Gliadin
exprimiert (wie irgendeines der hierin erwähnten Gliadine, welche Zöliakie verursachen
können),
oder eine solche, welche nicht ein Gliadin exprimiert, das eine
Sequenz umfaßt,
die von einer T-Zelle, welche das Mittel erkennt, erkannt werden
kann. Wenn die Wildtyp-Pflanzenzelle
ein derartiges Gliadin exprimieren würde, dann kann sie somit manipuliert
werden, um die Expression eines solchen Gliadins zu verhindern oder
zu verringern oder um die Aminosäuresequenz
des Gliadins so zu verändern,
daß es
nicht länger
Zöliakie
hervorruft (typischerweise, indem nicht länger das Epitop der Erfindung
exprimiert wird).
-
Dies
kann beispielsweise durchgeführt
werden, indem Mutationen in 1, 2, 3 oder mehr oder alle solcher
Gliadingene in der Zelle eingebracht werden, beispielsweise in kodierende
oder nicht-kodierende (z. B. Promotor-)Regionen. Solche Mutationen
können
beliebige des Typs oder der Länge
an Mutationen sein, welche hierin (z. B. in Bezug auf homologe Proteine)
erörtert
werden. Die Mutationen können
in einer gerichteten Weise (z. B. unter Anwendung von ortsgerichteter
Mutagenese oder homologen Rekombinationstechniken) oder in einer
statistischen Weise (z. B. durch Verwendung eines Mutagens, und
dann typischerweise durch Selektieren hinsichtlich mutagenisierten
Zellen, welche das Gliadin (oder eine Gliadinsequenz, welche Zöliakie verursacht)
nicht länger
exprimieren) eingeführt
werden.
-
Im
Falle von Pflanzen oder Pflanzenzellen, welche ein Protein exprimieren,
das eine Sequenz umfaßt, die
in der Lage ist, als ein Antagonist zu wirken, kann eine derartige
Pflanze oder Pflanzenzelle ein Wildtyp-Gliadinprotein (z. B. ein
solches, welches Zöliakie
verursacht) exprimieren. Vorzugsweise werden durch die Gegenwart
der Antagonistensequenz verringerte Zöliakie-Symptome (wie etwa gar
keine Symptome) in einem Individuum, welches eine Nahrung aufnimmt,
die Protein aus der Pflanze oder Pflanzenzelle umfaßt, verursacht.
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Das
Polynukleotid, welches in der Pflanzenzelle vorhanden ist (oder
welches in selbige hinein transformiert wurde), wird im Allgemeinen
einen Promotor umfassen, der zum Exprimieren des Mutanten-Gliadinproteins
in der Pflanzenzelle in der Lage ist. Abhängig vom gewünschten
Expressionsmuster kann der Promotor konstitutiv, Gewebe- oder Stadium-spezifisch
und/oder induzierbar sein. Beispielsweise kann eine starke konstitutive
Expression in Pflanzen mit den CAMV-35S-, Rubisco-ssu- oder Histon-Promotoren
erhalten werden. Des Weiteren können
gewebespezifische oder stadiumspezifische Promotoren verwendet werden,
um die Expression von Protein der Erfindung auf bestimmte Gewebe
in einer transgenen Pflanze oder auf bestimmte Stadien in ihrer
Entwicklung zu lenken. Somit können
beispielsweise samenspezifische, wurzelspezifische, blattspezifische,
blütenspezifische
etc. Promotoren verwendet werden. Samenspezifische Promotoren schließen diejenigen
ein, welche von Dalta et al. (Biotechnology Ann. Rev. (1997), 3,
S. 269–296)
beschrieben wurden. Besondere Beispiele von samenspezifischen Promotoren
sind Napin-Promotoren (EP-A-0 255 378), Phaseolin-Promotoren, Glutenin-Promotoren,
Helianthenin-Promotoren (WO92/17580), Albumin-Promotoren (WO 98/45460), Oleosin-Promotoren
(WO98/45461) und ATS1- und ATS3-Promotoren
(PCT/US98/06798).
-
Die
Zelle kann in einer beliebigen Form vorliegen. Beispielsweise kann
sie eine isolierte Zelle, z. B. ein Protoplast, sein oder sie kann
ein Teil eines Pflanzengewebes, z. B. ein Callus, oder ein Gewebe
sein, welches aus einer Pflanze herausgeschnitten wurde, oder sie
kann Teil einer ganzen Pflanze sein. Die Zelle kann von jedwedem
Typ (z. B. von jeglichem Typ an Pflanzenteil) sein, beispielsweise
eine undifferenzierte Zelle, wie eine Callus-Zelle; oder eine differenzierte
Zelle, wie eine Zelle eines Typs, welcher in Embryonen, Pollen,
Wurzeln, Keimlingen oder Blättern
gefunden wird. Pflanzenteile schließen Wurzeln; Keimlinge; Blätter; und
Teile, die an der Reproduktion beteiligt sind, wie Pollen, Eierzellen,
Staubblätter,
Antheren, Petalen, Sepalen und andere Blütenteile, ein.
-
Die
Erfindung sieht ein Verfahren zum Erhalten einer transgenen Pflanzenzelle
vor, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem
Polynukleotid oder Vektor der Erfindung, um eine transgene Pflanzenzelle
zu erhalten. Jedwedes geeignete Transformationsverfahren kann angewandt
werden (im Falle von Weizen können
die Techniken, welche offenbart wurden in Vasil, V., et al., Biotechnology
10, 667–674 (1992),
angewandt werden). Bevorzugte Transformationstechniken schließen die
Elektroporation von Pflanzenprotoplasten und Partikel-Beschuss ein.
Die Transformation kann somit zu einem chimären Gewebe oder einer chimären Pflanze
führen,
in welcher/welchem einige Zellen transgen sind und einige nicht.
-
Die
Zelle der Erfindung oder so erhaltene Zelle kann durch im Fachgebiet
bekannte Techniken zu einer transgenen Pflanze regeneriert werden.
Diese können
die Verwendung von Pflanzenwachstumssubstanzen, wie Auxinen, Giberellinen
und/oder Cytokininen einschließen,
um das Wachstum und/oder die Teilung der transgenen Zelle zu stimulieren.
In ähnlicher
Weise können
Techniken, wie somatische Embryogenese und Meristem-Kultur angewandt
werden. Regenerationstechniken sind im Fachgebiet gut bekannt, und
Beispiele können
gefunden werden z. B. in
US 4
459 355 ,
US 4 536 475 ,
US 5 464 763 ,
US 5 177 010 ,
US 5 187 073 ,
EP 267 195 ,
EP 604 662 ,
EP 672 752 ,
US 4 945 050 ,
US 5 036 006 ,
US 5 100 792 ,
US 5 371 014 ,
US 5 478 744 ,
US 5 179 022 ,
US 5 565 346 ,
US 5 484 956 ,
US 5 508 468 ,
US 5 538 877 ,
US 5 554 798 ,
US 5 489 520 ,
US 5 510 318 ,
US 5 204 253 ,
US 5 405 765 ,
EP 442 174 ,
EP 486 233 ,
EP 486 234 ,
EP 539 563 ,
EP 674 725 , WO 91/02071 und WO 95/06128.
-
In
vielen derartigen Techniken ist ein Schritt die Bildung eines Callus,
d. h. eines Pflanzengewebes, welches sich vermehrende und/oder teilende
Zellen umfaßt.
Derartige Calli sind ein weiterer Aspekt der Erfindung, wie es auch
andere Typen von Pflanzenzellkulturen und Pflanzenteilen sind. So
sieht die Erfindung beispielsweise transgene Pflanzengewebe und
-teile vor, einschließlich
Embryonen, Meristemen, Samen, Keimlingen, Wurzeln, Stengeln, Blättern und
Blütenteilen.
Diese können
in dem Sinn chimär
sein, daß einige
ihrer Zellen Zellen der Erfindung sind und einige nicht. Transgene
Pflanzenteile und -gewebe, Pflanzen und Samen der Erfindung können von
jedweder der hierin erwähnten
Pflanzenspezies sein.
-
Regenerationsvorgehensweisen
werden typischerweise die Selektion von transformierten Zellen mittels
Markergenen beinhalten.
-
Der
Regenerationsschritt führt
zur Entstehung einer transgenen Pflanze der ersten Generation. Die
Erfindung sieht ebenfalls Verfahren zum Erhalten von transgenen
Pflanzen von weiteren Generationen aus dieser Pflanze der ersten
Generation vor. Diese sind als transgene Nachkommenschafts-Pflanzen
bekannt. Nachkommen-Pflanzen der zweiten, dritten, vierten, fünften, sechsten
und weiteren Generationen können
aus der transgenen Pflanze der ersten Generation durch jedwede im
Fachgebiet bekannte Methode erhalten werden.
-
Somit
sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalten einer
transgenen Nachkommenschafts-Pflanze vor, umfassend das Erhalten
einer transgenen Nachkommenschafts-Pflanze der zweiten Generation aus einer
transgenen Pflanze der ersten Generation der Erfindung, und gegebenenfalls
das Erhalten von transgenen Pflanzen von einer oder mehreren weiteren
Generationen aus der so erhaltenen Nachkommenschafts-Pflanze der
zweiten Generation.
-
Nachkommenschafts-Pflanzen
können
aus ihren Vorfahren von früheren
Generationen durch jedwede bekannte Technik hergestellt werden.
Insbesondere können
Nachkommenschafts-Pflanzen
hergestellt werden durch:
Erhalten eines transgenen Samens
aus einer transgenen Pflanze der Erfindung, welche einer früheren Generation
angehört,
danach Erhalten einer transgenen Nachkommen-Pflanze der Erfindung,
welche einer neuen Generation angehört, durch Aufziehen des transgenen
Samens; und/oder
klonale Vermehrung einer transgenen Pflanze
der Erfindung, welche einer früheren
Generation angehört,
wodurch eine transgene Nachkommenschafts-Pflanze der Erfindung erhalten
wird, welche einer neuen Generation angehört; und/oder
Kreuzen einer
transgenen Erstgenerations-Pflanze der Erfindung, welche einer früheren Generation
angehört, mit
einer anderen kompatiblen Pflanze, wodurch durch eine transgene
Nachkommenschafts-Pflanze der Erfindung erhalten wird, welche einer
neuen Generation angehört;
und gegebenenfalls
Erhalten von transgenen Nachkommenschafts-Pflanzen
von einer oder mehreren weiteren Generationen aus der so erhaltenen
Nachkommenschafts-Pflanze.
-
Diese
Techniken können
in einer beliebigen Kombination eingesetzt werden. Zum Beispiel
können
klonale Vermehrung und sexuelle Vermehrung an verschiedenen Punkten
in einem Verfahren angewandt werden, welches zur Entstehung einer
zur Kultivierung geeigneten transgenen Pflanze führt. Insbesondere kann eine wiederholte
Rückkreuzung
mit einem Pflanzen-Taxon mit landwirtschaftlich wünschenswerten
Merkmalen vorgenommen werden. Weitere Schritte der Entfernung von
Zellen aus einer Pflanze und der Regeneration neuer Pflanzen daraus
können
ebenfalls ausgeführt
werden.
-
Des
Weiteren können
weitere wünschenswerte
Merkmale durch Transformieren der Zellen, Pflanzengewebe, Pflanzen
oder Samen, an jedem geeigneten Stadium im oben stehenden Verfahren
eingeführt
werden, um wünschenswerte
kodierende Sequenzen einzubringen, welche von den Polynukleotiden
der Erfindung verschieden sind. Dies kann durch die hierin beschriebenen
Techniken für
die Einbringung von Polynukleotiden der Erfindung durchgeführt werden.
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Zum
Beispiel können
weitere Transgene unter denjenigen ausgewählt werden, welche für andere
Herbizidresistenz-Merkmale kodieren, z. B. Toleranz gegenüber: Glyphosat
(z. B. unter Verwendung eines EPSP-Synthase-Gens (z. B. EP-A-0 293
358) oder eines Gens für
Glyphosat-Oxidoreduktase (WO 92/000377)); oder Toleranz gegen Fosametin;
ein Dihalogenbenzonitril; Glufosinat, z. B. unter Verwendung eines
Gens für Phosphinothrycin-Acetyltransferase
(PAT) oder Glutamin-Synthase (vgl. EP-A-0 242 236); Asulam, z. B.
unter Verwendung eines Dihydropteroat-Synthase-Gens (EP-A-0 369
367); oder einen Sulphonylharnstoff, z. B. unter Verwendung eines
ALS-Gens); Diphenylether, wie Verwendung eines ALS-Gens); Diphenylether,
wie Acifluorfen oder Oxyfluorfen, z. B. unter Verwendung eines Protoporphyrogen-Oxidase-Gens);
ein Oxadiazol, wie Oxdiazon; ein zyklisches Imid, wie Chlorophthalim;
ein Phenylpyrazol wie TNP, oder ein Phenopylat- oder Carbamatanalog
davon.
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In ähnlicher
Weise können
Gene für
nützliche
Eigenschaften, welche von Herbizidtoleranz verschieden sind, eingeführt werden.
Zum Beispiel können
Gene für
Insektenresistenz eingeführt
werden, insbesondere Gene, welche Bacillus thuringiensis (Bt)-Toxine
kodieren. In gleicher Weise können
Gene für
Krankheitsresistenz eingeführt
werden, z. B. wie in WO 91/02701 oder WO 95/06128.
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Typischerweise
wird ein Protein der Erfindung in einer Pflanze der Erfindung exprimiert.
Abhängig
vom verwendeten Promotor kann diese Expression konstitutiv oder
induzierbar sein. In ähnlicher
Weise kann sie gewebe- oder stadiumspezifisch sein, d. h. auf ein
besonderes Pflanzengewebe (wie irgendeines der hierin erwähnten Gewebe)
oder Stadium in der Pflanzenentwicklung gerichtet sein.
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Die
Erfindung sieht ebenfalls Verfahren zum Erhalten von Getreideprodukten
durch Ernten und gegebenenfalls weitere Verarbeitung von transgenen
Pflanzen der Erfindung vor. Mit Getreideprodukt ist jedwedes nützliche
Produkt gemeint, welches aus einer Getreidepflanze erhältlich ist.
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Produkte welche Mutanten-Gliadinproteine
oder Proteine enthalten, welche Sequenz umfassen, die zur Wirkung
als ein Antagonist in der Lage ist
-
Die
Erfindung sieht ein Produkt vor, welches die Mutanten-Gliadinproteine
oder Protein, welches eine Sequenz umfaßt, die zur Wirkung als ein
Antagonist in der Lage ist, umfaßt. Dieses wird typischerweise
aus Pflanzenteilen von hierin erwähnten Pflanzen, welche solche
Proteine exprimieren, abgeleitet oder besteht daraus. Ein solches
Produkt kann direkt durch Ernten oder indirekt durch Ernten und
weitere Verarbeitung der Pflanze der Erfindung erhältlich sein.
Direkt erhältliche
Produkte schließen
Körner
ein. Alternativ dazu kann ein solches Produkt indirekt durch Ernten
und weiteres Verarbeiten erhältlich
sein. Beispiele von Produkten, welche durch weiteres Verarbeiten
erhältlich
sind, sind Mehl oder destillierte alkoholische Getränke; Nahrungsmittelprodukte,
hergestellt aus direkt erhaltenem oder weiterverarbeitetem Material,
z. B. gebackene Produkte (z. B. Brot), welche aus Mehl hergestellt
werden. Typischerweise handelt es sich um solche Nahrungsmittelprodukte,
welche von menschlichen Individuen verzehrbar und verdaubar sind
(d. h. nicht-toxisch sind und Nährstoffwert
besitzen).
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Im
Falle von Nahrungsmittelprodukten, welche das Protein umfassen,
das eine Antagonistensequenz umfaßt, kann das Nahrungsmittelprodukt
auch Wildtyp-Gliadin umfassen, aber vorzugsweise ist der Antagonist
in der Lage, eine (z. B. vollständige)
Reduktion der Zölakie-Symptome hervorzurufen,
nachdem ein solches Nahrungsmittel verzehrt worden ist.
-
Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
-
Beispiel 1
-
Wir
führten
eine Epitop-Kartierung bei Zöliakie
durch Verwendung eines Satzes von 51 synthetischen 15mer-Peptiden
durch, welche die vollständige
Sequenz eines vollständig
charakterisierten a-Gliadins, "A-Gliadin", überspannen
(siehe Tabelle 1). A-Gliadin-Peptide wurden auch individuell mit
tTG behandelt, um Produkte zu erzeugen, welche diejenigen nachahmen
könnten,
die in vivo3 hergestellt werden. Wir bemühten uns ebenfalls,
Zöliakie-Patienten
am Punkt der Initiation des Krankheits-Rückfalls zu untersuchen, um
die Möglichkeit
zu vermeiden, daß Epitop-"Spreading" oder -"Erschöpfung" stattgefunden haben
könnte,
wie es bei experimentellen Infektions- und Autoimmunkrankheiten
beschrieben wurde.
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Klinische und A-Gliadin-spezifische
T-Zell-Antworten bei einer 3- und 10-tägigen Brot-Herausforderung
-
In
einer Pilotuntersuchung erhielten zwei Subjekte mit nachlassender
Zöliakie,
definiert durch Abwesenheit von Serum-Anti-Endomysium-Antikörper (EMA),
bei einer glutenfreien Diät
täglich
vier Scheiben standardmäßiges glutenhaltiges
Weißbrot
zusätzlich
zu ihrer üblichen
glutenfreien Ernährung
zum Essen. Das Subjekt 1 lehnte Brot aufgrund von Unterleibschmerzen,
Mundgeschwüren
und mäßigem Durchfall
nach drei Tagen ab, aber Subjekt 2 fuhr damit 10 Tage lang bei einer
lediglich mäßigen Übelkeit
nach einer Woche fort. Der EMA wurde in Subjekt 2 eine Woche nach
der Brot-Herausforderung positiv, was anzeigte, daß das verwendete
Brot einen Zöliakie-Rückfall verursacht
hatte. In Subjekt 1 jedoch blieb der EMA bis zu zwei Monaten nach
der Brot-Herausforderung negativ. In beiden Subjekten verschwanden
die Symptome, welche mit der Brot-Herausforderung auftraten, innerhalb
von zwei Tagen nach Rückkehr
zu einer glutenfreien Ernährung.
-
PBMC-Antworten
in IFNγ-ELISPOT-Assays
auf A-Gliadin-Peptide wurden nicht vor oder während der Brot-Herausforderung
gefunden. Vom Tag nach dem Brot-Entzug aber (Tag 4) zeigte in Subjekt
1 ein einzelner Pool von 5 überlappenden
Peptiden, welche mit tTG behandeltes A-Gliadin 51–85 überspannten
(Pool 3), potente IFNg-Antworten (siehe Figur deltes A-Gliadin 51–85 überspannten
(Pool 3), potente IFNg-Antworten (siehe 1a). In
Subjekt 1 blieb die PBMC-IFNg-Antwort auf A-Gliadin-Peptid allein
auf den Pool 3 gerichtet und war am Tag 8 maximal. Die Dynamik und
Größe der Antwort
auf Pool 3 war ähnlich
zu derjenigen, welche von α-Chymotrypsin-verdautem
Gliadin hervorgerufen wurde. PBMC-IFNγ-Antworten
auf tTG-behandelten Pool 3 waren durchweg 5- bis 12-mal größer als
bei nicht mit tTG behandeltem Pool 3, und die Antworten auf mit α-Chymotrypsin
verdautes Gliadin waren 3- bis 10-mal größer, wenn mit tTG behandelt
worden war. In Subjekt 2 war mit tTG behandelter Pool 3 ebenfalls
der einzige immunogene Satz an A-Gliadin-Peptiden am Tag 8, aber
diese Antwort war schwächer
als bei Subjekt 1, wurde am Tag 4 nicht beobachtet, und ab Tag 11
war die Antwort auf Pool 3 vermindert, und andere tTG-behandelte
Pools von A-Gliadin-Peptiden riefen stärkere IFNα-Antworten hervor (siehe 1b).
-
Die
Pilotuntersuchung zeigte, daß die
anfängliche
T-Zell-Antwort in diesen Zöliakie-Subjekten gegen einen
einzigen tTG-behandelten A-Gliadin-Pool von fünf Peptiden gerichtet war und
ohne Weiteres im peripheren Blut gemessen wurde. Wenn die Antigen-Exposition
aber zehn anstatt drei Tage lang fortgesetzt wird, erscheinen T-Zell-Antworten
gegen andere A-Gliadin-Peptide, was konsistent mit einer Epitop-Ausbreitung
bzw. einem Epitop-Spreading
ist.
-
Zöliakie-spezifische IFN-g-Induktion
durch tTG-behandelte A-Gliadin-Peptide
-
In
fünf von
sechs weiteren Zöliakie-Subjekten
auf glutenfreier Diät
(siehe Tabelle 1) identifizierte eine Brot-Herausforderung während drei
Tagen tTG-behandelte Peptide in Pool 3 und insbesondere Peptide,
entsprechend 56–70
(12) und 60–75
(13), als die einzigen A-Gliadin-Komponenten,
welche IFNγ aus
PBMC hervorriefen (siehe 2). IL-10-ELISPOT-Assays,
welche parallel zu IFNγ-ELISPOT
durchgeführt
wurden, zeigten keine IL-10-Antwort auf die tTG-behandelten Peptide
12 oder 13. In einem Subjekt gab es keine IFNγ-Antworten auf irgendein A-Gliadin-Peptid
oder mit α-Chymotrypsin
verdautes Gliadin vor, während
oder bis zu vier Tage nach der Brot-Herausforderung. In keinem dieser
Zöliakie-Subjekte
wich der EMA-Zustand von der Basislinie ab, als bis zu zwei Monate
lang nach der Brot-Herausforderung
gemessen wurde.
-
PBMC
aus vier gesunden EMA-negativen Subjekten mit den HLA-DQ-Allelen α1·0501, β1·0201 (Alter 28–52, zwei
Frauen), welche drei Tage lang mit Brot nach Befolgung einer glutenfreien
Diät während eines
Monats herausgefordert worden waren, zeigten keine IFNγ-Antworten überhalb
der Negativkontrolle auf jedwedes der A-Gliadin-Peptide mit oder
ohne tTG-Behandlung. Somit war die Induktion von IFNγ in PBMC
gegen tTG-behandelte Pool3- und
A-Gliadin-Peptide 56–70
(12) und 60–75
(13) Zöliakie-spezifisch
(7/8 gegen 0/4, p < 0,01
mittels Chi-Quadrat-Analyse).
-
Feinkartierung
des minimalen A-Gliadin-T-Zell-Epitops
-
tTG-behandelte
Peptide, welche Trunkierungen von A-Gliadin 56–75 repräsentieren, enthüllten, daß die gleiche
Kernpeptidsequenz (QPQLP) für
die Antigenität
in allen der fünf
untersuchten Zöliakie-Subjekten essentiell
war (siehe 3). PBMS-IFNγ-Antworten auf tTG-behandelte Peptide,
welche diese Kernsequenz überspannten,
beginnend mit dem 7-mer PQPQLPY und mit zunehmender Länge, zeigten,
daß das
tTG-behandelte 17-mer QLQPFPQPQLPYPQPQS (A-Gliadin 57–73) eine
optimale Aktivität
in dem IFNγ-ELISPOT besaß (siehe 4).
-
Desamidierung-von Q65
durch tTG erzeugt das immundominante T-Zell-Epitop in A-Gliadin
-
Eine
HPLC-Analyse demonstrierte, daß die
tTG-Behandlung von A-Gliadin 56–75
ein einziges Produkt erzeugte, welches geringfügig später als das Stammform-Peptid
eluierte. Eine Aminosäuresequenzierung zeigte,
daß von
den sechs in A-Gliadin 56–75
enthaltenen Glutamin(Q)-Resten Q65 präferenziell durch tTG desamidiert
wurde (siehe 5). Die Bioaktivität von Peptiden,
welche seriellen Verlängerungen
von der A-Gliadin-62-68-Kernsequenz aus entsprachen, in welchen
Glutamat (E) das Q65 ersetzte, war äquivalent zu den gleichen Peptiden
mit Q65 nach tTG-Behandlung (siehe 4a). Die
Ersetzung von Q57 und Q72 durch E, zusammen oder allein, mit E65
verstärkte
nicht die Antigenität
des 17-mers in den drei untersuchten Zöliakie-Subjekten (siehe 6).
Q57 und Q72 wurden untersucht, weil Glutaminreste, denen ein Prolin
folgt, in Gliadinpeptiden nicht in vitro durch tTG desamidiert werden
(W. Vader et al., Proceedings 8th International Symposium Coeliac
Disease). Deshalb wurde das immundominante T-Zell-Epitop auf QLQPFPQPELPYPQPQS
eingegrenzt.
-
Die immundominante T-Zell-Epitop-Antwort
ist DQ2-restringiert und CD4-abhängig
-
In
zwei Zöliakie-Subjekten,
welche für
HLA-DQ α1·0501, β1·0201 homozygot
waren, blockierte monoklonaler Anti-DQ-Antikörper die ELISPOT-IFNγ-Antwort
auf tTG-behandeltes A-Gliadin 56–75, aber bei Anti-DP und -DR-Antikörpern war
dies nicht der Fall (siehe 7). Eine
mittels Anti-CD4- und Anti-CD8-Magnetkügelchen erfolgende Depletion
von PBMC aus zwei Zöliakie-Subjekten
zeigte, daß die
IFNγ-Antwort
auf tTG-behandeltes A-Gliadin 56–75 CD4-T-Zell-vermittelt ist.
-
Diskussion
-
In
dieser Untersuchung beschreiben wir eine ziemlich simple nahrungsmäßige Antigen-Herausforderung unter
Einsatz von standardmäßigem Weißbrot, um
eine vorübergehende
Population von CD4-T-Zellen im peripheren Blut von Zöliakie-Subjekten
hervorzurufen, die auf ein tTG-behandeltes A-Gliadin-l7-mer mit
der Sequenz: QLQPFPQPELPYPQPQS (Reste 57–73) antwortfähig sind.
Die Immunantwort auf A-Gliadin 56–75 (Q→E65) ist auf das Zöliakie-assoziierte
HLA-Allel DQ α1·0501, β1·0201 restringiert.
Die Wirkung von Gewebe-Transglutaminase
in vitro desamidiert selektiv Q65. Hervorgerufene Periphere-Blut-IFNg-Antworten auf synthetische
A-Gliadinpeptide mit der Substitution Q→E65 sind äquivalent zu tTG-behandelten
Q65-A-Gliadinpeptiden; beide stimulieren bis zu zehnmal mehr T-Zellen
im IFNg-ELISPOT als unmodifizierte Q65-A-Gliadinpeptide.
-
Wir
haben dieses Zöliakie-spezifische
T-Zell-Epitop absichtlich unter Anwendung von in vivo-Antigenherausforderung
und kurzfristigen ex vivo-Immunassays eingegrenzt, um die Möglichkeit
methodischer Artefakte zu vermeiden, welche bei der Verwendung von
T-Zell-Klonen in
einer Epitopkartierung auftreten können. Unsere Feststellungen
zeigen, daß Antworten
von T-Zellen aus peripherem Blut auf den Verzehr von Gluten rasch
aber kurzlebig sind und für
eine Epitopkartierung verwendet werden können. Die in vivo-Antigen-Herausforderung
hat ebenfalls gezeigt, daß es
eine zeitliche Hierarchie von Immunantworten auf A-Gliadinpeptide gibt;
mittels tTG modifiziertes A-Gliadin 57–73 ruft nicht nur die stärkste IFNg-Antwort
in PBMC hervor, sondern es handelt sich dabei auch um die erste
IFNg-Antwort, welche
auftritt.
-
Weil
wir nur Peptide, welche A-Gliadin überspannen, untersucht haben,
kann es andere Epitope in anderen Gliadinen von gleicher oder größerer Bedeutung
in der Pathogenese von Zöliakie
geben. Tatsächlich
ist die Peptidsequenz am Kern des Epitops in A-Gliadin, welche wir
identifiziert haben (PQPQLPY), mehreren anderen Gliadinen gemeinsam
(SwissProt- und Trembl-Zugangsnummern: P02863, Q41528, Q41531, Q41533, Q9ZP09,
P04722, P04724, P18573). Allerdings riefen A-Gliadinpeptide, von
denen früher
gezeigt wurde, Bioaktivität
bei Biopsie-Herausforderung und in vivo-Untersuchungen zu besitzen
(zum Beispiel: 31–43,
44–55 und
206–217)4, 5, keine IFNg-Antworten
in PBMC im Anschluss an eine drei Tage lange Brot-Herausforderung in
Zöliakie-Subjekten
hervor. Diese Peptide können "sekundäre" T-Zell-Epitope sein,
welche mit der Ausweitung der Immunantwort zustande kommen.
-
Beispiel 2
-
Der Effekt
von Substitutionen im immundominanten Epitop auf die T-Zell-Erkennung
-
Der
Effekt des Substituierens des Glutamats an der Position 65 im 57-73-A-Gliadin-Epitop
wurde durch Messen der Peripheren-Blut-Antworten gegen die substitutierten
Epitope in einem IFNγ-ELISPOT-Assay unter
Verwendung von synthetischen Peptiden (bei 50 μg/ml) bestimmt. Die Antworten
wurden in 3 Zöliakie-Subjekten
6 Tage nach Beginnen der Gluten-Herausforderung
(4 Scheiben Brot täglich
während
3 Tagen) gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 und der 8 gezeigt.
Wie ersehen werden kann, stimulierte die Substitution des Glutamats
zu Histidin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Prolin oder Arginin eine
Antwort, deren Größe geringer
als 10% der Größe der Antwort
auf das immundominante Epitop war. Somit konnte die Mutation von
A-Gliadin an dieser Position verwendet werden, um ein Mutantengliadin
mit verringerter oder fehlender Immunreaktivität herzustellen.
-
Beispiel 3
-
Testen der
Immunreaktivität
von äquivalenten
Peptiden aus anderen natürlich
vorkommenden Gliadinen
-
Die
Immunreaktivität
von äquivalenten
Peptiden aus anderen natürlich
vorkommenden Weizen-Gliadinen wurde unter Verwendung von synthetischen
Peptiden, entsprechend den natürlich
vorkommenden Sequenzen, welche dann mit Transglutaminase behandelt
wurden, untersucht. Diese Peptide wurden in einem ELISPOT auf die
gleiche Weise und mit PBMCs aus den gleichen Subjekten getestet,
wie in Beispiel 2 beschrieben. Mindestens fünf der Peptide zeigen eine
Immunreaktivität,
welche mit dem Peptid A-Gliadin 57–73 E65 (nach Transglutaminase-Behandlung)
vergleichbar war, was anzeigt, daß es wahrscheinlich ist, daß auch andere
Gliadinproteine in Weizen diese Zöliakie-spezifische Immunantwort
induzieren (Tabelle 4 und 9).
-
Methoden
-
- Subjekte: Die in der Untersuchungen verwendeten Patienten
besuchten eine Zöliakie-Klinik
in Oxford in Großbritannien.
Zöliakie
wurde auf der Grundlage der typischen Dünndarm-Histologie sowie der Normalisierung
der Symptome und der Dünndarm-Histologie
mit Gluten-freier Diät,
diagnostiziert.
- Gewebe-Typisierung: Die Gewebe-Typisierung wurde unter Verwendung
von DNA durchgeführt,
die aus EDTA-antikoagulierten peripherem Blut extrahiert worden
war. Die HLA- DQA
und -DQB-Genotypierung wurde mittels PCR unter Verwendung von sequenzspezifischen
Primermischungen6–8 durchgeführt.
- Anti-Endomysium-Antikörper-Assay:
EMA wurden durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Patientenserum,
welches 1:5 mit Affen-Oesophagus verdünnt worden war, gefolgt von
FITC-konjugiertem Ziege-Anti-Mensch-IgA, nachgewiesen. Das IgA wurde
vor EMA quantifiziert, und keines der Subjekte war IgA-defizient.
- Antigen-Herausforderung: Im Anschluss an eine glutenfreie Diät konsumierten
Zöliakie-Subjekte 4 Scheiben glutenhaltiges
Brot (50 g/Scheibe, Sainsbury's "standard white sandwich
bread") täglich 3
oder 10 Tage lang. EMA wurde die Woche vor und bis zu zwei Monate
nach Beginn der Brotherausforderung untersucht. Gesunde Subjekte,
welche vier Wochen lang eine glutenfreien Diät befolgt hatten, verzehrten
ihre übliche
Diät einschließlich vier
Scheiben glutenhaltigem Brot während
drei Tagen und kehrten dann weitere sechs Tage lang zur glutenfreien
Diät zurück.
- IFNγ-
und IL-10-ELISPOT: PBMC wurden aus 50–100 ml venösem Blut durch Ficoll-Hypaque-Dichtezentrifugation
präpariert.
Nach drei Waschungen wurden PBMC in vollständigen RPMI resuspendiert,
welches 10% hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum enthielt. ELI-SPOT-Assays auf Einzelzell-Sekretion
von IFNγ und
IL-10 wurden unter Verwendung kommerzieller Kits (Mabtech; Stockholm,
Schweden) mit 96-Vertiefungs-Platten (MAIP-S-45; Millipore, Bedford,
MA) gemäß den Anweisungen
des Herstellers (wie anderorts9 beschrieben) mit
2 – 5 × 105 (IFNγ)
oder 0,4 – 1 × 105 (IL-10) PBMC in jeder Vertiefung durchgeführt. Die
Peptide wurden in Doppelausfertigungs-Vertiefungen getestet, und
gereinigtes Proteinderivat aus Mycobacterium tuberculosis (PPD RT49)
(Serum Institute; Kopenhagen, Dänemark)
(20 μg/ml)
wurde in allen Assays als Positivkontrolle eingeschlossen.
- Peptide: Synthetische Peptide wurden von Research Genetics (Huntsville,
Alabama) erworben. Massenspektroskopie und HPLC bestätigten die
Authentizität
der Peptide und eine Reinheit von > 70%.
Der Verdau von Gliadin (Sigma; G-3375) (100 mg/ml) mit α-Chymotrypsin
(Sigma; C-3142), 200:1 (w/w), wurde bei Raumtemperatur in 0,1 M
NH4HCO3 mit 2 M
Harnstoff durchgeführt
und nach 24 Stunden durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 98°C angehalten. Nach Zentrifugation
(13000 g, 10 Minuten) wurde der Gliadinverdau-Überstand sterilfiltriert (0,2
mm). Der Verdau von Gliadin wurde mittels SDS-PAGE bestätigt und
die Proteinkonzentration wurde ermittelt. α-Chymotrypsin-verdautes Gliadin
(640 μg/ml)
und synthetische Gliadinpeptide (15-mere: 160 μg/ml, andere Peptide: 0,1 mM)
wurden individuell 2 Stunden lang mit tTG (Sigma; T-5398) (50 μg/ml) in
PBS + CaCl2, 1 mM, bei 37°C be handelt.
Peptide und Peptidpools wurden in sterile 96-Vertiefungs-Platten
aliquotiert und bei –20°C bis zur
Verwendung gefroren aufbewahrt.
- Aminosäuresequenzierung
von Peptiden: Umkehrphasen-HPLC wurde angewandt, um das Peptid zu
reinigen, welches aus der tTG-Behandlung von A-Gliadin 56–75 resultierte.
Ein einzelnes Produkt wurde identifiziert und einer Aminosäuresequenzierung
unterzogen (automatischer Sequenzierer vom Modell 494A, Applied Biosystems,
Foster City, Kalifornien). Die Sequenz von unmodifiziertem G56-75
wurde als: LQLQPFPQPQLPYPQPQSFP bestätigt, und tTG-behandeltes G56-75
wurde identifiziert als: LQLQPFPQPELPYPQPQSFP. Die Desamidierung
von Glutamylresten wurde als die Menge (pmol) an gewonnenem Glutamat
definiert, ausgedrückt
als ein Prozentsatz der vereinigten Menge an Glutamin und Glutamat,
welche in den Zyklen 2, 4, 8, 10, 15 und 17 der Aminosäuresequenzierung
gewonnen wurde. Die auf tTG zurückzuführende Desamidierung wurde
definiert als (% Desamidierung von Glutamin in dem tTG-behandelten
Peptid – %
Desamidierung in dem unbehandelten Peptid)/(100 – % Desamidierung in dem unbehandelten
Peptid.
- CD4/CD8- und HLA-Klasse II-Restriktion: Magnetische Anti-CD4-
oder Anti-CD8-beschichtete
Kügelchen
(Dynal, Oslo, Norwegen) wurden viermal mit RPMI gewaschen und dann
30 Minuten lang mit PBMC in komplettem RPMI, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes
humanes AB-Serum (5 × 106 Zellen/ml), auf Eis inkubiert. Die Kügelchen
wurden unter Verwendung eines Magneten entfernt, und die verbleibenden
Zellen wurden ausgezählt. Die
in vivo-HLA-Klasse-II-Restriktion der Immunantwort auf tTG-behandeltes
A-Gliadin 56–75
wurde durch Inkubieren von PBMC (5 × 106 Zellen/ml)
mit monoklonalen Anti-HLA-DR- (L243), -DQ- (L2) und -DP- (B7.21) -Antikörpern (10 μg/ml) bei
Raumtemperatur während
einer Stunde vor der Zugabe von Peptid festgestellt.
-
Beispiel 4
-
Mucosale Integrin-Expression
durch Gliadin-spezifische Lymphozyten des peripheren Blutes
-
Die
Wechselwirkung zwischen endothelialen und Lymphozyten-Adressinen
erleichtert das "Homing" bzw. "gerichtete Einnisten" von organspezifischen
Lymphozyten. Es sind viele Adressine bekannt. Das Heterodimer α4β7 ist
spezifisch für
die Lamina propria des Darms sowie andere mucosale Lymphozyten,
und αEβ7 ist spezifisch für intra-epitheliale Lymphozyten
in Darm und Haut. Ungefähr
30 % der CD4-T-Zellen des peripheren Blutes exprimieren α4β7 und
befinden sich angenommermaßen
im Übergang
zu einer mukosalen Stelle, wohingegen 5 % der T-Zellen des peripheren
Blutes αEβ7 exprimieren. Immunomagnetische Kügelchen, welche
mit für αE oder β7 spezifischem
Antikörper
beschichtet sind, depletieren PBMC von Zellen, welche jeweils αEβ7 oder αEβ7 und α4β7 exprimieren.
In Kombination mit dem ELISpot-Assay ermöglicht die Depletion mittels
immunomagnetischen Kügelchen
eine Bestimmung der Adressin-Expression gliadinspezifischer T-Zellen,
welche diese Zellen als ein Mukosa-Oberflächen-Homing aufweisend identifizieren
kann. Interessanterweise ist eine Gluten-Herausforderung in vivo
mit dem raschen Eintreten von CD4-T-Zellen in die Lamina propria
des Dünndarms
(nicht-intraepitheliale Stellen) assoziiert, wo über 90% der Lymphozyten α4β7 exprimieren.
-
Immunomagnetische
Kügelchen
wurden hergestellt und verwendet, um PBMC aus Zöliakie-Subjekten am Tag 6 oder 7 nach Beginnen
der dreitägigen
Glutenherausforderung zu depletieren. Eine FACS-Analyse zeigte,
daß αE-Kügelchen
ungefähr
50 % der positiven CD4-T-Zellen
depletierten bzw. herausfingen, wohingegen β7-Kügelchen
alle β7-positiven CD4-T-Zellen depletierten. Die Depletion von
PBMC unter Verwendung von CD4- oder β7-Kügelchen, aber nicht CD8- oder αE-Kügelchen,
eliminierte die Antworten im Interferon-Gamma-ELISpot. tTG-Gliadin- und PPD-Antworten
wurden durch CD4-Depletion eliminiert, aber durchwegs mittels Depletion
mit Integrin-spezifischen Kügelchen
beeinflusst.
-
Somit
exprimieren für
A-Gliadin 57–73
QE65 spezifische T-Zellen, welche nach der Gluten-Herausforderung bei
Zöliakie
induziert werden, das Integrin α4β7, welches auf Laminapropria-CD4-T-Zellen
im Dünndarm vorhanden
ist.
-
Beispiel 5
-
Optimale Länge des
T-Zell-Epitops
-
Frühere Daten
aus Tests von Peptiden mit 7 bis 17 Aminosäuren Länge, welche den Kern des dominanten
T-Zell-Epitops in A-Gliadin überspannten,
wiesen darauf hin, daß das
17mer, A-Gliadin 57–73
QE65, maximale Antworten im Interferon-Gamma-Elispot unter Anwendung
von mononuklearen Zellen aus peripherem Blut (PBMC) aus Zöliakie-Freiwilligen
6 Tage nach dem Beginn einer dreitägigen Gluten-Herausforderung induzierte.
-
Peptide,
welche Erweiterungen von der Kernsequenz des dominanten T-Zell-Epitops
in A-Gliadin repräsentierten,
wurden in dem IFN-Gamma-ELISPOT unter Verwendung von mononuklearen
Zellen aus peripherem Blut (PBMC) von Zöliakie-Freiwilligen 6 Tage
nach Beginn einer 3-tägigen
Gluten-Herausforderung bewertet (n = 4). Peptid 13: A-Gliadin 59–71 QE65
(13mer), Peptid 15: 58–72
QE65 (15mer), ..., Peptid 27: 52–78 QE65 (27mer).
-
Wie
in der 11 gezeigt, verstärkt die
Erweiterung der A-Gliadin 57–73
QE65-Sequenz die Antwort im IFNgamma-Elispot nicht wesentlich. Die
nachfolgende Beispiele charakterisieren die Agonisten- und Antagonisten-Aktivität von A-Gliadin
57–73
QE65 unter Verwendung von 17mer-Peptiden.
-
Beispiel 6
-
Vergleich von A-Gliadin
57–73
QE65 mit anderen DQ2-restringierten T-Zell-Epitopen bei Zöliakie
-
Dosis-Antwort-Untersuchungen
wurden unter Verwendung von Peptiden durchgeführt, entsprechend unmodifizierten
und Transglutaminase-behandelten Peptiden, welche T-Zell-Epitopen von Gluten-spezifischen T-Zell-Klonen
und -Linien aus Darm-Biopsien von Zöliakie-Subjekten entsprachen.
Die Antworten auf die Peptide wurden als Prozentsatz der Antwort
auf A-Gliadin 57–73
QE65 ausgedrückt.
Alle Subjekte waren HLA-DQ2+ (keines war DQ8+).
-
Die
Untersuchungen zeigen, daß A-Gliadin
57–73
QE65 das wirkungsvollste Gliadinpeptid für eine Induktion von Interferon-Gamma
im ELISpot-Assay unter Verwendung von Zöliakie-PBMC nach Gluten-Herausforderung ist
(siehe 12a–h und die Tabellen 5 und 6).
Die zweiten und dritten Epitope sind suboptimale Fragmente von größeren Peptiden,
d. h. A-Gliadin
57–73
QE65 und GDA4_WHEAT P04724-84-100 QE92. Das Epitop ist nur mäßig bioaktiv
(ungefähr
ein Zwanzigstel so aktiv wie A-Gliadin 57–73 QE65, nach Subtrahieren
des Leerwertes).
-
A-Gliadin
57–73
QE65 ist wirksamer als andere bekannte T-Zell-Epitope bei Zöliakie.
Es gibt 16 Polymorphismen von A-Gliadin 57–73 (einschließend die
Sequenz PQLPY) unter sequenzierten Gliadin-Genen, und deren Bioaktivität wird als
Nächstes überprüft.
-
Beispiel 7
-
Vergleich von für Gliadin
und A-Gliadin 57–73
QE65 spezifischen Antworten in peripherem Blut
-
Der
relative Beitrag des dominanten Epitops, A-Gliadin 57–73 QE65,
zur gesamten T-Zell-Antwort
auf Gliadin bei Zöliakie
ist ein kritischer Punkt. Pepsin-Trypsin- und Chymotrypsinverdautes
Gliadin sind herkömmlicherweise
als Antigen für
die Entwicklung von T-Zell-Linien
und -Klonen bei Zöliakie
verwendet worden. Es ist jedoch möglich, daß diese Proteasen durch bestimmte
Peptidepitope schneiden. Tatsächlich
erzeugt ein Chymotrypsin-Verdau von rekombinantem α9-Gliadin
das Peptid QLQPFPQPELPY, welches eine Trunkierung der optimalen
Epitopsequenz QLQPFPQPELPYPQPQS (siehe oben) ist. Die Transglutaminase-Behandlung erhöht wesentlich
die Wirksamkeit von Chymotrypsin-verdautem Gliadin in Proliferations-Assays
von Gliadin-spezifischen T-Zell-Klonen und -Linien. So kann Transglutaminase-behandeltes,
mit Chymotrypsin verdautes Gliadin (tTG-Gliadin) nicht ein ideales
Antigen sein, aber Antworten gegen diese Mischung können die "gesamte" Zahl an Lymphozyten
des peripheren Blutes, welche für
Gliadin spezifisch sind, approximieren bzw. näherungsweise angeben. Der Vergleich
von Antworten gegen A-Gliadin 57–73 QE65 und tTG-Gliadin im ELISpot-Assay
gibt eine Anzeige des Beitrags dieses dominanten Epitops zur insgesamten
Immunantwort auf Gliadin bei Zöliakie
und ist auch ein Maß des
Epitop-Spreading.
-
PBMC,
welche am Tag 6 oder 7 nach Beginnen einer Gluten-Herausforderung
in 4 Zöliakie-Subjekten gesammelt
wurden, wurden in Dosis-Antwort-Untersuchungen unter Verwendung
von Chymotrypsin-verdautem Gliadin +/– tTG-Behandlung untersucht
und mit ELISpot-Antworten
auf eine optimale Konzentration an A-Gliadin 57–73 QE65 (25 mcg/ml) verglichen.
Die tTG-Behandlung von Gliadin verstärkte PBMC-Antworten im ELISpot
ungefähr
10fach (tTG war vergleichbar zum Leerwert, wenn es allein getestet
wurde) (siehe 13a–c). In den vier untersuchten
Zöliakie-Subjekten
rief A-Gliadin 57–73
QE65 (25 mcg/ml) Antworten zwischen 14 und 115 % von denjenigen
von tTG-Gliadin (500 mcg/ml) hervor, und, umso größer die
Antwort auf A-Gliadin 57–73
QE65 ist, desto größer ist
der Anteil, den sie an der tTG-Gliadin-Antwort repräsentierte.
-
Verhältnismäßig beschränkte bzw.
wenige Daten legen nahe, daß A-Gliadin
57–73
QE65-Antworten in
einigen Subjekten vergleichbar zu tTG-Gliadin wären. Das Epitop-Spreading,
welches mit fortgeschritteneren Anti-Gliadin-T-Zell-Antworten assoziiert
ist, kann für
den kleineren Beitrag von A-Gliadin 57–73 QE65 an "gesamten" Gliadin-Antworten
im peripheren Blut in manchen Individuen verantwortlich sein. Das
Epitop-Spreading kann in Individuen mit weniger strengen glutenfreien
Diäten
aufrechterhalten bleiben.
-
Beispiel 8
-
Definition von Gliadinpeptiden,
welche bei Zöliakie
bioaktiv sind: Polymorphismen von A-Gliadin 57–73
-
Überlappende
15mer-Peptide, überspannend
die vollständige
Sequenz von A-Gliadin, wurden überprüft, um die
immundominante Sequenz bei Zöliakie
zu identifizieren. A-Gliadin war das erste vollständig sequenzierte
Alpha-Gliadin-Protein und -Gen, aber ist eines von ungefähr 30–50 verwandten
Alpha-Gliadin-Proteinen in Weizen. Fünfundzwanzig verschiedene Alpha- Gliadin-Gene sind
mittels Durchsuchen von Proteindatenbanken, Swiss-Prot und TREMBL,
identifiziert worden, wobei weitere 8 Alpha-Gliadine beschrieben
wurden. Innerhalb dieser 25 Alpha-Gliadine sind 16 unterschiedliche
Polymorphismen der Sequenz, welche A-Gliadin 57–73 entspricht, enthalten (siehe
Tabelle 7).
-
Synthetische
Peptide, welche diesen 16 Polymorphismen entsprechen, in einer unmodifizierten
Form, nach Behandlung mit Transglutaminase in vitro, sowie mit an
der Position 10 substituiertem Glutamat (äquivalent zu QE65 in A-Gliadin
57–73),
wurden unter Verwendung von PBMC aus Zöliakie-Subjekten, normalerweise
im Anschluss an eine glutenfreie Diät, am Tag 6 oder 7 nach Glutenherausforderung
in Interferon-Gamma-ELISpot-Assays untersucht. Glutamat-substituierte
Peptide wurden bei drei Konzentrationen verglichen (2,5, 25 und
250 mcg/ml), unmodifiziertes Peptid und Transglutaminase-behandelte
Peptide wurden nur bei 25 mcg/ml untersucht. Die Bioaktivität wurde
ausgedrückt
als Prozentsatz der Antwort, assoziiert mit A-Gliadin 57–73 QE65,
25 mcg/ml, in individuellen Subjekten (n = 4) (siehe 14).
-
Die
Bioaktivität
von "Wildtyp"-Peptiden wurde durch
Behandlung mit Transglutaminase wesentlich erhöht (> 5fach). Die Transglutaminase-Behandlung
von Wildtyp-Peptiden führte
zu einer ähnlichen
Bioaktivität wie
jener der gleichen Peptide, welche mit Glutamat an Position 10 substituiert
waren. Die Bioaktivitäten
von fünf
Glutamant-substituierten Peptiden (B, C, K, L, M) waren > 70 % von derjenigen
von A-Gliadin 57–73
QE65 (A), aber keines war signifikant mehr bioaktiv als A-Gliadin
57–73
QE65. PBMC-Antworten auf Glutamat-substituierte Peptide bei Konzentrationen
von 2,5 und 250 mcg/ml waren zu denjenigen bei 25 mcg/ml vergleichbar.
Sechs Glutamat-substituierte Gliadinpeptide (H, I, J, N, O, P) waren < 15 % so bioaktiv
wie A-Gliadin 57–73 QE65.
Die anderen Peptide wiesen eine intermediäre Bioaktivität auf.
-
Mindestens
sechs Gliadin-abgeleitete Peptide sind hinsichtlich der Wirksamkeit
gleichwertig zu A-Gliadin 57–73
QE65 nach Modifikation durch Transglutaminase. Relativ nicht-bioaktive
Polymorphismen von A-Gliadin 57–73
existieren ebenfalls. Diese Daten zeigen, daß eine Transglutaminase-Modifikation
von Peptiden aus mehreren Gliadinen von Tricetum aestivum, T. uartu
und T. spelta zum Hervorbringen des immundominanten T-Zell-Epitops
bei Zöliakie
in der Lage sein können.
-
Die
genetische Modifikation von Weizen, um einen nicht-zöliakisch-toxischen
Weizen zu erzeugen, erfordert wahrscheinlich die Entfernung oder
Modifikation von mehreren Gliadin-Genen. Die Erzeugung von Weizen, welcher
Gliadine oder andere Proteine oder Peptide enthält, welche Sequenzen beinhalten,
die "abgewandelte
Peptidligand"-Antagonisten
von A-Gliadin 57–73
definieren, ist eine alternative Strategie zur Erzeugung von genetisch
modifiziertem Weizen, welcher eher therapeutisch als "nicht-toxisch" bei Zöliakie-Erkrankung
ist.
-
Beispiel 9
-
Eingrenzen der Kern-Epitop-Sequenz:
-
Der
Vergleich von Peptiden, welche Trunkierungen von A-Gliadin 56–75 vom
N- und C-Terminus
aus entsprachen, wies darauf hin, daß die Kernsequenzen des T-Zell-Epitops
PELPY ist (A-Gliadin 64–68).
Versuche, Nicht-Agonisten und Antagonisten zu definieren, werden
sich auf Varianten von A-Gliadin konzentrieren, welche an Resten
substituiert sind, die wesentlich zu seiner Bioaktivität beitragen.
-
Peptide,
welche A-Gliadin 57–73
QE65 entsprechen, bei welchem Alanin (15)
oder Lysin (16) für die Reste 57 bis 73 substituiert
ist, wurden im IFN-gamma-ELISPOT unter Verwendung von mononuklearen Zellen
aus peripherem Blut (PBMC) aus Zöliakie-Freiwilligen 6 Tage
nach Beginn einer dreitägigen
Glutenherausforderung verglichen (n = 8) [BL steht für Leerprobe,
E ist A-Gliadin 57–73
QE65: QLQPFPQPELPYPQPQS].
-
Es
wurde festgestellt, daß Reste,
welche A-Gliadin 60–70
QE65 (PFPQPELPYPQ entsprachen, wesentlich zur Bioaktivität in A-Gliadin
57–73
QE65 beitragen. Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65, welche an den Positionen
60–70
substituiert sind, werden in einem 2-Schritt-Vorgehen untersucht. Anfänglich wird
A-Gliadin 57–73
QE65, welches an den Positionen 60–70 unter Verwendung von 10
verschiedenen Aminosäuren mit
gegensätzlichen
Eigenschaften substituiert ist, überprüft. Eine
zweite Gruppe von A-Gliadin 57–73 QE65-Varianten
(substituiert mit allen anderen natürlich vorkommenden Aminosäuren außer Cystein
an Positionen, welche sich als gegenüber Modifikation empfindlich
erweisen) werden in einer zweiten Runde überprüft.
-
Beispiel 10
-
Agonisten-Aktivität von substituierten
Varianten von A-Gliadin 57–73
QE65
-
A-Gliadin
60–70
QE65 ist die Kernsequenz des dominanten T-Zell-Epitops in A-Gliadin.
Antagonisten- und Nicht-Agonisten-Peptidvarianten dieses Epitops
werden mit hoher Wahrscheinlichkeit durch Modifikation dieser Kernsequenz
erzeugt. Zu Anfang wird A-Gliadin
57–73
QE65, welches an den Positionen 60–70 unter Verwendung von 10
unterschiedlichen Aminosäuren
mit gegensätzlichen
Eigenschaften substituiert ist, im IFN-gamma-ELISPOT unter Verwendung von PBMC
aus Zöliakie-Subjekten
6 Tage nach Beginnen einer 3-tägigen
Glutenherausforderung getestet. Eine zweite Gruppe von A-Gliadin tenherausforderung
getestet. Eine zweite Gruppe von A-Gliadin 57–73 QE65-Varianten (substituiert
mit allen anderen natürlich
vorkommenden Aminosäuren,
außer
Cystein) an den Positionen 61–70
wurde ebenfalls überprüft. Beide
Gruppen von Peptiden (alle bei 50 mcg/ml, in zweifacher Ausfertigung)
wurden unter Verwendung von PBMC aus 8 Subjekten untersucht und
mit dem unmodifizierten Peptid verglichen (20 Wiederholungsansätze je Assay).
Frühere
Untersuchungen zeigen, daß die
optimale Konzentration für
A-Gliadin 57–73
QE65 in diesem Assay zwischen 10 und 100 mcg/ml liegt.
-
Die
Ergebnisse werden als mittlere Antwort in "Spot-Forming-Cells" (95 % Konfidenz-Intervall) als Prozentsatz der mittleren
A-G 57–73
QE65-Antwort in jedem Individuum ausgedrückt. Ungepaarte t-Tests werden verwendet,
um die ELISPOT-Antworten von modifizieren Peptiden mit A-G 57–73 QE65
zu vergleichen. Super-Agonisten wurden als bei einem Signifikanzniveau
von p < 0,01 eine
größere Antwort
denn A-G 57–73 QE65
aufweisend; partielle Agonisten als bei einem Signifikanzniveau
von p < 0,01 eine
geringere Antwort denn A-G 57–73
QE65 aufweisend, und Nicht-Agonisten als nicht signifikant unterschiedlich
(p > 0,01) vom Leerwert
(Puffer ohne Peptid) definiert. Peptide mit einer Agonistenaktivität von 30
% oder weniger von derjenigen von A-Gliadin 57–73 QE65 wurden als "geeignete" partielle oder Nicht-Agonisten
zur Untersuchung hinsichtlich antagonistischer Aktivität betrachtet
(siehe Tabelle 8 und 17–27).
-
Die
IFNgamma-ELISPOT-Antwort von PBMC auf A-Gliadin 57–73 QE65
ist auf molekularer Ebene hochspezifisch. Prolin an der Position
64 (P64), Glutamtat bei 65 (E65) und Leucin an der Position 66 (L66), und
zu einem geringeren Ausmaß Q63,
P67, Y68 und P69, sind besonders empfindlich gegenüber Modifikation.
Die Substitutionen Y61 und Y70 erzeugen beide Super-Agonisten mit
einer um 30 % größeren Bioaktivität als das
Elternpeptid, wahrscheinlich durch Verstärkung der Bindung an HLA-DQ2,
da das Motiv für
dieses HLA-Molekül
eine Präferenz
für sperrige
hydrophobe Reste an den Positionen 1 und 9 zeigt. Achtzehn Nicht-Agonisten-Peptide
wurden identifiziert. Die Bioaktivitäten der Varianten (50 mcg/ml):
P65, K64, K65 und Y65 (Bioaktivität 7–8 %) waren vergleichbar zum
Leerwert (7 %). Insgesamt 57 mutierte Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65
waren 30 % oder weniger so bioaktiv wie A-Gliadin 57–73 QE65.
-
Die
molekulare Spezifität
der Peripheres-Blut-Lymphozyten(PBL)-T-Zell-Antwort auf das dominante Epitop,
A-Gliadin 57–73
QE65, ist unter HLA-DQ2+-Zöliakie-Subjekten
durchweg reproduzierbar und ist für eine begrenzte Zahl an Aminosäuren in
den 7 Kern-Aminosäuren hochspezifisch.
Bestimmte Einzel-Aminosäure-Varianten
von A-Gliadin 57–73
QE65 sind in konsistenter Weise Nicht-Agonisten in allen HLA-DQ2+-Zöliakie-Subjekten.
-
Beispiel 11
-
Antagonisten-Aktivität von substituierten
Varianten
-
Die
Homogenität
der PBL-T-Zell-Antwort auf A-Gliadin 57–73 QE65 bei HLA-DQ2+-Zöliakie legt nahe, daß abgewandelte
Peptid-Liganden (APL), welche zum Antagonismus in PBMC ex vivo fähig sind,
existieren können,
selbst obwohl es wahrscheinlich ist, daß die PBL-T-Zell-Antwort poly-
oder oligoklonal ist. APL-Antagonisten sind im Allgemeinen schwache
Agonisten. 57 Einzel-Aminosäure-substituierte
Varianten von A-Gliadin 57–73
QE65 mit einer Agonistenaktivität
von 30 % oder weniger sind identifiziert worden und sind geeignete
Kandidaten als APL-Antagonisten. Darüber hinaus sind auch bestimmte
schwachbioaktive natürlich
vorkommende Polymorphismen von A-Gliadin 57–73 QE65 identifiziert worden
(siehe unten stehend) und können "natürlich vorkommende" APL-Antagonisten
sein. Es ist ebenfalls vorgeschlagen worden, daß eine Kompetition um die Bindung
von MHC gleichfalls die antigen-spezifische T-Zell-Immunantwort
antagonisieren kann. Somit können
Nicht-Gliadin-Peptide, welche keine IFNgamma-Antworten in zöliakischen
PBMC nach Glutenherausforderung induzieren aber bekanntermaßen an HLA-DQ2
binden, in der Lage zum Reduzieren von T-Zell-Antworten sein, welche
durch A-Gliadin 57–73
QE65 hervorgerufen wurden. Zwei Peptide, welche stark an HLA-DQ2
binden, sind HLA-Klasse 1 α 46–60 (HLA
1a) (PRAPWIEQEGPEYW) und Thyroid-Peroxidase (tp) 632–645Y (IDVWLGGLLAENFLPY).
-
Eine
gleichzeitige Zugabe von Peptid (50 μg/ml) oder Puffer und A-Gliadin
57–73
QE65 (10 μg/ml)
in IFNgamma-ELISPOT unter Verwendung von PBMC aus Zöliakie-Freiwilligen
6 Tage nach Beginnen einer 3-tägigen
Glutenherausforderung (n = 5) wurde durchgeführt. Die Ergebnisse wurden
als Antwort mit Peptid plus A-G 57–73 QE65 (Mittelwert von zweifachen
Ausfertigungen) als Prozentsatz der Antwort mit Puffer plus A-G 57–73 QE65
(Mittelwert von 20 Wiederholungsansätzen) ausgedrückt (siehe
Tabelle 9).
-
Vier
Einzelaminosäure-substituierte
Varianten von A-Gliadin 57–73
QE65 verringern die Interferon-gamma-PBMC-ELISPOT-Antwort auf A-Gliadin
57–73
QE65 (p < 0,01)
um zwischen 25 % und 28 %, 13 andere Peptidevarianten verringern
die ELISPOT-Antwort um zwischen 18 % und 24 % (p < 0,06). Der HLA-DQ2-Binder
Thyroid-Peroxidase (tp) 632–645Y
verringert PBMC-Interferon-gamma-Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65
um 31 % (p < 0,0001),
aber der andere HLA-DQ2-Binder, HLA-Klasse 1 α 46–60, verändert die Antworten nicht (siehe
Tabelle 9). Das Peptid, welches einem Transglutaminase-modifizierten
Polymorphismus von A-Gliadin 57–73
entspricht, SwissProt-Zugangsnummer: P04725 82–98 QE90 (PQPQPFPPELPYPQPQS),
verringert die Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 um 19 % (p < 0,009) (siehe Tabelle
11).
-
Die
Interferon-Gamma-Antworten von PBMC auf A-Gliadin 57–73 QE65
in ELISPOT-Assays
werden durch Co-Verabreichung von bestimmten Einzelaminosäure-A-Gliadin
57–73
QE65-Varianten, einem Polymorphismus von A-Gliadin 57–73 QE65
und einem nichtverwandten Peptid, welches bekanntermaßen HLA-DQ2
bindet, im fünffachen Überschuss,
verringert. Diese Feststellung legt nahe, daß abgewandelte Peptid-Ligand-Antagonisten
von A-Gliadin 57–73
QE65 existieren. Nicht nur vermeintliche APL-Antagonisten sondern
auch bestimmte Peptide, welche HLA-DQ2 binden, verringern effektiv
die PBL-T-Zell-Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65.
-
Diese
Feststellungen unterstützen
zwei Strategien zur Unterbrechung der T-Zell-Antwort auf das dominante
A-Gliadin-Epitop bei HLA-DQ2+-Zöliakie.
- 1. Optimierung von APL-Antagonisten durch Substituieren
von Aminosäuren
an mehr als einer Position (64–67)
zur Verwendung als "traditionelle" Peptid-Pharmazeutika
oder für
die spezifische genetische Modifikation von Gliadin-Genen in Weizen.
- 2. Verwendung von Hochaffinitäts-HLA-DQ2-Bindungspeptiden
zur kompetitiven Inhibierung der Präsentation von A-Gliadin 57–73 QE65
in Assoziation mit HLA-DQ2.
-
Diese
zwei Vorgehensweisen können
wechselseitig kompatibel sein. Super-Agonisten wurden durch Ersetzen
von F6l und Q70 durch Tyrosinreste erzeugt. Es ist wahrscheinlich,
daß diese
Super-Agonisten eher aus einer verbesserten Bindung an HLA-DQ2 resultierten
als aus dem verstärkten
Kontakt mit dem T-Zell-Rezeptor. Durch Kombinieren dieser Modifikationen
mit anderen Substitutionen, welche mäßig effektive APL-Antagonisten
erzeugen, könnte
man den inhibitorischen Effekt von substituierten A-Gliadin 57–73 QE65-Varianten
wesentlich verstärken.
-
Beispiel 12
-
Entwicklung von Interferon-gamma-ELISpot
unter Verwendung von PBMC und A-Gliadin 57–73 QE65 und P04724 84–100 QE92
als Diagnose für
Zöliakie:
Definition von Immun-Resnonsivität bei neu
diagnostizierter Zöliakie
-
Die
Induktion der Responsivität
gegenüber
dem dominanten A-Gliadin-T-Zell-Epitop in PBMC, welche im Interferon-gamma-ELISpot
gemessen wird, folgt auf eine Glutenherausforderung in fast allen
DQ2+-Zöliakie-Subjekten,
welche eine strenge langfristige glutenfreie Diät (GFD) befolgten, aber nicht
in gesunden DQ2+-Subjekten nach 4 Wochen langem Befolgen einer strengen
GFD. Antworten auf A-Gliadin 57–73
QE65 sind in PBMC von Zöliakie-Subjekten vor der
Glutenherausforderung nicht messbar, und Pilot-Daten haben nahegelegt,
daß diese
Antworten in PBMC von unbehandelten Zöliakie-Patienten nicht gemessen
werden konnten. Diese Daten legen nahe, daß bei Zöliakie die Immunresponsivität gegenüber A-Gliadin
57–73QE65
im Anschluss an Antigen-Ausschluss (GFD) wiederhergestellt wird.
Wenn ein diagnostischer Test unter Verwendung des ELISpot-Assays
und von PBMC entwickelt werden soll, ist es wünschenswert, die Dauer einer
GFD zu definieren, welche erforderlich ist, bevor die Glutenherausforderung
in der Lage ist, Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 und andere immunreaktive
Gliadinpeptide im Blut zu induzieren.
-
Neu
diagnostizierte DQ2+-Zöliakie-Subjekte
wurden aus dem ambulanten Gastroenterologie-Service rekrutiert. PBMC wurden präpariert
und in Interfon-gamma-ELISpot-Assays getestet, bevor bei den Subjekten mit
einer GFD begonnen wurde, sowie eine oder zwei Wochen nach Beginnen
der GFD. Darüber
hinaus wurde eine Glutenherausforderung (3 Tage lang Verzehr von
4 Scheiben standardmäßigem Weißbrot, 200
g/Tag) eine oder zwei Wochen nach Beginn der GFD durchgeführt. PBMC
wurden präpariert
und am Tag 6 nach Beginn der Glutenherausforderung getestet. A-Gliadin
57–73
QE65 (A), P04724 84–100
QE92 (B) (allein und kombiniert) und A-Gliadin 57–73 QP65
(P65) (nicht-bioaktive Variante, siehe oben) (alle 25 mcg/ml) wurden untersucht.
-
Alle
außer
einem neu diagnostizierten Zöliakie-Patienten
waren DQ2+ (einer war DQ8+) (n = 11). PBMC aus neu diagnostizierten
Zöliakie-Patienten,
welche unbehandelt waren, oder nach 1 oder 2 Wochen im Anschluss
an GFD, zeigten keine Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 und P04724 84–100 QE92
(allein oder kombiniert), welche nicht signifikant unterschiedlich
zu Leerprobe oder A-Gliadin 57–73
QP65 waren (n = 9) (siehe 28). Eine
Glutenherausforderung in Zöliakie-Patienten,
welche lediglich eine Woche lang einer GFD folgten, verstärkte die
Antworten auf A-Gliadin 57–73
QE65 oder P04724 84–100
QE92 (allein oder kombiniert) nicht wesentlich. Eine Glutenherausforderung
2 Wochen nach Beginnen der GFD jedoch induzierte Antworten auf A-Gliadin
57–73
QE65 und P04724 84–100
QE92 (allein oder kombiniert), welche signifikant größer als
bei der nicht-bioaktiven Variante A-Gliadin 57–73 QP65 und der Leerprobe
waren. Obwohl diese Antworten nach Glutenherausforderung nach 2
Wochen substanziell waren, erschienen sie geringer zu sein als in
Subjekten > 2 Monate
nach Beginn der GFD. Antworten auf A-Gliadin 57–73 QE65 allein waren äquivalent
oder größer als
Antworten auf P04724 84–100
QE92 allein oder bei Vermischung mit A-Gliadin 57–73 QE65.
Keines der Subjekte erlitt problematische Symptome bei der Glutenherausforderung.
-
Die
Immun-Responsivität
(wie gemessen in PBMC nach Glutenherausforderung) gegenüber A-Gliadin wird
2 Wochen nach Beginnen der GFD partiell wiederhergestellt, was impliziert,
daß eine "Immun-Nicht-Responsivität" gegenüber diesem
dominanten T-Zell-Epitop bei unbehandelter Zöliakie und mindestens eine
Woche lang nach Beginn der GFD vorherrscht. Der optimale Zeitpunkt
eines diagnostischen Tests für
Zöliakie
unter Anwendung von Glutenherausforderung und Messung von Antworten
auf A-Gliadin 57–73
QE65 im ELISpot-Assay liegt bei mindestens 2 Wochen nach dem Beginnen
einer GFD.
-
Interferon-gamma-sezernierende-T-Zellen,
welche für
A-Gliadin 57–73
QE65 spezifisch sind, können nicht
im peripheren Blut in unbehandelten Zöliakiepatienten gemessen werden
und können
nur durch Glutenherausforderung nach mindestens 2 Wochen GFD (Antigenausschluss)
induziert werden. Deshalb ist die Zeitgebung eines diagnostischen
Tests unter Anwendung dieser Methodik ausschlaggebend, und weitere
Untersuchungen werden für
seine Optimierung benötigt.
Diese Feststellungen sind konsistent mit einer funktionellen Anergie
von T-Zellen, welche für
das dominante Epitop A-Gliadin 57–73 QE65 spezifisch sind, welche
durch Antigenausschluss (GFD) rückgängig gemacht
wird. Dieses Phänomen
ist zuvor nicht bei einer Krankheit des Menschen aufgezeigt worden
und spricht für
die Möglichkeit,
daß bei
Zöliakie
eine T-Zell-Anergie mit einer Peptidtherapie induzierbar sein kann.
-
Literaturbezugsstellen
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-
Tabelle
1. Proteinsequenz von A-Gliadin (basierend auf Aminosäure-Sequenzierung)
-
-
-
Tabelle
5. T-Zell-Epitope, welche bei Zöliakie
beschrieben wurden
-
- NS: in Originalveröffentlichung
nicht angegeben, iTCC: intestinaler T-Zell-Klon, iTCL: intestinale
polyklonale T-Zellinie, bTCC: T-Zell-Klon aus peripherem Blut
- * Alle Peptide sind die Produkte aus Transglutaminase-Modifizierung
von Wildtyp-Gluten-Peptiden, außer
dem vierten und sechsten Peptid.
-
Tabelle
6. Relative Bioaktivität
von Gliadin-T-Zell-Epitopen in Zöliakie-PBMC
nach Gluten-Herausforderung
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- * Sequenz bezieht sich auf diejenige von Transglutaminase-modifiziertem
Peptid und das T-Zell-Epitop. Wildtyp ist das unmodifizierte Gliadinpeptid.
Daten aus 4 Patienten. Die Leerprobe war 5 (1) %.
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Tabelle
7. Polymorphismen von A-Gliadin 57–73 A.
Sequenzen, abgeleitet aus "Nordic
Autumn"-Weizenstamm
Mjoelner
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B.
SWISSPROT und TREMBL-Scan (10.12.99) nach Gliadinen, welche die
Sequenz XXXXXXXPQLPYXXXXX enthalten
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Tabelle
8. Bioaktivität
von substituierten Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65 (Subst) im Vergleich
zu unmodifiziertem A-Gliadin 57–73
QE65 (G) (Mittelwert 100 %, CI 97–104) und Leerprobe (kein Peptid,
b1) (Mittelwert 7,1 %, CI: 5,7–8,5)
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Tabelle
9. Antagonismus der Interferon-gamma-ELISPOT-Antwort auf A-Gliadin
57–73
QE65 durch substituierte Varianten von A-Gliadin 57–73 QE65
(Subst) (P ist das Signifikanzniveau im ungepaarten t-Test). Die Agonisten-Aktivität (% Agonist)
von Peptiden im Vergleich zu A-Gliadin 57–73 QE65 ist ebenfalls gezeigt.
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Tabelle
10. Inhibition der Interferon-gamma-ELISPOT-Antwort auf A-Gliadin
57–73
QE65 durch Peptide, welche bekanntermaßen HLA-DQ2 binden (P ist das
Signifikanzniveau im ungepaarten t-Test).
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Tabelle
11. Antagonismus der Interferon-gamma-ELISPOT-Antwort auf A-Gliadin
57–73
QE65 durch natürlich vorkommende
Polymorphismen von A-Gliadin 57–73
QE65 (P ist das Signifikanzniveau in einem ungepaartem t-Test).
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