MXPA02003295A - Epitope de diagnostico y terapeutico y planta transgenica. - Google Patents

Epitope de diagnostico y terapeutico y planta transgenica.

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Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo de diagnosis de un padecimiento coeliaco, o susceptibilidad a padecimiento coeliaco, en un individuo que comprende: (a) poner en contacto una muestra a partir del hospedero con un agente seleccionado de (i) el epitope que comprende una secuencia la cual es: SEC ID NO: 1 o 2, o una secuencia equivalente a partir de un homologo que se origina naturalmente de la gliadina representada por la SEC ID NO:3, (ii) un epitope que comprende la secuencia que comprende: SEC ID NO:1, o una secuencia equivalente a partir de un homologo que se origina naturalmente en la gliadina representada por la SEC ID NO. 3, en la cual el epitope es un oligopeptido aislado derivado de una proteina gliadina, (iii) un analogo de (i) o (ii) el cual es capaz de ser reconocido por un receptor de las celulas T que reconoce (i) o (ii), el cual en el caso de un analogo peptidico no es mas de 50 aminoacidos en longitud, o (iv) un producto que comprende dos o mas agentes como se define en (i), (ii) o (iii), y (b) determinar in vitro si las celulas T en la muestra reconocen el agente, reconocimiento por las celulas T que indica que el individuo tiene, o es susceptible al, padecimiento coeliaco. Tambien se proporcionan las composiciones terapeuticas las cuales comprenden el epitope y las proteinas gliadinas las cuales no causan padecimientos coeliacos.

Description

EPIT0PE DE DIAGNOSTICO Y TERAPÉUTICO Y PLANTA TRANSGENICA La invención se refiere a la diagnosis y terapia de padecimientos coeliacos, y a una proteina gliadina la cual no causa padecimiento coeliaco. Una reacción inmune a la gliadina (un componente del gluten) en la dieta causa el padecimiento coeliaco. Se sabe que las respuestas inmunes en el tejido intestinal, preferencialmente responden a la gliadina, la cual se ha modificado por una transglutaminasa intestinal. El padecimiento coeliaco es diagnosticado por detección de anticuerpos anti-endomisiales, pero esto requiere confirmación por el hallazgo de una inflamación linfocitica en las biopsias intestinales. La toma de tal biopsia es inconveniente para el paciente. Los investigadores han asumido previamente que solamente las respuestas de las células T intestinales, proporcionan una indicación exacta de la respuesta inmune contra las gliadinas. Por lo tanto, se han concentrado en la investigación de las respuestas de las células T en el tejido intestinal1. Se conocen los epitopes de gliadina los cuales requieren modificación de transglutaminasa (antes de que sean reconocidos por el sistema inmune)2. Los inventores han encontrado el epitope de las células T inmunodominantes reconocido por el sistema inmune en padecimientos coeliacos, y han mostrado que este es reconocido por las células T en la sangre periférica de los individuos con padecimientos coeliacos. Tales células T se encuentran estar presentes a frecuencias suficiente altas para ser detectables sin la reestimulación (es decir, podrá ser usado un sistema de detección de "respuesta reciente") . El epitope se identificó usando un método a base de clonación de las células no T, el cual proporciona una reflexión más exacta de los epitopes a ser reconocidos. El epitope inmunodominante requiere modificación de transglutaminasa (que causa substitución de una glutamina particular a glutamato) antes del reconocimiento del sistema inmune. Basados en estos trabajos, los inventores han desarrollado una prueba la cual puede ser usada para diagnosticar padecimientos coeliacos a un estado temprano. La prueba puede llevarse a cabo en una muestra a partir de la sangre periférica y por lo tanto no se requiere una biopsia intestinal. La prueba es más sensible que las pruebas de anticuerpos, las cuales están actualmente siendo usadas. La invención asi proporciona un método de diagnosis de padecimientos coeliacos, o susceptibilidad a padecimientos coeliacos, en un individuo que comprende: (a) poner en contacto una muestra a partir del hospedero con un agente seleccionado de (i) el epitope que comprende una secuencia la cual es: SEC ID N0:1 ó 2, o una secuencia equivalente a partir de un homólogo que se origina naturalmente de la gliadina representada por la SEC ID NO: 3, (ii) un epitope que comprende la secuencia que comprende: SEC ID N0:1, o una secuencia equivalente a partir de un homólogo que se origina naturalmente en la gliadina representada por la SEC ID NO: 3, en la cual el epitope es un oligopeptido aislado derivado de una proteina gliadina, (iii) un análogo de (i) ó (ii) el cual es capaz de ser reconocido por un receptor de las células T que reconoce (i) ó (ii) , el cual en el caso de un análogo peptidico no es más de 50 aminoácidos en longitud, o (iv) un producto que comprende dos o más agentes como se define en (i) , (ii) o (iii) , y (b) determinar in vi tro si las células T en la muestra reconocen el agente, reconocimiento por las células T que indica que el individuo tiene, o es susceptible al, padecimiento coeliaco. La invención también proporciona el uso de un agente para la preparación de medios de diagnóstico para uso en un método de diagnosis de padecimientos coeliacos, o la susceptibilidad al padecimiento coeliaco, en un individuo, dicho método comprende determinar si las células T del individuo reconocen el agente, reconocimiento por las células T que indica que el individuo tiene, o es susceptible al padecimiento coeliaco. El hallazgo de un epitope inmunodominante el cual es modificado por la transglutaminasa también permite la diagnosis del padecimiento coeliaco basado en la determinación de si otros tipos de respuestas inmunes a este epitope están presentes. Asi, la invención también proporciona un método de diagnosis de padecimientos coeliacos, o susceptibilidad a padecimientos coeliacos en un individuo que comprende determinar la presencia de un anticuerpo que se enlaza al epitope en una muestra del individuo, la presencia del anticuerpo que indica que el individuo tiene, o es susceptible al padecimiento coeliaco. La invención adicionalmente proporciona el agente, opcionalmente en asociación con un portador, para uso en un método de tratamiento o prevención de padecimientos coeliacos tolerando células T las cuales reconocen el agente. También está proporcionado un antagonista de una célula T la cual tiene un receptor de la célula T que reconoce (i) ó (ii) , opcionalmente en asociación con un portador, para uso en un método de tratamiento o prevención del padecimiento coeliaco antagonizando tales células T. Adicionalmente está proporcionado el agente o un análogo que se enlaza a un anticuerpo (que enlaza el agente) para uso en un método de tratamiento o prevención de padecimientos coeliacos en un individuo tolerando el individuo para prevenir la producción de tal anticuerpo. La invención proporciona un método para determinar si una composición es capaz de causar padecimiento coeliaco, que comprende determinar si una proteina capaz de ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia de oligopéptido como se define anteriormente, está presente en la composición, la presencia de una proteina indica que la composición es capaz de causar el padecimiento coeliaco. La invención también proporciona una proteina gliadina mutante cuya secuencia de tipo nativa puede ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia que comprende un epitope que comprende una secuencia como se define anteriormente, pero en la cual la proteina gliadina mutante se ha modificado en tal forma que no contiene una secuencia la cual puede ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia que comprende tal epitope que comprende una secuencia; o un fragmento de tal proteina gliadina mutante el cual es al menos de 15 aminoácidos de longitud y el cual comprende la secuencia la cual se ha modificado en tal forma. La invención también proporciona una proteína que comprende una secuencia la cual es capaz de enlazarse a un receptor de las células T, en el cual el receptor de la célula T reconoce el agente, y en la cual la secuencia es capaz de causar antagonismo de una célula T que lleva tal receptor de la célula T. Adicionalmente la invención proporciona un alimento que comprende las proteínas definidas anteriormente. La invención está ilustrada por los siguientes dibujos acompañantes en los cuales: Las Figuras la y lb muestran respuestas ELISPOT IFN-? de CMSP (células mononucleares sanguíneas periféricas) recientemente aisladas (el eje vertical muestra células que forman manchas por 106 CMSP) a 3 combinaciones de pétidos tratados y no tratados con transglutaminasa (tTG) (cada péptido 10 µg/ml) que incluye cinco ldmers traslapantes que se empalman a la gliadina-A 51-85 (véase Tabla 1) y a una gliadina digerida por quimotripsina (40 µg/ml) en padecimiento coeliaco del Sujeto 1, inicialmente en remisión siguiendo una dieta libre de gluten después cambiada con 200g de pan diariamente por tres días a partir del día 1 (a) . Las respuestas de ELISPOT IFN-? de CMSP por el Sujeto 2 a los combinaciones 1-10 del péptido gliadina-A tratado con tTG se empalmaron a la proteína gliadina-A completa durante el día diez del cambio del pan (b) . El eje horizontal muestra los días después de comenzar el pan. Las Figuras 2a y 2b muestran las respuestas de ELISPOT IFN-? de CMSP con 3 combinaciones del péptido tratado con tTG (empalmado con gliadina-A 51-85) en 7 sujetos con padecimientos coeliacos individuales (el eje vertical muestra las células que forman manchas por 106 CMSP) , inicialmente en la remisión en dieta libre de gluten, cambiada con pan por tres días (días 1 a 10) . El eje horizontal muestra días después de comenzar el pan (a) . Respuestas de ELISPOPT IFNg de CMSP con péptidos de 15 mers traslapantes tratados con tTG incluidos en 3 combinaciones; la barras representan la respuesta media (+ SEM) a péptidos individuales (10 µg/ml) en 6 sujetos con padecimientos coeliacos al día 6 ó 7 (b) . (En sujetos individuales, las respuestas del ELISPOT a los péptidos, se calcularon como un % de respuesta provocada por el péptido 12 como se muestra por el eje vertical) . La Figura 3 muestra respuestas de ELISPOT IFN? de CMSP en truncaciones tratadas con tTG de una gliadina-A 56-75 (0.1 µM) . Las barras representan la media (+ SEM) en 5 sujetos con padecimientos coeliacos. (En sujetos individuales, las respuestas se calcularon como el % de la respuesta máxima provocada por cualquiera de los péptidos sometidos a pruebas) . Las Figuras 4a y 4b muestran como la estructura mínima del epítope de gliadina-A dominante se conformó en mapas usando péptidos de gliadina-A de 7-17 mers tratados con tTG (0.1 µM) que incluyen la secuencia PQPQLPY (gliadina-A 62-68) (a), y los mismos péptidos sin tratamiento tTG pero con substitución Q—>E65(b). Cada línea representa respuestas de ELISPOT IFNg de CMSP en cada uno de los tres sujetos con padecimientos coeliacos al día 6 ó 7 después de que el pan se ingirió en los días 1-3. (En sujetos individuales, las respuestas de ELISPOT se calcularon como un % de la respuesta provocada por el 17 mer, gliadina-A 57-73) . La Figura 5 muestra los aminoácidos los cuales fueron desamidados por el tTG. Se incubó la gliadina-A 56-75 (LQLQPFPQPQLPYPQPQSFP) (0.1 µM) con tTG (50 µg/ml) a 37°C por 2 horas. Se identificó un producto único y se purificó por cromatografía de fase inversa CLAR. El análisis de aminoácido seguido por el % de desamidación (Q—E) de cada residuo de Gln en la gliadina-A 56-75 es atribuible a tTG para ser calculado (eje vertical). La Figura 6 muestra el efecto de substitución de Q- E en gliadina-A 57-73 a otras posiciones además de Q65 usando los 17 mers: QLQPFPQPELPYPQPES (E57, 65), QLQPFPQPELPYPQPES (E65,72), ELQPFPQPELPYPQPES (e57, 65,72), y QLQPFPQPELPYPQPQS (E65) en tres sujetos con padecimientos coeliacos al día 6 ó 7 después de que el pan se ingirió en los días 1-3. El eje vertical muestra el % de la respuesta E65. Las Figuras 7a y 7b muestran que la gliadina-A 56- 75 tratada con tTG (0.1 µM) provocó respuestas de ELISPOT IFN-g en (a) perlilla magnético CD4 y CD8 disminuido de CMSP.
(Las barras representan respuestas de CMSP disminuido de CD4 como un % de respuestas de CMSP suprimidas de CD8; las células que forman manchas por millones de CMSP suprimidas de CD8 fueron: Sujeto 4: 29, y Sujeto 6:535). (b) Respuestas de ELISPT IFN-? de CMSP (células que forman manchas/millón de CMSP) , después de la incubación con anticuerpos monoclonales a HLA-DR (L243), -DQ (L2) y -DP (B7.21) (10 µg/ml) 1 hora previo a 56-75 tratados con tTG (0.1 µM) en dos sujetos con padecimientos coeliacos homocigotos para HLA-DQ al*0501, bl*0201.
La Figura 8 muestra el efecto de substituir Glu en la posición 65 por otros aminoácidos en el epítope inmunodominante. El eje vertical muestra el % de respuesta en los 3 sujetos con relación al epítope inmunodominante. La Figura 9 muestra la inmunoreactividad de péptidos de gliadina que se originan naturalmente (medición de respuestas de 3 sujetos), los cuales contienen la secuencia PQLPY con (obscurecido) y sin (claro) tratamiento con transglutaminasa. La Figura 10 muestra supresión de cuentas inmunomagnéticas específicas de CD8, CD4, ß7, y aE de células mononucleares sanguíneas periféricas a partir de dos sujetos coeliacos 6 días después de comenzar el cambio de gluten seguido por ELISPOT gama interferona. Se usó como el antígeno, gliadina-A 57-73 QE65 (25 cmg/ml), gliadina digerida con quimotripsina tratada con tTG (100 mcg/ml) o PPD ( 10 mcg/ml) . La Figura 11 muestra la longitud del epítope de las células T óptimas. Las Figuras 12a a 12h muestran una comparación de gliadina- A 57-73 QE65 con otros péptidos en un estudio de respuesta de dosis. Las Figuras 13a a 13c muestran una comparación de respuestas específicas de gliadina y gliadina-A 57-73 QE65.
Las Figuras 14a a 14e muestran la bioactividad de polimorfismos de gliadina en sujetos coeliacos. Las Figuras 15 y 16 muestran la definición de la secuencia de epítope central. Las Figuras 17 a 27, muestran la actividad agonista de las variantes de gliadina-A 57-73 QE65. Las Figuras 28a a 28y muestran respuestas en diferentes grupos de pacientes. - Descripción Detallada de la Invención El término 'padecimiento coeliaco" abarca un espectro de condiciones causadas por grados variantes de sensibilidad al gluten, incluyendo una forma severa caracterizada por una mucosa intestinal pequeña lisa (atrofia vellosa hiperplástica) y otras formas caracterizadas por síntomas más ligeros. Los individuos mencionados anteriormente (en el contexto de diagnosis o terapia) son humanos. Pueden tener padecimiento coeliaco (sintomático o asintomático) o se sospechan de tenerlo. Puede ser en una dieta libre de gluten. Puede ser en una respuesta de fase aguda (por ejemplo, pueden tener padecimiento coeliaco, pero han ingerido solamente gluten en las últimas 24 horas antes de las cuales habían sido de dieta libre de gluten por 14 a 28 días) . Los individuos pueden ser susceptibles al padecimiento coeliaco, tal como una susceptibilidad genética (determinada por ejemplo, por individuos que tienen relativos con padecimientos coeliacos o poseen genes los cuales causan predisposición a padecimientos coeliacos) .
El agente. El agente es típicamente un péptido, por ejemplo, de longitud 7 hasta 50 aminoácidos, tal como 10 a 40, ó 15 hasta 30 aminoácidos de longitud. La SEC ID NO:l es PQPELPY, la SEC ID NO: 2 es QLQPFPQPELPYPQPQS, la SEC ID NO: 3 se muestra en la Tabla 1 y es la secuencia de una gliadina-A completa. El glutamato en la posición 4 de la SEC ID NO:l (equivalente a la posición 9 de la SEC ID NO: 2) es generado por el tratamiento de transglutaminasa de la gliadina-A. El agente puede ser el péptido representado por la SEC ID NO:l ó 2 o una epítope que comprende la secuencia que comprende la SEC ID NO:l la cual es un oligopéptido aislado derivado de una proteína gliadina; o un equivalente de estas secuencias a partir de una proteína gliadina que se origina naturalmente, la cual es un homólogo de la SEC ID NO: 3. Así, el epítope puede ser un derivado de la proteína representada por la SEC ID NO: 3. Tal derivado es típicamente un fragmento de la gliadina, o un derivado mutado de la proteína o completa o fragmento. Por lo tanto, el epítope de la invención no incluye esta proteína gliadina completa que se origina naturalmente, y no incluye otras gliadinas completas que se originan naturalmente. El epítope puede así, ser un fragmento de la gliadina-A (por ejemplo, la SEC ID NO: 3), el cual comprende la secuencia de la SEC ID NO:l, obtenible por tratamiento (completamente o parcialmente) con transglutaminasa, es decir, con 1, 2, 3 ó más glutaminas substituidas por glutamatos (incluyendo la substitución dentro de la SEC ID NO:l) . Tales fragmentos pueden ser o pueden incluir las secuencias representadas por las posiciones 55 a 70, 58 a 73, 61 a 77 de la SEC ID NO: 3 mostradas en la Tabla 1. Típicamente tales fragmentos serán reconocidos por las células T en al menos la misma extensión que los péptidos representados por la SEC ID NO:l ó 2 están reconocidos en cualquiera de los ensayos descritos aquí usando las muestras a partir de pacientes con padecimientos coeliacos. En el caso en donde el epítope comprende una secuencia equivalente a los epítopes anteriores (incluyendo fragmentos) de otra proteína gliadina (por ejemplo, cualquiera de las proteínas gliadinas mencionadas aquí o cualquiera de las gliadinas las cuales causan padecimiento coeliaco) , tales secuencias equivalentes corresponderán a un fragmento de una proteína gliadina típicamente tratada (parcialmente o completamente) con transglutaminasa. Tales péptidos equivalentes pueden ser determinados por alineación de las secuencias de otras proteínas gliadinas con la SEC ID NO: 3 (por ejemplo, usando cualquiera de los programas mencionados aquí) . La transglutaminasa está comercialmente disponible (por ejemplo, Sigma T-5398). La Tabla 4 proporciona ejemplos de secuencias equivalentes adecuadas. El agente el cual es un análogo, es capaz de ser reconocido por TCR, el cual reconoce (i) ó (ii) . Por lo tanto, de manera general cuando el análogo se agrega a las células T en la presencia de (i) ó (ii) , típicamente también en la presencia de una célula que presenta el antígeno (CPA) (tal como cualquiera de las CPA mencionadas aquí) , el análogo inhibe el reconocimiento de (i) ó (ii) , es decir, el análogo es capaz de competir con (i) ó (ii) en tal sistema. El análogo puede ser uno el cual es capaz de enlazarse al TCR el cual reconoce (i) ó (ii) . Tal enlace puede ser sometido a prueba por técnicas estándares. Tales TCR pueden ser aislados a partir de células T, las cuales se han mostrado por reconocer (i) ó (ii) (por ejemplo, usando el método de la invención) . La demostración del enlace del análogo a los TCR, puede entonces mostrarse determinando si el TCR inhibe el enlace del análogo a la substancia que enlaza el análogo, por ejemplo, un anticuerpo al análogo. Típicamente, el análogo es enlazado a una molécula MHC clase II (por ejemplo HLA-DQ2) en tal inhibición de ensayo de enlace. Típicamente, el análogo inhibe el enlace de (i) ó (ii) a TCR. En este caso, la cantidad de (i) ó (ii) la cual puede enlazar el TCR en la presencia del análogo se disminuye. Esto es debido a que el análogo es capaz de enlazarse al TCR y por lo tanto, compite con (i) ó (ii) para el enlace al TCR. Las células T para uso en los experimentos de enlaces anteriores pueden ser aisladas de pacientes con padecimientos coeliacos, por ejemplo, con la ayuda del método de la invención. Otras características de enlace del análogo pueden también ser las mismas como (i) ó (ii) , y así típicamente el análogo se enlaza a la misma molécula de clase II MHC a la cual el péptido se enlaza (HLA-DQ2) . El análogo típicamente se enlaza a los anticuerpos específicos para (i) ó (ii) , y así inhibe el enlace de (i) ó (ii) a tales anticuerpos . El análogo es típicamente un péptido. Puede tener homología con (i) ó (ii) , típicamente al menos 70% de homología, preferiblemente al menos 80, 90%, 95%, 97% o 99% de homología con (i) ó (ii) , por ejemplo, sobre una región de al menos 15 más (tal como la longitud completa del análogo y/o (i) ó (ii) , o a través de la región la cual contacta el TCR o enlaza la molécula MHC) aminoácidos contiguos. Los métodos de medición de la homología de la proteína son bien conocidos en la técnica y se entenderán por aquellos de habilidad en la técnica en el presente contexto, la homología está calculada en la base de identidad de aminoácido (algunas veces referido como "homología dura") . Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT el cual puede ser usado para calcular la homología (por ejemplo, usado en sus conjuntos de faltas) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p 387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden ser usados para calcular la homología o secuencias alineadas (típicamente en sus conjuntos de faltas) , por ejemplo como se describe en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10. Los conjuntos de programas (software) para la realización de análisis BLAST están públicamente disponibles a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología (http: //www. ncbi . nlm. nih. gov/) . Este algoritmo involucra primero identificar pares de secuencias de registro altas (PSA) identificando palabras cortas de longitud en la secuencia de pregunta que ya sea iguala o satisface algunos registros T de umbrales de valores positivos cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es referido como el umbral de registro de palabras cercanas (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabras cercanas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar PSA que los contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones junto con cada secuencia para hasta donde el registro de alineación cumulativa puede ser incrementado. Las extensiones para los aciertos de palabras en cada dirección son detenidas cuando: el registro de alineación cumulativa falla por la cantidad de X a partir de su máximo valor alcanzado; el registro cumulativo va de cero o más bajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de registros negativos; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST , T y X, determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como defectos una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de registro BLOSUM62 (véase Henikoff (1992) Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 89: 10915-10919), alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras . El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc . Nal t . Acad. Sci . USA 90:5873-5787. Una medición de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una igualación entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos podrían ocurrir por cambio. Por ejemplo, una secuencia es considerada similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia a la segunda secuencia es menos de aproximadamente 1, preferiblemente menos de aproximadamente 0.1, más preferiblemente menos de aproximadamente 0.01 y más preferiblemente menos de aproximadamente 0.001. Los análogos de péptidos homólogos típicamente difieren de (i) ó (ii) por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó más mutaciones (las cuales pueden ser substituciones, supresiones o inserciones) . Estas mutaciones pueden ser medidas a través de cualquiera de las regiones mencionadas arriba con relación a la homología calculada. Las substituciones son preferiblemente "conservativas". Estas son definidas de conformidad con la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna, pueden ser substituidos entre sí: Típicamente los aminoácidos en el análogo en las posiciones equivalentes a aminoácidos en (i) ó (ii) , contribuyen al enlace de la molécula MHC o son responsables del reconocimiento por TCR, son los mismos o están conservados . Típicamente, el péptido de análogo comprende una o más modificaciones, las cuales puede ser modificaciones post-transduccionales naturales o modificaciones artificiales. La modificación puede proporcionar una porción química (típicamente por substitución de un hidrógeno, por ejemplo, de un enlace C-H) , tal como un grupo amino, acetilo, hidroxi o halógeno (por ejemplo, flúor) o grupo carbohidrato. Típicamente, la modificación está presente en el término N o C. El análogo puede comprender uno o más aminoácidos no naturales, por ejemplo, aminoácidos con una cadena lateral diferente de los aminoácidos naturales. De manera general, los aminoácidos no naturales tendrán un N término y/o un C término. El aminoácido no natural puede ser un aminoácido L ó D. El análogo típicamente tiene una forma, tamaño, flexibilidad o configuración electrónica, la cual es substancialmente similar a (i) ó (ii) . Es típicamente un derivado de (i) ó (ii) . En una modalidad, el análogo es una proteína de fusión que comprende la secuencia de SEC ID NO:l ó 2, o cualquiera de los otros péptidos mencionados aquí y la secuencia no gliadina. En una modalidad el análogo es o imita (i) ó (ii) enlazado a una molécula Clase II MHC. 2, 3, 4 ó más de tales complejos pueden ser asociados o enlazados entre sí, por ejemplo, usando un sistema a base de biotina/estreptavidina, en la cual típicamente 2, 3 o 4 moléculas de MHC etiquetadas con biotina se enlazan a una porción de estreptavidina. Este análogo típicamente inhibe el enlace del complejo (i) ó (ii) /clase II MHC a un TCR o anticuerpo el cual es específico para el complejo. El análogo es típicamente un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, tal como un fragmento Fab o (Fab)2. El análogo puede ser inmovilizado en un soporte sólido, particularmente un análogo el cual imita el enlace peptídico en una molécula MHC. El análogo es típicamente designado por medios computacionales y después sintetizado usando métodos conocidos en la técnica. Alternativamente el análogo puede seleccionarse de una biblioteca de compuestos. La biblioteca puede ser una biblioteca combinatorial o una biblioteca de exhibición, tal como una biblioteca de exhibición de fago. La biblioteca de compuestos puede ser expresada en la biblioteca de exhibición en la forma de su enlace a una molécula clase II MHC, tal como HLA-DQ2. Los análogos se seleccionan de manera general de la biblioteca basados en su habilidad para imitar las características de enlaces (i) ó (ii) . Así, pueden ser seleccionados basados en la habilidad para enlazarse a TCR o anticuerpo el cual reconoce (i) ó (ii) . Típicamente, los análogos serán reconocidos por las células T al menos a la misma extensión como cualquiera de los agentes (i) ó (ii) por ejemplo, al menos a la misma extensión como el epítope equivalente y preferiblemente a la misma extensión como el epítope representado por la SEC ID NO: 2, se reconocen en cualquiera de los ensayos descritos aquí, típicamente usando células T a partir de pacientes con padecimientos coeliacos. Los análogos pueden ser reconocidos a estas extensiones in vivo y así pueden ser capaces de inducir síntomas de padecimientos coeliacos en al menos la misma extensión como cualquiera de los agentes mencionados aquí (por ejemplo en un paciente humano o modelo animal) . Los análogos pueden ser identificados en un método que comprende determinar si una substancia candidata es reconocida por un receptor de células T que reconoce un epítope de la invención, reconocimiento de la substancia que indica que la substancia es un análogo. Tal como TCR puede ser cualquiera de los TCR mencionados aquí, y pueden estar presentes en las células T. Cualquier ensayo adecuado mencionado aquí puede ser usado para identificar el análogo. En una modalidad, este método es llevado a cabo in vivo . Como se mencionó anteriormente, los análogos preferidos son reconocidos en al menos la misma extensión como el péptido de la SEC ID NO: 2, y así el método puede ser usado para identificar análogos los cuales son reconocidos en esta extensión. En una modalidad, el método comprende determinar si una substancia candidata es capaz de inhibir el reconocimiento de un epítope de la invención, la inhibición del reconocimiento indica que la substancia es un análogo. El agente puede ser un producto que comprende al menos 2, 5, 10 ó 20 agentes como se define por (i), (ii) , ó (iii) . Típicamente, la composición comprende epítopes de la invención (o análogos equivalentes) de diferentes gliadinas, tales como cualquiera de las especies o variedades de o tipos de gliadinas mencionadas aquí. Las composiciones preferidas comprenden al menos un epítope de la invención, o análogo equivalente, de todas las gliadinas presentes en cualquiera de las especies o variedades mencionadas aquí, o de 2, 3, 4, o más de las especies mencionadas aquí (tal como a partir del panes de especies que consisten de trigo, centeno, cebada, avena y triticale) .
Diagnosis Como se mencionó anteriormente el método de diagnosis de la invención se puede basar en la detección de las células T las cuales enlazan el agente o en la detección de anticuerpos que reconocen el agente. Las células T las cuales reconocen el agente en el método (el cual incluye el uso antes mencionado) generalmente son células T las cuales se han pre-sensibilizado in vivo a gliadina. Como se mencionó anteriormente tales células T de experiencia antígena se han encontrado que están presentes en la sangre periférica. En el método las células T se pueden poner en contacto con el agente in vi tro o in vivo, y determinar si las células T reconocen el agente que se puede desempeñar in vi tro o in vivo. Por consiguiente la invención proporciona el agente para el uso en un método de diagnosis puesto en práctica en el cuerpo humano. Se proporcionan diferentes agentes para el uso simultáneo, separado o consiguiente en tal método. El método in vi tro típicamente se realiza en solución acuosa en la cual se adiciona el agente. La solución también comprenderá las células T (y en ciertas modalidades las CPAs descritas posteriormente) . El término "poner en contacto" como se usa en esta incluye agregar la sustancia particular a la solución. La determinación si las células T reconocen el agente generalmente se da por la detección de un cambio en el estado de las células T en la presencia del agente o la determinación si las células T enlazan el agente. El cambio de estado generalmente se origina por la actividad funcional del antígeno específico de la célula T después de que el RCT enlaza el agente. El cambio de estado se puede medir adentro (por ejemplo, el cambio en la expresión intracelular de proteínas) o afuera (por ejemplo, la detección de sustancias secretadas) de las células T. El cambio de estado de la célula T puede ser el inicio de o incremento en la secreción de una sustancia de la célula T, tal como una citosina, especialmente IFN-?, IL-2 o TNF-a. Particularmente se prefiere la determinación de la secreción de IFN-?. La sustancia típicamente se puede detectar dejando enlazarla a un agente de enlace específico y luego midiendo la presencia del complejo de sustancia/agente enlace. El agente de enlace específico típicamente es un anticuerpo, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales. Los anticuerpos para citosina son comercialmente disponibles, o se pueden elaborar usando técnicas estándares. Típicamente el agente de enlace específico se inmoviliza en un soporte sólido. Después de que la sustancia se deja enlazar el soporte sólido se puede lavar opcionalmente para remover el material el cual no se enlaza específicamente al agente. El complejo de sustancia/agente se puede detectar usando un segundo agente de enlace el cual enlazará el complejo. Típicamente el segundo agente enlaza la sustancia en un sitio el cual es diferente del sitio el cual enlaza el primer agente. El segundo agente preferiblemente es un anticuerpo y se etiqueta directamente o indirectamente por una etiqueta detectable. Por consiguiente el segundo agente se puede detectar por un tercer agente el cual típicamente se etiqueta directamente o indirectamente por una etiqueta detectable. Por ejemplo el segundo agente puede comprender una porción de biotina, permitiendo la detección por un tercer agente el cual comprende una porción de estreptavidina y típicamente fosfatasa alcalina como una etiqueta detectable. En una modalidad el sistema de detección el cual se usa es el ensayo de ELISPOT ex vivo descrito en la WO 98/23960. En este ensayo la IFN-? secretada de la célula T se enlaza por un primer anticuerpo específico de IFN-? el cual se inmoviliza en un soporte sólido. El enlace de IFN-? luego se detecta usando un segundo anticuerpo específico de IFN-? el cual se etiqueta con una etiqueta detectable. Tal anticuerpo etiquetado se puede obtener de MABTECH (Estocolmo, Suecia) . Otras etiquetas detectables las cuales se pueden usar se describen posteriormente. El cambio de estado de la célula T el cual se puede medir puede ser el incremento en la absorción de sustancias por la célula T, tal como la absorción de timidina. El cambio de estado puede ser un incremento en el tamaño de las células T, o la proliferación de las células T, o un cambio en los marcadores de la superficie celular en la célula T. En una modalidad el cambio de estado se detecta midiendo el cambio en la expresión intracelular de las proteínas, por ejemplo el incremento en la expresión intracelular de cualquiera de las citosinas mencionadas anteriormente. Tales cambios intracelulares se pueden detectar poniendo en contacto el interior de la célula T con una porción que enlaza las proteínas expresadas de una manera específica y lo cual permite la clasificación de las células T por citometría de flujo.
En una modalidad cuando se enlaza el RCT, el agente se enlaza a una molécula MHC de clase II (típicamente HLA-DQ2), la cual está presente típicamente en la superficie de una célula que presenta antígeno (CPA) . Sin embargo como se menciona en esta otros agentes pueden enlazar un RCT sin la necesidad también de enlazar una molécula MHC. Generalmente las células T las cuales se ponen en contacto en el método se toman del individuo en una muestra sanguínea, aunque se pueden usar otros tipos de muestras las cuales contienen células T. La muestra se puede agregar directamente al ensayo o primero se puede procesar. Típicamente el procesamiento puede comprender la dilución de la muestra, por ejemplo con agua o solución amortiguadora. Típicamente la muestra se diluye de 1.5 a 100 veces, por ejemplo 2 a 50 ó 5 a 10 veces. El procesamiento puede comprender la separación de componentes de la muestra. Típicamente las células mononucleares (CMs) se separan de las muestras. Las células CMs comprenderán las células T y las CPAs. Por consiguiente en el método las CPAs presentes en las CMs separadas pueden presentar el péptido a las células T. En otra modalidad solamente las células T, tales como solamente las células CD4 T, se pueden purificar de la muestra. Las células T, CMBPs y CMs se pueden separar de la muestra usando las técnicas conocidas en la técnica, tales como aquellas descritas en Lalvani et al (1997) J. Exp. Med. 186, p859-865. En una modalidad las células T usadas en el ensayo están en la forma de muestras no procesadas o diluidas, o son células T recientemente aisladas (tal como en la forma de CMs o CMBPs recientemente aisladas) las cuales se usan directamente ex vivo, es decir, las mismas no se cultivan antes de ser usadas en el método. Así, las células T no se han reestimulado de una manera in vi tro específica de antígeno. Sin embargo, las células T se pueden cultivar antes del uso, por ejemplo en la presencia de uno o más de los agentes, y generalmente también citosinas que promueven el crecimiento exógeno. Durante el cultivo el (los) agente (s) típicamente está(n) presente (s) en la superficie de las CPAs, tal como la CPA usada en el método. El pre-cultivo de las células T puede conducir a un incremento en la sensibilidad del método. Por consiguiente, las células T se pueden convertir en las líneas celulares, tales como las líneas celulares de corta duración (por ejemplo como se describe en Ota et al (1990) Nature 346, p 183-187) . La CPA la cual típicamente está presente en el método puede ser del mismo individuo como la célula T o de un hospedero diferente. La CPA puede ser una CPA que acontece naturalmente o una CPA artificial. La CPA es una célula la cual es capaz de presentar el péptido a una célula T. Típicamente es una célula B, célula dendrítica o macrófago. Típicamente se separa de la misma muestra como la célula T y típicamente está co-purificada con la célula T. Así, la CPA puede estar presente en las CMs o CMBPs. La CPA típicamente es un cultivo celular o una célula recientemente asilada ex vivo . Puede estar en la forma de una línea celular, tal como una línea celular inmortalizada o de corto período. La CPA puede expresar las moléculas MHC clase II vacías en su superficie . En el método uno o más agentes (diferentes) se pueden usar. Típicamente las células T derivadas de la muestra se pueden colocar en un ensayo con todos los agentes el cual se propone para someter a prueba o las células T se pueden dividir y colocar en ensayos separados cada uno de los cuales contiene uno o más de los agentes. La invención también proporciona los agentes tal como dos o más de cualquiera de los agentes antes mencionados (por ejemplo, las combinaciones de agentes los cuales están presentes en la composición de agente descrita anteriormente) para el uso simultáneo, separado o consiguiente (por ejemplo para el uso in vivo) . En una modalidad el agente se agrega per se directamente a un ensayo que comprende células T y CPAs. Como se describió anteriormente las células T y las CPAs en tal ensayo podrán estar en la forma de CMs. Cuando los agentes los cuales se pueden reconocer por la célula T sin la necesidad de la presentación por CPAs se usan entonces no se requieren las CPAs. Los análogos los cuales se asemejan al original (i) o (ii) enlazan a una molécula MHC son un ejemplo de tal agente. En una modalidad el agente se proporciona a la CPA en la ausencia de la célula T. La CPA entonces se proporciona a la célula T, típicamente después de que se deja presentar el agente en su superficie. El péptido puede haber sido tomado dentro de la CPA y presentado, o simplemente ser tomado en la superficie sin que entre dentro de la CPA. La duración para la cual el agente se pone en contacto con las células T variará dependiendo del método usado para determinar el reconocimiento del péptido. Típicamente 105 a 107, preferiblemente 5xl05 a 106 CMBPs se agregan a cada ensayo. En el caso donde el agente se agrega directamente al ensayo su concentración es de 10"1 a 103 µg/ml, preferiblemente 0.5 a 50 µg/ml o 1 a 10 µg/ml. Típicamente la longitud del tiempo para el cual las células T se incuban con el agente es de 4 a 24 horas, preferiblemente 6 a 16 horas. Cuando se usan las CMBPs ex vivo se ha encontrado que se pueden incubar 0.3xl06 CMBPs en 10 µg/ml del péptido por 12 horas a 37°C. La determinación del reconocimiento del agente por las células T se puede dar midiendo el enlace del agente a las células T (esto se puede realizar usando cualquier formato de ensayo de enlace adecuado descrito en esta) . Típicamente las células T las cuales enlazan el agente se pueden clasificar basadas en este enlace, por ejemplo usando una máquina de FACS. Se cree que ocurrirá la presencia de las células T las cuales reconocen el agente si la frecuencia de las células clasificadas usando el agente es superior a un valor de ?control' . La frecuencia de las células T que experimentan el antígeno generalmente es 1 en 1O6 a 1 en 103, y por lo tanto se puede determinar si o no las células clasificadas son células T que experimentan el antígeno. La determinación del reconocimiento del agente por las células T se puede medir in vivo. Típicamente el agente se administra al hospedero y luego se puede medir una respuesta la cual indica el reconocimiento del agente. El agente típicamente se administra intradérmicamente o epidérmicamente. El agente típicamente se administra por contacto con el exterior de la piel, y se puede retener en el sitio con la ayuda de un yeso o aposito. Alternativamente el agente se puede administrar por aguja, tal como por inyección, pero también se puede administrar por otros métodos tales como balística (por ejemplo, las técnicas de balística las cuales se han usado para suministrar ácidos nucleicos) . La EP-A- 0693119 describa las técnicas las cuales se pueden usar típicamente para administrar el agente. Típicamente se administra de 0.001 a 1000 µg, por ejemplo de 0.01 a 100 µg o 0.1 a 10 µg del agente. En una modalidad un producto se puede administrar el cual es capaz de proporcionar el agente in vivo. Así se puede administrar un polinucleótido capaz de expresar el agente, típicamente en cualquiera de las formas descritas antes para la administración del agente. El polinucleótido típicamente tiene cualquiera de las características del polinucleótido proporcionado por la invención el cual se describe posteriormente. El agente se expresa del polinucléotido in vivo . Típicamente se administra de 0.001 a 1000 µg, por ejemplo de 0.01 a 100 µg o 0.1 a 10 µg de polinucléotido . El reconocimiento del agente administrado a la piel típicamente se indica por el incidente de inflamación (por ejemplo, endurecimiento, eritema o edema) en el sitio de la administración. Este generalmente se mide por la examinación visual del sitio. El método de diagnosis basado en la detección de un anticuerpo que enlaza el agente típicamente se realiza poniendo en contacto una muestra del individuo (tal como cualquiera de las muestras mencionadas aquí, opcionalmente procesadas de cualquier manera mencionada en esta) con el agente y determinar si un anticuerpo en la muestra enlaza el agente, tal enlace indica que el individuo tiene, o es susceptible a la enfermedad celíaca. Cualquier formato adecuado de ensayo de enlace se puede usar, tal como cualquier formato mencionado en esta.
Terapia La identificación del epítope inmunodominante permite que los productos terapéuticos se elaboren los cuales llevan a cabo las células T las cuales reconocen este epítope (tales células T son unas las cuales participan en la respuesta inmune contra gliadina) . Este hallazgo también permite la prevención o tratamiento de enfermedad celíaca suprimiendo (por tolerancia) una respuesta de la célula T o anticuerpo al epítope. Ciertos agentes de la invención enlazan el RCT la cual reconoce el epítope de la invención (como se mide usando cualquiera de los ensayos de enlace descritos anteriormente) y origine la tolerancia de la célula T que porta el RCT. Tales agentes, opcionalmente en asociación con un portador, pueden por lo tanto ser usados para prevenir o tratar la enfermedad celíaca. Generalmente la tolerancia se puede originar por los mismos péptidos los cuales pueden (después de ser reconocidos por el RCT) originar la actividad funcional del antígeno específico de la célula T (tal como cualquier actividad mencionada en esta, por ejemplo, secreción de citosinas) . Tales agentes originan la tolerancia cuando los mismos están presentes el sistema inmune en una contexto de "tolerancia". La tolerancia conduce a una disminución en el reconocimiento de un epítope de anticuerpo o célula T por el sistema inmune. En el caso de un epítope de célula T esto puede ser originado por la supresión o energizado de las células T las cuales reconocen el epítope. Por consiguiente se incrementa la actividad de la célula T (por ejemplo como se mide en los ensayos adecuados mencionados en esta) en respuesta al epítope. La tolerancia de una respuesta de anticuerpo significa que se produce una cantidad disminuida del anticuerpo específico al epítope cuando el epítope se administra. Los métodos de presentación de antígenos al sistema inmune en tal contexto son conocidos y se describen por ejemplo en Yoshida et al. Clin. Immunol. Immunopathol . 82, 207-215 (1997), Thurau et al. Clin. Exp. Immunol. 109, 370-6 (1997), y Weiner et al. Res. Immunol. 148, 528-33 (1997).
Ciertas rutas particulares de administración pueden originar la tolerancia, tal como oral, nasal o intreperitoneal . Los productos particulares los cuales origina la tolerancia se pueden administrar (por ejemplo, en una composición la cual también comprende el agente) al individuo. Tales productos incluyen citosinas, tales como citosina las cuales favorecen una respuesta Th2 (por ejemplo, IL-4, TGF-ß o IL-10) . Los productos o el agente se pueden administrar a una dosis la cual origina la tolerancia.
La invención proporciona una proteína la cual comprende una secuencia capaz de actuar como un antagonista de la célula T (la célula T reconoce el agente) . Tales proteínas y tales antagonistas también se pueden usar para prevenir o tratar la enfermedad celíaca. El antagonista originará una disminución en la respuesta de la célula T. En una modalidad el antagonista enlaza el RCT de la célula T (generalmente en la forma de un complejo con HLA-DQ2) pero en lugar de originar la activación funcional normal origina una señal anormal que se hace pasar a través de la cascada de señalamiento intracelular de RCT la cual origina que la célula T tenga actividad de función disminuida (por ejemplo en respuesta al reconocimiento de un epítope, típicamente como se mide por cualquier ensayo adecuado mencionado en esta) . En una modalidad el antagonista compite con el epítope para enlazar un componente de la trayectoria de presentación y procesamiento de MHC, tal como una molécula MHC (típicamente HLA-DQ2) . Por consiguiente el antagonista puede enlazar la HLA-DQ2 (y así ser un péptido presentado por esta molécula MHC) , tal como péptido TP (Tabla 10) o un homólogo de este.
Los métodos que originan el antagonismo son conocidos en la técnica. En una modalidad el antagonista es un homólogo de los epítopes mencionados anteriormente y puede tener cualquiera de la secuencia, enlace u otras propiedades del agente (particularmente análogos) . Los antagonistas típicamente difieren de cualquiera de los epítopes anteriores (los cuales con capaces de originar una función normal del antígeno específico en la célula T) por 1, 2, 3, 4 o más mutaciones (cada una de las cuales puede ser una sustitución, inserción o supresión) . Tales antagonistas se llaman "ligandos de péptido alterados" o "LPA" en la técnica. Las mutaciones típicamente son las posiciones de aminoácido las cuales se ponen en contacto con el RCT. Los antagonistas pueden diferir del epítope por una sustitución dentro de la secuencia la cual es equivalente a la secuencia presentada por los aminoácidos 65 a 67 de A-gliadina (tales antagonistas se muestran en la Tabla 9) . Preferiblemente así, el antagonista tiene una sustitución en el equivalente de la posición 64, 65 ó 67. Preferiblemente la sustitución es 64W, 67W, 67M o 65T. Puesto que la respuesta inmune de la célula T al epítope de la invención en un individuo es policlonal mayor que un antagonista puede necesitar ser administrado al origen del antagonismo de las células T de la respuesta la cual tiene diferentes RCTs. Por lo tanto los antagonistas se pueden administrar en una composición la cual comprende al menos 2, 4, 6 o más antagonistas diferentes, cada uno antagoniza diferentes células T. La invención también proporciona un método de identificar un antagonista de una célula T (el cual reconoce el agente) que comprende poner en contacto una sustancia candidata con la célula T y detectar su la sustancia origina una disminución en la capacidad de la célula T para sufrir una respuesta del antígeno específico (por ejemplo, usando cualquier ensayo adecuado mencionado en esta) , la detección de cualquier disminución en dicha capacidad que indica que la sustancia es un antagonista. En una modalidad los antagonistas (incluyendo las combinaciones de antagonistas a un epítope particular) o agentes de tolerancia (célula T y tolerancia de anticuerpo) están presentes en una composición que comprende al menos 2, 4, 6 o más antagonistas o agentes los cuales antagonizan o toleran a diferentes epítopes de la invención, por ejemplo a las combinaciones de epítopes descritos anteriormente con relación a los agentes los cuales son un producto que comprende más de una sustancia.
Prueba si una composición es capaz de originar la enfermedad celíaca Como se mencionó anteriormente la invención proporciona un método de determinación si una composición es capaz de originar una enfermedad celíaca que comprende la detección de la presencia de una secuencia de proteína la cual es capaz de ser modificada por una transglutaminasa como la secuencia que comprende el agente o epítope de la invención (tal actividad de transglutaminasa puede ser una actividad de transglutaminasa del intestino humano) . Típicamente esto se realiza usando un ensayo de enlace en el cual una porción la cual se enlaza a la secuencia de una manera específica se pone en contacto con la composición y la formación del complejo secuencia/porción se detecta y se usa para averiguar la presencia del agente. Tal porción puede ser cualquier sustancia adecuada (o tipo de sustancia) mencionada en esta, y típicamente es un anticuerpo específico. Se puede usar cualquier formato adecuado de ensayo de enlace (tal como aquellos mencionados en esta) . En una modalidad la composición se pone en contacto con al menos 2, 5, 10 o más anticuerpos los cuales son específicos para los epítopes de la invención de diferentes gliadinas, por ejemplo un panel de anticuerpos capaz de reconocer las combinaciones de los epítopes descritos anteriormente con relación a los agentes de la invención los cuales son un producto que comprende más de una sustancia. La composición típicamente comprende material de una planta que expresa una gliadina la cual es capaz de originar la enfermedad celíaca (por ejemplo cualquiera de las gliadinas o plantas mencionadas en esta) . Tal material puede ser una parte de planta, tal como producto cosechado (por ejemplo, semilla) . El material puede ser productos procesados del material de planta (por ejemplo, cualquier producto mencionado en esta) , tal como harina de trigo o alimento que comprende la gliadina. El procesamiento del material alimenticio y la prueba en los ensayos de enlace adecuados es de rutina, por ejemplo como se menciona en Kricka LJ, J. Boilumin. Chemilumin. 13, 189-93 (1998) .
Ensayos de enlace La determinación del enlace entre cualquiera de las dos sustancias mencionadas en esta se puede dar midiendo una característica de cualquiera de las dos o ambas sustancias que cambian en el enlace, tal como un cambio espectroscópico.
El formato de ensayo de enlace puede ser un sistema de "cambio de banda". Este involucra la determinación si la presencia de una sustancia (tal como una sustancia candidata) avanza o retarda el progreso de la otra sustancia durante la electroforesis en gel. El formato puede ser un método de enlace competitivo el cual determina si una sustancia es capaz de inhibir el enlace de la otra sustancia a un agente el cual es conocido que enlaza la otra sustancia, tal como un anticuerpo específico.
Proteínas de gliadina mutantes La invención proporciona una proteína de gliadina en la cual una secuencia de epítope de la invención, o secuencia la cual se puede modificar por una transglutaminasa para proporcionar una secuencia que se ha mutado para que ya no origine, o sea reconocida por, una respuesta de la célula T que reconoce el epítope. En este contexto el término reconocimiento se refiere al RCT que enlaza el epítope en una forma que ocurre la actividad funcional específica de antígeno (no antagonístico) normal de la célula T.
Los métodos de identificación de epítopes en otras gliadinas se describieron anteriormente. El tipo silvestre de la gliadina mutada es una que causa la enfermedad celíaca. Una gliadina tendrá homología con SEC ID NO: 3, por ejemplo al grado mencionado anteriormente (en relación con el análogo) a través de toda la SEC ID NO: 3 o a través de 15, 30, 60, 100 ó 200 aminoácidos contiguos de SEC ID NO: 3. La gliadina mutada no causará la enfermedad celíaca o causará la disminución de los síntomas de la enfermedad celíaca. Típicamente, la mutación disminuye la capacidad del epítope a inducir una respuesta a la célula T. El epítope mutado puede tener un enlace disminuido a HLA-DQ2, una capacidad disminuida a ser presentada por un CPA o una capacidad disminuida a unirse a o a ser reconocida (es decir, causa la actividad funcional específica del antígeno) por células T que reconocen el agente. La gliadina mutada o epítope, por lo tanto, no mostrará o reducirá el reconocimiento en cualquiera de los ensayos mencionados aquí con relación a los aspectos de diagnóstico de la invención. La mutación puede ser una o más eliminaciones, adiciones o substituciones de longitud de 1 a 3, 4 a 6, 6 a 10, 11 a 15 o más en el epítope, por ejemplo, a través de la secuencia SEC ID NO: 2 o su equivalente. Preferiblemente la gliadina mutante tiene al menos una mutación en la secuencia SEC ID NO:l. Una mutación preferida está en la posición 65en una A-gliadina (o en una posición equivalente en otras gliadinas) . Típicamente la glutamina que está presente en forma natural en está posición se substituye con cualquiera de los aminácidos mostrados en la Tabla 3, preferiblemente con histidina, tirosina, triptófano, lisina, prolina, o arginina. La invención también proporciona así el uso de una mutación (cualquiera de las mutaciones en cualquiera de las secuencias descritas aquí) en un epítope de una proteína de gliadina, tal epítope es un epítope de la invención, para reducir la capacidad de la proteína de gliadina a causar la enfermedad de celíaca. En una modalidad la secuencia mutada es capaz de actuar como un antagonista. Por consiguiente, la invención proporciona una proteína que comprende una secuencia la cual es capaz de enlazarse a un receptor de la célula T, este receptor de la célula T reconoce un agente de la invención, y tal secuencia es capaz de causar el antagonismo de una célula T que lleva un receptor de la célula T. La invención también proporciona proteínas que son fragmentos de las proteínas de gliadina mutantes anteriores, _^^^¡s^¡ ^ las cuales son al menos 15 aminoácidos de largo (por ejemplo, al menos 30, 60, 100, 150, 200, o 250 aminoácidos de largo) y las cuales comprenden las mutaciones descritas anteriormente que disminuyen la capacidad de la gliadina a ser reconocida. Cualquiera de las proteínas mutantes (incluyendo fragmentos) mencionadas aquí también se puede presentar en la forma de proteínas de fusión, por ejemplo con otras gliadinas o con proteínas sin gliadina. La proteína de tipo silvestre equivalente a la proteína de gliadina mutada típicamente es de un monocotiledon gramináceo, tal como una planta del género Triticum, por ejemplo, trigo, arroz, cebada, avena o tritícalo. La proteína es típicamente un a, aß, ß, ? o ? gliadina. La gliadina puede ser una A-gliadina.
Conjuntos La invención también proporciona un conjunto para realizar el método que comprende uno o más agentes y opcionalmente un medio para detectar el reconocimiento del agente por la célula T. Típicamente los diferentes agentes se proveen para uso simultáneo, separado o secuencial. Típicamente el medio para detectar el reconocimiento permite o ayuda a la detección basada en las técnicas descritas anteriormente . Por consiguiente, el medio puede permitir la detección de una substancia secretada por las células T después del reconocimiento. Así, el conjunto puede incluir adicionalmente una porción de enlace específico para la substancia, tal como un anticuerpo. La porción típicamente es específica para IFN-?. La porción típicamente está inmovilizada en un soporte sólido. Esto significa que después del enlace de la porción la substancia permanecerá en la proximidad de la célula T la cual la secretará. Por consiguiente, las ?manchas' de complejo de substancia/porción se forman en el soporte, cada mancha representa una célula T que está secretando la substancia. La cuantificación de las manchas, y típicamente comparando de nuevo un control, permite la determinación del reconocimiento del agente. El conjunto también puede comprender un medio para detectar el complejo de substancia/porción. Un cambio detectable puede ocurrir en la porción por sí misma después del enlace de la substancia, tal como un cambio de color. Alternativamente, una segunda porción directa o indirectamente etiquetada para la detección se puede permitir para enlazar el complejo substancia/porción para permitir la determinación de las manchas. Como se describió anteriormente, la segunda porción puede ser específica para la substancia, pero enlaza un sitio diferente en la substancia que la primera porción. El soporte inmovilizado puede ser una placa con cavidades, tal como una placa de microtitulación. Cada ensayo por lo tanto puede realizarse en una cavidad separada en la placa. El conjunto adicionalmente puede comprender el medio para las células T, porciones de supresión o amortiguadores de lavado a ser usados en los pasos de detección. El conjunto adicionalmente puede comprender reactivos adecuados para la separación de la muestra, tal como la separación de CMBPs o células T de la muestra. El conjunto se puede designar para permitir la detección de las células T directamente en la muestra sin que se requiera cualquier separación de los componentes de la muestra. El conjunto puede comprender un instrumento el cual permite la administración del agente, tal como la administración intradérmica o epidérmica. Típicamente, tal instrumento comprende el yeso, vendaje o una o más agujas. El instrumento puede permitir el suministro balístico del agente. El agente en el conjunto puede estar en la forma de una composición farmacéutica. El conjunto también puede comprender controles, tal como controles positivos o negativos. El control positivo puede permitir el sistema de detección a ser probado. Por consiguiente, el control positivo típicamente mimetiza el reconocimiento del agente en cualquiera de los métodos anteriores. Típicamente en los conjuntos designados a determinar el reconocimiento in vivo, el control positivo es una citosina. En el conjunto designado para detectar in vivo el reconocimiento del agente el control positivo puede ser el antígeno al cual más individuos podrían responder. El conjunto también puede comprender un medio para tomar una muestra que contiene células T del hospedero, tal como una muestra de sangre. El conjunto puede comprender un medio para separar las células mononucleares o células T de una muestra del hospedero.
Polinucleótidos, células, mamiferos transgénicos y anticuerpos La invención también proporciona un polinucleótido el cual es capaz de expresión para proporcionar el agente o proteínas de gliadina mutantes. Típicamente, el polinucleótido es ADN o ARN, y es de hebra sencilla o doble. El polinucléotido preferiblemente comprenderá al menos 50 bases o pares de base, por ejemplo 50 a 100, 100 a 500, 500 a 1000 o 1000 a 2000 o más bases o pares de base. Por lo tanto, el polinucleótido comprende la secuencia que codifica la secuencia de SEC ID NO:l ó 2 o cualquiera de los agentes mencionados aquí. A las 5' y 3' de esta secuencia de codificación, el polinucleótido de la invención tiene la secuencia o codones los cuales son diferentes de la secuencia o codones 5' y 3' a estas secuencias en el gen de gliadina correspondiente . 5' y/o 3' a la secuencia que codifica el péptido, el polinucleótido tiene una secuencia de codificación o sin codificación. La secuencia 5' y/o 3' a la secuencia de codificación puede comprender las secuencias que ayudan a la expresión, tal como transcripción y/o traducción, de la secuencia que codifica el agente. El polinucleótido puede ser capaz de expresar la célula procariótico o eucariótica del agente. En una modalidad el polinucleótido es capaz de expresar el agente en una célula de mamífero, tal como una célula de humano, primate o roedor (por ejemplo, ratón o rata) .
Un polinucleótido de la invención puede hibridarse selectivamente a un polinucleótido que codifica SEC ID NO: 3 a un nivel significativamente superior del antecedente. La hibridación selectiva típicamente se logra usando condiciones de medio para alta exactitud (por ejemplo 0.03M de cloruro de sodio y 0.03M de citrato de sodio a aproximadamente 50°C a en forma aproximada 60°C) . Sin embargo, tal hibridación se puede realizar bajo cualesquiera condiciones adecuadas conocidas en la técnica (véase Sambrook et al (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual) . Por ejemplo, si se requiere alta exactitud, las condiciones adecuadas incluyen 0.2 x SSC a 60°C. Si se requiere menor exactitud, las condiciones adecuadas incluyen 2 x SSC a 60°C. Agentes o proteínas de la invención se pueden codificar por los polinucleótidos descritos aquí. El polinucleótido puede formar o se puede incorporar en un vector replicable. Tal vector es capaz de replicarse en una célula adecuada. El vector puede ser un vector de expresión. En tal vector el polinucleótido de la invención es enlazado operablemente a la secuencia de control la cual es capaz de proporcionar la expresión del polinucleótido. El vector puede contener un marcador que se puede seleccionar, tal como el gen de resistencia de ampicilina. El polinucleótido o vector puede estar presente en una célula. Una célula puede haber sido transformada por el polinucleótido o vector. La célula puede expresar el agente. La célula será elegida para ser compatible con el vector y puede ser, por ejemplo, una célula procariótica (bacteriana), de levadura, de insecto o de mamífero. El polinucleótido o vector se puede introducir en las células hospederas usando técnicas convencionales que incluyen la precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano, o electroporación . La invención provee procesos para la producción de las proteínas de la invención por medios recombinantes. Estos pueden comprender (a) cultivar una célula transformada como se definió anteriormente bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína, y preferiblemente (b) recuperar el polipéptido expresado. Opcionalmente, el polipéptido se puede aislar y/o purificar, por técnicas conocidas en la materia. La invención también proporciona RCTs los cuales reconocen (o enlazan) el agente, o fragmentos de los mismos los cuales son capaces de tal reconocimiento (o enlace) . Esto se puede presentar en cualquier forma mencionada aquí (por ejemplo, pureza) descrita aquí con relación a la proteína de la invención. La invención también provee células T las cuales expresan tales RCTs que pueden estar presentes en cualquier forma (por ejemplo, pureza) descritos aquí para las células de la invención. La invención también provee anticuerpos monoclonales o policlonales los cuales específicamente reconocen los agentes (tales como cualquiera de los epítopes de la invención) y los cuales reconocen las proteínas de gliadina mutantes (y típicamente no reconocen las gliadinas de tipo silvestre equivalentes) de la invención, y métodos para producir tales anticuerpos. Los anticuerpos de la invención se enlazan específicamente a estas substancias de la invención. Para los propósitos de esta invención, el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fv, F(ab) y F(ab)2, así como también anticuerpos de cadena única. Un método para producir un anticuerpo policlonal comprende inmunizar un animal hospedero adecuado, por ejemplo un animal experimental, con el inmunógeno y aislar las inmunoglobulinas del suero. El animal, por lo tanto, se puede inocular con el inmunógeno, la sangre posteriormente removida del animal y la fracción de IgG purificada. Un método para producir un anticuerpo monoclonal comprende inmortalizar células que producen el anticuerpo deseado. Las células de hibridoma se pueden producir fusionando las células del vaso de un animal experimental inoculado con células de tumor (Kohler and Milstein (1975) Nature 256, 495-497) . Una célula inmortalizada que produce el anticuerpo deseado se puede seleccionar por un procedimiento convencional. Las hibridomas se pueden crecer en cultivo o inyectar intraperitonealmente para la formación de fluido de ascitis o en la corriente sanguínea de un hospedero alogénico o hospedero inmunocomprometido. El anticuerpo humano se puede preparar por inmunización in vi tro de linfocitos humanos, seguido por la transformación de los linfocitos con el virus Epstein-Barr. Para la producción de tanto los anticuerpos monoclonales como policlonales, el animal experimental es convenientemente una cabra, conejo, rata o ratón. Si se desea, el inmunógeno se puede administrar como un conjugado en el cual se acopla en inmunógeno, por ejemplo, vía una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos, a un portador adecuado. La molécula portadora típicamente es un portador fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido se puede aislar y, si se desea, purificar. El polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo de la invención, puede lleva una etiqueta detectable. Las etiquetas detectables las cuales permiten la detección de la substancia secretada por inspección visual, opcionalmente con la ayuda de un medio de agrandamiento óptico, son preferidas. Un sistema está basado típicamente en una etiqueta de enzima la cual causa el cambio de color en un substrato, por ejemplo, fosfatasa alcalina que causa un cambio de color en un substrato. Tales substratos están comercialmente disponibles, por ejemplo, de BioRad. Otras etiquetas adecuadas incluyen otras enzimas tales como peroxidasa, o etiquetas de proteína, tales como biotina, o radioisótopos, tales como 32P o 35S . Las etiquetas anteriores se pueden detectar usando técnicas conocidas . Los polinucleótidos, agentes, proteínas, anticuerpos o células de la invención, pueden estar en la forma substancialmente purificada. Los mismos pueden estar en la forma substancialmente aislada, en este caso comprenderán de manera general al menos 80%, por ejemplo, al menos 90, 95, 97 o 99% del polinucleótido, péptido, anticuerpo, células o masa seca en la preparación. El polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo típicamente está substancialmente libre de otros componentes celulares. El polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo se puede usar en una forma substancialmente aislada, purificada o libre en el método o puede estar presente en tales formas en el conjunto. La invención también proporciona un mamífero transgénico el cual expresa un RCT de la invención. Este puede ser cualquiera de los mamíferos descritos aquí (por ejemplo, en relación con la producción del anticuerpo) . Preferiblemente el mamífero tiene, o es susceptible, a la enfermedad celíaca. El mamífero también puede expresar HL-A-DQ2 y/o se puede dar una dieta que comprenda una gliadina la cual causa la enfermedad celíaca (por ejemplo, cualquiera de las proteínas de gliadina mencionadas aquí) . Por consiguiente, el mamífero puede actuar como un modelo de animal para la enfermedad celíaca. La invención también proporciona un método para identificar un producto el cual es terapéutico para la enfermedad celíaca que comprende administrar una substancia candidata a un mamífero de la invención la cual tiene, o es susceptible a, la enfermedad celíaca y determinar si la substancia previene o trata la enfermedad celíaca en el mamífero, la prevención o tratamiento de la enfermedad celíaca indica que la substancia es un producto terapéutico. Un producto se puede usar para tratar o prevenir la enfermedad celíaca. La invención proporciona agentes terapéuticos (incluyendo profilácticos) o substancias de diagnóstico (los agentes, proteínas y polinucleótidos de la invención) . Estas substancias están formuladas para la administración clínica mezclándolas con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, los mismos se pueden formular por administración tópica, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, intradérmica, epidérmica o transdérmica. Las substancias se pueden mezclar con cualquier vehículo el cual sea farmacéuticamente aceptable y apropiado para la vía de administración deseada. El portador o diluyente farmacéuticamente para la inyección puede ser, por ejemplo, una solución estéril o isotónica tal como Agua para Inyección o solución salina fisiológica, o una partícula portadora para el suministro balístico. La dosis de las substancias se pueden ajustar de acuerdo con varios parámetros, especialmente de acuerdo con el agente usado; la edad, el peso y la condición del paciente a ser tratado, el modo de administración usado; la severidad de la condición a ser tratada; y el régimen clínico requerido. Como una guía, la cantidad de substancia administrada por inyección es convenientemente desde 0.01 mg/kg a 30 mg/kg, preferiblemente desde 0.1 mg/kg a 10 mg/kg. Las vías de administración y dosificación descritas están propuestas sólo como una guía puesto que un practicante experto será capaz de determinar fácilmente la vía de administración y dosificación óptima para cualquier paciente y condición particular. Las substancias de la invención se pueden usar así en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal, o en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano. En particular, los mismos se pueden usar en un método para el tratamiento o prevención de la enfermedad celíaca. La invención también proporciona los agentes para uso en un método para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la enfermedad celíaca. Por consiguiente, la invención proporciona un método para prevenir o tratar la enfermedad celíaca que comprende administrar a un humano con necesidad de la misma una substancia de la invención (típicamente una cantidad efectiva no tóxica de la misma) . El agente de la invención se puede hacer usando técnicas de química sintética, estándar, tal como por el uso de un sintetizador automático. El agente se puede hacer a partir de un polipéptido más largo, por ejemplo, una proteína de fusión, este polipéptido típicamente comprende la secuencia del péptido. El péptido se puede derivar del polipéptido, por ejemplo, hidrolizando el polipéptido, tal como usando una proteasa; o por rompimiento físico del polipéptido. El polipéptido de la invención se puede hacer usando técnicas estándar, tal como usando un sintetizador.
Células de plantas y plantas que expresan las proteína de gliadina mutantes o proteínas expresadas que comprenden secuencias las cuales pueden actuar como antagonistas La célula de la invención puede ser una célula de planta, tal como una célula de una especie de monocotiledoneo gramináceo. La especie puede ser una cuya forma de tipo silvestre expresa gliadinas, tal como cualquiera de las proteínas de gliadina mencionadas aquí (incluyendo gliadinas con cualquier grado de homología a SEC ID NO: 3 mencionada aquí). Un gliadina puede causar la enfermedad celíaca en humanos. La célula puede ser de trigo, maíz, avena, centeno, arroz, cebada, tritícalo, sorgo, o caña de azúcar. Típicamente, la célula es del género Triticum, tal como aestivum, spelta, polonicum, o monococcum. La célula de la planta de la invención típicamente es una que no expresa una gliadina de tipo silvestre (tal 5 como cualquiera de las gliadinas mencionadas aquí las cuales pueden causar la enfermedad celíaca) , o una que no expresa una gliadina que comprende una secuencia que puede ser reconocida por una célula T que reconoce el agente. Por consiguiente, si la célula de planta de tipo silvestre 10 expresa una gliadina entonces se puede tratar por ingeniería para prevenir o reducir la expresión de una gliadina o cambiar la secuencia de aminoácido de la gliadina de modo que no cause la enfermedad celíaca (típicamente sin expresar el epítope de la invención) . 15 Esto se puede dar, por ejemplo, introduciendo las mutaciones en 1, 2, 3 o más o todos los genes de gliadina en la célula, por ejemplo por codificación o sin codificación (por ejemplo, regiones promotoras) . Tales mutaciones pueden ser cualquiera del tipo o longitud de mutaciones descritas 20 aquí (por ejemplo, con relación a las proteínas homologas) . Las mutaciones se pueden introducir de una manera directa (por ejemplo, usando mutagénesis directa de sitio o técnicas de recombinación homologas) o en forma al azar (por ejemplo, "• j—"-«-»>--usando un mutagen, y luego seleccionar típicamente células mutagenizadas las cuales no expresan la gliadina (o una secuencia de gliadina la cual causa la enfermedad celíaca) ) . En el caso de plantas o células de plantas que expresan una proteína que comprende una secuencia capaz de actuar como un antagonista una planta o célula de planta puede expresar una proteína de gliadina de tipo silvestre (por ejemplo, una que causa la enfermedad celíaca) .
Preferiblemente aunque la presencia de la secuencia antagonista causará los síntomas de la enfermedad celíaca reducida (tales como sin síntomas) en un individuo quién ingiere un alimente que comprende la proteína de la planta o célula de la planta. El polinucleótido el cual está presente en (o el cual se transforma en) la célula de planta generalmente comprenderá el promotor capaz de expresar la proteína de gliadina mutante en la célula de planta. Dependiendo de la configuración de la expresión deseada, el promotor puede ser constitutivo, de tejido o etapa específica; y/o inducible. Por ejemplo, la expresión constitutiva fuerte en plantas se puede obtener con la CAMV 35S, Rubisco ssu, o promotores de histona. También, los promotores de tejido específico o etapa específica se pueden usar para formar el blanco de expresión de proteína de la invención a tejidos particulares en una planta transgénica o a etapas particulares en su desarrollo. Así, por ejemplo, se pueden usar promotores de semilla específica, de raíz específica, de hoja específica, de flor específica, etc. Los promotores de semilla específica incluyen aquellos descritos por Dalta et al (Biotechnology Ann. Rev. (1997), 3, pp. 269-296). Los ejemplos particulares de promotores de semilla específica son promotores de napin (EP-A-0 255,378), promotores de faseolina, promotores de glutenina, promotores de heliantenina (WO92/17580) , promotores de albúmina (WO98/45460) , promotores de oleosina (W098/45461) y promotores de ATS1 y ATS3 (PCT/US98/06798) . La célula puede estar en cualquier forma. Por ejemplo, puede ser una célula aislada, por ejemplo, un protoplasto, o puede ser parte de un tejido de planta, por ejemplo, un callo, o un tejido extirpado de una planta, o puede ser parte de una planta completa. La célula puede ser de cualquier tipo (por ejemplo de cualquier tipo de parte de planta) . Por ejemplo, una célula no diferenciada, tal como una célula de callo; o una célula diferenciada, tal como una célula de un tipo encontrado en un embrión, polen, raíces, retoños u hojas. Las partes de la planta incluyen raíces; retoños; hojas; y partes involucradas en reproducción, tal como polen, óvulo, estambres, anteras, pétalos, sépalos y otras partes de la flor. La invención proporciona un método para obtener una célula de planta transgénica que comprende transformar una célula de planta con un polinucleótido o vector de la invención para dar una célula de planta transgénica. Cualquier método de transformación adecuado puede ser usado (en el caso del trigo las técnicas descritas en Vasil V et al, Biotechnology 10, 667-674 (1992) pueden ser usadas). Las técnicas de transformación preferidas incluyen electroporación' de protoplastos de planta y bombardeo de partículas. La transformación por consiguiente puede resultar en un tejido quimérico o planta en la cual algunas células son transgénicas y algunas no son. La célula de la invención o por consiguiente la célula obtenida se puede regenerar en una planta transgénica por técnicas conocidas en la materia. Estas pueden involucrar el uso de substancias de crecimiento de plantas tal como auxinas, giberelinas y/o citoquininas para estimular el crecimiento y/o división de la célula transgénica. En forma similar, se pueden usar técnicas tales como embriogenesis somática y cultivo meristem. Las técnicas de regeneración son bien conocidas en la técnica y se pueden encontrar ejemplos en, por ejemplo, US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5, 177,010, US 5, 177,010, US 5, 187,073, EP 267,159, EP 604,662, EP 672,159, EP 604,662, EP 672,752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5, 489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442,174, EP 486,233, EP 486,234, EP 539,563, EP 674,725, WO91/02071 y WO 95/06128. En muchas técnicas, un paso es la formación de un callo, es decir, un tejido de planta que comprende expandir y/o dividir células. Tales callos son un aspecto adicional de la invención cuando son otros tipos de cultivos de células de plantas y partes de plantas. Por consiguiente, por ejemplo, la invención proporciona tejidos y partes de plantas transgénicas, incluyendo embriones, estambres, semillas, brotes, raíces, tallos, hojas y partes de flores. Estas pueden ser quiméricas en el sentido que alguna de sus células son células de la invención y algunas no son. Las partes y tejidos de plantas transgénicas, plantas y semillas de la invención pueden ser cualquiera de las especies de plantas mencionadas aquí .
Los procedimientos de regeneración típicamente involucrarán la selección de células transformadas por medio de genes marcadores. El paso de regeneración da origen a una primera generación de plantas transgénicas. La invención también proporciona métodos de obtención de plantas transgénicas de generaciones adicionales a partir de esta primera generación de planta. Estas son conocidas como plantas transgénicas progenitoras. Las plantas progenitoras de segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y generaciones adicionales pueden obtenerse de la primera generación de plantas transgénicas por cualquiera de los medios conocidos en la técnica. Así, la invención proporciona un método de obtención de una planta de progenie transgénica que comprende obtener una segunda generación de progenie transgénica a partir de una primera generación de planta transgénica de la invención, y opcionalmente obtención de plantas transgénicas de una o más generaciones adicionales de la segunda generación de progenie de plantas así obtenidas. Las progenies de plantas pueden ser producidas de sus predecesores de generaciones tempranas por cualquier técnica conocida. En particular, las progenies de plantas pueden ser producidas por: obtención de una semilla transgénica a partir de una planta transgénica de la invención que pertenece a una generación previa, después obtener una progenie de planta transgénica de la invención que pertenece a una nueva generación creciendo la semilla transgénica, y/o propagar clonalmente una planta transgénica de la invención que pertenece a una generación previa para dar una progenie de planta transgénica de la invención que pertenece a una nueva generación; y/o cruzar una primera generación de planta transgénica de la invención que pertenece a una generación previa con otra planta compatible para dar una progenie de planta transgénica de la invención que pertenece a una nueva generación; y opcionalmente obtener plantas de progenies transgénicas de una o más generaciones adicionales a partir de la progenie de planta así obtenida. Estas técnicas puede ser usadas en cualquier combinación. Por ejemplo, puede ser usada la propagación sexual y propagación clonal a diferentes puntos en un proceso que da origen a una planta transgénica adecuada para cultivación. En particular, puede intentarse el retrocruce repetitivo con un taxon de planta con características agronómicamente deseables. Los pasos adicionales de remover células a partir de una planta y la regeneración de nuevas plantas a partir de estas pueden también llevarse a cabo. También, las características adicionales pueden ser introducidas transformando las células, tejidos de plantas, plantas o semillas, en cualquier estado en el proceso anterior, para introducir secuencias de codificación deseables preferentemente los polinucleótidos de la invención. Esto puede llevarse a cabo por las técnicas descritas aquí para la introducción de polinucleótidos de la invención . Por ejemplo, los transgenes adicionales pueden ser seleccionados de aquellos que codifican para otros ensayos de resistencia a herbicidas por ejemplo, tolerancia a: Glifosato (por ejemplo, usando un gen de sintasa EPSP (por ejemplo, EP-A-0 293,358) o un gen de oxidoreductasa de glifosato (WO 92/000377)); o tolerancia a fosametina; un dihalobenzonitrilo; glufosinato, por ejemplo, usando una acetil transferasa de fosfinotricina (PAT) o un gen de sintasa glutamina (cotéjese EP-A-0 242,236); asulam; por ejemplo, usando un gen de sintasa dihidropteroato (EP-A-0 369,367); o una sulfonilurea, por ejemplo, usando un gen ALS) ; difeniléteres tales como acifluorfeno u oxifluorfeno, por ejemplo, usando un gen de oxidasa de protoporfirogeno) ; un oxadiazol tal como oxadiazona; una imida cíclica tal como cloroftalima; un fenilpirazol tal como TNP, o un fenopilato o carbamato análogo del mismo. De manera similar, pueden ser introducidos los genes para propiedades benéficas preferentemente tolerancia a herbicidas. Por ejemplo, genes para resistencia a insectos pueden ser introducidos, notablemente genes que codifican a las toxinas de Ba cill us thuringiensis (Bt) . Del mismo modo, los genes para la resistencia a padecimientos pueden ser introducidos, por ejemplo, como en WO91/02701 o WO95/06128. Típicamente, una proteína de la invención está expresada en una planta de la invención. Dependiendo del promotor usado, esta expresión puede ser constitutiva o inducible. De manera similar, puede ser específica del tejido o etapa, es decir, dirigida hacia un tejido de planta particular (tal como cualquiera de los tejidos mencionados aquí) o etapa en desarrollo de la planta. La invención también proporciona métodos para obtener productos de cultivos cosechando y opcionalmente procesando además, plantas transgénicas de la invención. Por producto de cultivo significa cualquier producto útil obtenible a partir de una planta de cultivo.
Productos que contiene proteínas gliadinas mutantes o proteínas que comprenden secuencias capaces de actuar como un antagonista La invención proporciona un producto que comprende las proteínas gliadinas mutantes o proteínas que comprenden secuencias capaces de actuar como un antagonista. Esto es típicamente derivado de o comprendido de partes de plantas a partir de plantas mencionadas aquí, las cuales expresan tales proteína. Tal producto puede ser obtenible directamente cosechándolo o indirectamente, cosechándolo y además procesando la planta de la invención. Los productos directamente obtenibles incluyen granos. Alternativamente, tal producto puede ser obtenible indirectamente, cosechándolo y además procesándolo. Los ejemplos de productos obtenibles por procesamientos adicionales son harina o bebidas alcohólicas destiladas; productos alimenticios elaborados de material procesado adicional u obtenidos directamente, por ejemplo, productos horneados (por ejemplo, pan), elaborados de harina. Típicamente tales productos alimenticios, los cuales son ingestibles y digestibles (es decir, no tóxicos y de valor nutriente) por individuos humanos. En el caso de productos alimenticios que comprenden la proteína la cual comprende una secuencia antagonista, el producto alimenticio puede también comprender gliadina de tipo nativa, pero preferiblemente el antagonista es capaz de causar una reducción (por ejemplo completamente) en los síntomas de padecimientos coeliacos después de que tal alimento es ingerido. La invención es ilustrada por los siguientes Ejemplos : Ejemplo 1 Se llevó a cabo la formación de mapas epítopes en padecimientos Coeliacos pero usando una serie de 51 péptidos 15 mer sintéticos que empalman la secuencia completa de una gliadina-a completamente caracterizada, "gliadina-A" (véase Tabla 1). Los péptidos de gliadina-A también fueron tratados individualmente con tTG para generar productos que podrán imitar aquellos producidos in vivo3. También buscamos estudiar pacientes con padecimientos coeliacos en el punto de iniciación de la recaída del padecimiento para evitar la posibilidad de que pueda haber ocurrido la "extensión" o "agotamiento" del epítope, como se describe en las infecciones experimentales y padecimientos autoinmunes.
Respuestas de la célula T específicas de la gliadina-A y clínicas con 3 y 10 días de cambio de pan En un estudio piloto, dos sujetos con padecimientos coeliacos en remisión, definidos por la ausencia de anticuerpo anti-endomisial de suero (AAE) , en una dieta libre de gluten, fueron alimentados de cuatro rodajas de pan blanco que contiene gluten estándar diariamente además de su dieta usual libre de gluten. El sujeto 1 dejó el pan debido al dolor abdominal, ulceras bucales y diarrea media después de tres días, pero el Sujeto 2 continuó por 10 días con solamente náusea media a una semana. El AAE llegó a ser positivo en el Sujeto 2 una semana después del cambio del pan, indicando que el pan usado ha causado una recaída del padecimiento coeliaco. Pero en el Sujeto 1, el AAE permaneció negativo hasta dos meses después del cambio del pan. En ambos sujetos, los síntomas que aparecen con el cambio del pan resuelto dentro de dos días después regresan a la dieta libre de gluten. Las respuestas CMSP en ensayos de ELISPOT IFN? a péptidos de gliadina-A, no se encontraron antes o durante el cambio del pan. Pero a partir del día después del retiro del pan (Día 4) en el Sujeto 1 en una única combinación de 5 péptidos traslapantes que se empalman a la gliadina-A 51-85 (Combinación 3) tratados con tTG, mostró respuestas IFNg potentes (véase Figura la) . En el Sujeto 1, la respuesta IFNg de CMSP a un péptido de gliadina-A permaneció dirigida a la Combinación 3 sola y fue máxima al día 8. Las dinámicas y magnitudes de la respuesta a la combinación 3 fueron similares a aquellas provocada por una gliadina digerida con a-quimotripsina. Las respuestas IFN? de CMSP a 3 combinaciones tratadas con tTG, fueron consistentemente 5 a 12 veces mayores que la combinación 3 no tratada con tTG, y las respuestas a la gliadina digerida con a-quimotripsina fueron 3 a 10 veces mayores si se trataron con tTG. En el sujeto 2, la Combinación 3 tratada con tTG también fue la única serie inmunogénica de péptidos de gliadina-A al día 8, pero esta respuesta fue más débil que en el Sujeto 1, no se observó en el Día 4 y el Día 11 la respuesta en la Combinación 3 que ha disminuido y otras combinaciones tratadas con tTG de péptidos de gliadina-A, provocaron respuestas IFNa más fuertes (véase Figura lb) . El estudio piloto indicó que la respuesta a las células T iniciales en estos sujetos con padecimientos coeliacos, fue contra una combinación única de gliadina-A tratada con tTG de cinco péptidos y se midió fácilmente en la sangre periférica. Pero si una exposición de antígeno se continua por diez días en lugar de tres, las respuestas de las células T a otros péptidos de glidina-A son consistentes con expansión de epítopes.
Inducción de IFN-g especifica del padecimiento coeliaco por péptidos de gliadina-A tratados con tTG. En cinco de seis sujetos con padecimientos coeliacos en dieta libre de gluten (véase Tabla 1), el cambio de pan por tres días identificó péptidos tratados con tTG en la Combinación 3, y en particular, péptidos que corresponden a 56-70 (12) y 60-75 (13) como el único componente de gliadina-A- que estimula la IFN? a partir de CMSP (véase Figura 2) . Los ensayos de ELISPOT IL-10 que corren en paralelo al ELISPOT INF?, no mostraron respuesta IL-10 a 12 ó 13 péptidos tratados con tTG. En un sujeto, no hubo respuesta IFN? en cualquier gliadina-A o gliadina digerida con a-quimotripsina antes, durante o hasta cuatro días después del cambio de pan. En ninguno de estos sujetos con padecimientos coeliacos, se hizo el cambio de estatus de AAE a partir de la línea base cuando se midió por hasta dos mes des después del cambio de pan. Las CMSP de cuatro sujetos saludables, negativos en AAE con los alelos HLA-DQ al*0501, ßl*0201 (edades 28-52, 2 hembras) quienes han sido cambiados por tres días con pan después de seguir una dieta libre de gluten por un mes, no mostraron respuestas IFN? arriba del control negativo en cualquiera de los péptidos de gliadina-A con o sin tratamiento con tTG. Así, la inducción de IFN? en CMSP a la combinación 3 tratada con tTG y péptidos de gliadina-A 56-76 (12) y 60-75 (13, fue específica del padecimiento coeliaco (7/8 contra 0/4, p<0.01 por análisis de Chi cuadrada).
Formación de mapas finos del epítope de células T de gliadina-A mínima Los péptidos tratados con tTG que representan truncaciones de gliadina-A 56-75, revelaron que la misma secuencia de péptido central (QPQLP) , fue esencial para la antigenicidad en todos los cinco sujetos con padecimientos coeliacos valorados (véase Figura 3) . Las respuestas IFN? de CMSP para péptidos tratados con tTG, empalmando esta secuencia central que comienza con el mero 7 PQPQLPY e incrementando en longitud, indican que el 17 mer tratado con tTG QLQPFPQPQLPYPQPQS (gliadina-A 57-73), posee actividad óptima en ELISPOT de INF? (véase Figura 4) .
Desamidación de Q65 por tTG que genera el epítope de células T inmunodominantes en la gliadina-A El análisis de CLAR demostró que el tratamiento de tTG de la gliadina-A 56-75 generó un producto único que eluye marginalmente después que el péptido original . El secuenciamiento del aminoácido indicó que fuera de los seis residuos de glutamina (Q) contenidos en la gliadina 56-75, el Q65 fue preferencialmente desamidado por tTG (véase Figura 5) . La bioactividad de péptidos que corresponden a las expansiones seriales de la secuencia de gliadina-A 62-68 central en la cual el glutamato (E) reemplaza a Q65, fue equivalente a los mismos péptidos con Q65 después del tratamiento con tTG (véase Figura 4) . El reemplazo de Q57 y Q62 por E junto o solo, con E65, no mejora la antigenicidad del 17-mer en los tres sujetos con padecimientos coeliacos estudiados (véase Figura 6) . Fueron investigados el Q57 y Q72 debido a que los residuos de glutamina seguidos por la prolina en los péptidos de gliadina, no son desamidados por tTG in vi tro (W. Vader et al., Proceedings 8th, International Symposium Coeliac Disease) . Por lo tanto, el epítope de las células T inmunodominantes se definió como QLQPFPQPELPYPQPQS .
La respuesta de epítope de células T inmunodominantes es restringida de DQ2 y dependiente de CD4 En dos sujetos con padecimientos coeliacos homocigotos para HLA-DQ al*0501, ßl*0201, el anticuerpo monoclonal anti-DQ bloqueó la respuesta IFN? del MANCHADO ELI en gliadina-A 56-75 tratada con tTG, pero el anticuerpo anti-DP y DR no (véase Figura 7) . La supresión de perlillas magnéticas anti-CD4 y anti-CD8 de CMSP a partir de dos sujetos con padecimientos coeliacos, indicó la respuesta IFN-? con gliadina-A 56-75 tratada con tTG mediada por las células T CD4.
Discusión En este estudio describimos un cambio de antígeno de dieta preferentemente simple usando pan blanco estándar para provocar una población temporal de células T CD4 en sangre periférica de sujetos con padecimientos coeliacos responsables de una gliadina-A de 17 mers tratados con tTG con la secuencia: QLQPFPQPELPYPQPQS (residuos 57-73) . La respuesta inmune a la gliadina-A 56-75 (Q-E65) es restringida al alelo HLA asociado con el padecimiento coeliaco, DQ al*0501, ßl*0201. La acción de la transglutammasa del tejido in vi tro desamida selectivamente el Q65. Las respuestas IFNg de la sangre periférica provocadas con los péptidos de gliadina-A sintética con la substitución de Q-E65, son equivalentes a los péptidos de gliadina-A Q65 tratados con tTG; ambos estimulan hasta 10 veces más células T en el MANCHADO ELIS IFNg que los péptidos de gliadina-A Q65 no modificados . Hemos deliberadamente definido este epítope de células T específicas del padecimiento coeliaco usando cambios de antígenos in vivo y ensayos inmunes ex vivo de corto término para evitar la posibilidad de artefactos metodológicos que puedan ocurrir con el uso de clones de células T en la formación de mapas epítopes. Nuestros hallazgos indican que las células T sanguíneas periféricas, que responden a la ingestión de gluten, son rápidas pero de vida corta y pueden ser utilizadas para la formación de mapas epítopes. El cambio de antígeno in vivo ha mostrado también que hay una jerarquía temporal de respuestas inmunes a los péptidos de gliadina-A 57-73 modificados por tTG no solamente estimulando las respuestas IFNg más fuertes en CMSP, sino también apareciendo la primera respuesta IFNg. Debido a que hemos valorado solamente péptidos que se empalman con la gliadina-A, pueden ser otros epítopes en otras gliadinas de igual o mayor importancia en la patogénesis del padecimiento coeliaco. De hecho, la secuencia de péptidos en el centro del epítope en la gliadina-A que se han identificado (PQPQLPY), está portada por varios otros ligandos (S issProt y Trembl, números de acceso: P02863, Q41528, Q41531, Q41533, Q9ZP09, P04722, P04724, P18573) . Sin embargo, los péptidos de A-gliadina que han sido previamente mostrados, poseen bioactividad en el cambio de biopsia y en estudios in vivo (por ejemplo: 31-43, 44-55, y 206-217) ' , no provocan respuestas IFNg en CMSP después de tres días de cambio de pan en sujetos con padecimientos coeliacos. Estos péptidos pueden ser epítopes de células T "secundarias" que se originan con la expansión de la respuesta inmune.
Ejemplo 2 El efecto en el reconocimiento de las células T de substituciones en el epitope inmunodominante El efecto de substituir el glutamato en la posición 65 en el epítope de gliadina-A 57-73, se determinó midiendo las respuestas de sangre periférica contra los epítopes substituidos en un ensayo de ELISPOT IFN? usando péptidos sintéticos (a 50 µg/ml) . Las respuestas se midieron en sujetos con padecimientos coeliacos después de 6 días de comenzar el cambio del gluten (4 rodajas de pan diariamente por 3 días) . Los resultados se muestran en la tabla 3 y figura 8. Como puede verse, la substitución del glutamato a histidina, tirosina, triptofano, lisina, prolina o arginina, estimuló una respuesta cuya magnitud fue de menos de 10% de la magnitud de la respuesta al epítope inmunodominante. Así, la mutación de la gliadina-A en esta posición, podrá ser empleada para producir una gliadina mutante, la cual reduce o ausenta la inmunoreactividad.
Ejemplo 3 Pruebas de la inmunoreactividad de péptidos equivalentes de otras gliadinas que se originan naturalmente. La inmunoreactividad de los péptidos equivalentes a partir de otras gliadinas de trigo que se originan naturalmente se valoró usando péptidos sintéticos que corresponden a las secuencias que se originan naturalmente las cuales entonces se trataron con transglutaminasa. Estos péptidos entonces se sometieron a pruebas en un ELISPOT en la misma manera y ccn CMSP a partir de los mismos sujetos como se describe en el Ejemplo 2. Al menos cinco de los péptidos mostraron inmunoreactividad comparable con el péptido E65 de gliadina-A 57-72 (después del tratamiento con transglutaminasa) , indicando que otras proteínas de gliadina en trigo son también probable que induzcan esta respuesta inmune específica del padecimiento coeliaco (Tabla 4 y Figura 9) .
Métodos Sujetos: Los pacientes usados en el estudio se atendieron en una Clínica Coeliaca en Oxford, Reino Unido. El padecimiento coeliaco se diagnosticó en base a la histología del intestino delgado típica, y la normalización de los síntomas e histología del intestino delgado con dieta libre de gluten.
Introducción del tejido: La introducción del tejido se realizó usando ADN extraído de sangre periférica anticoagulada EDTA. El genotipeo HLA-DQA y DQB se realizó por PCR usando mezclas de cebadores específicos de la secuencia6"8.
Ensayo de anticuerpo anti-endomisial . El AAE se detectó por inmunoflorescencia directa usando suero de paciente diluido 1:5 con esófago de mono, seguido por IgA anti-humano de cabra conjugado con FITC. El IgA se cuantificó previo al AAE, ninguno de los sujetos fueron deficientes en IgA.
Cambio de Antígeno: Los sujetos con padecimientos coeliacos siguieron una dieta libre de gluten, consumieron cuatro rodajas de pan que contiene gluten (50g/rodaja, wpan blanco para emparedado estándar" Sainsbury) diariamente por 3 a 10 días. El AAE se valoró la semana antes y hasta dos meses después de comenzar el cambio de pan. Los sujetos saludables quienes han seguido una dieta libre de gluten por cuatro semanas, consumieron su dieta usual incluyendo cuatro rodajas de pan que contiene gluten por tres días, después regresaron a la dieta libre de gluten por unos seis días adicionales.
ELISOT IFN? e IL-10: Se prepararon CMSP a partir de 50-100 ml de sangre venosa por centrifugación de densidad Ficoll-Hypaque. Después de tres lavados, las CMSP se resuspendieron en RPMI completo que contiene suero AB humano inactivado por calor al 10%. Los ensayos de ELISPOT para la secreción celular única de IFN? y IL-10, se realizó usando equipos comerciales (Mabtech; Estocolmo, Suecia) con placas de 96 pocilios (MAIP-S-45; Millipore, Bedford, MA) , de conformidad con las instrucciones del fabricantes (como se describe en otra parte9), con 2-5xl05 (IFN?) ó 0.4-105 (IL-10) CMSP en cada pocilio. Los péptidos se valoraron en pocilios duplicados, y la proteína purificada derivada de tuberculosis de Mycobacterium (PPD RT49) (Serum Institute; Copenhagen, Dinamarca) (20 µg/ml), se incluyó como un control positivo en todos los ensayos.
Péptidos: Los péptidos sintéticos se adquirieron de Research Genetics (Huntsville, Alabama) . La espectroscopia de masas y autenticidad de péptidos se verificó por HPLC y >70% pureza.
La digestión de gliadina (Sigma, G-3375) (100 mg/ml) con a-quimotripsina (Sigma, C-3142) 2001:1 (p/p), se realizó a temperatura ambiente en 0.1 M de NH4HCO3 con 2 M de urea y se interrumpió después de 24 horas por calentamiento a 98 °C por 10 minutos. Después de la centrifugación (13000g, 10 minutos) , la gliadina digerida por el sobrenadante se filtró esterilizada (0.2 mm) . La digestión de gliadina se verificó por SDS-PAGE y se valoró la concentración de proteína. La gliadina se digerió por a-quimotripsina (640 µg/ml) y péptidos de gliadina sintéticos (15 mers: 160 µg/ml, otros péptidos: 0.1 M) , fueron individualmente tratados con Ttg (Sigma, T-5398) (50 µg/ml) en PBS + CaCl2 1 mM por 2 horas a 37°C. Los péptidos y combinaciones de péptidos se sometieron a alícuotas en placas estériles de 96 pocilios y se almacenaron por congelamiento a -20°C hasta su uso.
Secuencíamiento de aminoácido de péptidos: Se usó CLAR de fase inversa para purificar el péptido resultante del tratamiento con tTG de gliadina-A 56-75. Se identificó un producto único y se sometió a secuenciamiento de aminoácido (secuenciador automatizado Modelo 494A, Applied Biosystems, Foster City, California) . La secuencia de G56-75 no modificada se confirmó como: LQLQPFPQPQLPYPQPQSFP, y tTG tratado con G56-75, se identificó como: LQLQPFPQPELPYPQPQSFP. La desamidación de residuos de glutamilo se define como la cantidad (pmol) de glutamato recuperado expresado como un porcentaje de la cantidad combinada de glutamina y glutamato recuperado en ciclos 2, 4, 8, 10, 15 y 17 del secuenciamiento de aminoácido. La desamidación atribuible a tTG fue definida como (% de desamidación de glutamina en el péptido tratado con tTG -% de desamidación en el péptido no tratado) / (100 -% de desamidación en el péptido no tratado.
Restricción de HLA Clase II y CD4/CD8: Se lavaron cuatro veces perlillas magnéticas revestidas con anti-CD4 ó anti-CD8 (Dynal, Oslo, Noruega), con RPMI después se incubaron con CMSP en RPMI completo que contiene suero AB humano inactivado por calor al 10% (5 x 106 células/ml) por 30 minutos en hielo. Las perlillas se removieron usando un magneto y las células restantes se contaron. La restricción de HLA Clase II in vivo de la respuesta inmune a gliadina-A 56-75 tratada con tTG, se estableció por incubación de CMSP (5 x 106 células/ml) con anticuerpos monoclonares anti-HLA-DR (L243) , DQ(L2), y DP (B7.21) (10 µg/ml) a temperatura ambiente por una hora, previo a la adición del péptido.
Ejemplo 4 Expresión de Integrina mucosa por linfocitos sanguíneos periféricos específicos de gliadina La interacción entre la dirección endotelial y del linfocito, facilitan el dirección de los linfocitos específicos del órgano. Muchas adresinas se conocen. El herterodímero a4ß7 es específico para la lamina propria del intestino y otros linfocitos mucosos, y el aEß7 es específico y los linfocitos intra-epiteliales en el intestino y la piel. Aproximadamente 30% de las células T CD4 sanguíneas periféricas, expresan a4ß7 y se presume están en tránsito en un sitio mucoso, mientras el 5% de las células T sanguíneas periféricas expresan aEß7. Las perlillas inmunomagnéticas revestidas con anticuerpos específicos para aE ó ß7, suprimen CMSP de células que expresan aEß7, ó aEß7, y a4ß7 respectivamente. En combinación con el ensayo de manchado ELI, la privación de perlilla inmunomagnética permite la determinación de la expresión de adresina de las células T específicas de la gliadina que pueden identificar estas células como dirigidas en una superficie mucosal. De manera interesante, el cambio de gluten in vivo está asociado con un rápido influjo de células T CD4 en la propria de lámina intestinal delgada (sin sitios intra-epitelial) , en donde sobre el 90% de los linfocitos expresan a4ß7. Las perlillas inmunomagnéticas se prepararon y usaron para suprimir CMSP de sujetos coeliacos al día 6 ó 7 después de comenzar el día 3 del cambio de gluten. El análisis FACS demostró perlillas aE suprimidas aproximadamente al 50% de células T CD4 positivas, mientras las perlillas ß suprimen todas de células T CD4 positivas. La supresión de CMSP usando perlillas ß7 ó CD4, pero no perlillas aE o CD8, abolió respuestas en el manchadoELIS gama interferona. Las respuestas de gliadina tTG y PPD se abolieron por la supresión CD4, pero consistentemente se afectaron por la supresión de la perlilla específica de la integrina. Así, las células T específicas QE65 de gliadina-A 57-73, inducidas después del cambio de gluten en padecimientos coeliacos, expresan la integrina a4ß7, presentes en las células T CD4 de la lamina propria en- el intestino delgado .
Ej emplo 5 Longitud óptima de Epítope de células T Péptidos sometidos a pruebas de datos previos, a partir de 7 hasta 17 aminoácidos en longitud, empalmando el centro del epítope de células T dominantes en gliadina-A, indicaronó que el 17mer, gliadinas-A 57-73 QE65, induce respuestas máximas en el manchadoElis gama interferona usando células mononucleares sanguíneas periféricas (CMSP) a partir de voluntarios coeliacos 6 días después de comenzar un cambio de 3 días de gluten. Los péptidos que representan expansiones de la secuencia central del epítope de células T dominante en gliadina-A, se valoraron en el ELISPOT gama IFN usando células mononucleares sanguíneas periféricas (CMSP) a partir de voluntarios coeliacos en 6 días después de comenzar un cambio de gluten de 3 días (n=4) . Péptido 13: gliadina-A 59-71 EQ65 (13 mer), péptido 15: 58-72 QE65 (15 mer)..., péptido 27:52-78 QE65 (27 mer) .
Como se muestra en la figura 11, la expansión de la secuencia de gliadina-A 57-73 QE65, no mejora substancialmente la respuesta en el manchado ELIS gama IFN.
Los ejemplos subsiguientes caracterizan la actividad agonista y antagonista de gliadina-A 57-73 QE65 usando péptidos 17mer.
Ejemplo 6 Comparación de gliadina-A 57-73 QE65 con otros epítopes de células T restringidos D02 en padecimientos coeliacos Los estudios de respuesta de dosis se realizaron usando péptidos que corresponden a péptidos tratados con transglutaminasa y no modificados, que corresponden a epítopes de células T de clones de células T específicas del tejido y líneas a partir de biopsias intestinales de sujetos coeliacos. Las respuestas a péptidos se expresaron como porcentaje de respuesta a gliadina-A 57-73 QE65. Todos los sujetos fueron HLA-DQ2+ (ninguno fue DQ8+). Los estudios indican que la gliadina-A 57-73 QE65 es el péptido de gliadina más potente para la inducción de gama interferona en el ensayo de ELISPOT usando CMSP después del cambio del gluten (véase Figuras 12a-h, y Tablas 5 y 6) . El segundo y tercer epítopes son fragmentos subóptimos de subóptimos de péptidos más grandes, es decir, gliadina-A 57-73 QE65 y GD4_WHEAT P04724-84-100 QE92. El epítope es solamente modestamente bioactivo (aproximadamente 1/20 tan activo como la gliadina-A 57-73 QE65 después de que el blanco es sustraído) . La gliadina-A 57-73 QE65 es más potente que otros epítopes de células T conocidas en los padecimientos coeliacos. Hay 16 polimorfismos de gliadina-A 57-73 (incluyendo la secuencia PQLPY) contra los genes de gliadina secuenciados, su bioactividad se valoró después.
Ejemplo 7 Comparación de respuestas específicas de gliadina y gliadina- A 57-73 QE65 en sangre periférica La contribución relativa del epítope dominante glidina-A 57-73 QE65, para la respuesta de las células T totales a gliadína en padecimiento coeliaco, es una publicación crítica. La pepsina-tripsina y gliadina digerida por quimotripsina, han sido tradicionalmente usadas como antígenos para el desarrollo de líneas de células T y clones en los padecimientos coeliacos. Sin embargo, es posible que estas proteasas pueden desdoblarse a través de ciertos epítopes de péptidos. Sin embargo, la digestión de quimotripsina de a9-gliadina recombinante, genera el péptido QLQPFPQPELPY, esta es una truncación de la secuencia de epítope óptima QLQPFPQPELPYPQPQS (véase anteriormente) . El tratamiento con transglutaminasa substancialmente incrementa la potencia de la gliadina digerida por quimotripsina en ensayos de proliferación de clones y líneas de células T específicas de la gliadina. Por lo tanto, la gliadina digerida por quimotripsina tratada con transglutaminasa (gliadina tTG) , puede no ser un antígeno ideal, pero la respuesta contra esta mezcla puede ser aproximadamente el número * total" de linfocitos sanguíneos específicos para gliadina. La comparación de respuestas contra la gliadina-A 57-73 QE65 y gliadina tTG en el ELISPOT da una indicación de la contribución de este epítope dominante a la respuesta inmune total a la gliadina en padecimientos coeliacos, y también ser una medida de extensión de epítope. Las CMSP colectadas al día 6 ó 7 después de comenzar el cambio con gluten en 4 sujetos coeliacos, se valoraron en estudios de respuesta de dosis usando tratamiento de gliadina digerida por quimotripsina +/- tTG y compararon con las respuestas de ELISPOT a una concentración óptima de gliadina-A 57-73 QE65 (25 mcg/ml) . El tratamiento de TTG de glidina mejoró respuestas de CMSP en el ELISPOT aproximadamente 10 veces (el tTG fue comparable con el blanco cuando se valoró solo (véase Figura 13a-c) . En los cuatro sujetos coeliacos estudiados, la gliadina-A 57-73 QE65 (25 mcg/ml) provocó respuestas entre 14 y 115% de aquellas de la gliadina Ttg (500 mcg/ml) y es la mayor respuesta a la gliadina-A 57-73 QE65, la mayor proporción está representada de la respuesta de gliadina tTG. Relativamente, los datos limitados sugieren que la respuestas de gliadina-A 57-73 QE65 son comparables con la gliadina tTG en algunos sujetos. La extensión del epítope asociada, con más respuestas de células T anti-gliadina involucradas, puede contar para la contribución más pequeña de la gliadina-A 57-73 QE65 a las respuestas de gliadina * total" en la sangre periférica en algunos individuos. La extensión del epítope puede ser mantenida en individuos con menos dietas libres estrictamente de gluten.
Ejemplo 8 Definición de péptidos de gliadina bioactivos en padecimientos coeliacos. Polimorfismos de gliadina-A 57-73 Péptidos de 15 mer traslapantes que empalman la secuencia completa de gliadina-A, se valoraron con el fin de identificar la secuencia inmunodominante en padecimientos coelicos. La gliadina-A fue la primera proteína y gen de alfa gliadina secuenciado completamente, pero es una de las aproximadamente 30-50 proteínas de alfa gliadina relacionadas en el trigo. Veinticinco genes de alf -gliadina distintos han sido identificados buscando base de datos -de proteínas, Swiss-Prot y TREMBL describen unas 8 alfa-gliadinas adicionales. Contenidas dentro de estas 25 alfa-glaidinas, hay 16 distintos polimorfismos de la secuencia correspondiente a la gliadina-A 57-73 (véase Tabla 7) . Los péptidos sintéticos que corresponden a estos 16 polimorfismos, en una forma no modifcada después del tratamiento con transglutaminasa in vi tro, así como también con glutamato substituido en la posición 10 (equivalente a QE65 en la gliadina-A 53-73) , se valoraron usando CMSP de sujetos coeliacos, normalmente después de una dieta libre de gluten, al día 6 ó 7 después del cambio de gluten en ensayos de manchadoELIS gama interferona. Los péptidos glutamato substituidos se compararon a tres concentraciones (2.5, 25 y 250 mcg/ml), el péptido no modificado y los péptidos tratados con transglutaminasa se valoraron a 25 mcg/m solamente. La bioactividad se expresó como el % de las respuestas asociadas con la gliadina-A 57-73 QE65 25 mcg/ml en sujetos individuales (n=4) (véase Figura 14).
La bioactividad de péptidos de "tipo nativo" se incrementó substancialmente (>5 veces) por tratamiento con transglutaminasa. El tratamiento con transglutaminasa de péptidos de tipo nativo resultó en bioactividad similar a aquella de los mismos péptidos substituidos con glutamato en la posición 10. Las bioactividades de cinco péptidos substituidos con glutamato (B, C, K, L M ) , fueron >70% de aquella de la gliadina-A 57-73 QE65 (A) , pero ninguna fue significantemente más bioactiva que la gliadina-A 57-73 QE65. Las respuestas a las CMSP a los péptidos substituidos por glutamato a concentraciones de 2.5 y 250 mcg/ml, fueron comparables con aquellas a 25 mcg/ml. Seis péptidos de gliadina substituidos con glutamato (H, I, J, N, O, P) , fueron <15% tan bioactivos como la gliadina-A 57-73 QE65. Otros péptidos fueron intermedios en la bioactividad. Al menos seis péptidos derivados de gliadina son equivalentes en potencia a la gliadina-A 57-73 QE65 después de la modificación por transglutaminasa. Relativamente, también existen polimorfismos no bioactivos de gliadina-A 57-73. Estos datos también indican que la modificación de transglutaminasa de péptidos a partir de varias gliadinas de Tricetum aestivum, T. uartu y T. spelta, pueden ser capaces de generar el epítope de células T inmunodominantes en el padecimiento coeliaco. La modificación genética de trigo para generar trigo no tóxico coeliaco es probablemente remoción requerida o modificación de genes de gliadina múltiples. La generación de trigos que contienen gliadinas y otras proteínas o péptidos que incorporan secuencias que definen los antagonistas ligandos de péptidos alterados de gliadina-A 57- 73 es una estrategia alternativa para generar trigo genéticamente modificado que es terapéuticamente más preferido que los 'no tóxicos" en padecimientos coeliacos.
Ejemplo 9 Definición de secuencia de Epitope central La comparación de péptidos que corresponden a truncaciones de gliadina-A 57-73 a partir de los N y C terminales, indican que la secuencia central del epítope de las células T es PELPY (gliadina-A 64-68) . Intentos por definir los no agonistas y antagnostas serán foco en variantes de gliadina-A que son substituidas en los residuos que contribuyen substancialmente a su bioactividad. Los péptidos que corresponden a gliadina-A 57-73 QE65 con alanina (Figura 15) o lisina (Figura 16) substituidos por los residuos 57 a 73, se compararon en ELISPOT de gama interferona usando células mononucleares sanguíneas periféricas (CMSP) a partir de voluntarios coeliacos 6 días después e comenzar un cambio de gluten de 3 días (n=8) . [BL es blanco, E as gliadina-A 57-73 QE65: QLQPFPQPELPYPQPQS] . Se encontró que residuos que corresponden a la gliadina-A 60-70 QE65 (PFPQPELPYPQ) contribuyen substancialmente a la bioactividad en la gliadina-A 57-73 QE65. Las variantes de la gliadina-A 57-73 QE65 substituida en las posiciones 60-70, son valoradas en un procedimiento de dos pasos. Inicialmente, se valoró la gliadina-A 57-73 QE65 substituida en las posiciones 60-70 usando 10 diferentes aminoácidos con propiedades contrastantes . Se valoró en una segunda vuelta un segundo grupo de variantes de gliadina-A 57-73 QE65 (substituidos con todos los otros aminoácidos que se originan naturalmente, excepto cisteína en las posiciones que comprueba que son sensibles a la modificación) .
Ejemplo 10 Actividad agonista de variantes substituidas de gliadina-A 57-73 QE65 La gliadina-A 57-73 QE65 es la secuencia central del epítope de las células T dominantes en la gliadina-A. Las variantes de péptidos antagonistas y no antagonistas de este epítope son más probablemente generadas por modificación de esta secuencia central. Inicialmente, la gliadina-A 57-73 QE65 substituida en las posiciones 60-70 usando 10 diferentes aminoácidos con propiedades contratantes, será valorada en ELISPOT GamalFN usando CMSP de sujetos coeliacos 6 días después de iniciar el cambio de gluten por 3 días. Un segundo grupo de variantes de gliadina-A 57-73 QE65 (substituida con otros aminoácidos que se originan naturalmente excepto cisteína) en las posiciones 60-71 también se valoraron. Ambos grupos de péptidos (todos a 50 mcg/ml, por duplicado) , se valoraron usando CMSP a partir de 8 sujetos y compararon con los péptidos no modificados (20 replicas por ensayo) . Estudios previos indican que la concentración óptima para gliadina-A 57-73 QE65 en este ensayo es entre 10 y 100 mcg/ml . Los resultados están expresados como respuesta media en las células que forman manchas (95% de intervalo de confianza) como % de respuesta media A-G 57-73 QE65 en cada individuo. Las pruebas de t no apareadas se usarán para comparar respuestas ELISPOT de péptidos modificados con A-G 57-73 QE65. Los superagonistas se definieron por tener una respuesta mayor que A-G 57-73 Q65 a un nivel de significancia de p<0.01; los agonistas parciales como tienen una respuesta menor que A-G 57-73 QE65 a un nivel de significancia de p<0.01 y no agonistas no son significantemente diferentes (p>0.01) del blanco (amortiguador sin péptido) . Los péptidos con actividad agonista de 30% o menor que la de gliadina-A 57-73 QE65 se consideraron parciales 'adecuados" o no agonistas para valorar la actividad antagonística (véase Tabla 8 y Figuras 17-27) . La respuesta ELISPOT de gamalFN de CMSP a gliadina- A 57-73 QE65 es altamente específica a un nivel molecular. Prolina en la posición 64 (P64), glutamato en la 65 (E65) y leucina en la posición 66 (L66) , y a una extensión menor Q63, P67, Y68 y P69 son particularmente sensibles a modificación. Las substituciones Y61 y Y70, ambas generan super-agonistas con 30% de bioactividad mayor que el péptido original, probablemente mejorando el enlace a HLA-DQ2 puesto que la porción para esta molécula HLA indica un preferencia para volumen hidrófobo que reside en las posiciones 1 y 9. Dieciocho péptidos no agonistas se identificaron. Las bioactividades de las variantes (50 mcg/ml): P65, K64, K65 y Y65 (bioactividad del 7-8%) fueron comparables con el blanco (7%) . En total, 57 variantes mutadas de gliadina-A 57-73 QE65 fueron 30% o menos bioactivas que la gliadina-A 57-73 QE65. La especificidad molecular de la respuesta de las células T del linfocito sanguíneo periférico (LSP) al epítope dominante, gliadina-A 57-73 QE65, es consistentemente reproducible contra sujetos coeliacos HLA-DQ2+, y son altamente específicas a un número restringido de aminoácidos en los 7 aminoácidos centrales. Ciertas variantes de aminoácidos únicos de gliadina-A 57-73 QE65 son consistentemente no agonistas en todos los sujetos coeliacos HLA-DQ2+.
Ejemplo 11 Actividad antagonista de variantes substituidas La homogenidad de la respuesta de las células T PBL a gliadina-A 57-73 QE65 en padecimientos coeliacos HLA-DQ2+, sugiere que los ligandos de péptidos alterados (LPA) capaces de antagonismo en CMSP ex vivo puedan existir, aún a pesar de que la respuesta de la célula T PLB sea probablemente poli u oligo-clonal . Los antagonistas son generalmente agonistas débiles. Cincuenta y siete variantes substituidas de aminoácido de gliadina-A 57-73 QE65 con actividad agonista del 30% o menos, han sido identificados y son candidatos substituibles como antagonistas APL. Además, ciertos polimorfismos que se originan naturalmente, débilmente bioactivos de gliadina-A 57-73 QE65, han sido también identificados (véase abajo) y pueden ser antagonistas APL 'originados naturalmente" . También ser ha sugerido que la competición para el enlace MHC puede también antagonizar el antígeno específico inmune a las células T. Por lo tanto, los péptidos no gliadina no inducen respuestas IFNgama en CMSP coeliacos después del cambio del gluten pero se conocen por enlazarse a HLA-DQ2, pueden ser capaces de reducir las respuestas de las células T provocadas por gliadina-A 57-73 QE65. Dos péptidos que se enlazan ávidamente a HLA-DQ2 son HLA clase 1 a (LHLA la) (PRAPWIEQEGPEYW) y peroxidasa de tiroides (pt) 632-645Y ( IDVWLGGLLAENFLPY) . La adición simultánea de péptido (50 µg/ml) o amortiguador y gliadina-A 57-73 QE65 (10 µg/ml) en ELISPOT IFNgama usando CMSP a partir de voluntarios coeliacos 6 días después de comenzar el cambio de gluten de 3 días (n=5) . Los resultados se expresaron como respuesta con péptido más A-G 57-73 QE65 (media de duplicados) como % de respuesta con amortiguador más A-G 57-73 QE65 (media de 20 réplicas) (Véase Tabla 9) . Cuatro variantes substituidas con aminoácidos únicas de gliadina-A 57-73 QE65, reducen la respuesta ELISPOT de CMSP gama interferona a una gliadina-A 57-73 QE65 (p<0.01) entre 25% y 28%, 13 otras variantes de péptidos reducen la respuesta de ELISPOT entre 18% y 24% (p<0.06). El enlazador HLA-DQ2, peroxidasa de tiroides (pt) 632-645Y, reduce las respuestas gama interferona de CMSP con gliadina-A 57-73 QE65 por 31% (p>0.0001) pero el otro enlazador HLA-DQ2, HLA clase 1 a 46-60, no altera las respuestas (véase Tabla 9) . El péptido que corresponde al polimorfismo modificado con transglutaminasa de gliadina-A 57-73, acceso S issProt No.: P04725 82-98 QE90 (PQPQPFPPELPYPQPQS) reduce las respuestas a gliadina-A 57-73 QE65 por 19% (p<0.009) (véase Tabla 11). Las respuestas gama interferona de CMSP a gliadina-A 57-73 QE65 en ensayos de ELISPOT se reducen por la coadministración de ciertas variantes de gliadina-A 57-73 QE65 de aminoácidos únicos, un polimorfismo de gliadina-A 57-73 QE65, y un péptido no relacionado enlazado a HLA-DQ2 en cinco veces exceso. Estos hallazgos sugieren que los antagonistas ligandos del péptido alterado de gliadina-A 57-73 QE65 existen. No solamente antagonistas APL putativos, sino también ciertos péptidos que se enlazan a HLA-DQ2 efectivamente reducen las respuestas de las células T PBL a gliadina-A 57-73 QE65. Estos hallazgos soportan dos estrategias para interrumpir la respuesta de las células T al epítope de gliadina-A dominante en el padecimiento coeliaco HLA-DQ2+. 1. Optimización de los antagonistas APL substituyendo aminoácidos a más de una posición (64-67) para usarse como farmacéuticos péptidos "tradicionales" o para modificación genética específica de genes de gliadina en trigo. 2. Uso de péptidos de enlace HLA-DQ2 de alta afinidad para inhibir competitivamente la presentación de gliadina-A 57-73 QE65 en asociación .
Estos dos procedimientos pueden ser mutuamente compatibles. Los super-agonistas se generaron reemplazando F61 y Q70 con residuos de tirosina. Es probable que estos super-agonistas resulten de enlace mejorado a HLA-DQ2 preferentemente contacto mejorado con el receptor de las células T. Combinando estas modificaciones con otras substituciones que generan antagonistas APL modestamente efectivos podrán substancialmente mejorar el efecto inhibitorio de variantes de gliadina-A 57-73 QE65 substituida .
Ejemplo 12 Desarrollo de ELISPOT gama interferona usando CMSP y gliadina-A 57-73 QE65 y P04724 84-100 QE92 como un diagnóstico para el padecimiento coeliaco. Definición de responsabilidad inmune en padecimiento coeliacos recientemente diagnosticados. La inducción de responsabilidad al epítope de las células T de gliadina-A dominante, en CMSP medido en la manchadoELI gama interferona seguido del cambio de gluten en casi todos los sujetos coeliacos DQ2+ sigue una dieta libre de gluten estricta de largo término (DLG) pero no en sujetos saludables DQ2+ después de 4 semanas siguiendo un estricto DLG. Las respuestas de gliadina-A 57-73 QE65 no son medibles en CMSP de sujetos coeliacos antes del cambio de gluten y los datos pilotos han sugerido que estas respuestas no podrán ser medidas en CMSP de coeliacos no tratados. Estos datos sugieren que en responsabilidad inmune de padecimientos coeliacos a gliadina-A 57-73 QE65, se restaura después de la exclusión del antígeno (DLG) . Si una prueba de diagnóstico es desarrollada usando el ensayo de ELISPOT y CMSP, es deseable definir la duración de la DLG requerida antes de que el cambio de gluten sea capaz de inducir respuestas a gliadina-A 57-73 QE65 y otros péptidos de gliadina inmunoreactivos en la inmunoreactivos en la sangre. Los sujetos coeliacos DQ2+ recientemente diagnosticados se reclutaron del servicio de pacientes externos de gastroenterología . Las CMSP se prepararon y sometieron a pruebas en ensayos de manchadoELI de gama interferona antes de que los sujetos comenzaran la DLG, y a una o dos semanas después que comenzaron la DLG. Además, el cambio de gluten (3 días consumiendo 4 rodajas estándares con pan blanco, 200 g/día) , se realizó a una o dos semanas después de comenzar con la DLG. Las CMSP se prepararon y sometieron a ensayos al día seis después de comenzar el cambio de gluten. Una gliadina-A 57-73 QE65 (A) , P04724 84- 100 QE92(B) (sola y combinada) y gliadina-A 57-73 QE65 (P65) (variante no bioactiva, véase anteriormente) (todas de 25 mcg/ml) se sometieron a ensayos. Todos pero solo un paciente coeliaco recientemente diagnosticado fue DQ2+ (uno fue DQ8+) (n=ll) . Las CMSP de coeliacos recientemente diagnosticados que no fueron tratados, o después de 1 o 2 semanas siguiendo la DLG, no mostraron respuestas contra gliadina-A 57-73 QE65 y P04724 84-100 QE92 (sola o combinada) que no fueron significantemente diferentes del blanco o gliadina-A 57-73 QE65 (n=9) (véase Figura 28) . El cambio de gluten en coeliacos quienes han seguido la DLG por solamente una semana, no mejoró substancialmente las respuestas a gliadina-A 57-73 QE65 o P04724 84-100 (sola o combinada) . Pero el cambio de gluten 2 semanas después de comenzar la DLG no induce respuestas a la gliadina-A 57-73 QE65 y P04724 84-100 QE92 (sola o combinada) que fueron significantemente mayores que la variante no bioactiva de gliadina-A 57-73 QE65 y el blanco. Aunque estas respuestas después del cambio de gluten a las 2 semanas fueron substanciales, parecen ser menores que en sujetos de >2 meses después de comenzar la DLG. Las respuestas a gliadina-A 57-73 QE65 sola fueron equivalentes o mayores que las respuestas a P4724 84-100 QE92 solas o cuando se mezclan con gliadina-A 57-73 QE65. Ninguno de los sujetos experimentó síntomas de alteración con el cambio del gluten. La responsabilidad inmune (medida en CMSP después del cambio de gluten) en gliadina-A es parcialmente restaurada 2 semanas después de comenzar la DLG, implicando que la "irresponsabilidad inmune" a este epítope de células T dominante, prevalece en padecimientos coeliacos no tratados y por al menos una semana después de iniciar la DLG. El tiempo óptimo de una prueba de diagnóstico para padecimientos coeliacos usando cambio de gluten y medición de las respuestas a gliadina-A 57-73 QE65 en el ensayo de manchadoELI es al menos 2 semanas después de comenzar una DLG. Las células T que secretan gama interferona específicas a gliadina-A 57-73 QE65, no pueden ser medidas en la sangre periférica en coeliacos no tratados, y pueden solamente ser inducidas por el cambio del gluten después de al menos 2 semanas de DLG (exclusión de antígeno) . Por lo tanto, el tiempo de una prueba de diagnóstico usando esta metodología es crucial y estudios adicionales son necesarios para su optimización. Estos hallazgos son consistentes con la energía funcional de las células T específicas para el epítope dominante, gliadina-A 57-73 QE65, invertida por la exclusión del antígeno (DLG) . Este fenómeno no ha sido demostrado previamente en padecimientos humanos, y soporta la posibilidad de que la energía de las células T pueda ser inducible con terapia de péptido en padecimientos coeliacos.
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Tabla 1. Secuencia de proteína de gliadina A (basado en un secuenciamiento de amlno ácido) VRVPVPQLQp QNPSQQQPQE QVPEVQQQQF PGQQQQFPPQ QPYPQPQPFP SQQFYT QLQP FPQPQLFVPQ 1 1 1 21 31 41 51 61 PQSFPPQQPY PQPQPQYSQP QQPISQQQAQ QQQQQQQQQQ QQQJZQQILQ QQLIPCMDW LQQHNIAHAR "71 81 91 101 111 121 131 SQVLQQS-TVQ LLQELCCQHL WQIPEQSQCQ AimJVVHApLHQQQKQQQ SSQVSFQQP LQQYP LGQGS 14] 151 161 171 181 191 201 FR SQQNPQA QGSVQPQQLP QFEE-RNLAL QTLPAMCNVY IAJPYCTIAPF GIFGTN 211 221 231 241 251 261 Tabla 2. Padecimientos Coeliacos de Sujetos Estudiados Sexo Dieta libre HLA-DQ2 Cambio Síntomas Edad de Gluten de pan Con el pan 1 64 f 14 Homocigoto 3 días Dolor abdominal, letargo, úlceras de boca, diarrea 2 57 m 1 Heterocigoto 10 días Letargo, náusea 3 35 f 7 Heterocigoto 3 días Náusea 4 36 m 6 Homocigoto 3 días Dolor abdominal, úlceras de boca, diarrea 5 26 m 19 Heterocigoto 3 días Ninguna 6 58 m 35 Heterocigoto 3 días Ninguna 7 55 m 1 Heterocigoto 3 días Diarrea 8 48 f 15 Homocigoto 3 días Dolor abdominal, diarrea Aminoácido en posición 65 Rango Media Glutamato (100) 100% Aspargina (50-84) 70% Aspartato (50-94) 65% Alanina (44-76) 64% Cisteína (45-83) 62% Serina (45-75) 62% Valina (24-79) 56% Treonina 46-66) 55% Glicina (34-47) 40% Leucina (8-46) 33% Glutamina (16-21) 19% Isoleucina (3-25) 14% Metionina (3-32) 14% Fenilamina (0-33) 12% Histidina (0-13) 8% Tirosina (0-17) 8% Triptofano (0-17) 8% Lisina (0-11) 4% Prolina (0-4) 2% Arginina (0-2) 1% Tabla 3 Respuesta del Manchado Eli Secuencia del Péptido Residuos correspondientes en secuencias de proteína gliadina No TC TG (no. de acceso) I (1-13) QLQPFPQPQLPYPQPQS 57-73 Oti.dina a (T- ?_t]«un) Q41S45 100 (100) QLQPFPQPEl-PYPQPQS -7-73 Oli-dina a -e-tivimi) 0 1545 J(J -7) 53(44-67) QLQ.FPyPQU?SQPQP 77..5 precursor de Gliadina pB (T. -c-nvupi) P02863 76-92 oiiidba -c(T-»e?-cvuj-?) 04152- 77-93 Proteina de almacenamiento deobidina a (T. -_-T¡V«[D)Q41531 57.73 Péptido maduro deGUiáipa aT. «eip om) Q41533 77-93 Precui .or d(-G_i-d-_a o(T- spelta) Q9ZP09 12(0-20) 83(61-115) QLQPFPQPQU?PQFQP 77-93 Precursor A-II de Gliadina a/B (T..cstivu-tn) P O 472 t9(0--S) E3(74-9? QLOPFPQPQLPYPQPQI. 77-93 Precursor A-IV de Gliadina a/B OJ- «e-rcvn.-) P04724 7 - 3 Precursor MM1 de GUadlna a/B f1- *8pv»?_?) P 18573 3(0-7) 10- (4l-I.-2) PQ-J?PQPQIJ?PQPCJP «4-100 Precursor A-IV de Gliadina ß/B (T..cmvum) P04724 P U. VPQPO P-yTQPQi. -4-100 Precursor MM1 de GUadlna«/B (T. - -tlwitD) P18573 0(0-1) 3(0-7) QLQPF QPQLPYSQPQP 77-9 J Precursor AI de GUadinaa/P (T. i rovutn) P04721 77-M OU.áina a (T..cstivurn) Q41509 0 (0-0) 2 (0-7) 3PFSQPOU. YSQPQP 77.93 Proteína de almacenamiento de-Güi?-ja üOJ- «C-TIVU?J) Q41530 PQPQP-TPQL.PYPQTQP 77-93 Precursor A-D. de Glladinaa/B (T. rarrvun. P04723 |7(0-»Ü) 24(11-43) PQPOPFPPp prPQPQS 82.98 Precursor A- V de Glladina a9 (T. ?c_nv«ß?) P04725 10(0- JO) 1. (11-3-) PQPQPFPPQLPYPQPPP 82-98 Precursor PW1215 del clon de Gliadlna WB (T. -.e-tivum) P04726 82-98 Gliadinaa.'B Ct- urartu) Q41632 10(0-30) 21(11-33) PQPQPf-T-PQLPYPQPQS 79-95 Precursor PW 8142 del clon de Gliadina aB (T. - -tivuu) P04726 79-95 Oh'tdma a(T..c-trwiía) Q415229 79-95 Precursor de Gliadina a/P (T. M -?VUQJ) Q41546 Tabla 4 Tabla 5. Epitopes de células T descritos en padecimientos coeliacos Fuente Restricción Frecuencia Secuencia* Gamma-gliadina DQ2 3 NS (iTCC) QQLPQPEQPQQSFPEQERPF Alfa-gliadina DQ2 12/17 (iTCL) QLQPFPQPELPY Alfa-gliadina DQ2 H/17 (iTCL) PQPELPYPQPELPY Alfa-gliadina DQ2 1/23 (bTCC) LGQQQPFPPQQPYPQPQPF Alfa-gliadina DQB 3 NS (iTCC) QQYPSGEGSFQPSQE PQ Gluteina DQ8 1/1 (iTCC) GQQGYYPTSPQQSGQ Alfa-gliadina DQ2 1 1/12 in vivo QLQPFPQPELPYPQPQS NS no declarado en la publicación original, iTCC clon de células T intestinales, iTCL línea de células T policlonales intestinales, bTCC clon de células T sanguíneas periféricas. *Todos los péptidos son los productos de péptidos de gluten 10 de tipo nativos modificados con transglutaminasa, excepto el péptido cuarto y sexto.
Tabla 6. Bioactividad relativa de epitopes de célula T de gliadina en CMSP coeliaco después del cambio de gluten Respuesta de manchado ELI como % de gliadina A 57-73 QE65 (todos 25 cm ml) - -. Secuencia" Tipo silvestre Tipo silvestre+tTg E-sustituido QQLPQPEQPQQSFPEQERPF 9 (3) 18 (7) 10 (5) QLQPFPQPELPY 6 (2) 19 (0 8 (3) PQPELPYPQPELPY 13 (6) 53 (8) 48 (9) QQYPSGEGSFQPSQENPQ 10 (3) 9 (3) 14 (8) QLQPFPQPELPYPQPQS 18 (7) 87 (7) 100 PQLPYPQPELPYPQPQP 14 (4) 80 (17) 69 (20) ^secuencia se refiere a aquella del péptido modificado con 20 transglutaminasa (tTG) y el epítope de las células T. El tipo nativo es el péptido gliadina no modificado. Datos de 4 sujetos. El blanco fue 5(1) %) .
Tabla 7. Polimorfismo de A-gliadina 57-73 A. Secuencias derivadas de cepas de trigo de otoflo Nórdico Mjoelner B. Exploración TREMBL y SWISSPROT (10.12.99) para gliadinas que contienen la secuencia: XXXXXXXPQLPYXXX5 X Trigo (al menos declarado Triticuní aestivum) número de acceso de gliadina Polimorfismo Q41545 A-gliadina (a partir de la proteína secuenciada) 57-73 (A) QLQPFPQPQLPYPQPQS SWISSPROT- GDAO_ WHEAT P02863 77-93 (F) QLQPFPQPQLPYSQPQP GDA1_WHEAT P0472 I 77-93 (G) QLQPFLQPQLPYJSQPQF CDA- _WHEAT 04722 77-93 (B) QLQPFPQPQLPYPQPQP GD-**__TWHEATP04723 77-93 (O) EOPOPFPPQLPYPQTQP GDA4 WHEAT 04724 T7-93 (C) QLQPFPQPQLPYPQPQ GDA4 WHEAT P04724 84-100 (K) PQLPYPQPQLPYPQPQP GDA5 WHEAT P0472S 82-98 (N) PJQEOEEETQLFYPQPQS GP A6 WHEAT P04726 82-98 (P) PQ__<__eFPPQLPYPQP_PP GDA7IWHEAT P04727 79-95 (M) PQPOPFLPQU?POPOS GDA9„WHEAT P 18573 77-93 (C) QLQFFPQPQLPYPQPQL GDA9 WHEAT P18573 84-100 (L) P2LPYPQPQLPYPQPQÍ.
GDA9XVHEAT P18573 91-107 ( ) PQLP?PQPQLPYPQPQP TREMBL Q41509 ALPHA-GLIADIN 77-93 (G) QLQPFLQPQLPYSQPQP Q41528 ALPHA-GLLAniN 76-92 (F) QLQPFPQEQLPYSQPQF Q41529 ALPHA GLJLADIN 79-95 (M) POPOPFLPOLPYPOPOS Q41530 ALPHA-GLIADEN 77-93 í) QLQPFgQPQLPYSQPQP Q41531 ALFHA-GLIADIN 77-93 (F) QLQPFPQPQLPY QPQP Q41533 ALPHA-GLIADrN 57- 3 (F) QLQPFPQPQLPY^QPQP Q41S46 ALPHA BETA-GLlAJDIN 79-95 (M) PQPQPFLPQLPYPQPQS Q 1632 ALPHA/BETA-TYPE GLIADJX Triúcutn urartu 82-98 (P) PQPOPFPPOLPYPOPPP Q9ZP09 ALPHA-GLIADIN TptJcum speha 77-93 (F) QLQPFPQPQLPYSQPQP Tabla 8. Bioacüvldad de las variantes substituidas de A-gliadina 57-73 QE65 (subst) comparada con gliadina A 57-73 QE65 (G) (media 100% 95% CT 97-104) y objetivo (no péptido, bl) (media 7.1%, 95% Cl: 5.7-8.5) rnG Snbjt % r«« >*?h_< r-»G JS k_t PitC PwM Super-agonista FC2 71 0.001 _u_ 47 «O.O0O1 N66 2* «=00001 Yß 129 «0.00 vo 70 «o.oooi C69 4 . <s.ooot S-C4 24 <0.0001 01 Y70 129 0.0006 S69 -70 «D.0O01 1*63 47 o.ooo? Kß 23 <o.ooo? Agonista H63 70 ooo? H6* 47 «0.0001 65 23 Q.0O0I W70 119 0017 FEJ 70 0.008 M68 46 <-o.oooi H6C 23 <o.ooo? KS7 li002 po 69 «ooooi JMS 46 «aoooi K67 22 <o.ooo? YS9 li? 0.O4 ta «9 "-o.oooi V<» 46 «o.ooot L64 22 -C0.0001 A57 U6 0.046 L61 69 «o.oooi G63 45 «o.oooi fißc 22 <o.ooo? S70 116 0.043 S61 ? «00001 V*4 45 «30.0001 F<7 21 0.000I KS» U4 008 T6J 69 «o _s_? E61 43 0.0001 « 21 <o.ooa\ w» 110 0.31 TO 69 «0.0001 A«9 43 «aoooi GM 21 <J0.O 0l A73 109 0.24 66 6- <0.0001 B.63. 42 • «o.oooi Gé5 2t <o.ooo? 15? IOS 037 769 67 <o.ooo? GtS 41 O.000l D64 21 «a.0001 G_» 108 03 KCO 66 <o.ooo? A64 2 «c.oooi íes 21 <00001 J-5» ?os 0-3 S SO 66 o.oooi C65 42 «D.0001 M*4 20 n.ooo? «0.0001 W60 10. 0.62 M61 66 «o.oooi N67 41 «o.oooi G67 19 -cooooi «0.0001 A59 104 0 SI P61 65 «O.OOOl W63 41 oooo? T«S 19 <0.000l 0.003 K72 104 065 M62 64 «sO.COOl F<S» 41 <0.0001 A.66 19 <aoo?i «ooooi S59 103 0.76 íl 64 «ooooi N68 40 «O.OOOt M-t 19 •F.oooi 0.0003 K7. 102 0.8 C*l 64 «O.OOOl V«6 40 «0.0001 R__» 19 o.ooo? 0.0001 ?70 103. 0.81 *« 64 «0.0001 H-9 40 <0.0001 Í7 19 <o.ooo? «o.oooi YM 101 0.96 M2 60 «OOOOl M» 40 «0.0001 K(8 18 <M.OO01 «0.0001 ?72 1.00 0.94 US 60 -B0O01 R6» 40 o.oao? B(4 18 «-a.ooot «00001 Sß 9» 0.67 S67 39 «saooot 65> 40 «0.0001 W(4 18 <0.- »? aoooi KS9 96 0.46 N6) S9 O.OOOl Qß» 39 <0D00l 065 18 <oooo? O.0002 leo 96 05 Iß» 5? «0.0001 -ET 38 «0.0001 F64 16 <o.ooo? 0.0008 C7D 95 0.41 V«l 5. «O.OOOl » 38 OO0OI l-ss 16 aooo? 0.OO22 D«S 95 0.44 Dßt 58 <o.ooo? K«- 38 «aoooi NS 16 <ooas? «O.DOOl E70 93 0-27 B60 57 <aooo? E67 37 «ooßoi MS 16 •C0.O001 0.12 ISl 92 0.19 A61 57 <o.ooo? US» 37 «o.oooi «7 15 o.ooo? 0.0012 S« 92 0.23 Qßt 56 «o.osoi S6 36 <aooo? M65 14 <o.ooo? OJJ15 rs» 88 O?g vea 56 «0.0001 G62 36 «O.OOOl ?«6 14 <o.ooo? 0.013 M-3 87 003 N6S S« <oaoo? E* 36 «aoooi B67 1 <0.0001 0.002 K7I «s 0O 7 MI 56 «ooooi E68 36 «0.0001 Sin agonista V62 84 004 A«S 53 «o.oooi VÍ7 35 «O.OOOl M3 13 «0.0001 0.012 170 84 0.04 .66 53 0.0001 WJ 35 «o.osoi XM 12 «0.0001 0.053 161 83 001 Sil S3 «aoooi utx 34 <0.000l WßS 11 «0.0001 0.24 VÍ8 « 0-O04J S68 53 «00001 Q«6 34 0.0001 0*4 I] «0.0001 01$ ES» 81 0.01 Y63 52 «o.oooi A*7 33 <o.ooo? G** 11 -?.0001 0.07 Agonista pal cial W*S 51 «0.O0O1 f«Z 32 «o.oooi R65 11 «o.oooi 0.26 W£l 79 0002 EO 51 «0.0001 F6* 31 «o.oooi YÍ7 10 «0.0001 0.13 ACO 7S ooo. T64 31 «0.0001 B62 31 .-0.0001 K*6 10 «0.0001 0.17 Y6I 78 0006 TS7 51 «D.aooi D*9 31 «o.oooi KC6 10 «o.oooi 021 Cßo Tt 0.003 Y*» 50 «0.0001 ß67 30 <0.0001 RC(. to «0.0001 0.23 ?.v 77 0.003 DO 30 «0.0001 M<7 29 0.000l S7 10 <o.ooo? o.st wcz 76 0.0009 A.6S 49 «3.0001 Y<6 28 <o.ooo? P65 8 «0.0001 0.S7 QSO 76 0.001 K61 49 «0.0001 M7 38 íOcOOOl ?ao 8 «0.0001 0.82 ??3 71 0.0002 166 49 «O.00OI BKS 26 O.0O01 KCS 8 -a., oooi 0.43 1-2 74 0.0005 T*8 48 «0.0001 s8 26 <o.oaot Y65 7 •ao.aooi 0.9 KTO 74 0.001 865 48 «0.0001 Y64 25 ß.oo?? HSt 72 «o.oooi L*S 48 «OOOOl BKC 25 «-0.0O01 5 « 72 50.OOOl Q6S 48 <aooo? T66 25 <-0.00Ot Tabla 9. Antagonismo de respuesta de ELISPOT gama interferona de gliadina-A 57-73 QE65 por variantes substituidas de gliadina-A 57-73 QE65 (subst) (P es nivel significante en prueba de t no apareada) . También se muestra la ctividad agonista (% agonista) de péptidos comparada con la gliadina-A 57-73 QE65.
Subst '/. Inhibit. P % agonist- Sub-rt % lnlu-ñt- P % agsais Agón listas «SSR 13 0.18 11 65T 28 0 004 19 d5M 13 0.16 14 67M 27 0.005 29 68P 13 0 16 26 2 64 26 0.007 18 63R 13 0 19 19 67W 25 0.008 19 66G 12 0.19 1 1 8 Agonis tas potenciales 65Q 12 0.2 18 671 24 0.013 10 65Y 12 0.22 7 67Y 24 0.013 21 66S 12 0.22 22 64G 21 0.03 21 *S7F 11 0 25 21 6dD 21 0 029 16 66R 10 0.29 10 65L. 20 0.046 26 67K 10 0 29 10 66N 20 0.037 24 64F 10 0.29 16 6SH 20 0.038 16 65F 9 0 41 16 64N 19 0.05 16 63P 8 0 42 13 64Y 19 0 06 25 65EK 8 0.39 25 66Y 19 0.048 28 64Q 7 0.49 11 674E 19 0.049 12 641 5 0.6 21 6 A 18 0.058 30 •58K 5 0.56 19 67H 18 0.052 22 67Q 5 0 61 18 Sin agonistas 6SG 5 0.62 15 6SV 17 0.07 23 64M 4 0.7 20 651 17 0.086 21 66H 4 0.66 23 (¡6T 17 0 069 25 66 £ 3 0 76 10 65W 15 0.11 11 66'D 1 0.9 14 <S7R 15 0.13 14 63K 1 0 88 23 GSP 15 0 13 8 64H 1 0.93 18 65 K 15 o.p 8 66K 0 0 98 10 «6W 15 0.12 21 64K -2 0.88 8 67C 14 0 14 19 64L -U 0.26 22 66A 14 0.14 19 Tabla 10. Inhibición de respuesta de ELISPOT gama interferona de gliadina-A 57-73 QE65 por péptidos conocidos por enlazarse a HLA-DQ2 (P es el nivel de significancia de prueba t no apareada) .
Péptido % Inhibición P TP 31 <0 . 0001 HLA l a 0 0 . 95 Tabla 11. Antagonismo de respuesta de ELISPOT gama interferona de gliadina-A 57-73 QE65 por polimorfismos que se originan naturalmente de gliadina-A 57-73 QE65 (P es nivel significante en prueba de t no apareada) .
Gliadina A 57-73 QE65 polimorfismo •/• Inhibh- P P04725 82-98 QE90 POPOPFPPELPYPOPQS 19 0.009 Q41509 77-93 QE85 QLQPFI^QPE PYSQPQP 11 0.15 Glia 1,6 58-74 QE66 fQPFPPPELPYPQJ P 11 0.11 P04723 77-93 QE85 POPOPFPPELPYPQTOP 10 0.14 Glirx 3-5 57-73 QE65 QLQPFPQPELSYSQPQP 7 0.34 P02863 77-93 QE85 QLQPFPQPELPYSQPQP 6 0.35 Q41509 77-93 OE85 QLQPF QPEL X§QPQP 6 0 41 P04727 79-95 QE65 POPOPFI-PE PYPOPOS 6 0 39 P04726 82-98 QE90 PQPQPFPPELPYPQPEP 5 0.43 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (59)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método de diagnosis de padecimientos coeliacos, o susceptibilidad a padecimientos coeliacos, en un individuo, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra a partir del hospedero con un agente seleccionado de (i) el epítope que comprende una secuencia la cual es: SEC ID NO:l ó 2, o una secuencia equivalente a partir de un homólogo que se origina naturalmente de la gliadina representada por la SEC ID NO:3, (ii) un epítope que comprende la secuencia que comprende: SEC ID NO:l, o una secuencia equivalente a partir de un homólogo que se origina naturalmente en la gliadina representada por la SEC ID NO: 3, en la cual el epítope es un oligopeptido aislado derivado de una proteína gliadina, (iii) un análogo de (i) ó (ii) el cual es capaz de ser reconocido por un receptor de las células T que reconoce (i) ó (ii), el cual en el caso de un análogo peptídico no es más de 50 aminoácidos en longitud, o (iv) un producto que comprende dos o más agentes como se define en (i), (ii) o (iii), y (b) determinar in vi tro si las células T en la muestra reconocen el agente, reconocimiento por las células T que indica que el individuo tiene, o es susceptible al, padecimiento coeliaco.
2. Uso de un agente como se define en la reivindicación 1 para la preparación de medios de diagnóstico para uso en un método de diagnosis de un padecimiento coeliaco, o susceptibilidad a padecimiento coeliaco, en un individuo, dicho método comprende determinar si las células T del individuo reconocen el agente, reconocimiento por las células T que indica que el individuo tiene, o es susceptible a padecimiento coeliaco.
3. Un método o uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el agente es un análogo (iii) el cual comprende (i) ó (ii) enlaces a (a) una molécula HLA, o (b) un fragmento de una molécula HLA capaz de enlazarse a (i) ó (ii) .
4. Un método o uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la molécula o fragmento HLA está en un complejo que comprende cuatro moléculas HLA o fragmentos de moléculas HLA.
5. Uso de conformidad con la reivindicación 2, 3 ó 4, en donde el método comprende administrar el agente a la piel de un individuo y detectar la presencia de inflamación en el sitio de administración, la detección de la inflamación indica que las células T del individuo reconocen el agente.
6. Un método de conformidad con la reivindicación 1, 3 ó 4, caracterizado porque la muestra es una muestra de sangre .
7. Un método de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4 ó 6, caracterizado porque las células T no son estimuladas de una manera específica del antígeno in vi tro antes de dicha determinación.
8. Un método o uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en las cuales el reconocimiento del agente por las células T está determinado detectando la secreción de una citosina a partir de las células T.
9. Un método o uso de conformidad con la reivindicación 8 en la cual la citosina es la IFN-?.
10. Un método o uso de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, en la cual la citosina es detectada permitiendo a la citosina enlazarse a un anticuerpo inmovilizado específico a la citosina y después detectar la presencia del complejo de anticuerpo/citosina .
11. Un método o uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde dicha determinación se hace midiendo si el agente se enlaza al receptor de las células T.
12. Un método para identificar un análogo como se define en una reivindicación 1, 3 ó 4, caracterizado porque comprende determinar si una substancia candidato es reconocida por un receptor de las células T que reconoce un epítope que comprende una secuencia como se define en la reivindicación 1, reconocimiento de la substancia que indica que la substancia es un análogo.
13. Un método de diagnosis de padecimiento coeliaco, o susceptibilidad a padecimiento coeliaco, en un individuo, caracterizado porque comprende determinar la presencia de un anticuerpo que se enlaza a un epítope de un epítope que comprende la secuencia como se define en la reivindicación 1 en una muestra a partir del individuo, la presencia del anticuerpo que indica que el individuo tiene, o es susceptible a padecimiento coeliaco.
14. Un agente como se define en la reivindicación 1, opcionalmente en asociación con un portador, para uso en un método de tratamiento o prevención de padecimiento coeliaco tolerando células T las cuales reconocen el agente.
15. Un antagonista de una célula T la cual tiene un receptor de células T como se define en la reivindicación 1 (iii), opcionalmente en asociación con un portador, para uso en un método de tratamiento o prevención de padecimientos coeliacos por antagonización de tales células T.
16. Un agente como se define en la reivindicación 1 o un análogo que se enlaza a un anticuerpo como se define en la reivindicación 13 para uso en un método de tratamiento o prevención de padecimientos coeliacos en un individuo tolerando el individuo para prevenir la producción de tal anticuerpo .
17. Un método para determinar si una composición es capaz de causar padecimiento coeliaco, caracterizado porque comprende determinar si una proteína capaz de ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia de oligopéptidos como se define en la reivindicación 1, está presente en la composición, la presencia de la proteína indica que la composición es capaz de causar padecimiento coeliaco.
18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque dicha determinación se hace al poner en contacto la composición con un anticuerpo específico para la secuencia la cual es capaz de ser modificada a la secuencia de oligopéptido, el enlace del anticuerpo a una proteína en la composición que indica que la composición es capaz de causar padecimientos coeliacos.
19. Una proteína de gliadina mutante cuya secuencia de tipo nativa puede ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia, caracterizada porque comprende una secuencia que comprende el epítope como se define en la reivindicación 1, pero en la cual la proteína gliadina mutante se ha modificado en tal forma que no contiene una secuencia la cual puede ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia que comprende una secuencia que comprende epítope como se define en la reivindicación 1; o un fragmento de tal proteína gliadina mutante, la cual es al menos de 15 aminoácidos de longitud y la cual comprende una secuencia la cual se ha modificado en dicha forma.
20. Una proteína caracterizada porque comprende una secuencia la cual es capaz de enlazarse a un receptor de las células T, en el cual el receptor de las células T reconoce un agente como se define en la reivindicación 1, y en la cual la secuencia es capaz de causar un antagonismo de una célula T que porta tal receptor de las células T.
21. Un método para identificar un antagonista de una célula T, en el cual la célula T reconoce un agente como se define en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende poner en contacto una substancia candidato con la célula T y detectar si la substancia causa una disminución en la habilidad de la célula T para someter una respuesta específica del antígeno, la detección de cualquiera de tales disminuye en la habilidad, indicando que la substancia es un antagonista .
22. Un equipo para llevar a cabo el método o uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque comprende un agente como se define en la reivindicación 1, 3 ó 4 y un medio para detectar el reconocimiento del péptido por la célula T.
23. Un equipo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque los medios para detectar el reconocimiento comprenden un anticuerpo a IFN-?.
24. Un equipo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el anticuerpo es inmovilizado en un soporte sólido y opcionalmente el equipo también comprende un medio para detectar el complejo anticuerpo/IFN-?.
25. Un agente como se define en la reivindicación 1 o un antagonista como se define en la reivindicación 15.
26. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un agente o antagonista como se define en la reivindicación 25 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable .
27. Una composición para tolerar un individuo a una proteína gliadina para suprimir la producción de una célula T o una respuesta anticuerpo a un agente como se define en la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende un agente como se define en la reivindicación 1.
28. Una composición para antagonizar una respuesta a las células T a un agente como se define en la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende un antagonista como se define en la reivindicación 15.
29. Uso de un agente o antagonista como se define en la reivindicación 24 o una secuencia de tipo nativa como se define en la reivindicación 19 para producir un anticuerpo específico al agente, antagonista o secuencia de tipo silvestre .
30. Uso de una mutación en un epítope de una proteína gliadina, en la cual el epítope es como se define en la reivindicación 1, para disminuir la habilidad de la proteína gliadina para causar padecimiento coeliaco.
31. Un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una proteína o fragmento como se define en la reivindicación 19 ó 20.
32. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque adicionalmente comprende una o más secuencias regulatorias operablemente ligadas a la secuencia codificante, en la cual las secuencias regulatopas son capaces de asegurar la expresión de la secuencia codificante en una célula.
33. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la(s) secuencia (s) regulatorias permiten la expresión de la secuencia codificante en una célula de mamífero o procariótica.
34. Un polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 31 a 33, caracterizado porque es un vector o el cual está en la forma de un vector.
35. Una célula caracterizada porque comprende un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34 o la cual se ha transformado con tal polinucleótido .
36. Una célula de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque es una célula procariótica o una célula de mamífero.
37. Un mamífero que expresa un receptor de las células T como se define en la reivindicación 1.
38. Método para identificar un producto el cual es terapéutico para el padecimiento coeliaco caracterizado porque comprende administrar una substancia candidato a un mamífero como se define en la reivindicación 37, la cual tiene o la cual es susceptible a padecimientos coeliacos y determinar si la substancia previene o trata el padecimiento coeliaco en el mamífero, la prevención o tratamiento del padecimiento coeliaco indica que la substancia es un producto terapéutico .
39. Un producto terapéutico como se define en el método de la reivindicación 38 para uso en un método de prevención o tratamiento de padecimientos coeliacos.
40. Un método de diagnosis de padecimiento coeliaco, o susceptibilidad a padecimientos coeliacos en un individuo, caracterizado porque comprende administrar un agente como se define en la reivindicación 1, y determinar in vivo o in vi tro si las células T en el individuo reconocen el agente, reconocimiento del agente que indica que el individuo tiene o es susceptible a padecimientos coeliacos.
41. Un método de prevención o tratamiento de padecimientos coeliacos, caracterizado porque comprende administrar un agente o composición como se define en la reivindicación 1 o uno cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.
42. Un método para prevenir o tratar padecimientos coeliacos, caracterizado porque comprende (a) diagnosis del padecimiento coeliaco en un individuo en un método como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 40, y (b) administrar a un individuo reconocido en (a) por tener, o ser susceptible al padecimiento coeliaco de un agente terapéutico para prevenir o tratar el padecimiento coeliaco.
43. Una célula de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque es una célula ce una especie de monocotiledónea graminácea.
44. Una célula de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque es una célula de trigo, maíz, cebada, centeno, arroz, avena, triticale, sorgo o caña de azúcar.
45. Un proceso para la producción de una proteína codificada por una secuencia codificante como se define en la reivindicación 31, caracterizado porque el proceso comprende: (a) cultivar una célula de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 35, 36, 43 o 44, bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína; y opcionalmente (b) recuperar la proteína expresada.
46. Un método para obtención de una célula de planta transgénica, caracterizado porque comprende:. (a) transformar una célula de planta con un vector de conformidad con la reivindicación 34 para dar una célula de planta transgénica.
47. Un método para obtención de una primera generación de planta transgénica, caracterizado porque comprende : (b) regenerar una célula de planta transgénica transformada con un vector de conformidad con la reivindicación 34 para dar una planta transgénica.
48. Un método para obtención de una semilla de planta transgénica, caracterizado porque comprende: (c) obtener una semilla transgénica a partir de una planta transgénica obtenible por el paso (b) de la reivindicación 47.
49. Un método para obtener una progenie de planta transgénica, caracterizado porque comprende obtener una segunda generación de progenie de planta transgénica a partir de una primera generación de planta transgénica obtenible por un método de conformidad con la reivindicación 47, y opcionalmente obtener plantas transgénicas de una o más generaciones ad. cionales a partir de la segunda generación de progenie de planta así obtenida.
50. Un método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque comprende: (d) obtener una semilla transgénica a partir de una primera generación de planta transgénica obtenible por el método de conformidad con la reivindicación 48, después obtener una segunda generación de progenie de planta transgénica de la semilla transgénica, y/o (e) propagar clonalmente una primera generación de planta transgénica obtenible por el método de conformidad con la reivindicación 47 para dar una para dar una segunda generación de progenie de planta; y/o (f) cruzar una primera generación de planta transgénica obtenible por un método de conformidad con la reivindicación 47 con otra planta para dar una segunda generación de progenie de planta; y opcionalmente (g) obtener plantas de progenies transgénicas de una o más generaciones a partir de la segunda generación de progenie de planta así obtenida.
51. Una célula de planta transgénica, semilla de planta o progenie de planta obtenible por un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 51.
52. Una planta transgénica o semilla de planta, caracterizada porque comprende células de plantas de conformidad con la reivindicación 43 o 44.
53. Un callo de célula de planta transgénica, caracterizado porque las células de planta de conformidad con la reivindicación 43 o 44 obtenibles de una célula de planta transgénica, primera generación de planta, semilla de planta o progenie como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 43, 44 o 46 hasta 50.
54. Una planta o callo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 53, caracterizada porque es de una especie como se define en la reivindicación 43 o 44.
55. Un método para obtener un producto de cultivo, caracterizado porque comprende cosechar un producto de cultivo de una planta de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51 hasta 54 y opcionalmente además procesar el producto cosechado.
56. Un método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la planta es una planta de trigo y el producto de cultivo cosechado es un grano; opcionalmente además procesado en harina y otro producto de grano. 5
57. Un producto de cultivo obtenible por un método de conformidad con la reivindicación 55 ó 56.
58. Un alimento que comprende una proteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20.
59. Un alimento de conformidad con la 10 reivindicación 58, caracterizado porque una proteína como se define en la reivindicación 19 ó 20 es usada en lugar de gliadina de tipo nativa. 15 20 ^^H^^^^ RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método de diagnosis de un padecimiento coeliaco, o susceptibilidad a padecimiento coeliaco, en un individuo que comprende: (a) poner en contacto una muestra a partir del hospedero con un agente seleccionado de (i) el epítope que comprende una secuencia la cual es: SEC ID N0:1 ó 2, o una secuencia equivalente a partir de un homólogo que se origina naturalmente de la gliadina representada por la SEC ID NO: 3, (ii) un epítope que comprende la secuencia que comprende: SEC ID NO:l, o una secuencia equivalente a partir de un homólogo que se origina naturalmente en la gliadina representada por la SEC ID NO: 3, en la cual el epítope es un oligopeptido aislado derivado de una proteína gliadina, (iii) un análogo de (i) ó (ii) el cual es capaz de ser reconocido por un receptor de las células T que reconoce (i) ó (ii), el cual en el caso de un análogo peptídico no es más de 50 aminoácidos en longitud, o (iv) un producto que comprende dos o más agentes como se define en (i) , (íi) o (iii) , y (b) determinar ín vi tro si las células T en la muestra reconocen el agente, reconocimiento por las células T que indica que el individuo tiene, o es susceptible al, padecimiento coeliaco. DX 3Í.1S También se proporcionan las composiciones terapéuticas las cuales comprenden el epítope y las proteínas gliadinas las cuales no causan padecimientos coeliacos. O 1 3^ 5
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