ES2335895T3 - Epitopo de diagnostico y terapeutico. - Google Patents

Abstract

Un péptido cuya longitud no supera los 50 aminoácidos, y que puede ser reconocido por un receptor de células T que reconoce un epítopo que comprende la secuencia 62PQPELPY68 (SEQ ID NO: 1).

Description

Epítopo de diagnóstico y terapéutico.

La presente invención se refiere al diagnóstico y terapia de enfermedad celiaca, y a péptidos obtenidos de una proteína de gliadina que no causa enfermedad celiaca.

Una reacción inmunitaria a la gliadina (un componente del gluten) en la dieta causa enfermedad celiaca. Se sabe que las respuestas inmunitarias en el tejido intestinal responden preferentemente a gliadina que ha sido modificada por una transglutaminasa intestinal. La enfermedad celiaca se diagnostica por detección de anticuerpos antiendomisiales, pero esto requiere confirmación por el hallazgo de una inflamación linfocítica en biopsias intestinales. La toma de dicha biopsia es incómoda para el paciente.

Los investigadores han supuesto anteriormente que sólo las respuestas de células T intestinales proporcionan una indicación precisa de la respuesta inmunitaria contra gliadinas. Por tanto, se han concentrado en la investigación de respuestas de células T en tejido intestinal^{1}. Por ejemplo, el documento EP-0.905.518 desvela epítopos de células T de glutenina y gliadina. Éstos son reconocidos específicamente por células T sensibles o específicas del gluten obtenidas intestinalmente. Los péptidos tienen secuencias SGQGSFQPSQQ (gliadina 206-216; SEQ ID NO: 4) y GQQGYYPTSPQQSGQ (glutenina; SEQ ID NO: 5). Se conocen epítopos de gliadina que requieren modificación de transglutaminasa (antes de ser reconocidos por el sistema inmunitario)^{2}.

Los autores de la invención han encontrado el epítopo de célula T inmunodominante reconocido por el sistema inmunitario en enfermedad celiaca, y han demostrado que es reconocido por células T en la sangre periférica de individuos con enfermedad celiaca. Se encontró que dichas células T están presentes en frecuencias suficientemente altas para ser detectables sin reestimulacíón (es decir, podría usarse un sistema de detección de "nueva respuesta"). El epítopo se identificó usando un procedimiento basado en clonación de células no T que proporcionaba un reflejo más preciso de los epítopos en reconocimiento. El epítopo inmunodominante requiere modificación de transglutaminasa (que causa la sustitución de una glutamina particular por glutamato) antes de reconocimiento por el sistema inmunitario.

Basándose en este trabajo, los autores de la invención han desarrollado una prueba que puede usarse para diagnosticar enfermedad celiaca en una fase temprana. La prueba puede efectuarse en una muestra de sangre periférica y por tanto no se requiere una biopsia intestinal. La prueba es más sensible que las pruebas de anticuerpos que se están usando en la actualidad.

La invención proporciona así un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo que comprende:

(a) puesta en contacto de una muestra del hospedador con un agente seleccionado entre (i) un péptido cuya longitud no supera los 50 aminoácidos, y que puede ser reconocido por un receptor de células T que reconoce un epítopo que comprende la secuencia ^{62}PQPELPY^{68} (SEQ ID NO: 1) ; (ii) un péptido de (i), en el que el péptido es una variante sustituida de A-gliadina 57-73 QE65 que comprende la sustitución de aminoácido S63, D65, 163, M63, VS2 o V68; (iii) un péptido de (i), en el que el péptido es una variante sustituida de A-gliadina 57-73 QE65 que comprende la sustitución de aminoácido Y62, W62, L63, 162, W68, F62, V63, H63, F63, 162, T63, M66, S62, M62, A63, L62, 168, S67, Q62, F68, N65, A62, A68, P66, S68, Y63, E63, T64, T67 o D63; (iv) un péptido de (i), en el que el péptido es un antagonista del receptor de células T que comprende la sustitución de aminoácido 65T, 67M, 64W o 67W; (v) una proteína de fusión que comprende un péptido según (i), (ii), (iii) o (iv) y otra secuencia de gliadina o de no gliadina; o un péptido de (i), (ii), (iii) o (iv), o una fusión de (v), que comprende un aminoácido no natural, y

(b) determinación in vitro de si las células T en la muestra reconocen el agente, reconocimiento por las células T que indica que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca.

La memoria descriptiva también proporciona el uso del agente para la preparación de un medio de diagnóstico para uso en un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento la determinación de si las células T del individuo reconocen el agente, reconocimiento por las células T que indica que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca.

El hallazgo de un epítopo inmunodominante que es modificado por transglutaminasa permite también el diagnóstico de enfermedad celiaca basándose en determinar si están presentes otros tipos de respuesta inmunitaria a este epítopo. Así la memoria descriptiva proporciona también un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo que comprende la determinación de la presencia de un anticuerpo que se une al epítopo en una muestra del individuo, la presencia del anticuerpo que indica que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca.

La memoria descriptiva proporciona adicionalmente el agente, opcionalmente en asociación con un soporte, para uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de enfermedad celiaca por tolerización de células T que reconocen el agente. También se proporciona un antagonista de una célula T que tiene un receptor de células T que reconoce (i) o (ii), opcionalmente en asociación con un soporte, para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de enfermedad celiaca por antagonización de dichas células T. Adicionalmente se proporciona el agente o un análogo que se une a un anticuerpo (que se une al agente) para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de enfermedad celiaca en un individuo por tolerización del individuo para prevenir la producción de dicho
anticuerpo.

La memoria descriptiva proporciona un procedimiento de determinación de si una composición es capaz de causar enfermedad celiaca que comprende la determinación de si una proteína capaz de ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia de oligopéptidos según se define anteriormente está presente en la composición, indicando la presencia de la proteína que la composición es capaz de causar enfermedad celiaca.

La memoria descriptiva también proporciona una proteína de gliadina mutante cuya secuencia de tipo salvaje puede ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia que comprende una secuencia que comprende epítopo según se define anteriormente, aunque dicha proteína de gliadina mutante ha sido modificada de tal manera que no contiene secuencia que pueda ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia que comprenda dicha secuencia que comprende epítopo; o un fragmento de dicha proteína de gliadina mutante que tiene al menos una longitud de 15 aminoácidos y que comprende la secuencia que ha sido modificada de dicha manera.

La memoria descriptiva también proporciona una proteína que comprende una secuencia que es capaz de unirse a un receptor de células T, receptor de células T que reconoce el agente, y siendo capaz la secuencia de causar antagonismo de una célula T que lleva dicho receptor de células T.

Adicionalmente la memoria descriptiva proporciona un alimento que comprende las proteínas definidas anteriormente.

La invención se ilustra mediante los siguientes dibujos adjuntos en los que:

la fig. 1 muestra respuestas de ELISPOT de IFN\gamma de PBMC (célula mononuclear de sangre periférica) recién aislada (el eje vertical muestra puntos de formación de células por 10^{6} PBMC) a reserva 3 de péptidos tratados y no tratados con transglutaminasa (tTG) (cada péptido 10 \mug/ml) que incluye cinco 15-meros superpuestos que se extienden a A-gliadina 51-85 (véase Tabla 1) y gliadina digerida con \alpha-quimotripsina (40 \mug/ml) en el Sujeto 1 con enfermedad celiaca, inicialmente en remisión después de una dieta sin gluten y a continuación sometido a prueba de provocación con 200 g de pan diarios durante tres días desde el día 1 (a). Respuestas de ELISPOT de IFN\gamma de PBMC por el Sujeto 2 a reservas de péptidos de A-gliadina tratados con tTG 1-10 que se extienden a la proteína de A-gliadina completa durante prueba de provocación con pan de diez días (b). El eje horizontal muestra los días después de comenzar con el pan;

la fig. 2 muestra respuestas de ELISPOT de IFN\gamma de PBMC a reserva 3 de péptidos tratados con tTG (que se extienden A-gliadina 51-85) en 7 sujetos individuales con enfermedad celiaca (el eje vertical muestra células de formación de puntos por 10^{6} PBMC), inicialmente en remisión en dieta sin gluten, con prueba de provocación con pan durante tres días (días 1 a 3). El eje horizontal muestra días después de comenzar con el pan (a). Respuestas de Elispot de IFN\gamma de PBMC a péptidos 15-meros superpuestos tratados con tTG en reserva 3; las barras representan la respuesta media (ETM) a péptidos individuales (10 \mug/ml) en 6 sujetos con enfermedad celiaca en día 6 ó 7 (b). (En sujetos individuales, se calcularon las respuestas de ELISPOT a péptidos como un % de respuesta desencadenada por péptido 12 - según se muestra mediante el eje vertical);

la fig. 3 muestra respuestas de ELISPOT de IFN\gamma de PBMC a truncamientos tratados con tTG de A-gliadina 56-75 (0,1 \muM). Las barras representan la media (ETM) en 5 sujetos con enfermedad celiaca. (En sujetos individuales, las respuestas se calcularon como el % de la respuesta máxima desencadenada por cualquiera de los péptidos sometidos a prueba);

la fig. 4 muestra cómo se hizo corresponder la estructura mínima del epítopo de A-gliadina dominante usando péptidos de A-gliadina 7-17-meros tratados con tTG (0,1 \muM) incluyendo la secuencia, PQPQLPY (A-gliadina 62-68) (a), y los mismos péptidos sin tratamiento tTG pero con Q-E65 de sustitución (b). Cada línea representa respuestas de ELISPOT de IFN\gamma de PBMC en cada uno de los tres sujetos con enfermedad celiaca en el día 6 ó 7 después de ingerir pan en los días 1 a 3. (En sujetos individuales, las respuestas de ELISPOT se calcularon como un % de la respuesta desencadenada por el 17-mero, A-gliadina 57-73);

la fig. 5 muestra los aminoácidos que se desamidaron por tTG. Se incubó A-gliadina 56-75 (LQLQPFPQPQLPYP
QPQSFP) (0,1 \muM) con tTG (50 \mug/ml) a 37ºC durante 2 horas. Se identificó un único producto y se purificó por HPLC de fase inversa. El análisis de aminoácidos permitió calcular un % de desamidación (Q-E) de cada residuo de Gln en A-gliadina 56-75 atribuible a tTG (eje vertical);

la fig. 6 muestra el efecto de sustituir Q-E en A-gliadina 57-73 en otras posiciones además de Q65 usando los 17-meros: QLQPFPQPELPYPQPES (E57, 65), QLQPFPQPELPYPQPES (E65, 72), ELQPFPQPELPYPQPES (E57, 65, 72), y QLQPFPQPELPYYQPQS (E65) en tres sujetos con enfermedad celiaca el día 6 ó 7 después de que ingirieran pan en los días 1 a 3. El eje vertical muestra el % de la respuesta E65;

\newpage

la fig. 7 muestra que A-gliadina tratada con tTG 56-75 (0,1 \muM) desencadeno respuestas de ELISPOT de IFN\gamma en (a) PBMC con depleción de perlas magnéticas CD4 y CD8. (Las barras representan respuestas de PBMC con depleción de CD4 como un % de respuestas de PBMC con depleción de CD8; las células de formación de puntos por millón de PBMC con depleción de CD8 fueron: Sujeto 4: 29, y Sujeto 6: 535). (b) Respuestas de ELISPOT de IFN\gamma de PBMC (células de formación de puntos/millón de PBMC) después de incubación con anticuerpos monoclonales a HLADR (L243), -DQ (L2) y -DP (B7, 21) (10 \mug/ml) 1 h antes de 56-75 tratado con tTG (0,1 \muM) en dos sujetos con enfermedad celiaca homocígotos para HLA-DQ al*0501, bl*0201;

la fig. 8 muestra el efecto de sustituir Glu en posición 65 por otros aminoácidos en el epítopo inmunodominante. El eje vertical muestra la respuesta en % en los 3 sujetos en relación con el epítopo inmunodominante;

la fig. 9 muestra la inmunorreactividad de péptidos de gliadina de ocurrencia natural (midiendo respuestas de los 3 sujetos) que contienen la secuencia PQLPY con (sombreada) y sin (clara) tratamiento de transglutaminasa;

la fig. 10 muestra depleción de perlas inmunomagnéticas específicas de CD8, CD4, \beta_{7}, y \alpha^{E} de células mononucleares de sangre periférica de dos sujetos celiacos 6 días después de comenzar una prueba de provocación con gluten seguido de ELISpot de interferón gamma. Como antígeno se usaron A-gliadina 57-73 QE65 (25 mcg/ml), gliadina digerida con quimotripsina tratada con tTG (100 mcg/ml) o PPD (10 mcg/ml);

la fig. 11 muestra la longitud óptima de epítopo de célula T;

la fig. 12 muestra una comparación de A-gliadina 57-73 QE65 con otros péptidos en un estudio de dosis-respuesta;

la fig. 13 muestra una comparación de respuestas específicas de gliadina y A-gliadina 57-73 QE65;

la fig. 14 muestra la bioactividad de polimorfismos de gliadina en sujetos celiacos;

las fig. 15 y 16 muestran la definición de la secuencia de epítopo central.

las fig. 17 a 27 muestran la actividad agonista de variantes de A-gliadina 57-73 QE65;

la fig. 28 muestra respuestas en diferentes grupos de pacientes.

Descripción detallada de la invención

En su forma más amplia la invención se define en las reivindicaciones independientes:

Elemento 1 : un péptido cuya longitud no supera los 5 0 aminoácidos, y que puede ser reconocido por un receptor de células T que reconoce un epítopo que comprende la secuencia ^{62}PQPELPY^{68} (SEQ ID NO: 1).

Elementos 2 a 11 definen formas de realización preferidas.

Elemento 12: Un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo que comprende:

(a) puesta en contacto de una muestra del hospedador con un péptido o proteína de fusión de cualquiera de los elementos 1 a 6, y

(b) determinación in vitro de si células T en la muestra reconocen el péptido o proteína de fusión; indicando el reconocimiento por las células T que el individuo tiene o es susceptible a enfermedad celiaca.

Elemento 13: Uso de un péptido o proteína de fusión según cualquiera de los elementos 1 a 6 para la preparación de un medio de diagnóstico para uso en un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento la determinación de si las células T del individuo reconocen el péptido, indicando el reconocimiento por las células T que el individuo tiene o es susceptible a enfermedad celiaca.

Elementos 14 y 15 definen formas de realización preferidas.

Elemento 16: Un kit para efectuar un procedimiento o uso según cualquiera de los elementos 12 a 15 que comprende un péptido o proteína de fusión de cualquiera de los elementos 1 a 6 y un medio para detectar el reconocimiento del péptido o proteína de fusión por la célula T.

Elemento 17: Un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca en un individuo que comprende

(a) puesta en contacto de una muestra del individuo con un péptido o proteína de fusión según cualquiera de los elementos 1 a 6; y

(b) determinación de la presencia de un anticuerpo que se une al péptido o proteína de fusión, indicando la presencia del anticuerpo que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca.

Elemento 18: Un kit para efectuar el procedimiento del elemento 17 que comprende un péptido o proteína de fusión de cualquiera de los elementos 1 a 6; y un medio para detectar la unión del anticuerpo. Uso de un péptido o proteína de fusión según se define en cualquiera de los elementos 1 a 6 para producir un anticuerpo específico para el péptido.

Elemento 19: Un procedimiento para identificar un análogo de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos ^{62}PQPELPY^{68} (SEQ ID NO: 1) o ^{57}QLQPFPQPELPYPQPQS^{73} (SEQ ID NO: 2) que comprende la determinación de si una sustancia candidata es reconocida por un receptor de células T o un anticuerpo que reconoce el péptido, indicando el reconocimiento de la sustancia que la sustancia es un análogo.

SEQ ID NO: 1 se refiere a la secuencia de aminoácidos ^{62}PQPELPY^{68}

SEQ ID NO: 2 se refiere a la secuencia de aminoácidos ^{57}QLQPFPQPELPYPQPQS^{73}.

En la siguiente memoria descriptiva cualquier forma de realización que no se encuadre dentro del ámbito de las reivindicaciones se considera que no forma parte de la invención.

El término "enfermedad celiaca" comprende un espectro de dolencias causadas por grados variables de sensibilidad al gluten, incluyendo una forma grave caracterizada por una mucosa plana del intestino delgado (atrofia vellosa hiperplásica) y otras formas caracterizadas por síntomas más leves.

El individuo mencionado anteriormente (en el contexto de diagnóstico o terapia) es un ser humano.

Puede tener enfermedad celiaca (sintomática o asintomática) o ser sospechoso de tenerla. Puede estar con una dieta sin gluten. Puede estar en una respuesta de fase aguda (por ejemplo, puede tener enfermedad celiaca, pero sólo haber ingerido gluten en las últimas 24 horas antes de lo cual ha seguido una dieta sin gluten durante 14 a 28 días).

El individuo puede ser susceptible a enfermedad celiaca, como una susceptibilidad genética (determinada por ejemplo porque el individuo tiene parientes con enfermedad celiaca o posee genes que causan predisposición a enfermedad celiaca).

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El agente

El agente es normalmente un péptido, por ejemplo de 7 a 50 aminoácidos de longitud, como de 10 a 40, o de 15 a 3 0 aminoácidos de longitud.

SEQ ID NO: 1 es PQPELPY. SEQ ID NO: 2 es QLQPFPQPELPYPQPQS. SEQ ID NO: 3 se muestra en la Tabla 1 y es la secuencia de una A-gliadina entera. El glutamato en posición 4 de SEQ ID NO: 1 (equivalente a posición 9 de SEQ ID NO: 2) es generado por tratamiento con transglutaminasa de A-gliadina.

El agente puede ser el péptido representado por SEQ ID NO: 1 ó 2 o un epítopo que comprende secuencias que comprenden SEQ ID NO: 1 que es un oligopéptido aislado obtenido de una proteína de gliadina; o un equivalente de estas secuencias de una proteína de gliadina de ocurrencia natural que es un homólogo de SEQ ID NO: 3. Así el epítopo puede ser un derivado de la proteína representada por SEQ ID NO: 3. Dicho derivado es normalmente un fragmento de la gliadina, o un derivado mutado de la proteína entera o un fragmento. Por tanto el epítopo de la invención no incluye esta proteína de gliadina entera de ocurrencia natural, y no incluye otras gliadinas enteras de ocurrencia natural.

El epítopo puede así ser un fragmento de A-gliadina (por ejemplo SEQ ID NO: 3), que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, obtenible por tratamiento (completa o parcialmente) con transglutaminasa, es decir con 1, 2, 3 o más glutaminas sustituidas con glutamatos (incluyendo la sustitución dentro de SEQ ID NO: 1).

Dichos fragmentos pueden ser o pueden incluir las secuencias representadas por las posiciones 55 a 70, 58 a 73, 61 a 77 de SEQ ID NO: 3 mostradas en la Tabla 1. Normalmente dichos fragmentos serán reconocidos por células T en al menos la misma magnitud que los péptidos representados por SEQ ID NO: 1 ó 2 son reconocidos en cualquiera de los ensayos descritos en la presente memoria descriptiva usando muestras de pacientes con enfermedad celiaca.

En el caso en que el epítopo comprende una secuencia equivalente a los epítopos anteriores (incluyendo fragmentos) de otra proteína de gliadina (por ejemplo cualquiera de las proteínas de gliadina mencionadas en la presente memoria descriptiva o cualquier gliadina que cause enfermedad celiaca), dichas secuencias equivalentes corresponderán a un fragmento de una proteína de gliadina tratado normalmente (parcial o totalmente) con transglutaminasa. Dichos péptidos equivalentes pueden determinarse alineando las secuencias de otras proteínas de gliadina con SEQ ID NO: 3 (por ejemplo usando cualquiera de los programas mencionados en la presente memoria descriptiva). La transglutaminasa está disponible comercialmente (por ejemplo Sigma T-5398). La Tabla 4 proporciona ejemplos de secuencias equivalentes adecuadas.

El agente que es un análogo puede ser reconocido por un TCR que reconoce (a) el epítopo que comprende la secuencia que es: SEQ ID NO: 1 ó 2, o una secuencia equivalente de un homólogo de ocurrencia natural de la gliadina representada por SEQ ID NO: 3, (b) un epítopo que comprende la secuencia que comprende: SEQ ID NO: 1, o una secuencia equivalente de un homólogo de ocurrencia natural de la gliadina representada por SEQ ID NO: 3, epítopo que es un oligopéptido aislado obtenido de una proteína de gliadina. Por tanto generalmente cuando se añade el análogo a células T en presencia de (a) o (b), normalmente también en presencia de un antígeno que presenta la célula (ACP) (como cualquiera de las ACP mencionadas en la presente memoria descriptiva), el análogo inhibe el reconocimiento de (a) o (b), es decir el análogo es capaz de competir con (a) o (b) en dicho sistema.

El análogo puede ser uno que sea capaz de unirse al TCR que reconoce (a) o (b). Dicha unión puede someterse a prueba mediante técnicas estándar. Dichos TCR pueden aislarse a partir de células T que han demostrado que reconocen (a) o (b) (por ejemplo usando el procedimiento de la invención). La demostración de la unión del análogo a los TCR puede mostrarse a continuación por la determinación de si los TCR inhiben la unión del análogo a una sustancia que se une al análogo, por ejemplo un anticuerpo al análogo. Normalmente el análogo se une a una molécula MHC de clase II (por ejemplo HLA-DQ2) en dicha inhibición de ensayo de unión.

Normalmente el análogo inhibe la unión de (a) o (b) a un TCR. En este caso, la cantidad de (a) o (b) que puede unirse al TCR en presencia del análogo se reduce. Esto se debe a que el análogo es capaz de unirse al TCR y por tanto compite con (a) o (b) para unión al TCR.

Las células T para uso en los experimentos de unión anteriores pueden aislarse de pacientes con enfermedad celiaca, por ejemplo con la ayuda del procedimiento de la invención. Otras características de unión del análogo también pueden ser las mismas que (a) o (b), y así normalmente el análogo se une a la misma molécula MHC de clase II a la que se une el péptido (HLA-DQ2). El análogo normalmente se une a anticuerpos específicos para (a) o (b), y así inhibe la unión de (a) o (b) a dichos anticuerpos.

El análogo es normalmente un péptido. Puede tener homología con (a) o (b), normalmente al menos homología del 70%, preferentemente al menos homología del 80%, 90%, 95%, 97% o 99% con (a) o (b), por ejemplo en una región de al menos 15 aminoácidos contiguos más (como la longitud entera del análogo y/o (a) o (b), o a través de la región que está en contacto con el TCR o se une con la molécula MHC). Los procedimientos de medida de la homología de proteínas son bien conocidos en la técnica y los expertos en la materia comprenderán que en el presente contexto, la homología se calcula sobre la base de la identidad de aminoácidos (referida a veces como "homología dura").

Por ejemplo UWGCG Package proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo usada en sus ajustes por omisión) (Devereux y col. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Pueden usarse los algoritmos PILEUP y BLAST para calcular la homología o alinear secuencias (normalmente según sus ajustes por omisión), por ejemplo según se describe en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F y col. (1990) J Mol Biol 215:403-10.

El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primero la identificación de pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de breves palabras de longitud W en la secuencia de búsqueda que se correspondan con o satisfagan alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere como el umbral de puntuación de proximidad (Altschul y col., más arriba). Estos aciertos de palabras de proximidad inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas que encuentren HSP que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta el punto en que pueda incrementarse la puntuación de alineación acumulativa. Las extensiones para los aciertos de palabras en cada dirección se interrumpen cuando: la puntuación de alineación acumulativa desciende por debajo de la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa desciende a cero o inferior, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cada secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como valores por omisión una longitud de palabra (W) de 11, alineaciones de matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) (b) de 50, esperanza (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas
cadenas.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la semejanza entre dos secuencias; véase por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Una medida de semejanza proporcionada por el algoritmo BLAST es la mínima probabilidad sumatoria (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se produzca por casualidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad sumatoria mínima en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menor que aproximadamente 1, preferentemente menor que aproximadamente 0,1, más preferentemente menor que aproximadamente 0,01 y con la máxima preferencia menor que aproximadamente 0,001.

Los análogos de péptidos homólogos difieren normalmente de (a) o (b) en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8o más mutaciones (que pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones). Esta mutación puede medirse en cualquiera de las regiones mencionadas anteriormente en relación con el cálculo de homología. Las sustituciones son preferentemente "conservadoras". Éstas se definen según la Tabla siguiente. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse unos por otros:

1

Normalmente los aminoácidos en el análogo en las posiciones equivalentes a los aminoácidos en (a) o (b) que contribuyen a la unión de la molécula MHC o son responsables del reconocimiento por el TCR, son los mismos o se conservan.

Normalmente el péptido análogo comprende una o más modificaciones, que pueden ser modificaciones naturales post-traducción o modificaciones artificiales. La modificación puede proporcionar una fracción química (normalmente por sustitución de un hidrógeno, por ejemplo de un enlace C-H), como un grupo amino, acetil, hidroxi o halógeno (por ejemplo, flúor) o un grupo carbohidrato. Normalmente, la modificación está presente en el término N o C.

El análogo puede comprender uno o más aminoácidos no naturales, por ejemplo aminoácidos con una cadena lateral diferente de los aminoácidos naturales. Generalmente, el aminoácido no natural tendrá un término N y/o un término C. El aminoácido no natural puede ser un aminoácido L o D.

El análogo tiene normalmente una forma, tamaño, flexibilidad o configuración electrónica que es sustancialmente similar a (a) o (b). Normalmente es un derivado de (a) o (b). En una forma de realización el análogo es una proteína de fusión que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 ó 2, o cualquiera de los otros péptidos mencionados en la presente memoria descriptiva; y secuencia no gliadina.

En una forma de realización el análogo es o emula a (a) o (b) unido a molécula MHC de clase II. Pueden asociarse o unirse entre sí 2, 3, 4 o más de dichos complejos, por ejemplo usando un sistema basado en biotina/estreptavidina, en el que normalmente 2, 3 ó 4 moléculas MHC marcadas con biotina se unen a una fracción de estreptavidina. Este análogo inhibe normalmente la unión del complejo (a) o (b)/MHC Clase II a un TCR o anticuerpo que es específico para el complejo.

El análogo es normalmente un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, como un fragmento Fab o (Fab)_{2}. El análogo puede inmovilizarse en un soporte sólido, en particular un análogo que emula al péptido unido a una molécula MHC.

El análogo está diseñado normalmente por medios computacionales y a continuación se sintetiza usando procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente el análogo puede seleccionarse a partir de una biblioteca de compuestos. La biblioteca puede ser una biblioteca combinatoria o una biblioteca de muestra, como una biblioteca de muestra de fagos. La biblioteca de compuestos puede expresarse en la biblioteca de muestra en la forma de estar unidos a una molécula MHC de clase II, como HLA-DQ2. Los análogos se seleccionan generalmente a partir de la biblioteca basándose en su capacidad para emular las características de unión (a) o (b). Así pueden seleccionarse basándose en la capacidad para unirse a TCR o un anticuerpo que reconozca (a) o (b).

Normalmente, los análogos serán reconocidos por células T al menos en la misma magnitud en que se reconoce cualquiera de los agentes (a) o (b), por ejemplo al menos en la misma magnitud que el epítopo equivalente y preferentemente en la misma magnitud que el péptido representado por SEQ ID NO: 2, en cualquiera de los ensayos descritos en la presente memoria descriptiva, normalmente usando células T a partir de pacientes con enfermedad celiaca. Los análogos pueden reconocerse en estas magnitudes in vivo y así pueden ser capaces de inducir síntomas de enfermedad celiaca en al menos la misma magnitud que cualquiera de los agentes mencionados en la presente memoria descriptiva (por ejemplo en un paciente humano o un modelo animal).

Los análogos pueden identificarse en un procedimiento que comprende la determinación de si una sustancia candidata es reconocida por un receptor de células T que reconoce un epítopo de la invención, reconocimiento de la sustancia que indica que la sustancia es un análogo. Dichos TCR pueden ser cualquiera de los TCR mencionados en la presente memoria descriptiva, y pueden estar presentes en células T. Puede usarse cualquier ensayo adecuado mencionado en la presente memoria descriptiva para identificar el análogo. En una forma de realización, este procedimiento se efectúa in vivo. Según se menciona anteriormente, los análogos preferidos se reconocen al menos en la misma magnitud que el péptido SEQ ID NO: 2, y así el procedimiento puede usarse para identificar análogos que son reconocidos en esta magnitud.

En una forma de realización el procedimiento comprende la determinación de si una sustancia candidata es capaz de inhibir el reconocimiento de un epítopo de la invención, inhibición de reconocimiento que indica que la sustancia es un análogo.

El agente puede ser un producto que comprende al menos 2, 5, 10 ó 20 agentes según se define por (i), (ii) (iii), (iv) o (v). Normalmente la composición comprende epítopos de la invención (o análogos equivalentes) de diferentes gliadinas, como cualquiera de las especies o variedades o tipos de gliadina mencionadas en la presente memoria descriptiva. Las composiciones preferidas comprenden al menos un epítopo de la invención, o análogo equivalente, a partir de todas las gliadinas presentes en cualquiera de las especies o variedades mencionadas en la presente memoria descriptiva, o a partir de 2, 3, 4 o más de las especies mencionadas en la presente memoria descriptiva (como a partir del panel de especies consistentes en trigo, centeno, cebada, avena y triticale).

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Diagnóstico

Según se menciona anteriormente el procedimiento de diagnóstico de la invención puede basarse en la detección de células T que se unen al agente o en la detección de anticuerpos que reconocen el agente.

Las células T que reconocen el agente en el procedimiento (que incluye el uso mencionado anteriormente) son generalmente células T que han sido presensibilizadas in vivo a gliadina. Según se menciona anteriormente se ha encontrado que dichas células T experimentadas en antígeno están presentes en la sangre periférica.

En el procedimiento las células T pueden entrar en contacto con el agente in vitro o in vivo, y la determinación de si las células T reconocen el agente puede realizarse in vitro o in vivo. Así la invención proporciona el agente para uso en un procedimiento de diagnóstico practicado en el cuerpo humano. Se proporcionan diferentes agentes para uso simultáneo, separado o secuencial en dicho procedimiento.

El procedimiento in vitro se efectúa normalmente en solución acuosa en la que se añade el agente. La solución comprenderá también las células T (y en ciertas formas de realización las ACP expuestas más adelante). El término "contacto" según se usa en la presente memoria descriptiva incluye la adición de la sustancia en particular a la solución.

La determinación de si las células T reconocen el agente se realiza generalmente por detección de un cambio en el estado de las células T en presencia del agente o determinación de si las células T se unen al agente. El cambio en el estado está causado generalmente por actividad funcional específica de antígenos de la célula T después de que el TCR se une el agente. El cambio de estado puede medirse en el interior (por ejemplo cambio en la expresión intracelular de proteínas) o en el exterior (por ejemplo detección de sustancias secretadas) de las células T.

El cambio en el estado de la célula T puede ser el inicio o el aumento en la secreción de una sustancia a partir de la célula T, como una citocina, especialmente IFN-\gamma, IL-2 o TNF-\alpha. Se prefiere en particular la determinación de secreción de IFN-\gamma. La sustancia puede detectarse normalmente permitiendo que se una a un agente de unión específico y midiendo a continuación la presencia del complejo de agente de unión específica/sustancia. El agente de unión específica es normalmente un anticuerpo, como anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos a citocinas están disponibles comercialmente, o pueden prepararse usando técnicas estándar.

Normalmente el agente de unión específica se inmoviliza en un soporte sólido. Después de dejar que la sustancia se una al soporte sólido puede lavarse opcionalmente para retirar material que no está unido específicamente al agente. El complejo agente/sustancia puede detectarse mediante el uso de un segundo agente de unión que se unirá al complejo. Normalmente el segundo agente se une a la sustancia en un sitio que es diferente del sitio al que se une el primer agente. El segundo agente es preferentemente un anticuerpo y se etiqueta directa o indirectamente mediante una etiqueta detectable.

Así el segundo agente puede detectarse mediante un tercer agente que normalmente se etiqueta directa o indirectamente mediante una etiqueta detectable. Por ejemplo el segundo agente puede comprender una fracción de biotina, permitiendo la detección por un tercer agente que comprende una fracción de estreptavidina y normalmente fosfatasa alcalina como etiqueta detectable.

En una forma de realización el sistema de detección que se usa es el ensayo ELISPOT ex vivo descrito en el documento WO-98/23.960. En ese ensayo el IFN-\gamma secretado desde la célula T se une mediante un primer anticuerpo específico IFN-\gamma que se inmoviliza en un soporte sólido. El IFN-\gamma unido se detecta a continuación usando un segundo anticuerpo específico de IFN-\gamma que se etiqueta con una etiqueta detectable. Dicho anticuerpo etiquetado puede obtenerse de MABTECH (Estocolmo, Suecia). A continuación se exponen otras etiquetas detectables que pueden usarse.

El cambio en el estado de la célula T que puede medirse puede ser el aumento en la captación de sustancias por la célula T, como la captación de timidina. El cambio en el estado puede ser un aumento en el tamaño de las células T, o proliferación de las células T, o un cambio en los marcadores de superficie celular en la célula T.

En una forma de realización el cambio de estado se detecta midiendo el cambio en la expresión intracelular de proteínas, por ejemplo el aumento en la expresión intracelular de cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente. Dichos cambios intracelulares pueden detectarse mediante puesta en contacto del interior de la célula T con una fracción que se une a las proteínas expresadas de una manera específica y que permite la ordenación de las células T por citometría de flujo.

En una forma de realización cuando se une al TCR el agente se une a una molécula MHC de clase II (normalmente HLADQ2), que normalmente está presente en la superficie de un célula de presentación de antígeno (ACP). Sin embargo, según se menciona en la presente memoria descriptiva otros agentes pueden unirse a TCR sin la necesidad de unirse también a una molécula MHC.

Generalmente las células T que están en contacto en el procedimiento se toman del individuo en una muestra de sangre, aunque pueden usarse otros tipos de muestras que contienen células T. La muestra puede añadirse directamente al ensayo o puede procesarse primero. Normalmente el procesamiento puede comprender la dilución de la muestra, por ejemplo con agua o tampón. Normalmente la muestra se diluye de 1,5 a 100 veces, por ejemplo de 2 a 50 o de 5 a 10 veces.

El procesamiento puede comprender la separación de componentes de la muestra. Normalmente se separan de las muestras células mononucleares (MC). Las MC comprenderán las células T y ACP. Así en el procedimiento las ACP presentes en las MC separadas puede presentar el péptido a las células T. En otra forma de realización sólo las células T, por ejemplo sólo las células T CD4, pueden purificarse a partir de la muestra. Las PBMC, MC y células T pueden separarse de la muestra usando técnicas conocidas en la técnica, como las descritas en Lalvani y col. (1997) J. Exp. Med. 186, p859-865.

En una forma de realización las células T usadas en el ensayo están en la forma de muestras no procesadas o diluidas, o con células T recién aisladas (como en la forma de MC o PBMC recién aisladas) que se usan directamente ex vivo, es decir no se cultivan antes de ser usadas en el procedimiento. Así las células T no han sido reestimuladas en una manera específica de antígenos in vitro. Sin embargo las células T pueden cultivarse antes de uso, por ejemplo en presencia de uno o más de los agentes, y generalmente también citocinas de promoción del crecimiento exógenas. Durante el cultivo el o los agentes están presentes normalmente en la superficie de las ACP, como la ACP usada en el procedimiento. El precultivo de las células T puede conducir a un aumento en la sensibilidad del procedimiento. Así las células T pueden convertirse en líneas celulares, por ejemplo líneas celulares de corta duración (por ejemplo según se describe en Ota y col. (1990) Nature 346, pl83-187).

La ACP que está presente normalmente en el procedimiento puede ser del mismo individuo que la célula T o de un hospedador diferente. La ACP puede ser una ACP de ocurrencia natural o una ACP artificial. La ACP es una célula que es capaz de presentar el péptido a una célula T. Normalmente es una célula B, célula dendrítica o macrófago. Normalmente se separa de la misma muestra que la célula T y normalmente se copurifica con la célula T. Así la ACP puede estar presente en MC o PBMC. La ACP es normalmente una célula ex vivo recién aislada o una célula cultivada. Puede estar en la forma de una línea celular, como una línea celular de corta duración o inmortalizada. La ACP puede expresar moléculas MHC de clase II vacías en su superficie.

En el procedimiento pueden usarse uno o más agentes (diferentes). Normalmente las células T obtenidas de la muestra pueden colocarse en un ensayo con todos los agentes que están destinados para la prueba o pueden dividirse las células T y colocarse en ensayos separados cada uno de los cuales contiene uno o más de los agentes.

La invención también proporciona los agentes como dos o más de cualquiera de los agentes mencionados en la presente memoria descriptiva (por ejemplo las combinaciones de agentes que están presentes en el agente de composición expuesto anteriormente) para uso simultáneo, separado o secuencial (por ejemplo, para uso in vivo).

En una forma de realización se añade agente per se directamente a un ensayo que comprende células T y ACP. Según se expone anteriormente las células T y las ACP en dicho ensayo podrían estar en la forma de MC. Cuando se usan agentes que pueden ser reconocidos por la célula T sin necesidad de presentación por ACP, a continuación no se requieren ACP. Los análogos que emulan el (a) o (b) original unido a una molécula MHC son un ejemplo de dicho agente.

En una forma de realización el agente se proporciona a la ACP en ausencia de la célula T. A continuación se proporciona la ACP a la célula T, normalmente después de dejarse que se presente el agente en su superficie. El péptido puede haber sido captado en el interior de la ACP y presentado, o simplemente captado en la superficie sin entrar en el interior de la ACP.

La duración en la que el agente está en contacto con las células T variará dependiendo del procedimiento usado para determinación de reconocimiento del péptido. Normalmente se añaden de 10^{5} a 10^{7}, preferentemente de 5 x 10^{5} a 10^{6} PBMC, a dicho ensayo. En el caso en que se añade agente directamente al ensayo, su concentración es de 10^{-1} a 10^{3} \mug/ml, preferentemente de 0,5 a 50 \mug/ml o de 1 a 10 \mug/ml.

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Normalmente el lapso de tiempo durante el que las células T se incuban con el agente está comprendido entre 4 y 24 horas, preferentemente 6 y 16 horas. Cuando se usan PBMC ex vivo se ha encontrado que pueden incubarse 0,3 x 10^{6} PBMC en 10 \mug/ml de péptido durante 12 horas a 37ºC.

La determinación del reconocimiento del agente por las células T puede realizarse midiendo la unión del agente a las células T (esto puede efectuarse usando cualquier formato adecuado de ensayo de unión expuesto en la presente memoria descriptiva). Normalmente, las células T que se unen al agente pueden ordenarse basándose en esta unión, por ejemplo usando una máquina FACE. La presencia de células T que reconocen el agente se considera que tiene lugar si la frecuencia de células ordenadas usando el agente es superior a un valor de "control". La frecuencia de células T con experiencia en antígeno es generalmente de 1 por 10^{6} a 1 por 10^{3}, y por tanto puede determinarse si las células ordenadas son células con experiencia en antígenos.

La determinación del reconocimiento del agente por las células T puede medirse in vivo. Normalmente el agente se administra al hospedador y a continuación una respuesta que indica que puede medirse el reconocimiento del agente. El agente se administra normalmente por vía intradérmica o epidérmica. El agente se administra normalmente por puesta en contacto con el exterior de la piel, y puede retenerse en el sitio con la ayuda de un parche o apósito. Alternativamente el agente puede administrarse por aguja, por ejemplo por inyección, pero también puede administrarse por otros procedimientos como balística (por ejemplo las técnicas de balística que se han usado para suministrar ácidos nucleicos). El documento EP-A-0693119 describe técnicas que normalmente pueden usarse para administrar el agente. Normalmente se administra de 0,001 a 1.000 \mug, por ejemplo de 0,01 a 100 \mug o de 0,1 a 10 \mug de agente.

En una forma de realización puede administrarse un producto que es capaz de proporcionar el agente in vivo. Así puede administrarse un polinucleótido capaz de expresar el agente, normalmente en cualquiera de las formas descritas anteriormente para la administración del agente. El polinucleótido tiene normalmente cualquiera de las características del polinucleótido proporcionado por la invención que se expone más adelante. El agente se expresa a partir del polinucleótido in vivo. Normalmente se administra de 0,001 a 1.000 \mug, por ejemplo de 0,01 a 100 \mug o de 0,1 a 10 \mug de polinucleótido.

El reconocimiento del agente administrado a la piel se indica normalmente por la ocurrencia de inflamación (por ejemplo induración, eritema o edema) en el sitio de administración. Esto se mide generalmente por examen visual del sitio.

El procedimiento de diagnóstico basado en la detección de un anticuerpo que se une al agente se efectúa normalmente mediante puesta en contacto de una muestra del individuo (como cualquiera de las muestras mencionadas aquí, procesadas opcionalmente en cualquiera de las formas mencionadas en la presente memoria descriptiva) con el agente y la determinación de si un anticuerpo en la muestra se une al agente, indicando dicha unión que el individuo tiene, o es susceptible a enfermedad celiaca. Puede usarse cualquier formato adecuado de ensayo de unión, como cualquiera de los formatos mencionados en la presente memoria descriptiva.

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Terapia

La identificación del epítopo inmunodominante permite preparar productos terapéuticos que se dirigen a las células T que reconocen este epítopo (como las células T que participan en la respuesta inmunitaria contra gliadina). Este hallazgo permite también la prevención o tratamiento de enfermedad celiaca por supresión (por tolerización) de una respuesta de anticuerpo o célula T al epítopo.

Ciertos agentes de la invención se unen al TCR que reconoce el epítopo de la invención (medido usando cualquiera de los ensayos de unión expuestos anteriormente) y causan tolerización de la célula T que transporta el TCR. Dichos agentes, opcionalmente en asociación con un soporte, pueden usarse por tanto para prevenir o tratar enfermedad celiaca.

Generalmente la tolerización puede estar causada por los mismos péptidos que pueden (después de ser reconocidos por el TCR) causar actividad funcional específica de antígenos de la célula T (como cualquier actividad mencionada en la presente memoria descriptiva, por ejemplo secreción de citocinas). Dichos agentes causan tolerización cuando se presentan al sistema inmunitario en un contexto de "tolerización".

La tolerización conduce a una disminución en el reconocimiento de un epítopo de célula T o anticuerpo por el sistema inmunitario. En el caso de un epítopo de célula T puede estar causado por la deleción o anergización de células T que reconocen el epítopo. Así, la actividad de células T (por ejemplo según se mide en ensayos adecuados mencionados en la presente memoria descriptiva) en respuesta al epítopo disminuye. La tolerización de una respuesta de anticuerpo significa que se produce una cantidad disminuida de anticuerpo específico para el epítopo cuando se administra el epítopo.

Los procedimientos de presentación de antígenos al sistema inmunitario en dicho contexto son conocidos y se describen por ejemplo en Yoshida y col. Clin. Immunol. Immunopathol. 82, 207-215 (1997), Thurau y col. Clin. Exp. Immunol. 109, 370-6 (1997), y Weiner y col. Res. Immunol. 148, 528-33 (1997). En ciertas rutas de administración particulares pueden causar tolerización, como oral, nasal o intraperitoneal. Los productos particulares que causan tolerización pueden administrarse (por ejemplo en una composición que comprende también el agente) al individuo. Dichos productos incluyen citocinas, como citocinas que favorecen una respuesta Th2 (por ejemplo IL-4, TGF-\beta o IL-10). Los productos o agente pueden administrarse a una dosis que provoca tolerización.

La invención proporciona una proteína que comprende una secuencia capaz de actuar como un antagonista de la célula T (célula T que reconoce al agente). Dichas proteínas y dichos antagonistas también pueden usarse para prevenir o tratar enfermedad celiaca. El antagonista causará una disminución en la respuesta de las células T. En una forma de realización, el antagonista se une al TCR de la célula T (generalmente en forma de un complejo con HLA-DQ2) pero en vez de causar activación funcional normal causa una señal anormal que se transmitirá a través de la cascada de señalización intracelular de TCR que hace que la célula T tenga una actividad funcional reducida (por ejemplo en respuesta al reconocimiento de un epítopo, normalmente medida por cualquier ensayo adecuado mencionado en la presente memoria descriptiva).

En una forma de realización el antagonista compite con el epítopo para unirse a un componente de ruta de procesamiento y presentación de TCR, por ejemplo una molécula MHC (normalmente HLA-DQ2). Así el antagonista puede unirse a HLA-DQ2 (y así ser un péptido presentado por esta molécula MHC), como péptido TP (Tabla 10) o un homólogo del mismo.

Los procedimientos que causan antagonismo son conocidos en la técnica. En una forma de realización el antagonista es un homólogo de los epítopos mencionados anteriormente y puede tener cualquiera de la secuencia, unión u otras propiedades del agente (en particular, análogos). Los antagonistas difieren normalmente de cualquiera de los epítopos anteriores (que son capaces de causar una función específica de antígeno normal en la célula T) por 1, 2, 3, 4 o más mutaciones (cada una de las cuales puede ser una sustitución, inserción o deleción). Dichos antagonistas se denominan "ligandos de péptidos alterados" o "APL" en la técnica. Las mutaciones están normalmente en las posiciones de aminoácidos que entran en contacto con el TCR.

El antagonista puede diferir del epítopo por una sustitución dentro de la secuencia que es equivalente a la secuencia representada por aminoácidos 65 a 67 de A-gliadina (dichos antagonistas se muestran en la Tabla 9). Así preferentemente el antagonista tiene una sustitución en el equivalente de posición 64, 65 ó 67. Preferentemente la sustitución es 64W, 67W, 67M o 65T.

Como la respuesta inmunitaria de las células T al epítopo de la invención en un individuo es policlonal puede necesitarse administrar más de un antagonista para causar antagonismo de células T de la respuesta que tienen diferentes TCR. Por tanto los antagonistas pueden administrarse en una composición que comprende al menos 2, 4, 6 o más antagonistas diferentes, cada uno de los cuales antagoniza a diferentes células T.

La invención también proporciona un procedimiento de identificación de un antagonista de una célula T (que reconoce el agente) que comprende puesta en contacto de una sustancia candidata con la célula T y detección de si la sustancia causa una disminución en la capacidad de la célula T de experimentar una respuesta específica a antígeno (por ejemplo usando cualquier ensayo adecuado mencionado en la presente memoria descriptiva), indicando la detección de cualquiera de dichas disminuciones en dicha capacidad que la sustancia es un antagonista.

En una forma de realización los antagonistas (que incluyen combinaciones de antagonistas a un epítopo particular) o los agentes de tolerización (tolerización a células T y anticuerpos) están presentes en una composición que comprende al menos 2, 4, 6 o más antagonistas o agentes que antagonizan o toleran diferentes epítopos de la invención, por ejemplo las combinaciones de epítopos expuestas anteriormente en ión con los agentes que son un producto que comprende más de una sustancia.

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Prueba de si una composición es capaz de causar enfermedad celiaca

Según se menciona anteriormente la invención proporciona un procedimiento de determinación de si una composición es capaz de causar enfermedad celiaca que comprende la detección de la presencia de una secuencia de proteínas que es capaz de modificarse por una transglutaminasa como una secuencia que comprende el agente o epítopo de la invención (dicha actividad de transglutaminasa puede ser una actividad de transglutaminasa intestinal humana). Normalmente esto se realiza usando un ensayo de unión en el que una fracción que se une a la secuencia de una manera específica se pone en contacto con la composición y la formación de complejo de secuencia/fracción se detecta y se usa para elucidar la presencia del agente. Dicha fracción puede ser cualquier sustancia (o tipo de sustancia) adecuada mencionada en la presente memoria descriptiva, y es normalmente un anticuerpo específico. Puede usarse cualquier formato adecuado de ensayo de unión (como los mencionados en la presente memoria descriptiva).

En una forma de realización la composición se pone en contacto con al menos 2, 5, 10 o más anticuerpos que son específicos para epítopos de la invención a partir de diferentes gliadinas, por ejemplo un panel de anticuerpos capaz de reconocer las combinaciones de epítopos expuestas anteriormente en relación con agentes de la invención que son un producto que comprende más de una sustancia.

La composición comprende normalmente material de una planta que expresa una gliadina que es capaz de causar enfermedad celiaca (por ejemplo cualquiera de las gliadinas o plantas mencionadas en la presente memoria descriptiva). Dicho material puede ser una parte vegetal, como un producto recolectado (por ejemplo semilla). El material puede ser productos procesados del material vegetal (por ejemplo cualquiera de los productos mencionados en la presente memoria descriptiva), como una harina o alimento que comprende la gliadina. El procesamiento de material alimentario y la prueba en ensayos de unión adecuados son rutinarios, por ejemplo según se menciona en Kricka LJ, J. Biolumin. Chemilumin. 13, 189-93 (1998).

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Ensayos de unión

La determinación de unión entre dos sustancias cualesquiera mencionadas en la presente memoria descriptiva puede realizarse midiendo una característica de una o las dos sustancias que cambie con la unión, como un cambio espectroscópico.

El formado del ensayo de unión puede ser un sistema de "desplazamiento de banda". Esto implica la determinación de si la presencia de una sustancia (como una sustancia candidata) avanza o retrasa el progreso de la otra sustancia durante la electroforesis de gel.

El formato puede ser un procedimiento de unión competitiva que determina si la sustancia es capaz de inhibir la unión de la otra sustancia a un agente del que se conoce que se une a la otra sustancia, como un anticuerpo especifico.

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Proteínas de gliadina mutantes

También se describe mediante ejemplo una proteína de gliadina en la que una secuencia de epítopos de la invención, o secuencia que puede modificarse por una transglutaminasa para proporcionar dicha secuencia se ha mutado de manera que ya no causa, o no es reconocida por, una respuesta de células T que reconoce el epítopo. En este contexto el término reconocimiento se refiere al TCR que se une al epítopo de tal forma que tiene lugar una actividad funcional de la célula T específica de antígeno normal (no antagonista).

Los procedimientos de identificación de epítopos equivalentes en otras gliadinas se exponen anteriormente. El tipo salvaje de la gliadina mutada es el que causa enfermedad celiaca. Dicha gliadina tendrá homología con SEQ ID NO: 3, por ejemplo en el grado mencionado anteriormente (en relación con el análogo) en todo el SEQ ID NO: 3 o en los 15, 30, 60, 100 ó 200 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 3.

La gliadina mutada no causará enfermedad celiaca ni causará síntomas de enfermedad celiaca. Normalmente la mutación reduce la capacidad del epítopo de inducir una respuesta de células T. El epítopo mutado puede tener una unión reducida a HLA-DQ2, una capacidad reducida para ser presentada por una ACP o una capacidad reducida para unirse a o ser reconocida (es decir causar actividad funcional específica de antígeno) por células T que reconocen el agente. La gliadina o epítopo mutado, por tanto, mostrarán un reconocimiento reducido o inexistente en cualquiera de los ensayos mencionados en la presente memoria descriptiva en relación con los aspectos de diagnóstico de la invención.

La mutación puede ser una o más deleciones, adiciones o sustituciones de longitud 1 a 3, 4a 6, 6 a 10, 11 a 15 o más en el epítopo, por ejemplo en toda la secuencia SEQ ID NO: 2 o su equivalente. Preferentemente la gliadina mutante tiene al menos una mutación en la secuencia SEQ ID NO: 1. Una mutación preferida está en posición 65 en A-gliadina (o en una posición equivalente en otras gliadinas). Normalmente la glutamina de ocurrencia natural en su posición está sustituida en cualquiera de los aminoácidos mostrados en la Tabla 3, preferentemente a histidina, tirosina, triptófano, lisina, prolina o arginina.

También se describe mediante ejemplo una mutación (como cualquiera de las mutaciones en cualquiera de las secuencias expuestas en la presente memoria descriptiva) en un epítopo de una proteína de gliadina, epítopo que es un epítopo de la invención, para reducir la capacidad de la proteína de gliadina de causar enfermedad celiaca.

En una forma de realización la secuencia mutada es capaz de actuar como un antagonista. Así la invención proporciona una proteína que comprende una secuencia que es capaz de unirse a un receptor de células T, receptor de células T que reconoce un agente de la invención, y secuencia que es capaz de causar antagonismo de una célula T que transporta dicho receptor de células T.

También se describen mediante ejemplo proteínas que son fragmentos de las proteínas de gliadina mutantes anteriores, que tienen al menos una longitud de 15 aminoácidos (por ejemplo al menos una longitud de 30, 60, 100, 150, 200 ó 250 aminoácidos) y que comprenden las mutaciones expuestas anteriormente que reducen la capacidad de la gliadina de ser reconocidas. Cualquiera de las proteínas mutantes (incluidos fragmentos) mencionadas en la presente memoria descriptiva puede estar también presente en la forma de proteínas de fusión, por ejemplo con otras gliadinas o con proteínas no de gliadina.

La proteína equivalente de tipo salvaje a la proteína mutada de gliadina es normalmente de una monocotiledónea gramínea, como una planta del género Triticum, por ejemplo trigo, centeno, cebada, avena o triticale. La proteína es normalmente una \alpha, \alpha\beta, \beta, \gamma o \omega gliadina. La gliadina puede ser una A-gliadina.

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Kits

La invención también proporciona un kit para efectuar el procedimiento que comprende uno o más agentes y opcionalmente un medio para detectar el reconocimiento del agente por la célula T. Normalmente los diferentes agentes se proporcionan para uso simultáneo, separado o secuencial. Normalmente el medio para detectar el reconocimiento permite o favorece la detección basada en las técnicas expuestas anteriormente.

Así el medio puede permitir la detección de una sustancia secretada por las células T después del reconocimiento. El kit puede así incluir adicionalmente una fracción de unión específica para la sustancia, como un anticuerpo. La fracción es normalmente específica para IFN-\gamma. La fracción está normalmente inmovilizada en un soporte sólido. Esto significa que después de la unión a la fracción la sustancia permanecerá en la proximidad de la célula T que la secretó. Así, se forman "puntos" de complejo sustancia/fracción en el soporte, representando cada punto una célula T que está secretando la sustancia. La cuantificación de los puntos, y normalmente la comparación frente a un control, permite la determinación de reconocimiento del agente.

El kit también puede comprender un medio para detectar el complejo sustancia/fracción. Puede producirse un cambio detectable en la fracción en sí después de la unión de la sustancia, como un cambio de color. Alternativamente puede permitirse que una segunda fracción etiquetada directa o indirectamente para detección se una al complejo sustancia/fracción para permitir la determinación de los puntos. Como se expone anteriormente la segunda fracción puede ser específica para la sustancia, pero se une a un sitio diferente en la sustancia que la primera fracción.

El soporte inmovilizado puede ser una placa con pocillos, como una placa de microvaloración. Cada ensayo puede efectuarse por tanto en un pocillo separado en la placa.

El kit puede comprender adicionalmente medio para las células T, fracciones de detección o tampones de lavado que se usarán en las etapas de detección. El kit puede comprender adicionalmente reactivos adecuados para la separación de la muestra, como la separación de PBMC o células T de la muestra. El kit puede estar diseñado para permitir la detección de las células T directamente en la muestra sin requerir ninguna separación de los componentes de la muestra.

El kit puede comprender un instrumento que permite la administración del agente, como administración intradérmica o epidérmica. Normalmente dicho instrumento comprende parche, apósito o una o más agujas. El instrumento puede permitir el suministro balístico del agente. El agente en el kit puede estar en la forma de una composición farmacéutica.

El kit puede comprender también controles, como controles positivos o negativos. El control positivo puede permitir probar el sistema de detección. Así el control positivo emula normalmente el reconocimiento del agente en cualquiera de los procedimientos anteriores. Normalmente en los kits diseñados para determinar el reconocimiento in vitro el control positivo es una citocina. En el kit diseñado para detectar el reconocimiento in vivo del agente el control positivo puede ser antígeno al que la mayoría de los individuos deberían responder.

El kit puede comprender también un medio para tomar una muestra que contiene células T del hospedador, como una muestra de sangre. El kit puede comprender un medio para separar células mononucleares o células T de una muestra del hospedador.

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Células de polinucleótidos, mamíferos transgénicos y anticuerpos

También se describe mediante ejemplo un polinucleótido que es capaz de expresión para proporcionar el agente o las proteínas de gliadina mutantes. Normalmente el polinucleótido es ADN o ARN, y es monocatenario o bicatenario. El polinucleótido comprenderá preferentemente al menos 5 0 bases o pares de bases, por ejemplo de 50 a 100, 100 a 500, 500 a 1.000 o 1.000 a 2.000 o más bases o pares de bases. El polinucleótido comprende por tanto la secuencia que codifica la secuencia de SEQ ID NO: 1 ó 2 o cualquiera de los agentes mencionados en la presente memoria descriptiva. En 5' y 3' de esta secuencia de codificación el polinucleótido tiene secuencia o codones que son diferentes de la secuencia o codones 5' y 3' para estas secuencias en el gen de gliadina correspondiente.

En 5' y/o 3' para la secuencia que codifica el péptido, el polinucleótido tiene secuencia de codificación y de no codificación. La secuencia 5' y/o 3' para la secuencia de codificación puede comprender secuencias que ayudan a la expresión, como transcripción y/o traducción, de la secuencia que codifica el agente. El polinucleótido puede ser capaz de expresar la célula procariota o eucariota del agente. En una forma de realización el polinucleótido es capaz de expresar el agente en una célula de mamífero, como célula de ser humano, primate o roedor (por ejemplo ratón o rata).

Un polinucleótido según se describe mediante ejemplo puede hibridarse selectivamente para un polinucleótido que codifica SEQ ID NO: 3 en un nivel significativamente superior al fondo. La hibridación selectiva se consigue normalmente usando condiciones de medio de alta restrictividad (por ejemplo cloruro de sodio 0,03 M y citrato de sodio 0,03 M a entre aproximadamente 50ºC y aproximadamente 60ºC). Sin embargo, dicha hibridación puede efectuarse en cualquier condición adecuada conocida en la técnica (véase Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Por ejemplo, si se requiere alta restrictividad, las condiciones adecuadas incluyen 0,2 x SSC a 60ºC. Si se requiere baja restrictividad, las condiciones adecuadas incluyen 2 x SSC a 60ºC.

Los agentes o proteínas de la invención pueden codificarse mediante los polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva.

El polinucleótido puede formar o incorporarse en un vector replicable. Dicho vector es capaz de replicarse en una célula adecuada. El vector puede ser un vector de expresión. En dicho vector el polinucleótido está unido operativamente a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión del polinucleótido. El vector puede contener un marcador seleccionable, como el gen de resistencia a la ampicilina.

El polinucleótido o vector puede estar presente en una célula. Dicha célula puede haber sido transformada por el polinucleótido o vector. La célula puede expresar el agente. La célula se elegirá compatible con dicho vector y puede ser por ejemplo una célula procariota (bacteriana), de levadura, de insecto o de mamífero. El polinucleótido o vector puede introducirse en células hospedadoras usando técnicas convencionales que incluyen transfección o electroporación DEAE-dextrano de precipitación de fosfato de calcio.

También se describen mediante ejemplo procedimientos para la producción de las proteínas de la invención por medios recombinantes. Esto puede comprender (a) cultivo de una célula transformada según se define anteriormente en condiciones que permiten la expresión de la proteína; y preferentemente (b) recuperación del polipéptido expresado. Opcionalmente, el polipéptido puede aislarse y/o purificarse, por técnicas conocidas en la técnica.

También se describen mediante ejemplo los TCR que reconocen (o se unen a) el agente, o fragmentos de los mismos que son capaces de dicho reconocimiento (o unión). Estos pueden estar presentes en cualquier forma mencionada en la presente memoria descriptiva (por ejemplo pureza) expuesta en la presente memoria descriptiva en relación con la proteína de la invención. También se describen mediante ejemplo células T que expresan dichos TCR que pueden estar presentes en cualquier forma (por ejemplo pureza) expuesta en la presente memoria descriptiva para las
células.

La invención también proporciona anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen específicamente los agentes (como cualquiera de los epítopos de la invención) de la invención, y procedimientos de preparación de dichos anticuerpos. Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a estas sustancias de la invención.

Para los fines de esta invención, el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpos como fragmentos Fv, F(ab) y F (ab)_{2}, así como anticuerpos monocatenarios.

Un procedimiento para producir un anticuerpo policlonal comprende la inmunización de un animal hospedador adecuado, por ejemplo un animal experimental, con el inmunógeno y el aislamiento de las inmunoglobulinas del suero. Por tanto, el animal puede ser inoculado con el inmunógeno, retirarse la sangre posteriormente del animal y purificarse la fracción de IgG. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal comprende la inmortalización de células que producen el anticuerpo deseado. Pueden producirse células de hibridoma mediante fusión de células del bazo a partir de un animal experimental inoculado con células tumorales (Kohler y Milstein (1975) Nature 256,
495-497).

Puede seleccionarse una célula inmortalizada que produce el anticuerpo deseado mediante un procedimiento convencional. Los hibridomas pueden desarrollarse en cultivo o inyectarse intraperitonealmente para formación de fluido de ascitis o en el torrente sanguíneo de un hospedador alogénico o un hospedador inmunocomprometido. El anticuerpo humano puede prepararse mediante inmunización in vitro de linfocitos humanos, seguido por transformación de los linfocitos con virus de Epstein-Barr.

Para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales, el animal experimental es de forma adecuada una cabra, conejo, rata o ratón. Si se desea, el inmunógeno puede administrarse como un conjugado en el que se acopla el inmunógeno, por ejemplo por medio de una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos, a un soporte adecuado. La molécula de soporte es normalmente un soporte fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido puede aislarse y, si se desea, purificarse.

El polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo de la invención, puede llevar una etiqueta detectable. Se prefieren las etiquetas detectables que permiten la detección de la sustancia secretada por inspección visual, opcionalmente con la ayuda de un medio de aumento óptico. Dicho sistema se basa normalmente en una etiqueta enzimática que provoca un cambio de color en un sustrato, por ejemplo fosfatasa alcalina que causa un cambio de color en un sustrato. Dichos sustratos están disponibles comercialmente, por ejemplo en BioRad. Otras etiquetas adecuadas incluyen otras enzimas como peroxidasa, o etiquetas de proteínas, como biotina; o radioisótopos, como 32P o 35S. Las etiquetas anteriores pueden detectarse usando técnicas conocidas.

Polinucleótidos, agentes, proteínas, anticuerpos o células de la invención puede estar en forma sustancialmente purificada. Pueden estar en forma sustancialmente aislada, en cuyo caso comprenderán generalmente al menos el 80%, por ejemplo al menos el 90, 95, 97 ó 99% del polinucleótido, péptido, anticuerpo, células o masa seca en la preparación. El polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo está normalmente sustancialmente libre de otros componentes celulares. El polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo puede usarse en dicha forma sustancialmente aislada, purificada o libre en el procedimiento o estar presente en dichas formas en el kit. También se describe mediante ejemplo un mamífero transgénico que expresa un TCR.

Puede ser cualquiera de los mamíferos expuestos en la presente memoria descriptiva (por ejemplo en relación con la producción del anticuerpo). Preferentemente el mamífero tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca. El mamífero puede expresar también HLA-DQ2 y/o puede recibir una dieta que comprenda una gliadina que cause enfermedad celiaca (por ejemplo cualquiera de las proteínas de gliadina mencionadas en la presente memoria descriptiva). Así el mamífero puede actuar como un modelo animal para enfermedad celiaca.

También se describe mediante ejemplo un procedimiento de identificación de un producto que es terapéutico para enfermedad celiaca que comprende la administración de una sustancia candidata a un mamífero que tiene, o que es susceptible a, enfermedad celiaca y la determinación de si la sustancia previene o trata la enfermedad celiaca en el mamífero, indicando la prevención o tratamiento de enfermedad celiaca que la sustancia es un producto terapéutico. Dicho producto puede usarse para tratar o prevenir enfermedad celiaca.

La invención proporciona agentes terapéuticos (que incluyen profilácticos) o sustancias de diagnóstico (los agentes, proteínas y polinucleótidos de la invención). Estas sustancias se formulan para administración clínica mezclándolas con un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo pueden formularse para administración tópica, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, infraocular, intradérmica, epidérmica o transdérmica. Las sustancias pueden mezclarse con cualquier vehículo que sea farmacéuticamente aceptable y apropiado para la ruta de administración deseada. El soporte o diluyente farmacéuticamente para inyección puede ser, por ejemplo, una solución estéril o isotónica como agua para inyección o solución salina fisiológica, o una partícula de soporte para suministro balístico.

La dosis de las sustancias puede ajustarse según varios parámetros, especialmente según el agente usado; la edad, peso y dolencia del paciente que será tratado; el modo de administración usado; la gravedad de la dolencia que se tratará; y el régimen clínico requerido. Como guía, la cantidad de sustancia administrada por inyección es de forma adecuada de 0,01 mg/kg a 30 mg/kg, preferentemente de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg.

Las rutas de administración y dosificaciones descritas pretenden ser sólo una guía ya que un experto en la materia podrá determinar fácilmente la ruta de administración y la dosificación óptimas para cualquier paciente y dolencia en particular.

Las sustancias de la invención pueden usarse así en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal, o en un procedimiento de diagnóstico practicado en el cuerpo humano. En particular pueden usarse en un procedimiento de tratamiento o prevención de enfermedad celiaca. La invención también proporciona los agentes para uso en un procedimiento de fabricación de un medicamento para tratamiento o prevención de enfermedad celiaca.

El agente de la invención puede prepararse usando técnicas estándar de química sintética, como mediante el uso de un sintetizador automatizado. El agente puede prepararse a partir de un polipéptido más largo, por ejemplo una proteína de fusión, polipéptido que comprende normalmente la secuencia del péptido. El péptido puede obtenerse del polipéptido, por ejemplo, hidrolizando el polipéptido, por ejemplo usando una proteasa; o por ruptura física del polipéptido. El polinucleótido de la invención puede prepararse usando técnicas estándar, por ejemplo usando un sintetizador.

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Células vegetales y plantas que expresan proteínas mutantes de gliadina o expresan proteínas que comprenden secuencias que pueden actuar como antagonistas

La célula descrita en la presente memoria descriptiva mediante ejemplo puede ser una célula vegetal, como una célula de una especie monocotiledónea gramínea. La especie puede ser una cuya forma de tipo salvaje exprese gliadinas, como cualquiera de las proteínas de gliadina mencionadas en la presente memoria descriptiva (incluyendo gliadinas con cualquier grado de homología a SEQ ID NO: 3 mencionado en la presente memoria descriptiva). Dicha gliadina puede causar enfermedad celiaca en seres humanos. La célula puede ser de trigo, maíz, avena, centeno, arroz, cebada, triticale, sorgo o caña de azúcar. Normalmente la célula es del género Triticum, como aestivum, spelta, polonicum o monococcum.

La célula vegetal es normalmente una que no expresa gliadina de tipo salvaje (como cualquiera de las gliadinas mencionadas en la presente memoria descriptiva que pueden causar enfermedad celiaca), o una que no expresa una gliadina que comprende una secuencia que puede ser reconocida por una célula T que reconoce el agente. Así si la célula vegetal de tipo salvaje expresa dicha gliadina a continuación puede tratarse por ingeniería para prevenir o reducir la expresión de dicha gliadina o cambiar la secuencia de aminoácidos de la gliadina de manera que deje de causar enfermedad celiaca (normalmente dejando de expresar el epítopo de la invención).

Esto puede hacerse por ejemplo introduciendo mutaciones en 1, 2, 3 o más o todos los genes de dicha gliadina en la célula, por ejemplo en codificación o no codificación (por ejemplo regiones de promotor). Dichas mutaciones pueden ser cualesquiera del tipo o longitud de mutaciones expuestas en la presente memoria descriptiva (por ejemplo, en relación con proteínas homologas). Las mutaciones pueden introducirse de una manera directa (por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio o técnicas de recombinación homologa) o en una manera aleatoria (por ejemplo usando un mutágeno, y a continuación seleccionando normalmente para células mutagenizadas que dejan de expresar la gliadina (o una secuencia de gliadina que causa enfermedad celiaca)).

En el caso de plantas o células vegetales que expresan una proteína que comprende una secuencia capaz de actuar como un antagonista dicha planta o célula vegetal puede expresar una proteína de gliadina de tipo salvaje (por ejemplo una que causa enfermedad celiaca). Preferentemente la presencia de la secuencia antagonista causará síntomas reducidos de enfermedad celiaca (por ejemplo, ausencia de síntomas) en un individuo que ingiera un alimento que comprenda proteína de la planta o célula vegetal.

El polinucleótido que está presente en (o que se transformó en) la célula vegetal generalmente comprenderá un promotor capaz de expresar la proteína de gliadina mutante la célula vegetal. Dependiendo del patrón de expresión deseado, el promotor puede ser constitutivo, específico del tejido o la fase; y/o inducible. Por ejemplo, una expresión constitutiva fuerte en plantas puede obtenerse con los promotores CAMV 3 5S, Rubisco ssu, o histona. También, los promotores específicos de tejidos o específicos de la fase pueden usarse para dirigir la expresión de proteína de la invención a tejidos concretos en una planta transgénica o para fases particulares en su desarrollo. Así, por ejemplo pueden usarse promotores específicos de semillas, específicos de raíces, específicos de hojas, específicos de flores, etc. Los promotores específicos de semillas incluyen los descritos por Dalta y col. (Biotechnology Ann. Rev. (1997), 3, pág. 269-296). Ejemplos concretos de promotores específicos de semillas son promotores de napina (documento EP-A-0.255.378), promotores de faseolina, promotores de glutenina, promotores de heliantenina (documento W092/17580), promotores de albúmina (documento W098/45.460), promotores de oleosina (documento W098/454) y promotores ATS1 y ATS3 (documento PCT/US98/06798).

La célula puede estar en cualquier forma. Por ejemplo, puede ser una célula aislada, por ejemplo un protoplasto, o puede ser parte de un tejido vegetal, por ejemplo un callo, o un tejido escindido de una planta, o puede ser parte de una planta entera. La célula puede ser de cualquier tipo (por ejemplo de cualquier tipo de parte de una planta). Por ejemplo, una célula indiferenciada, como una célula de callo; o una célula diferenciada, como una célula de un tipo encontrado en embriones, polen, raíces, vástagos u hojas. Las partes de la planta incluyen raíces; vástagos; hojas; y partes que intervienen en la reproducción, como polen, huevos, estambres, anteras, pétalos, sépalos y otras partes de la flor.

También se describe mediante ejemplo un procedimiento de obtención de una célula vegetal transgénica que comprende la transformación de una célula vegetal con un polinucleótido o vector de la invención para dar una célula vegetal transgénica. Puede usarse cualquier procedimiento de transformación adecuado (en el caso del trigo, pueden usarse las técnicas desveladas en Vasil V y col., Biotechnology 10, 667-674 (1992)). Las técnicas de transformación preferidas incluyen electroporación de protoplastos vegetales y bombardeo con partículas. La transformación puede dar lugar así a un tejido o planta quiméricos en los que algunas células son transgénicas y otras no.

La célula puede regenerarse en una planta transgénica por técnicas conocidas en la técnica. Éstas pueden implicar el uso de sustancias de crecimiento vegetal como auxinas, gíberelinas y/o citocininas para estimular el crecimiento y/o división de la célula transgénica. Análogamente, pueden usarse técnicas como embriogénesis somática y cultivo de meristemo. Las técnicas de regeneración son bien conocidas en la técnica y pueden encontrarse ejemplos, por ejemplo en los documentos US-4.459.355, US-4.536.475, US-5.464.763, US-5.177.010, US-5.187.073, EP-267.159, EP-604.662, EP-672.752, US-4.945. 050, US-5.036.006, US-5.100.792, US-5.371.014, US-5.478.744, US-5.179.022, US-5.565.346, US-5.484.956, US-5.508.468, US-5.538.877, US-5.554.798, US-5.489.520, US-5.510.318, US-5.204.253, US-5.405.765, EP-442.174, EP-486.233, EP-486.234, EP-539.563, EP-674.725, WO-91/0.2 07 y WO-95/06.128.

En muchas de estas técnicas, una etapa es la formación de un callo, es decir un tejido vegetal que comprende células de expansión y/o división. Dichos callos son un aspecto adicional de la invención ya que son otros tipos de cultivos de células vegetales y partes de plantas. Así, por ejemplo, la invención proporciona tejidos y partes de plantas transgénicas, que incluyen embriones, meristemos, semillas, vástagos, raíces, tallos, hojas y partes de flor. Éstos pueden ser quiméricos en el sentido de que algunas de sus células son células de la invención y otras no. Las partes y tejidos de plantas transgénicas, plantas y semillas pueden ser de cualquiera de las especies vegetales mencionadas en la presente memoria descriptiva.

Los procedimientos de regeneración implicarán normalmente la selección de células transformadas por medio de genes marcadores.

La etapa de regeneración da lugar a una planta transgénica de primera generación. También se describen mediante ejemplo procedimientos de obtención de plantas transgénicas de generaciones posteriores a esta planta de primera generación. Se conocen como plantas transgénicas de progenie. Las plantas de progenie de generaciones segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y posteriores pueden obtenerse a partir de planta transgénica de primera generación por cualquier medio conocido en la técnica.

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Así, se describe mediante ejemplo un procedimiento de obtención de una planta de progenie transgénica que comprende la obtención de una planta de progenie de segunda generación a partir de una planta transgénica de primera generación de la invención, y opcionalmente la obtención de plantas transgénicas de una o más generaciones adicionales a partir de la planta de progenie de segunda generación así obtenida.

Las plantas de progenie pueden producirse a partir de sus predecesores de generaciones anteriores por cualquier técnica conocida. En particular, las plantas de progenie pueden producirse por:

obtención de una semilla transgénica a partir de una planta transgénica perteneciente a una generación previa, obteniendo a continuación una planta de progenie transgénica

pertenencia a una nueva generación por cultivo de la semilla transgénica; y/o

propagación clonal de una planta transgénica que pertenece a una generación anterior para dar una planta de progenie transgénica perteneciente a una nueva generación; y/o

cruzamiento de una planta transgénica de primera generación perteneciente a una generación anterior con otra planta compatible para dar una planta de progenie transgénica perteneciente a una nueva generación; y opcionalmente

obtención de plantas de progenie transgénicas de una o más generaciones adicionales a partir de una planta de progenie así obtenida.

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Estas técnicas pueden usarse en cualquier combinación. Por ejemplo, la propagación clonal y la propagación sexual pueden usarse en diferentes puntos en un procedimiento que da lugar a una planta transgénica adecuada para cultivo. En particular, puede emprenderse el retrocruzamiento repetitivo con un taxón de planta con características deseables agronómicamente. Pueden efectuarse también etapas de eliminación de células de una planta y regeneración de nuevas plantas a partir de las mismas.

También, pueden introducirse características deseables por transformación de las células, tejidos vegetales, plantas o semillas, en cualquier fase adecuada en el procedimiento anterior, para introducir secuencias de codificación deseables distintas de los polinucleótidos de la invención. Esto puede efectuarse por las técnicas descritas en la presente memoria descriptiva para la introducción de polinucleótidos.

Por ejemplo, pueden seleccionarse transgenes adicionales a partir de los que codifican para otros rasgos de resistencia a herbicidas, por ejemplo tolerización a: Glifosato (por ejemplo usando un gen de EPSP-sintasa (por ejemplo documento EP-A-0.293.358) o un gen de glifosato-oxidorreductasa (documento WO-92/000.377)); o tolerización a fosametina; un dihalobenzonitrilo; glufosinato, por ejemplo usando una fosfinotricina-acetil-transferasa (PAT) o gen de glutamino-sintasa (véase documento EP-A-0.242.236); asulam; por ejemplo usando un gen de dihidropteroato-sintasa (documento EP-A-0.369.367); o una sulfonilurea, por ejemplo usando un gen de ALS); éteres difenílicos como acifluorfeno u oxifluorfeno, por ejemplo usando un gen de protoporfirógeno-oxidasa); un oxadiazol como oxadiazona; una imida cíclica como cloroftalím; un fenílpirazol como TNP, o un análogo de fenopilato o carbamato del mismo.

Análogamente, puede introducirse genes para propiedades beneficiosas distintas de tolerización a herbicidas. Por ejemplo, pueden introducirse genes para resistencia a insectos, especialmente genes que codifican toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt). Análogamente, pueden introducirse genes para resistencia a enfermedades, por ejemplo como en los documentos WO-91/02.701 o WO-95/06.128.

Normalmente, una proteína se expresa en una planta. Dependiendo del promotor usado, esta expresión puede ser constitutiva o inducible. Análogamente, puede ser específica de tejidos o de fases, es decir dirigida hacia un tejido vegetal concreto (como cualquiera de los tejidos mencionados en la presente memoria descriptiva) o fase en el desarrollo de la planta.

También se describen mediante ejemplo en la presente memoria descriptiva procedimientos de obtención de productos de cultivo por recolecta, y opcionalmente posterior procesamiento, de plantas transgénicas. Por producto de cultivo se entiende cualquier producto útil obtenible de una planta de cultivo.

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Productos que contienen proteínas mutantes de gliadina o proteínas que comprenden secuencia capaz de actuar como antagonistas

También se describe mediante ejemplo un producto que comprende las proteínas mutantes de gliadina o proteína que comprende la secuencia capaz de actuar como un antagonista. Esta se obtiene normalmente de o comprende partes vegetales de plantas mencionadas en la presente memoria descriptiva que expresan dicha proteína. Dicho producto puede obtenerse directamente por recolecta o indirectamente, por recolecta y posterior procesamiento de la planta. Los productos obtenibles directamente incluyen granos. Alternativamente, dicho producto puede obtenerse indirectamente, por recolecta y posterior procesamiento. Algunos ejemplos de productos obtenibles por procesamiento posterior son harina o bebidas alcohólicas destiladas; productos alimenticios preparados de material obtenido directamente o procesado adicionalmente, por ejemplo productos horneados (por ejemplo pan) hechos de harina. Normalmente dichos productos alimenticios son ingeribles y digeribles (es decir no tóxicos y de valor nutritivo) por individuos humanos.

En el caso de productos alimenticios que comprenden la proteína que comprende una secuencia antagonista el producto alimenticio puede comprender también gliadina de tipo salvaje, aunque preferentemente el antagonista es capaz de provocar una reducción (por ejemplo completamente) en los síntomas de enfermedad celiaca después de que se ingiere dicho alimento.

La invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos:

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Ejemplo 1

Efectuamos cartografía de epítopos en Enfermedad celiaca usando un conjunto de 51 péptidos de 15-meros sintéticos que se extienden a la secuencia completa de una a-gliadina caracterizada totalmente, "A-gliadina" (véase Tabla 1). Los péptidos de A-gliadina también se trataron individualmente con tTG para generar productos que podrían emular a los producidos in vivo^{3}. También buscamos estudiar a pacientes de Enfermedad celiaca en el punto de inicio de recaída de la enfermedad para evitar la posibilidad de que pueda haber ocurrido "extensión" o "agotamiento" del epítopo, según se describe en enfermedades infecciosas y autoinmunes experimentales.

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Respuestas de células T específicas de A-gliadina y clínicas con prueba de provocación con pan de 3 y 10 días

En un estudio piloto, dos sujetos con Enfermedad celiaca en remisión, definida por ausencia de anticuerpo antiendomisial (EMA) en suero, con una dieta sin gluten fueron alimentados con cuatro rebanadas de pan blanco normal que contenía gluten diariamente además de su dieta habitual sin gluten. El Sujeto 1 dejó el pan por dolor abdominal, úlceras en la boca y diarrea leve después de tres días, pero el Sujeto 2 prosiguió durante 10 días con sólo náuseas ligeras en una semana. El EMA se convirtió en positivo en el Sujeto 2 una semana después de la prueba de provocación con pan, lo que indica que el pan usado había causado una recaída de la Enfermedad celiaca. Pero en el Sujeto 1, el EMA siguió siendo negativo hasta dos meses después de la prueba de provocación con pan. En los dos sujetos, los síntomas que
aparecieron con la prueba de provocación con pan se resolvieron en dos días después de volver a la dieta sin gluten.

Las respuestas de PBMC en ensayos ELISPOT de IFN\gamma a péptidos de A-gliadina no se encontraron antes de o durante la prueba de provocación con pan. Pero desde el día después de la retirada del pan (Día 4) en el Sujeto 1 una única reserva de 5 péptidos superpuestos extendiéndose a A-gliadina 51-85 (Reserva 3) tratados con tTG mostró potentes respuestas de IFN\gamma (véase fig. 1a). En el Sujeto 1, la respuesta de IFN\gamma de PBMC a péptido de A-gliadina siguió dirigiéndose a la Reserva 3 en solitario y fue máxima en el Día 8. La dinámica y la magnitud de la respuesta a la Reserva 3 fueron similares a las desencadenadas por gliadina digerida con \alpha-quimotripsina. Las respuestas de IFN\gamma de PBMC a la Reserva 3 tratada con tTG fueron consistentemente de 5 a 12 veces mayores que la Reserva 3 no tratada con tTG, y las respuestas a gliadina digerida con \alpha-quimotripsina fueron de 3 a 10 veces mayores si se trató con tTG. En el Sujeto 2, la Reserva 3 tratada con tTG fue también el único conjunto inmunógeno de péptidos de A-gliadina en el Día 8, pero esta respuesta fue más débil que en el Sujeto 1, no se observó en el Día 4 y en el Día 11 la respuesta a la Reserva 3 había disminuido y otras reservas tratadas con tTG de péptidos de A-gliadina desencadenaron respuestas más intensas a IFN\alpha (véase fig. 1b).

El estudio piloto indicó que la respuesta inicial de células T en estos sujetos con enfermedad celiaca fue contra una reserva de A-gliadina tratada con tTG de cinco péptidos y se midió fácilmente en sangre periférica. Pero si se continúa con la exposición al antígeno durante diez días en lugar de tres, aparecen las respuestas de células T a otros péptidos de A-gliadina, consistentes con extensión del epítopo.

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Inducción de IFG-\gamma específico de enfermedad celiaca por péptidos de A-gliadina tratados con tTG

En cinco de seis sujetos adicionales con enfermedad celiaca en dieta sin gluten (véase Tabla 1), la prueba de provocación con pan durante tres días identificó péptidos tratados con tTG en la Reserva 3, y en particular, péptidos correspondientes a 56-70 (12) y 60-75 (13) como únicos componentes de A-gliadina que desencadenaron IFN\gamma a partir de PBMC (véase fig. 2). Los ensayos ELISPOT de IL-10 ejecutados en paralelo con ELISPOT de IFN\gamma no mostraron respuesta a IL-10 para péptidos tratados con tTG 12 ó 13. En un sujeto, no hubo respuestas de IFN\gamma a ningún péptido de A-gliadina o gliadina digerida con \alpha-quimotripsina antes, durante o hasta cuatro días después de la prueba de provocación con pan. En ninguno de estos sujetos con enfermedad celiaca cambió el estado de EMA desde la línea de referencia cuando se midió hasta dos meses después de la prueba de provocación con pan.

El valor de PBMC de cuatro sujetos sanos negativos a EMA con los alelos HLA-DQ \alphal*0501, \betal*0201 (edades 28-52, 2 mujeres) que se sometieron a prueba de provocación durante tres días con pan después de seguir una dieta sin gluten durante un mes, no mostró respuestas a IFN\gamma por encima del control negativo a ninguno de los péptidos de A-gliadina con o sin tratamiento con tTG. Así, la inducción de IFN\gamma en PBMC para Reserva 3 tratada con tTG y péptidos de A-gliadina 56-70 (12) y 60-75 (13) fue específica de Enfermedad celiaca (7/8 frente 0/4, p < 0,01 por análisis de chi cuadrado).

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Correspondencia fina de epítopo de células T de A-gliadina mínimo

Los péptidos tratados con tTG que representan truncamientos de A-gliadina 56-75 revelaron que la misma secuencia central de péptidos (QPQLP) era esencial para antigenicidad en los cinco sujetos con enfermedad celiaca evaluados (véase fig. 3). Las respuestas a IFN\gamma de PBMC para péptidos tratados con tTG que se extienden a esta secuencia central que empiezan por el PQPQLPY de 7-mero y aumentan en longitud, indicaron que QLQPFPQPQLPYPQPQS de 17-mero tratado con tTG (A-gliadina 57-73) poseía actividad óptima en la prueba ELISPOT de IFN\gamma (véase fig. 4).

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La desamidación de 065 por tTG genera el epítopo de células T inmunodominante en A-gliadina

El análisis por HPLC demostró que el tratamiento con tTG de A-gliadina 56-75 generaba un único producto que se eluía marginalmente después que el péptido original. La secuenciación de aminoácidos indicaba que de los seis residuos de glutamina (Q) contenidos en A-gliadina 56-75, Q65 se desamidaba preferentemente por tTG (véase fig. 5). La bioactividad de los péptidos correspondientes a expansiones en serie desde la secuencia central de A-gliadina 62-68 en que el glutamato (E) sustituyó a Q65, era equivalente a los mismos péptidos con Q65 después de tratamiento con tTG (véase fig. 4a). La sustitución de Q57 y Q72 por E conjuntamente o en solitario, con E65 no potenció la antigenicidad del 17-mero en los tres sujetos con enfermedad celiaca estudiados (véase fig. 6). Se investigaron Q57 y Q72 debido a que los residuos de glutamina seguidos por prolina en péptidos de gliadina se desamidan por tTG in vitro (W. Vader y col., Proceedings 8th International Symposium Coeliac Disease). Por tanto, el epítopo de células T inmunodominante se definió como QLQPFPQPELPYPQPQS.

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La respuesta de epítopos de células T inmunodominantes es restringida para D02 y dependiente de CD4

En dos sujetos con enfermedad celiaca homocigotos para HLA-DQ \alpha1*0501, \beta1*0201, el anticuerpo monoclonal anti-DQ bloqueó la respuesta a ELISPOT de IFN\gamma a A-gliadina 56-75 tratada con tTG, pero no el anticuerpo anti-DP y -DR (véase fig. 7). La depleción de perlas magnéticas anti-CD4 y anti-CD8 de PBMC de dos sujetos con enfermedad celiaca indicó que la respuesta a IFN\gamma para A-gliadína 56-75 tratada con tTG está mediada por células T CD4.

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Discusión

En este estudio describimos una prueba provocación de antígeno en la dieta bastante sencilla usando pan blanco corriente para desencadenar una población transitoria de células T CD4 en sangre periférica de sujetos con enfermedad celiaca que responden a 17-mero de A-gliadina tratada con tTG con la secuencia: QLQPFPQPELPYPQPQS (residuos 57-73). La respuesta inmunitaria a A-gliadina 56-75 (Q-E65) está restringida al alelo HLA asociado con Enfermedad celiaca, DQ \alpha1*0501, \beta1*0201. La acción de transglutaminasa en tejidos in vitro desamida selectivamente Q65. Las respuestas a IFN\gamma de sangre periférica desencadenadas a péptidos sintéticos de A-gliadina con la sustitución Q-E65 es equivalente a péptidos de A-gliadina Q65 tratados con tTG; ambos estimulan hasta 10 veces más células T en ELISPOT de IFN\gamma que los péptidos de A-gliadina Q65 sin modificar.

Hemos definido deliberadamente este epítopo de células T específico de Enfermedad celiaca usando prueba de provocación de antígeno in vivo y ensayos inmunitarios ex vivo de corta duración para evitar la posibilidad de artefactos metodológicos que pueden ocurrir con el uso de clones de células T en cartografía de epítopos. Nuestros hallazgos indican que las respuestas de células T de sangre periférica a ingestión de gluten son rápidas pero de corta duración y pueden usarse para cartografía de epítopos. La prueba de provocación de antígeno in vivo ha demostrado también que existe una jerarquía temporal de respuestas inmunitarias a péptidos de A-gliadina; la A-gliadina 57-73 modificada por tTG no sólo desencadena la respuesta más intensa a IFN\gamma en PBMC sino que también es la primera respuesta a IFN\gamma en aparecer.

Dado que hemos evaluado sólo péptidos que se extienden a A-gliadina, puede haber otros epítopos en otras gliadinas de igual o mayor importancia en la patogenia de la Enfermedad celiaca. De hecho, la secuencia de péptidos en el centro del epítopo en A-gliadina que hemos identificado (PQPQLPY) es compartida por varias gliadinas más (SwissProt y Trembl, números de acceso: P02863, Q41528, Q41S31, Q41533, Q9ZP09, P04722, P04724, P18873). Sin embargo, los péptidos de A-gliadina que según se ha mostrado anteriormente poseen bioactividad en prueba de provocación de biopsia y estudios in vivo (por ejemplo: 31-43, 44-55 y 206-217)^{4,5 }no desencadenaron respuestas a IFN\gamma en PBMC después de prueba de provocación con pan de tres días en sujetos con enfermedad celiaca. Estos péptidos pueden ser epítopos de células T "secundarios" que surgen con la extensión de la respuesta inmunitaria.

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Ejemplo 2 Efecto sobre reconocimiento de células T de sustituciones en el epítopo inmunodominante

El efecto de sustituir el glutamato en la posición 65 en el epítopo de A-gliadina 57-73 se determinó mediante medida de las respuestas de sangre periférica frente a los epítopos sustituidos en un ensayo ELISPOT de IFN\gamma usando péptidos sintéticos (a 50 \mug/ml). Las respuestas se midieron en 3 sujetos con enfermedad celiaca 6 días después de comenzar la prueba de provocación con gluten (4 rebanadas de pan diarias durante 3 días). Los resultados se muestran en la Tabla 3 y la fig. 8. Como puede verse, la sustitución del glutamato por histidina, tirosina, triptófano, lisina, prolina o arginina estimuló una respuesta cuya magnitud fue inferior al 10% de la magnitud de la respuesta al epítopo inmunodominante. Así la mutación de A-gliadina en esta posición podría usarse para producir una gliadina mutante con inmunorreactividad reducida o ausente.

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Ejemplo 3 Prueba de la inmunorreactividad de péptidos equivalentes con respecto a otras gliadinas de ocurrencia natural

Se evaluó la inmunorreactividad de péptidos equivalentes con respecto a otras gliadinas de trigo de ocurrencia natural usando péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias de ocurrencia natural que se trataron a continuación con transglutaminasa. Estos péptidos se sometieron a prueba en un ELISPOT de la misma manera y con PBMC de los mismos sujetos que se describieron en el Ejemplo 2. Al menos cinco de los péptidos muestran inmunorreactividad comparable al péptido de A-gliadina 57-73 E65 (después de tratamiento con transglutaminasa) lo que indica que también es probable que otras proteínas de gliadina en el trigo induzcan esta respuesta inmunitaria específica de Enfermedad celiaca (Tabla 4 y fig. 9).

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Procedimientos

Sujetos: Los pacientes usados en el estudio asistieron a una Clínica para Celiacos en Oxford, Reino Unido. La enfermedad celiaca se diagnosticó sobre la base de histología típica del intestino delgado y normalización de síntomas e histología del intestino delgado con dieta sin gluten.

Tipificación de tejidos: La tipificación de tejidos se realizó usando ADN extraído de sangre periférica anticoagulada EDTA. La genotipificación de HLA-DQA y DQB se realizó mediante PCR usando mezclas de cebadores específicas de secuencias^{6-9}.

Ensayo de anticuerpos antiendomisiales: Los EMA se detectaron por inmunofluorescencía indirecta usando suero de los pacientes diluido 1:5 con esófago de mono, seguido por IgA antihumana de cabra conjugada de FITC. La IgA se cuantificó antes de EMA, ninguno de los sujetos tenía deficiencia de IgA.

Prueba de provocación de antígeno: Los sujetos con enfermedad celiaca después de una dieta sin gluten, consumieron 4 rebanadas de pan con gluten (50 g/rebanada, "pan de sándwich blanco estándar" de Sainsbury) diarias durante 3 ó 10 días. Se evaluaron los EMA la semana anterior y hasta dos meses después de iniciar la prueba de provocación con pan. Los sujetos sanos que habían seguido una dieta sin gluten durante cuatro semanas, consumieron su dieta habitual que incluía cuatro rebanadas de pan con gluten durante tres días, y a continuación volvieron a una dieta sin gluten durante seis días más.

ELISPOT de IFN\gamma e IL-10: Se prepararon PBMC a partir de 50-100 ml de sangre venosa por centrifugado de densidad de Ficoll-Hypaque. Después de tres lavados, se resuspendieron PBMC en RPMI completa que contenía el 10% de suero AB humano inactivado por calor. Se realizaron ensayos ELISPOT para secreción de célula única de IFN\gamma e IL-10 usando kits comerciales (Mabtech; Estocolmo, Suecia) con placas de 96 pocillos (MAIP-S-45; Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones de los fabricantes (como se describe en otro lugar^{9}) con 2-5 x 10^{5} (IFN\gamma) o 0,4-1 x 10^{5} (IL-10) de PBMC en cada pocillo. Se evaluaron los péptidos en pocillos duplicados, y se incluyó derivado de proteína purificada de Mycobacterium tuberculosis (PPD RT4 9) (Serum Institute; Copenhague, Dinamarca) (20 \mug/ml) como un control positivo en todos los ensayos.

Péptidos: Se compraron péptidos sintéticos de Research Genetics (Huntsville, Alabama). La espectroscopia de masas y HPLC verificaron la autenticidad de los péptidos y una paridad > 70%. Se realizó la digestión de gliadina (Sigma; G-3375) (100 mg/ml) con \alpha-quimotripsina (Sigma; C-3142) 200:1 (p/p) a temperatura ambiente en NH_{4}HC0_{3} 0,1 M con urea 2 M y se interrumpió después de 24 h por calentamiento a 98ºC durante 10 minutos. Después de centrifugado (13.000 g, 10 minutos), el sobrenadante de digesta de gliadina se esterilizó con filtro (0,2 mm). La digestión de gliadina se verificó por SDS-PAGE y se evaluó la concentración de proteínas. Se trató individualmente la gliadina digerida con \alpha-quimotripsina (640 \mug/ml) y los péptidos de gliadina sintéticos (15-mero: 160 \mug/ml, otros péptidos: 0,1 mM) con tTG (Sigma; T-5398) (50 \mug/ml) en PBS + CaCl_{2 }1 mM durante 2 h a 37ºC. Los péptidos y las reservas de péptidos se repartieron alícuotamente en placas estériles de 96 pocillos y se almacenaron congelados a -20ºC hasta su uso.

Secuenciación de aminoácidos de péptidos: Se usó HPLC de fase inversa para purificar el péptido resultante de tratamiento con tTG de A-gliadina 56-75. Se identificó un solo producto y se sometió a secuenciación de aminoácidos (secuenciador automatizado Modelo 494A, Applied Byosistems, Foster City, California). La secuencia de G56-75 sin modificar se continuó como: LQLQPFPQPQLPYPQPQSFP, y G56-75 tratado con tTG se identificó como: LQLQPFPQPELPYPQPQSFP. La desamidación de residuos de glutamilo se definió como la cantidad (pmol) de glutamato recuperado expresado como un porcentaje de la cantidad combinada de glutamina y glutamato recuperados en ciclos 2, 4, 8, 10, 15 y 17 de la secuenciación de aminoácidos. La desamidación atribuible a tTG se definió como (% de desamidación de glutamina en el péptido tratado con tTG - % de desamidación en el péptido sin tratar)/(100 - % de desamidación en el péptido sin tratar).

Restricción de CD4/CD8 y HLA de clase II: Se lavaron perlas magnéticas revestidas con anti-CD4 o anti-CD8 (Dynal, Oslo, Noruega) cuatro veces con RPMI y a continuación se incubó con PBMC en RPMI completa que contenía suero AB humano inactivado por calor al 10% (5 x 10^{6} células/ml) durante 30 minutos en hielo. Se retiraron las perlas usando un imán y se contaron las células restantes. La restricción in vivo de HLA clase II de la respuesta inmunitaria a A-gliadina 56-75 tratada con tTG se estableció incubando PBMC (5 x 10^{6} células/ml) con anticuerpos monoclonales anti-HLA-DR (L243), -DQ (L2) y -DP (B7,21) (10 \mug/ml) a temperatura ambiente durante una hora antes de la adición de péptido.

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Ejemplo 4 Expresión de integrina de mucosa por linfocitos de sangre periférica específicos de gliadina

La interacción entre adresinas endoteliales y de linfocitos facilita el alojamiento de linfocitos específicos de órganos. Se conocen muchas adresinas. El heterodímero \alpha_{4}\beta_{7} es específico del tracto digestivo de la lámina propia y otros linfocitos de mucosas, y \alpha^{E}\beta_{7} es específico y los linfocitos intraepiteliales en el tracto digestivo y la piel. Aproximadamente el 30% de células T CD4 de sangre periférica expresa \alpha_{4}\beta_{7} y se presume que están en tránsito hacia un sitio mucoso, mientras que el 5% de las células T de sangre periférica expresan \alpha^{E}\beta_{7}. Las perlas inmunomagnéticas revestidas con anticuerpo específico para \alpha^{E} o \beta_{7} agotan PBMC de células que expresan \alpha^{E}\beta_{7} o \alpha^{E}\beta_{7} y \alpha_{4}\beta_{7} respectivamente. En combinación con ensayo ELISpot, la depleción de perlas inmunomagnéticas permite la determinación de expresión de adresina de células T específica de gliadinas que puede identificar estas células como alojamiento en una superficie mucosa. De modo interesante, la prueba de provocación con gluten in vivo se asocia con rápido influjo de células T CD4 a la lámina propia del intestino delgado (no sitios intraepiteliales), en la que más del 90% de linfocitos expresan \alpha_{4}\beta_{7}.

Las perlas inmunomagnéticas se prepararon y se usaron para agotar PBMC en sujetos celiacos en el día 6 ó 7 después de comenzar una prueba de provocación de gluten de 3 días. Los análisis de FACS demostraron que las perlas de \alpha^{E} agotaron aproximadamente el 50% de células T CD4 positivas, mientras que las perlas \beta_{7} agotaron todas las células T CD4 positivas \beta_{7}. La depleción de PBMC usando perlas de CD4 o \beta_{7/} pero no perlas de CD8 o \alpha^{E}, abolieron las respuestas en ELISpot de interferón gamma. Las respuestas de gliadina tTG y PPD fueron abolidas por depleción de CD4, pero se vieron afectadas consistentemente por depleción de perlas específicas de integrina.

Así las células T específicas de A-gliadina 57-73 QE65 inducidas después de prueba de provocación con gluten en enfermedad celiaca expresan la integrina, \alpha_{4}\beta_{7},_{ }presente en células T CD4 de la lámina propia en el intestino
delgado.

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Ejemplo 5 Longitud óptima de epítopos de células T

Los datos previos de prueba de péptidos de 7 a 17 aminoácidos de longitud que se extienden al núcleo del epítopo de células T dominante en A-gliadina indicaron que la A-gliadina 57-73 QE65 de 17-mero indujo respuestas máximas en Elispot de interferón gamma usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios celiacos 6 días después de iniciar una prueba de provocación con gluten de 3 días.

Se evaluaron péptidos que representan expansiones desde la secuencia central del epítopo de células T dominante en A-gliadina en ELISPOT de IFN gamma usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios celiacos en 6 días después de iniciar una prueba de provocación con gluten de 3 días (n = 4). Péptido 13: A-gliadina 59-71 QE65 (13-mero), péptido 15: 58-72 QE65 (15-mero),..., péptido 27: 52-78 QE65 (27-mero).

Según se muestra en la fig. 11, la expansión de la secuencia de A-gliadina 57-73 QE65 no potencia sustancialmente la respuesta en Elispot de IFN gamma. Los Ejemplos posteriores caracterizan la actividad agonista y antagonista de A-gliadina 57-73 QE65 usando péptidos de 17-meros.

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Ejemplo 6 Comparación de A-gliadina 57-73 QE65 con otros epítopos de células T restringidos en DQ2 en enfermedad celiaca

Los estudios de dosis-respuesta se realizaron usando péptidos correspondientes a péptidos tratados con transglutaminasa y no modificados correspondientes a epítopos de células T de clones de células T específicos de gluten y líneas de biopsias intestinales de sujetos celiacos. Las respuestas a los péptidos se expresaron como porcentaje de respuesta a A-gliadina 57-73 QE65. Todos los sujetos fueron HLA-DQ2+ (ninguno fue DQ8+).

Los estudios indican que la A-gliadina 57-73 QE65 es el péptido de gliadina más potente para inducción de interferón gamma en el ensayo de ELISpot usando PBMC celiaco después de prueba de provocación con gluten (véase fig. 12a-h, y Tablas 5 y 6). Los epítopos segundo y tercero son fragmentos subóptimos de péptidos más grandes, es decir A-gliadina 57-73 QE65 y GPA4_WHEAT P04 72 4-84-100 QE92. El epítopo es sólo modestamente bioactivo (aproximadamente 1/20 de actividad que A-gliadína 57-73 QE65 después de restar la muestra en blanco).

A-gliadina 57-73 QE65 es más potente que otros epítopos conocidos de células T en enfermedad celiaca. Existen 16 polimorfismos de A-gliadina 57-73 (incluida la secuencia PQLPY) entre genes de gliadina secuenciados, y su bioactividad se evalúa a continuación.

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Ejemplo 7 Comparación de respuestas específicas de gliadina y A-gliadina 57-73 QE65 en sangre periférica

La contribución relativa del epítopo dominante, A-gliadina 57-73 QE65, a la respuesta total de células T a gliadina en enfermedad celiaca es una cuestión crítica. La pepsina-tripsina y la gliadina digerida con quimotripsina se han usado tradicionalmente como antígeno para el desarrollo de líneas y clones de células T en enfermedad celiaca. Sin embargo, es posible que estas proteasas puedan escindirse a través de ciertos epítopos de péptidos. De hecho, la digestión con quimotripsina de \alpha9-gliadina recombinante genera el péptido QLQPFPQPELPY, que es un truncamiento de la secuencia óptima de epítopos QLQPFPQPELPYPQPQS (véase más arriba). El tratamiento con transglutaminasa incrementa sustancialmente la potencia de gliadina digerida con quimotripsina en ensayos de proliferación de clones y líneas de células T específicos de gliadina. De aquí que la gliadina digerida con quimotripsina (gliadina tTG) tratada con transglutaminasa pueda no ser un antígeno ideal, aunque las respuestas contra esta mezcla pueden aproximarse al número "total" de linfocitos de sangre periférica específicos para gliadina. La comparación de respuestas contra A-gliadina 57-73 QE65 y gliadina tTG en el ensayo ELISpot da una indicación de la contribución de este epítopo dominante a la respuesta inmunitaria global a gliadina en enfermedad celiaca, y también es una medida de la extensión del epítopo.

Se evaluaron las PBMC recogidas en el día 6 ó 7 después de comenzar una prueba de provocación con gluten en 4 sujetos celiacos en estudios de dosis-respuesta usando gliadina digerida con quimotripsina +/- tratamiento con tTG y se comparó con respuestas de ELISpot para una concentración óptima de A-gliadina 57-73 QE65 (25 mcg/ml). El tratamiento con tTG de gliadina potenció las respuestas de PBMC en ELISpot aproximadamente 10 veces (tTG fue comparable a muestra en blanco cuando se evalúa en solitario) (véase fig. 13a-c). En los cuatro sujetos celiacos estudiados, A-gliadina 57-73 QE65 (25 mcg/ml) desencadenó respuestas entre el 14 y el 115% de las de gliadina tTG (500 mcg/ml), y cuanto mayor era la respuesta a A-gliadina 57-73 QE65 mayor era la proporción que representaba de la respuesta de gliadina tTG.

Los datos relativamente limitados sugieren que las respuestas de A-gliadina 57-73 QE65 son comparables a gliadina tTG en algunos sujetos. La extensión de epítopos asociada con respuestas de células T anti-gliadina más evolucionadas pueden explicar la menor contribución de A-gliadina 57-73 QE65 a las respuestas de gliadina "totales" en sangre periférica en algunos individuos. La extensión de epítopos puede mantenerse en individuos con dietas sin gluten menos estrictas.

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Ejemplo 8 Definición de péptidos de gliadina bioactivos en enfermedad celiaca: polimorfismos de A-gliadina 57-73

Se evaluó la superposición de péptidos de 15-meros que se extienden a la secuencia completa de A-gliadina con el fin de identificar la secuencia inmunodominante en enfermedad celiaca. La A-gliadina fue la primera proteína alfa completamente secuenciada de gliadina y gen, pero es una de las aproximadamente 3 0 a 50 proteínas alfa relacionadas de gliadina en el trigo. Se han identificado 2 5 genes de gliadina alfa distintos mediante búsqueda en bases de datos de proteínas, donde Swiss-Prot y TREMBL describen 8 gliadinas alfa adicionales. Contenidos dentro de estas 25 gliadinas alfa, hay 16 polimorfismos distintos de la secuencia correspondientes a A-gliadina 57-73 (véase
Tabla 7).

Se evaluaron péptidos sintéticos correspondientes a estos 16 polimorfismos, en una forma sin modificar, después de tratamiento con transglutaminasa in vitro, así como con glutamato sustituido en la posición 10 (equivalente a QE65 en A-gliadina 57-73) usando PBMC de sujetos celiacos, normalmente después de una dieta sin gluten, el día 6 ó 7 después de la prueba de provocación con gluten en ensayos ELISpot de interferón gamma. Se compararon los péptidos sustituidos con glutamato en tres concentraciones (2,5, 25 y 250 mcg/ml), se evaluaron el péptido sin modificar y péptidos tratados con transglutaminasa a 25 mcg/ml únicamente. La bioactividad se expresó como % de respuesta asociado con A-gliadina 57-73 QE65 25 mcg/ml en sujetos individuales (n = 4). (Véase fig. 14).

Se incrementó sustancialmente la bioactividad de péptidos de "tipo salvaje" (> 5 veces) por tratamiento con transglutaminasa. El tratamiento con transglutaminasa de péptidos de tipo salvaje dio como resultado bioactividad similar a la de los mismos péptidos sustituidos con glutamato en posición 10. Las bioactividades de cinco péptidos sustituidos con glutamato (B, C, K, L, M), fueron de > 70% de la de A-gliadina 57-73 QE65 (a), pero ninguno fue significativamente más bioactivo que A-gliadina 57-73 QE65. Las respuestas de PBMC a péptidos sustituidos con glutamato a concentraciones de 2,5 y 250 mcg/ml fueron comparables a los de a 25 mcg/ml. Seis péptidos de gliacina sustituidos con glutamato (H, I, J, N, O, P) fueron < 15% de bioactivos que A-gliadina 57-73 QE65. Otros péptidos fueron de bioactividad intermedia.

Al menos seis péptidos derivados de gliadina son equivalentes en potencia a A-gliadina 57-73 QE65 después de modificación por transglutaminasa. También existen polimorfismos relativamente no bioactivos de A-gliadina 57-73. Estos datos indican que la modificación por transglutaminasa de péptidos de varias gliadinas de Tricetum aestivum, T. uartu y T. spelta puede ser capaz de generar el epítopo de células T inmunodominante en enfermedad celiaca.

La modificación genética de trigo para generar trigo no tóxico para celiacos probablemente requiere la eliminación o modificación de múltiples genes de gliadina. La generación de trigo que contiene gliadinas u otras proteínas o péptidos que incorporan secuencias que definen antagonistas de ligandos de péptidos alterados de A-gliadina 57-73 es una estrategia alternativa para generar trigo modificado genéticamente que es terapéutico más que "no tóxico" en enfermedad celiaca.

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Ejemplo 9 Definición de secuencia de epítopos central

La comparación de péptidos correspondientes a truncamientos de A-gliadina 56-75 del terminal N y C indicó que la secuencia central del epítopo de células T es PELPY (A-gliadina 64-68). Los intentos de definir no agonistas y antagonistas se centrarán en variantes de A-gliadina que se sustituyen en residuos que contribuyen sustancialmente a su bioactividad.

Se compararon los péptidos correspondientes a A-gliadina 57-73 QE65 con alanina (fig. 15) o lisina (fig. 16) sustituidos para residuos 5 7 a 73 en ELISPOT de IFN gamma usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios celiacos 6 días después de iniciar una prueba de provocación con gluten de 3 días (n = 8). [BL es muestra en blanco, E es A-gliadina 57-73 QE65: QLQPFPQPELPYPQPQS].

Se encontró que residuos correspondientes a A-gliadina 60-70 QE65 (PFPQPELPYPQ) contribuyen sustancialmente a la bioactividad en A-gliadina 57-73 QE65. Las variantes de A-gliadina 57-73 QE65 sustituidas en posiciones 60-70 se evalúan en un procedimiento de 2 etapas. Inicialmente, se evalúa A-gliadina 57-73 QE65 sustituida en posiciones 60-70 usando 10 aminoácidos diferentes con propiedades que contrastan. En segunda tanda se evalúa un segundo grupo de variantes de A-gliadina 57-73 QE65 (sustituidas con otros aminoácidos de ocurrencia natural excepto cisteína en posiciones que demuestran ser sensibles a modificación).

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Ejemplo 10 Actividad agonista de variantes sustituidas de A-gliadina 57-73 QE65

La A-gliadina 60-70 QE65 es la secuencia central del epítopo de células T dominante en A-gliadína. Las variantes de péptidos antagonistas y no agonistas de este epítopo se generan con la máxima probabilidad mediante modificación de esta secuencia central. Inicialmente, la A-gliadina 57-73 QE65 sustituida en posiciones 60-70 usando 10 aminoácidos diferentes con propiedades en contraste se evaluará en ELISPOT de IFN gamma usando PBMC de sujetos celiacos 6 días después de iniciar una prueba de provocación con gluten de 3 días. También se evaluó un segundo grupo de variantes de A-gliadina 57-73 QE65 (sustituidas con todos los demás aminoácidos de ocurrencia natural excepto cisteína) en posiciones 61-70. Los dos grupos de péptidos (todos de 50 mcg/ml, en duplicado) se evaluaron usando PBMC de 8 sujetos y se comparó el péptido sin modificar (20 réplicas por ensayo). Los estudios anteriores indican que la concentración óptima para A-gliadina 57-73 QE65 en este ensayo está entre 10 y 100 mcg/ml.

Los resultados se expresan como respuesta media en las células de formación de puntos (intervalo de confianza del 95%) como % A-G 57-73 QE65 de respuesta media en cada individuo. Se usarán pruebas t no emparejadas para comparar respuestas de ELISPOT de péptidos modificados con A-G 57-73 QE65. Los superagonistas se definieron como los que tenían una respuesta mayor que A-G 57-73 QE65 en un nivel de significación de p < 0,01; los agonistas parciales como los que tenían una respuesta menor que A-G 57-73 QE65 en un nivel de significación de p < 0,01, y los no agonistas como los que no eran significativamente diferentes (p > 0,01) de la muestra en blanco (tampón sin péptido). Los péptidos con actividad agonista del 3 0% o menor que la de A-gliadina 57-73 QE65 se consideraron no agonistas o parciales "adecuados" para evaluar la actividad antagonista (véase Tabla 8 y fig. 17 a 27).

La respuesta de ELISPOT de IFN gamma de PBMC a A-gliadina 57-73 QE65 es altamente específica en un nivel molecular. La prolina en posición 64 (P64), el glutamato en 65 (E65) y la leucina en posición 66 (L66), y en menor medida Q63, P67, Y68 y P69 son particularmente sensibles a modificación. Las sustituciones Y61 y Y70 generan superagonistas con bioactividad un 30% mayor que el péptido original, probablemente al potenciar la unión a HLA-DQ2 ya que el motivo para esta molécula HLA indica una preferencia por residuos hidrófobos voluminosos en posiciones 1 y 9. Se identificaron 18 péptidos no agonistas. Las bioactividades de las variantes (50 mcg/ml) : P65, K64, K65 y Y65 (bioactividad 7-8%) fueron comparables a muestra en blanco (7%). En total, 57 variantes mutadas de A-gliadina 57-73 QE65 fueron bioactivas en el 30% o menos que A-gliadina 57-73 QE65.

La especificidad molecular de la respuesta de células T de linfocitos de sangre periférica (PBL) al epítopo dominante, la A-gliadina 57-73 QE65, es reproducible consistentemente entre sujetos celiacos HLA-DQ2+, y es altamente específica para un número restringido de aminoácidos en los 7 aminoácidos centrales. Algunas variantes de un solo aminoácido de A-gliadina 57-73 QE65 son consistentemente no agonistas en todos los sujetos celiacos HLA-DQ2+.

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Ejemplo 11 Actividad antagonista de variantes sustituidas

La homogeneidad de la respuesta de células T PBL a A-gliadina 57-73 QE65 en enfermedad celiaca HLA-DQ2+ sugiere que pueden existir ligandos de péptidos alterados (APL) capaces de antagonismo en PBMC ex vivo, aun cuando la respuesta de células T PBL sea probablemente poli- u oligo-clonal. Los antagonistas de APL son generalmente agonistas débiles. Se han identificado 57 variantes sustituidas con aminoácidos únicos de A-gliadina 57-73 QE65 con actividad agonista del 30% o menos y son candidatas adecuadas como antagonistas de APL. Además, se han identificado también ciertos polimorfísmos de ocurrencia natural débilmente bioactivos de A-gliadina 57-73 QE65 (véase más adelante) y pueden ser antagonistas de APL de "ocurrencia natural". También se ha sugerido que la competencia para unión a MHC también puede antagonizar respuesta inmunitaria de células T específica de antígenos. De ahí los péptidos no de gliadina que no inducen respuestas de IFN gamma en PBMC celiaca después de prueba de provocación con gluten pero se sabe que los que se unen a HLADQ2 pueden ser capaces de reducir respuestas de células T desencadenadas por A-gliadina 57-73 QE65. Dos péptidos que se unen ávidamente a HLA-DQ2 son HLA clase 1 \alpha 46-60 (HLA 1a) (PRAPWIEQEGPEYW) y peroxidasa tiroidea (tp) 632-645Y (IDVWLGGLLAENFLPY).

Adición simultánea de péptido (50 \mug/ml) o tampón y A-gliadina 57-73 QE65 (10 \mug/ml) en ELISPOT de IFN gamma usando PBMC de voluntarios celiacos 6 días después de comenzar una prueba de provocación con gluten de 3 días (n = 5). Los resultados se expresaron como respuesta con péptido más A-G 57-73 QE65 (media de duplicados) como % de respuesta con tampón más A-G 57-73 QE65 (media de 2 0 réplicas). (Véase Tabla 9).

Cuatro variantes sustituidas con aminoácidos únicos de A-gliadina 57-73 QE65 reducen la respuesta de ELISPOT de interferón gamma de PBMC a A-gliadina 57-73 QE65 (p < 0,01) entre el 25% y el 28%, otras 13 variantes de péptidos reducen la respuesta de ELISPOT en entre el 18% y el 24% (p < -0,06). El elemento de unión HLA-DQ2, peroxidasa tiroidea (tp) 632-645Y, reduce las respuestas de interferón gamma de PBMC a A-gliadina 57-73 QE65 en el 31% (p < 0,0001) pero el otro elemento de unión HLA-DQ2, HLA clase 1 \alpha 46-60, no altera las respuestas (véase Tabla 9). El péptido correspondiente a un polimorfismo modificado con transglutaminasa de A-gliadina 57-73, SwissProt nº de acceso: P04725 82-98 QE90 (PQPQPFPPELPYPQPQS) reduce las respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 en el 19% (p < 0,009) (véase Tabla 11).

Las respuestas de interferón gamma de PBMC a A-gliadina 57-73 QE65 en ensayos ELISPOT se reducen por coadministración de ciertas variantes de A-gliadina 57-73 QE65 de aminoácido único, un polimorfismo de A-gliadina 57-73 QE65, y se sabe que un péptido no relacionado se une a HLA-DQ2 en un exceso de cinco veces. Estos hallazgos sugieren que existen antagonistas de ligandos de péptidos alterados de A-gliadina 57-73 QE65. No sólo los posibles antagonistas de APL sino también ciertos péptidos que se unen HLA-DQ2 eficazmente reducen las respuestas de células T PBL a A-gliadina 57-73 QE65.

Estos hallazgos apoyan dos estrategias para interrumpir la respuesta de células T al epítopo de A-gliadina dominante en enfermedad celiaca HLADQ2+.

1. Optimización de antagonistas de APL por sustitución de aminoácidos en más de una posición (64-67) para uso como productos farmacéuticos de péptidos "tradicionales" o para modificación genética específica de genes de gliadina en trigo.

2. Uso de péptidos de unión a HLA-DQ2 de alta afinidad para inhibir competitivamente la presentación de A-gliadina 57-73 QE65 en asociación con HLA-DQ2.

Estos dos enfoques pueden ser mutuamente compatibles. Los superagonistas se generaron sustituyendo F61 y Q70 con residuos de tirosina. Es probable que estos superagonistas procedieran de una unión mejorada a HLA-DQ2 en vez de un contacto mejorado con el receptor de células T. Combinando estas modificaciones con otras sustituciones que generan antagonistas de APL de eficacia moderada se podría potenciar sustancialmente el efecto inhibidor de variantes de A-gliadina 57-73 QE65 sustituidas.

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Ejemplo 12 Desarrollo de ELISpot de interferón gamma usando PBMC y A-gliadina 57-73 QE65 y PQ4724 84-100 QE92 como un diagnóstico para enfermedad celiaca: Definición de capacidad de respuesta inmunitaria en enfermedad celiaca recién diagnosticada

La inducción de capacidad de respuesta al epítopo de células T de A-gliadina dominante en PBMC medida en ELISpot de interferón gamma sigue a la prueba de provocación con gluten en casi todos los sujetos celiacos DQ2+ después de una dieta sin gluten (DSG) de larga duración no en sujetos DQ2 + sanos después de 4 semanas después de una DSG estricta. Las respuestas de A-gliadina 57-73 QE65 no son mensurables en PBMC de sujetos celiacos antes de prueba de provocación con gluten y los datos piloto han sugerido que estas respuestas podrían no medirse en PBMC de celiacos sin tratar. Estos datos sugieren que la capacidad de respuesta inmune de enfermedad celiaca a A-gliadina 57-73 QE65 se restaura después de exclusión del antígeno (DSG). Si va a desarrollarse una prueba de diagnóstico usando el ensayo ELISpot y PBMC, es deseable definir la duración de la DSG requerida antes de que la prueba de provocación con gluten sea capaz de inducir respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 y otros péptidos de gliadina inmunorreactivos en la sangre.

Los sujetos celiacos DQ2+ de diagnóstico reciente fueron reclutados en el servicio de gastroenterología para pacientes ambulatorios. Las PBMC se prepararon y se sometieron a prueba en ensayos ELISpot de interferón gamma antes de que los sujetos iniciaran la DSG, y en una o dos semanas después de comenzar la DSG. Además, la prueba de provocación con gluten (3 días consumiendo 4 rebanadas pan blanco corriente, 200 g/día) se realizó en una o dos semanas después de iniciar la DSG. Las PBMC se prepararon y sometieron a ensayo en el día sexto después de comenzar la prueba de provocación con gluten. Se evaluó la A-gliadina 57-73 QE65 (A), P04724 84-100 QE92 (b) (sola y combinada) y la A-gliadina 57-73 QP65 (P65) (variante no bioactiva, véase más arriba) (todas con 2 5 mcg/ml).

Todos los pacientes celiacos de diagnóstico reciente menos uno eran DQ2+ (el uno era DQ8+) (n = 11). Las PBMC de celiacos de diagnóstico reciente que no recibían tratamiento, o después de 1 ó 2 semanas después de la DSG no mostraron respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 y P04724 84-100 QE92 (en solitario o en combinación) que no fueron significativamente diferentes de la muestra en blanco o A-gliadina 57-73 QP65 (n = 9) (véase fig. 28). La prueba de provocación con gluten en celiacos que habían seguido la DSG durante sólo una semana no potenció sustancialmente las respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 o P04724 84-100 QE92 (en solitario o en combinación). Pero la prueba de provocación con gluten 2 semanas después de comenzar la DSG indujo respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 y P04724 84-100 QE92 (en solitario o en combinación) que eran significativamente mayores que la variante no bioactiva A-gliadina 57-73 QP65 y la muestra en blanco. Aunque estas respuestas después de la prueba de provocación con gluten a las 2 semanas fueron sustanciales aparentemente eran menores que en sujetos > 2 meses después de comenzar la DSG. Las respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 en solitario fueron equivalentes o mayores que las respuestas a P04724 84-100 QE92 en solitario o mezclada con A-gliadina 57-73 QE65. Ninguno de los sujetos experimentó síntomas problemáticos con la prueba de provocación con gluten.

La capacidad de respuesta inmunitaria (medida en PBMC después de la prueba de provocación con gluten) a A-gliadina se restaura parcialmente 2 semanas después de comenzar la DSG, lo que implica que la "capacidad de respuesta inmunitaria" a este epítopo de células T dominante prevalece en enfermedad celiaca sin tratar y durante al menos una semana después de iniciar la DSG. El momento óptimo de una prueba de diagnóstico para enfermedad celiaca usando prueba de provocación con gluten y medida de respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 en el ensayo ELISpot es de al menos 2 semanas después de comenzar una DSG.

Las células T secretoras de interferón gamma específicas para A-gliadina 57-73 QE65 no pueden medirse en la sangre periférica en un celiaco sin tratar, y pueden inducirse sólo mediante prueba de provocación con gluten después de al menos 2 semanas de DSG (exclusión del antígeno). Por tanto, el momento de una prueba de diagnóstico que use esta metodología es crucial y se necesitan estudios adicionales para su optimización. Estos hallazgos son consistentes con anergia funcional de células T específicas para el epítopo dominante, A-gliadina 57-73 QE65, invertida por exclusión de antígenos (DSG). Este fenómeno no se ha demostrado previamente en una enfermedad humana, y apoya la posibilidad de que la anergia de células T pueda ser inducible con terapia con péptidos en enfermedad celiaca.

Referencias

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TABLA 1 Secuencia de proteínas de A-gliadina (basada en secuenciación de aminoácidos)

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TABLA 2 Sujetos con enfermedad celiaca estudiados

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TABLA 3

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TABLA 4

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TABLA 5 Epítopos de células T descritos en enfermedad celiaca

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TABLA 6 Bioactividad relativa de epítopos de células T de gliadina en PBMC celiaca después de prueba de provocación con gluten

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TABLA 7 Polimorfismos de A-gliadina 57-73

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TABLA 9 Antagonismo de respuesta de ELISPOT de interferón gamma de A-gliadina 57-73 QE65 por variantes sustituidas de A-gliadina 57-73 QE65 (Sust) (P es el nivel de significación en prueba t no emparejada). También se muestra la actividad de agonista (% agonista) de péptidos en comparación con A-gliadina 57-73 QE65

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TABLA 10 Inhibición de respuesta ELISPOT de interferón gamma A-gliadina 57-73 QE65 por péptidos que se sabe que se unen a HLA-DQ2 (P es el nivel de significación en prueba T no emparejada)

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TABLA 11 Antagonismo de respuesta ELISpot de interferón gamma de A-gliadina 57-73 QE65 por polimorfismos de A-gliadina 57-73 QE65 de ocurrencia natural (P es el nivel de significación en prueba t no emparejada)

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Referencias citadas en la descripción

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Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet W0-910.207-A [01353

\bullet EP-672.7 52-A [0135]

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\bullet WO-92.000.377-A [0143]

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Claims (20)

1. Un péptido cuya longitud no supera los 50 aminoácidos, y que puede ser reconocido por un receptor de células T que reconoce un epítopo que comprende la secuencia ^{62}PQPELPY^{68} (SEQ ID NO: 1).

2. Un péptido según la reivindicación 1, en el que el péptido es una variante sustituida de A-gliadina 57-73 QE65 que comprende la sustitución de aminoácido S63, D65, 163, M63, V62 o V68.

3. Un péptido según la reivindicación 1, en el que el péptido es una variante sustituida de A-gliadina 57-73 QE65 que comprende la sustitución de aminoácido Y62, W62, L63, 162, W68, F62, V63, H63, F63, T62, T63, M66, S62, M62, A63, L62, 168, S67, Q62, F68, N65, A62, A68, P66, S68, Y63, E63, T64, T67 o D63.

4. Un péptido según la reivindicación 1, en el que el péptido es un antagonista del receptor de células T que comprende la sustitución de aminoácido 65T, 67M, 64W o 67W.

5. Una proteína de fusión que comprende (a) un péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes y (b) otra secuencia de gliadina o de no gliadina.

6. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una proteína de fusión según la reivindicación 5, que comprende un aminoácido no natural.

7. Una composición que comprende uno o más de los péptidos o proteínas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Una composición farmacéutica que comprende un péptido o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable.

9. Un péptido o proteína de fusión según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 8, para uso en terapia.

10. Un péptido o proteína de fusión según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 8, para uso en el tratamiento o prevención de enfermedad celiaca.

11. Un péptido, proteína de fusión o composición farmacéutica según se define en la reivindicación 10, en que dicho tratamiento o prevención de enfermedad celiaca es por tolerización.

12. Un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo que comprende:

(a) puesta en contacto de una muestra del hospedador con un péptido o proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y

(b) determinación in vitro de si las células T en la muestra reconocen el péptido o proteína de fusión; reconocimiento por las células T que indica que el individuo tiene o es susceptible a enfermedad celiaca.

13. Uso de un péptido o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medio de diagnóstico para uso en un procedimiento de diagnostico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento la determinación de si las células T del individuo reconocen el péptido, reconocimiento por las células T que indica que el individuo tiene o es susceptible a enfermedad celiaca.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que el procedimiento comprende la administración del péptido o proteína de fusión a la piel en un individuo y la detección de la presencia de inflamación en el sitio de administración, indicando la detección de inflamación que las células T del individuo reconocen el péptido o proteína de fusión.

15. Un procedimiento según la reivindicación 12 o un uso según la reivindicación 13, en el que la muestra es una muestra de sangre.

16. Un kit para efectuar un procedimiento o uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 que comprende un péptido o proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un medio para detectar el reconocimiento del péptido o proteína de fusión por la célula T.

17. Un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca en un individuo que comprende

(a) puesta en contacto de una muestra del individuo con un péptido o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

(b) determinación de la presencia de un anticuerpo que se une al péptido o proteína de fusión, la presencia del anticuerpo que indica que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca.

18. Un kit para efectuar el procedimiento de la reivindicación 17 que comprende un péptido o proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y un medio para detectar la unión del anticuerpo.

19. Uso de un péptido o proteína de fusión según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para producir un anticuerpo específico para el péptido.

20. Un procedimiento para identificar un análogo de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos ^{62}PQPELPY^{68} (SEQ ID NO: 1) o ^{57}QLQPFPQPELPYPQPQS^{73} (SEQ ID NO: 2) que comprende la determinación de si una sustancia candidata es reconocida por un receptor de células T o un anticuerpo que reconoce el péptido, indicando el reconocimiento de la sustancia que la sustancia es un análogo.