KR0167016B1 - 항원 특이적인 활성화된 t 림프구, 이것의 검출 및 사용방법 - Google Patents
항원 특이적인 활성화된 t 림프구, 이것의 검출 및 사용방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR0167016B1 KR0167016B1 KR1019950000906A KR19950000906A KR0167016B1 KR 0167016 B1 KR0167016 B1 KR 0167016B1 KR 1019950000906 A KR1019950000906 A KR 1019950000906A KR 19950000906 A KR19950000906 A KR 19950000906A KR 0167016 B1 KR0167016 B1 KR 0167016B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- peptide
- mhc
- amino acid
- group
- complex
- Prior art date
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title abstract description 121
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 243
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 65
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 claims description 13
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 9
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 claims description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 description 36
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 25
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 13
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 13
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 13
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 101100223310 Homo sapiens GAD1 gene Proteins 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 10
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 9
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LZOIGVDSAMDBIO-LXWJMTKESA-N (2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C1=CC=CC=C1 LZOIGVDSAMDBIO-LXWJMTKESA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101100223318 Homo sapiens GAD2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PJPOCNJHYFUPCE-UHFFFAOYSA-N picen-1-ol Chemical compound C1=CC=CC2=C(C=CC=3C4=CC=C5C=CC=C(C=35)O)C4=CC=C21 PJPOCNJHYFUPCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-pyridin-2-ylsulfanylpropanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSC1=CC=CC=N1 QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTRLJOWPWILGSB-UHFFFAOYSA-N 1-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methoxymethyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1COCN1C(=O)C=CC1=O UTRLJOWPWILGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAAYDFBUMOADEP-UHFFFAOYSA-N 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)-3-hexanoyl-1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical class O=C1C=CC(=O)N1C1(C(=O)CCCCC)CC(=O)N(O)C1=O FAAYDFBUMOADEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIGPSBHTJZUPKU-UHFFFAOYSA-N 3-benzoyl-1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical class O=C1N(O)C(=O)CC1C(=O)C1=CC=CC=C1 WIGPSBHTJZUPKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102100032378 Carboxypeptidase E Human genes 0.000 description 1
- 108010058255 Carboxypeptidase H Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010053491 HLA-DR beta-Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 1
- 108010036012 Iodide peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010066345 MHC binding peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 208000001280 Prediabetic State Diseases 0.000 description 1
- 208000032236 Predisposition to disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000014267 Thyroid peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000003316 immunomagnetic separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]nonanamide Chemical compound CCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
Abstract
본 발명은 자체 반응성 펩티드, 펩티드-MHC착물, 여기에 반응하는 T 세포아군, 뿐만 아니라 상기 화합물의 진단적 및 치료적 응용에 관한 것이다.
Description
제1도는 본 발명에 따른 자기 반응성 아미노산 서열을 도시한 도면.
제2도는 본 발명에 따른 추가의 자기 반응성 아미노산 서열을 도시한 도면.
제3도는 펩티드 푸울에 의한 T 세포주 6/7의 증식 분석 결과를 나타낸 도면.
제4도는 펩티드 푸울에 의한 T 세포주 6/10의 증식 분석 결과를 나타낸 도면.
제5도는 푸울 7과 푸울 11의 개별적 펩티드들에 의한 T 세포주 6/10의 증식 분석 결과를 나타낸 도면.
제6도는 푸울 7과 푸울 11의 개별적 펩티드들에 의한 T 세포주 6/10의 증식 분석 결과를 나타낸 도면.
본 발명은 자기면역반응을 유발시키는 펩티드, 이러한 펩티드들과 주조직적 복합체(MHC)분자의 복합체, 상기 펩티드 및/또는 상기 펩티드와 MHC 분자의 복합체와 반응하는 T 세포 하위집단(subpopulation)에 관한 것이며, 또한 상기 화합물의 진단 및 치료적 사용방법에 관한 것이다.
류머티즘성 관절염 및 유아성 당뇨병(IDDM)과 같은 자기면역질환의 진전과정에서의 분자 상호관계에 대한 설명이 근년에 빠르게 진보되었고, 그 동안 상기 질환의 초기 진단 및 원인 치료를 위한 구체적 적용예들이 밝혀졌다.
유전적 소인 이외에, 환경적 인자가 또한 상기 질환의 진전에 관여하는 것이 확실하다. 예를 들어, IDDM의 경우에, 유전적 위험 인자 수준에서, MHC클라스 Ⅱ 항원의 소수의 대립 유전자만이 상기 질환과 밀접하게 관련되어 있다. 이러한 대립 유전자의 분석에 의해 IDDM에 대한 위험 그룹을 규정할 수 있다. [참조; Thomson et al., Am. J. Hum. Genet. 43(1988), 799-816 또는 Todd et al., Nature 329(1987), 599-604].
IDDM의 진전과 관련된 환경적 인자는 면역원으로서 작용하는 외인성 펩티드 서열일 것이다. 특히, 이와 관련하여 내인성 구조에 대해 부분적 상동성을 갖는 바이러스 항원들이 논의되었다. 특별한 경우, 특히 출생 후 단계에서, 소혈청 알부민과 같은 음식을 통해 섭취되는 항원은 내인성 구조에 대한 상동성으로 인해 자기공격적인 과정을 촉발시킬 수 있는 면역 반응을 유도할 수 있다.
세포독성 림프구에 의한 이자의 β세포의 점진적 파괴는 IDDM에서 질환 진행을 나타내는 전형적인 예이다. 상기 과정은 글루코오즈 대사의 장애가 나타나기 오래전에 시작된다. 당뇨병이 검출가능한 징후를 나타낼 때, β세포의 90%이상은 이미 파괴된다. 따라서, 위험에 직면한 사람에 있어서, 상기 자기공격적인 T 세포의 조기 검출은 이러한 질환에 걸린 환자에 대한 원인 치료를 제공하기 위해 매우 중요하다.
현재, 자기 면역 질환에서 내인성 조직의 파괴는 최초에는 매우 느리게 진행된다는 사실이 알려져 있다. 상기 과정의 초기 단계에서, 자기공격성 T 세포는 하나 또는 소수의 자기 항원만을 인지할 것이다. 타입 Ⅰ 당뇨병의 동물 모델(NOD 마우스)에 대한 카우프만(Kaufman)등의 연구(Naure 368(1993), 69-72) 및 티쉬(Tisch)등의 연구(Nature 368(1993), 72-78)는 상기 마우스에서 자발적으로 발생하는 당뇨병의 경우에. 초기의 T 세포로 매개된 자기면역 반응은 글루탐산 카르복시 이탈효소와 관련된 것임을 입증하였다. 이 경우에, 글루탐산 카르복시 이탈효소(GAD)의 C말단에서 단지 1개 또는 2개의 에피토프가 NOD 마우스에서 최초 인지된다. 이때에는 상기 설명된 바와 같이 아직 글루코오즈 대사에서의 어떠한 변화를 측정하는 것이 불가능한 반면, 퍼인슐리티스(perinsulitis)는 이미 검출가능하다. 상기 질환이 보다 진행되는 경우에만, 자기공격성 T 세포에 의해 인지되는 GAD 펩티드의 스펙트럼이 확장된다. 또한, 당뇨병의 징후가 나타난 후에. 다른 섬세포 항원(islet cell antigens), 예를들어 페리페린, 열충격 단백질 HSP 65 및 카르복시펩티다아제 H에 대해 미리 활성화된 T 세포를 검출하는 것이 가능하다.
사람의 경우, GAD에 대한 면역 반응은 타입 Ⅰ 당뇨병의 진전과 인과관계를 갖고 있다는 증거가 있다. 예를 들어, GAD에 대한 자기 항체의 병인학적 역할이 대수롭지 않은 것으로 판명될지라도, 예비 당뇨병의 80%이상에서 GAD에 대한 자기 항체를 검출하는 것이 가능하다. 대조적으로, 타입 Ⅰ 당뇨병 환자에서는 T 림프구에 의해 이자의 β세포가 점진적으로 파괴되는 것으로 추정된다. GAD를 향해 이동하는 이들 림프구는 몇몇 연구 그룹에 의해 이미 검출되었다(참조:Harrison et al., J. Clin. Invest. 89 (1992), 1161; Honeyman et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 535). 상기 그룹에 의해 발견된 자기 항체는 GAD 67 kd 분자의 아미노산 208 내지 404로 이루어진 펩티드 단편과 반응한다.
EP-A-O 519 469 호에는, 자기면역적으로 반응하는 사람의 GAD 65 kd 분자로부터 폴리펩티드가 기술되어 있다. 상기 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
상기 서열에서,
X는 1 내지 10개의 아미노산으로부터 선택된 임의적 서열이고,
Z는 1 내지 8개의 아미노산으로부터 선택된 임의적 서열이다.
본 발명의 목적은 타입 Ⅰ 당뇨병 환자로부터의 T 세포, 특히 최근에 발견된 타입 Ⅰ 당뇨병 환자로부터의 T 세포와 반응하는 신규의 자기 반응성 펩티드를 제공하고, 초기의 자기 에피토프를 규정하는데에 있다.
상기 목적은 자기 반응성 T 세포의 검출, 단리, 증식, 아네르기화 및/또는 제거를 위해 적합한 펩티드, 펩티드 유도체, 또는 유사하게 결합하는 분자에 의해 달성된다. 따라서, 본 발명의 주제는,
(a) 아미노산 서열(Ⅰ)
(b) 아미노산 서열(Ⅱ)
(c) 제1도 또는 제2도에 도시한 아미노산 서열 중 하나,
(d) 6개 이상의 아미노산 길이를 갖는,(a), (b) 및/또는 (c)로 나타낸 아미노산 서열의 부분 영역 및/또는
(e) (a), (b), (c) 및/또는 (d)로 나타낸 아미노산 서열과 본질적으로 동등한, MHC 분자에 대한 결합의 특이성 및/또는 친화성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 펩티드 유도체이다.
본 발명에 따르는 펩티드 또는 펩티드 유도체는 바람직하게는,
(a)아미노산 서열(Ⅰ),
(b) 아미노산 서열(Ⅱ),
(c)아미노산 서열(Ⅰ) 및/또는 (Ⅱ)의 부분 영역, 및/또는
(d)(a),(b) 및/또는 (c)로부터의 아미노산 서열과 본질적으로 동등한. MHC 분자에 대한 결합의 특이성 및/또는 친화성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체는 바람직하게는, N-말단서열 L-P 및 C-말단 서열 H-F가 보존되어 있는, 아미노산 서열(Ⅰ) 또는 이로부터 유도된 서열의 부분 영역 L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F를 포함한다.
아미노산 서열(Ⅰ)은 사람의 GAD 65의 아미노산 잔기 266-290에 해당하고, 아미노산 서열(Ⅱ)는 사람의 GAD 65의 아미노산 서열 306-325에 해당한다. 또한, 제1도 및 제2도에 도시된 아미노산 서열은 사람의 GAD 65의 부분 서열이다.
놀랍게도, 사람의 GAD 65의 아미노산 서열 266 내지 285 및 306 내지 325에 해당하는 펩티드가 최근에 발견된 타입 Ⅰ당뇨병 환자로부터 단리된 T 세포 하위집단과 특이적으로 반응함을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따르는 펩티드는 타입 Ⅰ 당뇨병의 매우 빠른 진단을 위해 사용될 수 있는 초기의 자기-에피토프(auto-epitopes)이다. 더욱이. 본 발명에 따르는 펩티드는 또한, 상기 펩티드와 반응하는 T 세포 집단을 비활성화시킴으로써 치료적으로 사용될 수 있다.
아미노산 서열(Ⅰ) 및 (Ⅱ)를 갖는 본 발명에 따른 펩티드와 반응하는 T 세포 하위집단의 바람직한 예는 T 세포주 6/7 및 6/10, 또는 동등한 결합 특이성을 갖는 T 세포이다. T 세포주 6/7 및 6/10은 부다페스트 조약의 규정에 따라 독일연방공화국 38124 브라운 쉬바이크 마쉐로더 베크 1 베에 소재하는 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨트렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH(DSM)에 기탁번호 DSM ACC2172(6/7) 및 DSM ACC2173(6/10)으로 1994년 5월 10일에 기탁하였다.
아미노산 서열(Ⅰ) 및 (Ⅱ)는 사람의 글루탐산 카르복시 이탈효소(GAD)의 65kd 이소 형태의 부분 영역이며, 이것의 완전한 아미노산 서열은 부(Bu)등의 문헌에 기술되어 있다.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992), 2115 ff). 아미노산 서열(Ⅰ) 및 (Ⅱ)는 타입 Ⅰ 당뇨병 환자의 말초 혈액으로부터 T 세포주를 준비한 후, 돼지의 뇌로부터의 GAD로 시험관내에서 자극하고, 사람의 GAD 서열로부터 유도된 합성 펩티드 서열에 의한 증식 분석에서 상기 T 세포주를 시험함으로써 확인한다.
본 발명에 따르는 펩티드는 화학적 방법을 사용하는 널리 공지된 합성 방법에 의해 생산되거나, 적합한 숙주 세포, 특히 대장균에서 상기 펩티드를 코드하는 DNA 서열을 클로닝 및 발현시키는 유전공학에 의해 생산될 수 있다.
또한, 본 발명은 특별히 규정된 아미노산 서열(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 부분 영역, 또는 6개 이상의 아미노산, 바람직하게는, 8개 이상의 아미노산, 특히 바람직하게는 10개 이상의 아미노산 및 가장 바람직하게는 15개 이상의 아미노산의 길이를 갖는 제1도 및 제2도에 나타낸 아미노산 서열의 부분 영역을 갖는 펩티드를 포함한다.
본 발명에 따른 펩티드의 최소 길이는 MHC 분자를 인지하고, 여기에 특이적으로 결합하며. 해당 T 세포 수용체와 반응하는 능력에 의해 결정된다.
GAD로부터 유도되고 MHC와 결합하는 본 발명에 따른 펩티드의 단편의 최대 길이는, 바람직하게는 100개의 아미노산, 특히 바람직하게는 50개의 아미노산 및 가장 바람직하게는 25개의 아미노산이다.
아미노산 서열(Ⅰ) 및 (Ⅱ) 또는 이들의 부분 영역을 갖는 펩티드 이외에, 본 발명은 상기 언급된 서열과 본질적으로 동등한, MHC 분자에 대한 결합의 특이성 및/또는 친화성을 나타내고, 바람직하게는, 아미노산 서열(Ⅰ) 또는 (Ⅱ), 또는 유사하게 결합하는 물질로부터 개개의 아미노산 잔기, 또는 아미노산 잔기의 짧은 단편의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 유도되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 또한 상기 언급된 아미노산 서열에 완전히 상응하지는 않지만, 동일하거나 밀접하게 관계된 앵커 위치를 갖는 펩티드 변형체에 관한 것이다. 이와 관련하여, 용어 앵커 위치는 MHC 분자, 특히 클라스 DR3, DR4 또는 DQ의 MHC 분자에 결합하는데 필수적인 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어 햄머(Hammer)등의 문헌(Cell 74(1993), 197-203)에는 DRB10401 결합 모티브에 대한 앵커 위치가 기술되어 있다. 이러한 앵커 위치는 본 발명에 따르는 펩티드에서 보존적이거나, 선택적으로, 화학적으로 밀접하게 관련된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 치환된다(예를들어, 발린에 의한 알라닌의 치환, 이소루신에 의한 루신의 치환, 및 그 반대의 치환). 본 발명에 따르는 펩티드에서의 앵커 위치는 상기 언급된 특이적 펩티드의 변형체를 MHC 분자에 대한 결합능력에 대해 시험함으로써 간단한 방법으로 결정될 수 있다. 본 발명에 따르는 펩티드는 상기 언급된 펩티드와 본질적으로 동등한, MHC 분자에 대한 결합의 특이성 및/또는 친화성을 나타냄을 특징으로 한다. 아미노산 서열(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)를 갖는 펩티드 또는 제1도 및 제2도에 나타낸 아미노산 서열로부터 유도된 펩티드는 바람직하게는, 모(母) 펩티드 또는 이것의 부분 서열에 대해 적어도 30%, 특히 바람직하게는 적어도 50% 및 가장 바람직하게는 적어도 60%의 상동성을 갖는다.
특별히 규정된 펩티드의 변형체의 예로는 사람의 GAD 67로부터의 상응하는 상동성 펩티드 단편이 있으며, 이것의 완전한 아미노산 서열은 부(Bu)등의 문헌(상기 문헌 참조)에 기술되어 있다.
또한, 용어 본질적으로 동등한, MHC 분자에 대한 결합의 특이성 및/또는 친화성은 아미노산 서열(Ⅰ)(Ⅱ) 또는 제1도 및 제2도에 나타낸 아미노산 서열과 비교하여 개선된 결합 특이성 및/또는 친화성을 포함하며, 특히 바람직하게는 8 내지 15개의 아미노산의 길이를 갖는 절단 펩티드의 경우에 발견된다.
더욱이, 본 발명은 또한 펩티드 유도체를 포함한다. 이 펩티드 유도체라는 용어는 하나 또는 수개의 아미노산이 화학 반응에 의해 유도되는 펩티드를 포함한다. 본 발명에 따르는 펩티드 유도체의 예로는 특히, 골격 및/또는 반응성 아미노산 측쇄 그룹, 예를들어 유리 아미노기, 유리 카르복실기 및/또는 유리 수산기가 유도체화되는 분자들이다. 아미노기의 유도체의 특정 예로는, 술폰산 또는 카르복실산 아미드, 티오우레탄 유도체 및 암모늄염, 예를들어 염산염이 있다. 카르복실기 유도체의 예로는 염, 에스테르 및 아미드가 있다. 수산기 유도체의 예로는 O-아실 또는 O-알킬 유도체가 있다. 더욱이, 본 발명에 따르는 용어 펩티드 유도체는 하나 또는 수개의 아미노산을 천연적으로 생성되는 또는 비-천연적으로 생성되는, 20개의 표준 아미노산의 아미노산 동족체로 치환시킨 펩티드를 포함한다. 이러한 동족체의 예로는, 4-히드록시프롤린, 5-히드록시리신, 3-메틸히스티딘, 호모세린, 오르니틴, β-알라닌 및 4-아미노부티르산이 있다.
아미노산 서열(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)를 갖는 펩티드들과 본질적으로 동등한, MHC 분자에 대한 결합의 특이성 및/또는 친화성을 갖지만, 이러한 펩티드들과는 대조적으로, T 세포의 활성화를 유발시키는 것 보다는 오히려 T 세포에서 아네르기 상태의 발생을 유발시키는 펩티드가 특히 바람직하다.
본 발명은 또한, MHC 결합 펩티드 부분이 거대 폴리펩티드 유니트의 구성요소인 폴리펩티드를 포함하며, MHC 결합 펩티드와 폴리펩티드 유니트의 나머지 부분 사이의 연결은 미리 결정된 절단점, 예를들어 프로테아제 절단부위를 갖는다.
본 발명의 추가의 주제는 신호 그룹 또는 마커그룹, 예를들어 형광 마커그룹(예:로다민, 피코에리트린), 디곡신(digoxin), 비오틴, 방사성 그룹 또는 독소그룹(예:리신, 콜레라 독소 등)을 생성시키는 물질을 수반하는 펩티드 또는 펩티드 유도체이다. 마커 그룹에 대한 본 발명에 따르는 펩티드의 커플링은 펩티드가 생체 내 또는 시험관내(예를들어, 영상화) 응용을 위한 진단제 또는 치료제로서 사용되는 것을 가능하게 한다. 더욱이, 본 발명에 따르는 펩티드는 예를들어, MHC 분자와 결합하는데 중요한 서열들이 스페이서 영역에 의해 서로 분리되어 있는 고리화 형태 또는 올리고머 형태로 존재할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 언급한 펩티드 또는 펩티드 유도체와 본질적으로 동등한, MHC분자에 대한 결합의 특히성 및/또는 친화성을 나타내는 펩티드 유사물질에 관한 것다. 펩티드 유사물질 또는 펩티드 유사체는 MHC 분자와의 상호작용과 관련하여 펩티드를 대신할 수 있고, 천연 펩티드에 비해 증가된 대사 안정성, 개선된 생체 이용률 및 보다 연장된 작용 기간을 가질 수 있는 화합물이다. 펩티드 유사체의 생산방법은 기안니스(Giannis) 및 콜터(Kolter) 에 의해 기술되어 있다[참조: Angew. Chem. 105(1993), 1303-1326, Lee et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 66(1993), 2006-2010 and Dorsch et al., Kontakte(Darmstadt)(1993)(2), 48-56]. 상기 참고문헌의 설명은 본 발명에 따른는 펩티드 유사물질의 생산과 관련하여 언급된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따르는 하나이상의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 펩티드 유사체, 및 하나이상의 MHC 분자 또는 MHC 분자의 펩티드 결합 유도체와 이루어진 복합체에 관한 것이다. 상기 복합체에서는, 바람직하게는 적어도 10-7l /몰, 특히 바람직하게는 10-8내지 10-9l /몰의 결합 상수를 갖는 펩티드, 펩티드 유도체 또는 펩티드 유사체가 MHC 분자 또는 MHC 분자의 펩티드 결합 유도체에 결합된다. 다른 방법으로, 펩티드, 펩티드 유도체 또는 펩티드 유사체는 예를들어, 광 결합제에 의해, 또는 유전공학적인 공유결합의 펩티드-MHC 융합으로서 MHC 분자에 공유결합될 수 있다. 이러한 펩티드-MHC 융합 단백질은 바람직하게는, HLA-DR 베타사슬 및 여기에 유전공학적으로 융합된 자기반응성 펩티드를 함유한다. 상기 복합체는 MHC 클라스II 분자 또는 이것의 펩티드 결합 유도체를 함유하는 것이 특히 바람직하다.
MHC 클라스II분자는 DR 타입, 예를들어 DR1, DR2, DR3 또는 DR4 타입을 갖는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는, MHC 클라스II분자는 서브타입 DR B1 101, DR B1 0301, DR B1 0401, DR B1 0402, DR B1 0404 또는 DR B1 1601을 갖는다. 서브 타입 DR B1 0101 또는 DR B1 0401의 MHC 클라스II 분자가 가장 바람직하다. DR B1 대립 유전자 0401 및 0101 및/또는 1601의 존재하에 아미노산 서열(1)의 자기 반응성 펩티드에 의해 T 세포주 6/7(DSM ACC2172)이 증식된다. DR B1 대립 유전자 0401의 존재하에 증식은 아미노산 서열(II)를 갖는 자기 반응성 펩티드에 의해 관찰된다. DR B1 대립 유전자 0401의 존재하에 아미노산 서열(I) 및 (II)의 자기 반응성 펩티드에 의해 T 세포주 6/10(DSM ACC2173)이 증식된다.
상기 서브타입의 MHC 클라스II 분자를 코드하는 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 하기 문헌에 공개되어 있다[Corell et al. (Mol. Immunol. 28(1991), 533-543)]. 상기 문헌은 본원에서 인용된다.
용어 bMHC 분자의 펩티드 결합 유도체는 천연 MHC 분자의 단백질 가수분해 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성되고, 본질적으로 펩티드 결합 성질이 보존된 MHC 분자의 단편으로 이루어진다. 또한, 상기 용어는 펩티드 결합에 관련된 MHC 부분 이외에 추가의 폴리펩티드 성분을 함유하는 융합 단백질을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따르는 펩티드-MHC 복합체는 바람직하게는, 펩티드가 유리된 MHC 분자 또는 MHC 분자 유도체를, 본 발명에 따르는 펩티드, 펩티드 유도체 또는 펩티드 유사체와 결합시켜 생성시킨다. 펩티드가 유리된 MHC 분자의 생성은 예를들어, 천연 MHC 분자를 펼침으로써 결합된 펩티드를 해리시키고, 비어있는 MHC 분자를 재굴곡시킴으로써 수행된다[참조: Dornmair and McConnell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(1990), 4134-4138 and WO91-14701).
다른 한편으로는, 펩티드가 유리된 MHC 분자는 MHC 분자 또는 이것의 유도체의 재조합 생산에 의해 얻어질 수 있다. 이것의 예로는 섬유아세포에서의 MHC 클라스II 분자의 발현 뿐만 아니라(Germain and Malissen, Ann. Rev. Immunol. 4(1990), 281-315), CHO 세포에서의 막 앵커 없는 가용성 MHC 클라스II 분자 유도체의 발현(Wettstein et al., J. Exp. Med. 174(1991), 219-228, Buelow et al., Eur. J. Immunol. 23(1990), 69-76) 그리고 곤충 세포에서의 바쿨로바이러스 발현계의 사용에 의한 가용성 MHC 클라스II 분자 유도체의 발현이 있다(Stern and Wiley, Cell 68(1992), 465-477; Scheirle et al., J. Immunol. 149(1992), 1994-1999). MHC 클라스I 분자는 또한, CHO 세포(Fahnestock et al., Science 258(1992), 1658-1662), 곤충세포(Jackson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992), 12117-12120; Matsamura et al., J. Biol. chem. 267(1992), 23589-23595) 및 섬유아세포(Mage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992), 10658-10661)에서 발현된다.
또한 펩티드가 유리된 MHC 분자는 대장균에서 발현될 수 있는 것으로 공지되어 있다[참고문헌: Parker et al., Mol. Immunol. 29(1992), 371-378; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992), 8403-8407; Garboczi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992), 3429-3433; Altman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993), 10330-10334]. 상기 공보에 기술된 MHC 분자 또는 MHC 분자 유도체의 재조합 발현에 대한 기술이 본 발명을 위해 인용된다.
본 발명에 따른 복합체의 MHC 성분은 바람직하게는, 재조합 MHC 분자 또는 이것의 펩티드 결합 유도체, 및 특히 바람직하게는, 막 앵커가 부분적으로 또는 완전히 결실된 가용성 MHC 분자 유도체이다.
본 발명에 따르는 자기 반응성 펩티드를 제공하는 MHC 분자를 확인하기 위해, 공여체의 항원제공 세포를 표지화된 형태의 본 발명에 따르는 펩티드와 함께 인큐베이션시키고, 결합된 펩티드는 천연 MHC 분자의 변성에 의해 우선 해리시키는 것이 바람직하다. 이어서, 표지화된 MHC-펩티드 복합체는 MHC 분자의 프레임워크에 특이적인 결정기에 지향되는 서브타입 특이적인 항체에 의해 면역침전되고, 표지화된 펩티드의 존재에 의해 확인될 수 있다.
다른 방법으로, EBV(엡스타인-바 바이러스)로 형질전환된 공여체의 B세포가 항원제공 세포로서 사용될 수 있다.
재조합 MHC 분자 유도체로부터 본 발명에 따르는 복합체의 생성은 예를 들어, MHC 분자,예를들어 MHC DR3, DR4 또는 DQ 분자의 α 및 β 사슬의 가용성 부분에 대한 DNA 단편이 EBV로 형질전환된 공여체의 B 세포주로부터의 cDNA를 상응하는 MHC 분자를 발현시키는 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 단리되는 방식으로 수행될 수 있다. 이 단계에서는, PCR 프라이머의 적절한 선택에 의해 α 및 β 사슬의 C 말단에서 정제 보조서열, 예를들어 올리고히스티딘 세그먼트(예를들어, 헥사히스티딘 세그먼트)를 도입시키는 것이 바람직하다. 계속해서, PCR생성물은 대장균에서 하위클로닝되고, 봉입체로서 발현된다. 상기 봉입체는 공지된 방법(대장균에서 MHC 분자의 발현에 대한 상기 문헌 참조)에 의해 가용화되고, MHC 단백질은 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 계속해서, α 및 β 서브유니트는 상기 펩티드의 존재하에 복원된다.
또한, 본 발명에 따르는 펩티드-MHC 복합체는 상기 기술된 바와 같은 마커 그룹을 수반할 수 있으며, 이 경우에, 마커 그룹은 공지된 방법에 의해 복합체의 MHC 성분 뿐만 아니라 펩티드 성분에도 결합될 수 있다.
본 발명의 추가의 주제는 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 결합되는 2개 이상의 MHC 분자 또는 MHC 분자 유도체를 함유하는 올리고머화된 펩티드-MHC 복합체이다. 공지된 단량체 복합체(MHC 분자에 대해)와 비교하여, 이러한 올리고머화된 펩티드-MHC 분자 복합체의 장점은, 더 높은 친화성, 및 개선된 진단 및/또는 치료 효율을 갖는다는 점이다.
본 발명의 한 구체예에서, 이러한 올리고머화된 복합체는 공지된 방법에 따라, 화학적 커플링 시약, 예를들어 N-숙신이미딜-3(2-피리딜티오)프로피오네이트, 3-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 말레이미도헥사노일-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 비스(말레이미도메틸)에테르, 수베르산 디숙신이미딜, 글루타르디알데히드 등을 통한 단량체 펩티드-MHC복합체의 공유적 교차결합에 의해 생산될 수 있다. 선택적으로, 특정 커플링 시약이 바람직하게는 펩티드 성분 또는 MHC 성분의 개별적 아미노산에 작용하는 방식으로, 펩티드 성분 또는 MHC 성분의 개별적 아미노산을 변형시키는 것이 가능하다. SH 결합제에 의한 커플링 또는 아미노기를 통한 커플링은 단백질 성분의 경우에 재조합 수단에 의해 부가적 시스테인 또는 리신 잔기를 도입시킴으로써 달성되거나, 펩티드 성분의 경우에는 화학적 합성에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 올리고머화된 펩티드-MHC 복합체는 MHC 분자에 결합하는 펩티드 성분이 올리고머, 즉, 2개 이상의 MHC 결합 영역을 함유하는 펩티드 분자로서 사용되는 방식으로 생산될 수 있으며, 이 경우 MHC 분자와 결합하는데 중요한 서열들은 스페이서 영역에 의해 서로 분리되어 있다. 상기 스페이서 영역은 일반적으로 10개 내지 15개의 아미노산으로 이루어진다. 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 또는 이들의 조합물과 같은 저분자 친수성 아미노산이 사용된다. 펩티드가 유리된 MHC 분자가 상기 펩티드 올리고머의 존재하에 복원되는 경우, 비-공유적 상호작용을 통해 올리고머화된 펩티드 성분에 의해 교차결합된 MHC 분자들을 함유하는 본 발명에 따르는 올리고머화된 복합체가 형성된다.
또한, 올리고머화된 펩티드-MHC 복합체는 재조합적으로 생산된 MHC 분자를 변형시킴으로써 생산될 수 있다. MHC 클라스II 분자의 재조합 α 또는 β 사슬의 발현을 위한 벡터를 구성하는 동안, 바람직하게는 C-말단에서 항체에 의해 인지되는 에피토프를 코드하는 유전자 세그먼트를 클로닝하는 것이 가능하다. 상기 항체는 IgG 타입을 가질 수 있지만, IgG 타입을 가지는 것이 바람직하다. 복원된 단량체 펩티드-MHC 복합체는 수개의 항체 및 수개의 펩티드-MHC 복합체로 이루어진 비-공유적인 교차결합 면역 복합체가 생성되도록, 도입된 에피토프를 인지하는 항체와 함께 인큐베이션시킨다. MHC 분자의 α 또는 β 사슬을 코드하는 DNA 단편으로의 에피토프를 코드하는 DNA 세그먼트의 도입은 널리 공지된 분자생물학적 기술, 예를들어 제한부위로의 삽입 또는 특정부위 돌연변이발생에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따르는 올리고머화된 펩티드-MHC 복합체는 바람직하게는, 아미노산 서열(I),(II), 제1도 및 제2도에 나타낸 아미노산 서열, 이들의 부분 영역 및/또는 이들로부터 유도된 아미노산 서열, 또는 이들의 펩티드 유도체 또는 펩티드 유사체로 이루어진 펩티드를 함유한다. 올리고머화된 복합체는 바람직하게는, 타입I 당뇨병의 진단용 또는 치료용 시약으로서 사용된다.
따라서, 본 발명은 원한다면 일반적인 약제학적 첨가제와 조합하여, 활성성분으로서 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드 유사체 및/또는 펩티드-MHC 복합체를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 조성물은 보조 자극 성분, 예를들어 IL-2 및 IL-4와 같은 사이토킨, 및/또는 T세포상의 표면 분자 CD-28에 결합할 수 있는 표면 항원 B7(Wyss-Coray et al., Eur. J. Immunol. 23(1993), 2175-2180; Freeman et al., Science 262(1993), 909-911)을 함유할 수 있다. 보조 자극 성분의 존재는 상기 조성물의 치료 효과를 개선 및/또는 변경시킬 수 있다.
더욱이, 본 발명은 면역계에 영향을 주는 질환 또는 질환에 대한 소인, 또는 종양 또는 종양에 대한 소인, 특히 자기면역 질환 또는 자기면역 질환에 대한 소인, 예를들어 당뇨병 타입I 또는 타입II, 바람직하게는 당뇨병 타입I의 진단을 위한 약제의 생산을 위해, 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드 유사체 및/또는 펩티드-MHC 복합체를 함유하는 약제학적 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
그러나, 기타의 자기면역 질환의 경우에, 유사한 진단적 응용이 또한 가능하다. 이러한 자기면역 질환의 예로는, 미엘린 기본 단백질 또는 단백질 지질 단백질에 대한 반응성 T 세포가 측정될 수 있는 다중 경화증, 콜라겐 타입 II, 시토케라틴 및 Hsp 65에대한 반응성 T세포가 측정될 수 있는 류머티스성 관절염, 갑성선 과산화효소에 대한 반응성 T 세포가 측정될 수 있는 바세도우병이 있다.
예를들어 동맥 경화증의 경우에서와 같이, 일반적으로 면역계에 영향을 주는 모든 질환에 대해 진단적 응용이 가능하다. 이 경우에, 상기 질환은 열충격 단백질 Hsp 65에 대한 면역반응과 관련이 있는 것으로 입증되었다[참조: Xu et al., Lancet 341, 8840(1993), 255-259].
추가의 응용은 종양 항원에 반응하는 T 세포의 진단적 검출이다. 이것의 예로는 흑색종 환자로부터 단리된 흑색종 관련 항원 MAGE 1에 대한 T 세포가 있다[참조: van der Bruggen et al., Science 254(1991), 1643-1647]. 본 발명에 따르는 올리고머화된 복합체는 충분하지 못한 세포량으로 인해 통상적인 방법에 의해 종량을 검출할 수 없는 단계에서 상기 T 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 특이적으로 반응하는 T 세포의 검출이 항-종양 백신화를 모니터하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 체액, 예를들어 전혈로부터 유래한 것이 바람직한 T 세포를 함유하는 샘플을 본 발명에 따르는 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드 유사체 및/또는 본 발명에 따르는 복합체와 접촉시키고, T 세포와 펩티드 또는 복합체의 반응을 측정하는 것을 특징으로 하는, 특이적인 T 세포 하위집단의 결정방법에 관한 것이다. T 세포와 복합체 또는 펩티드의 특이적 반응은 예를들어, 방사능의 혼입에 의해 측정될 수 있는 증가된 T 세포 증식에 의해 검출될 수 있다. 다른 한편으로 T 세포의 반응은 표지화된 펩티드 또는 복합체의 사용에 의해 직접 결정될 수 있다. 이러한 구체예에서, 펩티드 또는 복합체는 여기에 커플링된 형광 마커그룹과 함께 사용되는 것이 바람직하다. 평가는 예를들어, T 세포를 T 세포에 특이적인 항체에 커플링된 제1형광 마커와 접촉시키고 나서, 제2형광 마커에 커플링된 펩티드-MHC 복합체와 접촉시키는 FACS 분석에 의해 수행하고, 이중 표지화된 세포의 존재는 형광사진 분석에 의해 결정될 수 있다. 상기 방식으로, 본 발명에 따르는 펩티드 또는 펩티드 유도체 및/또는 본 발명에 따르는 펩티드-MHC 복합체와의 반응성을 특징으로 하는 T 세포 하위집단이 결정된다. 혈액중의 특이적 T 세포집단의 저농도 때문에, 미리 활성화된 T 세포의 선택, 예를들어 IL-2 및/또는 IL-2 수용체 항체와의 인큐베이션에 의한 IL-2수용체 양성의 T 세포의 선택적 농축, 및 예를들어 면역자기법의 사용에 의한 항체 결합 세포의 후속 분리를 본 발명의 첫 번째 단계로서 수행한다. 다른 한편으로, T 세포와 펩티드 또는 복합체의 접촉 후, 미리 활성화된 세포에 대한 선택이 수행될 수 있다.
본 방법의 변형으로, 미리 활성화된 자기 반응성 T 세포, 즉 표면 마커로서 IL-2 수용체를 갖는 T 세포와 비활성화된 자기 반응성 T 세포, 즉 IL-2 수용체가 없는 T 세포의 비가 결정될 수 있다.
특히, 타입I 당뇨병을 진단하기 위해, 또한 면역계에 영향을 주는 다른 질환 또는 이러한 질환에 대한 소인의 진단을 위해 상기 방법이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 면역계에 영향을 주는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 생산을 위해, 본 발명에 따르는 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드 유사체 및/또는 펩티드-MHC 복합체를 함유하는 약제학적 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 펩티드 및 본 발명에 따르는 펩티드-MHC 복합체의 치료적 응용을 위해, 예를들어 독소에 커플링된 펩티드 또는 펩티드-MHC 복합체를 사용하는 것이 가능하고, 다른 한편으로, 비록 T 세포 수용체에 결합가능하지만, T 세포의 활성화를 유발시키지 않는, 즉 아네르기 효과를 갖는 복합체의 성분으로서 또는 단독으로 펩티드를 사용하는 것이 또한 가능하다.
이러한 아네르기화 펩티드 유사체의 치료 작용은 T 세포 수용체(TCR)가 T 세포를 활성화시키기 위해 클라스I 또는 클라스II의 MHC 항원에 의해 제공되는 펩티드와 상호작용해야 한다는 사실에 기인한 것이다. 이러한 과정에서, 펩티드의 앵커 위치에서의 아미노산은 특히, MHC 분자에 대한 결합을 담당하는 반면, 펩티드중의 다른 아미노산은 TCR과의 상호작용에 기여함으로써, T 세포 자극을 유발시킨다. 따라서, 앵커 위치의 존재로 인해 MHC 분자에 여전히 결합하지만, 다른 한편으로, T 세포 활성화를 부분적으로 유발시키거나, 유발시키지 않는 펩티드 중의 아미노산 치환들에 의해 펩티드 유사체를 생산하는 것이 가능하다[참조: Sloan Lancaster et al., Nature 363(1993), 156-159]. 이러한 펩티드 유사체는 예를들어, 특정 표면 분자의 발현을 더 높은 수준으로 조정하지만(예를들어, IL-2 수용체, LFA-1), 증식 또는 사이토킨 발현이 일어나지 않는 효과를 가질 수 있다. 이러한 펩티드 유사체와 상호 작용하는 T 세포는 소위 아네르기 상태로 형질전환된다. 즉, 이들은 면역원성 펩티드에 의한 계속되는 규칙적 자극 후에도 더이상 증식할 수 없다. 상기 아네르기 상태는 적어도 7일간 지속되고, 따라서, 자기 면역 질환의 치료에서 치료적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 치료적 일면은, 펩티드 또는 펩티드 및 MHC 분자의 복합체가 항원으로서 사용될 수 있다는 것이다. 이 경우에, 이러한 항원은 면역원, 즉 면역 반응을 자극하는 제제, 또는 면역관용원(tolerogen), 즉 면역 관용을 유발시키는 제제로서 작용할 수 있다. 면역원으로서의 응용은 예를들어, 종양항원에 대한 백신화를 위해 사용될 수 있다. 이를 위해 지금까지 사용된 전체 종양 세포대신에, 상응하는 MHC 분자와의 복합체, 특히 올리고머화된 복합체의 형태로 T 세포에 의해 인지되는 종양 특이적인 펩티드를 주입하여 종양에 대한 T 세포 반응을 생성시키는 것이 가능하다. 면역 자극을 증가시키기 위해, 부가적 자극 물질과 조합하여 복합체를 투여하는 것이 또한 가능하다. 본 발명에 따르는 펩티드-MHC 복합체에 선택적으로 그리고 바람직하게 공유결합되는 IL2 또는 IL4와 같은 사이토킨이 이러한 목적에 적합하다. 복합체를 T 세포 활성화를 위해 보조 성분과 결합시키고, 특히 항원제공 세포의 경우 필수적인 표면분자, 예를들어 표면 분자 B7과 결합시키는 것이 추가로 가능하다.
바람직한 치료용 제형은 펩티드를 지진 MHC 분자를 인공 소낭, 예를들어 B7 및/또는 고정화 사이토킨과 같은 추가의 막 결합 분자를 선택적으로 수반할 수 있는 지질 소낭으로 혼입한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따르는 펩티드 또는 펩티드-MHC 복합체와 반응하는 T 세포 하위집단의 단리방법에 관한 것이다. 이러한 방법에서, 예를들어 환자로부터 사전에 수집한 체액으로부터 유래한 T 세포를 함유하는 샘플을 본 발명에 따르는 펩티드 또는 본 발명에 따르는 펩티드-MHC 복합체와 접촉시키고, 펩티드 또는 복합체와 반응하는 T 세포를 확인하며, 필요하다면, 다른 T 세포로부터 이들을 분리한다. 또한, 이경우에, T 세포와 펩티드 또는 복합체의 접촉 전 및/또는 후에, 미리 활성화된 T 세포, 즉 IL-2수용체를 갖는 T 세포를 선택하는 것이 가능하다.
이러한 방법에서, 펩티드 또는 펩티드-MHC 복합체는 담체상에서 고정화 형태로 사용될 수 있는데, 이는 다른 T 세포로부터 양성으로 반응하는 T 세포 집단의 분리를 간소화시킨다. T 세포주는 재자극에 의해 상기 방식으로 단리된 T 세포 하위집단으로부터 준비될 수 있다. 상기 자기 반응성 T 세포주는 환자를 면역시키기 위해 사용될 수 있다.
타입I 당뇨병의 특이적 면역 치료는, 우선 자기 항원, 예를들어 GAD 65에 대한 특이적 T 세포주를 IDDM 환자로부터 단리시키는 것을 포함한다. 그 다음, 상기 T 세포주의 미세한 특성을 측정한다. 즉, 자기 반응성 펩티드를 확인한다. 우세한 펩티드, 즉 여러개의 단리된 T 세포주가 반응하는 펩티드를 인지하는 T 세포주는 환자의 추후 백신화를 위해 선택된다. 특히, 아미노산 서열(I) 또는 (II)를 갖는 펩티드를 인지하는 T 세포가 존재한다.
환자중에 명백하에 우세한 펩티드가 없는 경우, 수개의 T 세포주가 추후의 접종을 위해 혼합되어야 한다. 선택된 T 세포 클론은 활성화 분자의 발현 및 특히, T 세포 수용체의 우수한 발현을 보장하기 위해, 항원 제공 세포 및 적절한 펩티드에 의한 접종전에 다시 자극받는다. 그 다음, T 세포주는 예를들어, 열처리 및/또는 바람직하게는 4000 내지 10000rad, 특히 바람직하게는 약 8000rad의 조사량으로 방사능 조사에 의해 비활성화되고, 바람직하게는 107내지 5×107개의 세포수로 T 세포주가 얻어진 환자에게 피하주사된다. 일반적으로, 3회 이상의 주사가 6 내지 12개월 동안에 걸쳐 수행된다.
계속해서, 접종된 환자의 T 세포 반응이 시험될 수 있다. 이를 위해, 환자의 말초 혈액 림프구(PBL)가 예를들어,피콜(Ficoll) 밀도 기울기 원심 분리에 의해 단리되고, 접종에 의해 야기된 증식은 표준 증식 시험으로 시험된다. 성공적인 면역후에, 접종에 대한 반응으로 환자의 PBL의 실제 증식을 검출하는 것이 가능해야 한다. 면역화 이후의 추가의 제어는 면역화과정 동안 환자의 GAD-반응성 T 세포의 빈도수를 측정하는 것이다. 이것은 예를들어, GAD로 접종한 후, 예를들어 4000rad로 방사전 조사된 자기 자극 세포를 사용하는 표준 제한희석법에 의해 수행될 수 있다. 면역화가 성공적으로 일어나는 경우, 자기 반응성 T 세포의 빈도는 상당히 감소한다.
또한, 조절 T 세포에 의해 인지되는, 접종물의 T 세포상의 표면 구조가 추가로 한정된 후에, 예를들어 T 세포수용체의 세그먼트로 조절 T 세포의 부분구조를 면역시키는 것이 가능하다.
다른 한편으로는, 분열할 수 있는 T 세포는 종양 세포에 대한 환자의 활성 면역화를 유도하는 항-종양 백신화를 위해 재주입될 수 있다.
또한, 특이적 T 세포 하위집단을 확인 또는 활성화/억제시키기 위한 진단 및 치료방법에서, MHC- 펩티드 복합체의 작용을 자극하는 항-이디오 타입 항체가 본 발명에 따르는 펩티드 또는 펩티드-MHC 분자 대신에 사용될 수 있다. 이러한 항체는 예를들어 마우스에서 항체를 생성시키기 위해 면역 원인 특정 펩티드에 대항하는 특이적 T 세포하위집단을 사용함으로써 수득되거나, 우선 MHC- 펩티드 복합체에 대한 항체를 생성시킨 후, 상기 제1항체에 대한 항-이디오 타입 항체를 생성시킴으로써 쉽게 수득할 수 있다.
따라서, 본 발명의 주제는 또한, 본 발명에 따르는 펩티드, 펩티드 유도체, 또는 복합체에 대한 항체(제1항체)이며, 이는 펩티드, 펩티드 유도체 또는 복합체로 면역시키고, 면역화에 의해 생성된 항체, 바람직하게는 쾰러(Kohler)및 밀슈타인(Milstein)의 방법 또는 이들의 발전된 방법에 의해 생성된 모노클론성 항체를 단리시킴으로써 얻을 수 있다.
최종적으로, 본 발명은 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 복합체에 지향되는 제1항체로 면역화시킨 후, 면역화에 의해 생성된 항-이디오 타입 항체를 단리시킴으로써 얻을 수 있는 제1항체에 대한 항-이디오 타입항체에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 주제는, 본 발명에 따르는 자기 반응성 펩티드, 펩티드 유도체 또는 펩티드 유사체, 또는 상기 펩티드와 MHC 분자의 복합체와 반응하는 T 세포이다. 바람직한 예로는 T 세포주 6/7(DSM ACC2172) 또는 6/10(DSM ACC 2173)으로부터 유래한 T 세포, 또는 동등한 T 세포 수용체 결합 특이성을 갖는, 즉 아미노산 서열(I) 및/또는 (II) 및/또는 이들 아미노산 서열들의 부분 영역을 갖는 펩티드 유도체 또는 MHC 분자에 의해 제공되는 펩티드를 인지하는 T 세포가 있다.
이하에서는, 제1도 내지 제4도를 참조로 하기 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
[ 실시예 1]
GAD-특이적인 T 세포주의 준비
1. 1차 자극
피콜 밀도기울기 원심분리법에 의해 타입I 당뇨병 환자의 EDTA 혈액으로부터 말초혈액 림프구(PBL)를 단리시킨다. RPMI 배지에서 세포들을 2회 세척한 다음, RPMI 1640, 5% 사람혈청, 2mM 글루타민 그리고 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신으로 이루어진 배지에 넣는다. 100,000개의 세포에 상당하는 100μl의 세포 현탁액을 96웰-둥근바닥 플레이트의 각각의 웰에 취한다. 다음으로 돼지의 GAD(SW-GAD)를 2.5μg/μg의 최종농도가 되도록 첨가하였다. 세포들을 37℃/7% CO2의 인큐베이터에서 3-4일간 인큐베이션시킨다. 이 기간이 지나면, 100μl의 IL-2(30U/ml)을 첨가 한다. 3-4일 후, 모든 배양 혼합물로부터 100μl를 흡출하고, 다시 100μl의 IL-2(30U/ml)를 첨가한다. 이 작업을 3-4일간에 걸쳐 반복한다.
2. 재자극
제1자극을 시작한지 제14일째에 제1재자극을 수행한다. 이를 위해서, 제1자극에 비해 2배의 자기 조직의 PBL을 피콜에 의해 단리하고, 2×106/ml의 세포농도가 되도록 배지에서 조정한다. 상기 자극세포들의 1/2을 항원 SW-GAD(최종농도 5μg/ml,항원펄스)와 함께 2시간 동안 37℃/7% CO2로 인큐베이션한다. 나머지 절반을 항원이 없는 동일한 조건하에서 배지만을 사용하여 인큐베이션한다. 그 다음에는, 모든 자극 세포들을 4000rad로 조사한다. 그리고 나서, 자극 세포들을 96-웰 둥근바닥 플레이트에 분배하되(100,000개 세포/웰), 항원이 함유된 자극세포들을 가진 웰을 항상 항원이 함유되지 않은 자극세포들을 가진 웰에 인접하게 하는 방식으로 분배시킨다.
그 다음에는, 1차 자극 준비들로부터 T 세포를 준비한다. 이를 위해, 1차 자극 준비물들로부터의 상충액을 흡출하고, 플레이트의 세포들을 매번 100μl의 세척용 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium = DMEM)로 2회 세척한다. 2회 세척 사이에 세포들을 플레이트에서 400g로 원심분리한다. 그 다음에는, 세포들을 각각 100μl의 배지에서 취하고, 이중 50μl씩을 재자극용 플레이트의 2개의 인접한 웰에 각각 분배시킨다. 항원이 들어있는 1개의 웰과 항원이 들어있지 않은 인접 웰에서 T 세포를 인큐베이션시키는 방식으로 상기 재자극의 항원 특이성을 모니터할 수 있다.
재자극을 시작한지 2일 또는 3일 후에, 현미경으로 증식을 평가할 수 있다. 이 방법에 있어서는, 항원이 존재하는 웰내에서만 증식이 일어나는 미소배양물 쌍만이 관련된 것으로 간주된다. 4일째부터는 100μl의 IL-2(30U/ml)를 차례로 각각의 배양물 웰에 첨가한다. 14일째까지는 약 50%의 배지를 3-4일마다 IL-2(30U/ml)로 교환한다.
성장이 양호할 때, 배양물을 몇개의 96 웰 플레이트에 분배한다. 추후 재자극의 경우, 이들을 보다 큰 웰에 분배시킬 수도 있다. 상기 방법에 따라, 새로운 재자극을 2주 마다 수행한다. 계속된 3번째 재자극 이후, 미소 배양물의 특이성이 증식 시험으로 결정된다.
3. SW-GAD를 사용한 증식시험
모든 시험을 적어도 2중 준비물에서 수행한다.
a) 자극 세포:
HLA 클래스II 항원과 관련하여 동일한 자기 조직의 PBL 또는 통상의 공여체의 PBL를 자극 세포로 사용한다. PBL을 상기에서 기술한 항원과 함께 예비 인큐베이션시키고, 4000rad로 조사한 후, 96 웰 플레이트에 분포시킨다(100,000 세포/웰).
b) T 세포
사용된 T 세포는 항상 재자극 기간의 최종 단계에서 유래된 것이다. DMEM을 사용하여 이들을 3회 세척하여 항원과 IL-2를 없애고, 6000개 세포/96웰로 나눈다. 상기 방법으로 단리시킨 T 세포주 6/7 및 6/10를 부다페스트 조약하의 규정에 따라 DSM에 기탁번호 DSM ACC2172 및 DSM ACC2173으로 기탁하였다.
SW-GAD와 함께 인큐베이션하는 것 이외에도, 대조군을 GAD없이 인큐베이션하였다.
37℃/7% CO2에서 3-4일 경과시킨 후, 1μLCi3H-티미딘을 첨가하고 16-20시간 동안 추가로 인큐베이션시킨다. 그 다음에는, 세포 수확장치를 사용하여 세포들을 유리 섬유 필터위에 옮기고, 혼입된 방사성을 β-카운터로 측정한다.
표 1에는 SW-GAD를 사용한 증식시험의 전형적인 결과를 나타내고 있다.
4. H-GAD 서열에서 유래된 펩티드들을 사용한 증식시험
4회 이상의 재자극 시험에 의해 확장되고, 증식시험에서 SW-GAD와 반응하는 T 세포주를 H-GAD 의 중복 펩티드를 사용하여 추가로 시험하였다. 상기 실험의 목적은 T 세포에 의해 인지되는 H-GAD의 에피토프를 한정하는 것이다. 이를 위해서, H-GAD의 중복되는 20량체 펩티드를 먼저 합성한다(중복 영역은 10개의 아미노산, 총 59개의 상이한 펩티드).
상기 펩티드들 중 4-5개를 합쳐서 푸울을 형성시키고, 각각 18μg/ml의 최종 농도로 자극세포에 첨가한다(섹션 3a에 설명된 바와 같이 자극세포를 준비함). 섹션 3a에 설명된 바와 같이 상기 자극세포들의 후속처리를 수행한다.
그 다음으로, 미세배양 웰 당 6,000 내지 20,000개의 T 세포들을 첨가한다. 후속 과정들은 섹션 3b에 설명된 바와 같다.
제3도와 제4도에는, 사람의 GAD 65kd의 펩티드 푸울을 사용한 T 세포주 6/7 및 6/10에 대한 증식분석 결과가 제시되어 있다. 상기 2가지 T 세포주는 모두 푸울 11로부터의 펩티드에 의해 강력하게 증식된다. 푸울 7을 사용해도, 이보다 작지만 현저한 증식이 관찰된다.
제5도와 제6도에는, 푸울 7 및 11로부터의 10μg/ml의 개별적 펩티드들에 의한 T 세포주 6/7 및 6/10에 대한 증식분석 결과가 제시되어 있다. 상기 2개 세포주는 모두 펩티드 5G1(사람의 GAD 65의 아미노산 266-285에 해당됨)에 의해 현저한 증식을 나타내고, 펩티드 5F3(사람의 GAD 65의 아미노산 306-325에 해당됨)에 의해서는 5G1보다 작기는 하지만 현저한 증식을 나타낸다.
[실시예 2]
항원 특이적인 T 세포 하위집단의 단리 및 측정방법
항원 특이적인 T 림프구와 특히 자기항원에 지향되는 T-림프구는 말초 혈액내에서 극히 적은 수(10 내지 10 으로 예상됨)로 발생되기 때문에, 무엇보다도 선택단계에 의해 생체내 예비 활성화 T 세포를 농축시켜야 한다. 이는 다음의 2가지 방법으로 달성하게 된다.
1. IL-2와의 인큐베이션에 의한 생체내 예비 활성화 T 세포의 확장
이를 위해, 피콜 밀도기울기 원심분리에 의해 PBL을 단리시키고, IL-2가 함유된 세포 배양배지(RPMI 1640/5% 사람 혈청/30U/ml IL-2)에서 2×10 세포/ml로 조정한다. 상기 세포들의 200μl 분취액을 48 웰 플레이트에 분배하고 7일간 인큐베이션한다. 4일후, IL-2를 추가로 다시 첨가하였다. 예비 활성화시킨 T 세포는 고친화성 IL-2 수용체를 발현시키므로 생체내 예비 활성화된 T 세포는 상기 자극 기간 동안에 선택적으로 증식되고, 1차 배양물에 축적된다. 자극기간의 종결후에, 각각 웰에서 세포들을 세척하고, 이를 계수하며, 증식시험에 사용한다.
2. 면역자기 분리방법에 의한 생체내 예비 활성화된 T 세포의 농축
이를 위해, 피콜로 단리된 PBL을 고친화성 IL-2 수용체에 대한 단일 클론성 항체와 함께 인큐베이션시킨다(7×10 PBL/ml; 100μg/ml 항-IL-2수용체 항체(뵈링거 만하임); 4℃에서 30분). 그 다음에는 세포 현탁액을 얼음냉각된 RPMI/10% 사람 혈청(HS)으로 2회 세척한 다음(400g/10분), 상기 현탁액의 세포농도를 1-3×10 /ml로 조정한다. 양의 항-마우스 항체에 커플링시킨 Dynal사의 Dynabead M-280을 여기에 첨가한다(표적 세포에 대한 Dynabead의 비율은 약 10-15). 현탁액을 4℃에서 매우 천천히 로울러에 옮긴다. 그 다음으로, 현탁액을 RPM/10% HS로 10배 희석시키고, 미리 냉각시킨 자기입자 농축기(MPC)에 1-2분간 놓아둔다. IL-2수용체를 수반하는 로제트 T 세포(rosetted T cell)를 자석으로 고정화시키고, 상층액을 흡출해내고, 인큐베이션 용기를 MPC로부터 제거한 후, 나머지 세포들을 RMPI/10% HS에 재현탁시킨다. MPC에서 다시한번 표적세포의 분리를 수행한다. 이 세척단계를 다시 한번 반복한다. 그 다음으로는, 분리시킨 세포들을 배지에 재현탁시키고 세포의 수를 1×10 /ml로 조정한다. 분리 항체들에 의한 공지의 방법으로 자성 비이드(magnetobead)들을 제거시킨다.
그 다음에는, 상기 2.1 또는 2.2에 따른 방법들로 농축시킨 예비활성화 세포들을 자기 항원 펩티드 또는 펩티드/MHC 복합체에 대한 반응성에 대해 시험하였다.
이를 위한 몇가지 방법이 있다.
3. 방사선 조사된 자극세포들과 항원으로서 펩티드를 사용한 증식시험
우선, 피콜 단리된 PBL로부터 자기 조직의 자극세포를 준비한다. 자극세포들을 세포배양 배지에 10 세포/ml의 농도로 조정하고, 펩티드와 함께(최종 농도 10μg/ml)2시간 동안 37℃/7% CO로 인큐베이션한다. 그 다음에는, 자극세포들을 4000rad로 조사한 다음, 100,000/웰의 세포수로 96-웰 둥근바닥 플레이트에 분배시킨다.
상기 2.1 또는 2.2에서 얻어진, 생체내 예비활성화된 100,000개의 T 세포를 각각 첨가하고, 4일간 37℃/7% CO로 인큐베이션시킨다. 그 다음에는, 준비물 부피의 1/2을 IL-2(30U/ml)로 교환한다. 상기 과정을 4일 후에 다시 한번 반복한다.
미소배양을 시작한 후 12일째에, 실제 증식 시험을 수행한다. 이 시험을 위해, 우선 미소 배양물을 DMEM으로 2회 세척하여 항원과 IL-2를 제거한다. 각각의 배양물을 4개의 분취액으로 나누고, 방사선을 조사시킨 100,000개의 자기 조직의 PBL의 존재하에 2중으로 3일 동안 인큐베이션(37℃/7% CO)시키고, 각각의 경우, 펩티드 펄스와 함께 또는 펩티드 펄스 없이 인큐베이션시킨다. 상기 기간경과 후, H-티미딘을 첨가하고, 16-20 시간이 더 경과된 후에, 혼입된 방사능을 측정한다.
4. 올리고머화된 펩티드/HLA 복합체에 의해 표지화시킴으로써 자기 항원 반응성 T 세포를 직접적으로 검출하는 방법
상기 2.2의 방법에 따라 농축된, 생체내 예비 활성화시킨 T 세포들을 본 방법에 사용한다. 세포들을 RPMI/10% HS에서 10 /ml의 농도로 조정하고, 형광성 표지물질이 제공된 올리고머화 HLA- 펩티드 복합체와 함께 4℃ 에서 30분간 인큐베이션한다. 그 다음으로는, 세포들을 얼음냉각된 세포배양배지로 2회 세척한다. 형광물질로 표지화시킨 세포의 집단에 대한 분석을 유동 세포계수기(flow cytometer)에서 수행한다.
[실시예 3]
한정된 자기 반응성 펩티드를 제공하는 MHC 분자의 확인
펩티드들을, 우선 예컨대 Bolton 과 Hunter의 방법(Bolton, A.E. 및 Hunter, W.M. Biochem. J.133(1993), 529-531)에 따라 I로 표지화시킨다. 그 다음에는, 시험되는 MHC 타입을 가지는 공여체의 2-5×10 개의 PBL을 I-표지화 펩티드(2-10μM)가 함유된 세포배양 배지에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 세포들을 세척한 후, 이들을 0.5%의 NP40; 0.5%의 Mega9;150mM NaCl; 5mM EDTA; 5mM Tris pH 7.5; 2mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 구성된 용해 완충액에서 용해시킨다. MHC 분자들을 단백질 A-세파로스에 결합된 프레임워크 특이적인 단일 클론항체들(예를들어, HLA-DR의 경우에 단일 클론항체 L243(ATCC HB 55)에 의해 혼합물로부터 면역침전시키고, 단백질 A-세파로스에 결합된 방사능을 감마 카운터로 측정한다.
[실시예 4]
T 세포주 6/7(DSM ACC2172) 및 6/10(DSM ACC2173)에 자기 반응성 펩티드를 제공하는 MHC 분자의 서브타입의 결정
실험 방법은 실시예 1.3과 유사하다. 그러나, 자기 조직의 PBL을 항원제공 세포로 사용하지 않고, 그 대신에 상기 공여체의 MHC 분자와 완전히 일치하지 않는 이종 공여체로부터의 PBL을 사용한다. 이때, 공여체의 T 세포주는 한정된 MHC 대립 유전자에 대해서만 발생된 것이다. 자기 항원성 펩티드 5G1(사람의 GAD65의 아미노산 266-285에 해당) 및 5F3(사람의 GAD65의 아미노산 306-325에 해당)을 사용하여 증식 시험을 수행하였다.
표 3에는 이와 같은 시험 혼합물에 대한 결과를 제시하고 있다. T 세포주 6/7과 6/10은 DR B1-대립 유전자 0401의 존재하에 상기 2개 펩티드 모두에 의해 증식된다. DQ A1 또는 DQ B1 대립 유전자의 변이는 T 세포주의 자극성에 영향을 미치지 않는다. T 세포주 6/7은 대립 유전자 B1 0101 및/또는 1601와 연관된 펩티드 5G1 을 추가로 인지한다.
TCL = T 세포주
APC = 항원 제공 세포
SI = 자극지수: 펩티드가 존재하는 경우의 cpm/펩티드가 없는 경우의 cpm
[실시예 5]
T 세포주 6/10을 사용한, 펩티드 5G1의 변이체에 의한 증식시험
자극 펩티드 5G1의 코아 구조를 설명하기 위해, T 세포주 6/10을 사용하여 상기 펩티드의 다양한 변이체에 의한 증식시험을 수행하였다(표 4참조).
제1계열의 20량체 변이체를 사용한 실험은 5G1구조상에서 C-말단 또는 N-말단에 인접한 아미노산들이 T 세포주 6/10에 의한 인지에 있어서 어떤 역할을 하는지를 확인하려고 하는 것이다. 자극지수가 나타내는 바와 같이, C-말단의 방향으로의 20량체 펩티드 이동은 증식 활성의 증가를 유도하지 않는다. N-말단쪽으로의 6개 아미노산 이동은 자극 수용력의 손실을 초래한다.
제2계열의 펩티드 변이체를 사용한 실험에서는 C-말단을 단축시킨 영향을 검사한다. 이러한 계열의 실험에서는, C-말단의 아미노산 잔기인 히스티딘(H)과 페닐알라닌(F)이 자극 수용력에 있어 중요한 것으로 밝혀졌다.
제3계열의 펩티드 변이체를 사용한 시험의 목적은 최소 자극 활성 펩티드의 N-말단을 한정하려는 것이었다. 만일 아미노산인 루신(L)과 프롤린(P)을 본래의 C-말단을 가진 18량체로부터 제거시키면, 자극지수가 급격히 감소한다. 따라서, N-말단은 L과 P에 의해 한정된다. 만일 C-말단이 H와 F에 의해 추가로 짧아지면, 이 역시 자극활성의 손실을 초래한다.
따라서, T 세포주 6/10의 경우에는, 여전히 자극성을 가지는 최소 펩티드는 서열 LPRLIAFTSEHSHF를 가지는 14량체이다.
Claims (22)
- (a) 아미노산 서열(I)(b) 아미노산 서열(II)(c) 하기 아미노산 서열들 중 하나;(d) 6개 이상의 아미노산의 길이를 갖는, 상기 (a), (b) 및 (c)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열의 부분 영역; 및 (e) 상기 (a), (b), (c) 및 (d)로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 아미노산 서열과 본질적으로 동등한, MHC 분자에 대한 결합특이성, 친화성, 또는 결합특이성 및 친화성을 나타내는 아미노산 서열들을 포함하는, 펩티드, 또는 골격 및/또는 유리 아미노기, 유리 카르복실기, 또는 유리 수산기와 같은 반응성 아미노산 측쇄 그룹이 유도체화된 펩티드 유도체.
- 제1항에 있어서, (a) 상기 아미노산 서열(I); (b) 상기 아미노산 서열(II); (c) 상기 아미노산 서열(I) 및 (II)로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 아미노산들의 부분 영역; 및 (d) 상기 (a), (b) 및 (c)로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 아미노산 서열과 본질적으로 동등한, MHC 분자에 대한 결합특이성,친화성, 또는 결합특이성 및 친화성을 나타내는 아미노산 서열들을 포함하는, 펩티드, 또는 골격 및/또는 유리 아미노기, 유리 카르복실기, 또는 유리 수산기와 같은 반응성 아미노산 측쇄 그룹이 유도체화된 펩티드 유도체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 8개 이상의 아미노산의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 펩티드, 또는 골격 및/또는 유리 아미노기, 유리 카르복실기, 또는 유리 수산기와 같은 반응성 아미노산 측쇄 그룹이 유도체화된 펩티드 유도체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 10개 이상의 아미노산의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 펩티드, 또는 골격 및/또는 유리 아미노기, 유리카르복실기, 또는 수산기와 같은 반응성 아미노산 측쇄 그룹이 유도체화된 펩티드 유도체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 25개까지의 아미노산의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 펩티드, 또는 골격 및/또는 유리 아미노기, 유리 카르복실기, 또는 유리 수산기와 같은 반응성 아미노산 측쇄 그룹이 유도체화된 펩티드 유도체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 마커그룹을 수반함을 특징으로 하는 펩티드, 또는 골격 및/또는 유리 아미노기, 유리 카르복실기, 또는 유리 수산기와 같은 반응성 아미노산 측쇄 그룹이 유도체화된 펩티드 유도체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따르는 펩티드, 또는 골격 및/또는 유리 아미노기, 유리 카르복실기, 또는 유리 수산기와 같은 반응성 아미노산 측쇄 그룹이 유도체화된 펩티드 유도체와 본질적으로 동등한, MHC 분자에 대한 결합 특이성, 친화성, 또는 결합특이성 및 친화성을 갖는 펩티드 유사체.
- MHC 분자 또는 MHC 분자의 펩티드 결합 유도체에 결합되는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따르는 하나이상의 펩티드 또는 펩티드 유도체, 또는 제7항에 따르는 펩티드 유사체를 포함하는 복합체.
- 제8항에 있어서, MHC 클라스II 분자 또는 이것의 펩티드 결합 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제9항에 있어서, MHC 클라스II 분자가 타입 DR1,DR2,DR3 또는 DR4인 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제 10항에 있어서, MHC 클라스II 분자가 서브타입 DR B1 0101, DR B1 0301, DR B1 0401, DR B1 0402, DR B1 0404 또는 DR B1 1601을 갖는 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제11항에 있어서, MHC 클라스II 분자가 서브타입 DR B1 0101 또는 DR B1 0401을 갖는 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 MHC 분자 또는 이것의 펩티드 결합 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제13항에 있어서, MHC 분자의 가용성 펩티드 결합 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항, 또는 제14항에 있어서, 마커그룹을 수반하는 것을 특징으로 하는 복합체.
- 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 결합되는 2개 이상의 MHC 분자 또는 MHC 분자 유도체를 함유하는 올리고머화된 펩티드-MHC 분자 복합체.
- 제16항에 있어서, 화학적 커플링제에 의해 교차결합된 펩티드-MHC 분자 복합체를 함유함을 특징으로 하는 올리고머화된 펩티드-MHC 분자 복합체.
- 제 16항에 있어서, 수개의 MHC-결합 영역을 갖는 올리고머화된 펩티드 성분에 의해 교차 결합된 MHC 분자 또는 MHC 분자 유도체를 함유함을 특징으로 하는 올리고머화된 펩티드-MHC 분자 복합체.
- 제16항에 있어서, 항체에 의해 교차 결합된 펩티드-MHC 분자 복합체를 함유함을 특징으로 하는 올리고머화된 펩티드-MHC 분자 복합체.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 MHC 분자를 함유함을 특징으로 하는 올리고머화된 펩티드-MHC 분자 복합체.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따르는 하나이상의 펩티드 또는 펩티드 유도체, 또는 제7항에 따르는 펩티드 유사체를 함유함을 특징으로 하는 올리고머화된 펩티드-MHC 분자 복합체.
- 제20항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따르는 하나이상의 펩티드 또는 펩티드 유도체, 또는 제7항에 따르는 펩티드 유사체를 함유함을 특징으로 하는 올리고머화된 펩티드-MHC 분자 복합체.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DEP4401629.8 | 1994-01-20 | ||
| DE4401629 | 1994-01-20 | ||
| DEP4403522.5 | 1994-02-04 | ||
| DE4403522 | 1994-02-04 | ||
| DEP4418091.8 | 1994-05-24 | ||
| DE4418091A DE4418091A1 (de) | 1994-01-20 | 1994-05-24 | Antigen-spezifische, aktivierte T-Lymphozyten, Nachweis und Anwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR950023651A KR950023651A (ko) | 1995-08-18 |
| KR0167016B1 true KR0167016B1 (ko) | 1999-01-15 |
Family
ID=25933166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019950000906A KR0167016B1 (ko) | 1994-01-20 | 1995-01-20 | 항원 특이적인 활성화된 t 림프구, 이것의 검출 및 사용방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR0167016B1 (ko) |
| DE (1) | DE4418091A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19534170C1 (de) * | 1995-09-14 | 1997-04-10 | Univ Tuebingen | Rekombinantes Polypeptid basierend auf der Primärsequenz der invarianten Kette mit mindestens einer Primärsequenz von einem spezifischen T-Zellepitop oder eines Proteinderivats und dieses rekombinante Polypeptid kodierende Nukleinsäuren |
-
1994
- 1994-05-24 DE DE4418091A patent/DE4418091A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-01-20 KR KR1019950000906A patent/KR0167016B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4418091A1 (de) | 1995-07-27 |
| KR950023651A (ko) | 1995-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20060171954A1 (en) | Antigen specific activated T-lymphocytes, detection and use | |
| US8053235B2 (en) | Methods of generating antigen-specific CD4+CD25+regulatory T cells, compositions and methods of use | |
| EP2249864B1 (en) | Strategies to prevent and/or treat immune responses to soluble allofactors | |
| Panina-Bordignon et al. | Recognition by class II alloreactive T cells of processed determinants from human serum proteins | |
| Halbout et al. | T cell response to preproinsulin I and II in the nonobese diabetic mouse | |
| WO2014191432A1 (en) | Improved method for the detection, preparation and depletion of cd4+ t lymphocytes | |
| US20210401976A1 (en) | Immunogenic peptides with improved oxidoreductase motifs | |
| EP0815136B1 (en) | Immunoreactive and immunotherapeutic molecules which interact in subjects with insulin-dependent diabetes mellitus (iddm) | |
| US20230340061A1 (en) | Peptides and methods for the treatment of multiple sclerosis | |
| Zhang et al. | Immunological heterogeneity of autoreactive T lymphocytes against the nicotinic acetylcholine receptor in myasthenic patients | |
| US20020114816A1 (en) | Autoreactive peptides from human glutamic acid-decarboxylase (gad) | |
| KR0167016B1 (ko) | 항원 특이적인 활성화된 t 림프구, 이것의 검출 및 사용방법 | |
| US7173108B2 (en) | Peptide epitopes recognized by disease promoting CD4+ T lymphocytes | |
| AU1093995A (en) | Surface membrane proteins and their effect on immune response | |
| Roudier et al. | Tolerance to a self peptide from the third hypervariable region of the E chain. Implications for molecular mimicry models of autoimmune disease | |
| US20240132556A1 (en) | Peptides and methods for the treatment of neuromyelitis optica | |
| CA2370763C (en) | Peptide epitopes recognized by disease promoting cd4+ t lymphocytes | |
| CA2758956C (en) | Peptide epitopes recognized by disease promoting cd4+ t lymphocytes | |
| KR19990035757A (ko) | 생체 내 당뇨병 시험 방법 | |
| EP4362972A1 (en) | Peptides and methods for the treatment of neuromyelitis optica | |
| AU706774B2 (en) | Immunoreactive and immunotherapeutic molecules which interact in subjects with insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) | |
| Parkar et al. | In vitro priming of human lymphocytes to heterologous insulins | |
| US20030077758A1 (en) | Myc repressor modulation to treat aging-related disorders |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |