DE69533905T2

DE69533905T2 - Interferon alpha/beta bindendes Protein, seine Herstellung und Anwendung

Info

Publication number: DE69533905T2
Application number: DE69533905T
Authority: DE
Inventors: Batya Cohen; Daniela Novick; Menachem Rubinstein
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1994-02-07
Filing date: 1995-02-06
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2015-02-07
Also published as: JP3670045B2; EP0676413A2; RU2336279C2; FI118084B; IL108584A; ZA95968B; ATE286509T1; PT676413E; RU2362781C2; EP0676413B1; DE69533905D1; RU2004106773A; CN1286976C; KR950032620A; UA46694C2; CN1109505A; KR100382628B1; RU2004106775A; RU2004106774A; ES2236696T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Interferon α/β bindende Proteine, welche die Aktivität von verschiedenen IFN-α-Unterarten ebenso wie die Aktivität von IFN-β modulieren können. Im Besonderen betrifft diese Erfindung die Clonierung von DNA-Molekülen, die diese Proteine codieren, und ihre Expression in Wirtszellen.
Die israelische Patentenmeldung Nr. 103052 beschreibt und beansprucht ein lösliches IFN-α-Rezeptorprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 45000, das durch Western-Blotverfahren mit monoclonalen anti-IFN-α-Rezeptor-Antikörpern identifiziert wurde. Die vorstehende Anmeldung beschreibt und beansprucht ebenfalls ein weiteres lösliches IFN-α-Bindeprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 40000, das durch Quervernetzung mit ¹²⁵I-IFN-α2 und Immunpräzipitation mit monoclonalen anti-IFN-α-Antikörpern identifiziert wurde. Aus Serum gewonnen, wies diese Spezies ein Molekulargewicht von 50000 auf. Die israelische Patentenmeldung Nr. 106591 beschreibt und beansprucht das vorstehend angesprochene 40000-IFN-α-Bindeprotein (nachstehend „IFNAB-BP" oder „IFNAB-BPII"), das in homogenem Zustand aus Urin erhalten wurde und eine Sequenz aufwies, die sich von jedem anderen bekannten Protein unterscheidet. Die zwei vorstehend erwähnten Israelischen Patentanmeldungen entsprechen EP-A 0 588 177.
IFNAB-BP bindet an und blockiert die Aktivität einer Vielzahl von IFNA-α-Unterarten und auch von IFN-β. In dieser Hinsicht unterscheiden sich die Bindungscharakteristika von IFNAB-BP eindeutig von denjenigen eines früher beschriebenen Zelloberflächen-Interferon-Rezeptors, der nur auf menschliches Interferon alpha B reagiert.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden zwei cDNA-Moleküle, die Vorläufer von IFNAB-BP codieren, cloniert und ihre Sequenz wird bestimmt. Beide stammen vermutlich von dem gleichen Gen, z.B. durch alternatives Spleißen. Die Herstellung von zwei rekombinanten Proteinen, bezeichnet als IFNAB-BPI und IFNAB-BPII, in Säuger- und anderen Wirtszellen wird ebenfalls beschrieben.
IFNAB-BPI und IFNAB-BPII können die Aktivität von Typ I-Interferonen, das sind die verschiedenen Unterarten von Interferon-α, und auch von Interferon-β modulieren. Somit können sie unerwünschte Wirkungen von Typ I-Interferonen hemmen.
Typ I-Interferone (IFNs) (IFN-α, IFN-β und IFN-ω) bilden eine Familie von strukturell verwandten Cytokinen, die üblicherweise durch ihre Fähigkeit definiert werden, eine Resistenz gegen virale Infektionen zu vermitteln. Von vielen anderen biologischen Aktivitäten von Typ I-IFNs wurde berichtet, einschließlich der Hemmung der Zellproliferation, der Induktion von MHC-Antigenen der Klasse I und einiger anderer immunregulatorischer Aktivitäten (1). IFN-α und IFN-β sind von Nutzen bei der Behandlung von einigen viralen Erkrankungen, einschließlich Hepatitis C (2, 3) und viralen Warzen (4, 5), ebenso wie von bestimmten Malignitäten wie Haarzellenleukämie (6), chronische myelogene Leukämie (7) und Kaposis Sarkom (8).
IFN-α wurde in Seren verschiedener Patienten mit Autoimmunerkrankungen wie systemischem Lupus erythematodes (9) und auch von AIDS-Patienten (10) nachgewiesen. IFN-α wurde mit dem Verlauf von juveniler Diabetes in Zusammenhang gebracht (11). Es gab auch einen Bericht, dass eine erhöhte Expression von IFN-α in der weißen Microgliamasse zu der Symptomatik bei der Alzheimer Krankheit beitragen könnte (51). Weiterhin wurde gezeigt, dass eine Therapie mit IFN-α in einigen Fällen zu unerwünschten Nebenwirkungen einschließlich Fieber und neurologischen Schädigungen führen kann (12). Daher gibt es krankhafte Situationen, in denen eine Neutralisierung der IFN-α-Aktivität für den Patienten von Vorteil sein kann.
Wie im Falle anderer Cytokine übt IFN-α seine biologischen Aktivitäten aus, indem es an einen Zelloberflächen-Rezeptor bindet, der für alle IFN-α-Unterarten ebenso wie für IFN-β spezifisch ist (13). Ein menschlicher IFN-α-Rezeptor (IFNAR) wurde identifiziert und aus Daudizellen cloniert (14). Der clonierte Rezeptor besitzt eine einzelne Transmembrandomäne, eine extrazelluläre und eine intrazelluläre Domäne. Wenn er in murinen Zellen exprimiert wird, vermittelt dieser Rezeptor eine Ansprechbarkeit auf menschliches IFN-αB, aber nicht in signifikanter Weise auf andere IFN-α- und IFN-β-Spezies, was darauf hindeutet, dass zusätzliche Komponenten an der Reaktion auf IFN-β und auf verschiedene IFN-α-Unterarten beteiligt sind.
Einige andere Untersuchungen deuten darauf hin, dass es zusätzliche Komponenten oder Rezeptoruntereinheiten gibt, die an der Bindung von IFN-α und IFN-β beteiligt sind (15–17). Darüber hinaus wurde berichtet, dass der bereits beschriebene Rezeptor (14) an der Bindung aller IFN-α- und IFN-β-Spezies beteiligt ist (18).
Cytokin-Bindeproteine (lösliche Cytokinrezeptoren) entsprechen den extrazellulären Liganden-Bindedomänen ihrer entsprechenden Zelloberflächen-Cytokinrezeptoren. Sie entstehen entweder durch alternatives Spleißen einer dem Zelloberflächen-Rezeptor zugehörigen Vorläufer-mRNA oder durch proteolytische Spaltung des Zelloberflächen-Rezeptors. Solche löslichen Rezeptoren wurden in der Vergangenheit beschrieben, einschließlich u.a. die löslichen Rezeptoren von IL-6 und IFN-γ (19–21), TNF (22–24), IL-1 (25–27), IL-4 (25, 28), IL-2 (29, 30), IL-7 (31) und IFN-alpha (32).
Die vorliegende Erfindung stellt DNA-Moleküle bereit, die das bekannte IFN-α/β-Bindeprotein (IL106591) codieren. Solche DNA-Moleküle codieren sogar zwei unterschiedliche Proteine, IFNAB-BPI und IFNAB-BPII, die vermutlich durch alternatives Spleißen von der gleichen Vorläufer-mRNA stammen, um zwei mRNA-Moleküle zu ergeben, wobei eines eine Größe von etwa 1,5 kb und das andere eine Größe von etwa 4,5 kb aufweist und jedes von ihnen eines der Bindeproteine codiert, nämlich die 1,5 kb-mRNA IFNAB-BPI codiert und die 4,5 kb-mRNA IFNAB-BPII codiert. Der Ausdruck IFNAB-BP entspricht sowohl IFNAB-BPI als auch IFNAB-BPII. Aus dem Harn stammendes IFNAB-BP wird als IFNAB-BPII identifiziert.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein DNA- und RNA-Molekül bereit, das ein IFN-α/β-Bindeprotein, ausgewählt aus IFNAB-BPI, IFNAB-BPII, Vorläufern und fusionierten Proteinen von IFNAB-BPI und IFNAB-BPII, codiert.
Die Erfindung stellt weiterhin die die DNA-Moleküle enthaltenden replizierbaren Expressionsvehikel, damit transformierte Wirte und durch solche transformierten Wirte hergestellte Proteine bereit. Der Ausdruck „DNA-Moleküle" schließt genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und Kombinationen davon ein.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Herstellung in Wirtszellen bereit, die funktionelle IFNAB-BPI und IFNAB-BPII, Vorläufer oder fusionierte Proteine herstellen können.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls rekombinante IFNAB-BPI und IFNAB-BPII, Vorläufer oder fusionierte Proteine und Salze von all diesen und Arzneimittel bereit, die IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII, Vorläufer, fusionierte Proteine oder Salze von all diesen enthalten.
Die Erfindung stellt weiterhin eine diagnostische Zusammensetzung bereit, umfassend

(a) das erfindungsgemäße DNA-Molekül; und/oder
(b) das erfindungsgemäße IFN-α/β-Bindeprotein.

Die diagnostischen Zusammensetzungen können beim Nachweis des erfindungsgemäßen Proteins verwendet werden.
IFNAB-BPI und IFNAB-BPII hemmen die biologischen Aktivitäten von natürlichen menschlichen Leukocyten- und Fibroblasten-Interferonen ebenso wie von rekombinantem menschlichem IFN-α2, IFN-αB, IFN-αC und IFN-β. IFNAB-BPI entspricht einem neuartigen Transmembranprotein, welches der ligandenbindende IFN-α/β-Rezeptor ist. IFNAB-BPII ist ein löslicher Rezeptor, der im Wesentlichen der extrazellulären ligandenbindenden Domäne von IFNAB-BPI entspricht.
1 zeigt die Clonierungsstrategie von IFNAB-BPI und IFNAB-BPII:

(A) Mittlere Reihe: Die Sequenz eines internen CNBr-Peptids (27 Aminosäurereste, cb7), das von dem 40000-IFNAB-BPI aus dem Harn erhalten wurde. Obere und untere Reihen: Synthetische degenerierte Oligonucleotidgemische in Sense-(oben) und Antisense-(unten) Orientierung, die auf der Basis der Peptidsequenz erstellt und für reverse Transkription (nur Antisense-Primer) und für Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet wurden.
(B) Agarosegelelektrophorese von PCR-Produkten, die mit Hilfe der vorstehenden Sense- und Antisense-Primer hergestellt wurden. Die folgenden RNAs und Primer wurden für die Erzeugung einer cDNA verwendet, die als Matrize für die PCR verwendet wurde: (1) PolyA⁺-RNA von Daudizellen, Antisense- Primer. (2) PolyA⁺-RNA von Daudizellen, oligo-d(T)-Primer. (3) Gesamt-RNA von WISH-Zellen, Antisense-Primer. Die Größe (bp) der DNA-Längenstandards ist an der linken Seite angezeigt.
(C) Obere Reihe: Der nicht degenerierte Anteil der Sequenz, erhalten von pBluescript-Clonen des 101 bp-PCR-Produktes. Untere Reihe: Translation der resultierenden nicht degenerierten DNA-Sequenz in die erwartete Sequenz, die ein Teil der Sequenz des Peptides cb7 (Reste 9–20) ist.

2 zeigt die cDNA und die translatierte Polypeptidsequenz von Clon q10, der die cDNA von IFNAB-BPI trägt:
Dieser Clon wurde aus einer Lambda gt11-Bibliothek, die aus cDNA von menschlichen HeLa-Zellen gemacht wurde, durch das Durchmustern mit einem synthetischen Oligonucleotid, das der nicht degenerierten DNA-Sequenz von 1(C) entspricht, isoliert. Sequenzen, die dem N-Terminus des aus dem Harn stammenden IFNAB-BP und dessen CNBr-Peptiden entsprechen, sind unterstrichen und der entsprechende Sequenzname ist unterhalb der Linie angegeben (n1, N-Terminus 1; n2, N-Terminus 2; cb3, CNBr-Peptid 3; cb6, CNBr-Peptid 6; cb7, CNBr-Peptid 7).
Hydrophobe Sequenzen, die dem Signalpeptid (s) und der Transmembrandomäne (tm) entsprechen, sind doppelt unterstrichen. Die fett geschriebenen Zahlen auf der rechten Seite sind diejenigen für die Aminosäurereste. Normal geschriebene Zahlen entsprechen den Nucleotidresten, wobei das Anfangs-A von ATG als Nr. 1 gesetzt wurde.
3 zeigt den Nachweis von mRNA durch Northern-Transfer mit einer spezifischen Sonde, die der Sequenz von IFNAB-BPI und IFNAB-BPII gemeinsam ist:
Eine 397 Basenpaar (bp)-Sonde, die den Nucleotiden 218–614 von IFNAB-BPI entspricht, wurde durch Polymerasekettenreaktion mit den geeigneten Primern hergestellt und durch Markierung mit Zufallsprimern mit [³²P] markiert. Poly A⁺-RNA von menschlichen Daudizellen wurde durch Elektrophorese auf Agarose (1,5%) analysiert, auf Nitrocellulose transferiert und mit der spezifischen Sonde hybridisiert. Die Größe der ribosomalen RNA ist auf der rechten Seite angezeigt.
4 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen eines vollständigen dem IFNAB-BPI entsprechenden 1,5 kb-cDNA-Clons. Aminosäurereste im Einzelbuchstabencode sind beginnend mit dem Translations-Initiations-Codon fett nummeriert. Hydrophobe Leader- und Transmembranregionen sind unterstrichen. N-terminale Proteinsequenzen von IFNAB-BP aus Harn (ab Codon 27) und die internen CNBr-Peptide sind gepunktet unterstrichen (Cys- und N-glycosylierte Asn-Reste sind jedoch nicht nachweisbar). N-Glycosylierungssignale sind durch Sternchen angezeigt und das Polyadenylierungssignal ist doppelt unterstrichen.
5 zeigt einen Teil der Nucleotid- und Aminosäuresequenzen eines dem IFNAB-BPII entsprechenden 4,5 kb-cDNA-Clons. Aminosäurereste im Einzelbuchstabencode sind beginnend mit dem Translations-Initiations-Codon fett nummeriert. Die hydrophobe Leaderregion ist unterstrichen. N-terminale Proteinsequenzen von IFNAB-BP aus Harn (ab Codon 27) und die internen CNBr-Peptide sind gepunktet unterstrichen (Cys- und N-glycosylierte Asn-Reste sind nicht nachweisbar). N-Glycosylierungssignale und das Stopp-Codon sind durch Sternchen angezeigt.
6 zeigt die Konstruktion eines Säuger-Expressionsvektors für die Expression der extrazellulären ligandenbindenden Domäne von IFNAB-BPI.

(A) Synthetische Sense- und Antisense-Oligonucleotide, die für die Herstellung der DNA, die die extrazelluläre ligandenbindende Domäne von IFNAB-BPI codiert, durch Polymerasekettenreaktion verwendet werden.
(B) Agarosegelelektrophorese des ca. 850 bp großen Produktes einer Polymerasekettenreaktion (PCR), das mit den vorstehenden Sense- und Antisense-Primern und DNA des Clons q10 hergestellt wurde.
(C) Die Struktur von pEF-BOS-IFNAB-BPI, ein Säuger-Expressionsvektor zur Herstellung eines löslichen IFNAB-BPI.

7 zeigt die Expression von IFNAB-BPI und IFNAR in verschiedenen Zellen:
Die Expression von IFNAB-BPI in verschiedenen Zellen ist gezeigt durch SDS-PAGE (7,5% Acrylamid, nicht reduzierende Bedingungen) von mit Detergens behandelten Zellextrakten, gefolgt durch Immunblotting mit Kaninchen-anti-IFNAB-BPII-Antikörpern und ¹²⁵I-Protein A. Clon 369.11 ist IFNAB-BPI exprimierende NIH-3T3-Zellen; Clon 470.6 ist IFNAR exprimierende NIH-3T3-Zellen und Clon 508.12 exprimiert beide Proteine. NIH-3T3-Kontrollzellen und menschliche Daudizellen sind ebenfalls gezeigt. Die 51 kDa-Form (in murinen Zellen) und die 102 kDa-Form (in Daudizellen) von IFNAB-BPI sind durch Pfeile angezeigt. Die Molekularmassen-Größenstandards sind auf der linken Seite gezeigt.
8 zeigt die Bindung von ¹²⁵I-IFN-α2 an verschiedene Wirtszellen:
(A) Sättigungs-Bindung von ¹²⁵I-IFN-α2 an IFNAB-BPI exprimierende NIH-3T3-Zellen (Clon 369.11,
) und an sowohl IFNAB-BPI als auch IFNAR exprimierende Zellen (Clon 508.12, •) und das Fehlen der Bindung an Zellen, die nur IFNAR exprimieren (Clon 470.6, Δ). (B) Scatchard-Analyse der ¹²⁵I-IFN-α2-Bindung an die vorstehend genannten Zellen. Die Bindungsdaten wurden mittels des LIGAND-Programms analysiert. Die folgenden Zellen zeigten eine saturierbare Bindung mit hoher Affinität: huDaudi (Δ), IFNAB-BPI-positive Zellen (Clon 369.11, •) und Clon 508.12, der sowohl IFNAR als auch IFNAB-BPI exprimiert (
).
9 fasst die Ergebnisse einer Untersuchung auf einem BIACORE-System zusammen, welche die Affinität von IFNAB-BPII aus Harn zu IFN-α2 bestimmt:
IFN-α2 wurde auf dem Sensorchip immobilisiert und verschiedene Konzentrationen von IFNAB-BPII aus Harn wurden durch den Sensorchip geschickt. „Relative Antwort gegenüber der Zeit" zeigt den Bindungs- und Dissoziationsprozess. Die apparente Dissoziationskonstante beträgt 3,12 × 10^–9 M.
10 zeigt einen ELISA von IFNAB-BPII aus Harn:
Reines IFNAB-BPII aus Harn wurde nacheinander zweimal auf die angegebenen Konzentrationen verdünnt und auf microELISA-Platten gegeben, die mit mab-anti-IFNAB-BPII-Antikörpern vorbeschichtet worden waren. Die Platten wurden anschließend mit Kaninchen-anti-IFNAB-BPII-Antikörpern umgesetzt, gefolgt durch ein Ziegen-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-Konjugat und ABTS/H₂O₂ als Substrat. Die Platten wurden bei 405/630 nm abgelesen. Die untere Nachweisgrenze ist 30 pg/ml.
Entsprechend der Israelischen Patentanmeldung Nr. 106591 wurde ein IFN-α/β-Bindeprotein mit einem Molekulargewicht von 40000 (IFNAB-BP) aus normalem Harn mittels zwei chromatographischer Schritte isoliert. Ungereinigte Proteine aus Harn wurden auf eine Säule gegeben, die aus an Agarose gebundenem IFN-α2 bestand. Die Säule wurde gewaschen, um nicht maßgebliche Proteine zu entfernen, und die gebundenen Proteine wurden dann bei niedrigem pH-Wert eluiert. Die eluierten Proteine wurden dann durch Größenausschluß-HPLC aufgetrennt, um einige Proteinpeaks zu erhalten, von denen einer durch seine Fähigkeit, spezifisch mit ¹²⁵I-IFN-α2 zu reagieren und die antivirale Aktivität von IFN-α und IFN-β zu blockieren, charakterisiert wurde. Dieses Protein wurde durch N-terminate Mikrosequenzanalyse weiter charakterisiert, was eine Hauptsequenz an seiner N-terminalen Domäne ergab:
Eine Nebenpolypeptidsequenz, die der Hauptsequenz entspricht, aber drei zusätzliche Aminosäurereste (Ile-XXX-Tyr) an dem N-Terminus der vorstehenden Sequenz aufweist, wurde nachgewiesen (XXX bezeichnet eine nicht identifizierte Aminosäure). Die resultierende Sequenz wurde mit der des bekannten IFN-αB-Rezeptors (14) verglichen und stellte sich als komplett verschieden heraus (14). Sie war auch unterschiedlich zu jedem anderen bekannten Protein und sie wurde nicht durch irgendeine bekannte DNA-Sequenz codiert, was unter der Verwendung des FastA-Programms durch einen Vergleich mit Swissprot- und Genebank-Datenbanken festgestellt wurde (33).
Eine Probe des IFNAB-BP aus Harn wurde mit CNBr gespalten, auf SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran elektrotransferiert und die resultierenden Spaltungsfragmente wurden einer Protein-Mikrosequenzierung unterzogen. Eines der Fragmente wies ein Molekulargewicht von weniger als 10 k auf und eine interne Sequenz wie folgt (Met steht der tatsächlichen Sequenz voran):
Diese interne Sequenz wurde in Sense- und Antisense-Primer revers translatiert, denen geeignete Restriktionsstellen hinzugefügt wurden. Gesamt-RNA wurde aus menschlichen Zellen gereinigt und Erststrang-cDNA wurde mit reverser Transkriptase unter der Verwendung von entweder dem Antisense-Oligonucleotidgemisch oder von oligo-d(T) als Primer erzeugt. Das resultierende cDNA-Fragment wurde anschließend in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) unter der Verwendung der kombinierten degenerierten Sense- und Antisense-Primer amplifiziert. Die Analyse der PCR-Produkte auf einem 3% Agarosegel zeigte eine spezifische 101 bp große Oligonucleotidbande. Diese DNA wurde durch Restriktion gespalten, in pBluescript (Stratagene) cloniert und kompetente E. coli-Zellen wurden mit diesem Vektor transfiziert. Einige unabhängige Clone wurden sequenziert. Die Sequenz der Region, die durch die degenerierten Sense- und Antisense-Primer flankiert wurde, war unveränderlich und codierte die erwartete Sequenz des vorstehend erwähnten CNBr-Peptids (cb7) des IFNAB-BP aus Harn. Ein Oligonucleotid, das dieser nicht degenerierten internen Sequenz entspricht, wurde synthetisiert, endständig markiert und für die Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken verwendet.
Die Durchmusterung einer Lambda gt11-cDNA-Bibliothek von menschlichen HeLa-Zellen (Clontech) ergab einige positive Clone. Einer dieser Clone, bezeichnet mit q10, enthielt einen offenen Leserahmen, der einem Signalpeptid, einer extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne und einer kurzen cytoplasmischen Domäne entsprach. Die von dem IFNAB-BP aus Harn erhaltenen Peptidsequenzen waren alle innerhalb der durch q10 codierten extrazellulären Domäne vorhanden. Einige wenige Aminosäurereste der Peptidsequenz waren wegen der Limitierung der Proteinsequenzierungs-Technologie (hauptsächlich die fehlende Fähigkeit, Cys und die niedrigen Ser entsprechenden Peakhöhen zu identifizieren) nicht richtig.
Die Sense- und Antisense-Primer, die den Enden der Nucleotidsequenz 219–613 des Clons q10 (2) entsprachen, wurden für die Herstellung einer spezifischen Sonde durch PCR unter der Verwendung des Clons q10 als DNA-Matrize verwendet. Die resultierende DNA wurde mit [³²P] markiert und für eine Northern-Blot-Hybridisierung von poly A⁺-mRNA von zwei menschlichen Zelllinien verwendet. In beiden Fällen wurden zwei spezifische Banden beobachtet, eine, die einer 1,5 kb-mRNA, und eine andere, die einer 4,5 kb-mRNA entsprach. Das primäre Translationsprodukt der 1,5 kb-mRNA wird als IFNAB-BPI-Vorläufer bezeichnet. Das primäre Translationsprodukt der 4,5 kb-mRNA wird als IFNAB-BPII-Vorläufer bezeichnet.
Die vorher erwähnte spezifische Sonde wurde für die Durchmusterung einer weiteren menschlichen cDNA-Bibliothek verwendet und zwei Gruppen von cDNA-Clonen wurden identifiziert. Eine Gruppe (ungefähr 20 einzelne Clone) hatte eine Länge von 1,5 kb und codierte den gleichen Vorläufer des Transmembranproteins, der durch den Clon q10 codiert wurde. Die zweite Gruppe (2 einzelne Clone) hatte eine Länge von 4,5 kb. Diese Größen waren die gleichen wie die der zwei mRNA-Spezies und daher codierten die 1,5 kb-Clone IFNAB-BPI, während die 4,5 kb-Clone IFNAB-BPII codierten. Die Sequenzierung der 4,5 kb-Clone zeigte an, dass sie einen Vorläufer eines verkürzten löslichen Rezeptors codieren, der den Codons 1-239 des Clons q10 entspricht. Jedoch waren die Codons 238 und 239 unterschiedlich und es folgte ein Stopp-Codon. Die Proteinsequenzanalyse des C-Terminus des 40000-IFNAB-BP aus Harn zeigte an, dass es durch die 4,5 kb-cDNA codiert wird, wie durch die letzten beiden Aminosäurereste bestimmt wurde, und daher wurde das IFNAB-BP aus Harn als IFNAB-BPII identifiziert. „Vorläufer", wie hier verwendet, ist definiert als das primäre Translationsprodukt, welches das Signalpeptid einschließt.
DNA, die den Vorläufer einer verkürzten löslichen Form von IFNAB-BPI codiert, wurde durch PCR erzeugt. Das resultierende PCR-Produkt wurde in einen Säuger-Expressionsvektor inseriert und für die Transfektion von verschiedenen Säugerzellen wie Affen-COS-Zellen verwendet. Solche Zellen exprimierten große Mengen an biologisch aktivem rekombinantem löslichem IFNAB-BPI.
In ähnlicher Weise wurde die den Vorläufer von IFNAB-BPII codierende DNA durch PCR erzeugt. Das resultierende PCR-Produkt wurde in einen Säuger-Expressionsvektor inseriert und für die Transfektion von verschiedenen Säugerzellen wie Affen-COS-Zellen verwendet. Solche Zellen exprimierten große Mengen an biologisch aktivem rekombinantem IFNAB-BPII.
In ähnlicher Weise wurde die den gesamten Vorläufer von IFNAB-BPI codierende DNA durch PCR erzeugt. Das resultierende PCR-Produkt wurde in einen Säuger-Expressionsvektor inseriert und für die Transfektion von verschiedenen Säugerzellen wie NIH-3T3-Mauszellen verwendet. Solche Zellen exprimierten große Mengen an menschlichem IFNAB-BPI. Die Zellen waren in der Lage, menschliches IFN-α2 mit hoher Affinität zu binden (Kd = 3,6 × 10^–9 M). Wenn sowohl das menschliche IFNAB-BPI als auch der vorher clonierte menschliche IFN-αB-Rezeptor IFNAR (14) in NIH-3T3-Mauszellen gleichzeitig exprimiert wurden, wurde die Affinität des zusammengesetzten Rezeptors etwa um das 10-fache erhöht (Kd = 4 × 10^–10 M). Wenn im Gegensatz dazu nur der menschliche IFNAR in murinen Zellen exprimiert wurde, konnte keine Bindung des menschlichen IFN-α2 gezeigt werden. Daher wird ein zusammengesetztes Protein, das zwei verknüpfte Polypeptide enthält, von denen eines die Ligandenbindedomäne von IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII trägt und das zweite Polypeptid die extrazelluläre Domäne von IFNAR trägt, im Vergleich mit IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII alleine eine höhere Affinität für IFN-α aufweisen.
Die Affinität des IFNAB-BPII aus Harn für IFN-α2 wurde mit Hilfe des BIACORE-Systems (Pharmacia, Schweden) bestimmt. IFN-α2 wurde auf einem Sensorchip immobilisiert und man ließ es an IFNAB-BPII binden. Auf der Basis von K_on und K_off-Werten wurde ein Kd-Wert von 3,12 × 10^–9 M erhalten. Dieser Wert liegt sehr nah an dem, der mit IFNAB-BPI exprimierenden NIH-3T3-Zellen erhalten wurde.
Die vorstehend erwähnten Clonierungs-, Clonisolierungs-, Identifizierungs-, Charakterisierungs- und Sequenzierungsverfahren sind nachstehend in den Beispielen genauer beschrieben.
IFNAB-BPI und IFNAB-BPII können auch durch andere Arten von rekombinanten Zellen wie prokaryontische Zellen, z.B. E. coli, oder andere eukaryontische Zellen wie CHO-, Hefe- oder Insektenzellen hergestellt werden. Verfahren zur Konstruktion von geeigneten Vektoren, die DNA tragen, die entweder IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII codieren und für eine Transformation (z.B. E. coli und Hefezellen) oder die Infektion von Insektenzellen geeignet sind, um rekombinantes IFNAB-BPI und IFNAB-BPII herzustellen, sind im Fachgebiet gut bekannt. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., Hrsg. „Current Protocols in Molecular Biology" Current Protocols, 1993; und Sambrook et al., Hrsg. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, 1989.
Die Erfindung betrifft weiterhin aus Wildtyp-IFNAB-BPΙ oder -IFNAB-BPII bestehende fusionierte Proteine, die mit einem anderen Polypeptid oder Protein fusioniert sind und eine ähnliche Fähigkeit zeigen, die biologischen Aktivitäten von IFN-α und IFN-β oder anderer Cytokine, die den Interferon alpha/beta-Rezeptor gemeinsam haben, zu blockieren.
IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII, Vorläufer oder fusionierte Proteine codierende DNA und die funktionell verknüpften transkriptionellen und translationalen regulatorischen Signale werden in eukaryontische Vektoren inseriert, die die Fähigkeit besitzen, die erwünschten Gensequenzen in das Wirtszellenchromosom zu integrieren. Um die Zellen, in die die eingebrachte DNA stabil in das Chromosom integriert wurde, selektieren zu können, werden ein oder mehrere Marker verwendet, welche die Selektion auf Wirtszellen, die den Expressionsvektor enthalten, zulassen. Der Marker kann für die Prototrophie eines auxotrophen Wirtes, eine Resistenz gegen Biozide, z.B. Antibiotika, oder eine Resistenz gegen Schwermetalle wie Kupfer oder ähnliches sorgen. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Gensequenzen verknüpft oder durch Cotransfektion in die gleiche Zelle eingebracht werden. Zusätzliche Elemente können auch für die optimale Synthese einer Einzelketten-Bindeprotein-mRNA benötigt werden. Diese Elemente können Spleißsignale ebenso wie Transkriptionspromotoren, Enhancer und Terminationssignale einschließen (34).
Zum Zweck der Expression der IFNAB-BPI- und IFNAB-BPII-Proteine wird das in die Zelle der Wahl einzubringende DNA-Molekül vorzugsweise in ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingefügt, der zu einer autonomen Replikation in dem Empfängerwirt fähig ist.
Wichtige Faktoren bei der Auswahl eines bestimmten Plasmides oder viralen Vektors schließen ein: die Einfachheit, mit der Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und aus den Empfängerzellen selektiert werden können, die den Vektor nicht enthalten; die Anzahl der Kopien des Vektors, die in einem bestimmten Wirt erwünscht sind; und ob es wünschenswert ist, den Vektor zwischen Wirtszellen unterschiedlicher Spezies „pendeln" zu können. Bevorzugte prokaryontische Vektoren schließen Plasmide ein, wie die, die in E. coli replizieren können, zum Beispiel pBR322, ColE1, pSC101, pACYC184 usw. (35); Bacillus-Plasmide wie pC194, pC221, pT127 usw. (36); Streptomyces-Plasmide einschließlich pIJ101 (37), Streptomyces-Bakteriophagen wie ΦC31 (38) und Pseudomonas-Plasmide (39, 40).
Bevorzugte eukaryontische Plasmide schließen BPV, Vaccinia, SV40, 2-Micron-Zirkel usw. oder ihre Abkömmlinge ein. Solche Plasmide sind im Fachgebiet gut bekannt (41–45).
Wenn einmal der Vektor oder die DNA-Sequenz, die das (die) Konstrukt(e) enthält, für die Expression vorbereitet wurde, kann der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle durch irgendeine der Vielzahl an geeigneten Verfahren wie Transformation, Transfektion, Lipofektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation, direkte Mikroinjektion usw. eingebracht werden.
In dieser Erfindung zu verwendende Wirtszellen können entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Bevorzugte prokaryontische Wirte schließen Bakterien wie E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia usw. ein. Der am meisten bevorzugte prokaryontische Wirt ist E. coli. Bakterielle Wirte von besonderem Interesse schließen E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F^–, lambda^–, phototroph (ATCC 27325)) und andere Enterobakterien wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Spezies ein. Unter solchen Bedingungen wird das Protein nicht glycosyliert werden. Der prokaryontische Wirt muss zu dem Replikon und den Kontrollsequenzen in dem Expressionsplasmid kompatibel sein.
Da jedoch IFNAB-BPI und IFNAB-BPII glycosylierte Proteine sind, werden eukaryontische Wirte gegenüber prokaryontischen Wirten bevorzugt. Bevorzugte eukaryontische Wirte sind Säugerzellen, z.B. menschliche, Affen-, Maus- und Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), weil sie bei Proteinmolekülen posttranslationale Modifikationen einschließlich korrekter Faltung, Ausbildung korrekter Disulfidbrücken ebenso wie Glycosylierung an korrekten Stellen ermöglichen. Auch Hefezellen und Insektenzellen können postranslationale Peptidmodifikationen einschließlich einer Hoch-Mannose-Glycosylierung durchführen. Es existiert eine Anzahl von rekombinanten DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und Plasmide in einer hohen Kopienzahl verwenden, was für die Produktion der gewünschten Proteine in Hefe- und Insektenzellen eingesetzt werden kann. Hefezellen erkennen Leadersequenzen in clonierten Genprodukten von Säugern und scheiden Peptide aus, die die Leadersequenzen beinhalten. Nach dem Einbringen des Vektors werden die Wirtszellen in einem selektiven Medium angezogen, was auf das Wachstum von Vektor enthaltenden Zellen selektiert. Die Expression der clonierten Gensequenzen) führt zu der Produktion von IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII, Vorläufern oder Fusionsproteinen. Die exprimierten Proteine werden dann durch jegliches herkömmliche Verfahren einschließlich Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Elektrophorese oder ähnliche oder durch Affinitätschromatographie unter der Verwendung von monoclonalen anti-IFNAB-BPI-Antikörpern, die auf einer in einer Säule befindlichen Gelmatrix immobilisiert wurden, isoliert und gereinigt. Ungereinigte Präparationen, die rekombinantes IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII oder ihre Vorläufer enthalten, werden durch die Säule geschickt, wobei IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII oder ihre Vorläufer über den spezifischen Antikörper an die Säule gebunden werden, während die Verunreinigungen durchlaufen werden. Nach einem Waschschritt wird das Protein aus dem Gel unter Bedingungen eluiert, die üblicherweise zu diesem Zweck angewendet werden, d.h. bei einem hohen oder niedrigen pH-Wert, z.B. pH 11 oder pH 2.
Der Ausdruck „fusioniertes Protein" bezeichnet ein Polypeptid, das IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII fusioniert mit einem anderen Protein umfasst, das z.B. eine verlängerte Aufenthaltszeit in Körperflüssigkeiten aufweist. IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII kann also mit einem anderen Protein, Polypeptid oder ähnlichem, z.B. einem Immunglobulin oder einem Fragment davon, fusioniert werden.
Der hier verwendete Ausdruck „Salze" bezeichnet sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen von IFNAB-BPI, IFNAB-BPII, ihren aktiven Fraktionen, Muteinen oder fusionierten Proteinen davon. Salze einer Carboxylgruppe können durch im Fachgebiet bekannte Verfahren erzeugt werden und schließen anorganische Salze, zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- oder Zinksalze und ähnliche, und Salze mit organischen Basen wie die, die zum Beispiel mit Aminen wie Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und ähnlichen gebildet werden, ein. Säureadditionssalze schließen zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren wie zum Beispiel Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren wie zum Beispiel Essigsäure oder Oxalsäure ein. Natürlich müssen solche Salze eine im Wesentlichen ähnliche Aktivität wie IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII oder deren aktive Fraktionen aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Arzneimittel, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger und das erfindungsgemäße IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII oder deren Vorläufer, fusionierte Proteine und deren Salze umfassen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden für die Verabreichung vorbereitet, indem IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII mit physiologisch verträglichen Trägern und/oder Stabilisatoren und/oder Hilfsmitteln vermischt und in eine Dosierungsform z.B. durch Lyophilisierung in Dosierungsröhrchen gebracht werden. Das Verfahren der Verabreichung kann auf jegliche akzeptierte Art der Verabreichung für ähnliche Mittel stattfinden und wird von dem zu behandelnden Krankheitszustand abhängen, z.B. intravenös, intramuskulär, subkutan, durch örtliche Injektion oder lokale Anwendung oder kontinuierlich durch Infusion usw. Die Menge der zu verabreichenden aktiven Verbindung wird von dem Verabreichungsweg, der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand des Patienten abhängen. Eine örtliche Injektion wird zum Beispiel eine niedrigere Proteinmenge bezogen auf das Körpergewicht benötigen als eine intravenöse Infusion.
Wie in der Israelischen Patentanmeldung Nr. 106591 erwähnt, hemmte das IFN-α/β-Bindeprotein (oder hier als IFNAB-BPII bezeichnet) die antivirale Aktivität von IFN-α2, IFN-αB, IFN-αC und IFN-β und nicht von IFN-γ, was darauf hindeutet, dass IFNAB-BPI und IFNAB-BPII allgemeine TypI-IFN-Bindeproteine sind. Daher sind diese bei der Modulation oder Blockierung der biologischen Aktivitäten von verschiedenen IFN-α-Unterarten und IFN-β von Nutzen, zum Beispiel bei TypI-Diabetes, verschiedenen Autoimmunkrankheiten, Abstoßungen von Transplantaten, AIDS und ähnlichen Krankheiten, bei denen eine anomale Expression von IFN-α oder IFN-β vorliegt, d.h. IFNAB-BPI und IFNAB-BPII können bei jedem Zustand verwendet werden, bei dem ein Übermaß an IFN-α oder IFN-β endogen produziert oder exogen verabreicht wird.
Dementsprechend sind IFNAB-BPI und IFNAB-BPII, deren Vorläufer, fusionierte Proteine und deren Salze für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten, von anderen Entzündungen in Säugern, für Behandlungen einer durch die Verabreichung von Interferon alpha oder beta verursachten Toxizität, von juvenilem Diabetes, von Lupus erythematodes und von AIDS vorgesehen.
Wie vorstehend angedeutet, haben die Proteine der vorliegenden Erfindung auch einen nicht therapeutischen Nutzen wie bei der Reinigung von TypI-Interferon-Spezies.
Die vorliegende Erfindung stellt auch DNA-Moleküle bereit, die jedes der Proteine der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend definiert, codieren, replizierbare Expressionsvehikel, die solche DNA-Moleküle umfassen, und mit solchen Expressionsvehikeln transformierte Wirtszellen einschließlich prokaryontische und eukaryontische Wirtszellen, vorzugsweise Affen-COS-Zellen.
Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Produktion jedes der Proteine der vorliegenden Erfindung, indem eine transformierte Zelle in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gezüchtet und das durch das DNA-Molekül codierte Protein gewonnen wird, und das Expressionsvehikel innerhalb einer so transformierten Wirtszelle ein.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht:
BEISPIEL 1: Proteinsequenzanalyse von IFNAB-BP aus Harn
Reines IFNAB-BP, das, wie in der Israelischen Patentanmeldung Nr. 106591 beschrieben, erhalten wurde, wurde auf einer PVDF-Membran (Pro-Spin, Applied Biosystems, USA) adsorbiert und die Membran wurde einer Proteinsequenzanalyse auf einem Mikrosequenziergerät des Modells 475 ((Applied Biosystems, USA) unterzogen. Die folgende Hauptsequenz wurde erhalten:
Zusätzlich wurde ein zweites Polypeptid mit drei zusätzlichen Aminosäureresten (Ile-xxx-Tyr) an dem N-Terminus der Hauptsequenz nachgewiesen (xxx bezeichnet eine nicht identifizierte Aminosäure). Die resultierende Sequenz ist komplett unterschiedlich zu der des bereits bekannten IFN-αB-Rezeptors (IFNAR, Referenz 14) und unterscheidet sich von jedem anderen bekannten Protein. Sie unterscheidet sich auch von jedem durch eine bekannte DNA-Sequenz codierten Protein, wie durch eine Suche in den Swissprot- und Genebank-Datenbanken durch das Programm FastA (33) festgestellt wurde. Daher ist dieses Protein ein neuartiges IFN-α bindendes Protein. Durch die Isolierung der cDNA-Clone (siehe nachstehend) wurde geklärt, dass der Rest 10 ein Cys und kein Arg und der Rest 15 ein Ser und kein Arg ist. Darüber hinaus wurde xxx als Ser identifiziert. Es ist bekannt, dass Cys nicht durch ein Mikrosequenziergerät identifiziert werden kann, während Ser manchmal in dem analytischen Prozess zerstört und daher nicht identifiziert wird.
Eine Probe des IFNAB-BP aus Harn wurde mit CNBr gespalten, durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Sieben getrennte Peptidbanden, bezeichnet mit cb1–cb7, wurden aufgetrennt und auf der Membran durch eine Färbung mit Coomassie-Blau nachgewiesen. Jede Bande wurde ausgeschnitten und einer Protein-Mikrosequenzierung unterzogen. Eines der Peptide, cb7, war kleiner als 10000 und ergab die folgende interne Sequenz (Met steht der tatsächlichen Sequenz voran):
Ein weiteres Peptid, cb3, hatte die folgende Sequenz (Met steht der tatsächlichen Sequenz voran):
Der Rest 13 wurde später als Cys identifiziert, wie durch die cDNA-Sequenz bestimmt wurde (siehe nachstehend). Cys-Reste können durch Protein-Mikrosequenzierung nicht identifiziert werden.
Ein weiteres Peptid, cb6, hatte die folgende Sequenz (Met steht der tatsächlichen Sequenz voran):
Der Rest 4 wurde später als Asn identifiziert, wie durch die cDNA-Sequenz bestimmt wurde (siehe nachstehend). Dieser Asn-Rest ist Teil einer potentiellen Glycosylierungs-Signalsequenz (Asn-Phe-Thr) und die Abwesenheit des Asn-Signals in der Proteinsequenz deutet darauf hin, dass es in der Tat glycosyliert ist.
Die anderen Peptidbanden wurden durch die Sequenzierung als Produkte einer unvollständigen Spaltung mit CNBr identifiziert. Sie ergaben entweder die Sequenz der N-terminalen Domäne wie vorher für IFNAB-BP gefunden oder die gleiche interne Sequenz wie cb3, cb6 oder cb7.
Beispiel 2: Proteinsequenzanalyse des C-terminalen Peptides von IFNAB-BP aus Harn
Eine Probe von IFNAB-BP aus Harn (~10 μg) wurde mit DTT reduziert, durch Iodacetamid alkyliert und mit Endoproteinase Lys C (Boehringer Mannheim, Deutschland) in einem Verhältnis von Enzym zu Substrat von 1:50 gespalten. Das resultierende Peptidgemisch wurde durch RP-HPLC auf einer RP18-Säule (Aquapore RP18, Applied Biosystems Inc.) unter der Verwendung eines Acetonitril-Gradienten in wässriger 0,1% Trifluoressigsäure aufgetrennt. Einzelne Peptidpeaks wurden kovalent an Sequalon AA-Membranen (Millipore, Bedford MA) gebunden und wie vorstehend einer N-terminalen Sequenzierung unterzogen. Eines der Peptide wurde als das C-terminale Peptid mit der folgenden Sequenz identifiziert:
Die C-terminale Sequenz entsprach derjenigen des 4,5 kb-Clons (siehe nachstehend) und konnte von derjenigen des mutmaßlichen durch die 1,5 kb-cDNA codierten Proteins durch die letzten zwei Aminosäurereste (Phe12-Ser13 anstelle von Ser-Ala) unterschieden werden. Somit ist der aus dem Harn isolierte lösliche Rezeptor als IFNAB-BPII identifiziert. Er wird unabhängig von einer spezifischen 4,5 kb-mRNA translatiert und wird nicht durch das Ablösen von dem Zelloberflächen-Rezeptor erzeugt.
Beispiel 3: Konstruktion von degenerierten Sense- und Antisense-Primern und Identifizierung einer nicht degenerierten Sequenz von IFNAB-BP-cDNA.
Die Sequenz des Peptides cb7 wurde in Sense-(Aminosäuren 1-8) und Antisense-(Aminosäuren 27-20) Primer revers translatiert. Decanucleotide und Nonanucleotide, die eine BamHI- bzw. SalI-Endonuclease-Restriktionssequenz enthielten, wurden an die 5'-Enden der Primer-Oligonucleotide angefügt (1A). Aus Daudi- und WISH-Zellen wurde Gesamt-RNA extrahiert und Erststrang-cDNA wurde unter der Verwendung von entweder dem Antisense-Oligonucleotidgemisch oder oligo-d(T) als Primer mit reverser Transkriptase erzeugt. Das resultierende cDNA-Fragment wurde anschließend in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) unter der Verwendung der kombinierten degenerierten Sense- und Antisense-Primer amplifiziert. Die Analyse der PCR-Produkte auf einem 3%-Agarosegel zeigte die erwartete 101 bp-Bande, die mit der cDNA sowohl der Daudi- als auch der WISH-Zellen erhalten wurde (1B). Das 101 bp-Fragment wurde mit BamHI und SalI gespalten, in pBluescript II KS+ (Stratagene) cloniert und 5 Clone wurden sequenziert. Die Sequenz der durch die Sense- und Antisense-Primer flankierten Region war unveränderlich und codierte die erwartete Sequenz der Aminosäurereste 9-19 des Peptides cb7 (1C). Anschließend wurde ein 35 bp-Oligonucleotid, das der nicht degenerierten internen Sequenz entsprach, synthetisiert und für die Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken verwendet.
Beispiel 4. Identifizierung von partiellen cDNA-Clonen von IFNAB-BPI
Das synthetische nicht degenerierte 35 bp-Oligonucleotid des Beispiels 2 wurde [³²P]-markiert und für das Durchmustern einer Lambda gt11-cDNA-Bibliothek aus menschlichen HeLa-Zellen (Clontech) verwendet. Fünf positive Clone wurden identifiziert. Einer dieser Clone, bezeichnet mit q10, enthielt eine Insertion von 1,4 kb. Die Sequenzierung des Clons q10 ergab eine Sequenz mit einem offenen Leserahmen, in dem ein Signalpeptid, eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und ein Teil einer intrazellulären Domäne identifiziert wurden (2). Die N-terminale Proteinsequenz codierende DNA-Sequenzen wurden ebenso wie die Sequenzen der drei CNBr-Peptide cb3, cb6 und cb7 des IFNAB-BP aus Harn innerhalb der durch die DNA des Clons q10 codierten extrazellulären Domäne identifiziert. Einige Cys- und Ser-Reste (gepunktet unterstrichen, 2) wurden durch die Proteinsequenzierung nicht richtig identifiziert. Es ist jedoch bekannt, dass das für die Proteinsequenzierung verwendete Verfahren Cys-Reste nicht anzeigt und in manchen Fällen Ser-Reste übersieht. Auch ein Asn-Rest in Peptid 6 wurde nicht detektiert, was darauf hinweist, dass er glycosyliert ist. Der Vergleich der DNA-Sequenz des Clons q10 mit der Genebank-Datenbank zeigte keine Identität mit irgendwelchen bekannten Sequenzen. Somit enthält dieser Clon eine neue DNA-Sequenz.
Beispiel 5. Northern-Transfer von menschlicher mRNA
Eine radioaktiv markierte Sonde wurde aus dem Clon q10 hergestellt und für eine Northern-Blot-Hybridisierung von polyA⁺-mRNA von zwei menschlichen Zelllinien verwendet: Daudi und WISH. In beiden Fällen wurden zwei spezifische Banden beobachtet, eine, die 1,5 kb entspricht, und eine andere, die 4,5 kb entspricht. Auf der Basis der Intensität der Banden wurde geschätzt, dass die 1,5 kb-mRNA etwa zweimal so häufig vorkommend ist wie die 4,5 kb-mRNA. Das mit der RNA aus den WISH-Zellen erhaltene Signal war kaum sichtbar, während das Signal der RNA aus Daudizellen (3) nachweisbar war. Die 1,5 kb-mRNA wird in einen Vorläufer von IFNAB-BPI, das einen Zelloberflächen-Interferonrezeptor darstellt, translatiert. Die längere mRNA repräsentiert ein unterschiedliches Transkript, das für ein unterschiedliches Protein codiert, das mit IFNAB-BPI mindestens etwa 100 Aminosäuren gemeinsam hat. Dieses Protein ist der Vorläufer von IFNAB-BPII, von dem später gezeigt wird, dass es eine lösliche Form des Interferon α/β-Rezeptors ist.
Beispiel 6. Identifizierung von vollständigen cDNA-Clonen von IFNAB-BPI und IFNAB-BPII
Eine menschliche Monocyten-cDNA-Bibliothek, die in dem Phagen λpCEV9 konstruiert wurde (Gutkind, J. S., et al., Molec. Cell. Biol. 11, 1500–1507, 1991), wurde dann mit einer 397 bp-Sonde, die durch PCR aus der codierenden Region von Clon q10 hergestellt wurde, durchmustert. Wir isolierten 22 Clone mit einer 1,5 kb-Insertion und zwei Clone mit einer 4,5 kb-Insertion aus 10⁶ unabhängigen Phagen. Eine DNA-Sequenzanalyse von zwei 1,5 kb-Clonen (λpCEV9-m6 und λpCEV9-m24) und ebenso von dem gesamten offenen Leserahmen der zwei 4,5 kb-Clone (λpCEV9-m19 und λpCEV9-m27) wurde durchgeführt. Die 1,5 kb-Clone codierten einen vollständigen Vorläufer von IFNAB-BPI, das einen Zelloberflächen-Rezeptor darstellt, mit einem offenen Leserahmen von 331 Codons (4). Die aus dem IFNAB-BP aus Harn erhaltenen Protein- und CNBr-Sequenzen (gepunktet unterstrichen, 4) wurden alle innerhalb der translatierten Sequenz identifiziert. Die teilweise Sequenzierung der zwei 4,5 kb-Clone ergab die gleiche 5''-Sequenz von 237 Codons, wie sie in den 1,5 kb-Clonen vorhanden ist, gefolgt durch eine unterschiedliche Sequenz, die ein Terminationssignal nach dem Codon 239 beinhaltete (5). Zusammengefasst waren folgende Codons unterschiedlich: Codon 13 (Leu anstelle von His); Codon 108 (Thr anstelle von Ile) und die Codons 238–240 (Phe-Ser-Stopp anstelle von Ser-Ala-Ser). In beiden 4,5 kb-Clonen war in keinem der drei Leserahmen ein offener Leserahmen hinter dem Stopp-Codon zu erkennen. Somit codiert die 4,5 kb-cDNA einen Vorläufer eines verkürzten löslichen Rezeptors, bei dem es sich um IFNAB-BPII handelt und der in seiner C-terminalen Sequenz zu dem aus Harn isolierten identisch ist. Die zwei die Vorläuferproteine von sowohl IFNAB-BPI als auch von IFNAB-BPII codierenden mRNAs stammen von dem gleichen Gen, wahrscheinlich durch alternatives Spleißen.
Beispiel 7. Konstruktion eines Säuger-Expressionsvektors und Herstellung von rekombinanten löslichen IFNAB-BPI und IFNAB-BPII
Eine die Signalsequenz und die extrazelluläre Domäne von IFNAB-BPI codierende DNA wurde unter der Verwendung von synthetischen Sense- und Antisense-Primern, die XbaI-Restriktionsstellen tragen (6A), und von q10-DNA als Matrize mit VENT-DNA-Polymerase (Stratagene) durch PCR erzeugt. Das resultierende PCR-Produkt (6B) wurde mit XbaI gespalten und in den Expressionsvektor pEF-BOS ligiert, um pEF-BOS-IFNAB-BPI zu ergeben (6C, Referenz 46). Das Konstrukt wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Kompetente E. coli wurden transformiert und Clone mit der IFNAB-BPI-Sequenz in der richtigen Orientierung wurden isoliert. Das pEF-BOS-sABR-Konstrukt wurde für die Transfektion von Affen-COS-Zellen verwendet. Diese Zellen exprimierten 12 ng/ml an rekombinantem löslichem IFNAB-BPI, das im Zellkulturüberstand erhalten wurde, wie durch ELISA und durch dessen Fähigkeit, die biologische (antivirale) Aktivität der menschlichen Interferone alpha und beta zu hemmen, bestimmt wurde. Analog dazu wurde die DNA-Region, die in dem 4,5 kb-Clon IFNAB-BPII codiert, in einen Säuger-Expressionsvektor, wie für die extrazelluläre Domäne von IFNAB-BPI beschrieben, inseriert und für die Transformation von Zellen verwendet. Solche Zellen produzieren aktives IFNAB-BPI, das in das Kulturmedium der Zellen abgeschieden wird.
Beispiel 8. Konstruktion von eukaryontischen Expressionsvektoren und Expression von IFNAB-BPI und IFNAB-BPII in murinen Zellen
Eine das gesamte IFNAB-BPI codierende DNA wurde unter der Verwendung von synthetischen Sense- und Antisense-Primern, die XbaI-Restriktionsstellen tragen, und von Plasmid pCEV9-m6 als Matrize mit VENT-DNA-Polymerase (Stratagene) durch PCR erzeugt. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit XbaI gespalten und in den Expressionsvektor pEF-BOS ligiert, um pEF-BOS-IFNABR zu erhalten. Die IFNAR (14) entsprechende cDNA wurde unter der Verwendung von spezifischen Oligonucleotiden durch RT-PCR erzeugt (48). Das amplifizierte Produkt wurde in die XbaI-Restriktionsstelle des Expressionsvektors pEF-BOS (46) cloniert, um pEF-BOS-IFNAR zu erhalten. Diese Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Kompetente E. coli-Zellen wurden transformiert und Clone mit den IFNAB-BPI- und IFNAR-Sequenzen in der richtigen Orientierung wurden isoliert.
Murine Zellen, die die clonierte IFNAB-BPI-cDNA in stabiler Art und Weise exprimierten, wurden entwickelt. Exponentiell wachsende NIH-3T3-Zellen (1,5 × 10⁶ in 10 cm-Platten) wurden unter Verwendung des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahrens (49) gleichzeitig mit pSV2neo (2 μg) und pEF-BOS-IFNABR (10 μg DNA) transfiziert. Unabhängige G418-resistente Clone wurden identifiziert und subcloniert. Clone, die große Mengen an IFNAB-BPI exprimierten, wurden durch die Bindung an einen gegen das IFNAB-BPI aus Harn gerichteten Antikörper und durch die Bindung von ¹²⁵I-IFN-α2 identifiziert (Tabelle IV).
Für die Bindung von anti-IFNAB-BPII-Antikörpern wurden Zellen (1 × 10⁶) in 35 mm-Vertiefungen (Platten mit sechs Vertiefungen, Costar) ausgesät und bis zur Konfluenz angezogen (20 h). Die Zellen wurden mit DMEM, das 2% FBS und 0,1% Natriumazid enthielt, (Waschmedium) gewaschen, gefolgt durch eine Inkubation von 20 min in dem Waschmedium. Kaninchen-anti-IFNAB-BPII-Antikörper (2 ml, 1:500 in dem Waschmedium) wurden zu den gewaschenen Zellen gegeben und die Zellen wurden für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, ¹²⁵I-Protein A (2 ml, 250000 CpM in dem Waschmedium) wurde zugegeben und die Zellen wurden für weitere 45 min inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, mit Trypsin geerntet und gezählt.
Für die Bindung von ¹²⁵I-IFN-α2 wurden Zellen (1 × 10⁶) in 35 mm-Vertiefungen (Platten mit sechs Vertiefungen, Costar) ausgesät und bis zur Konfluenz angezogen (20 h). Die Zellen wurden mit DMEM, das 2% FBS und 0,1% Natriumazid enthielt, (Waschmedium) gewaschen, gefolgt durch eine Inkubation von 20 min in dem Waschmedium. ¹²⁵I-IFN-α2 (2–3 × 10⁵ CpM, 10⁸ Einheiten/mg, 5 × 10⁷ CpM/μg) wurde zugegeben und die Inkubation wurde für 2 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, mit Trypsin geerntet und gezählt.
SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen eines mit Detergens behandelten Extraktes von positiven Clonen (z.B. Clon 369.11), gefolgt durch Immunblotting mit dem vorstehend erwähnten Antikörper, ergab eine starke Bande von etwa 51 kDa (7).
IFNAR exprimierende murine Zellen wurden in ähnlicher Weise durch Transfektion mit dem Plasmid pEF-BOS-IFNAR entwickelt. Clon Nr. 470.6 war IFNAR-positiv, wie durch die Fähigkeit von huIFN-αB, eine antivirale Reaktion in diesen Zellen wirksam zu induzieren, festgestellt wurde. Wie erwartet waren andere IFNs vom TypI (z.B. hu IFN-β) in Clon 470.6 nicht aktiv.
Die Clone 369.11 und 470.6., die IFNAB-BPI und IFNAR exprimieren, wurden dann mit dem komplementären Rezeptorprotein (pEF-BOS-IFNAR bzw. pEF-BOS-IFNABR) transfiziert. Für eine stabile Coexpression wurden G418-resistente Clone, die entweder IFNAR oder IFNAB-BPI exprimieren, mit pSV2hygro (2 μg) zusammen entweder mit pEF-BOS-IFNABR oder pEF-BOS-IFNAR wie vorstehend transfiziert. Hygromycin- und G418-resistente Clone, die IFNAR und IFNAB-BPI co-exprimieren, wurden isoliert und subcloniert. Von dem Clon 369.11 stammende IFNAR-positive Clone wurden durch ihre antivirale Reaktion auf huIFN-αB identifiziert, während von dem Clon 470.6 stammende IFNAB-BPI-positive Clone durch die Bindung von sowohl anti-IFNAB-BPII-Antikörpern als auch von ¹²⁵I-IFN-α2 identifiziert wurden. Clon 508.12, der von dem Clon 369.11 stammt, und Clon 1306, der von dem Clon 470.6 stammt, banden sowohl ¹²⁵I-IFN-α2 als auch IFN-α/βR-Antikörper (Tabelle IV). Darüber hinaus reagierten sie in einem antiviralen Test auf huIFN-αB. Daher haben wir geschlossen, dass diese Clone sowohl IFNAB-BPI als auch funktionellen IFNAR exprimieren.
Tabelle IV. Expression von IFNAB-BPI in verschiedenen Zellen.
Beispiel 9. Bestimmung der Affinität von in murinen Zellen exprimiertem IFNAB-BPI und IFNAR
Clone, die entweder IFNAR oder IFNAB-BPI exprimieren, wurden hinsichtlich ihrer Bindung von ¹²⁵I-huIFN-α2 getestet und die Bindungsdaten wurden durch eine Scatchard-Analyse bewertet. Zellen (1 × 10⁶) wurden in 35 mm-Vertiefungen (Platten mit sechs Vertiefungen, Costar) ausgesät und bis zur Konfluenz angezogen (20 h). Die Zellen wurden mit DMEM, das 2% FBS und 0,1% Natriumazid enthielt, (Waschmedium) gewaschen, gefolgt durch eine Inkubation von 20 min in dem gleichen Medium. ¹²⁵I-IFN-α2 (2–3 × 10⁵ CpM, 10⁸ Einheiten/mg, 5 × 10⁷ CpM/μg) wurde zusammen mit den angezeigten Konzentrationen von nicht markiertem IFN-α2 zugegeben und die Inkubation wurde für 2 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Zellen wurden dreimal mit dem Waschmedium gewaschen, mit Trypsin geerntet und gezählt. Die Bindungsdaten wurden durch das LIGAND-Programm analysiert (50).
Zellen, die nur IFNAR exprimieren (Clon 470.6), zeigten keine spezifische Bindung von ¹²⁵I-IFN-α2 (8A) und daher konnte kein Kd-Wert von solchen putativen Bindungsstellen erhalten werden. Im Gegensatz zu Clon 470.6 wurde mit Zellen, die IFNAB-BPI alleine exprimieren (Clon 369.11), eine spezifische und saturierbare Bindung mit hoher Affinität erhalten. Der Kd dieser Bindung betrug 3,6 × 10^–9 M bei 23°C (Tabelle V).
Die Bindung von ¹²⁵I-IFN-α2 an 508.12-Zellen (die sowohl IFNAB-BPI als auch IFNAR exprimieren) wurde durch eine Scatchard-Analyse bewertet und die Ergebnisse wurden mit denen von Clon 369.11 (der nur IFNAB-BPI exprimiert) verglichen. Als Folge der Coexpression von IFNAB-BPI und IFNAR wurde eine saturierbare Bindung erhalten und die Affinität für IFN-α2 erhöhte sich um etwa zehnfach (8), was der des Rezeptors in Daudizellen nahe kommt (Kd = 4,0 × 10^–10 M gegenüber 1,6 × 10^–10 M, Tabelle V). Dieses Ergebnis zeigt an, dass IFNAR und IFNAB-BPI bei der Ligandenbindung zusammenwirken.
Tabelle V. Bindungsmerkmale von verschiedenen Wirtszellen (Ligand = ¹²⁵I-IFN-α2).
Beispiel 10. Bestimmung der Affinität von IFNAB-BPII aus Harn
Menschliches IFN-α2 wurde durch ein durch den Hersteller bereitgestelltes automatisches Verfahren auf einem Sensorchip von BIAcore (Pharmacia, Schweden) immobilisiert. Etwa 30 fmol IFN-α2 wurden immobilisiert. In Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf verschiedene Konzentrationen (28–112 nM) verdünntes IFNAB-BPII aus Harn wurde durch den Sensogrammchip geleitet und das Ausmaß der Assoziation und Dissoziation (in PBS) wurde aufgezeichnet. Auf der Basis der resultierenden Daten wurde ein Kd-Wert von 3,12 × 10^–9 M berechnet (9). Somit ist die Affinität von IFNAB-BPI aus Harn zu der von in Wirtszellen exprimiertem IFNAB-BPI sehr ähnlich.
Beispiel 11. Expression von IFNAB-BPI und IFNAB-BPII in E. coli, Hefe und Insektenzellen.
IFNAB-BPI und IFNAB-BPII werden auch durch weitere rekombinante Zellen wie prokaryontische Zellen, z.B. E. coli, oder andere eukaryontische Zellen wie Hefe- und Insektenzellen produziert. Gut bekannte Verfahren sind verfügbar für die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die DNA tragen, die entweder IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII und ihre aktiven Fraktionen codiert, und die geeignet sind für die Transformation von E. coli und Hefezellen oder die Infektion von Insektenzellen, um rekombinantes IFNAB-BPI und IFNAB-BPII zu produzieren. Für die Expression in Hefezellen wird die IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII (Beispiel 5 und 6) codierende DNA ausgeschnitten und in für die Transfektion von Hefezellen geeignete Expressionsvektoren inseriert. Für die Expression in Insektenzellen wird die IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII codierende DNA in einen Baculovirus inseriert und die Insektenzellen werden mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert. Für die Expression in E. coli wird die IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII codierende DNA einer ortsgerichteten Mutagenese mit geeigneten Oligonucleotiden unterzogen, sodass ein Initiations-ATG-Codon direkt vor das erste Codon des reifen IFNAB-BPI (2) oder IFNAB-BPII inseriert wird. In einer anderen Ausführungsform kann eine solche DNA mit geeigneten Sense- und Antisense-Primern durch PCR hergestellt werden. Die resultierenden cDNA-Konstrukte werden dann durch im Fachgebiet gut bekannte Techniken (35) in auf geeignete Weise konstruierte prokaryontische Expressionsvektoren inseriert.
Beispiel 12: Konstruktion von rekombinanten Fusionsproteinen von IFNAB-BPI und IFNAB-BPII
Die Produktion von Proteinen, die entweder die ligandenbindende Domäne von IFNAB-BPI oder von IFNAB-BPII umfassen, die mit der konstanten Region der schweren Kette von IgG1 fusioniert sind, kann wie folgt durchgeführt werden: die DNA von IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII wird mit geeigneten Oligonucleotiden einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, sodass eine einzigartige Restriktionsstelle unmittelbar vor und nach den die ligandenbindenden extrazellulären Domänen codierenden Sequenzen eingeführt wird. In einer anderen Ausführungsform kann eine solche DNA mit Hilfe von spezifisch entworfenen Primern, die die Restriktionsstellen tragen, durch PCR hergestellt werden. Ein anderes Plasmid, das die konstante Region der schweren Kette von IgG1 trägt, z.B. pRKCO42Fc1 (47), wird einer ähnlichen ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, um die gleiche einzigartige Restriktionsstelle so nah wie möglich an das Asp 216 der schweren Kette von IgG1 auf eine Art und Weise einzuführen, dass eine Translation in der Phase des fusionierte Proteins möglich ist. Ein dsDNA-Fragment, das aus untranslatierten 5'-Sequenzen besteht und entweder IFNAB-BPII oder die ligandenbindende Domäne von IFNAB-BPI codiert, wird durch Spaltung an den einzigartigen Restriktionsstellen hergestellt. Das mutierte pRKCD42Fc1 wird in ähnlicher Weise gespalten, um ein großes Fragment zu erzeugen, das das Plasmid und die IgG1-Sequenzen enthält. Die zwei Fragmente werden dann ligiert, um ein neues Plasmid zu erzeugen, das einen Polypeptid-Vorläufer codiert, der entweder aus IFNAB-BPII oder der ligandenbindenden Domäne von IFNAB-BPI und etwa 227 C-terminalen Aminosäuren der schweren Kette von IgG1 besteht (Gelenkregion und CH2- und CH3-Domänen). Die die fusionierten Proteine codierende DNA kann aus dem Plasmid isoliert werden, indem es mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und dann in leistungsfähige prokaryontische oder eukaryontische Expressionsvektoren inseriert wird.
Beispiel 13: Konstruktion von rekombinanten Fusionsproteinen von IFNAB-BPI und IFNAB-BPII mit IFNAR
Die Herstellung von Proteinen, die entweder die extrazelluläre Domäne von IFNAB-BPI oder von IFNAB-BPII fusioniert mit der konstanten Region der schweren Kette von IgG1 umfassen, kann, wie in Beispiel 12 beschrieben, durchgeführt werden. Die Herstellung eines Proteins, das die extrazelluläre Domäne von IFNAR fusioniert mit der konstanten Region der leichten Kette von IgG1 umfasst, wird in ähnlicher Weise durchgeführt. Eukaryontische Expressionsvektoren, die entweder die ligandenbindende Domäne von IFNAB-BPI fusioniert mit der konstanten Region der schweren Kette von IgG1 oder IFNAB-BPII fusioniert mit der konstanten Region der schweren Kette von IgG1 codieren, werden zusammen mit einem eukaryontischen Expressionsvektor, der die extrazelluläre Domäne von IFNAR fusioniert mit der konstanten Region der leichten Kette von IgG1 codiert, für die Cotransfektion eines geeigneten Säugerwirtes verwendet. Positive Transfektanten werden ein zusammengesetztes Protein sekretieren, das aus den konstanten Regionen von IgG1, der extrazellulären Domäne von IFNAR, das die variablen Regionen der leichten Kette von IgG1 ersetzt, und entweder IFNAB-BPII oder der ligandenbindenden Domäne von IFNAB-BPI, die die variablen Regionen der schweren Ketten von IgG1 ersetzen, besteht.
In einem anderen Beispiel werden die konstanten Regionen der schweren und der leichten Ketten vertauscht, d.h. die extrazelluläre Domäne von IFNAR wird mit den konstanten Regionen der schweren Kette von IgG2 fusioniert, während entweder die ligandenbindende Domäne von IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII mit der konstanten Region der leichten Kette von IgG2 fusioniert wird.
Basierend auf dem Beispiel 9 wird erwartet, dass diese fusionierten Proteine im Vergleich zu der von IFNAB-BPI oder IFNAB-BPII eine 10-fach höhere Affinität für IFN-α zeigen.
Referenzbeispiel 14: Herstellung von polyconalen Antikörpern gegen IFNAB-BP
Zu Beginn werden Kaninchen subkutan 5 μg einer reinen Präparation von IFNAB-BP aus dem Harn, die in vollständigem Freundschem Adjuvans emulgiert ist, injiziert. Drei Wochen später werden ihnen wiederum 5 μg der Präparation in unvollständigem Freundschem Adjuvans subkutan injiziert. Vier weitere Injektionen werden in Abständen von 10 Tagen als Lösungen in PBS gegeben. Die Kaninchen werden 10 Tage nach der letzten Immunisierung ausgeblutet. Die Entwicklung der Antikörpermenge wurde mit Hilfe eines Festphasen-Radioimmuntests (sRIA) unter der Verwendung von PVC-Platten mit 96 Vertiefungen, die über Nacht bei 4°C in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit IFNAB-BP (1 μg/ml) beschichtet wurden, verfolgt. Die Platten wurden dann mit Rinderserum-Albumin (BSA, 0,5%) und Tween 20 (Sigma USA, 0,05%) in PBS über Nacht bei 4°C blockiert. Die Platten wurden mit 5-fachen Verdünnungen des Kaninchen-Antiserums für 4 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt, gewaschen und mit ¹²⁵I-Protein A (10⁵ CpM/Vertiefung) in PBS für 45 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Platten wurden dann gewaschen, einzelne Vertiefungen wurden geschnitten und gezählt. Der Titer wird berechnet als der Umkehrwert der maximalen Verdünnung, die 10-fach höhere Zählimpulse als das Kontrollserum ergab. Der Titer nach 5 Injektionen war höher als 1:60000.
Die Entwicklung der Antikörpermenge wurde auch über die Fähigkeit des Antiserums, die antivirale Aktivität von menschlichem IFN-α2 zu blockieren, verfolgt. Vorher gebildete Einzelschichten von menschlichen WISH-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit zweifachen Verdünnungen des Antiserums beginnend mit einer Verdünnung von 1:250 in Vertiefung Nr. 1 für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. IFN-α2 (10 Einheiten/ml, Endkonz.) wurde anschließend zugegeben und nach einer Stunde bei 37°C wurden die Zellen dem vesikulären Stomatitis-Virus ausgesetzt. Der neutralisierende Titer nach 7 Immunisierungen betrug 120000 antivirale Einheiten/ml.
Referenzbeispiel 15: Herstellung von monoclonalen Antikörpern gegen IFNAB-BP
Weiblichen Balb/C-Mäusen (3 Monate alt) wurde zuerst 2 μg gereinigtes IFNAB-BP in einer Emulsion von vollständigem Freundschem Adjuvans und drei Wochen später subkutan in unvollständigem Freundschem Adjuvans injiziert. Drei weitere Injektionen wurden in Abständen von 10 Tagen subkutan in PBS gegeben. Ein Bindungstiter von 1:60000 wurde durch sRIA erhalten (siehe Beispiel 9). Letzte Auffrischungen wurden der Maus mit dem höchsten Bindungstiter 4 und 3 Tage vor der Fusion intraperitoneal gegeben. Die Fusion wurde unter der Verwendung einer NSO/1-Myelomzelllinie und von Lymphocyten, die aus der Milz und den Lymphknoten des Tieres gewonnen wurden, als Fusionspartner durchgeführt. Die fusionierten Zellen wurden in Mikrokulturplatten verteilt und die Hybridome wurden in DMEM, das mit HAT und 15% Pferdeserum ergänzt wurde, selektiert. Die Hybridome, bei denen festgestellt wurde, dass sie Antikörper gegen IFNAB-BP produzieren, wurden unter Anwendung des limitierenden Verdünnungsverfahrens subcloniert und in Balb/C-Mäuse, die mit Pristan für die Produktion eines Ascites vorbereitet wurden, injiziert. Die Isotypen der Antikörper wurden unter der Verwendung eines im Handel erhältlichen ELISA-Kits (Amersham, UK) bestimmt.
Das Durchmustern auf Hybridome, die monoclonale anti-IFNAB-BP-Antikörper produzieren, wurde wie folgt durchgeführt: Hybridom-Überstände wurden unter Anwendung eines Radioimmuntests mit umgekehrter Festphase (IRIA) auf die Anwesenheit von anti-IFNAB-BP-Antikörpern getestet. PVC-Mikrotiterplatten (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) wurden mit affinitätsgereinigten Ziegen-anti-Mausserum-F(ab)₂-Antikörpern (Jackson Labs, USA) (10 μg/ml, 100 μl/Vertiefung) beschichtet. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Platten zweimal mit PBS, das BSA (0,5%) und Tween 20 (0,05%) enthielt, gewaschen und in Waschlösung für mindestens 2 h bei 37°C blockiert. Die Hybridomkultur-Überstände (100 μl/Vertiefung) wurden zugegeben und die Platten wurden für 4 h bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit der Waschlösung gewaschen und für eine weitere Inkubation von 16 h bei 4°C wurde ¹²⁵I-IFNAB-BP zugegeben. Die Platten wurden dreimal gewaschen und einzelne Vertiefungen wurden ausgeschnitten und in einem Gammazähler gezählt. Proben, die Zählungen ergaben, die mindestens 5 mal höher als der Wert der Negativkontrolle waren, wurden als positiv angesehen (Tabelle VI). Fünf positive Clone wurden ausgewählt, für weitere Untersuchungen subcloniert und charakterisiert. Alle Clone waren vom IgG1-Isotyp.
Tabelle VI: Clone, die monoclonale Antikörper gegen IFNAB-BP produzieren
Referenzbeispiel 16: Affinitätschromatographie von IFNAB-BP mit monoclonalen Antikörpern
Antikörper gegen IFNAB-BP wurden für die Reinigung von IFNAB-BP durch Affinitätschromatographie eingesetzt. Der monoclonale Antikörper Nr. 5.73 wurde in diesem Beispiel für die Affinitätschromatographie verwendet. Ascites-Flüssigkeit, die den durch das Hybridom Nr. 5.73 sekretierten monoclonalen Antikörper enthielt, wurde durch eine Ammoniumsulfatfällung bei 50% Sättigung, gefolgt durch eine ausgiebige Dialyse gegen PBS, gereinigt. Etwa 10 mg Immunglobulin wurden an 1 ml Affigel 10 (Bio-Rad USA), wie durch den Hersteller angegeben, gebunden.
250 ml von menschlichen Proteinen aus dem Harn (250 l ungereinigtem Harn entsprechend) wurden bei 4°C bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,25 ml/min auf 0,5 ml der anti-IFNAB-BP-Antikörper-Säule gegeben. Die Säule wurde mit PBS gewaschen, bis in den Waschlösungen kein Protein mehr nachgewiesen werden konnte. IFNAB-BP wurde mit 25 mM Zitronensäurepuffer mit einem pH-Wert von 2,2 (8 × Fraktionen mit 1 Säulenvolumen) eluiert und unmittelbar mit 1 M Na₂CO₃ neutralisiert. Eine Silberfärbung der SDS-PAGE der eluierten Fraktionen zeigte eine Hauptbande mit einem MG von 40000. Eine weitere Reinigung dieser Präparation wurde durch eine Größenausschlußchromatographie erreicht.
Referenzbeispiel 17: ELISA-Test von IFNAB-BPII
Mikrotiterplatten (Dynatech oder Maxisorb von NUNC) wurden mit dem monoclonalen anti-IFNAB-BP-Antikörper Nr. 46.10 (Ig-Fraktion, 120 μl/Vertiefung, 10 μg/ml in PBS) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit PBS, das BSA (0,5%), Tween 20 (0,05%) und NaN₃ (0,02%) enthielt, (Blockierungslösung) gewaschen und in der gleichen Lösung über Nacht bei 37°C blockiert. Die getesteten Proben wurden in der Blockierungslösung, die 0,1% NP40 und 0,65 M NaCl enthielt, seriell zweifach (beginnend mit 1:4) verdünnt und für 4 h bei 37°C zu den Vertiefungen (100 μl/Vertiefung) gegeben. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS, das 0,05% Tween 20 enthielt, (PBS/Tween) gewaschen, gefolgt durch die Zugabe von Kaninchen-anti-IFNAB-BPII-Serum (1:1000 in Blockierungslösung ohne NaN₃, 100 μl/Vertiefung) für eine weitere Inkubation über Nacht bei 4°C. Die Platten wurden dreimal mit PBS/Tween (100 μl/Vertiefung) gewaschen und ein Konjugat einer Ziegen-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase (HRP, Jackson Labs, 1:10000 in PBS/Tween, 100 μl/Vertiefung) wurde für 2 h bei Raumtemperatur zugegeben. Die Platten wurden dreimal mit PBS/Tween gewaschen und die Farbe wurde durch die Zugabe von 100 μl einer frisch hergestellten ABTS-Lösung (2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure, Sigma, 10 mg; 6,4 ml H₂O; 2,2 ml 0,2 M Na₂HPO₄; 1,4 ml 0,2 M Zitronensäure, 1 μl H₂O₂) als Substrat zu jeder Vertiefung entwickelt. Die Farbe entsteht nach 30 min und die Reaktion kann durch die Zugabe von 100 μl 0,2 M Zitronensäure/Vertiefung gestoppt werden. Die Platten wurden in einem automatischen ELISA-Lesegerät bei 405 nm gelesen, wobei um unspezifisches Lesen bei 630 nm korrigiert wurde. Die untere Nachweisgrenze dieses Tests betrug 30 pg/ml (10).
Die vorangegangene Beschreibung spezieller Ausführungsformen zeigt die allgemeine Natur der Erfindung, sodass andere durch die Anwendung des aktuellen Wissensstandes solche spezifischen Ausführungsformen für verschiedene Anwendungen auf einfache Weise modifizieren und/oder anpassen können, ohne dabei das allgemeine Konzept zu verlassen und daher soll es beabsichtigt sein und ist es beabsichtigt, dass solche Anpassungen und Modifikationen innerhalb der Bedeutung und des Bereiches von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen liegen. Es sollte klar sein, dass die hier verwendete Ausdrucksweise oder Terminologie dem Zweck der Beschreibung dient und nicht der Einschränkung.
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Claims

DNA-Molekül, das ein IFN-α/β-Bindeprotein codiert, ausgewählt aus (a) IFNAB-BPI, das die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz hat; (b) IFNAB-BPII, das die in 5 gezeigte Aminosäuresequenz hat; und (c) Vorläufern oder Fusionsproteinen der Proteine nach (a) oder (b).
mRNA-Molekül, das das Produkt der Transkription des DNA-Moleküls nach Anspruch 1 ist.
mRNA-Molekül nach Anspruch 2, ausgewählt aus (a) einem mRNA-Molekül von etwa 1,5 kb, welches, wenn es translatiert wird, einen IFNAB-BPI-Vorläufer liefert; und (b) einem mRNA-Molekül von etwa 4,5 kb, welches, wenn es translatiert wird, ein IFNAB-BPII liefert.
Replizierbares Expressionsvehikel, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 1.
Replizierbares Expressionsvehikel nach Anspruch 4, welches das Plasmid pEF-BOS-IFNAB-BPI ist, dessen Konstruktion in Beispiel 7 beschrieben ist.
Wirtszelle, die transformiert ist mit dem replizierbaren Expressionsvektor nach Anspruch 4 oder 5.
Wirtszelle nach Anspruch 6, die eine prokaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 6, die eine eukaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, die eine Affen-COS-Zelle ist.
IFN-α/β-Bindeprotein, das durch die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder die RNA-Sequenz nach Anspruch 2 oder 3 codiert wird, oder das durch die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6 bis 9 hergestellt wird, oder ein Salz dieses Bindeproteins.
IFN-α/β-Bindeprotein nach Anspruch 10, das ein reifes Protein oder ein Salz davon ist.
Arzneimittel, umfassend das IFN-α/β-Bindeprotein nach Anspruch 10 oder 11 oder ein Salz davon, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung des IFN-α/β-Bindeproteins nach Anspruch 10 oder 11 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung der IFN-α- oder IFN-β-Aktivität.
Verwendung des IFN-α/β-Bindeproteins nach Anspruch 10 oder 11 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung der IFN-α- oder IFN-β-Aktivität.
Verfahren zur Herstellung des IFN-α/β-Bindeproteins nach einem der Ansprüche 10 oder 11, umfassend die Züchtung der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6 bis 9 und die Gewinnung des IFN-α/β-Bindeproteins.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 1 und/oder das IFN-α/β-Bindeprotein nach Anspruch 10 oder 11.