JP3670045B2 - インターフェロンα／β結合タンパク質およびその製造法 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、インターフェロン−β（以下、ＩＦＮ−βと略す）の活性のみならず、種々のインターフェロン−α（以下、ＩＦＮ−αと略す）サブタイプの活性を調節(modulating)しうる、新規のＩＦＮ−α／β結合タンパク質に関する。さらに詳しくは、本発明は、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ分子のクローニング、宿主細胞中でのそれらの発現およびこれらのタンパク質に対する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
イスラエル国特許出願第１０３０５２号明細書では、モノクローナルの抗ＩＦＮ−αレセプター抗体を用いるウェスタンブロット法により同定された、分子量約４５,０００の可溶性ＩＦＮ−αのレセプタータンパク質が記載され、クレームされている。前記明細書には、¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２を用いるクロスリンキング(cross-linking)および抗ＩＦＮ−αモノクローナル抗体を用いる免疫沈降により同定された、約４０,０００の分子量を有する異なる可溶性ＩＦＮ−α結合タンパク質についても記載され、クレームされている。血清からえたばあいは、この種は５０Ｋの分子量を有していた。イスラエル国特許出願第１０６５９１号明細書には、均一な状態で尿からえられ、他の既知のあらゆるタンパク質とも異なる配列を有する前記の分子量４０,０００のＩＦＮ−α結合タンパク質（以下、「尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰ」または「ＩＦＮＡＢ−ＢＰII」と称する）が記載され、クレームされている。ＩＦＮＡＢ−ＢＰはＩＦＮ−βのみならず種々のＩＦＮ−αサブタイプに結合してそれらの活性をブロックする。この点において、ＩＦＮＡＢ−ＢＰの結合特性は、既に記載されているヒトインターフェロン−αＢに対してのみ反応する細胞表面インターフェロンレセプターの結合特性とは著しく異なる。
【０００３】
本発明ではＩＦＮＡＢ−ＢＰの前駆体をコードする２種のｃＤＮＡ分子をクローン化し、それらの塩基配列を決定した。両者はおそらく同一の遺伝子に由来（たとえば、択一的スプライシング(alternative splicing)による）する。また、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIと称される、２種の組換えタンパク質のホ乳動物およびそのほかの宿主細胞における産生についても記載する。本発明ではさらにＩＦＮレセプターのブロッキングに有用であり、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの免疫検定法および免疫精製（immunopurification）に有用であるＩＦＮＡＢ−ＢＰに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体についても開示する。
【０００４】
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIは、ＩＦＮ−βならびにＩ型インターフェロン類、すなわちＩＦＮ−αの種々のサブタイプの活性を調節することができる。このように、これらはＩ型インターフェロン類の望ましくない効果を阻害しうる。
【０００５】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）類（ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−ω）はウイルス感染に対する耐性を与えるというそれらの能力によって通常定義され、構造的に関連するサイトカインのファミリーからなる。Ｉ型インターフェロン類のほかの多くの生物学的活性が報告されているが、それらは細胞増殖の阻害、ＭＨＣクラスＩ抗原の誘導およびほかの数種の免疫調節活性（文献１）があげられる。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、ヘアリー細胞白血病（文献６）、慢性の骨髄性白血病（文献７）およびカポジ肉腫（文献８）のようなある種の悪性腫瘍ならびにＣ型肝炎（文献２および３）およびウイルスいぼ(viral warts)（文献４および５）を含む数種のウイルス疾患の治療に有用である。
【０００６】
ＩＦＮ−αは、エイズ患者（文献１０）ならびに全身性紅斑性狼瘡（文献９）のような自己免疫疾患を有する多種の患者の血清中に検出された。ＩＦＮ−αは若年性糖尿病(juvenile diabetes)の進行に関係していた（文献１１）。また、白質マイクログリア(white matter microglia)での増加したＩＦＮ−αの発現は、アルツハイマー病の病理学に寄与しているという報告もある（文献５１）。さらには、ＩＦＮ−αによる治療は、発熱および脳神経学的疾患を含む望ましくない副作用を導く一部の症例においても示されている（文献１２）。このように、ＩＦＮ−αの活性を中和することが患者にとって有益かもしれない病理学的状況もある。
【０００７】
ほかのサイトカイン類のばあいのように、ＩＦＮ−αは、ＩＦＮ−βに対するのと同様にすべてのＩＦＮ−αサブタイプに対して特異的である細胞表面レセプターに結合することによってその生物学的活性を発揮する（文献１３）。ヒトＩＦＮ−αのレセプター（ＩＦＮＡＲ）が同定され、Ｄａｕｄｉ（ダウディ）細胞からクローン化された（文献１４）。クローン化されたレセプターは単一の膜貫通型ドメイン、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有する。このレセプターはネズミの細胞で発現されると、ヒトＩＦＮ−αＢに反応するが、ほかのＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β種には顕著には反応しない。このことはＩＦＮ−βおよび種々のＩＦＮ−αサブタイプに対する反応には付加的な成分が関係しているかもしれないということを示している。
【０００８】
ほかのいくつかの研究によれば、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの結合に関係している付加的な成分またはレセプターサブユニットが存在することが示されている（文献１５、１６、１７）。さらには、すでに記載したレセプター（文献１４）はすべてのＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β種の結合に関係していると報告されている（文献１８）。
【０００９】
サイトカイン結合タンパク質（可溶性サイトカインレセプター）は、それらの各自の細胞表面サイトカインレセプターの細胞外リガンド結合ドメインに対応する。それらは、細胞表面レセプターに共通するｍＲＮＡ前駆体のほかのスプライシングによるかまたは細胞表面レセプターのタンパク質分解切断により生じる。これらの可溶性レセプターは、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ（文献１９、２０、２１）、ＴＮＦ（文献２２、２３、２４）、ＩＬ−１（文献２５、２６、２７）、ＩＬ−４（文献２５、２８）、ＩＬ−２（文献２９、３０）、ＩＬ−７（文献３１）およびＩＦＮ−α（文献３２）のほかの可溶性レセプターとともに既に記載されている。
【００１０】
本発明は既知のＩＦＮ−α／β結合タンパク質（イスラエル国特許出願第１０６５９１号明細書参照)をコードするＤＮＡ分子を提供する。これらＤＮＡ分子は、２種の異なるタンパク質、すなわちＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを実際にコードしており、おそらく同一のｍＲＮＡ前駆体に由来し、択一的スプライシングにより２種のｍＲＮＡ分子を生ずるのであろうと考えられる。ｍＲＮＡの一方は約１.５ｋｂの大きさを有し、もう一方は約４.５ｋｂの大きさを有する。そして各々ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩをコードする１.５ｋｂのｍＲＮＡおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードする４.５ｋｂのｍＲＮＡであり、前記結合タンパク質のうちの１つをコードする。「ＩＦＮＡＢ−ＢＰ」という用語はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの両者に対応する。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIとして同定される。
【００１１】
このように、本発明はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの融合タンパク質およびムテイン体、それらの機能的誘導体ならびにそれらの活性画分から選ばれるＩＦＮ−α／β結合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を提供する。
【００１２】
さらに本発明は前記ＤＮＡ分子を含有する複製可能な発現ビヒクル(replicable expression vehicle)、それらビヒクルで形質転換された宿主、前記の形質転換された宿主によって産生されたタンパク質を提供する。「ＤＮＡ分子」という用語はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびそれらの組合せを含む。
【００１３】
本発明は、また、厳密な条件下で前記ＤＮＡ分子とハイブリダイズし、ＩＦＮＡＢ−ＢＰ類と同様の生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子に関する。
【００１４】
本発明は、機能的ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの融合タンパク質、ムテイン体または活性画分を産生しうる宿主細胞の製造法をも提供する。
【００１５】
本発明はさらに組換え体ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの融合タンパク質、ムテイン体または活性画分、これらすべての塩、ならびにＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、これらの融合タンパク質、ムテイン体、活性画分またはこれらすべての塩を含有する医薬組成物を提供する。
【００１６】
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIは、組換え体ヒトＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−βと同様に、天然型のヒト白血球インターフェロンおよび線維芽細胞インターフェロンの生物学的活性を阻害する。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩはリガンド結合ＩＦＮ−α／βレセプターである新規の膜貫通型タンパク質に相当する。ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIは細胞外の、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのリガンド結合ドメインの細胞外に本質的に相当する可溶性レセプターである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの融合タンパク質もしくはムテイン体、それらの機能的誘導体またはそれらの活性画分から選ばれる、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、融合タンパク質およびムテイン体、それらの機能的誘導体またはそれらの活性画分と同一または類似の生物学的活性を有するタンパク質をコードし、前記ＤＮＡ分子と厳密な条件下でハイブリッド形成しうるＤＮＡ分子、成熟ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩをコードする配列からなるＤＮＡ分子、成熟ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードする配列からなるＤＮＡ分子、前述のいずれかのＤＮＡ分子からなり、形質転換体である宿主細胞において、前記ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、それらの融合タンパク質、それらのムテイン体、それらの機能的誘導体、それらの活性画分、ならびに前記ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、それらの融合タンパク質およびムテイン体、それらの機能的誘導体もしくはそれらの活性画分と同一または類似の生物学的活性を有するタンパク質のいずれかを発現しうる、複製可能な発現ビヒクル、前記のいずれかの発現ビヒクルで形質転換された宿主細胞、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、融合タンパク質、ムテイン体、機能的誘導体および活性画分から選ばれる組換えＩＦＮ−α／β結合タンパク質の製造法であって、前記のいずれかの形質転換された宿主細胞を培養し、前記ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を回収することからなる、前記ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の製造法、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、ムテイン体、融合タンパク質、機能的誘導体および活性画分ならびに該結合タンパク質の塩から選択されるＩＦＮ−α／β結合タンパク質、前記のいずれかのＩＦＮ−α／β結合タンパク質からなる医薬組成物ならびにＩＦＮ−α／β結合タンパク質に対する抗体に関する。
【００１８】
【実施例】
イスラエル国特許出願第１０６５９１号明細書によれば、分子量４０,０００を有するＩＦＮ−α／β結合タンパク質（ＩＦＮＡＢ−ＢＰ）が２つのクロマトグラフィーの工程により正常の尿から単離された。ＩＦＮ−α２が結合しているアガロースからなるカラムに粗尿由来タンパク質を流した。カラムを洗浄して関連しないタンパク質を除去し、つぎに結合しているタンパク質を低ｐＨで溶出した。ついで、溶出されたタンパク質をサイズ排除ＨＰＬＣ（size exclusion HPLC）により分析していくつかのタンパク質のピークをえた。そのうちの１つは、¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２と特異的に反応し、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイルス活性をブロックするというその能力によって特徴づけられた。さらにこのタンパク質は、Ｎ末端のマイクロシークエンシング分析（N-terminal microsequence analysis）により、そのＮ末端ドメインに以下で示される主な配列（配列番号１）がえられると特徴づけられた。
【００１９】

【００２０】
主な配列に対応して、マイナーなポリペプチド配列ではあるが、３つの過剰なアミノ酸残基（Ｉｌｅ−ＸＸＸ−Ｔｙｒ）を前記配列番号１のＮ末端にもつ配列が検出された（ＸＸＸは同定されていないアミノ酸を示す）。えられた配列を既知のＩＦＮ−αＢレセプターの配列（文献１４）と比較すると全く異なっていることがわかった。それは、ほかのあらゆる既知のタンパク質とも異なり、ファストＡ（Fast A）プログラムを用いてスイスプロットおよびゲンバンクデータライブラリー（Swissprot and Genbank data libraries）と比較することによって決定したところ、既知のＤＮＡ配列のいずれによってもコードされていなかった（文献３３）。
【００２１】
尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのサンプルをＣＮＢｒで分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜にエレクトロブロットし、そしてえられた分解画分をタンパク質のマイクロシークエンシング分析に付した。画分の１つは１０Ｋより小さい分子量を有し、以下の配列番号２で示される内部の配列を有することがわかった（Ｍｅｔは実際の配列に先行する）。
【００２２】

【００２３】
この内部の配列は適切な制限部位が加えられたセンスおよびアンチセンスプライマーに逆翻訳された。ヒトの細胞から全ＲＮＡを精製し、プライマーとしてアンチセンスオリゴヌクレオチド混合物またはオリゴｄ（Ｔ）のいずれかを用いて、逆転写酵素により第１のｃＤＮＡ鎖を生じさせた。えられたｃＤＮＡ断片は、ついで組合わされたセンスおよびアンチセンス変性プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。３％アガロースゲル上でのＰＣＲ産物の分析により、特定の１０１ｂｐオリゴヌクレオチドのバンドが示された。このＤＮＡは制限酵素により分解され、クローニングベクターであるpBluescript（ストラタジーン(Stratagene)社製）に挿入された。このベクターを用いてコンピテント細胞である大腸菌をトランスフェクトした。数種の独立したクローンの配列が決められた。センスおよびアンチセンスの変性プライマーによるフランキング領域の配列は不変であり、前述の尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＣＮＢｒペプチド（ＣＮＢｒにより分解されたペプチド）（ｃｂ７）から予測される配列をコードしていた。この変性していない内部の配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、末端を標識してｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。
【００２４】
ヒトＨｅＬａ細胞のλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社製）のスクリーニングにより、数種の陽性クローンがえられた。これらのクローンのうち、ｑ１０と称されるクローンは、シグナルペプチドに対応するオープンリーディングフレーム、細胞外ドメイン、膜貫通型ドメインおよび短い細胞質ドメインを有していた。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰからえたペプチドの配列は、ｑ１０によってコードされている細胞外ドメインにすべて存在していた。ペプチド配列のうち少数のアミノ酸残基がタンパク質のシークエンス技術の限界のためにまちがっていた（主に、Ｃｙｓは同定できずＳｅｒに対応するピークが低レベルである）。
【００２５】
ＤＮＡ鋳型としてクローンｑ１０を用いて、ＰＣＲにより特定のプローブを調製するために、クローンｑ１０のヌクレオチド配列２１９〜６１３（図２参照）の末端に対応するセンスおよびアンチセンスプライマーを用いた。えられたＤＮＡを［³²Ｐ］で標識し、２種のヒト細胞系統からえたポリＡ＋鎖ｍＲＮＡのノーザンブロット法によるハイブリダイゼーションに用いた。両方のばあいにおいて、２種の特異的なバンドが観察された。一方は１.５ｋｂのｍＲＮＡに相当し、もう一方は４.５ｋｂのｍＲＮＡに相当した。１.５ｋｂのｍＲＮＡの一次翻訳産物をＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ前駆体と称する。そして４.５ｋｂのｍＲＮＡの一次翻訳産物をＩＦＮＡＢ−ＢＰII前駆体と称する。
【００２６】
前述の特定のプローブを追加のヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用い、２つのグループのｃＤＮＡクローンを同定した。１つのグループ（約２０の個々のクローン）は１.５ｋｂの長さを有し、クローンｑ１０によってコードされる膜貫通型タンパク質の同一の前駆体がコードされていた。もう一方のグループ（２つの個々のクローン）は４.５ｋｂの長さを有していた。これらの大きさは２種のｍＲＮＡ種の大きさと同一であり、したがって１.５ｋｂのｃＤＮＡクローンはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩをコードし、一方の４.５ｋｂのｃＤＮＡクローンはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードしている。４.５ｋｂのクローンを配列決定することにより、それらはクローンｑ１０の１〜２３９コドンに相当する、切断された可溶性レセプター(truncated soluble receptor)の前駆体をコードしていることが示された。しかしながら、２３８および２３９のコドンは異なっており、終止コドンに続いていた。尿由来の分子量４０,０００のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＣ末端をタンパク質のシークエンシング分析すると、最後の２アミノ酸残基により決定されるように、これは４.５ｋｂのｃＤＮＡにコードされていることが示された。したがって尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIであると同定された。ここで、「前駆体」とは、シグナルペプチドを含む一次翻訳産物として定義する。
【００２７】
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの切断された可溶性形態である前駆体をコードするＤＮＡをＰＣＲにより産生した。えられたＰＣＲ産物は、ホ乳類の発現ベクターに挿入され、サルＣＯＳ細胞のような種々のホ乳類細胞へのトランスフェクションに用いられた。このような細胞は高レベルの生物学的活性を有する組換え体可溶性ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現した。
【００２８】
同様に、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの前駆体をコードするＤＮＡをＰＣＲで産生した。えられたＰＣＲ産物をホ乳類の発現ベクターに挿入し、サルＣＯＳ細胞の種々のホ乳類細胞へのトランスフェクションに用いた。このような細胞は高レベルの生物学的活性を有する組換え体ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを発現した。
【００２９】
同様に、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの全前駆体をコードするＤＮＡをＰＣＲ法により産生した。えられたＰＣＲ産物をホ乳類の発現ベクターに挿入し、マウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞のような種々のホ乳類細胞へのトランスフェクションに用いた。このような細胞は高レベルのヒトＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現した。この細胞はヒトＩＦＮ−α２に高親和性（Ｋｄ＝３.６×１０^-9Ｍ）で結合することができた。ヒトＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよび従来クローン化されているヒトＩＦＮ−αＢレセプターＩＦＮＡＲ（文献１４）の両者は、マウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞で共に発現される（co-express）が、混成レセプターの親和性は約１０倍（Ｋｄ＝４×１０^-10Ｍ）まで増加した。それに対して、マウス細胞でヒトＩＦＮＡＲのみが発現されるばあいは、ヒトＩＦＮ−α２の結合を立証することはできなかった。したがって、２種の結びつけられたポリペプチド（一方はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのリガンド結合ドメインを有し、もう一方はＩＦＮＡＲの細胞外ドメインを有する第２のポリペプチド）を含有する混成タンパク質は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰII単独と比べてＩＦＮ−αへのより高い親和性を示すであろう。
【００３０】
尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのヒトＩＦＮ−α２への親和性は、ＢＩＡコアシステム（BIAcore system）、（ファルマシア社製、スウェーデン国）によって決定された。ＩＦＮ−α２をセンサーのチップに固定し、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを結合させた。KonおよびKoff値にもとづき、３.１２×１０^-9ＭのＫｄ値をえた。この値はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いてえられた値ときわめて近似している。
【００３１】
前記クローニング、クローンの単離、同定、特徴づけおよび配列決定手順は以下の実施例においてさらに詳細に記載する。
【００３２】
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIは、ほかのタイプの組換え細胞、たとえば大腸菌のような原核細胞もしくはＣＨＯ、酵母または昆虫細胞のようなほかの真核細胞などによっても産生されうる。組換え体ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを産生するため、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのいずれかをコードするＤＮＡを有し、（たとえば、大腸菌や酵母細胞を）形質転換するまたは昆虫細胞に感染するのに適する、適切なベクターを構築する方法は、当業者によく知られている。たとえば、アウスベル（Ausubel）ら編、「カレント プロトコルズ イン モレキュラー バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）」、カレント プロトコルズ（Current Protocols）（１９９３）およびサムブロック（Sambrook）ら編、「モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル」第２版、コールド スプリングハーバー プレス（Cold Spring Harbor Press）（１９８９）を参照されたい。
【００３３】
本発明はさらにＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの活性ムテイン体および活性画分に関し、野生型のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIからなる融合タンパク質、または、ほかのポリペプチドまたはタンパク質と融合し、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの生物学的活性またはインターフェロンα／βレセプターを共有するほかのサイトカインの生物学的活性をブロックする類似の能力を示す、それらの活性ムテイン体またはそれらの活性画分に関する。
【００３４】
実用的に関連した転写および翻訳調節シグナルならびにＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの活性画分、ムテイン体もしくは融合タンパク質をコードするＤＮＡを、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体に組込むことのできる真核のベクターに挿入する。導入されたＤＮＡをそれらの染色体に安定に組込んだ細胞を選択できるようにするために、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１またはそれより多くのマーカーを用いる。マーカーは栄養素要求性宿主への原栄養、抗生物質などの生物致死剤耐性または銅などの重金属に対する耐性などを提供してもよい。選択しうるマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結するか、またはコトランスフェクション（cotransfection）により同一細胞に導入されうる。一本鎖の結合タンパク質をコードするｍＲＮＡの最適合成のためにさらなる要素が必要とされてもよい。これらの要素は転写プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナル(terminalion signals)と同様にスプライスシグナルを含有してもよい（文献３４）。
【００３５】
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIタンパク質、それらの活性画分または誘導体の発現のために、選択される細胞に導入されるべきＤＮＡ分子は、レシピエント宿主（recipient host）中で自律的複製が可能なプラスミドまたはウイルスベクターに取込まれるのが好ましいであろう。
【００３６】
特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際に重要な要因は以下のことが含まれる。ベクターを含むレシピエント細胞が認識され、ベクターを含まないレシピエント細胞から選択されうることが容易であること、特定の宿主でベクターのコピー数が希望どおりになること、および異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル（shuttle）」できることを望むかどうかである。好ましい原核ベクターは、たとえばｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４などの大腸菌中で複製しうるプラスミド（文献３５）、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などのバチルス（Bacillus）プラスミド（文献３６）、ｐＩＪ１０１を含むストレプトマイセス（Streptomyces）プラスミド（文献３７）、φＣ３１などのストレプトマイセス（Streptomyces）バクテリオファージ（文献３８）およびシュードモナス（Pseudomonas）プラスミド（文献３９、４０）などがあげられる。好ましい真核プラスミドとしては、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−ミクロンサークルなどやそれらの誘導体などがあげられる。このようなプラスミドは当業者によく知られているものである（文献４１、４２、４３、４４、４５）。
【００３７】
一旦構築物（construct(s)）を含有するベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために調製されると、この発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション（lipofection）、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、ダイレクトマイクロインジェクションなどの種々の適切な手段のいずれかにより適切な宿主細胞に導入されうる。
【００３８】
本発明で用いられる宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれでもよい。好ましい原核細胞の宿主としては、大腸菌、バチルス、ストレプトマイセス、シュードモナス、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）などの細菌があげられる。最も好ましい原核細胞の宿主は大腸菌である。とくに興味深い細菌の宿主としては、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ^-、λ^-、光合成(phototropic)（ＡＴＣＣ ２７３２５））、サルモネラ チフィムリウム（Salmonella typhimurium）もしくはセラチア ナルセッセンス（Serratia narcescens）などの他の腸内細菌および様々のシュードモナス種があげられる。このような条件下ではタンパク質はグリコシル化されないであろう。原核細胞の宿主は発現プラスミドのレプリコンおよびコントロール配列に適合しなければならない。
【００３９】
しかしながら、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIはグリコシル化されるタンパク質なので、真核細胞の宿主は原核細胞の宿主よりも好ましい。好ましい真核細胞の宿主としては、たとえばヒト、サル、マウス、チャイニーズハムスターオーバリー（ＣＨＯ）細胞などのホ乳類の細胞があげられる。なぜなら、これらの細胞は、正しい部位でのグリコシル化と同様、正しい折りたたみ、正しいジスルフィド結合形成を含むタンパク質分子への翻訳後の修飾を行うからである。また、酵母細胞および昆虫細胞は高レベルのマンノースのグリコシル化を含む翻訳後のペプチド修飾を行うことができる。酵母細胞でおよび昆虫細胞で所望のタンパク質の産生のために利用することができる、強力なプロモーター配列と多数のプラスミドのコピーを利用する多くのＤＮＡ組換え法が存在する。酵母細胞はクローン化されたホ乳動物の遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチドを分泌する。ベクターの導入後、宿主細胞はベクター含有細胞の成長を選択する選択培地で増殖する。クローン化された遺伝子配列の発現の結果、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの融合タンパク質、ムテイン体、活性画分が産生される。ついで、発現したタンパク質は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などの従来のあらゆる手法により、または抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩモノクローナル抗体が固定されたゲルマトリックスを充填したカラムを用いてアフィニティクロマトグラフィーを行うことにより単離され精製される。前記組換え体ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの活性画分または誘導体を含有する粗な調製物をカラムに流すと、不純物はカラムを通過するであろうが、前記組換え体ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの活性画分または誘導体は特異的な抗体によりカラムに結合するであろう。洗浄ののち、溶出のために通常用いられる条件、すなわち高または低ｐＨ、たとえばｐＨ１１または ｐＨ２でタンパク質をゲルから溶出する。
【００４０】
ここで、「ムテイン体」という用語は、野生型のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分と比較してえられた産物の活性を著しく変更することなく、天然のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分の１またはそれより多くのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置換されるか削除される、または１またはそれより多くのアミノ酸残基がＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの天然型の配列に追加される、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの類似体を意味する。これらのムテイン体は既知の合成および／または部位特異的（site-directed）変異誘発技術によって、またはそれらに適したほかの既知の技術により調製する。 このようなムテイン体は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分と実質的に類似の活性を有するようなＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのアミノ酸と充分に重複するアミノ酸配列を有することが好ましい。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの活性の１つは、組換え体ヒトＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−βと同様に、天然のヒト白血球および線維芽細胞インターフェロンのような１またはそれより多くのＩ型インターフェロンに結合する能力である。ムテイン体が１またはそれより多くのこのようなインターフェロンに対して実質的に結合活性を有するかぎり、アフィニティクロマトグラフィーの手段によるなどのそのようなインターフェロンの精製に用いることが可能であり、したがってムテイン体がＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIと実質的に類似の活性を有すると考えられうる。したがって、ラジオイムノアッセイやＥＬＩＳＡのような、適切に標識されたインターフェロンにムテイン体が結合するかどうかを決定するための、たとえば単純なサンドイッチ競合検定法にそのようなムテイン体を付すことからなるルーチンの実験手段により、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIと実質的に同様な活性を有するムテイン体がえられたかどうかを決定することができる。Ｉ型インターフェロンのいかなる種にも結合するムテイン体はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの充分な活性を保ち、少なくとも１つのＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの開示された有用性をもち、したがってそれらを実質的に類似した活性をもつので、このテストは数種のＩ型インターフェロンを用いて繰り返し行われるべきである。
【００４１】
好ましい具体例では、このようなムテイン体のいずれもＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのいずれかの配列と少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。さらに好ましくは、それらと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性または相同性を有するものである。
【００４２】
本発明で用いられうるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの活性画分のムテイン体、またはそれらをコードする核酸は、ここに記載の技術および説明にもとづいて、過度の実験を行なうことなく当業者によって通常通りにえられうる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドのように実質的に対応する限られたセットの配列を含む。タンパク質の化学的性質および構造の詳しい記載については、シュルツ、ジーイー（Schulz, G.E.）ら著、「プリンシプルズ オブ プロテイン ストラクチャー（Principles of Protein Structure）」スプリンガー−ベーラグ（Springer-Verlag）、ニューヨーク、１９７８年およびクリートン、ティー イー（Creighton, T.E.）著、「プロテインズ：ストラクチャー アンド モレキュラー プロパティ（Proteins:Structure and Molecular Properties）」ダブリュー エイチ フリーマン アンド コー（W.H. Freeman & Co.）、サンフランシスコ、１９８３年を参照されたい。コドン プリファレンス（codon preference）のようなヌクレオチド配列の置換の説明については、アウスベル（Ausubel）ら著、同上、セクションＡ．１．１〜Ａ．１．２４およびサムブロックら著、同上、アペンディセス(Appendices)ＣおよびＤを参照されたい。
【００４３】
本発明のムテイン体に好ましい変更は「保存的」置換として知られている変更である。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの活性画分の保存的アミノ酸置換は、充分に類似の物理化学的性質を有する群のうちの同義アミノ酸を含む。これは群の構成要素間の置換は分子の生物学的機能を保つであろうということである（グランタム（Grantham）著、サイエンス、１８５巻、８６２〜８６４頁（１９７４年）参照）。アミノ酸の挿入および削除は、また、それらの機能を変えることなく、前述で定義した配列で行われてもよく、とくに挿入または削除が少数のアミノ酸、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のみであり、機能的なコンホメーションに重要な（critical）アミノ酸（たとえばシステイン残基）の除去または置換(displace)がないばあいに行われてもよいことは明らかである（アンフィンセン（Anfinsen）著、「プリンシパルズ ザット ガバン ザ ホールディング オブ プロテイン チェインズ（Principles That Govern The Folding of Protein Chains）」サイエンス、１８１巻、２２３〜２３０頁（１９７３年）参照）。このような削除および／または挿入によって産生されたタンパク質およびムテイン体は、本発明の範囲に含まれる。
【００４４】
表１に好ましい同義アミノ酸の群を示す。さらに、表２により好ましい同義アミノ酸の群を示す。表３に最も好ましい同義アミノ酸の群を示す。
【００４５】
【表１】

【００４６】
【表２】

【００４７】
【表３】

【００４８】
本発明に用いるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの活性画分のムテイン体をうるために用いられうるタンパク質において、アミノ酸置換を産生する具体例としてはマーク(Mark)らによる米国再発行特許第３３，６５３号、米国特許第４，９５９，３１４号、同第４，５８８，５８５号および同第４，７３７，４６２号各明細書、コス(Koths)らによる米国特許第５，１１６，９４３号明細書、ネーメン(Namen)らによる米国特許第４，９６５，１９５号明細書、チョン(Chong)らによる米国特許第４，８７９，１１１号明細書およびリー(Lee)らによる米国特許第５，０１７，６９１号明細書に記載されており、リジン置換タンパク質については、（ショウ(Shaw)らによる）米国特許第４，９０４，５８４号明細書に記載されているような既知の方法工程がある。
【００４９】
本発明のほかの好ましい実施態様において、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分のあらゆるムテイン体はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのアミノ酸配列に本質的に対応するアミノ酸配列を有する。ここで、「本質的に対応する」という用語は、天然のタンパク質の基本的な性質に影響を与えない、とくに、１またはそれより多くのＩ型インターフェロンに結合するそれらの能力が関与し、それによりin situで天然のＩ型インターフェロンレセプターにＩ型インターフェロンが結合するのを阻害する能力があるかぎり、天然のタンパク質の配列のマイナーな変更を有するタンパク質を含むことを意図する。「本質的に対応する」という表現に含まれると一般的に考えられる変更のタイプは、結果的にきわめて少ないマイナーな修飾がおこり、所望の活性を前記方法でスクリーニングする、通常の突然変異誘発技術をこれらタンパク質をコードするＤＮＡに用いたばあいにえられるであろうタイプである。
【００５０】
本発明のムテイン体は、本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードするＤＮＡまたはＲＮＡと厳密な条件でハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸によりコードされるタンパク質を含む。また、本発明は所望の核酸の同定および精製にプローブとしても有用である核酸も包含する。さらに、このような核酸は本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの機能的な活性を保持するポリペプチドをコードするかどうかを決定するための重要な候補となりうる。「厳密な条件」という用語は、当業者が通常「厳密な（stringent)」として用いている、ハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄の条件のことを意味する（アウスベルら著、「カレント プロトコルズ イン モレキュラー バイオロジー (Current Protocols in Molecular Biology)」、同上、インターサイエンス(Interscience)、ニューヨーク、セクション６．３および６．４（１９８７年、１９９２年）およびサムブロックら著、同上、参照）。限定されないが、厳密な条件の具体例としては、たとえば２×ＳＳＣおよび０.５％ＳＤＳ、５分間、２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ、１５分間、０.１×ＳＳＣおよび０.５％ＳＤＳ、３７℃、３０〜６０分間そののちに０.１×ＳＳＣおよび０.５％ＳＤＳ、６８℃、３０〜６０分間における試験下において理論値Ｔｍのハイブリッドを下まわる１２〜２０℃の洗浄条件があげられる。また、厳密な条件とは、ＤＮＡ配列、（１０〜４０塩基のような）オリゴヌクレオチドプローブまたは混合したオリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存すると当業者は理解している。混合プローブが用いられるばあいは、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を用いるのが好ましい（アウスベル著、同上、参照）。
【００５１】
「融合タンパク質」という用語は、たとえば体液中での残存時間が延長された、ほかのタンパク質と融合されたＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分もしくはそれらのムテイン体からなるポリペプチドを意味する。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分は、たとえばイムノグロブリンまたはそれらの断片などのほかのタンパク質、ポリペプチドなどと融合してもよい。
【００５２】
ここで「塩」という用語は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの活性画分、ムテイン体または融合タンパク質のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両者を意味する。カルボキシル基の塩は、当該技術分野の既知の方法によって形成されてもよく、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛などの無機塩および、たとえばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのようなアミンを用いて形成されたような有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩としては、たとえば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩およびたとえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩を含む。もちろん、このようなあらゆる塩は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分と実質的に同様の活性を有さなければならない。
【００５３】
「機能的誘導体」は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分、それらのムテイン体および融合タンパク質の誘導体を含み、それらは当該技術分野の既知の方法により、残基の側鎖またはＮ末端基もしくはＣ末端基として生じる機能性基から調製されてもよく、それらが薬学的に許容しうるかぎり、すなわちそれらがＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの活性と実質的に同様であるタンパク質の活性を壊さず、それを含有する組成物に毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。これらの誘導体は、たとえば抗原部位を覆い、体液中でＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分の残存を延長するポリエチレングリコール側鎖を含んでもよい。ほかの誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアとまたは第１級もしくは第２級アミンと反応することによるカルボキシル基のアミド、アシル部分（moiety）（たとえば、アルカノイル基またはカルボサイクリックアロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離の水酸基（たとえば、セリルまたはスレオニル残基の水酸基）のＯ−アシル誘導体が含まれる。
【００５４】
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、ムテイン体および融合タンパク質の「活性画分」とは、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIと実質的に同様の活性を有し、本発明ではタンパク質分子またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのあらゆる断片を含有する融合タンパク質を、単独でまたは関連する分子もしくはそれらと結合する残基（たとえば糖またはリン酸塩の残基）が結合したもののポリペプチド鎖のあらゆる断片もしくは前駆体または前記タンパク質分子のあらゆる集合体が含まれる。
【００５５】
さらに、本発明は薬学的に許容しうる担体および本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性ムテイン体、融合タンパク質およびそれらの塩、それらの機能的誘導体または活性断片からなる医薬組成物に関する。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの誘導体を生理学的に許容しうる担体、および／または安定剤および／または賦形剤とを混合することにより、投与用に調製され、投与形態；たとえば投与バイアルに凍結乾燥することにより調製される。投与方法は同様の薬剤について許容されうる投与形態のいずれでも可能であるが、処置される条件、たとえば静脈内、筋肉内、皮下に投与、局所的に注射するかまたは局所的に適用するか、または点滴によって投与するかなどによる。活性のある化合物の投与量は投与経路、治療される疾患、患者の状態による。局所的に注射するばあいは、たとえば静脈内注射のばあいよりも体重に対してより少量のタンパク質が要求される。
【００５７】
イスラエル国特許出願第１０６５９１号明細書に記載のとおり、ＩＦＮα／β結合タンパク質（または本明細書で称されるＩＦＮＡＢ−ＢＰII）は、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−β（ＩＦＮ−γではない）の抗ウイルス活性を阻害し、このことはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIが一般的なＩ型ＩＦＮ結合タンパク質であることを示している。このように、これらは種々のＩＦＮ−αサブタイプおよびＩＦＮ−βの生物学的活性の調節またはブロックに有用である。たとえばＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの異常な発現が見られる、Ｉ型糖尿病、種々の自己免疫疾患、移植拒絶、エイズおよび類似の疾患に有用である。すなわち、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIは過剰のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが細胞内に産生されるかまたは細胞外から投与される状態に用いられうる。
【００５８】
したがって、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの活性断片、ムテイン体、融合タンパク質およびそれらの塩、機能的誘導体ならびにそれらの活性断片が、自己免疫疾患の治療、ホ乳類におけるほかの炎症の治療、ＩＦＮ−αまたはβを投与することによって生ずる毒性の治療、若年性糖尿病、紅斑性狼瘡およびエイズの治療に必要であることが示される。
【００５９】
また、前述のように本発明のタンパク質は、Ｉ型インターフェロン類の精製などの非治療的有用性をも有する。
【００６０】
本発明は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能的誘導体および活性断片に対する抗体をも含む。
【００６１】
「抗体」という用語は、可溶性または結合形態で標識されうるポリクローナル抗体類、モノクローナル抗体類（以下、Ｍａｂｓと略す）、キメラ抗体類、抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を意味し、また、酵素分解、ペプチド合成または組換え技術に限られず、既知の技術により提供されるそれらの活性断片も同様に意味する。
【００６２】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。モノクローナル抗体は抗原に対して特異的な実質的に均一な抗体の集団であり、この集団は実質的に類似のエピトープ結合部位を含む。Ｍａｂｓは当業者に知られている方法によりえられうる（コフラー(Kohler)およびミルシュタイン(Milstein)著、ネイチャー、２５６巻、４９５〜４９７頁、１９７５年、米国特許第４，３７６，１１０号明細書、アウスベルら編、同上、ハーロー(Harlow)およびレーン(Lane)、「アンチボディーズ：ア ラボラトリー マニュアル（ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL)」、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー、１９８８年、およびコーリガン(Colligan)ら編、「カレントプロトコルズ イン イムノロジー (Current Protocols in Immunolgy)」、グリーン パブリッシング アソーシエイト アンド ウィリー インターサイエンス(Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience)、ニューヨーク、（１９９２、１９９３年）を全体的に参照されたい）。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ギルド(GILD)およびそれらのサブクラスを含むイムノグロブリンのクラスのいずれであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはin vitro、in situまたはin vivoで培養されてもよい。in vivoまたはin situにて高力価のＭａｂｓが産生されることにより、本願発明の方法は現時点での好ましい産生法であるということが示される。
【００６３】
キメラ抗体は、マウスＭａｂ由来の可変領域とヒトイムノグロブリンの定常領域とを有するような、異なる動物種由来の異なる部分からなる分子である。キメラ抗体は、適用の際には免疫原性を減少させるため、そして産生の際には収率を高めるためにおもに用いられる。たとえば、ハイブリドーマからマウスのＭａｂｓが多量にえられるが、ヒトに対しては免疫原性が高いばあいに、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体が用いられる。キメラ抗体およびそれらの産生法は当該技術分野で知られている（キャビリー(Cabilly)ら著、プロシーディング ナチュラル アカデミー オブ サイエンス (Proc. Natl.Acad.Sci.) 、米国、８１巻、３２７３〜３２７７頁（１９８４年）、モーリソン(Morrison)ら著、プロシーディング ナチュラル アカデミー オブ サイエンス、米国、８１巻、６８５１〜６８５５頁（１９８４年）、ボーリアン(Boulianne)ら著、ネイチャー、３１２巻、６４３〜６４６頁（１９８４年）、キャビリー(Cabilly)ら著、欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書（１９８４年１１月１４日に公開）、ヌーベルガー(Neuberger)ら著、ネイチャー３１４巻、２６８〜２７０頁（１９８５年）、タニグチ(Taniguchi)ら著、欧州特許出願公開第１７１４９６号明細書（１９８５年２月１９日に公開）、モーリソンら著、欧州特許出願公開第１７３４９４号明細書（１９８６年３月５日に公開）、ヌーベルガーら著、ＰＣＴ出願(PCT Application)ＷＯ ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日に公開）、クドー(Kudo)ら著、欧州特許出願公開第１８４１８７号明細書(１９８６年６月１１日に公開）、モーリソンら著、欧州特許出願公開第１７３４９４号明細書（１９８６年３月５日に公開）、サーガン(Sahagan)ら著、ジェイ イムノル(J. Immunol.)１３７巻、１０６６〜１０７４頁（１９８６年）、ロビンソン(Robinson)ら著、国際特許公開(International Patent Publication)、ＷＯ ９７０２６７１（１９８７年５月７日に公開）、リウ(Liu)ら著、プロシーディング ナチュラル アカデミー オブ サイエンス、米国、８４巻、３４３９〜３４４３頁（１９８７年）、サン(Sun)ら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４巻、２１４〜２１８頁（１９８７年）、ベター(Better)ら著、サイエンス、２４０巻、１０４１〜１０４３頁（１９８８年）、ハーローおよびレーン著、アンチボディーズ：ア ラボラトリー マニュアル、同上を全体的に参照されたい）。
【００６４】
抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般的には結合する唯一の決定基を認識する抗体である。イディオタイプ（Ｉｄ）抗体は、同じ種および遺伝タイプ（たとえば、マウス系統）の動物をモノクローナル抗体のソースとして、抗イディオタイプが調製されているモノクローナル抗体を用いて免疫することにより調製されうる。免疫された動物は、これらのイディオタイプの決定基に対する抗体を産生することにより、免疫している抗体のイディオタイプの決定基を認識し反応するであろう（たとえば、米国特許第４，６９９，８８０号明細書を全体的に参照されたい）。
【００６５】
また、抗イディオタイプ抗体はまた別の動物における免疫反応を引き起こす「免疫原」として用いられてもよく、いわゆる抗イディオタイプ抗体に対する抗体(anti-anti-Id antibody)を産生する。抗イディオタイプに対する抗体は抗イディオタイプ抗体に対する抗体を誘導したオリジナルのモノクローナル抗体とエピトープについて同じでありうる。このように、モノクローナル抗体のイディオタイプの決定基に対する抗体を用いることによって、同一の特異性を有する抗体を発現するほかのクローンを同定することが可能となる。
【００６６】
したがって、本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIおよび関連するタンパク質に対して生じたモノクローナル抗体がＢＡＬＢ／Ｃマウスのような適切な動物に抗イディオタイプ抗体を誘導するために用いうる。そのような免疫されたマウスからえた脾臓細胞を抗イディオタイプＭａｂｓを分泌する抗イディオタイプハイブリドーマを産生するために用いる。さらに、抗イディオタイプＭａｂｓはキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体とカップリングさせて、さらなるＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫することに用いることができる。これらのマウスの血清は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIエピトープに特異的なオリジナルのモノクローナル抗体の結合特性を有する抗イディオタイプ抗体に対する抗体を含有するであろう。
【００６７】
このように、抗イディオタイプＭａｂｓは、それら自身にイディオタイプのエピトープを有するか、またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのような、評価されているエピトープと構造的に類似する「イディオトープ」を有する。
【００６８】
「抗体」という用語は、抗原と結合しうる、たとえばＦａｂおよびＦ（ａｂ´）₂ などのそれらの活性断片と同様に両方のインタクトな分子を含有することをも意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ´）₂ 断片はインタクトな抗体のＦｃ断片を欠いており、循環血からより速く消え、インタクトな抗体よりも非特異的に組織に結合することがないようである（ワール（Wahl）ら著、ジェー ヌクル メド（J. Nucl. Med.）２４巻、３１６〜３２５頁（１９８３年）参照）。
【００６９】
本発明に有用な抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ´）₂ ならびにほかの断片がインタクトな抗体分子のためにここに開示した方法にしたがって、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIおよび関連タンパク質の検出および定量に用いられうることは明らかであろう。このような断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ´）₂ 断片を産生するため）などの酵素を用いてタンパク質の分解を行なうことにより典型的に産生される。
【００７０】
分子と特異的に反応することができ、それにより前記分子が抗体と結合するばあい、前記抗体は前記分子を「結合しうる」といわれる。「エピトープ」という用語は、抗体によって結合されることができ、前記抗体によっても認識されうる、あらゆる分子の部分を意味する。エピトープまたは「抗原決定基」は通常、アミノ酸または糖の側鎖などの化学的に活性のある表面の群性体(grouping)基からなり、特定の電荷特性と同様に特定の三次元構造の特徴を有する。
【００７１】
「抗原」は、動物に付加的に抗原のエピトープに結合できる抗体を産生させることができる抗体により結合されうる、分子またはその部分である。抗原は１またはそれより多くのエピトープを有していてもよい。前述の特異的な反応とは、高度な選択性で抗原がそれに対応する抗体と反応するが、ほかの抗原によって引き出されうるほかの多数の抗体とは反応しないことを意味する。
【００７２】
本発明に有用な、抗体の断片を含む抗体は、サンプル中のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたは関連タンパク質を定量的にまたは定性的に検出するために、または、本発明のそれらのタンパク質を発現する細胞の存在を検出するために用いられてもよい。これは、蛍光的に標識された抗体（以下参照）を用いる免疫蛍光法と光学顕微鏡を用いる検出、フローサイトメトリックを用いる検出または蛍光光度計を用いる検出とを組み合わせることにより達成可能である。
【００７３】
本発明に有用な抗体（またはそれらの断片）は、本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIおよび関連タンパク質のin situの検出のために免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡(immunoeletron microscopy)におけるように組織学的に用いられてもよい。in situの検出は、患者から組織学的標本を採取し、標識された本発明の抗体をそのような標本に提供することによって達成されてもよい。抗体（または断片）は、標識された抗体（または断片）を生物学的なサンプルに適用するかまたはおおう(overlay)ことによって好ましくは提供される。このような手順を用いることにより、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたは関連タンパク質の存在のみならず検査される組織におけるその分布までも決定することが可能となる。当業者ならば、本発明を用いると、そのようなin situの検出を行なうために（染色手順などの）組織学的方法のあらゆる広範な変法を修飾することができるということを容易に理解するであろう。
【００７４】
本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたは関連タンパク質に対するこれらの検定法は、典型的には、生物学的液体、組織抽出物、リンパ球または白血球などの新しく採取した細胞または組織培養でインキュベートされていた細胞などの生物学的サンプルを、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたは関連タンパク質を同定しうる、検出可能であるように標識された抗体の存在下で、インキュベートし、当該技術分野でよく知られている数多くの技術のいずれかにより抗体を検出することからなる。
【００７５】
生物学的サンプルをニトロセルロースなどの固相支持体または担体、もしくは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化しうるほかの固体の支持体または担体で処理してもよい。そして支持体または担体を適切な緩衝液で洗浄したのちに、検出可能なように標識された本発明の抗体で処理する。そののちに、固相支持体または担体を結合していない抗体を除去するためにさらに緩衝液で洗浄してもよい。前記固相支持体または担体上の結合している標識量はついで通常の手段によって検出されてもよい。
【００７６】
「固相支持体」、「固相担体」、「固体の支持体」、「固体の担体」、「支持体」または「担体」とは、抗原または抗体を結合しうるあらゆる支持体または担体を意図する。よく知られた支持体または担体としては、たとえばガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然のまたは修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド類、アガロースおよび磁鉄鉱などがあげられる。担体の性質は、本発明の目的のためには、ある程度可溶性であるかまたは不溶性でありうる。支持体の材料は、カップリングされる分子が抗原または抗体と結合しうる限り、実質的に可能なあらゆる構造の形状(configuration)を有していてもよい。したがって、支持体または担体の形状は、ビーズにおけるような球状、もしくは試験管の内部表面または棒の外部表面におけるような円筒状であってもよい。また、表面はシート、テストストリップなどのように平らであってもよい。好ましい支持体または担体としては、たとえばポリスチレンビーズがあげられる。当業者であれば、抗体または抗原の結合に適したほかの多くの担体を知っているであろうし、またルーチンの実験作業を用いることにより同じことを突きとめることができるであろう。
【００７７】
本発明の所定のロットの抗体の結合活性は、充分に既知の方法により決定されうる。当業者であれば、ルーチンの実験を行なうことにより、各決定に対して実施できて最適な検定法の条件を決定することができるであろう。
【００７８】
洗浄、撹拌、振とう、ろ過などのほかの工程は、通常どおりにまたは特定の状況に必要な工程を検定法に追加してもよい。
【００７９】
本発明の抗体を検出可能となるように標識する方法の１つは、抗体と酵素とを結合させることであり、これは酵素免疫法（ＥＩＡ）に用いられる。この酵素は、順次、適切な基質にのちにさらされると、分光光度手段、蛍光測定手段または視覚的手段により検出されうる化学部分(chemical moiety)を産生するような様式で基質と反応する。抗体を検出されうるように標識するために用いることができる酵素としては、たとえばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、三炭糖リン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼなどがあげられる。検出は、酵素に対して色素の基質を用いる比色法によって達成されうる。また、検出は基質との酵素反応の程度を類似して調製された標準品と視覚的に比較することにより達成されてもよい。
【００８０】
検出はほかの免疫検定法のあらゆる変法を用いて行なわれてもよい。たとえば、抗体または抗体の断片を放射能で標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いてＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの検出が可能である。ＲＩＡについての適切な記載は、ワーク、ティー エス(Work, T.S.)ら著、「ラボラトリー テクニックズ アンド バイオケミストリー イン モレキュラー バイオロジー(Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology)」、ノース ホーランド パブリッシング カンパニー(North Holland Publishing Company)、ニューヨーク（１９７８年）、とくにチャード、ティー(Chard, T.)による「アン イントロダクション トゥ ラジオイムン アッセイ アンド リレイテッド テクニックズ（An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques)」の章に記載されている。ラジオアイソトープは、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いる手段によるかまたはオートラジオグラフィーによって検出されうる。
【００８１】
また、本発明の抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光的に標識された抗体が適した波長の光にさらされると、蛍光のためにその存在が検出されうる。最も一般的に用いられている蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミンなどがあげられる。 さらに、抗体は¹⁵²Ｅｕ、またはランタニド系などの蛍光発光金属を用いて検出可能となるように標識されうる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタアセティックアシッド（ＥＴＰＡ）のような金属のキレート基を用いて抗体に結合されうる。
【００８２】
抗体は、ビオチンとカップリングすることにより検出可能となるよう標識されうる。ビオチン化抗体は、ついで蛍光化合物とペルオキシダーゼなどの酵素と、または放射性アイソトープなどとカップリングされるアビジンもしくはストレプトアビジンによって検出されうる。
【００８３】
抗体は、化学発光化合物とカップリングすることにより、検出可能となるよう標識されることも可能である。化学発光物が標識された抗体の存在は、ついで化学反応の過程の間に生ずる発光の存在を検出することにより決定される。とくに有用な化学発光標識化合物としては、たとえばルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル(theromatic acridinium ester)、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルがあげられる。
【００８４】
同様に、生物学的発光化合物が本発明の抗体の標識に用いられてもよい。生物学的発光とは、触媒のタンパク質が化学発光反応の効率を増大する生物学的システムにみられる化学発光反応のタイプである。生物学的発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識するために重要な生物学的発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリン(aequorin)などがあげられる。
【００８５】
本発明の抗体分子は、「トゥ−サイト(two-site)」または「サンドイッチ」法としても知られている、免疫測定検定法(immunometric assay)に利用するのに適用されてもよい。典型的な免疫測定検定法では、標識していない多量の抗体（または抗体の断片）を固体の支持体または担体に結合し、検出可能となるように標識した多量の可溶性抗体を加えて固相抗体、抗原および標識抗体間で形成された３成分系の複合体を検出および／または定量する。
【００８６】
典型的で好ましい免疫測定検定法としては、固相に結合した抗体をまず被験サンプルに接触させ、２元の固相、抗体−抗原複合体の形成によってサンプルから抗原を抽出する、「順向の(forward)」検定法があげられる。適した期間インキュベートしたのち、固体の支持体または担体を洗浄して、もしあれば、未反応の抗原を含む液体サンプルの残りを除去し、そののちに未知量の標識抗体（「レセプター分子」として働く）を含む溶液と接触させる。標識されていない抗体により固体の支持体または担体に結合された抗原と標識抗体とを複合体にするために２回目のインキュベーションを行なったのちに、未反応の標識抗体を除去するためにさらに洗浄を行なう。
【００８７】
本発明の抗原を用いるとまた有用でありうる、「サンドイッチ」法のほかのタイプでは、いわゆる「同時の」および「逆の(reverse)」検定法が用いられる。「同時の」検定法は、固体の支持体または担体に結合している抗体と標識抗体とがともに同時に被験されるサンプルに加えられるような、１回のインキュベーション工程からなる。インキュベーションが完了すると、固体の支持体または担体を洗浄し、液体サンプルの残渣と複合体に形成されなかった標識抗体を除去する。そののち、固体の支持体または担体と結合していない標識抗体の存在を従来の「順向の」サンドイッチ検定法で行なわれるように決定する。
【００８８】
「逆の」検定法では、まず液体サンプルに標識抗体の溶液を段階的に加え、適したインキュベーション期間ののちに固体の支持体または担体に結合している標識されていない抗体を加える。２回目のインキュベーションののちに、通常の方法で固相を洗浄し、被験されるサンプルおよび未反応の標識抗体の溶液の残りを除去する。固体の支持体または担体に結合した標識抗体の決定は、「同時の」検定法および「順向の」検定法におけるように行なわれる。
【００８９】
本発明は、前述で定めた本発明のタンパク質のいずれをもコードするＤＮＡ分子類、それらＤＮＡ分子類のいずれかからなる複製可能な発現ビヒクル類、それら発現ビヒクルのいずれかで形質転換された、原核または真核細胞の宿主細胞、好ましくはサルＣＯＳ細胞を含む宿主細胞をも提供する。
【００９０】
さらに、本発明は、本発明の形質転換された細胞を培養し、そのような形質転換された宿主細胞内でＤＮＡ分子および発現ビヒクルにコードされたタンパク質を回収することにより本発明のタンパク質のいずれをも産生する方法をも提供する。
【００９１】
以下に図面について詳細に説明する。
【００９２】
図１は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩとＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのクローニング計画を示す。
【００９３】
（ａ）中列
尿由来の分子量４０,０００のＩＦＮＡＢ−ＢＰからえられた内部のＣＮＢｒペプチド（２７アミノ酸残基、ｃｂ７）の配列（配列番号２）である。
【００９４】
上列および下列
上列には合成センスを、下列にはアンチセンスを示す。これらはペプチド配列にもとづいて作製され、逆転写（アンチセンスプライマーのみ）とポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称す）に用いられる変性オリゴヌクレオチド混合物である。
【００９５】
（ｂ）前記センスおよびアンチセンスプライマーを用いてえられたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。以下のＲＮＡ類とプライマー類はＰＣＲのための鋳型として用いられたｃＤＮＡを産生するために用いられた：
（１）Ｄａｕｄｉ細胞のポリＡ＋ＲＮＡ、アンチセンスプライマー
（２）Ｄａｕｄｉ細胞のポリＡ＋ＲＮＡ、オリゴｄ（Ｔ）プライマー
（３）ＷＩＳＨ細胞の全ＲＮＡ、アンチセンスプライマー
ＤＮＡマーカーの大きさ（bp）は左側に示す。
【００９６】
（ｃ）上列
１０１ｂｐのＰＣＲ産物のpBluescriptクローンからえられた、配列の非変性部分を示す。
【００９７】
下列
えられた非変性ＤＮＡ配列のペプチドｃｂ７（残基９〜２０）の配列の一部である予測された配列への翻訳の結果を示す。
【００９８】
図２は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのｃＤＮＡを有するクローンｑ１０のｃＤＮＡおよび翻訳されたポリペプチドの配列（配列番号６）を示す。
【００９９】
このクローンは、ヒトＨｅＬａの細胞のｃＤＮＡから作製された、λｇｔ１１ライブラリーから、図１（ｃ）の非変性ＤＮＡ配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングすることにより単離された。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＮ末端およびそのＣＮＢｒペプチドに相当する配列には下線を引き、対応する配列名はその線の下に記載している（ｎ１はＮ末端１、ｎ２はＮ末端２、ｃｂ３はＣＮＢｒペプチド３、ｃｂ６はＣＮＢｒペプチド６、ｃｂ７はＣＮＢｒペプチド７を表わす）。シグナルペプチドおよび膜貫通型ドメイン（ｔｍ）に相当する疎水性配列には二重線が引かれている。右側の強調した太さの数字（下段）はアミノ酸残基の数字である。そのままの太さの数字（上段）は、ＡＴＧのイニシエーターＡを１番目とするヌクレオチド残基に対応する数字である。
【０１００】
図３は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの配列に共通する特異的なプローブを用いたノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの検出を示す。
【０１０１】
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの２１８〜６１４ヌクレオチドに対応する３９７塩基対（ｂｐ）プローブを適切なプライマーを用いてＰＣＲにより調製し、ランダムプライマー標識法により［³²ｐ］のラベル化を行った。ヒトＤａｕｄｉ細胞からえられたポリＡ＋ＲＮＡをアガロース（１.５％）上で電気泳動し、ニトロセルロースにブロッティングし特異的なプローブを用いてハイブリダイズすることにより分析した。ｒＲＮＡの大きさは右側に示されている。
【０１０２】
図４は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩに相当する完全な１.５kb ｃＤＮＡクローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。１つの文字コードで示されるアミノ酸残基は、翻訳開始コドンから始まって強調した太さの数字（下段）で番号をつける。疎水性リーダーおよび膜貫通領域には下線を付している。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＮ末端のタンパク質の配列（コドン２７から）および内部のＣＮＢｒペプチドはドットの下線を付している（しかしながら、ＣｙｓおよびＮ−グリコシル化されたＡｓｎ残基は検出することができない）。Ｎ−グリコシル化シグナルは星印によって示され、ポリアデニル化シグナルは二重線によって示す。
【０１０３】
図５は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIに相当する４.５ｋｂ ｃＤＮＡクローンの部分的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。１つの文字コードで示されるアミノ酸残基は、翻訳開始コドンから始まって、強調した太さの数字（下段）で番号がつけられている。疎水性リーダーには下線が付されている。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＮ末端のタンパク質の配列（コドン２７から）および内部のＣＮＢｒペプチドにはドットの下線を付している（ＣｙｓおよびＮ−グリコシル化されたＡｓｎ残基は検出することができない）。Ｎ−グリコシル化シグナルおよび終止コドンは星印で示されている。
【０１０４】
図６は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの細胞外の、リガンド結合ドメインの発現のためのホ乳類の発現ベクターの構築を示す。
【０１０５】
（ａ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの細胞外の、リガンド結合ドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによって調製するために用いられるセンスおよびアンチセンスの合成オリゴヌクレオチドを示す。
【０１０６】
（ｂ）前記センスおよびアンチセンスプライマーならびにクローンｑ１０のＤＮＡを用いて作製された８５０ｂｐまでのＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。右側の数値の単位はｂｐである。＋はＤＮＡを用いた完全な反応のレーン、−はＤＮＡのないコントロールのレーン、そしてＭはサイズマーカーのレーンを意味する。
【０１０７】
（ｃ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの可溶性部分（ｓＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ）を産生するためのホ乳類の発現ベクターであるｐＥＦ−ＢＯＳ−ｓＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの構造を示す。
【０１０８】
図７は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲの種々の細胞における発現を示す。
【０１０９】
種々の細胞におけるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの発現を、界面活性剤による細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７.５％アクリルアミド、非還元条件）に付し、続いてウサギ抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体および¹²⁵Ｉ−プロテインＡを用いてイムノブロッティングすることにより示す。クローン３６９.１１はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。クローン４７０.６はＩＦＮＡＲを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。クローン５０８.１２は両方のタンパク質を発現している。コントロールのＮＩＨ−３Ｔ３細胞およびヒトＤａｕｄｉ細胞は充分示されている。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの５１ｋＤａ型（マウス細胞における）および１０２ｋＤの型（Ｄａｕｄｉ細胞における）は矢印で示される。分子量マーカーは左側に示される。
【０１１０】
図８は、種々の宿主細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合を示している。
【０１１１】
（ａ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（クローン３６９.１１、黒四角で示す）およびＩＦＮＡＢ−ＢＰＩとＩＦＮＡＲの両者を発現する細胞（クローン５０８.１２、黒丸で示す）に対して¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合が飽和することと、ＩＦＮＡＲのみを発現する細胞（クローン４７０.６、黒三角で示す）に対して¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合が生じないことを示す。
【０１１２】
（ｂ）前記細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２結合をスキャッチャード分析したものである。結合のデータをリガンドプログラムにて解析した。以下の細胞は高親和飽和結合を示した。ヒトＤａｕｄｉ細胞（黒三角で示す）、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ陽性細胞（クローン３６９.１１、黒丸で示す）およびＩＦＮＡＲとＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの両者を発現している細胞（クローン５０８.１２、黒四角で示す）。
【０１１３】
図９は、尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＩＦＮ−α２に対する親和性を測定するＢＩＡコアシステムによる実験（ＩＦＮＡＺＫＡ・ＸＬＳ）の結果をまとめたものである。
【０１１４】
ＩＦＮ−α２をセンサーのチップに固定し、様々な濃度の尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをセンサーのチップに通過させた。「相対的反応と時間の関係」は結合と解離の経過を示す。みかけの解離定数は３.１２×１０^-9Ｍである。
【０１１５】
図９中、Ｋassは結合速度定数（association rate constant）、Ｋdissは解離速度定数（dissociation rate constant）およびＫｄは解離定数（dissociation constant)を意味する。
【０１１６】
図１０は、尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【０１１７】
純粋な尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを連続して倍数希釈して表示の濃度にし、それらをｍａｂ抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体で予めコーティングされているミクロＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレート中でウサギ抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体と反応させ、つづいて西洋ワサビペルオキシダーゼが標識されているヤギ抗ウサギ抗体（goat anti-rabbit horseradish peroxidase conjugate）、さらにはＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂基質を反応させた。プレートの吸光度をＯＤ４０５／６３０ｎｍで分析した。検出限界の下限は３０ｐｇ／ｍｌである。
【０１１８】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【０１１９】
実施例１
尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのアミノ酸配列分析
以下のようにイスラエル国特許出願第１０６５９１号明細書の記載にしたがってＩＦＮＡＢ−ＢＰをえた。製造業者の指示に従って、アフィゲル−１０(Afiigel-10)（１ｍｌ、バイオラッド(BioRad)社製、米国）にＩＦＮ−α２（５ｍｇ）を結合させてカラムにつめた。１０,０００Ｄａのカットオフの膜（ミリポア(Millipore)社製、米国）限外ろ過により尿からえられた粗尿タンパク質（１０００倍濃縮、１０ｇ、２５０ｍｌ）を流速０.２５ｍｌ／ｍｉｎでカラムに付した。カラムは０.５Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）２５０ｍｌ、つぎにＰＢＳ（１０ｍｌ）を用いて洗浄した。そののち結合したタンパク質（７５μｇ）を０.２５ｍＭクエン酸ｐＨ２.２で溶出し、直ちに１Ｍ炭酸ナトリウムで中和した。１ｍｌずつ画分を集めた。その画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析し、タンパク量をフルオレスカミン(fluorescamine)（シグマ(Sigma)社製、米国）を用いて測定した。種々の画分について、¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２とのクロスリンキング、免疫沈降ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを行なって分析した。未処理尿中ならびにＩＦＮ−α２−アガロースおよびＩＦＮ−β−アガロースカラム（ＩＦＮ−β（インターラブ(Interlab)社製、米国）をアフィゲル−１０に結合することによって調製された）の両方から溶出した画分中にＩＦＮＡＢ−ＢＰが見出された。
【０１２０】
溶出画分をスペロース１２カラム（１×３０ｃｍ、ファルマシア社、スウェーデン）に一部（０.３ｍｌ、１１μｇ）付した。カラムはリン酸緩衝性生理食塩水および０.０２％アジ化ナトリウムで前もって平衡化しておき、流速０.５ｍｌ／ｍｉｎにて溶出し、１分ごとの画分を集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により測定すると４０Ｋの均一なタンパク質として画分２６〜２８（７μｇ）にＩＦＮＡＢ−ＢＰが溶出した。２５０リットルの尿から約２５μｇの純粋なタンパク質を回収した。ＩＦＮ−βアガロースカラムに続いてスペロース１２カラムを行なって粗尿タンパク質を精製したばあいにも、同様の結果がえられた。えられた純粋なＩＦＮＡＢ−ＢＰをＰＶＤＦ膜（プロスピン(ProSpin)（登録商標）、アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製、米国）に吸着させ、その膜をモデル４７５マイクロシーケンサー（アプライド バイオシステムズ社製）のアミノ酸配列分析にかけた。その結果、配列番号１で示される主な配列がえられた。
【０１２１】
さらに、前記主配列のＮ末端における追加の３アミノ酸残基（Ｉｌｅ−ｘｘｘ−Ｔｙｒ）を有する第２のポリペプチドが検出された（ｘｘｘは未同定のアミノ酸を表わす）。えられた配列は、すでに知られているＩＦＮ−αＢレセプター（ＩＦＮＡＲ）（文献１４）の配列とはまったく異なっており、ほかの既知のタンパク質のものとも異なっていた。また、プログラム ファスト エイ（Fast A）（ジェネンティック コンピュータ グループ インク(Genentic Computer group Inc.)社製、米国）を用いてスイスプロット(Swissprot)データベース（スイス国、ジュネーブ大学におけるデータベースおよびゲンバンク(Genbank)データベース）を調査することにより決定されたように（文献３３）、前記配列は既知のＤＮＡ配列によってコードされるあらゆるタンパク質とも異なっていた。このように、このタンパク質は新規なＩＦＮ−α結合タンパク質である。以下に記載するｃＤＮＡクローンの単離の際に、残基１０はＣｙｓでありＡｒｇではないこと、そして残基１５はＳｅｒであってＡｒｇではないことが明らかになった。さらには、ｘｘｘがＳｅｒと同定された。Ｃｙｓはタンパク質マイクロシーケンサーによる同定ができず、Ｓｅｒは分析過程で時々こわされるので、同定されない尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのサンプルをＣＮＢｒで分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解しＰＶＤＦ膜にブロットした。ｃｂ１〜ｃｂ７と称される、７つの別個のペプチドバンドが分解されクマシーブルーで染色した際の膜上で検出された。各バンドはとり出され(excised)、タンパク質マイクロシーケンサーにかけた。そのうちの１つのペプチド、ｃｂ７は１０,０００より小さく、配列番号２で示される内部配列（Ｍｅｔは実際の配列に先行する）がえられた。
【０１２２】
一方、別のペプチド、ｃｂ３は、配列番号３で示される配列（Ｍｅｔは実際の配列に先行する）を有していた。
【０１２３】
残基１３は、ｃＤＮＡ配列（以下参照）から決定されたようにＣｙｓであるとのちに同定された。Ｃｙｓ残基はタンパク質マイクロシーケンサーでは同定することができない。
【０１２４】
ほかのペプチド、ｃｂ６は、配列番号４で示される配列（Ｍｅｔは実際の配列に先行する）を有していた。
【０１２５】
残基４は、ｃＤＮＡ配列（以下参照）から決定されたようにＡｓｎとのちに同定された。このＡｓｎ残基は潜在的なグリコシル化シグナル配列（Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ）の一部であり、タンパク質の配列においてＡｓｎシグナルが欠失していることは、それが実際にグリコシル化されることを示す。
【０１２６】
ほかのペプチドのバンドは、ＣＮＢｒによる不完全な分解産物として配列決定により同定された。これらは従来ＩＦＮＡＢ−ＢＰとしてすでに同定されたＮ末端ドメイン配列かもしくはｃｂ３、ｃｂ６またはｃｂ７と同様の内部配列のいずれかを有していた。
【０１２７】
実施例２
尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＣ末端ペプチドのアミノ酸配列分析
尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのサンプル（１０μｇ）をＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、エンドプロテイナーゼ Ｌｙｓ Ｃ（ベーリンガーマンハイム社製、ドイツ国）を用いて、酵素：基質＝１：５０の比となるようにして分解した。えられたペプチドの混合物をＲＰ１８カラム（アクアポア(Aquapore)ＲＰ１８（登録商標）、アプライド バイオシステムズ(Applied Biosystems Inc)社製）、０.１％トリフルオロ酢酸水溶液におけるアセトニトリルのグラジエントを用いるＲＰ−ＨＰＬＣで分解した。各々のピークのペプチドをセクアロン ＡＡ(Sequalon AA)膜（登録商標）（ミリポア（Millipore）社製、ベッドホールド（Bedford）、マサチューセッツ州、米国）に共有結合的につけ、前記のようにＮ末端の配列決定に付した。ペプチドのうちの１つは、配列番号５で示される配列を有するＣ末端のペプチドとして同定された。
【０１２８】
Ｃ末端の配列は４.５ｋｂ ｃＤＮＡクローンのＣ末端の配列と一致し（以下参照）、最後の２アミノ酸残基（Ｓｅｒ−ＡｌａにかえてＰｈｅ１２−Ｓｅｒ１３）により、１.５ｋｂ ｃＤＮＡよりコードされる推定タンパク質のＣ末端の配列と区別することができた。こうして、尿から単離された可溶性レセプターは、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIとして同定された。これは特定の４.５ｋｂ ｍＲＮＡとは無関係に翻訳され、細胞表面レセプターが除かれること(shedding)によって形成されるのではない。
【０１２９】
実施例３
変性したセンスおよびアンチセンスプライマーの構築とＩＦＮＡＢ−ＢＰ ｃＤＮＡの未変性の配列の同定
ペプチドｃｂ７の配列をセンスプライマー（アミノ酸１〜８）およびアンチセンスプライマー（アミノ酸２７〜２０）に逆に翻訳した。ＢａｍＨ ＩおよびＳａｌ Ｉエンドヌクレアーゼの制限配列をそれぞれ含むデカヌクレオチドおよびノナヌクレオチドをプライマーのオリゴヌクレオチドの５´末端に付加した（図１ａ参照）。Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）およびＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２５）から全ＲＮＡを抽出し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物またはオリゴｄ（Ｔ）のいずれかをプライマーとして用いて、逆転写により第１鎖のｃＤＮＡを産生した。つぎに、えられたｃＤＮＡ断片を組合わされたセンスおよびアンチセンス変性プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルで分析したところ、１０１ｂｐと考えられるバンドがＤａｕｄｉ細胞およびＷＩＳＨ細胞の両者のｃＤＮＡからえられたことが示された（図１ｂ参照）。１０１ｂｐ断片をＢａｍＨ ＩおよびＳａｌ Ｉで切断し、pBluescript II KS⁺（ストラタジーン社製）でクローン化し、５クローンを配列決定した。センスおよびアンチセンスプライマーによりフランキングされた領域の配列は不変で、ペプチドｃｂ７の９〜１９残基のアミノ酸であると予測される配列をコードしていた（図１ｃ参照）。ついで、非変性の内部配列に対応する３５ｂｐのオリゴヌクレオチドを合成し、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。
【０１３０】
実施例４
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの部分的なｃＤＮＡクローンの同定
実施例２の合成３５ｂｐ非変性オリゴヌクレオチドを［³²Ｐ］で標識し、ヒトＨｅＬａ細胞（クロンテック（Clontech）社製）のλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。５つの陽性クローンを同定した。これらのクローンのうちの１つは、ｑ１０と称され、１.４ｋｂの挿入物を含んでいた。クローンｑ１０の配列決定によりオープンリーディングフレームを有する配列がえられた。そこではシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの一部が同定された（図２参照）。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰの３つのＣＮＢｒペプチド、ｃｂ３、ｃｂ６およびｃｂ７の配列と同様に、Ｎ末端のタンパク質の配列をコードするＤＮＡ配列がクローンｑ１０のＤＮＡによりコードされる細胞外ドメイン内で同定された。いくつかのＣｙｓおよびＳｅｒ残基（図２のドットによるアンダーライン参照）はタンパク質の配列決定からは正しくは同定されなかった。しかしながら、タンパク質の配列決定に用いられた方法は、Ｃｙｓ残基を同定せず、時折Ｓｅｒ残基ものがすことは周知のことである。また、ペプチドｃｂ６のＡｓｎ残基は検出されなかったが、これはグリコシル化されていることを示している。クローンｑ１０のＤＮＡ配列とゲンバンクデータベースのとを比べてみても、既知の配列とは同定されなかった。したがってこのクローンは新規なＤＮＡ配列を含有する。
【０１３１】
実施例５
ヒトｍＲＮＡのノーザンブロッティング
放射線で標識されたＤＮＡプローブをクローンｑ１０から調製し、２種のヒト細胞系統Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）およびＷＩＳＨ（ＡＴＣＣＣＣＬ２５）細胞からポリＡ＋ｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションに用いた。両者ともに２つの特定のバンドが観察された。そのうちの１つは１.５ｋｂに相当し、もう一方は４.５ｋｂに相当した。バンドの強さにもとづき、１.５ｋｂのｍＲＮＡは４.５ｋｂのｍＲＮＡの約２倍ほど多いと見積もられた。ＷＩＳＨ細胞からのＲＮＡをもちいてえられたシグナルはほとんどみられないのに対し、Ｄａｕｄｉ細胞からのＲＮＡのシグナルは検出することができた（図３参照）。１.５ｋｂのｍＲＮＡは細胞表面のインターフェロンレセプターであるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの前駆体に翻訳される。より長いｍＲＮＡは異なる転写を示し、少なくとも約１００アミノ酸残基をＩＦＮＡＢ−ＢＰＩと分け合う異なるタンパク質をコードする。このタンパク質は、インターフェロンα／βレセプターの可溶性形態であるとのちに示される、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの前駆体である。
【０１３２】
実施例６
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの完全なｃＤＮＡクローンの同定
ファージλｐＣＥＶ９（ミキ トオル博士（ザ ナショナル キャンサー インスティチュート(the National Cancer Institute)、米国））により提供された）で構築されたヒト単球（ヒトの末梢血から単離）ｃＤＮＡライブラリー（グッドカインド、ジェイ エス（Gutkind, J.S.）ら著、モレク セル バイオル（Molec. Cell. Biol.）第１１巻、１５００〜１５０７頁、１９９１年参照）を、ついでクローンｑ１０をコードする領域からＰＣＲによって作製された３９７ｂｐのプローブでスクリーニングした。１.５ｋｂの挿入物を有する２２のクローンと４.５ｋｂの挿入物を有する２つのクローンを１０⁶の独立したファージから単離した。２つの４.５ｋｂクローン(λｐＣＥＶ９−ｍ１９およびλｐＣＥＶ９−ｍ２７）のオープンリーディングフレーム全体に加えて、２つの１.５ｋｂクローン（λｐＣＥＶ９−ｍ６およびλｐＣＥＶ９−ｍ２４）のＤＮＡ配列の分析を行なった。１.５ｋｂクローンは、３３１コドンのオープンリーディングフレームを有する、細胞表面レセプターであるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの完全な前駆体をコードしていた（図４参照）。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰからえられたタンパク質およびＣＮＢｒペプチド配列（図４のドットのアンダーラインで示される）は、翻訳されたＤＮＡ配列内ですべて同定された。２つの４.５ｋｂクローンの部分的な配列決定により、コドン２３９のあとに終止シグナルを含む異なる配列が続く、１.５ｋｂクローンに存在するような２３７のコドンの同様の５´配列が明らかになった（図５参照）。全体的にみて以下のコドンは異なっていた。コドン１３（ＨｉｓのかわりのＬｅｕ）、コドン１０８（ＩｌｅのかわりのＴｈｒ）およびコドン２３８〜２４０（Ｓｅｒ−Ａｌａ−ＳｅｒのかわりにＰｈｅ−Ｓｅｒ−終了）であった。４.５ｋｂクローンの両者には、あらゆる３つのリーディングフレームにおいて終止コドンを超えるオープンリーディングフレームはみられなかった。このように、４.５ｋｂ ｃＤＮＡは尿から単離されたＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＣ末端配列と一致する、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIである端が切り取られた可溶性レセプターの前駆体をコードする。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの両者の前駆体タンパク質をコードする２つのｍＲＮＡは、同一の遺伝子に由来し、おそらく択一的なスプライシングにより生ずると考えられる。
【０１３３】
実施例７
ホ乳動物の発現ベクターの構築および可溶性ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの組換え体の産生
ＸｂａＩ制限部位を有する合成センスおよびアンチセンスプライマー（図６ａ参照）および鋳型としてｑ１０ ＤＮＡを用いて、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）でＰＣＲを行ない、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのシグナル配列および細胞外ドメインをコードするＤＮＡを産生した。えられたＰＣＲ産物（図６ｂ参照）は、ＸｂａＩにより切断され、発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（大阪のエス ナガタ(S. Ngata)博士より提供された）に結合され、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ（図６ｃ参照、文献４６）を産生した。ＤＮＡの配列決定により構築が確かめられた。コンピテントの大腸菌（ＢＬ−２１株、ノバゲン インク(Novagen Inc.)社製、米国）を形質転換し、正しいオリエンテーションでＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの配列を有するクローンを単離した。ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの構築物は、サルＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７細胞、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ １６５１））のトランスフェクションに用いられた。これらの細胞は、細胞培養上清でえられた１２ｎｇ／ｍｌの可溶性ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの組換え体を発現したことが、ＥＬＩＳＡおよびヒトＩＦＮ−αおよびβの生物学的活性（抗ウイルス活性)を阻害するその能力により決定された。類似体では、４.５ｋｂクローンにＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードするＤＮＡ領域を、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの細胞外ドメインを記載したようにホ乳類の発現ベクターに挿入し、細胞の形質転換に用いた。これらの細胞は、前記細胞の培養培地に分泌される活性ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを産生している。
【０１３４】
実施例８
真核細胞の発現ベクターの構築およびマウス細胞のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲの発現
ＸｂａＩ制限部位を有する合成センスおよびアンチセンスプライマーおよび鋳型としてプラスミドｐＣＥＶ９−ｍ６を用い、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）でＰＣＲ法を行ない、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの全体をコードするＤＮＡを産生した。えられたＰＣＲ産物をＸｂａＩで切断し、発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳに結合してｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢＲを産生した。ＩＦＮＡＲ（文献１４）に対応するｃＤＮＡを特定のオリゴヌクレオチドを用いるＲＴ−ＰＣＲ（文献４８）を用いて産生した。増幅された産物をｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクター（文献４６）のＸｂａI制限部位にクローン化し、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＲをえた。これらの構築物は、ＤＮＡの配列決定をすることによって確かめられた。コンピテント大腸菌（ＢＬ−２１株、ノバゲン インク社製、米国）を形質転換し、正しいオリエンテーションでＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲ配列を有するクローンを単離した。
【０１３５】
クローン化されたＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ ｃＤＮＡを安定した様式で発現するマウス細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ １６５８）を増殖した。指数的に増殖するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ（ＣＲＬ １６５８）（１０ｃｍプレートに１.５×１０⁶細胞）を、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢＲ（１０μｇ ＤＮＡ）とともにｐＳＶ２ｎｅｏ（クロンテク(Clontech)社製、米国、ｐＭＡＭｎｅｏカタログ番号６１０４−１）（２μｇ）を用いてリン酸カルシウム沈降法（文献４９）によりコトランスフェクションした。独立したＧ４１８耐性コロニーが同定され、サブクローン化された。高レベルのＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現するクローンを尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩに対する抗体および¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合（表４参照）により同定した。
【０１３６】
抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体の結合のために、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ（ＣＲＬ １６５８））からえられた細胞（表４参照）(１×１０⁶細胞)を３５ｍｍウェル（６ウェルプレート、コースター（Costar）社製）にまき、コンフルエントまで増殖させた（２０時間）。細胞を２％ＦＢＳおよび０.１％アジ化ナトリウムを含むＤＭＥＭ（洗浄培地）で洗浄し、つづいて洗浄培地で２０分間インキュベートした。ウサギ抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体（２ｍｌ、１：５００洗浄培地中）を洗浄したウェルに加え、２時間、室温でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、¹²⁵Ｉ−プロテインＡ（２ｍｌ、２５０,０００ｃｐｍ洗浄培地中）を加えてさらに45分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、トリプシンを用いて回収し、細胞数を数えた。
【０１３７】
¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２を結合するために、細胞（１×10⁶細胞）を３５ｍｍウェル（６ウェルプレート、コースター社製）にまき、コンフルエントまで増殖させた（２０時間）。細胞を２％ＦＢＳおよび０.１％アジ化ナトリウム（洗浄培地）を含むＤＭＥＭで洗浄し、続いて洗浄培地で２０分間インキュベートした。 ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（２〜３×１０⁵ｃｐｍ、１０⁸単位／ｍｇ、５×１０⁷ｃｐｍ／μｇ）を加え、２時間、室温でインキュベーションを続けた。細胞を３回洗浄し、トリプシンを用いて回収し、細胞数を数えた。
【０１３８】
陽性クローン（たとえば、クローン３６９．１１）の洗剤抽出物（detergent extracts)の非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それにつづく前記抗体を用いた免疫ブロッティングにより、約５１ｋＤａの強力なバンドがえられた（図７参照）。
【０１３９】
ＩＦＮＡＲを発現するマウス細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ １６５８））はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＲとのトランスフェクションによって同様に増殖した。クローンNo.４７０．６は、これらの細胞における抗ウイルス反応性を効果的に誘導するｈｕＩＦＮ−αＢの能力によって決定されるように、ＩＦＮＡＲ−陽性であった。予測された、ほかのＩ型ＩＦＮ類（たとえば、ｈｕＩＦＮ−β）はクローン４７０．６において活性ではなかった。
【０１４０】
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲを発現する、クローン３６９．１１および４７０．６はついで相補的なレセプタータンパク質（それぞれｐＥＦ−ＢＯＳＩＦＮＡＲおよびｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢＲ）を用いてトランスフェクトした。安定な共発現(coexpression)のために、ＩＦＮＡＲまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのいずれかを発現するＧ４１８−耐性クローンを前記のｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢＲまたはｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＲのいずれかとともに、ｐＳＶ２ｈｙｇｒｏ（グリッツ(Gritz)およびデイビス(Davies)、ジーン(Gene)、２５巻、１７９〜１８８頁、１９８３年参照）（２μｇ）を用いてトランスフェクトした。ＩＦＮＡＲおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを共発現する、ハイブロマイシン(hygromycin)およびＧ４１８−耐性クローンを単離しサブクローン化した。クローン３６９．１１由来のＩＦＮＡＲ−陽性クローンをｈｕＩＦＮ−αＢに対するそれらの抗ウイルス反応性によって固定し、またクローン４７０．６由来の、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ−陽性クローンを抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体および¹²⁵I-ＩＦＮ−α２（リプロゲン(Reprogen)社製、イスラエル国、ネスジオナ）の両者の結合により同定した。クローン３６９．１１由来のクローン５０８．１２およびクローン４７０．６由来のクローン１３０６は¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２およびＩＦＮ−α／βＲ抗体の両者と結合した（表４参照）。さらに、これらは抗ウイルスアッセイ法でｈｕＩＦＮ−αＢに反応した。したがって、これらのクローンはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよび機能的ＩＦＮＡＲの両者を発現すると結論づけられる。
【０１４１】
表４に種々の細胞におけるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの発現を示す。
【０１４２】
【表４】

【０１４３】
実施例９
マウス細胞で発現されたＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲの親和性の決定ＩＦＮＡＲまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのいずれかを発現するクローンを、¹²⁵Ｉ−ｈｕＩＦＮ−α２の結合について試験し、結合データをスキャッチャード分析（Scatchard analysis）で評価した。
【０１４４】
ＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞（ＡＴＣＣ(ＣＲＬ １６５８)、１×１０⁶細胞）を３５ｍｍウェル（６ウェルプレート、コースター社製）にまき、コンフルエントまで増殖させた（２０時間）。細胞を２％ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＤＭＥＭ（洗浄培地）で洗浄し、つづいて同じ培地で２０分間インキュベートした。¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（２〜３×１０⁵ｃｐｍ、１０⁸単位／ｍｇ、５×１０⁷ｃｐｍ／μｇ）を決められた濃度の非標識のＩＦＮ−α２とともに加え、２時間、室温でインキュベートした。細胞を洗浄培地で３回洗浄し、トリプシンを用いて回収し、細胞数を数えた。結合データをリガンドプログラム（LIGAND program）（ザ ナショナル インスティチュート オブ ヘルス ユーエスエー（the National Institute of Health USA)、ムンソン、ピージェー(Munson, P.J.)およびロッドバード、ディ−(Rodbard, D)（１９８０年）、アナル バイオケム（Anal. Biochem.)、１０７巻、２２０〜２３９巻参考）により分析した（文献５０）。
【０１４５】
ＩＦＮＡＲのみを発現する細胞（クローン４７０．６）は¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の特異的結合を示さなかったので、このような推定の結合部位のＫｄ値はえることができなかった。それに対して、クローン４７０．６とは逆に高親和性で特異的でしかも飽和できる結合がＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを単独で発現する細胞（クローン３６９．１１）でえられた。この結合のＫｄ値は２３℃で３.６×１０^-9Ｍであった（表５参照）。
【０１４６】
５０８．１２細胞（ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲの両者を発現する）に対する¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合を、スキャッチャード分析で評価し、その結果をクローン３６９．１１(ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのみを発現する）のと比較した。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲの共発現の際に、飽和の結合がえられ、ＩＦＮ−α２に対する親和性がＤａｕｄｉ細胞におけるレセプターの親和性と接近して約１０倍高くなった（それぞれ、Ｋｄ＝４.０×１０^-10Ｍ、１.６× １０^-10Ｍ、表５参照）（図８参照）。この結果はＩＦＮＡＲおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰＩがともにリガンド結合することを示す。
【０１４７】
表５には種々の宿主細胞の結合特性（リガンド＝¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２）を示す。
【０１４８】
【表５】

【０１４９】
実施例１０
尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの親和性の決定
ＢＩＡコア（ファルマシア社製、スウェーデン）のセンサーのチップに、製造業者らにより提供された自動操作により、ヒトＩＦＮ−α２を固定化した。約 ３０ｆｍｏｌのＩＦＮ−α２を固定した。数種の濃度（２８〜１１２ｎＭ）までリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをセンソグラムのチップ（sensogram chip）に通し、（ＰＢＳ中の）結合(association)および解離の程度を記録した。えられたデータにもとづき、３.１２×１０^-9ＭのＫｄ値が計算された（図９参照）。このように、尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの親和性は宿主細胞において発現されたＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの親和性ときわめて類似している。
【０１５０】
実施例１１
大腸菌、酵母および昆虫細胞におけるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの発現
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを、大腸菌（ＢＬ−２１株（カタログ番号６９４４９−１）、ノバゲン インク(Novagen Inc.)製、米国）のような原核細胞、酵母（ピキア パストリス(Pichia pastoris)ＧＳ１１５株（カタログ番号Ｋ１７１０−０１）、インビトロゲン(Invitrogen)社製、米国）および昆虫（Ｓｆ９昆虫細胞（カタログ番号Ｋ８２２−０３の部分）、インビトロゲン社製、米国）細胞のようなほかの真核細胞などのさらなる組換え細胞で産生させた。
【０１５１】
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰII組換え体を産生するために、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのいずれかおよびそれらの活性断片をコードするＤＮＡを有し、大腸菌および酵母細胞の形質転換または昆虫細胞の感染に適する適切なベクターを構築するにあたって、既知の方法を利用した。酵母細胞で発現させるために、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードするＤＮＡ（実施例５および６）を切り出し、酵母細胞のトランスフェクションに適する発現ベクターに挿入した。昆虫細胞で発現させるために、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードするＤＮＡをバキュロウイルス（baculo virus)（カタログ番号Ｋ８２２−０３の部分、インビトロゲン社製、米国）に挿入し、この組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させた。大腸菌で発現させるために、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのいずれかをコードするＤＮＡを適切なオリゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異に付し、開始ＡＴＧコドンを成熟ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ（図２参照）またはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの第１のコドンのちょうど前に挿入した。または、そのようなＤＮＡを適切なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いるＰＣＲによって調製することができた。えられたｃＤＮＡの構築物は、ついでこの分野でよく知られている方法により適切に構築された原核細胞の発現ベクターに挿入した（文献３５）。
【０１５２】
実施例１２
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの組換え融合タンパク質の構築ＩｇＧ１のＨ鎖の定常部で融合させた、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのリガンド結合ドメインのいずれかからなるタンパク質の産生を以下の方法で行なった。
【０１５３】
リガンドに結合する細胞外ドメインをコードする配列の直前および直後に独自の制限部位を導入するために、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＤＮＡを、適切なオリゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異に供した。または、このようなＤＮＡを制限部位を有する特別に設計されたプライマーを用いるＰＣＲにより調製した。ＩｇＧ１ Ｈ鎖の定常部を有するほかのプラスミド、たとえばｐＲＫＣＯ４２Ｆｃｌ（文献４７）（ビルン(Byrn)ら、ネイチャー(Nature)、３４４巻：６６７頁、１９９０年参照）を、融合タンパク質に一致して翻訳を許容する方法で、できる限りＩｇＧ１ Ｈ鎖のＡｓｐ２１６に接近した同一の独自の制限部位を導入するために同様の部位特異的突然変異に供した。５´−非翻訳配列からなり、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのリガンド結合ドメインのいずれかをコードするｄｓ ＤＮＡ断片を、独自の制限部位で分解することにより調製した。変異したｐＲＫＣＤ４２Ｆｃｌを同様に分解して、プラスミドおよびＩｇＧ１配列を含む大きな断片を産生した。つぎに、２つの断片を、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのリガンド結合ドメインのいずれかからなるポリペプチドの前駆体および、ＩｇＧ１ Ｈ鎖の約２２７のＣ末端アミノ酸（ヒンジ領域ならびにＣＨ²およびＣＨ³ドメイン）をコードする新たなプラスミドを産生するために結合させた。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、適切な制限酵素で分解することによりプラスミドから単離され、ついで効率よく原核または真核細胞の発現ベクターに挿入されうる。
【０１５４】
実施例１３
ＩＦＮＡＲとのＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの組換え融合タンパク質の構築
ＩｇＧ１ Ｈ鎖の定常部と融合した、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの細胞外ドメインのいずれかからなるタンパク質の産生を実施例１２の記載にしたがって行なった。ＩｇＧ１ Ｌ鎖の定常部と融合したＩＦＮＡＲの細胞外ドメインからなるタンパク質の産生を同様に行なった。ＩｇＧ１ Ｈ鎖の定常部と融合したＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのリガンド結合ドメイン、またはＩｇＧ１ Ｈ鎖の定常部と融合したＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのいずれかをコードする真核細胞の発現ベクターを、ＩｇＧ１ Ｌ鎖の定常部と融合したＩＦＮＡＲの細胞外ドメインをコードする真核細胞の発現ベクターとともに適切なホ乳類宿主細胞のコトランスフェクションに用いた。陽性のトランスフェクタントは、ＩｇＧ１定常部、ＩｇＧ１ Ｌ鎖の可変部が置換されているＩＦＮＡＲの細胞外ドメインおよびＩｇＧ１ Ｈ鎖の可変部が置換されているＩＦＮＡＢ−ＢＰII、またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのリガンド結合ドメインのいずれかからなる混成タンパク質を分泌した。
【０１５５】
ほかの具体例では、Ｈ鎖およびＬ鎖の定常部がスイッチされる。すなわち、ＩＦＮＡＲの細胞外ドメインがＩｇＧ２ Ｈ鎖の定常部と融合し、一方、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのリガンド結合ドメインのいずれかが、ＩｇＧ２ Ｌ鎖の定常部と融合する。
【０１５６】
実施例９にもとづき、これら融合タンパク質はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＩＦＮ−αに対する親和性と比べると、約１０倍高い親和性を有することが期待される。
【０１５７】
実施例１４
ＩＦＮＡＢ−ＢＰに対するポリクローナル抗体の調製
完全フロインドアジュバントで乳化された尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰの純粋な調製物５μｇをまずウサギの皮下に注射した。３週間後、不完全フロインドアジュバント中の調製物５μｇを再び皮下に注射した。１０日間の間隔でＰＢＳ溶液としてさらに４回追加的に注射をした。最後の免疫の１０日後にウサギから採血をした。４℃、一晩、ＰＢＳ中ＩＦＮＡＢ−ＢＰ（１μｇ／ｍｌ）でコートした９６ウェルＰＶＣプレートを用いて、固相ラジオイムノアッセイ（ｓＲＩＡ）を行なうことにより、抗体のレベルの発展を測定した。つぎにプレートをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、０.５％）、トウィーン２０（シグマ社製、米国、０.０５％）を含むＰＢＳで４℃、一晩ブロックした。プレートを５倍希釈したウサギ抗血清と４時間、室温で反応させ、洗浄し、つぎに¹²⁵Ｉ−プロテインＡ（１０⁵ｃｐｍ／ウェル）を含むＰＢＳと４５分間、室温で反応させた。つづいてプレートを洗浄し、個々のウェルを切り取り、カウントした。力価を最大希釈の逆数として計算したところ、コントロールの抗血清よりも10倍高い値がえられた。５回目の注射ののちの力価は１：60,000よりも大きかった。
【０１５８】
また、抗体レベルの発展は、ヒトＩＦＮ−α２（リプロゲン社製、ネス ジオナ、イスラエル国）の抗ウイルス活性をブロックする抗血清の能力により測定した。９６ウェルプレートにあらかじめ形成された単層のヒトＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２５）を１番目のウェルで１：２５０の希釈から始まり、２倍希釈の抗血清と１時間、３７℃でインキュベートした。ＩＦＮ−α２（１０ｕ／ｍｌ、最終濃度）をつぎに加え、１時間、３７℃ののちに、水泡性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)を用いて免疫性のテストをした。７回の免疫ののちの中和された力価は１２０,０００抗ウイルス単位／ｍｌであった。
【０１５９】
実施例１５
ＩＦＮＡＢ−ＢＰに対するモノクローナル抗体の調製
雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（オーエルエー ラボラトリーズ(OLA laboratories)社製、米国）（３月令）に、まず２μｇの精製ＩＦＮＡＢ−ＢＰを含む完全フロインドアジュバントのエマルジョンを注射し、３週間後に不完全フロインドアジュバントを皮下に注射した。１０日間隔でさらに３回皮下にＰＢＳに加えて注射をした。１：６０,０００の結合力価がｓＲＩＡ（実施例９参照）によってえられた。最も高い結合力価を示すマウスに対して、融合の４日前および３日前に最終の二次免疫注射を腹腔内に行なった。融合はＮＳＯ／１ミエローマ細胞系（ガルフレ アンド マイルシュタイン メソッズ エンザイモル(Galfre and Milstein Methods Enzymol.)、７３巻：１頁１９８１年参照）と融合パートナーとしての動物の脾臓およびリンパ節の両方から調製されたリンパ球を用いて行なわれた。融合細胞を微小培養用プレートに分配し、ＨＡＴおよび１５％ウマ血清を加えたＤＭＥＭ中でハイブリドーマを選択した。ＩＦＮＡＢ−ＢＰに対する抗体を産生することがわかったハイブリドーマを限界希釈法によりサブクローン化し、腹水を産生するためにプリスタンで感作されたＢａｌｂ／Ｃマウスに注射した。市販のＥＬＩＳＡキット（アマシャム（Amersham）社製、イギリス国）を用いて抗体のアイソタイプを規定した。
【０１６０】
抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングをつぎのようにして行なった。ハイブリドーマ上清を、倒立固相ラジオイムノアッセイ（inverted solid phase radioimmunoassay(IRIA)）により抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰ抗体が存在するかどうか調べた。ＰＶＣマイクロタイタープレート（ダイナテック ラボラトリー(Dynatech Laboratories)社製、アレクサンドリア、バージニア州）をアフィニティ精製されたヤギ抗マウス血清Ｆ（ａｂ）₂抗体（ジャクソン ラブス(Jackson Labs)社製、米国）（１０μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）でコーティングした。一晩４℃でインキュベーションしたのち、プレートを２回ＢＳＡ（０.５％）およびトウィーン２０（０.０５％）を含有するＰＢＳで洗浄し、洗浄溶液で少なくとも２時間、３７℃でブロックした。ハイブリドーマの培養上清（１００μｌ／ウェル）を加え、プレートを４時間、３７℃でインキュベートした。つぎにプレートを３回洗浄溶液で洗浄し、¹²⁵Ｉ−ＩＦＮＡＢ−ＢＰ（１００μｌ、１０⁵ｃｐｍ）を加えてさらに１６時間、４℃でインキュベートした。プレートを３回洗浄し、個々のウェルを切り取り、ガンマ−カウンターで計測した。陰性のコントロール値よりも少なくとも５倍高いカウント数のあるサンプルを陽性とした（表６参照）。５種の陽性クローンを選択し、以下の検討のためにサブクローン化し、特徴づけられた。すべてのクローンはＩｇＧ１アイソタイプであった。
【０１６１】
表６にＩＦＮＡＢ−ＢＰに対するモノクローナル抗体を産生するクローン類を示す。
【０１６２】
【表６】

【０１６３】
実施例１６
モノクローナル抗体を用いるＩＦＮＡＢ−ＢＰのアフィニティクロマトグラフィー
ＩＦＮＡＢ−ＢＰに対する抗体をアフィニティクロマトグラフィーによりＩＦＮＡＢ−ＢＰの精製に利用した。この実施例では、モノクローナル抗体番号５．７３をアフィニティクロマトグラフィーに用いた。ハイブリドーマ番号５．７３から分泌されるモノクローナル抗体を含有する腹水を５０％飽和で硫安沈殿することにより精製し、ＰＢＳに対して充分に(extensively)透析した。製造者らによって特定されたように、１ｍｌのアフィゲル（Affigel）１０（バイオ−ラッド（Bio-Rad）社製、米国）に対して約１０ｍｇのイムノグロブリンが結合した。
【０１６４】
２５０ｍｌのヒト尿タンパク質（粗尿２５０リットルに対応する）を、４℃、流速０.２５ｍｌ／分で０.５ｍｌの抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰ抗体のカラムにかけた。タンパク質が洗浄液中に検出されなくなるまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。ＩＦＮＡＢ−ＢＰは、２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２.２）（８×１カラム体積画分）で溶出され、すぐに１Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃で中和された。溶出された画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色分析をしたところ、分子量４０,０００の主なバンドがみられた。この調製物のさらなる精製は、サイズ排除クロマトグラフィーによりえられた。
【０１６５】
実施例１７
ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＥＬＩＳＡ試験
マイクロタイタープレート（ダイナテック（Dynatech）社製またはマキシソーブ(Maxisorb)、ヌンク(Nunc)社製、デンマーク国）に抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰモノクローナル抗体番号４６．１０（Ｉｇ画分、１２０μｌ／ウェル、ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍｌ含有）を一晩、４℃でコーティングした。プレートを、ＢＳＡ(０.５％)、トウィーン２０（０.０５％）およびＮａＮ₃（０.０２％）を含有するＰＢＳ（ブロッキング溶液）で洗浄し、同じ溶液で一晩３７℃でブロッキングを行なった。試験されるサンプルを０.１％ＮＰ４０および０.６５Ｍ ＮａＣｌを含有するブロッキング溶液で連続的に倍数希釈し（１：４から出発）、４時間、３７℃でウェル（１００μｌ／ウェル）に加えた。つぎに、０.０５％トウィーン２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／トウィーン）でプレートを３回洗浄し、ウサギ抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII血清（１：１０００ ＮａＮ₃を含有しないブロッキング溶液、１００μｌ／ウェル）を加え、さらに一晩４℃でインキュベーションした。プレートをＰＢＳ／トウィーン（１００μｌ／ウェル）で３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼが接合したヤギ抗ウサギ抗体（ＨＲＰ、ジャクソン ラブス、１：１０,０００ＰＢＳ／トウィーン中、１００μｌ／ウェル）を２時間、室温で加えた。プレートを３回ＰＢＳ／トウィーンで洗浄し、各ウェルに１００μｌの新しく調製したＡＢＴＳ（２，２´−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）、シグマ社製、１０ｍｇ、６.４ｍｌのＨ₂Ｏ、２.２ｍｌの０.２Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１.４ｍｌの０.２Ｍクエン酸、１μｌのＨ₂Ｏ₂）を基質として加えることにより発色させた。３０分間発色させ、０.２Ｍクエン酸を１００μｌ／ウェル加えることにより反応を停止した。プレートを自動ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍで、非特異的リーディングに対しては６３０ｎｍで読んだ。この検定法の下の検出限界は３０ｐｇ／ｍｌであった（図１０参照）。
【０１６６】
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【発明の効果】
本発明によれば、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、ムテイン体、融合タンパク質、機能的誘導体および活性画分ならびに該結合タンパク質の塩から選択されるＩＦＮ−α／β結合タンパク質、それらをコードするＤＮＡ分子および製造法、それらを含有する医薬組成物、それらに対する抗体、それらを発現しうる複製可能な発現ビヒクルならびに該ビヒクルで形質転換された宿主細胞を提供することができる。
【０２１８】
【配列表】

【０２１９】

【０２２０】

【０２２１】

【０２２２】

【０２２３】

【０２２４】

【０２２５】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩとＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのクローニング計画を示す。
（ａ）中列
尿由来の分子量４０,０００のＩＦＮＡＢ−ＢＰからえられた内部のＣＮＢｒペプチド（２７アミノ酸残基、ｃｂ７）の配列（配列番号２）である。
上列および下列
上列には合成センスを、下列にはアンチセンスを示す。
（ｂ）前記センスおよびアンチセンスプライマーを用いてえられたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
（ｃ）上列
１０１ｂｐのＰＣＲ産物のpBluescriptクローンからえられた、配列の非変性部分を示す。
下列
えられた非変性ＤＮＡ配列のペプチドｃｂ７（残基９〜２０）の配列の一部である予測された配列への翻訳の結果を示す。
【図２】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのｃＤＮＡを有するクローンｑ１０のｃＤＮＡおよび翻訳されたポリペプチドの配列（配列番号６）を示す。
【図３】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの配列に共通する特異的なプローブを用いたノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの検出を示す。
【図４】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩに相当する完全な１.５kb ｃＤＮＡクローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図５】ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIに相当する４.５ｋｂ ｃＤＮＡクローンの部分的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図６】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの細胞外の、リガンド結合ドメインの発現のためのホ乳類の発現ベクターの構築を示す。
（ａ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの細胞外の、リガンド結合ドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによって調製するために用いられるセンスおよびアンチセンスの合成オリゴヌクレオチドを示す。
（ｂ）前記センスおよびアンチセンスプライマーならびにクローンｑ１０のＤＮＡを用いて作製された８５０ｂｐまでのＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
（ｃ）可溶性ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ（ｓＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ）を産生するためのホ乳類の発現ベクターであるｐＥＦ−ＢＯＳ−ｓＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの構造を示す。
【図７】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲの種々の細胞における発現を示す。
【図８】種々の宿主細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合を示している。
（ａ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（クローン３６９.１１、黒四角で示す）およびＩＦＮＡＢ−ＢＰＩとＩＦＮＡＲの両者を発現する細胞（クローン５０８.１２、黒丸で示す）に対して¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合が飽和することと、ＩＦＮＡＲのみを発現する細胞（クローン４７０.６、黒三角で示す）に対して¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合が生じないことを示す。
（ｂ）前記細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２結合をスキャッチャード分析したものである。
【図９】尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＩＦＮ−α２に対する親和性を測定するＢＩＡコアシステムによる実験（ＩＦＮＡＺＫＡ、ＸＬＳ）の結果をまとめたものである。
【図１０】尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＥＬＩＳＡの結果を示す。

Claims (12)

1. （ａ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、
   （ｂ）配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＩＦＮＡＢ−ＢＰＩＩ、および
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質の前駆体または融合タンパク質
   から選ばれる、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
2. 請求項１記載のＤＮＡ分子の転写産物であるｍＲＮＡ分子。
3. 翻訳の際にＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ前駆体を提供する約１.５ｋｂのｍＲＮＡ分子、および翻訳の際にＩＦＮＡＢ−ＢＰＩＩを提供する約４.５ｋｂのｍＲＮＡ分子から選ばれる請求項２記載のｍＲＮＡ分子。
4. 請求項１記載のＤＮＡ分子からなる複製可能な発現ビヒクル。
5. さらに、Ｇ−ＣＳＦ３’ＵＴＲ、ｈＥＦ１αプロモーターおよびＳＶ４０ｏｒｉを含む、請求項４記載の複製可能な発現ビヒクル。
6. 請求項４または５記載の発現ビヒクルで形質転換された宿主細胞。
7. 形質転換された宿主細胞が原核宿主細胞である請求項６記載の宿主細胞。
8. 形質転換された宿主細胞が真核宿主細胞である請求項６記載の宿主細胞。
9. 真核宿主細胞がサルＣＯＳ細胞である請求項８記載の宿主細胞。
10. 配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、または該ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの前駆体もしくは融合タンパク質から選ばれるＩＦＮ−α／β結合タンパク質、またはその塩。
11. 成熟タンパク質である請求項１０記載のＩＦＮ−α／β結合タンパク質、またはその塩。
12. 請求項１０または１１記載のＩＦＮ−α／β結合タンパク質の製造法であって、請求項６、７、８または９記載の宿主細胞を培養し、前記ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を回収することからなる、前記ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の製造法。

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