ES2950288T3 - Anticuerpos interferón beta y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente al interferón beta (IFNp). Dichos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son útiles para diversos fines terapéuticos o de diagnóstico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos interferón beta y usos de los mismos
Antecedentes de la invención
La familia de citoquinas del interferón (IFN) se descubrió inicialmente por su capacidad para proteger a las células de las infecciones víricas, pero ahora se aprecia que esta familia de citoquinas evolutivamente conservadas puede provocar una amplia gama de respuestas. La familia está formada por las subfamilias de IFN de tipo I, tipo II y tipo III, y los IFN de tipo I son los más diversos de todas las familias de citoquinas. Los IFN humanos de tipo I están codificados por 13 genes para los subtipos de IFNa, además de genes individuales para cada uno de los IFNp, IFNw, IFNk e IFNe. El IFNp y las diversas isoformas del IFNa son los IFN de tipo I mejor estudiados. La mayoría de las proteínas IFNa comparten un 78-98 % de identidad, e IFNp comparte ~35 % de identidad con una secuencia consenso de IFNa. El IFNp está naturalmente glicosilado, mientras que las isoformas del IFNa suelen estar sólo débilmente glicosiladas. Todos los IFN de tipo I se unen al receptor de citoquinas IFNAR de clase II de la superficie celular (compuesto por las dos cadenas IFNAR1 e IFNAR2). El IFNa tiene una semivida en suero de 2-3 horas, pero el IFNp es hidrófobo y raramente se detecta en suero, y estas características son consistentes con la noción de que el IFNa es efectivo sistémicamente, mientras que el IFNp actúa en sitios locales de forma autocrina/paracrina.
La producción de IFN puede ser estimulada por la exposición a patrones moleculares asociados a patógenos derivados de microbios, incluidos ácidos nucleicos microbianos, lípidos, proteínas y lipoproteínas. Sin embargo, cada vez hay más pruebas de que la producción de IFN también puede ser estimulada por autocomponentes endógenos que se liberan durante los procesos de la enfermedad, y esto es especialmente relevante en el contexto del lupus eritematoso sistémico (LES) y otras enfermedades reumáticas como la dermatomiositis (DM). El LES suele caracterizarse por una sobreproducción patológica de la expresión del IFN tipo I, y el IFNa es detectable en el suero de un número limitado de pacientes con LES.
Cada vez hay más pruebas de la importancia de la expresión de genes regulados por interferón (IRG) en la manifestación de la actividad/gravedad de la enfermedad del LES, como demuestran los resultados clínicos con el anticuerpo anti-IFNAR anifrolimab. En un estudio de fase 2 controlado con placebo, el anifrolimab redujo la gravedad de la enfermedad en múltiples variables clínicas y, al mismo tiempo, inhibió una firma IRG en aproximadamente un 90 % a las dos dosis probadas en ese estudio.
El documento CN 102 898 521 A divulga un anticuerpo murino criado contra interferón beta humano. AJITH SOMINANDA ET AL: inhibition of Endogenous Interferon Beta by Neutralizing Antibodies Against Recombinant Interferon Beta", ARCHIVES OF NEUROLOGY, vol. 67, no. 9, 2010 divulgan el uso de preparaciones de polisuero de pacientes desafiados con IFNp.. KATHLEEN C. F. SHEEHAN ET AL: "Selective Blockade of Interferon-[alpha] and -[beta] Reveals Their Non-Redundant Functions in a Mouse Model of West Nile Virus Infection", PLOS ONE, vol. 10, no. 5, 26 de mayo de 2015el artículo anticuerpo murino criado contra el interferón beta murino... vol. 21, n° 11, 1 de noviembre de 2001 (2001-11-01), páginas 931-941 divulgan anticuerpos monoclonales anti-IFNp.
Además del anticuerpo contra el receptor de IFN anifrolimab (anti-IFNAR), se están desarrollando clínicamente varios anticuerpos anti-IFNa, como sifalimumab, rontalizumab y AGS-009. El IFNa ha sido el centro de estos esfuerzos porque un gran número de pruebas (incluidos estudios genéticos, inmunológicos, serológicos y clínicos) han asociado el IFNa con trastornos autoinmunes. Sin embargo, basándose en las pruebas científicas existentes hasta la fecha, se espera que el IFNp desempeñe un papel similar al del IFNa en los trastornos autoinmunes. Hasta la fecha no se han descrito anticuerpos terapéuticos dirigidos específicamente contra el IFNp (y no contra el IFNa). En consecuencia, existe una necesidad insatisfecha de un anticuerpo que se una especialmente al IFNp para su uso en diversos fines terapéuticos o de diagnóstico.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones.
En un primer aspecto se proporciona un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a IFNp humano, que comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En un segundo aspecto se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a IFNp humano y comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:166 y SEQ ID NO:167.
En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de nucleótidos del inserto del plásmido depositado en el ATCC y que tiene el número de acceso PTA-122726 y la secuencia de nucleótidos del inserto del plásmido depositado en el ATCC y que tiene el número de acceso PTA-122727.
En un tercer aspecto se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico del segundo aspecto.
En un cuarto aspecto se proporciona una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico del segundo aspecto o un vector del tercer aspecto.
En un quinto aspecto se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo del primer aspecto, que comprende cultivar la célula huésped de la invención, en condiciones en las que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es producido por la célula huésped.
En un sexto aspecto se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, del primer aspecto, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un séptimo aspecto se proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, del primer aspecto, o la composición farmacéutica del sexto aspecto, para su uso en terapia.
En una realización, el uso es para un procedimiento de tratamiento de la dermatomiositis (DM) o un procedimiento de tratamiento del lupus eritematoso sistémico (LES).
La divulgación proporciona anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que unen Interferón beta (IFNp), así como usos de los mismos, y procedimientos asociados.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra la viscosidad del anticuerpo IFNp en el tampón MOD1.
La FIG. 2 es un gráfico de calorimetría diferencial de barrido (DSC) del anticuerpo CTI-AF1.
La FIG. 3 es el análisis por HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC) de la agregación de CTI-AF1, como resultado de la retención de pH bajo.
Las FIGS. 4A-4D muestran el análisis SE-HPLC de los puntos temporales de los estudios de estabilidad.
Las FIGS. 5A-5D muestran gráficos que demuestran que CTI-AF1 es estable a lo largo del tiempo cuando se almacena a 40 °C y no pierde la capacidad de neutralizar IFNp. El CTI-AF1 se almacenó a distintas temperaturas y periodos de tiempo y, a continuación, se evaluó la capacidad del anticuerpo para neutralizar el IFNp en un ensayo de reportero de luciferasa dependiente del IFN. Material almacenado durante 1 semana a 40 °C (FIG. 5A, T0 equivale a ningún tiempo a 40 °C) no tuvo pérdida de actividad neutralizante; el almacenamiento a 40 °C durante dos o tres semanas no tuvo impacto en la actividad (FIG. 5C). El material que se produjo tras la transfección de células CHO en lugar de células HEK293 o que contenía una mutación del aminoácido 44 de una fenilalanina a una prolina no tuvo ningún impacto en la neutralización (FIG. 5B). Por último, el material almacenado durante cuatro semanas a 40 °C o cinco semanas a temperatura ambiente (FIG. 5D) no influyeron en la capacidad de CTI-AF1 para neutralizar la actividad inducida por IFNp.
La FIG. 6 representa datos que muestran la identificación de hibridomas de ratón anti IFNp humanos que podrían bloquear la unión de IFNp a IFNAR2 mediante interferometría de biocapa (BLI) utilizando el ForteBio Octet para medir la interacción molecular. En primer lugar, se capturaron Abs IFNp antihumanos de ratón en un sensor de proteína G a partir de medios de cultivo acondicionados; a continuación, se unió IFNp humano (indicado por la flecha hIFN-p) y, a continuación, los complejos Ab:IFNp se expusieron a la cadena de alta afinidad del receptor humano, IFNAR2 (indicado por la flecha IFNAR2). Los anticuerpos no bloqueantes muestran una protuberancia ascendente en la curva que indica una unión adicional (como indica la flecha no neutralizante, abajo), mientras que los anticuerpos neutralizantes mostraron una curva relativamente plana (como indican las flechas neutralizantes, arriba). Varios hibridomas de ratón demostraron la capacidad de neutralizar la unión de IFNAR2 a IFNp y fueron seleccionados para su posterior caracterización y eventual humanización.
La FIG. 7 representa datos que muestran la determinación de la Kd de CTI-AF1 para IFNp humano mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). El CTI-AF1 se capturó en un chip sensor CM5 y, a continuación, a partir de 2,5 nM de IFNp, se hizo fluir sobre el CTI-AF1 una serie de titulación doble de 6 puntos de IFNp humano recombinante. Las muestras se realizaron por duplicado y la concentración de IFNp se indica a la derecha del gráfico. Para cada concentración de IFNp, las líneas grises finas representan la unión de IFNp en cada muestra replicada; la línea gris más gruesa representa la curva ajustada media calculada por el programa de análisis. Se determinó que la Kd de la CTI-AF1 para el IFNp humano era de aproximadamente 36 μM.
Las FIGS. 8A-8B demuestran que CTI-AF1 es un potente neutralizador de la señalización inducida por IFNp en múltiples ensayos. La FIG. 8A muestra que las células HEK293 transducidas de forma estable con un constructo reportero de luciferasa del elemento de respuesta estimulada por IFN (ISRE) se estimularon en presencia de IFNp y cantidades tituladas de CTI-AFl. Se observa una inhibición de la luminiscencia dependiente de la dosis que indica que el IPNp ha sido neutralizado. Se sabe que la unión del IFNp al receptor de interferón (IFNAR) induce la fosforilación de la proteína STAT1 en las células U937. La FIG. 8B muestra el análisis de fosforilación de STAT1. Las células U937 se expusieron a IPNp, se preincubaron con cantidades tituladas de CTI-AF1 durante 15 minutos y, a continuación, se evaluó el nivel de fosforilación de STAT1. Los datos muestran que existe una inhibición dependiente de la dosis de la fosforilación de STAT1, lo que indica que las señales dependientes de IFNp han sido neutralizadas por CTI-AF1.
La FIG. 9 demuestra que CTI-AF1 neutralizó la expresión del gen Mx1 (MxA) estimulado por IFN en fibroblastos dérmicos humanos primarios (HDF). Hay una serie de genes que se sabe que se expresan en respuesta a la estimulación con IFN, los genes estimulados por IFN (ISG). La Mx1 (MxA) está bien caracterizada como un IFN ISG de tipo I. Se evaluó la expresión del gen Mx1 (MxA) tras la estimulación con IFNp recombinante en HDF primarias en presencia o ausencia de las cantidades indicadas de CTI-AF1. Las células se estimularon durante 5 horas y luego se aisló el ARN. El ARN se convirtió en ADNc y se realizó una PCR cuantitativa (qPCR) para determinar el nivel de expresión de Mx1 (MxA) y se utilizó B2M como control. Los datos se presentan como veces inducción; se observó una inhibición dependiente de la dosis de la expresión génica de Mx1 (MxA) que indica la neutralización de la señalización de IFNp.
Las FIGS. 10A-10B demuestran que CTI-AF1 neutralizó específicamente el IFNp. Las células U937 se estimularon con IFNp (FIG. 10A) o IFNa (FIG. 10B) durante 15 minutos en presencia de anticuerpos neutralizantes del IFNp (CTI-AF1) o del IFNa (sifalimumab, SIF). CTI-AF1 inhibió la fosforilación de StAt I dependiente de IFNp (panel A), pero no tuvo ningún impacto en la fosforilación de STAT1 inducida por IFNa (panel B). Como control, se utilizó un anti-IFNa neutralizante (SIF) junto con la estimulación de IFNa para demostrar que se podía inhibir la fosforilación de STAT 1 dependiente de IFNa.
La FIG. 11 demuestra que CTI-AF1 era un potente inhibidor del IFNp endógeno secretado por fibroblastos dérmicos humanos primarios (HDF). Las HDF se estimularon con ácido poliinosínico:policitidílico (poli I:C) durante 24 horas para inducir la expresión de IFNp en presencia de cantidades tituladas de CTI-AF1 y, a continuación, se evaluó la expresión del gen Mx1 (MxA) como se describe en la FIG. 9. Se observó una inhibición dependiente de la dosis de la expresión del gen Mx1 (MxA) con cantidades crecientes de CTI-AF1 demostrando que el anticuerpo neutralizaba el IFNp producido endógenamente.
Las FIGS. 12A-12D representan la PK sérica de CTI-AF1 y los perfiles de cobertura cutánea de IFNp en humanos a 2 mg/kg IV Q4W. Se muestran los perfiles para una relación IFNp piel:plasma de 10 (FIGS 12Ay 12C) y 100 (FIGS. 12B y 12D, Obsérvese que la PK sérica de CTI-AF1 no se ve afectada por la relación piel:plasma de IFNp ni por la semivida de recambio de IFNp. Las líneas discontinuas de los paneles C y D representan una cobertura del 95 % de IFNp en la piel.
Las FIGS. 13A-13D muestran los perfiles para la relación piel:plasma de IFNp de 10 (FIGS. 13Ay 13C) y 100 (FIGS. 13B y 13D, Obsérvese que la PK sérica no se ve afectada por la relación IFNp piel:plasma ni por la semivida de recambio del IFNp. Las líneas discontinuas de los paneles C y D representan una cobertura del 95 % de IFNp en la piel.
La FIG. 14 muestra las concentraciones séricas medias de CTI-AF1 en monos cynomolgus procedentes del estudio de toxicidad.
La FIG. 15A muestra la secuencia y la estructura secundaria del IFNp humano (SEQ ID NO:41). La FIG. 15B muestra la alineación de secuencias de humano (SEQ ID NO:41), cynomolgus (SEQ ID NO:44), ratón (SEQ ID NO:42), rata (SEQ ID NO:43) y conejo (SEQ ID NO: 45) Secuencias IFNp.
La FIG. 16A muestra la relación entre la actividad del índice de área y gravedad de la enfermedad de la dermatomiositis cutánea (CDASI) y una puntuación de la firma de 10 genes en sangre. La puntuación de actividad CDASI >12 se correlaciona con una "firma" IRG en sangre elevada de 10 genes (correlación de intervalos de Spearman r=0,61; p <0,0001). La FIG. 16B muestra un fuerte efecto umbral observado con un corte CDASI de 12 que se asocia con un corte de la firma IRG de 3 veces (p = 0,0004, prueba de Mann-Whitney).
La FIG. 17 muestra muestras de suero de 25 donantes normales (no afectados), 19 donantes DM con un CDASI de <12, y 38 donantes DM con un CDASI de >12 analizadas para la presencia de proteína IFNp utilizando un kit ELISA de alta sensibilidad (PBLAssay Science) (prueba de Wilcoxon 'no afectados vs CDASI <12' p=0,39; prueba de Wilcoxon 'no afectado vs CDASI >12' p<0,0001).
Las FIGS. 18A-18B muestran niveles de ARNm de IFNa o IFNp (FIG. 18A) o una firma IRG en muestras de piel no afectada frente a piel afectada (FIG. 18B) en biopsias de piel emparejadas (es decir, tejido afectado y no afectado) recogidas de 5 pacientes con DM y evaluadas mediante una matriz personalizada de baja densidad TaqMan IFN tipo I (TLDA) (matriz de 96 ensayos). Cada punto de datos representa la media de 2 reacciones qPCR independientes por muestra; media ± SEM. Panel A: Prueba de intervalo con signo p-valor "IFNp no afectado frente a IFNp afectado"=0,06; Prueba de intervalo con signo p-valor "IFNa no afectado frente a IFNa afectado"=1,0. Panel B: Valor p de prueba de rango con firma "no afectado vs afectado"=0,002.
La FIG. 19 es un gráfico que muestra la inhibición dependiente de la dosis de CTI-AF1 de las proteínas híbridas IFNa/p. La ausencia (CID1281) o disminución (CID1280) de la inhibición de la fosforilación de STAT1 inducida por iFn indica que la inserción de la secuencia IFNa ha alterado el epítopo dentro de IFNp que es reconocido porCTI-AFI.
Las FIGS. 20A-20B muestra la estructura de co-cristal de cyno-IFNp y Fab de CTI-AF1. Los residuos del epítopo de unión se representan en gris en la FIG. 20A, y los residuos del paratopo de unión se representan en gris en la FIG. 20B
Descripción detallada de la invención
1. ANTICUERPOS ANTI-IFNp
A. Interferón beta (IFNp)
El interferón beta (IFNp), también conocido como IFN de fibroblastos, es un miembro glicosilado, secretado y de aproximadamente 22 kDa de la familia de moléculas de interferón de tipo I. La secuencia del precursor de IFNp humano se muestra como SEQ ID NO: 40. Un péptido señal (residuos 1-21 de SEQ ID NO: 40) del precursor se escinde para producir IFNp maduro (SEQ ID NO: 41), que comparte un 47 % y un 46 % de identidad de secuencia aminoacídica con las proteínas de ratón y rata, respectivamente. Las alineaciones de IFNp de varias especies se muestran en la Figura 15B. El péptido señal está subrayado en la secuencia siguiente.
MTNKCLLQIALLLCFSTTAL SMSYNLLGFL QRSSNFQCQKLLWQLNGRLE YCLKDRMNFD IPEEIKQLQQ
FQKEDAALTI YEMLQNIFAI FRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLK TVLEEKLEKE DFTRGKLMSS
LHLKRYYGRI LHYLKAKEYS HCAWTIVRVE ILRNFYFINR LTGYLRN (Human IFNPprecursor, SEQ
ID NO:40)
La estructura del IFNp contiene 5 a-hélices, designadas A (YNLLGFLQRSSNFQCQKLL; SEQ ID NO:153 o residuos 3-21 de SEQ ID NO:41), B (KEDAALTIYEMLQNIFAIF; SEQ ID NO:154 o residuos 52-70 de SEQ ID NO:41), C (ETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKL; SEQ ID NO:155 o residuos 81-106 de SEQ ID NO:41), D (SLHLKRYYGRILHYLKA; SEQ ID NO:156 o residuos 119-135 de SEQ ID NO:41) y E (HCAWTIVRVEILRNFYFINRLT; SEQ ID NO:157 o residuos 140-161 de SEQ ID NO:41). Las cinco a-hélices están interconectadas por bucles de 2 a 28 residuos denominados bucles AB, BC, CD y DE (Figura 15A). Se ha informado de que la hélice A, el bucle AB y la hélice E intervienen en la unión del IFNp a su receptor, el IFNa R.
B. Anticuerpos Anti-IFNp
Un posible inconveniente de un anticuerpo anti-IFNAR (por ejemplo, anifrolimab) es que tanto las citoquinas IFNa como IFNp se unen al IFNAR. Aunque estos dos tipos de citoquinas IFN provocan actividades biológicas similares en un grado parecido, existen diferencias significativas en la potencia y las actividades específicas de tipo celular entre estos dos tipos de IFN. Por ejemplo, el IFNp provoca una respuesta antiproliferativa notablemente mayor en algunos tipos celulares, como el carcinoma embrionario, el melanoma y los melanocitos, que el IFNa. También se ha observado una mayor potencia del IFNp en el tratamiento de la esclerosis múltiple y ciertos tipos de cáncer. Sin embargo, el bloqueo de la actividad de IFNAR no modula selectivamente las actividades de IFNp. Cabe destacar que el IFNa es una citoquina importante en la respuesta a las infecciones víricas, por lo que bloquear su actividad puede tener efectos no deseados. En consecuencia, un anticuerpo que se una especialmente al IFNp, pero no al IFNa, cubriría una importante necesidad no satisfecha para el tratamiento de enfermedades que están principalmente impulsadas por el IFNp.
La invención proporciona un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al IFNp humano. Como se muestra en los Ejemplos, el anticuerpo de la invención inhibe la unión del IFNp a su receptor, por lo que se denomina anticuerpo "neutralizante". Sin querer ceñirse a ninguna teoría en particular, los datos indican que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, bloquea, o bloquea parcialmente, los sitios de unión al receptor del IFNp, ya sea compitiendo por los mismos residuos o por residuos solapados del IFNAR, o creando impedimentos estéricos.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IFNp humano con un valor de afinidad de unión ( KD) que es al menos 100 veces menor, que su valor KD para un IFNa humano bajo sustancialmente las mismas condiciones de ensayo. Por ejemplo, la relación de KD para IFNp frente a KD para IFNa puede ser de 1:100 o menos, 1:250 o menos, 1:500 o menos, 1:1000 o menos, 1: 2500 o menos, 1:5000 o menos, o 1:10.000 o menos.
Los estudios de mutagénesis y los estudios de estructura cristalina también identificaron residuos de epítopos en IFNp humano que son reconocidos por los anticuerpos anti-IFNp divulgados en el presente documento. En concreto, entre todos los residuos de IFNp que se encuentran a menos de 3,8 A de un átomo pesado del anticuerpo (residuos de epítopos "potenciales"), se han identificado tres tipos diferentes: (i) residuos de epítopos "primarios" que se caracterizan por ser residuos muy enterrados en la interfaz anticuerpo-antígeno y una tolerancia de secuencia de cero a baja a cualquier otra sustitución de aminoácidos en esta posición; (ii) residuos de epítopos "secundarios" que se caracterizan por ser residuos con una superficie enterrada media en la interfaz y una tolerancia de secuencia media a las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones; y (iii) residuos de epítopos "opcionales" que se caracterizan por ser residuos con una superficie enterrada baja en la interfaz y una tolerancia de secuencia alta a las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones.
En el presente documento se proporciona el anticuerpo CTI-AF1 y sus variantes. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las siguientes secuencias CDR de cadena pesada: (i) CDR-H1 que comprende SEQ ID NO: 37' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO: 38, y CDR-H3 que comprende SEQ ID NO: 39; y (ii) las siguientes secuencias CDR de cadena ligera: CDR-L1 que comprende SEQ ID NO: 34' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO: 35, y CDR-L3 que comprende SEQ ID NO: 36.
Como demuestran los estudios de estructura cristalina, no todos los residuos de las CDR contribuyen a la unión anticuerpo-antígeno. Como se muestra en el Ejemplo 7 y en la Tabla 14, sólo un número limitado de residuos CDR están a menos de 3,8 A de un átomo pesado del antígeno, y se consideran residuos paratopo potenciales. Entre estos posibles residuos de parátopos, (i) los residuos de parátopos "primarios" son aquellos caracterizados como residuos altamente enterrados en la interfaz anticuerpo-antígeno y baja tolerancia de secuencia a cualquier otra sustitución de aminoácidos en esta posición; y (ii) los residuos de parátopos "secundarios" se caracterizan como residuos con menor superficie enterrada en la interfaz y mayor tolerancia de secuencia a las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento comprende (i) un CH que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 29; y/o (ii) una CL que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 30. La invención también abarca cualquier combinación de estas secuencias CH y CL.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento comprende un dominio Fc. El dominio Fc puede derivarse de IgA (por ejemplo, IgAi o IgA2), IgG, IgE o IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2 , IgG3 , o IgG4).
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento comprende (i) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 33, y/o (ii) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 32. La invención abarca también cualquier combinación de estas secuencias de cadena pesada y cadena ligera.
Los anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proporcionados en el presente documento incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (p. ej., Fab, Fab', F(ab')2 , Fv, Fc, etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos de cadena simple (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos de dominio (dAbs), anticuerpos humanizados y cualquier otra configuración de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluidas variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno pueden ser murinos, de rata, humanos o de cualquier otro origen (incluidos los anticuerpos quiméricos o humanizados). En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
La afinidad de unión de un anticuerpo puede expresarse como un valor Kd , que se refiere a la tasa de disociación de una interacción antígeno-anticuerpo particular. Kd es la relación entre la tasa de disociación, también llamada "tasa de desactivación (kdesactivación)", y la tasa de asociación, o "tasa de activación (kactivación)". Así, la Kd es igual a kdesactivación/kactivación (disociación/asociación) y se expresa como una concentración molar (M), y cuanto menor sea la Kd, mayor será la afinidad de unión. Los valores de Kd para los anticuerpos pueden determinarse utilizando procedimientos bien establecidos en la técnica. A menos que se especifique lo contrario, "afinidad de unión" se refiere a interacciones monovalentes (actividad intrínseca; por ejemplo, unión de un anticuerpo a un antígeno mediante una interacción monovalente).
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, tiene un valor de afinidad ( Kd) de no más de aproximadamente 1x1°-7 M, tal como no más de aproximadamente 1x1°-7 M, no más de aproximadamente 9*10-8 M, no más de aproximadamente 8*10-8 M, no más de aproximadamente 7*10-8 M, no más de aproximadamente 6*10-8 M, no más de aproximadamente 5*10-8 M, no más de aproximadamente4*10-8 M, no más de aproximadamente 3*10-8 M, no más de aproximadamente 2*10-8 M, no más de aproximadamente 1x1°-8 M, no más de aproximadamente 9*10-9 M, no más de aproximadamente 8*10-9 M, no más de aproximadamente7^10-9 M, no más de aproximadamente 6*10-9 M, no más de aproximadamente5^10-9 M, no más de aproximadamente 4*10-9 M, no más de aproximadamente 3*10-9 M, no más de aproximadamente2^10-9 M, no más de aproximadamente 1x1°-9 M, no más de aproximadamente 9*10-1° M, no más de aproximadamente 8*10-1° M, no más de aproximadamente 7*10-1° M, no más de aproximadamente 6*10-1° M, no más de aproximadamente 5*10-1° M, no más de aproximadamente 4*10-1° M, no más de aproximadamente 3x1°-1° M, no más de aproximadamente 2x1°-1° M, no más de aproximadamente 1x1°-1° M, no más de aproximadamente 9x1°-11 M, no más de aproximadamente 8x1°-11 M, no más de aproximadamente 7x1°-11 M, no más de aproximadamente 6x1°-11 M, no más de aproximadamente 5x1°-11 M, no más de aproximadamente 4x1°-11 M, no más de aproximadamente 3x1°-11 M, no más de aproximadamente 2x1°-11 M, no más de aproximadamente 1x1°-11 M, no más de aproximadamente 9x1°-12M, no más de aproximadamente 8x1°-12 M, no más de aproximadamente 7x1°-12 M, no más de aproximadamente 6x1°-12 M, no más de aproximadamente 5x1°-12 M, no más de aproximadamente 4x1°-12 M, no más de aproximadamente 3x1°-12 M, no más de aproximadamente 2x1°-12 M, no más de aproximadamente 1x1°-12 M, no más de aproximadamente 9x1°-13 M, no más de aproximadamente 8x1°-13 M, no más de aproximadamente 7x1°-13 M, no más de aproximadamente 6x1°-13 M, no más de aproximadamente 5x1°-13 M, no más de aproximadamente 4x1°-13 M, no más de aproximadamente 3x1°-13 M, no más de aproximadamente 2x1°-13 M, no más de aproximadamente 1x1°-13 M, de aproximadamente 1 x1°-7 M a aproximadamente 1 x1°-14 m , de aproximadamente 9 x1°-8 M a aproximadamente 1 x1°-14 m , de aproximadamente 8 x1°-8 M a aproximadamente 1 x1°-14 m , de 7 x1°-8 m a 1 x1°-14 m aproximadamente, de 6 «1°-8 M a 1 x i ° -14 m aproximadamente, de 5 x1°-8 M a 1 x1°-14 M aproximadamente, de 4 x1°-8 M a 1 x1°-14 M aproximadamente, de 3 x1°-8 M a 1 x1°-14 M aproximadamente, de aproximadamente 2 x1°-8 M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de aproximadamente 1 x1°-8M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de aproximadamente 9 x1°-9 M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de aproximadamente 8 x1°-9 M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de aproximadamente 7 x1°-9 M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de aproximadamente 6 x1°-9 M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de aproximadamente 5 x1°-9 M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de aproximadamente 4 x1°-9 M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de aproximadamente 3 x1°-9 M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de aproximadamente 2 x1°-9 M a aproximadamente 1 x1°-14 M, de 1 x1°-9M a 1 x1°-14 M aproximadamente, de 1 x1°-7 M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 9 x1°-8 M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 8 x1°-8 M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 7 x1°-8 M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 6 x1°-8 M a 1 x1°-13M aproximadamente, de 5 x1°-8 M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 4 x1°-8 M a 1 x1°-13M aproximadamente, de 3 x1°-8 M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 2 x1°-8 M a 1 x1°-13M aproximadamente, de 1 x1°-8M a 1 x1°-13M aproximadamente, de 9 x1°-9 M a 1 x1°-13M aproximadamente, de 8 x1°-9 M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 7 x1°-9M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 6 x1°-9 M a 1 x1°-13M aproximadamente, de 5 x1°-9 M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 4 x1°-9 M a 1 x1°-13M aproximadamente, de 3 x1°-9 M a 1 x1°-13 M aproximadamente, de 2 x1°-9 M a 1 x1°-13M aproximadamente o de 1 x1°-9M a 1 x1°-13 M aproximadamente.
El valor de Kd puede determinarse directamente mediante procedimientos bien conocidos, y puede calcularse incluso para mezclas complejas mediante procedimientos como los expuestos, por ejemplo, en Caceci et al. (1984) 9. 34°-362). Por ejemplo, la Kd puede establecerse utilizando un ensayo de unión con filtro de nitrocelulosa de doble filtro como el divulgado por Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9°: 34°-362). Otros ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de ligandos tales como anticuerpos hacia antígenos diana son conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo, ELISAs, transferencias Western, RIAs, y análisis de citometría de flujo, y otros ensayos ejemplificados en otra parte del presente documento.
Un procedimiento ejemplar para medir el valor de afinidad de unión ( Kd) es la resonancia de plasmón superficial (SPR), típicamente usando un sistema biosensor como un sistema BIACORE® . SPR se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensora, por ejemplo utilizando el sistema BIACORE® . El análisis cinético BIAcore comprende el análisis de la unión y disociación de un antígeno de un chip con una molécula inmovilizada (por ejemplo, una molécula que comprende un dominio de unión a antígeno), en su superficie; o la disociación de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de un chip con un antígeno inmovilizado. La medición SPR puede realizarse con un instrumento BIACORE® T1°° o T2°°. Por ejemplo, una condición de ensayo estándar para la resonancia de plasmón superficial puede basarse en la inmovilización de anticuerpos de aproximadamente 100-500 unidades de respuesta (RU) de IgG en el chip SPR. Las proteínas diana purificadas se diluyen en tampón hasta un intervalo de concentraciones finales y se inyectan a un caudal requerido (por ejemplo, 1°-1°° μl/min) para permitir el cálculo de Ka. Se deja que la disociación proceda para establecer la tasa de desactivación, seguida de MgCh 3 M (o 2° mM NaOH) para la regeneración de la superficie del chip. A continuación, los sensorgramas se analizan mediante un programa informático de evaluación cinética. En una realización ejemplar, el ensayo SPR se realiza de acuerdo con las condiciones establecidas en el Ejemplo 1.
Por ejemplo, el valor de afinidad de unión ( Kd) se mide utilizando un ensayo de exclusión cinética basado en solución (KinExA™). En una realización particular, la medición KinExAse lleva a cabo utilizando un instrumento KinExA™ 32°° (Sapidyne). El ensayo cinético de exclusión (KinExA™) es una plataforma de inmunoensayo de uso general (básicamente un espectrofluorímetro de flujo) capaz de medir constantes de disociación de equilibrio y constantes de velocidad de asociación y disociación para interacciones antígeno/anticuerpo. Dado que KinExA™ se lleva a cabo una vez obtenido el equilibrio, es una técnica ventajosa para medir la Kd de interacciones de alta afinidad en las que la tasa de desactivación de la interacción puede ser muy lenta. La metodología KinExA™ puede llevarse a cabo en general como se describe en Drake et al (2004) Analytical Biochemistry 328, 35-43.
Otro procedimiento para determinar la Kd de un anticuerpo es mediante el uso de interferometría de biocapa, utilizando típicamente la tecnología OCTET® (sistema Octet QKe, ForteBio).
En general, un anticuerpo anti-IFNp debe unirse a IFNp con alta afinidad, con el fin de bloquear eficazmente las actividades de IFNp. IFNp se une a IFNAR1 con una Kd de aproximadamente 50 nM, y a IFNAR2 con una Kd de aproximadamente 100 μM. En consecuencia, es deseable que el anticuerpo IFNp tenga afinidades de unión ( Kd) en el intervalo nanomolary picomolar, tal como aproximadamente 1 x i0 -9 M o inferior.
Ensayos de actividad
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención es un anticuerpo neutralizante que reduce al menos una actividad de IFNp. Dicha actividad de IFNp incluye, pero no se limita a, la unión a IFNAR, aumentar la expresión de un gen dependiente de IFNp, y/o inducir la fosforilación de, por ejemplo, STAT1, y/o STAT2, entre otras actividades de IFNp conocidas en la técnica. El hecho de que un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, reduzca una actividad de IFNp puede evaluarse mediante una serie de ensayos. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos para determinar si el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo: (a) inhibe la unión de IFNp a IFNAR; (b) reduce el nivel de expresión de un gen dependiente de IFNp; y/o (c) inhibe la fosforilación inducida por IFNp, tal como la fosforilación de STAT1, y/o STAT2.
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la unión de IFNp a IFNAR (por ejemplo, puede evaluarse mediante unión competitiva a IFNp). Por ejemplo, un ensayo puede comparar (i) la unión de IFNp a IFNAR en presencia del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, con (ii) la unión de IFNp a IFNAR en ausencia del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo. La reducción de la unión de IFNp a IFNAR puede ser de al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, en presencia del anticuerpo anti-IFNp, o fragmento de unión a antígeno del mismo. La unión esperada de IFNp a IFNAR en ausencia del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede establecerse como 100 %.
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la unión de IFNp a IFNAR, con una concentración inhibitoria media máxima ( IC50) de no más de aproximadamente 1*10'7 M, no más de aproximadamente 1*10'8 M, no más de aproximadamente 1*10'9 M, no más de aproximadamente 1x10'1° M, no más de aproximadamente 1x10'11 M, no más de aproximadamente 1x10'12 M, no más de aproximadamente 1x10'13 M, no más de aproximadamente 1*10' 14 M, no más de aproximadamente 1*10'15 M, de aproximadamente 1*10'7 M a aproximadamente 5*10'14 M, de aproximadamente 1*10'7 M a aproximadamente 1*10'14 M, de aproximadamente 1*10'7 M a aproximadamente 5*10' 13 M, de aproximadamente 1*10'7 M a aproximadamente 1*10'13 M, de aproximadamente 1*10'7 M a aproximadamente 5*10'12 M, o de aproximadamente 1*10'7 M a aproximadamente 1*10'12 M.
Las actividades de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención también pueden evaluarse midiendo el nivel de expresión de un gen dependiente de IFNp. Por ejemplo, el gen puede ser un componente corriente abajo en la vía de señalización mediada por IFNp (como CMPK2, IFIT1, IFI27, IFIH1, IFI44, IFI44L, IFI6, ISG15, LY6E, HERC5, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, RSAD2, XAF1, CXCL10, o cualquier combinación de los mismos). Alternativamente, el gen puede ser un gen reportero (por ejemplo, el gen reportero de luciferasa como se utiliza en los ejemplos) en el que el nivel de expresión del gen reportero se correlaciona con la actividad de IFNp (por ejemplo, el gen reportero está operativamente unido a un elemento de respuesta dependiente de IFNp). El nivel de expresión del gen corriente abajo o del gen informador puede evaluarse mediante diversos procedimientos, como la medición del nivel de ARN, el nivel de proteína o el nivel de actividad de una proteína. El ensayo puede comparar (i) el nivel de expresión del gen dependiente de IFNp en presencia del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, con (ii) el nivel de expresión del gen dependiente de IFNp en ausencia del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo. La reducción del nivel de expresión de un gen corriente abajo o de un gen informador puede ser de al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 %, en presencia del anticuerpo anti-IFNp, o fragmento de unión a antígeno del mismo. El nivel de expresión basal en ausencia del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede fijarse en el 100 %.
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la expresión de un gen dependiente de IFNp, con una concentración inhibitoria semimáxima ( IC50) de no más de aproximadamente 1*10-7 M, no más de aproximadamente 1*10-8 M, no más de aproximadamente 1*10-9 M, no más de aproximadamente 1*10-1° M, no más de aproximadamente 1*10-11 M, no más de aproximadamente 1*10-12 M, no más de aproximadamente 1*10-13 M, no más de aproximadamente 1*10-14 M, no más de aproximadamente 1*10-15 M, de aproximadamente 1*10-7 M a aproximadamente 5*10-14 M, de aproximadamente 1*10-7 M a aproximadamente 1*10-14 M, de aproximadamente 1 x io -7 M a aproximadamente 5*10-13 M, de aproximadamente 1*10-7 M a aproximadamente 1*10-13 M, de aproximadamente 1*10-7 M a aproximadamente 5*10-12 M, o de aproximadamente 1*10-7 M a aproximadamente 1*10-12 M. En determinadas realizaciones, se prefiere un IC50 de aproximadamente 1*10-1° M a aproximadamente 1*10-13 M. En ciertas realizaciones, se prefiere un IC50 de aproximadamente 5*10-11 M a aproximadamente 5*10-12 M.
La actividad inhibidora de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, también puede evaluarse midiendo el nivel de fosforilación inducida por IFNp, tal como la fosforilación de STAT1, y/o el nivel de fosforilación de STAT2. El ensayo puede comparar (i) el nivel de fosforilación de STAT1 y/o STAT2 en presencia del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, con (ii) el nivel de fosforilación de STAT1 y/o STAT2 en ausencia del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo. La reducción del nivel de fosforilación puede ser de al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 %, en presencia del anticuerpo anti-IFNp, o fragmento de unión a antígeno del mismo. El nivel basal de fosforilación de STAT1 y/o STAT2 en ausencia del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede establecerse en el 100 %.
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la fosforilación inducida por IFNp (tal como fosforilación de STAT1, y/o fosforilación de STAT2), con una concentración inhibitoria media máxima ( IC50) de no más de aproximadamente 1*10-7 M, no más de aproximadamente 1*10-8 M, no más de aproximadamente 1*10-9 M, no más de aproximadamente 1*10-1° M, no más de aproximadamente 1*10-11 M, no más de aproximadamente 1*10-12 M, no más de aproximadamente 1*10-13 M, no más de aproximadamente 1*10-14 M, no más de aproximadamente 1 x i0 -15 M, desde aproximadamente 1*10-7 M a de aproximadamente 1*10-7 M a aproximadamente 5*10-13 M, de aproximadamente 1*10-7 M a aproximadamente 1*10-13 M, de aproximadamente 1*10-7 M a aproximadamente 5*10-12 M, o de aproximadamente 1*10-7 M a aproximadamente 1 * i0 -12 M. En determinadas realizaciones, se prefiere un IC50 de aproximadamente 1*10-1° M a aproximadamente 1*10-13 M. En ciertas realizaciones, se prefiere un IC50 de aproximadamente 5*10-11 M a aproximadamente 5*10-12 M.
Las características del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención se evalúan además mediante otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su potencia, actividad farmacológica y eficacia potencial como agente terapéutico. Tales ensayos son conocidos en la técnica y dependen del uso previsto para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, ensayos de toxicidad, ensayos de inmunogenicidad, ensayos de estabilidad y/o perfiles PK/PD.
C. Ácidos nucleicos y procedimientos de producción de anticuerpos antilFNp
La invención también proporciona polinucleótidos que codifican el anticuerpo, incluyendo porciones de anticuerpo y anticuerpos modificados como se reivindica. La invención también proporciona un procedimiento para fabricar cualquiera de los polinucleótidos reivindicados. Los polinucleótidos pueden fabricarse y expresarse mediante procedimientos conocidos en la técnica.
La secuencia de un anticuerpo deseado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, y el ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede determinarse utilizando técnicas de secuenciación estándar. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo deseado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede insertarse en diversos vectores (como vectores de clonación y expresión) para la producción y caracterización recombinante. Un ácido nucleico que codifica la cadena pesada, o un fragmento de unión a antígeno de la cadena pesada, y un ácido nucleico que codifica la cadena ligera, o un fragmento de unión a antígeno de la cadena ligera, pueden clonarse en el mismo vector, o en vectores diferentes.
En un aspecto, la invención proporciona polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos del siguiente anticuerpo anti-IFNp y porciones de unión a antígeno del mismo: CTI-AF1.
La invención también proporciona polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NOs: (166) 167.
La invención también proporciona polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico del inserto de ADN del plásmido depositado en el ATCC y que tiene el número de acceso PTA-122727 o el inserto de ADN del plásmido depositado en el ATCC y que tiene el número de acceso PTA-122726.
En una realización, los dominios VH y VL, o la porción de unión a antígeno de los mismos, o HC o LC de longitud completa, están codificados por polinucleótidos separados. Alternativamente, tanto VH como VL, o la porción de unión a antígeno de las mismas, o HC y LC, están codificadas por un único polinucleótido.
Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de estas secuencias también se incluyen en la presente divulgación. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de ARNhn, que contienen intrones y se corresponden con una molécula de ADN de forma unívoca, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente divulgación, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o una porción del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes polinucleotídicas contienen una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones tales que la inmunorreactividad del polipéptido codificado no disminuye, en relación con una molécula inmunorreactiva nativa. El efecto sobre la inmunorreactividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, las variantes presentan al menos aproximadamente un 70 % de identidad, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 80 % de identidad, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 90 % de identidad, y en algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 95 % de identidad con una secuencia polinucleotídica que codifica un anticuerpo nativo o una porción del mismo. Estas cantidades no pretenden ser limitativas, y los incrementos entre los porcentajes mencionados se contemplan específicamente como parte de la divulgación.
Se dice que dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan normalmente comparando las secuencias a lo largo de una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un segmento de al menos unas 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a 75, o de 40 a 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado de forma óptima.
La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse utilizando el programa MegAlign® de la suite de software bioinformático Lasergene® (DNASTAR®, Inc., Madison, WI), utilizando los parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington d C Vol. 5, Suppl. 3, pp.
345-358; Hein J., 1990, Unified Approach toAlignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Teor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol.
4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 169(80):726-730)).
En algunas realizaciones, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, normalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Las variantes pueden también, o alternativamente, ser sustancialmente homólogas a un gen nativo, o a una porción o complemento del mismo. Dichas variantes polinucleotídicas son capaces de hibridarse en condiciones moderadamente estrictas con una secuencia de ADN natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).
Unas "condiciones moderadamente estrictas" adecuadas incluyen el prelavado en una solución de 5X SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridación a 50 °C-65 °C, 5X Ss C, durante toda la noche; seguido de dos lavados a 65 °C durante 20 minutos con cada una de las soluciones 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contienen 0,1 % SDS.
Tal como se utilizan en el presente documento, las "condiciones altamente rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad" son aquellas que: (1) emplear baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo 0,015 M de cloruro sódico/0,0015 M de citrato sódico/0,1 % de dodecil sulfato sódico a 50 °C; (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, 50 % (v/v) de formamida con 0,1 % de albúmina de suero bovino/0,1 % de Ficoll/0,1 % de polivinilpirrolidona/50 mM de tampón fosfato sódico a pH 6,5 con 750 mM de cloruro sódico, 75 mM de citrato sódico a 42 °C; o (3) emplear 50 % de formamida, 5X SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato sódico), 50 mM fosfato sódico (pH 6,8), 0,1 % pirofosfato sódico, 5X solución de Denhardt, ADN de espermatozoides de salmón sonicados (50 μg/mL), 0,1 % SDS y 10 % de sulfato de dextrano a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0,2X SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50 % a 55 °C, seguido de un lavado de alta rigurosidad consistente en 0,1X SSC que contiene EDTAa 55 °C. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptarse a factores como la longitud de la sonda y similares.
Se apreciará por aquellos de habilidad normal en la técnica que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos presentan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, la presente divulgación contempla específicamente polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotídicas aquí proporcionadas están dentro del alcance de la presente divulgación. Los alelos son genes endógenos alterados como resultado de una o más mutaciones, como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, aunque no necesariamente, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse mediante técnicas estándar (como la hibridación, la amplificación y/o la comparación de secuencias en bases de datos).
Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden obtenerse mediante síntesis química, procedimientos recombinantes o PCR. Los procedimientos de síntesis química de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y no es necesario describirlos en detalle en el presente documento. Un experto en la materia puede utilizar las secuencias aquí proporcionadas y un sintetizador de ADN comercial para producir la secuencia de ADN deseada.
Para preparar polinucleótidos utilizando procedimientos recombinantes, un polinucleótido que comprende una secuencia deseada puede insertarse en un vector adecuado, y el vector a su vez puede introducirse en una célula huésped adecuada para su replicación y amplificación, como se discute más adelante. Los polinucleótidos pueden insertarse en las células huésped por cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman introduciendo un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede mantenerse dentro de la célula como un vector no integrado (como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula huésped. El polinucleótido así amplificado puede aislarse de la célula huésped por procedimientos bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., 1989.
Alternativamente, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología PCR es bien conocida en la técnica y se describe en Patentes de EE.UU. n.° 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202 así como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
El ARN puede obtenerse utilizando el ADN aislado en un vector apropiado e insertándolo en una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, el ARN se puede aislar utilizando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, como se expone en Sambrook et al., 1989, por ejemplo.
Los vectores de clonación y expresión adecuados pueden incluir diversos componentes, como el promotor, el potenciador y otras secuencias reguladoras de la transcripción. El vector también puede construirse para permitir la clonación posterior de un dominio variable de anticuerpo en diferentes vectores.
Los vectores de clonación adecuados pueden construirse de acuerdo con técnicas estándar, o pueden seleccionarse de entre un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar en función de la célula huésped que se pretenda utilizar, los vectores de clonación útiles tendrán generalmente la capacidad de autorreplicarse, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden llevar genes para un marcador que pueda utilizarse en la selección de clones que contengan el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, μMB9, ColE1, pCR1, Rp4, ADN de fagos y vectores lanzadera como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Strategene e Invitrogen.
Se proporcionan además vectores de expresión. Los vectores de expresión generalmente son construcciones polinucleotídicas replicables que contienen un polinucleótido según la divulgación. Se sobreentiende que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped, ya sea como episomas o como parte integrante del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen, entre otros, plásmidos, vectores virales, incluidos adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, cósmidos y vectores de expresión divulgados en Publicación PCT n° WO 87/04462. Por lo general, los componentes del vector pueden incluir, entre otros, uno o más de los siguientes: una secuencia señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos adecuados de control transcripcional (como promotores, potenciadores y terminadores). Para la expresión (es decir, la traducción), también suelen ser necesarios uno o más elementos de control de la traducción, como sitios de unión a ribosomas, sitios de iniciación de la traducción y codones de parada.
Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés y/o los polinucleótidos mismos, pueden ser introducidos en la célula huésped por cualquiera de los medios apropiados, incluyendo electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula huésped.
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede fabricarse recombinantemente utilizando una célula huésped adecuada. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede clonarse en un vector de expresión, que a continuación puede introducirse en una célula huésped, como una célula E. coli, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula COS de simio, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula de mieloma en la que la célula no produce de otro modo una proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de un anticuerpo en la célula huésped recombinante. Las células huésped preferidas incluyen una célula CHO, una célula de riñón embrionario humano (HEK) 293, o una célula Sp2.0, entre muchas células bien conocidas en la técnica.
Un fragmento de anticuerpo puede producirse por degradación proteolítica o de otro tipo de un anticuerpo de longitud completa, por procedimientos recombinantes o por síntesis química. Un fragmento polipeptídico de un anticuerpo, especialmente polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, puede fabricarse convenientemente mediante síntesis química. Los procedimientos de síntesis química de proteínas y péptidos son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención puede ser madurado por afinidad. Por ejemplo, un anticuerpo madurado por afinidad puede producirse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896y WO2004/058184).
2. FORMULACIONES Y USOS
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención puede formularse como una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender además un portador, excipiente y/o estabilizador farmacéuticamente aceptable (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover), en forma de formulación liofilizada o solución acuosa. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes como ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio, el cloruro de bencetonio; el fenol, el alcohol butílico o el bencílico; los alquilparabenos, tales como el metil o el propilparabeno; el catecol; el resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y mcresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina de suero, la gelatina o las Igs; polímeros hidrófilos, tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como la glicina, la glutamina, la asparagina, la histidina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono tales como la glucosa, la manosa o las dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares tales como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; contra-iones formadores de sal tales como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen con más detalle en el presente documento.
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención puede utilizarse para diversos fines terapéuticos o de diagnóstico. Por ejemplo, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención puede usarse como agente de purificación por afinidad (por ejemplo, para purificación in vitro de IFNp), como agente de diagnóstico (por ejemplo, para detectar la expresión de IFNp en células, tejidos o suero específicos).
Los usos terapéuticos ejemplares del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluyen el tratamiento de una enfermedad reumática (como LES o DM) o una interferonopatía. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, también puede utilizarse en el tratamiento profiláctico (por ejemplo, administrándolo a un sujeto que no ha presentado síntomas de la enfermedad pero que es susceptible de padecer una enfermedad reumática o una interferonopatía).
Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención puede administrarse a un mamífero, especialmente a un humano mediante técnicas convencionales, como por vía intravenosa (como bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo), intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención también se administra adecuadamente por vía intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional.
En consecuencia, aunque los procedimientos para el tratamiento del cuerpo animal o humano mediante cirugía o terapia no están comprendidos en las reivindicaciones, la divulgación proporciona un procedimiento para reducir la actividad de IFNp, que comprende administrar a un sujeto (por ejemplo, un humano) que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención. Sin embargo, esto debe interpretarse como sustancias y composiciones para su uso en dicho tratamiento.
En ciertos casos, el sujeto padece o es susceptible de padecer una enfermedad reumática. En ciertas realizaciones, la enfermedad reumática es LES. En ciertas realizaciones, la enfermedad reumática es DM.
En ciertas realizaciones, el sujeto padece o es susceptible de padecer una interferonopatía.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención se administra por vía subcutánea. En ciertas realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención se administra por vía intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a un sujeto que las necesite con una frecuencia que puede variar con la gravedad de la enfermedad reumática o la interferonopatía. En el caso de la terapia profiláctica, la frecuencia puede variar en función de la susceptibilidad o predisposición del sujeto a padecer una enfermedad reumática o una interferonopatía.
Las composiciones pueden administrarse a los pacientes que lo necesiten en forma de bolo o mediante infusión continua. Por ejemplo, una administración en bolo de un anticuerpo presente como fragmento Fab puede ser en una cantidad de 0,0025 a 100 mg/kg de peso corporal, 0,025 a 0,25 mg/kg, 0,010 a 0,10 mg/kg o 0,10-0,50 mg/kg. Para infusión continua, un anticuerpo presente como fragmento Fab puede administrarse a 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal/minuto, 0,0125 a 1,25 mg/kg/min, 0,010 a 0,75 mg/kg/min, 0,010 a 1,0 mg/kg/min. o 0,10-0,50 mg/kg/min durante un periodo de 1-24 horas, 1-12 horas, 2-12 horas, 6-12 horas, 2-8 horas, o 1-2 horas.
Para la administración de un anticuerpo presente como anticuerpo de longitud completa (con regiones constantes completas), las cantidades de dosificación pueden ser de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg o más, de aproximadamente 2 mg/kg o más, de aproximadamente 3 mg/kg o más, de aproximadamente 4 mg/kg o más, de aproximadamente 5 mg/kg o más, de aproximadamente 6 mg/kg o más, de aproximadamente 7 mg/kg o más, de aproximadamente 8 mg/kg o más, de aproximadamente 9 mg/kg o más, superior o igual a 10 mg/kg, superior o igual a 11 mg/kg, superior o igual a 12 mg/kg, superior o igual a 13 mg/kg, superior o igual a 14 mg/kg, superior o igual a 15 mg/kg, superior o igual a 16 mg/kg, superior o igual a 17 mg/kg, superior o igual a 19 mg/kg o superior o igual a 20 mg/kg. La frecuencia de la administración dependerá de la gravedad de la afección. La frecuencia puede oscilar entre tres veces por semana y una vez cada dos o tres semanas.
Además, las composiciones pueden administrarse a los pacientes mediante inyección subcutánea. Por ejemplo, puede administrarse a los pacientes una dosis de 1 a 100 mg de anticuerpo anti-IFNp mediante inyección subcutánea o intravenosa administrada dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada nueve semanas, una vez cada diez semanas, dos veces al mes, una vez al mes, una vez cada dos meses o una vez cada tres meses. Por ejemplo, el anticuerpo CTI-AF1 tiene una semivida estimada de aproximadamente 19 días. Esta semivida permite la inyección subcutánea o intravenosa cada 2-6 semanas, por ejemplo una vez cada 2 semanas o una vez cada 4 semanas.
En ciertos casos, la semivida del anticuerpo anti-IFNp en humanos es de aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 15 días, aproximadamente 16 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 18 días, aproximadamente 19 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 21 días, aproximadamente 22 días, aproximadamente 23 días, aproximadamente 24 días, aproximadamente 25 días, aproximadamente 26 días, aproximadamente 27 días, aproximadamente 28 días, aproximadamente 29 días, aproximadamente 30 días, de aproximadamente 5 días a aproximadamente 40 días, de aproximadamente 5 días a aproximadamente 35 días, de aproximadamente 5 días a aproximadamente 30 días, de aproximadamente 5 días a aproximadamente 25 días, de aproximadamente 10 días a aproximadamente 40 días, de aproximadamente 10 días a aproximadamente 35 días, de aproximadamente 10 días a aproximadamente 30 días, de aproximadamente 10 días a aproximadamente 25 días, de aproximadamente 15 días a aproximadamente 40 días, de aproximadamente 15 días a aproximadamente 35 días, de aproximadamente 15 días a aproximadamente 30 días, o de aproximadamente 15 días a aproximadamente 25 días,
La composición farmacéutica puede administrarse por vía subcutánea o intravenosa cada 2-6 semanas, con una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 8 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 8 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 8 mg/kg, de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 8 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 8 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg, de aproximadamente 1,0 mg/kg, de aproximadamente 1,5 mg/kg, de aproximadamente 2,0 mg/kg, de aproximadamente 2.5 mg/kg, aproximadamente 3,0 mg/kg, aproximadamente 3,5 mg/kg, aproximadamente 4,0 mg/kg, aproximadamente 4,5 mg/kg, aproximadamente 5.0 mg/kg, aproximadamente 5,5 mg/kg, aproximadamente 6,0 mg/kg, aproximadamente 6,5 mg/kg, aproximadamente 7.0 mg/kg, aproximadamente 7,5 mg/kg, aproximadamente 8,0 mg/kg, aproximadamente 8,5 mg/kg, aproximadamente 9.0 mg/kg, aproximadamente 9,5 mg/kg o aproximadamente 10,0 mg/kg.
La composición farmacéutica puede administrarse por vía subcutánea o intravenosa cada 2-6 semanas, con una dosis de aproximadamente 2,0 mg/kg. La composición farmacéutica puede administrarse por vía subcutánea o intravenosa cada 2-6 semanas, con una dosis de aproximadamente 2,0 mg/kg a aproximadamente 10,0 mg/kg.
La composición farmacéutica puede administrarse por vía subcutánea cada 2 semanas.
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención puede utilizarse como monoterapia o en combinación con otras terapias para tratar una enfermedad reumática.
3. Definiciones
A menos que se definan de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados comúnmente entendidos por los expertos en la materia. Además, salvo que el contexto exija lo contrario, los términos en singular incluirán los plurales y los términos en plural incluirán los singulares. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con el cultivo de células y tejidos, la biología molecular, la inmunología, la microbiología, la genética, la química de proteínas y ácidos nucleicos y la hibridación descritas en el presente documento son las conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica.
Un "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se refiere a un fragmento de un anticuerpo de longitud completa que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (preferentemente con sustancialmente la misma afinidad de unión). Ejemplos de un fragmento de unión a antígeno incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd formado por los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv formado por los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región aislada determinante de la complementariedad (CDR), Fvs ligados a disulfuro (dsFv), y anticuerpos e intracuerpos antiidiotípicos (anti-ld). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando procedimientos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite fabricarlos como una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv)); véase por ejemplo, Bird et al. Science 242:423-426 (1988) y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85(5879):5883-1988)). También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena simple, como los diabodies. Los diábolos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, obligando así a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígenos (véase, por ejemplo, Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993); Poljaketal., 1994, Structure 2:1121-1123).
El "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH), solas o combinadas. Como se sabe en la técnica, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera constan cada una de tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), y están conectadas por cuatro regiones marco (FR), y contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos.
Los residuos de un dominio variable se numeran según Kabat, que es un sistema de numeración utilizado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos. Véase, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia lineal de aminoácidos real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, un FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un único aminoácido insertado (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de CDR-H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, según Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat "estándar". Existen varios algoritmos para asignar la numeración de Kabat. El algoritmo implementado en la versión 2012 de Abysis (www.abysis.org) se utiliza aquí para asignar la numeración de Kabat a las regiones variables a menos que se indique lo contrario.
Las posiciones específicas de residuos de aminoácidos en un anticuerpo (como los residuos de paratope) también se numeran según Kabat.
Las "Regiones Determinantes de Complementariedad" (CDRs) pueden ser identificadas de acuerdo a las definiciones de Kabat, Chothia, la acumulación de ambas Kabat y Chothia, AbM, contacto, y/o definiciones conformacionales o cualquier procedimiento de determinación de CDR bien conocido en el arte. Véase, por ejemplo Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. (regiones hipervariables); Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883 (estructuras estructurales de bucle). La definición AbM de las CDR es un compromiso entre Kabat y Chothia y utiliza el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (Accelrys®). La definición de "contacto" de las CDR se basa en los contactos observados entre antígenos, expuestos en MacCallum et al., 1996, J. Mol. 169(262):732-745)). La definición "conformacional" de las CDR se basa en los residuos que contribuyen de forma entálpica a la unión del antígeno (véase, p. ej, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166). Otras definiciones de los límites de los c Dr pueden no seguir estrictamente uno de los enfoques anteriores, pero sin embargo coincidirán con al menos una parte de los CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de la predicción o los resultados experimentales de que determinados residuos o grupos de residuos o incluso CDR enteros no afectan significativamente a la unión al antígeno. Tal y como se utiliza en el presente documento, un CDR puede referirse a CDR definidos mediante cualquier enfoque conocido en la técnica, incluidas combinaciones de enfoques.
En los Ejemplos (véase la Tabla 11), las CDR se definen como sigue (numeración según Kabat; H: cadena pesada; L: cadena ligera):
CDR-H1: H26-H35B; CDR-H2: H50-H65; CDR-H3: H95-H102
CDR-L1: L24-L34; CDR-L2: L50-L56; CDR-L3: L89-L97
Los residuos "marco" (FR) son residuos del dominio variable del anticuerpo distintos de los residuos CDR. Un marco de dominio VH o VL comprende cuatro subregiones marco, FR1, FR2, FR3 y FR4, intercaladas con CDR en la siguiente estructura: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. En los Ejemplos (véase la Tabla 11), los residuos FR incluyen los siguientes (numeración según Kabat; H: cadena pesada; L: cadena ligera):
Tabla 5
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Un "epítopo" se refiere a la zona o región de un antígeno (Ag) a la que se une específicamente un anticuerpo, por ejemplo, una zona o región que comprende residuos de aminoácidos que interactúan con el anticuerpo (Ab). Los epítopos pueden ser lineales o no lineales (por ejemplo, conformacionales).
Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une sustancialmente al mismo epítopo que otro anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, cuando la unión de los anticuerpos correspondientes, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son mutuamente excluyentes. Es decir, la unión de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, excluye la unión simultánea o consecutiva del otro anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo. Se dice que los epítopos son únicos, o no sustancialmente iguales, si el antígeno es capaz de acomodar la unión de ambos anticuerpos correspondientes, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, simultáneamente.
El término "paratopo" se deriva de la definición anterior de "epítopo" invirtiendo la perspectiva, y se refiere a la zona o región de una molécula de anticuerpo que interviene en la unión de un antígeno, por ejemplo, una zona o región que comprende residuos que interactúan con el antígeno. Un paratopo puede ser lineal o conformacional (como los residuos discontinuos en las CDR).
El epítopo/paratopo para un determinado par de unión anticuerpo/antígeno puede definirse y caracterizarse a diferentes niveles de detalle utilizando una variedad de procedimientos experimentales y computacionales de mapeo de epítopos. Los procedimientos experimentales incluyen la mutagénesis, la cristalografía de rayos X, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), la espectrometría de masas por intercambio de hidrógeno/deuterio (HX-MS) y diversos procedimientos de unión competitiva. Como cada procedimiento se basa en un principio único, la descripción de un epítopo está íntimamente ligada al procedimiento por el que se ha determinado. Así pues, el epítopo/paratopo de un determinado par anticuerpo/antígeno se definirá de forma diferente en función del procedimiento de mapeo empleado.
En su nivel más detallado, el epítopo/paratopo de la interacción entre un anticuerpo (Ab) y un antígeno (Ag) puede definirse mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos presentes en la interacción Ag-Ab, así como información sobre sus contribuciones relativas a la termodinámica de unión. A un nivel, un residuo epítopo/paratopo puede caracterizarse por las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos entre el Ag y el Ab. En un aspecto, el residuo epítopo/paratopo puede definirse mediante un criterio específico, por ejemplo, la distancia entre átomos en el Ab y el Ag (por ejemplo, una distancia igual o inferior a aproximadamente 4 A (como 3,8 A utilizado en los Ejemplos aquí) de un átomo pesado del anticuerpo cognado y un átomo pesado del antígeno. En otro aspecto, un residuo de epítopo/paratopo puede caracterizarse por participar en una interacción de enlace de hidrógeno con el anticuerpo/antígeno afín, o con una molécula de agua que también está unida por enlace de hidrógeno al anticuerpo/antígeno afín (enlace de hidrógeno mediado por agua). En otro aspecto, un residuo de epítopo/paratopo puede caracterizarse por formar un puente salino con un residuo del anticuerpo/antígeno afín. En otro aspecto, un residuo epítopo/paratopo puede caracterizarse como un residuo que tiene un cambio distinto de cero en el área superficial enterrada (BSA) debido a la interacción con el anticuerpo/antígeno afín. A un nivel menos detallado, el epítopo/paratopo puede caracterizarse a través de la función, por ejemplo, mediante la competición de unión con otros Abs. El epítopo/paratopo también puede definirse de forma más genérica como aquel que comprende residuos de aminoácidos cuya sustitución por otro aminoácido alterará las características de la interacción entre el Ab y elAg (por ejemplo, la exploración de la alanina).
En el contexto de una estructura cristalina derivada de rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab o dos fragmentos Fab, y su antígeno, a menos que se especifique lo contrario, un residuo de epítopo se refiere a un residuo de IFNp (i) que tiene un átomo pesado (es decir, un átomo que no es de hidrógeno) que está dentro de una distancia de aproximadamente 4 A (por ejemplo, 3,8 A) de un átomo pesado del anticuerpo cognado; (ii) que participa en un enlace de hidrógeno con un residuo del anticuerpo cognado, o con una molécula de agua que también está unida por enlace de hidrógeno al anticuerpo cognado (enlace de hidrógeno mediado por agua), (iii) que participa en un puente salino con un residuo del anticuerpo cognado, y/o (iv) que tiene un cambio distinto de cero en el área superficial enterrada (BSA) debido a la interacción con el anticuerpo cognado. En general, se impone un límite a la BSA para evitar la inclusión de residuos con interacciones mínimas. Por lo tanto, a menos que se especifique lo contrario, los residuos del epítopo de la categoría (iv) se seleccionan si tiene un BSA de 20 A2 o superior, o participa en interacciones electrostáticas cuando el anticuerpo se une al IFNp. Del mismo modo, en el contexto de una estructura cristalina derivada de rayos X, a menos que se especifique lo contrario o el contexto lo contradiga, un residuo paratopo, se refiere a un residuo de anticuerpo (i) que tiene un átomo pesado (es decir, un átomo que no es de hidrógeno) que está a una distancia de aproximadamente 4 A de un átomo pesado de IFNp, (ii) que participa en un enlace de hidrógeno con un residuo de IFNp, o con una molécula de agua que también está unida por enlace de hidrógeno a IFNp (enlace de hidrógeno mediado por agua), (iii) que participa en un puente salino con un residuo de IFNp, y/o (iv) que tiene un cambio distinto de cero en el área superficial enterrada debido a la interacción con IFNp. De nuevo, a menos que se especifique lo contrario, se seleccionan los residuos paratopo de la categoría (iv) si tiene un BSA de 20 A2 o superior, o participa en interacciones electrostáticas cuando el anticuerpo se une al IFNp. Los residuos identificados por (i) distancia o (iv) BSA suelen denominarse residuos "de contacto".
Del hecho de que las descripciones y definiciones de epítopos, dependen del procedimiento de mapeo de epítopos utilizado, y se obtienen a diferentes niveles de detalle, se deduce que la comparación de epítopos para diferentes Abs en el mismo Ag puede realizarse de forma similar a diferentes niveles de detalle. Por ejemplo, se dice que los epítopos descritos a nivel de aminoácidos, por ejemplo, determinados a partir de una estructura de rayos X, son idénticos si contienen el mismo conjunto de residuos de aminoácidos. Se dice que los epítopos caracterizados por una unión competitiva están solapados si la unión de los anticuerpos correspondientes es mutuamente excluyente, es decir, la unión de un anticuerpo excluye la unión simultánea o consecutiva del otro anticuerpo; y se dice que los epítopos están separados (únicos) si el antígeno es capaz de acomodar la unión de los dos anticuerpos correspondientes simultáneamente.
El epítopo y el parátopo de un par anticuerpo/antígeno dado pueden identificarse por procedimientos rutinarios. Por ejemplo, la localización general de un epítopo puede determinarse evaluando la capacidad de un anticuerpo para unirse a diferentes fragmentos o variantes de polipéptidos IFNp, como se describe con más detalle anteriormente en otra parte del presente documento. Los residuos específicos dentro de IFNp que hacen contacto con residuos específicos dentro de un anticuerpo también pueden determinarse utilizando procedimientos rutinarios, como los descritos en los ejemplos. Por ejemplo, el complejo anticuerpo/antígeno puede cristalizarse. La estructura cristalina puede determinarse y utilizarse para identificar sitios específicos de interacción entre el anticuerpo y el antígeno.
Los términos "se une específicamente" y "unión específica" son términos bien comprendidos en la técnica, y los procedimientos para determinar dicha unión específica también son bien conocidos en la técnica. Se dice que una molécula presenta una "unión específica" si reacciona o se asocia con mayor frecuencia, rapidez, duración y/o afinidad con una célula o sustancia concreta que con otras células o sustancias alternativas. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se "une específicamente" a una diana (por ejemplo, IFNp) si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias.
Por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a IFNp es un anticuerpo que se une a su antígeno cognado (IFNp) con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración que se une a otros antígenos, tales como otros miembros de la superfamilia IFN (por ejemplo, INFa, IFNy, IFNw), u otras moléculas no relacionadas. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IFNp puede unirse específicamente al IFNp humano en una muestra, pero no reconocer ni unirse sustancialmente a otras moléculas de la muestra en una condición de ensayo de unión estándar. También se entiende que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a una primera diana puede o no unirse específicamente a una segunda diana. Como tal, la "unión específica" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) la unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a "unión" significa unión específica.
Se puede utilizar una variedad de formatos de ensayo para seleccionar un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a una molécula de interés. Por ejemplo, el inmunoensayo ELISA en fase sólida, la inmunoprecipitación, Biacore™ (GE Healthcare), KinExA, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), Octet™ (FortéBio, Inc.) y el análisis de transferencia Western son algunos de los muchos ensayos que pueden utilizarse para identificar un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un antígeno. Típicamente, una unión específica será al menos el doble de la señal o ruido de fondo, más típicamente al menos 10 veces el fondo, al menos 50 veces el fondo, al menos 100 veces el fondo, al menos 500 veces el fondo, al menos 1000 veces el fondo, o al menos 10.000 veces el fondo.
La especificidad de la unión de un anticuerpo puede evaluarse determinando y comparando los valores de Kd de una unión específica entre un anticuerpo y el IFNp, con el valor de Kd de un anticuerpo de control que se sabe que no se une al IFNp. En general, se dice que un anticuerpo se "une específicamente" a un antígeno cuando la Kd es de aproximadamente *10'5 M o menos.
Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, "no se une sustancialmente" a un antígeno cuando no se une a dicho antígeno con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otros antígenos. Normalmente, la unión no será superior al doble de la señal o ruido de fondo. En general, se une al antígeno con una Kd de 1*10'4 M o más, 1x10'3 M o más, 1*10'2 M o más, o 1x10'1 M o más.
El término "competir", tal como se utiliza aquí con respecto a un anticuerpo, significa que la unión de un primer anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, a un antígeno reduce la unión posterior del mismo antígeno por un segundo anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo. En general, la unión de un primer anticuerpo crea un impedimento estérico, un cambio conformacional o la unión a un epítopo común (o a una porción del mismo), de forma que se reduce la unión del segundo anticuerpo al mismo antígeno. Para determinar si dos anticuerpos compiten entre sí pueden utilizarse ensayos de unión competitiva estándar.
Un ensayo adecuado para la competición de anticuerpos implica el uso de la tecnología Biacore, que puede medir el alcance de las interacciones usando la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR), típicamente usando un sistema biosensor (tal como un sistema BIACORE® ). Por ejemplo, la SPR puede utilizarse en un ensayo de inhibición de unión competitiva in vitro para determinar la capacidad de un anticuerpo de inhibir la unión de un segundo anticuerpo. Otro ensayo para medir la competencia de anticuerpos utiliza un enfoque basado en ELISA. Además, en el documento WO2003/48731 se describe un proceso de alto rendimiento para "agrupar" anticuerpos en función de su competencia . Existe competencia si un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, reduce la unión de otro anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, al IFNp. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo de competición de unión secuencial, añadiendo diferentes anticuerpos secuencialmente. El primer anticuerpo puede añadirse para alcanzar una unión cercana a la saturación. A continuación, se añade el segundo anticuerpo. Si la unión del segundo anticuerpo al IFNp no se detecta, o se reduce significativamente (por ejemplo, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % de reducción) en comparación con un ensayo paralelo en ausencia del primer anticuerpo (cuyo valor puede establecerse como 100 %), se considera que los dos anticuerpos compiten entre sí. En el Ejemplo 1 se proporciona un ensayo ejemplar de competición de anticuerpos (y análisis de epítopos solapados) mediante SPR.
También se puede realizar un ensayo de unión competitiva en el que la unión del anticuerpo al antígeno se compara con la unión de la diana por otro socio de unión de esa diana, como otro anticuerpo o un receptor soluble que de otro modo se une a la diana. La concentración a la que se produce una inhibición del 50 % se conoce como Ki. En condiciones ideales, la Ki es equivalente al Kd. Así, en general, la medición de Ki puede sustituirse convenientemente para proporcionar un límite superior para Kd. Las afinidades de unión asociadas con diferentes interacciones moleculares, por ejemplo, la comparación de la afinidad de unión de diferentes anticuerpos para un antígeno dado, pueden compararse mediante la comparación de los valores de Kd para los complejos anticuerpo/antígeno individuales. Los valores de KD para anticuerpos u otros socios de unión pueden determinarse utilizando procedimientos bien establecidos en la técnica.
Una proteína de "fusión Fc" es una proteína en la que uno o más polipéptidos están unidos de forma operable a un polipéptido Fc. Una fusión Fc combina la región Fc de una inmunoglobulina con un compañero de fusión. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana suele definirse para que se extienda desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el carboxiloterminal de la misma. La numeración de los residuos de la región Fc es la del índice UE descrito en Kabat et al., Secuencias de proteínas de interés inmunológico, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,Md., 1991. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, CH2 y CH3. Como es conocido en la técnica, una región Fc puede estar presente en forma dímera o monomérica.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un anticuerpo anti-IFNp, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una combinación que comprende dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que es de cantidad suficiente para lograr el propósito previsto, tal como la disminución de la unión de IFNp a IFNAR, la disminución de la fosforilación de STAT1 y/o STAT2, la disminución de la expresión del gen dependiente de IFNp, o causar de otro modo un beneficio medible in vivo a un sujeto necesitado. La cantidad exacta dependerá de numerosos factores, incluidos, entre otros, los componentes y las características físicas de la composición terapéutica, la población de pacientes prevista, las consideraciones individuales de los pacientes, etc., y puede determinarla un experto en la materia.
El término "tratamiento" incluye tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. Si se administra antes de la manifestación clínica de una enfermedad, trastorno o afección, el tratamiento se considera profiláctico. El tratamiento terapéutico incluye, por ejemplo, mejorar o reducir la gravedad de una enfermedad, trastorno o afección, o acortar la duración de la enfermedad, trastorno o afección. Preferentemente, la enfermedad, trastorno o afección está mediada por o relacionada con la unión de IFNp a IFNAR.
El término "aproximadamente", tal como se utiliza aquí, se refiere a /-10 % de un valor.
DEPÓSITO BIOLÓGICO
Los materiales representativos de la presente invención se depositaron en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, Estados Unidos, el 18 de diciembre de 2015. El vector CTI-AF1-VH, con número de acceso ATCC PTA-122727, comprende un inserto de ADN que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo CTI-AF1, y el vector CTI-AF1-VL, con número de acceso ATCC PTA-122726, comprende un inserto de ADN que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo CTI-AF1. Los depósitos se realizaron en virtud de lo dispuesto en el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes y su Reglamento (Tratado de Budapest).
Ejemplos
La invención se describe con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se facilitan a título meramente ilustrativo y no pretenden ser limitativos, a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos anti-IFNp
El anticuerpo CTI-AF1 es un anticuerpo IgG1 humanizado contra la citoquina soluble interferón beta (IFNp). Se generó un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb de ratón) contra el IFNp humano mediante inmunizaciones estándar de ratones BALB/c hembra con IFNp humano, y el posterior cribado de hibridomas.
Se seleccionaron dos clones de hibridoma para la humanización basándose en el perfil cinético de unión. Los clones mostraron un valor Kd de aproximadamente 20nM y un IC50 de aproximadamente 20nM. Los clones de hibridoma se humanizaron utilizando secuencias de marco de la línea germinal humana de IGKV1-39 (dominio variable de la cadena ligera DPK9; n° de acceso al banco de genes X59315) e IGHV1-69 (dominio variable de la cadena pesada DP10; n° de acceso al banco de genes L22582).
Se utilizaron múltiples rondas de maduración por afinidad para aumentar la afinidad del anticuerpo. Las secuencias de la región VL de estos anticuerpos se muestran en la Tabla 11. Todos los anticuerpos de la Tabla 11 tienen la misma secuencia VH. En particular, CTI-AF1 mostró una disminución del valor Kd de 25 nM a 29 μM al introducir las siguientes mutaciones en el dominio variable de la cadena ligera: Mutación de S a G en la posición 30, mutaciones de H a I y de T a I en las posiciones 92 y 93 respectivamente, y mutación de L a I en la posición 96. No se introdujeron mutaciones en el dominio variable de la cadena pesada.
Las afinidades de los anticuerpos CTI-AF al interferón beta humano (IFNp) se determinaron por SPR como sigue, utilizando un instrumento Biacore T200. Los anticuerpos se inmovilizaron directamente en la superficie de un chip sensor CM5 a temperatura ambiente, utilizando la técnica estándar de acoplamiento de aminas. Los niveles de inmovilización abarcaban una gama de 49 a 375 unidades de resonancia (UR). A continuación, se inyectó el analito, IFNp humano recombinante, en una serie de diluciones que iban desde 10 nM hasta 0,078 nM (dilución doble), a un caudal de 30 a 50 μl por minuto durante un tiempo de asociación que oscilaba entre 65 y 300 segundos, seguido de una fase de disociación de 10 minutos. Cada concentración se evaluó por duplicado. El analito se eliminó regenerando la superficie del chip sensor CM5 entre cada ciclo utilizando MgCh 3 M a pH 3,0 o 10 mM glicina-HCl a pH 1,5, seguido de un enjuague con tampón. Este paso de regeneración eliminó el analito ligado y devolvió la señal de respuesta a la línea de base. Los datos de la celda de flujo de referencia (sin analito) se restaron de las respuestas de unión al antígeno para eliminar los artefactos sistemáticos. La afinidad de unión aparente se determinó con un modelo de interacción 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore T200 versión 2.0. La constante de equilibrio Kd se determinó como la relación de las constantes de velocidad cinética,kd/ka. La unión se validó repitiendo los experimentos de unión durante varios días, utilizando dos instrumentos distintos y diferentes celdas de flujo en el chip sensor CM5. Los resultados se resumen en la Tabla 6.
Tabla 6 resúmenes de las actividades biológicas de los anticuerpos de la Tabla 11
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Ejemplo 2. PROPIEDADES BIOFISICAS DE LOS ANTICUERPOS ANTI-IFNp
CTI-AF1 se dializó y concentró a 150 mg/mL en tampón MOD1 con membrana de celulosa regenerada de 10KMWCO. El material de HTA de mono cynomolgus se ultrafiltró/diafiltró en el mismo tampón hasta una concentración final de 72 mg/mL con pérdidas mínimas de producto. Cuando se formuló en PBS, pH 7,2 a ~50 mg/mL, el CTI-AF1 se separó en fase a 2-8 °C y formó una emulsión lechosa estable. Al calentarse a temperatura ambiente, la solución vuelve a ser transparente. En el tampón MOD1 no se produjo separación de fases.
La viscosidad se midió a 22 °C utilizando el viscosímetro mVROC. Las inyecciones se realizaron a 100 μl/min utilizando una jeringa Hamilton de 100 μl. En la figura 1 se muestra la dependencia de la viscosidad con respecto a la concentración. Incluso con la concentración máxima, la viscosidad sigue siendo inferior a 10 cP.
La estabilidad térmica se evaluó utilizando MicroCal VP-DSC (Malvern). CTI-AF1 se exploró a 1 mg/mL de proteína en tampón MOD1 a 1 grad/min. Como se muestra en la Figura 2, la primera transición de fusión de esta molécula se produce a 69,4 °C, lo que está muy por encima del umbral de estabilidad requerido conocido para su fabricación a escala comercial.
La estabilidad a pH bajo se evaluó titulando el grupo de proteína A con ácido cítrico hasta pH 2,8, 3,0 y 3,4 e incubando durante 5 horas a temperatura ambiente antes de neutralizar a pH 7,0. Como se muestra en la Figura 3, la formación de HMMS sólo se produce a pH 2,8, mientras que a niveles de pH superiores el producto es estable. Esta estabilidad permitirá la inactivación de los virus con envoltura a pH bajo, como se requiere para la fabricación comercial.
La estabilidad a la congelación/descongelación se realizó a 72 mg/mL en tampón MOD1 colocando un tubo Eppendorf que contenía 1 mL de producto a -80 °C durante 10 min, seguido de descongelación a temperatura ambiente. No se observó agregación significativa tras 3 ciclos de congelación-descongelación.
Se realizaron estudios de estabilidad a 100 mg/mL en tampón MOD1 durante 6 semanas a 2-8 °C (Figura 4A) y a temperatura ambiente (22 °C, Figura 4C); en tampón MOD1 a 5 mg/mL durante 4 semanas a 40 °C (Figura 4B); en tampón 20 mM (ácido glutámico pH 4,0, histidina pH 5,8, tris pH 8,0) a 4 mg/mL durante 5 u 11 días a 37 °C (Figura 4D). La comprobación de los puntos temporales se realizó mediante SE-HPLC. No se detectó un aumento significativo del HMW en ninguno de los estudios. Del mismo modo, el análisis por GCE no mostró diferencias significativas entre los puntos temporales. La heterogeneidad de la carga se evaluó mediante iCE (Tabla 7), que mostró un aumento de las especies ácidas a 37 °C (especialmente a pH 8,0) y 40 °C, lo que indica cierto grado de desamidación y/u oxidación. Sin embargo, no se detectaron cambios importantes que desencadenaran una investigación por cromatografía líquida (CL)/espectrometría de masas (EM). Otras series de estabilidad (2-8 °C y temperatura ambiente) no mostraron cambios significativos en el % de especies ácidas y básicas por iCE.
Los puntos de tiempo de estabilidad de la serie de 40 °C se probaron en el ensayo basado en células que mide la neutralización de la actividad de IFNp (Figuras 5 A-D). El día 1, se sembraron 20.000 células HEK293 ISRE-Luc (IFNp responsive luciferase reporter) en 100 μl de DMEM con un 10 % de suero bovino fetal (FBS) por pocillo en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular. Las soluciones de anticuerpos se prepararon como reservas 2x comenzando con una concentración máxima de 1 μM en DMEM/10 % FBS, y luego se realizó una serie de diluciones de 11 puntos, 10 veces, con medios. Se preparó una reserva 20x de IFNp (0,625 ng/mL) en medio y se añadió a las reservas de valoración de anticuerpos hasta una concentración final 2x. Las soluciones anticuerpo:IFNp se incubaron durante 2 horas a 37 °C, después se añadieron 100 μL de la solución por pocillo y las placas se cultivaron durante toda la noche a 37 °C. El día 3, se preparó una solución de 150 μg/mL de luciferina de escarabajo, sal potásica y se añadieron 20 μL/pocillo y las placas se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La luminiscencia se leyó en un lector de placas multilabel EnVision. No se detectaron cambios en la actividad neutralizante.
CTI-AF1 es compatible con un tampón de formulación (20 mM His, 8,5 % Sacarosa, 0,05 mg/mL EDTA, pH 5,8) y mantiene la solubilidad hasta 150 mg/mL con una viscosidad aceptable.
Tabla 7: Heterogeneidad de la carga en las muestras de estabilidad
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(continuación)
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Ejemplo 3. FARMACOLOGIA
Breve resumen
CTI-AF1 es un anticuerpo IgG1 humanizado potente y altamente selectivo contra la citoquina soluble interferón beta (IFNp). In vitrn, el CTI-AF1 mostró una elevada afinidad por el IFNp humano ( Kd de 36,7+12,4 μM). El anticuerpo mostró una EC50 de unión similar para IFNp humano y de mono cynomolgus (15,28±2,11 μM y 25,04+5,11 μM, respectivamente). En ensayos funcionales basados en células humanas, CTI-AF1 mostró una potente neutralización de la fosforilación de STAT1 inducida por IFNp ( IC50 7,7±5,0 a 29,8+6,9 μM) y de la expresión de un reportero de luciferasa estimulado por interferón de tipo I en células humanas cultivadas (ensayo ISRE; IC5028,8+7,6 μM). El CTI-AF1 también inhibió la expresión de MxA(Mx1) inducida por IFNp en ensayos de expresión génica ( IC5029,4±23,5 μM) y fue capaz de inhibir el IFNp expresado endógenamente por fibroblastos dérmicos humanos, un tipo celular relevante para la enfermedad, tras la estimulación con ácido poliinosínico:policitidílico (poli I:C).
Farmacología primaria, in vitro
Durante el cribado inicial de hibridomas, se seleccionaron anticuerpos en función de su capacidad para bloquear la unión de IFNp a IFNAR2, el componente de alta afinidad del receptor de IFN de tipo I (Figura 6). En las pruebas posteriores a la humanización y la maduración por afinidad, la selección de anticuerpos se basó en la neutralización funcional del IFNp en ensayos celulares.
Se utilizó SPR para determinar la Kd de CTI-AF1 a IFNp humano; se realizaron experimentos de unión utilizando un biosensor óptico Biacore T200 equipado con un chip sensor CM5 de grado de investigación e IFNp humano (Peprotech). La regeneración del chip se realizó utilizando tampón de eliminación (MgCh 3M a pH 3,0 o 10mM glicina a pH 1,5) seguido de un enjuague con tampón. CTI-AF1 se inmovilizó en la superficie de un chip sensor CM5 a temperatura ambiente. El nivel de captura abarcaba una gama de 50 a 375 unidades de resonancia (UR). A continuación se inyectó el analito, IFNp humano, a un caudal de 30-50 μl por minuto durante un tiempo de asociación que osciló entre 65 y 300 segundos, seguido de una fase de disociación de 10 minutos. La caracterización cinética de las interacciones se llevó a cabo mediante el procedimiento multiciclo tradicional, utilizando una serie de concentraciones de IFNp humano de 10 nM hasta 0,078125 nM en una serie de diluciones dobles. Cada concentración se evaluó por duplicado. El analito se eliminó regenerando la superficie de la matriz entre cada ciclo utilizando MgCh 3M a pH 3,0 o 10 mM de glicina a pH 1,5, seguido de un enjuague con tampón. Este paso de regeneración eliminó el analito ligado y devolvió la señal de respuesta a la línea de base. Los datos de la celda de flujo de referencia (sin analito) se restaron de las respuestas de unión al antígeno para eliminar los artefactos sistemáticos. La afinidad de unión aparente se determinó utilizando un modelo de interacción simple 1:1 y la constante de equilibrio Kd se determinó como el cociente de las constantes de velocidad cinética. Se determinó que la afinidad de unión aparente de CTI-AF1 por IFNp humano era de 36,7±12,4 μM (Figura 7).
La unión de CTI-AF1 a IFNp humano junto con los ortólogos de mono cynomolgus, conejo, rata y ratón y tres de los homólogos humanos de tipo I más cercanos e IPNy (tipo II) se evaluó en ELISA en placa. Las placas ELISA se recubrieron durante la noche a 4 °C con 5 μg/mL de una de las siguientes citoquinas: IFNp humano, IFNp de mono cynomolgus, IFNp de rata, , IFNa2 humano, IFNy, IFNw humano;IFNp de ratón o IFNa14(H2) humano se recubrieron a 1 μg/mL, e IFNp de conejo se recubrió a 10 ng/mL. Todas las proteínas se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato libre de calcio y magnesio. Las placas recubiertas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,05 % de Tween-20 (PBST) y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (PBST+0,5 % BSA). Las placas se lavaron de nuevo con PBST y los anticuerpos primarios se añadieron a la placa a una concentración inicial de 30 nM, seguida de diluciones 1:3 en tampón de bloqueo. Para el IFNp anti-conejo, se realizaron diluciones 1:10. Se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y se concentró in vacuo. La unión se detectó con anticuerpos secundarios ligados a peroxidasa específicos para cada especie y sustrato de tetrametilbencidina (TMB1). La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 0,18 M (H2SO4) y la absorbancia se leyó a 450 nm en un lector multimarcador EnVision (PerkinElmer). La Tabla 8 muestra una reactividad similar para el IFNp humano y del mono cinomolgo, mientras que la reactividad al IFNp del conejo es 200 veces inferior. No se detectó ninguna unión con el IFNp de rata o ratón, ni con los tres homólogos humanos más próximos, ni con el IFNy (tipo II).
Tabla 8: Reactividad de CTI-AF1 frente a ortólogos de IFNp y homólogos de tipo I más próximos e IPNy medida por ELISA
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Se utilizaron dos ensayos in vitro para demostrar la inhibición dependiente de CTI-AF1 de las señales inducidas por IFNp. En primer lugar, se utilizaron células HEK293 transducidas de forma estable con un reportero de luciferasa ISRE humano como medida de la expresión génica dependiente de IFNp; el día 1, se sembraron 20 000 células HEK293 ISRE-Luc (reportero de luciferasa sensible a IFNp) en 100 μl de DMEM con un 10 % de suero bovino fetal (FBS) por pocillo en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular. Las soluciones de anticuerpos se prepararon como reservas 2x comenzando con una concentración máxima de 1 μM en DMEM/10 % FBS. Se realizó una serie de diluciones de 11 puntos y 10 veces con medios. Se preparó una cepa 20x de IFNp (28 nM, la concentración final del ensayo fue de 1,4 nM, la EC50) en medio y se añadió a las cepas de valoración de anticuerpos hasta una concentración final 2x. Las soluciones anticuerpo:IFNp se incubaron durante 2 horas a 37 °C, después se añadieron 100 μL por pocillo y las placas se cultivaron durante toda la noche a 37 °C. El día 3, se preparó una solución de 150 μg/mL de luciferina de escarabajo, sal potásica y se añadieron 20 μL/pocillo y las placas se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. La luminiscencia se leyó en un lector de placas multilabel EnVision. La Figura 8A muestra la inhibición dependiente de la dosis de CTI-AF1 de la actividad de la luciferasa inducida por IFNp con un IC50 de 28,8±7,6 μM.
En segundo lugar, la inhibición mediada por CTI-AF1 de la fosforilación de STAT1 inducida por IFNp se evaluó mediante flujo fosfórico. Las células U937, una línea celular monocítica humana, se cultivaron en RPMI 1640 con un 10 % de FBS y 2 mM de Glutamax (cRPMI). Las reservas de anticuerpos se hicieron a 4x, con una concentración máxima de 4 μM (la concentración máxima final fue de 1 μM) y se hizo una serie de diluciones de 12 puntos, 10 veces, en cRPMI; se añadieron 25 μL/pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con fondo en U. Se añadió un volumen igual de 4x IFNp (200 μM, la concentración final fue de 50 μM, EC90) a las de anticuerpos y se incubó durante 2 horas a 37 °C. Los pocillos de control incluyeron solo medio (sin expresión de pSTAT1 de fondo de estimulación) y solo IFNp 50 μM (señal máxima de pSTAT1). Se cosecharon las células U937, se centrifugaron durante 5 min a 1500 rpm, temperatura ambiente y luego se resuspendieron a una concentración de2*106/mL en cRPMI calentado a 37 °C; se añadieron 50 μL de suspensión celular por pocillo y se colocaron las placas a 37 °C durante 15 minutos. A continuación, se añadieron 100 μl de tampón de citofijación precalentado y las placas se volvieron a colocar a 37 °C durante 15 minutos. Se retiraron las placas y se centrifugaron como se ha descrito anteriormente. Se retiró el medio de las placas, se resuspendieron las células y se lavaron en 200 μl de PBS y se centrifugaron de nuevo. Se eliminó de nuevo el medio, se resuspendieron las células en 100 μl de tampón de permeabilización IV y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Al final de la incubación, las células se centrifugaron y lavaron como se ha descrito anteriormente. Tras el lavado con PBS, se resuspendieron las células en 100 μl de PBS/5 % de FBS; se añadieron 5 μl de TruStain FcX/pocillo y se incubaron las placas durante 10 min a 4 °C. Se añadieron 10 microlitros de anticuerpo antifosfo STAT1 conjugado con Alexa Fluor 674 (AF647) por pocillo y se incubaron durante 20 min a 4 °C. Tras la incubación, se añadieron 120 μl de tampón FACS por pocillo y las placas se centrifugaron como se ha descrito anteriormente. El lavado se repitió con 220 μl de tampón FACS y las células se resuspendieron en 120 uL de tampón FACS. Se utilizó un citómetro Fortessa para adquirir los datos y el análisis se realizó con el software FlowJo. Se calculó la intensidad de fluorescencia media geométrica (Geo MFI) en el canal AF647 y se utilizó el software prism para calcular la IC50. CTI-AF1 es un potente neutralizador del IFNp humano con una IC50 de 29,8±6,9 μM (Figura 8B).
Para evaluar la capacidad de CTI-AF1 de neutralizar la expresión génica de MxA (Mx1) inducida por IFNp recombinante, se sembraron fibroblastos dérmicos humanos normales (HDF) en un matraz T-150 en medio de cultivo de fibroblastos. Para preparar el ensayo, las células se desprendieron del matraz utilizando una solución de tripsina/EDTA y se colocaron en una placa de 48 pocillos con tres pocillos asignados por condición experimental. El día 3, las células se estimularon durante 5 horas con medio de cultivo enriquecido con 0,15 μM de IFNp que se preincubó durante 2 horas con o sin diluciones de CTI-AF1 que oscilaban entre 10 nM y 0,016 nM. Como control negativo del experimento se utilizó una combinación de 0,15 μM de IFNp y 50 nM de anticuerpo de control del isotipo. Tras 5 horas, se cosecharon las células, se aisló el ARN con el micro kit RNeasy y se sintetizó el ADNc con el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad. Los análisis de PCR en tiempo real Taqman se realizaron en un sistema Vii A7 (Thermo Fisher) utilizando sondas cebadoras específicas de genes humanos para Mx1 y B2M. La cuantificación relativa (veces del cambio) se calculó a partir de los valores Ct resultantes utilizando el procedimiento AACt de la siguiente manera: para cada condición, los valores Ct del gen de control endógeno (B2M) se restaron de los valores Ct respectivos del gen diana(Mxl). A continuación, se realizó la normalización con respecto a la muestra no tratada para calcular los valores AACt, que posteriormente se utilizaron para calcular las veces del cambio (2-ññCt). El anticuerpo de control negativo del isotipo no tuvo ningún impacto en la expresión de MxA(Mx1); sin embargo, en presencia de CTI-AF1, se observó una inhibición dependiente de la dosis de la transcripción del gen con un IC50 de 29,4 ±23,5 μM (Figura 9).
La especificidad de la neutralización de CTI-AF1 se evaluó utilizando el mismo ensayo pSTAT descrito anteriormente para la Figura 8B, sin embargo, las células U937 se estimularon con una concentración final de 20 μM de IFNp o 50 μM de IFNa. Las diferentes concentraciones de IFN de tipo I se seleccionaron para proporcionar un nivel similar de fosforilación de STAT1, ya que el IFNa es un activador menos potente de la señalización IFNAR. Se realizó una serie similar de diluciones de 12 puntos y 10 veces con sifalimumab (SIF) como control positivo para la neutralización de IFNa. Como puede observarse, CTI-AF1 inhibió específicamente la fosforilación de STAT1 inducida por IFNp, pero no inhibió la fosforilación inducida por IFNa (Figuras 10 A y B, respectivamente). Se realizó un único experimento utilizando IFNw (a 100 μM) o IFNa14 (a 4 μM) y el CTI-AF1 no tuvo ningún efecto sobre la fosforilación de STAT1 inducida por IFNw o IFNa14.
Para garantizar que CTI-AF1 neutralizaba el IFNp expresado endógenamente, se sembraron fibroblastos dérmicos humanos normales en una placa de 48 pocillos con tres pocillos asignados por condición experimental. El día 3, las células se estimularon con o sin una combinación de 1 μg/mL de poli I:C y diluciones de CTI-AF1 (intervalo de dosis: 50 μM - 100 nM) o 100 nM de sifalumumab. Tras 2,5 y 24 horas, se cosecharon las células, se aisló el ARN con el micro kit RNeasy y se sintetizó el ADNc con el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad. La PCR en tiempo real Taqman y los cálculos de las veces del cambio se realizaron como se ha descrito anteriormente (Figura 9). Aunque se desconocía la cantidad de IFNp inducida por la estimulación con poli I:C, se observó una inhibición dependiente de la dosis de la expresión de MxA(Mx1) en presencia de CTI-AF1 (Figura 11).
Ejemplo 4. FARMACOLOGÍA TRASLACIONAL
No se ha definido la relación PK/PD para IFNp en dermatomiositis (DM). No se dispone de modelos preclínicos traducibles pertinentes para la DM y no se conoce la concentración preclínica eficaz (Ceff). Se utilizará clínicamente una firma génica del interferón de tipo 1 como biomarcador mecanístico de la modulación farmacológica. Los genes del interferón de tipo 1 suelen estar elevados en pacientes con DM y LES, y el cambio medio de veces de la firma génica del interferón de tipo 1 se ha utilizado anteriormente en estudios clínicos de mAbs anti-IFNa (sifalimumab y rontalizumab) y anti-IFNAR (anifrolumab). Sin embargo, no se ha establecido una comprensión cuantitativa de la modulación de la firma génica y no se conoce la relación entre la exposición in vivo, la participación de la diana, la farmacología descendente y la eficacia a lo largo del tiempo. Las proyecciones de viabilidad de dosis eficaces en humanos se basan en la capacidad de CTI-AF1 para neutralizar >95 % del IFNp en la piel.
Se utiliza un ensayo LC\MSMS para medir el IFNp total en suero clínico y biopsias de tejido, y en combinación con la PK clínica y la Kd de CTI-AF1, se utiliza para evaluar y confirmar el compromiso de la diana. La firma genética del IFN tipo 1 en sangre y piel, así como el IP-10 (CXCL10), se evalúan como biomarcadores mecanísticos. En un estudio posterior de Prueba de Mecanismo (PdM)/Señal Inicial de Eficacia (SEE) en pacientes con DM, se utiliza el índice de área y gravedad de la enfermedad de la dermatomiositis cutánea (CDASI) como criterio de valoración primario (biomarcador de resultado) además de cualquier biomarcador mecanístico relevante.
Relación farmacocinética-farmacodinámica y dosis humana
Las relaciones farmacocinéticas y farmacodinámicas (PK/PD) entre la exposición al fármaco anticuerpo e IFNp para CTI-AF1 se han simulado utilizando parámetros PK comunicados para terapéuticas IgG1 típicas, constante de unión de equilibrio IFNp-CTI-AF1, concentraciones de IFNp en piel y suero, y semivida de recambio de IFNp.
Se utilizó un modelo PK/PD de "sitio de acción" para predecir la cobertura del IFNp en pacientes con DM. Se consideró necesaria una cobertura de IFNp >95 % en la fase valle para lograr la eficacia. Se supuso que las concentraciones intersticiales cutáneas de CTI-AF1 eran el 30 % de las concentraciones séricas. La afinidad de unión de CTI-AF1 a IFNp determinada por SPR (Biacore Kd = 36,7μM) se utilizó para el modelado PK/PD. En consonancia con esto, en ensayos funcionales basados en células, CTI-AF1 mostró una potente neutralización de la fosforilación de STAT1 inducida por IFNp ( IC5029,8 μM).
La mediana de la concentración de IFNp en el suero de pacientes con DM fue de 3 μg/mL (N=26); sin embargo, se desconoce la concentración de IFNp en la piel de pacientes con DM. Por lo tanto, en el modelo, se investigó el impacto de la relación IFNp piel:plasma en relaciones de 10 y 100. Dado que se trata de un parámetro sensible para el modelo, estas relaciones se utilizaron como condiciones límite propuestas para demostrar el impacto de la relación piel:plasma en la cobertura del objetivo.
La semivida in vivo del recambio de IFNp se estimó ajustando un modelo de 3 compartimentos a los datos de PK humana para IFNpla, que incluían 3 dosis IV. Este ajuste dio lugar a dos semividas diferentes para el recambio de IFNp que se consideran más relevantes, dependiendo de la fase y los compartimentos considerados que van desde 3 minutos (basado en la fase inicial) a 126 minutos (basado en la semivida efectiva). Para aumentar la confianza en este parámetro del modelo, se desarrolló un ensayo de IFNp para suero de mono cynomolgus para su uso en mono cynomolgus.
La relación IFNp piel:plasma y la tasa de recambio de IFNp son parámetros sensibles para el modelo PK/PD. Así pues, la evaluación de la viabilidad de la dosis eficaz en humanos se realizó utilizando los intervalos descritos anteriormente tanto para la relación IFNp piel:plasma como para la tasa de recambio de IFNp. En las Figuras 12 A-D (IV Q4W) y las Figuras 13A-D (SC Q1W) se muestran ejemplos de evaluaciones para dos probables regímenes de dosis clínicos de ESoE. Una solubilidad del CTI-AF1 de 150 mg/mL permitiría una dosis clínica de 2 mg/kg, ya que puede administrarse mediante una pluma inyectora de 1 mL. Por lo tanto, se utilizó una dosis de 2 mg/kg para las evaluaciones de viabilidad de la dosis que figuran a continuación.
Las Figuras 12A-D muestran que a una dosis de 2 mg/kg IV Q4W, independientemente de la relación IFNp piel:plasma, solo la semivida de 126 min para IFNp predice una cobertura >95 % de IFNp en la piel. Si la semivida del IFNp fuera de 3 min, se prevé que una cobertura >95 % del IFNp en la piel requeriría dosis superiores a 2 mg/kg.
Las Figuras 13A-D muestran que a una dosis de 2 mg/kg SC Q1W, independientemente de la relación IFNp piel:plasma, la semivida de 126 min para IFNp predice una cobertura >95 % de IFNp en la piel. Si la semivida del IFNp fuera de 3 min, entonces sólo la relación IFNp piel:plasma de 100 dará lugar a una cobertura >95 % de IFNp en la piel a 2 mg/kg. Por el contrario, si la relación IFNp piel:plasma es de 10, para lograr una cobertura >95 % serán necesarias dosis superiores a 2 mg/kg.
PK humana/Exposición
Sobre la base de los perfiles farmacocinéticos de CTI-AF1 en el mono cynomolgus, se espera que la farmacocinética de CTI-AF1 en humanos sea similar a los valores informados para una terapéutica IgG1 típica. Los valores de los parámetros farmacocinéticos de 2 compartimentos se resumen en la Tabla 9. En los paneles superiores de las Figuras 12A-D y 13A-D se muestran los perfiles de concentración-tiempo simulados de CTI-AF1 a los niveles de dosis eficaces proyectados.
Tabla 9: Parámetros farmacocinéticos previstos de CTI-AF1 en humanos
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Farmacocinética no clínica
La farmacocinética IV y SC de CTI-AF1 se ha evaluado en monos cynomolgus utilizando datos de un estudio exploratorio de toxicidad de dosis única. Los valores medios de los parámetros farmacocinéticos séricos de los monos cynomolgus se resumen en la Tabla 10 y las concentraciones séricas medias de CTI-AF1 se muestran en la Figura 14.
Tabla 10: Tabla resumen de la farmacocinética de CTI-AF1 en monos Cynomolgus
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Ejemplo 5. IFNp COMO OBJETIVO PARA LES Y LA DM
Cada vez hay más pruebas de que la producción de IFN está relacionada con el LES y otras enfermedades reumáticas, como la DM. Además, es probable que la perpetuación del proceso de la enfermedad de LES implique una mayor producción de IFN de tipo I y un círculo vicioso patogénico.
La DM es una enfermedad autoinmune rara (aproximadamente 20.000 pacientes en EE.UU.) caracterizada por la inflamación del músculo esquelético y la piel y, concomitantemente, debilidad del músculo esquelético y erupción cutánea. La DM se asocia típicamente a autoanticuerpos, y la patogénesis de la enfermedad puede implicar la unión secuencial de estos autoanticuerpos a un autoantígeno endotelial, desencadenando la activación del complemento y la inflamación vascular, lo que conduce finalmente a la atrofia perifascicular.
Como se muestra en las Figuras 16 A-B, los datos indicaron una asociación de la "firma" de transcripción del gen regulado por interferón tipo I (IRG) en la sangre DM con la actividad de la erupción cutánea, medida por el área de la enfermedad dermatomiositis cutánea y el índice de severidad (CDASI). El gen MxA(Mx1), altamente inducible por IFNp, se expresa en las miofibras perifasciculares y capilares de la DM, y el IFNp en suero sanguíneo -pero no el IFNa o IFNui- se asocia con la DM, pero no con otras miopatías inflamatorias o sueros normales. Estos datos apoyan la noción de que la lesión de los capilares, miofibras y piel en la DM resulta de una sobreproducción patogénica de mensaje y proteína IFNp. Los datos también han demostrado una asociación entre las puntuaciones CDASI y los niveles séricos de proteína IFNp (Figura 17). Los análisis de biopsias de piel emparejadas indican la presencia tanto de ARNm de IFNp como de sobrerregulación de una firma IRG sólo en el tejido afectado (Figuras 18 A-B). En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que la DM es una enfermedad impulsada por IFNp.
Dado que en muchos contextos tisulares la producción de IFNp puede preceder a la producción de IFNa e iniciar una elevación patogénica de la expresión de la firma IRG, junto con la noción de que la DM puede ser una enfermedad en gran medida impulsada por IFNp, se cree que la DM y el LES comparten muchas características y atributos patogénicos. De hecho, las lesiones cutáneas de la DM son difíciles, si no imposibles, de distinguir histológicamente de las del LES, y el diagnóstico de las lesiones cutáneas de la DM suele requerir la determinación clínica de un aumento de los tipos de células CD4+ y CXCR3+ y de la expresión endotelial de Mx1. Además, tanto la DM como el LES se caracterizan por la activación de los linfocitos B y la inflamación y destrucción tisular mediada por autoanticuerpos.
Tabla 11 Secuencias de anticuerpos anti-IFNp
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continuación
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Ejemplo 6. MAPEO DE EPÍTOPOS
Para dilucidar el epítopo reconocido por CTI-AF1, se fabricaron proteínas IFN|3 híbridas en las que se sustituyeron porciones seleccionadas de secuencias IFNp por secuencia IFNa. CTI-AF1 neutraliza específicamente el IFNp pero no el IFNa, por lo que la incapacidad de CTI-AF1 para neutralizar una determinada proteína híbrida indicaría la pérdida del epítopo. Se produjeron proteínas híbridas, se purificaron y se confirmó su capacidad para inducir la fosforilación de STAT1 (Tabla 12).
Tabla 12: secuencias de proteínas IFN híbridas
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Todas las proteínas híbridas purificadas fueron capaces de inducir la fosforilación de STAT1, sin embargo, hubo diferencias en la actividad biológica. Cada proteína híbrida se utilizó a la concentración EC80 en el siguiente ensayo de fosfo-STAT1 (pSTAT1). Las células U937, una línea celular monocítica humana, se cultivaron en RPMI 1640 con un 10 % de FBS (cRPMI). LAs reservas de anticuerpos se hicieron a 4x, con una concentración máxima de 4-400 ^M (la concentración máxima final fue de 1-100 ^M) y se hizo una serie de diluciones de 11 puntos y 10 veces en cRPMI; se añadieron 25 ^l/pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con fondo en U. Se añadió un volumen igual de IFNp híbrido 4x o de control a la concentración EC80 adecuada a las reservas de anticuerpos y se incubó durante 2 horas a 37 °C. Los pocillos de control incluyeron solo medio (sin expresión de pSTAT1 de fondo de estimulación) o sin adición de anticuerpo (señal máxima de pSTAT1). Se cosecharon las células U937, se centrifugaron durante 5 min a 1500 rpm a temperatura ambiente y luego se resuspendieron a una concentración de2*106/ml en cRPMI calentado a 37 °C; se añadieron 50 ^l de suspensión celular por pocillo y se colocaron las placas a 37 °C durante 15 minutos. A continuación, se añadieron 100 ^l de tampón de citofijación precalentado (BD Biosciences, n° de catálogo 554655) y las placas se volvieron a colocar a 37 °C durante 15 minutos. Se retiraron las placas y se centrifugaron como se ha descrito anteriormente. Se retiró el medio de las placas, se resuspendieron las células y se lavaron en 200 j l de PBS y se centrifugaron de nuevo. Se eliminó de nuevo el medio, se resuspendieron las células en 100 j l de tampón de permeabilización IV (BD Biosciences) y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Al final de la incubación, las células se centrifugaron y lavaron como se ha descrito anteriormente. Tras el lavado con PBS, se resuspendieron las células en 100 j l de PBS/5 % de FBS (tampón FACS); se añadieron 5 j l de TruStain FcX/pocillo (BioLegend) y se incubaron las placas durante 10 min a 4 °C. Se añadieron 10 microlitros de Alexa Fluor 674 (AF647) conjugado con antifosfo STAT1 Ab (BD Biosciences) por pocillo y se incubaron 20 min a 4 °C. Tras la incubación, se añadieron 120 j l de tampón FACS por pocillo y las placas se centrifugaron como se ha descrito anteriormente. El lavado se repitió con 220 j l de tampón FACS y las células se resuspendieron en 120ul de tampón FACS; se utilizó un citómetro Fortessa (BD Biosciences) para adquirir los datos y el análisis se realizó con el software FlowJo (TreeStar). Se calculó la intensidad de fluorescencia media geométrica (Geo MFI) en el canal AF647 y se utilizó el software prism para calcular la IC50. Los datos se normalizaron como la relación concentración de anticuerpo/concentración de IFN y se determinó el porcentaje de la señal máxima tras restar el fondo.
Las células U937 se estimularon con proteínas híbridas IFNa/IFNp durante 15 minutos en presencia de CTI-AF1, tras lo cual se evaluó la presencia de STAT1 fosforilada mediante citometría de flujo intracelular. CTI-AF1 no inhibió la fosforilación de STAT1 dependiente de CID1280 y la potencia de neutralización de la fosforilación de STAT1 inducida por CID1281 se redujo considerablemente. El CTI-AF1 neutralizó la fosforilación STAT1 de todas las demás proteínas IFN híbridas con igual potencia en relación con el IFNp humano. Véase la FIG. 19 y Tabla 13. Estos datos combinados indican que los residuos del epítopo reconocidos por CTI-AF1 están contenidos en los constructos CID1280 y CID1281, en los que las sustituciones de la secuencia IFNa abarcan los aminoácidos 85-89 y 90-100, respectivamente (véase la Tabla 12).
Tabla 13. IC 50 y veces del cambio de la neutralización mediada por CTI-AF1 de la fosforilación de STAT1 inducida por IFN de tipo I
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Ejemplo 7. ESTRUCTURA CRISTAL DE LOS ANTICUERPOS ANTI-IFNp
Los cocristales del complejo entre IFNp de mono Cynomolgus y CTI-AF1 Fab se cultivaron utilizando la siguiente solución como precipitante: 19 % PEG 3350, 250 mM Citrato sódico, 100 mM Bis-Tris propano pH 8,5. Los cristales pertenecen al grupo espacial P21 (parámetros de celda unitaria a=49,58 A; b=91,76 A; c=162,52 A; b=94,86 grad.) y contienen dos copias de complejo por unidad asimétrica cristalina. La estructura se ha determinado a una resolución de 3,2 A utilizando el procedimiento de sustitución molecular y el refinamiento se ha realizado con autoBUSTER.
CTI-AF1 Fab se une a IFNp en el lado formado por dos a-hélices, A y C, que definen el epítopo de unión de CTI-AF1 (Tabla 13)
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Todos los aminoácidos que se encuentran a menos de 3,8 A de CTI-AF1 se seleccionaron como residuos de epítopos "potenciales". los residuos del epítopo "primario" se caracterizan por ser residuos altamente enterrados en la interfaz CTI-AF1-IFNP y una tolerancia de secuencia de cero a baja a cualquier otra sustitución de aminoácidos en esta posición. los residuos de epítopos "secundarios" se caracterizan por ser residuos con una superficie enterrada media en la interfaz y una tolerancia de secuencia media a las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones. los residuos de epítopos "opcionales" se caracterizan por ser residuos con poca superficie enterrada en la interfaz y alta tolerancia de secuencia a las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones.
El paratopo de unión está formado por cinco regiones CDR-variables: CDR-H1, -H2, -H3 y CDR-L1, -L3 (Tabla 14). La superficie total enterrada bajo la interfaz de unión es de 1.920 A2 El análisis del modo de unión de CTI-AF1-IFNp revela que el efecto neutralizante de CTI-AF1 se consigue mediante el bloqueo directo en el sitio de unión de IFNAR1.
Tabla 14 Análisis de parátopos
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Todos los aminoácidos que se encuentran a menos de 3,8 A del IFNp se seleccionaron como parátopo de unión "potencial". "Los residuos de parátopo "primarios" se caracterizan por ser residuos altamente enterrados en la interfaz CTI-AF1-IFNp y baja tolerancia de secuencia a cualquier otra sustitución de aminoácidos en esta posición. los residuos de parátopos "secundarios" se caracterizan por ser residuos con menor superficie enterrada en la interfaz y mayor tolerancia de secuencia a las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones.
La Tabla 15 resume los pares de interacción epítopo-paratopo. La tabla 16 resume el análisis de epítopos y paratopos basado en la BSA.
Tabla 15: Pares de interacción epítopo-paratipo
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continuación
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Tabla 16: Análisis de epítopos y parátopos basado en la BSA
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continuación
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Ejemplo 8. PERFILES DE EXPRESION DEL INTERFERON DE TIPO I
En este ejemplo, estudiamos los perfiles de expresión de IFN tipo I de 4 líneas celulares relevantes para la enfermedad en respuesta a la estimulación del ligando del receptor tipo Toll. Se utilizaron cuatro tipos de células: PBMC, una línea celular de fibroblastos dérmicos, una línea celular muscular y una línea celular renal, que se estimularon con un agonista de TLR3, TLR4, TLRH8 y TLR9 en presencia y ausencia de anticuerpo anti-IFNp.
Los niveles de expresión génica de IFN tipo I y Mx1 en diferentes tipos de células humanas primarias se midieron mediante PCR cuantitativa. Las células primarias se cultivaron en los medios pertinentes de la siguiente manera: fibroblastos dérmicos humanos normales en medio FGM-2 bulletkit, mesangiales humanos normales en medio MsGM bulletkit, y células primarias derivadas de músculo esquelético humano en medio de crecimiento Myotonic. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron por centrifugación sobre Ficoll-Paque Plus. Las células mononucleares se cultivaron en RPMI1640 suplementado con un 10 % de FBS y penicilina-estreptomicina. Para medir la expresión génica del IFN de tipo I, se sembraron células y se estimularon con el ligando TLR correspondiente durante 1, 2,5, 5, 8 y 24 horas. Tras el cultivo, se cosecharon las células, se aisló el ARN y se sintetizó el ADNc. La expresión de los siguientes genes se evaluó mediante PCR Taqman: IFNp, Mx1, IFNal, IFNa2, IFNa4, IFNa5, IFNa6, IFNa7, IFNa8, IFNa14, IFNa16, IFNa17 y B2m. La PCR en tiempo real Taqman y los cálculos de las veces del cambio se realizaron como se ha descrito anteriormente (Figura 9).
La Tabla 17A muestra que el IFNp es el IFN de tipo I predominante producido por varios tipos de células humanas primarias residentes en tejido tras la estimulación del ligando del receptor tipo Toll (TLR). Se estimularon fibroblastos dérmicos, células musculares esqueléticas, células mesangiales glomerulares y PBMC de donantes humanos normales con poli I:C (ligando TLR3), LPS (ligando TLR4), R848 (ligando TLRH8) y ODN2216 (ligando TLR9) de forma dependiente del tiempo y la dosis. Los niveles de expresión relativa de IFNp, Mx1, IFNa (1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 14, 16 y 17) se midieron mediante PCR cuantitativa utilizando B2M como control. La expresión relativa de cada gen se indica como fuerte (+), débil (+/-) o sin expresión (-).
CTI-AF1 demostró ser un potente neutralizador del IFNp producido endógenamente a partir de células humanas primarias estimuladas con ligandos TLR (poli I:C, LPS, R848 u ODN2216). Las células se estimularon con los distintos ligandos TLR en ausencia o presencia de cantidades tituladas de CTI-AF1. La expresión de Mx1 se midió 24 horas después de la estimulación, con la excepción de las PBMC estimuladas con LPS, que se midió a las 6 horas. El aislamiento del ARN, la síntesis del ADNc y la PCR cuantitativa se realizaron como se ha descrito anteriormente (Figura 9). Aunque se desconocía la cantidad de IFNp inducida por cualquier tipo celular tras la estimulación TLR, se observó una inhibición dependiente de la dosis de la expresión de Mx1 en presencia de CTI-AF1.
La Tabla 17B muestra que CTI-AF1 es un potente inhibidor del IFNp endógeno secretado por células humanas primarias tras la estimulación con poli I:C y l Ps . Se estimularon las células con el ligando TLR indicado y se realizó una PCR cuantitativa para determinar el nivel de expresión de Mx1 utilizando B2M como control. La inhibición dependiente de la dosis de la expresión del gen Mx1 por CTI-AF1 se indica con "+", mientras que la ausencia de inhibición de la expresión de Mx1 dependiente de CTI-AF1 se indica con "-". Las condiciones en las que la expresión de IFN de tipo I fue insuficiente para provocar un aumento significativo de la expresión de Mx1 que pudiera ser neutralizado porCTI-AF1 se indican como NA.
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Tabla 18: Secuencias de las proteínas del interferón p
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al IFNp humano, que comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
2. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:166 y SEQ ID NO:167
4. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, que comprende la secuencia de nucleótidos del inserto del plásmido depositado en elATCC y que tiene el número de acceso PTA-122726 y la secuencia de nucleótidos del inserto del plásmido depositado en elATCC y que tiene el número de acceso PTA-122727.
5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
6. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, o el vector de la reivindicación 5.
7. Un procedimiento de producción de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 6, en condiciones en las que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es producido por la célula huésped.
8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, o la composición farmacéutica de la reivindicación 8, para su uso en terapia.
10. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, o la composición farmacéutica de la reivindicación 8, para su uso en un procedimiento de tratamiento de la dermatomiositis (DM) o un procedimiento de tratamiento del lupus eritematoso sistémico (LES).
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