ES2814150T3 - Moléculas de unión específicas para IL-21 y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-21 que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en el que (a) la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y (b) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión específicas para IL-21 y usos de las mismas

Antecedentes

Esta divulgación proporciona composiciones que se unen específicamente a IL-21 y métodos para el uso de tales composiciones, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio o autoinmunitario.

IL-21 pertenece a una familia de citocinas que incluye IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15, todas las cuales se unen a receptores privados (o compartidos) en el complejo con la cadena gamma del receptor de citocinas común (yc). La mayoría de las citocinas en esta familia son de suma importancia tanto para el mantenimiento como para la función de células T, células B y células NK. El receptor para IL-21 se distribuye ampliamente en células linfohematopoyéticas y no hematopoyéticas, y la IL-21 desempeña muchos papeles.

Por ejemplo, el acoplamiento de IL-21R por IL-21 conduce a la activación de varias rutas de señalización, incluyendo la ruta Jak/STAT (Davis, ID, et al., (2007) Clin Cancer Res 13, 3630-3636; Fuqua, CF, et al, (2008) Cytokine 44, 101­ 107; Habib, T, et al, (2002) Biochemistry 41, 8725-8731). Más específicamente, IL-21 activa St At 1, STAT3 y STAT5, indicado por una fosforilación aumentada de estas moléculas dentro de la célula (Asao, H, et al, (2001) J Immunol 167, 1-5; Diehl, SA, et al, (2008) J Immunol 180, 4805-4815; Scheeren, FA, et al, (2008) Blood 111, 4706-4715; Zeng, R, et al, (2007) Blood 109, 4135-4142). Se ha demostrado que la activación de STAT3 en particular desempeña un papel crítico en la regulación de las respuestas de las células B humanas a IL-21 (Avery, d T, et al, (2008) J Immunol 181, 1767-1779; Avery, DT et al., JExp Med 207, 155-171).

Además, la IL-21 contribuye al mantenimiento y la función de las células T de memoria CD8+ y las células NK, promueve la generación de células cooperadoras foliculares T (Tfh) y Th17 en el ratón (y quizás en el humano) e inhibe la generación celular de células T reguladoras (Treg). Se ha demostrado que la IL-21 modula la actividad de las células NK, incluyendo los efectos sobre su crecimiento de maduración y actividad citolítica (Spolski, R y Leonard, WJ, (2008) Curr Opin Immunol 20, 295-301). Además, se ha demostrado que la IL-21 promueve la producción de IFNy tanto por las células NK primarias como por la línea celular NK humana, NK-92 (Kasaian, MT, et al, (2002) Immunity 16, 559-569; Strengell, M, et al, (2003) J Immunol 170, 5464-5469). La IL-21 también tiene una variedad de efectos sobre las células no hematopoyéticas, tales como las células del estroma, donde induce inflamación a través de la liberación de metaloproteinasas de la matriz (MMP) (Monteleone et al, (2006) Gut 55, 1774-1780).

Una función principal no redundante de IL-21 es la promoción de la activación, diferenciación o muerte de células B durante las respuestas inmunitarias humorales. El efecto de IL-21 sobre las células B humanas se ha estudiado extensamente. La IL-21 tiene un profundo impacto en la supervivencia, activación y proliferación de células B, así como en la diferenciación de células B en células plasmáticas secretoras de Ig (PC) (Avery, DT, et al, (2008) J Immunol 181, 1767-1779; Avery, DT, et al, J Exp Med 207, 155-171); Bryant, VL, et al, (2007) J Immunol 179, 8180-8190; Ettinger, R, et al, (2005) J Immunol 175, 7867-7879; Parrish-Novak, J, et al, (2000) Nature 408, 57-63; Pene, J, et al, (2004) J Immunol 172, 5154-5157). Además, el aumento de la producción de IL-21 es característico de determinadas enfermedades autoinmunitarias y es probable que contribuya a la producción de autoanticuerpos, así como a las características patológicas de la enfermedad autoinmunitaria. La activación de células B in vivo puede impulsarse mediante interacciones con células T activadas que expresan moléculas coestimuladoras tales como CD40L y producen citocinas trópicas de células B tales como IL-21.

La sobreexpresión de IL-21 es una característica de muchas enfermedades o trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios, y es probable que sea un importante impulsor de la producción de autoanticuerpos, así como características patológicas de la enfermedad autoinmunitaria (Nakou et al, (2013) Clin. Exp. Rheumatol. 31, 172-179). El papel fundamental de IL-21 en la promoción de las respuestas inmunitarias humorales la convierte en un foco importante de posibles intervenciones terapéuticas en estados caracterizados por la sobreproducción de IL-21 y autoanticuerpos patógenos (Dolff et al., (2011) Arthritis Res. Ther. 13, R157; Kang et al., (2011) Arthritis Res. Ther.

13, R179; McGuire et al, (2011) Immunity 34, 602-615; Liu et al., (2012) Arthritis Res. Ther. 14, R255; Terrier et al, (2012) Arthritis Rheum. 64, 2001-2011; Li Q et al, (2013) PLoS One 8, e68145; Li Y et al, (2014) Neurol. Sci. 35, 29­ 34). Por tanto, se espera que la neutralización de IL-21 en situaciones de autoinmunidad afecte a varias poblaciones de células que se cree que están implicadas en la patogenia de la enfermedad inmunitaria. Tales enfermedades o trastornos incluyen, sin limitación, vasculitis, por ejemplo, vasculitis por anticuerpos frente al citoplasma de los neutrófilos (ANCA) o vasculitis de arteritis de células gigantes (GCA), síndrome de Sjogren, enfermedad inflamatoria intestinal, pénfigo vulgar, nefritis lúpica, psoriasis, tiroiditis, diabetes tipo I, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), espondilitis anquilosante, esclerosis, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, miastenia grave y enfermedad de injerto contra huésped (EICH).

La patogenia de la vasculitis asociada a los anticuerpos frente al citoplasma de los neutrófilos (ANCA) (AAV) se caracteriza por los principales autoanticuerpos contra la proteinasa 3 (PR3) y la mieloperoxidasa (MPO). Las células T CD4+ que producen iL-21 se expanden en la sangre (Abdulahad et al, (2013) Arth Res & Ther 15: R70). La IL-21 elevada está presente en el suero de AAV en relación con los controles sanos y la IL-21 exógena induce la secreción de autoanticuerpos ANCA in vitro a partir de PBMC aisladas de pacientes con AAV in vitro. LA AAV está constituida por granulomatosis con poliangeítis, anteriormente granulomatosis de Wegener (GPA), granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, también conocida como síndrome de Churg-Strauss (CSS) y poliangeítis microscópica (MPA). Por lo general, se agrupan juntas, pero epidemiológicamente la prevalencia y la distribución son diferentes. Los tratamientos actuales incluyen corticosteroides, biológicos, por ejemplo, rituximab, fármacos inmunodepresores, antibióticos o plasmaféresis, pero el pronóstico de los pacientes sigue siendo malo. Sigue existiendo una necesidad insatisfecha de encontrar tratamientos para la AAV.

El síndrome de Sjogren (SS) es una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por autoanticuerpos tales como el factor reumatoide (RF), así como autoanticuerpos contra varios antígenos nucleares tales como Ro/La. El SS es el segundo estado autoinmunitario más prevalente después de la AR. Hay al menos 1 millón de pacientes primarios de Sjogren en los EE. UU., de los cuales el 90% son mujeres. El SS afecta a las glándulas salivales, provocando, por ejemplo, sequedad de boca y ojos. Además, el SS puede afectar a otros órganos del cuerpo, incluyendo los riñones, los vasos sanguíneos, los pulmones, el hígado, el páncreas, el sistema nervioso periférico y el cerebro y se asocia con otras enfermedades autoinmunitarias tales como el lupus y la artritis reumatoide. Los niveles en suero de IL-21 muy elevados se correlacionan con un aumento de IgG1 y la presencia de autoanticuerpos (Kang, 2011). Pueden encontrarse niveles elevados de IL-21 e IL-21R en folículos ectópicos de glándulas salivales (Kang, 2011). Además, se sabe que la IL-21 desempeña un papel directo en la activación y citotoxicidad de las células NK. Se encuentra un mayor número de células NK residentes en tejidos que sobreexpresan el receptor activador NKp30 en las glándulas salivales de los pacientes con síndrome de Sjogren primario y se correlacionan con la puntuación de enfoque (Rusakiewicz et al, (2013) Sci. Transl. Med. 5, 195ra96). Estas células NK están implicadas en la patogenia de la enfermedad a través de la interferencia directa entre células NK y células del estroma dando como resultado daño tisular. La IL-21 y su receptor también se expresan en los infiltrados de las glándulas salivales (Kang, 2011), y se ha informado que las células Tfh CCR9+CD4+ de memoria que producen IL-21 se expanden en la circulación de la mayoría de los pacientes con SS (McGuire, 2011). Además, un nivel aumentado de células Tfh en pacientes con IL-21 elevada se asocia con manifestaciones extraglandulares (Szabo et al, (2013) Clinical Immunol 147, 95-104). Se ha demostrado en los modelos animales preclínicos beneficios de la inhibición de IL-21 (Liu et al. (2012) J Oral Pathol MedJ. No existe cura para el SS; los tratamientos actuales son de eficacia limitada y ninguno puede considerarse modificador de la enfermedad. La enfermedad de leve a moderada se trata sintomáticamente con medicamentos de venta libre. La enfermedad grave se trata actualmente con hidroxicloroquina, esteroides, metotrexato, azatioprina o rituximab extraoficial. Sigue existiendo una necesidad insatisfecha de encontrar tratamientos efectivos para el SS.

La neutralización de IL-21 tiene utilidad potencial en varias indicaciones, incluyendo SS primario y vasculitis (Kang, 2011; Bae et al., (2012) Allergy Asthma Immunol Res. 4, 351-356; Terrier, 2012; Abdulahad, 2013; Szabo, 2013).

El efecto de IL-21 sobre la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) se ha estudiado ampliamente. Cuando se administra mediante un sistema de genes hidrodinámicos, se ha demostrado que la IL-21 acelera en gran medida la EICH xenogénica de humano a ratón y se ha descubierto que aumenta las células B, las células plasmáticas y la inmunoglobulina (Wu et al, (2013) Protein Cell 4, 863-871). Por el contrario, se informó que el bloqueo de IL-21 en este sistema disminuye la lesión del tracto gastrointestinal, las citocinas Thl esplénicas y protege de la letalidad (Hippen et al, (2012) Blood 119, 619-628). Además, se informó que la protección contra la EICH depende de la generación de Tregs (Hippen et al, 2012).

Esta divulgación proporciona composiciones que se unen específicamente a IL-21 y métodos para el uso de tales composiciones, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio, inmunitario o autoinmunitario.

En un aspecto particular, esta divulgación contempla el tratamiento o la prevención de la EICH usando una composición que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a IL-21. Por ejemplo, se ha demostrado en un modelo de ratón xenogénico de EICH que una composición anti-IL-21 bloquea la IL-21 humana producida de novo. Esta composición inhibe de forma potente la enfermedad consuntiva inducida por EICH y la letalidad cuando se administra tanto de forma profiláctica como terapéutica.

Breve sumario de la invención

La invención es tal como se establece en las reivindicaciones. En particular, la invención se refiere a lo siguiente:

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-21 que comprende una región variable de cadena ligera (VH) y una región variable de cadena pesada (VL), en el que

(a) la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y

(b) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según el punto 1, que comprende además una región constante de cadena pesada, en el que la región constante de cadena pesada es un dominio constante de IgG.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según el punto 2, en el que el dominio constante de IgG comprende una o más sustituciones de aminoácido en relación con un dominio constante de IgG de tipo natural, y tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG de tipo natural.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según el punto 2 ó 3, en el que el dominio constante de IgG es un dominio constante de IgG1 humana.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según uno cualquiera de los puntos 1-4, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 24; o

en el que la cadena ligera contiene una región constante kappa humana y comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 26; o

en el que la cadena pesada y la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22.

6. El anticuerpo según uno cualquiera de los puntos 1-5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo recombinante.

7. El fragmento de unión a antígeno según uno cualquiera de los puntos 1-6, en el que el fragmento de unión a antígeno es Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv y sc(Fv)2.

8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según uno cualquiera de los puntos 1-7, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se conjuga con un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de la respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o un fragmento del mismo, un marcador detectable, un polietilenglicol (PEG), y cualquier combinación de los mismos.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según uno cualquiera de los puntos 1-8 y, opcionalmente, uno o más de un portador farmacéuticamente aceptable o un diluyente.

10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según uno cualquiera de los elementos 1 a 8, o composición según el punto 9, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno autoinmunitario en un sujeto, en el que la enfermedad autoinmunitaria es síndrome de Sjogren (SS), vasculitis asociada a ANCA (AAV), vasculitis de arteritis de células gigantes (GCA), lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, artritis reumatoide (AR), enfermedad de Crohn, miastenia grave, pénfigo vulgar, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), diabetes tipo I, enfermedad relacionada con IgG4, o cualquier combinación de los mismos.

11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición para su uso según el punto 10, en el que la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistémico.

12. Un método para detectar los niveles de expresión de IL-21 en una muestra que comprende (a) poner en contacto dicha muestra con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según uno cualquiera de los puntos 1 a 8; y (b) detectar la unión a IL-21 en dicha muestra.

13. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según uno cualquiera de los puntos 1 a 8, o la composición según el punto 9, para su uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad de injerto contra huésped en un sujeto.

Breve sumario de la divulgación

Algunos de los aspectos principales de la presente divulgación se resumen a continuación. Los aspectos adicionales se describen en las secciones: descripción detallada de la divulgación, ejemplos, dibujos y reivindicaciones de esta divulgación. La descripción en cada sección de esta divulgación se pretende que se lee junto con las otras secciones. Además, los diversos aspectos descritos en cada sección de esta divulgación pueden combinarse de diversas formas diferentes, y se pretende que todas estas combinaciones se encuentren dentro del alcance de la presente divulgación. La divulgación proporciona moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales capaces de inhibir la interacción de IL-21 y su receptor e inhibir la actividad de iL-21.

En algunos casos, una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a un epítopo de IL-21, en la que la molécula de unión se une específicamente al mismo epítopo de IL-21 que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) de 19E3, 9F11, 8B6 o 9H10.

En algunos casos, una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a IL-21 e inhibe competitivamente la unión de IL-21 por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la VH y VL de 19E3, 9F11, 8B6 o 9H10. En algunos casos, la VH y VL de 19E3 comprenden SEQ ID NO: 6 y 11, respectivamente, la VH y VL de 9F11 comprenden SEQ ID NO: 28 y 33, respectivamente, la VH y VL de 8B6 comprenden SEQ ID NO: 42 y 47, respectivamente, y la VH y VL de 9H10 comprenden las SEQ ID NO: 52 y 57, respectivamente.

En algunos casos, una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a IL-21 comprende una VL de anticuerpo, en la que la VL comprende secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 idénticas o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más de las VL-CDR a: SEQ ID NO: 12, 13 y 14, SEQ ID NO: 34, 35 y 36, SEQ ID NO: 48, 49 y 50, o SEQ ID NO: 58, 59 y 60, respectivamente.

En algunos casos, una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a IL-21 comprende una VH de anticuerpo, en la que la VH comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 idénticas o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más de las VH-CDR a: SEQ ID NO: 7, 8 y 9, SEQ ID NO: 29, 30 y 31, SEQ ID NO: 43, 44 y 45, o SEQ ID NO: 53, 54 y 55, respectivamente.

En algunos casos, una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a IL-21 comprende una VL de anticuerpo, en la que la VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 57.

En algunos casos, una molécula de unión aislada o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a IL-21 comprende una VH de anticuerpo, en la que la VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 52.

En algunos casos, la molécula de unión o fragmento de la misma comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En algunos casos, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-21 comprende una VL y una VH que comprenden secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 idénticas o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más CDR a: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 7, 8 y 9, SEQ ID NO: 34, 35, 36, 29, 30 y 31, SEQ ID NO: 48, 49, 50, 43, 44 y 45, o SEQ ID NO: 58, 59, 60, 53, 54 y 55, respectivamente.

En algunos casos, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-21, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una VH y una VL, en el que la VH y VL comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos al menos el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idénticas a las secuencias de aminoácidos de referencia seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 y 40, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 47, y SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 57, respectivamente.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una VH y una VL, en el que la VH comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región constante de cadena pesada o un fragmento de la misma. En algunos casos, la región constante de cadena pesada o fragmento de la misma es una región constante de IgG. En algunos casos, el dominio constante de IgG comprende una o más sustituciones de aminoácido en relación con un dominio constante de IgG de tipo natural en el que la IgG modificada tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG de tipo natural. En algunos casos, el dominio constante de IgG comprende una o más sustituciones de aminoácido de residuos de aminoácidos en las posiciones 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 y 428-436, donde la numeración de las posiciones de los aminoácidos es según al índice EU tal como se establece en Kabat. En algunos casos, al menos una sustitución de aminoácidos de dominio constante de IgG se selecciona del grupo que consiste en:

(a) sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 252 con tirosina (Y), fenilalanina (F), triptófano (W) o treonina (T),

(b) sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 254 con treonina (T),

(c) sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 256 con serina (S), arginina (R), glutamina (Q), ácido glutámico (E), ácido aspártico (D) o treonina (T),

(d) sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 257 con leucina (L),

(e) sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 309 con prolina (P),

(f) sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 311 con serina (S),

(g) sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 428 con treonina (T), leucina (L), fenilalanina (F) o serina (S), (h) sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 433 con arginina (R), serina (S), isoleucina (I), prolina (P) o glutamina (Q),

(i) sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 434 con triptófano (W), metionina (M), serina (S), histidina (H), fenilalanina (F) o tirosina, y

(j) una combinación de dos o más de las sustituciones.

En algunos casos, el dominio constante de IgG humana comprende sustituciones de aminoácido en relación con un dominio constante de IgG humana de tipo natural en las posiciones de Kabat 252, 254 y 256, en el que

(a) el aminoácido en la posición de Kabat 252 se sustituye con tirosina (Y),

(b) el aminoácido en la posición de Kabat 254 se sustituye con treonina (T), y

(c) el aminoácido en la posición de Kabat 256 se sustituye con ácido glutámico (E).

En algunos casos, el dominio constante de IgG humana es un dominio constante de IgG1 humana.

En algunos casos, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 24. En algunos casos, la región constante de cadena ligera se selecciona del grupo que consiste en una región constante kappa humana y una región constante lambda humana. En algunos casos, la región constante de cadena ligera es una región constante kappa humana. En algunos casos, la cadena pesada y la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26, respectivamente.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo murino, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, el fragmento de unión a antígeno es Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFvy sc(Fv)2.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse a IL-21 humana e IL-21 de macaco cangrejero.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo no se une específicamente a IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 o IL-15 humanas.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la unión de IL-21 al receptor de IL-21.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo es un antagonista de la actividad de IL-21.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir la fosforilación de STAT3 mediada por IL-21 en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir la fosforilación de STAT3 mediada por IL-21 humana y de macaco cangrejero en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir la producción de interferón-gamma (IFN-y) mediada por IL-21 por las células NK.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir la producción de interferón-gamma (IFN-y) mediada por IL-21 humana y de macaco cangrejero por las células NK. En algunos casos, las células NK son células NK-92 cultivadas.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir la diferenciación de células B mediada por IL-21 en células plasmáticas.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir la diferenciación mediada por IL-21 humana y de macaco cangrejero de células B estimuladas en células plasmáticas.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir la diferenciación de células B activadas por células T CD4+ en células plasmáticas.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a IL-21 humana con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 0,1 pM tal como se mide en una plataforma de ensayo de exclusión cinética (KinExA) 3000.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a IL-21 de macaco cangrejero con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 0,1 pM tal como se mide en una plataforma de ensayo de exclusión cinética (KinExA) 3000 .

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en el que la Kd para IL-21 humana es de aproximadamente 0,515 pM y la Kd para la IL-21 de macaco cangrejero es de aproximadamente 0,352 pM.

En algunos casos, el anticuerpo o fragmento del mismo se conjuga con un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de la respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o fragmento del mismo, un marcador detectable, un polietilenglicol (PEG), y una combinación de dos o más de dichos agentes.

En algunos casos, una composición comprende el anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en el presente documento, y un portador. Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunos casos, un polinucleótido aislado comprende un ácido nucleico que codifica para una VL de anticuerpo, en el que la VL comprende secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 idénticas o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más de las VL-CDR a: SEQ ID NO: 12, 13 y 14, SEQ ID NO: 34, 35 y 36, SEQ ID NO: 48, 49 y 50, o SEQ ID NO: 58, 59 y 60, respectivamente.

En algunos casos, un polinucleótido aislado comprende un ácido nucleico que codifica para una VH de anticuerpo, en el que la VH comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 idénticas o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más de las VH-CDR a: SEQ ID NO: 7, 8 y 9, SEQ ID NO: 29, 30 y 31, SEQ ID NO: 43, 44 y 45, o SEQ ID NOs: 53, 54 y 55, respectivamente.

En algunos casos, un polinucleótido aislado comprende un ácido nucleico que codifica para una VL de anticuerpo, en la que la VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 57. En algunos casos, un polinucleótido aislado comprende un ácido nucleico que codifica para una VH de anticuerpo, en el que la VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 52.

En algunos casos, el polinucleótido descrito en el presente documento comprende un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH o la VL descrita en el presente documento que puede unirse específicamente a IL-21. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente al mismo epítopo que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH y VL de 19E3, 9F11, 8B6 o 9H10.

En algunos casos, el polinucleótido descrito en el presente documento comprende un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH o la VL puede unirse a IL-21 humana y de macaco cangrejero.

En algunos casos, se proporciona un vector que comprende el polinucleótido descrito en el presente documento.

En algunos casos, se proporciona una composición que comprende el polinucleótido descrito en el presente documento o el vector descrito en el presente documento.

En algunos casos, se proporciona un polinucleótido o una combinación de polinucleótidos que codifican para la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, se proporciona un polinucleótido o combinación de polinucleótidos que codifican para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento.

En algunos casos, una composición comprende un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VH y un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VL, en el que la VL y VH comprenden secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 idénticas o idénticas excepto por cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más CDR a: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 7, 8, y 9, SEQ ID NO: 34, 35, 36, 29, 30 y 31, SEQ ID NO: 48, 49, 50, 43, 44 y 45, o SEQ ID NO: 58, 59, 60, 53, 54 y 55, respectivamente.

En algunos casos, una composición comprende un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VH y un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VL, en el que la VL y VH comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos al menos el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idénticas a las secuencias de aminoácidos de referencia seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 y 40, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 47, y SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 57, respectivamente.

En algunos casos, la VH y VL están codificadas por secuencias de ácido nucleico al menos el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idénticas a las secuencias de ácido nucleico de referencia seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 46, o SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 56, respectivamente.

En algunos casos, el polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VH y el polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VL están en el mismo vector. En algunos casos, se proporciona el vector tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, el polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VH y el polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VL están en diferentes vectores. En algunos casos, se proporcionan los vectores descritos en el presente documento.

En algunos casos, las composiciones tal como se describen en el presente documento incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende dicha VH y dicha VL que puede unirse específicamente a IL-21. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH o la VL puede unirse a IL-21 humana y de macaco cangrejero. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse específicamente al mismo epítopo que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende VH y VL de 19E3, 9F11, 8B6 o 9H10.

En algunos casos, se proporcionan células huésped que comprenden polinucleótidos tal como se describen en el presente documento, las composiciones tal como se describen en el presente documento o el vector o vectores tal como se describen en el presente documento.

En algunos casos, un método para elaborar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno tal como se describe en el presente documento comprende (a) cultivar la célula tal como se describe en el presente documento; y (b) aislar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En algunos casos, se proporciona un reactivo de diagnóstico o un kit que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento.

En algunos casos, un método para disminuir la fosforilación de STAT3 inducida por IL-21 en una célula que expresa IL-21R, incluye poner en contacto la célula con la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o la composición tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un método para disminuir la producción de IFNy mediada por IL-21 por una célula NK, incluye poner en contacto la célula NK con la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o la composición tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un método para disminuir la diferenciación mediada por IL-21 de células B no diferenciadas o de memoria en células plasmáticas, incluye poner en contacto células B no diferenciadas o de memoria con la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o la composición tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, las células T CD4+ activan la diferenciación de células plasmáticas.

En algunos casos, un método para tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio, inmunitario o autoinmunitario en un sujeto, incluye administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz de la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o la composición tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un método para prevenir una enfermedad o trastorno inflamatorio, inmunitario o autoinmunitario en un sujeto, incluye administrar a un sujeto susceptible a tal enfermedad o trastorno una cantidad eficaz de la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o la composición tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, la enfermedad autoinmunitaria es síndrome de Sjogren (SS), vasculitis (ANCA/GCA), lupus eritematoso sistémico o nefritis lúpica, artritis reumatoide (AR), enfermedad de Crohn, miastenia grave, o cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno inmunitario es EICH.

En algunos casos, el método para prevenir la EICH incluye reducir o eliminar los síntomas de la EICH.

En algunos casos, los síntomas de la EICH reducidos o eliminados son erupciones, ampollas, náuseas, pérdida del apetito, vómitos, saciedad temprana después de comer, diarrea, malestar abdominal, distensión abdominal, sangre en las heces, ictericia, orina oscura, malestar del abdomen superior, aumento de peso por retención agua (o hinchazón), síntomas similares a los de la artritis, dolor y rigidez, ojos secos, irritación de los ojos, llagas en la boca, tos persistente, falta de aliento, dificultad para respirar.

En algunos casos, un método para inhibir la pérdida de peso debida a EICH, incluye administrar a un sujeto que tiene EICH o susceptible a EICH, la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o la composición tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un método para reducir la anemia debida a EICH, incluye administrar a un sujeto que tiene EICH o susceptible a EICH, la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o la composición tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un método para inhibir la expansión de células T, incluye administrar a un sujeto que tiene EICH o susceptible a EICH, la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o la composición tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un método para reducir citocinas en un sujeto que tiene EICH o susceptible a EICH, incluye administrar al sujeto la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o el composición tal como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un método para detectar niveles de expresión de IL-21 en una muestra incluye (a) poner en contacto dicha muestra con la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describe en el presente documento o la composición tal como se describe en el presente documento y (b) detectar la unión a IL-21 en dicha muestra.

Breve descripción de los dibujos/figuras

La figura 1A muestra alineaciones de las regiones variables del anticuerpo monoclonal murino 9F11 (VH: SEQ ID NO: 28, VL: SEQ ID NO: 33) y tres variantes humanizadas (VH-4 y VH-11: SEQ ID NO: 41, VH-6: SEQ ID NO: 42, VL-4 y VL-6: SEQ ID NO: 43, VL-11: SEQ ID NO: 44). Los residuos que son diferentes entre humanos y murinos en las regiones de entramado tienen doble subrayado. Las mutaciones inversas murinas en las regiones de entramado están en negrita y las regiones CDR están subrayadas. La figura 1B muestra alineaciones de las regiones variables del anticuerpo monoclonal murino 19E3 (VH: SEQ ID NO: 6, VL: SEQ ID NO: 11) y tres variantes de VH humanizadas (SEQ ID NO: 61, 62 y 63) y dos variantes de VL humanizadas (SEQ ID NO: 64 y 65). Los residuos que son diferentes entre humanos y murinos en las regiones de entramado tienen doble subrayado. Las mutaciones inversas murinas en las regiones de entramado están en negrita y las regiones CDR están subrayadadas.

La figura 2A y la figura 2B muestran ajuste de la curva dual KinExA de concentraciones de 500 fM y 50 pM de IgG K44VHa-N56Q (MEDI7169) en competición en fase en disolución con IL-21 humana (figura 2A) y de macaco cangrejero (figura 2B).

La figura 3A muestra el efecto de IL-21 humana o de macaco cangrejero sobre la fosforilación de STAT3 de PBMC humanas. La figura 3B muestra la inhibición de la regulación por incremento inducida por IL-21 de macacos cangrejeros y humanos de la fosforilación de STAT3 de PBMC humanas por anticuerpos anti-IL-21 K2Ha-N56Q (triángulos invertidos), K44VHa-N56Q (MEDI7169) (rombos) y K44VHa6-N56Q (círculos).

La figura 4 muestra la inhibición de IL-21 humana (figura 4A) y de macaco cangrejero (figura 4B) inducida por células NK-92 IFNy.

La figura 5 muestra la inhibición de la diferenciación inducida por IL-21 de células B humanas en células plasmáticas o bien por IL-21 humana (figura 5A) o de macaco cangrejero (figura 5B). Los gráficos muestran la reducción del nivel de PC IgD- CD38hi en comparación con los controles. La figura 5C muestra que en condiciones de control, la estimulación con IL-21, anticuerpo anti-CD40 y anticuerpo anti-IgM dio como resultado una producción de Ig en el intervalo de 30-40 |ig/ml el día 6, y 19E3.1 y 9F11.1 inhibieron la producción de Ig.

La figura 6A muestra que el cultivo conjunto de células B con células T CD4+ activadas dio como resultado la aparición de una población de Pc IgD' CD38hi, expresando el 68,5% de las células CD19+ este fenotipo de PC el día 7. Las figuras 6b y 6C muestran inhibición de la diferenciación de PC mediante la adición de 19E3.1 o 9F11.1.

La figura 7 muestra que el anticuerpo anti-IL2 1 (19E3.1) bloquea la expansión de células T inducida por IL-21. Se estimularon células T humanas con IL-21 humana recombinante en combinación con anticuerpo anti-CD3. Se añadió el anticuerpo 19E3.1 a las concentraciones indicadas y se cuantificó la expansión de células T el día cuatro. Todas las condiciones se realizaron por duplicado. El experimento se realizó con dos donantes únicos. Se muestra un donante representativo.

La figura 8 muestra que K44VHa-N56Q (MEDI7 169) bloquea la enfermedad consuntiva inducida por EICH al limitar la expansión de células T CD4+. Se transfirieron Pb Mc del donante 1 (12,71 x 106) o PBMC del donante 2 (13,46 x 106) a ratones NOD/SCID/yc el día 0 del estudio. Los ratones recibieron 200 |ig de AcM de control (figura 8A) o K44VHa-N56Q (figura 8B) administrado tres veces por semana a partir del día -1. Se extrajo sangre de los ratones cada dos semanas y se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar el número y el fenotipo de las células CD45+ humanas. La figura 8C y la figura 8D muestran el porcentaje de células CD45+ humanas recogidas de ratones que recibieron el AcM de control o K44VHa-N56Q, respectivamente, (desde el día 21, donante 1; n = 3 AcM de control, n = 5 K44VHa-N56Q). La figura 8E y la figura 8F muestran el porcentaje de células CD4+ o CD8+ dentro de la fracción CD45+ humana en ratones que recibieron el AcM de control o K44VHa-N56Q, respectivamente, (desde el día 35, donante 2; n = 10 AcM de control vehículo PBS/n = 5 K44VHa-N56Q). Todas las condiciones tiñeron 100 |il de sangre y se recogieron en un citómetro de flujo durante el mismo periodo de tiempo, por lo que el número de eventos mostrados refleja el número relativo de células. Promedio ± error estándar de los números absolutos de células CD45+ humanas recogidas de sangre el día 21 fue para el donante 1, AcM de control, n = 3 (729, 111 ± 113,899) frente a K44VHa-N56Q, n = 5 (39,104 ± 5,159), P <0,0357. Para el donante 2, AcM de control y PBS combinados, n = 10 (237,294 ± 35,628) frente a K44VHa-N56Q, n = 5, (14,980 ± 2,275) P = 0,0007.

La figura 9 muestra que K44VHa-N56Q inhibe reversiblemente la expansión de células humanas en ratones receptores. Se transfirieron PBMC del donante 2 (13,46 x 106) a ratones NOD/SCID/yc el día 0 del estudio. Los ratones recibieron 200 |il de vehículo PBS (cuadrados), o 200 |ig de K44VHa-N56Q (triángulos) o AcM de control (círculos) administrados tres veces a la semana comenzando el día -1 hasta el día 44. Se extrajo sangre de los ratones cada dos semanas y se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar el número de células CD45+ humanas. Los datos indican el número de células humanas recogidas. Todas las condiciones tiñeron 100 |il de sangre y se recogió el mismo volumen en un citómetro de flujo, por lo que el número de acontecimientos mostrados refleja el número relativo de células.

La figura 10 muestra que K44VHa-N56Q protege de la pérdida de peso inducida por EICH y muerte. Se transfirieron PBMC del donante 1 (12,71 x 106) a ratones NOD/SCID/yc el día 0 del estudio y se siguió a los ratones para determinar la pérdida de peso corporal (figura 10 A) y muerte (figura 10B). Se administró K44VHa-N56Q (triángulos) o AcM de control (círculos rellenos) tres veces por semana a 200 |ig/ratón comenzando el día -1 hasta el día 31. Los animales que sin tratamiento previo (círculos abiertos) no recibieron células humanas ni AcM. El porcentaje de supervivencia representa cuando o bien murieron los ratones o bien alcanzaron el 20% de pérdida de peso corporal y fueron sacrificados. Se muestra uno de los dos experimentos independientes de PBMC de dos donantes diferentes.

La figura 11 muestra la inhibición de la proliferación celular y la producción de citocinas por K44VHa-N56Q. Se transfirieron PBMC del donante 2 (13,46 x 106) a ratones NOD/SCID/yc el día 0 del estudio y se les inyectaron o bien 200 |ig de K44VHa-N56Q o bien AcM de control tres veces por semana comenzando el día -1. Se extrajo sangre de los ratones y se evaluó la cantidad de citocinas en suero para determinar la presencia de citocinas usando el kit Th17 humano del sistema MILLIPLEX MAP de Millipore. Los niveles séricos (pg/ml) se muestran para IL-21 (figura 11A), interferón gamma (figura 11B), factor de necrosis tumoral alfa (figura 11C), IL-9 (figura 11D), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (FIG. HE), IL-10 (figura 11F) e IL-5 (figura 11G).

La figura 12 muestra que la inhibición de la proliferación celular y la producción de citocinas por anticuerpo anti-IL-21 es reversible. Se transfirieron PBMC del donante 1 (12,71 x 106) a ratones NOD/SCID/yc el día 0 y se les inyectaron o bien 200 |ig de K44VHa-N56Q (símbolos cerrados) o bien AcM de control (símbolos abiertos) tres veces por semana comenzando el día -1 hasta el día 31, cuando se detuvo K44VHa-N56Q. Se extrajo sangre de los ratones los días 15, 28, 43 y 57, y la cantidad de interferón gamma (figura 12A), factor de necrosis tumoral alfa (figura 12B) e IL-10 (figura 12C) en suero en estos momentos se determinó usando el kit Th17 humano del sistema MILLIPLEX MAP de Millipore. También se extrajo sangre de los ratones los días 7, 21, 35, 51 y 57, y se determinó el número de células CD45+ humanas (figura 12D). Todos los ratones que recibieron AcM de control murieron el día 28 del estudio; por tanto, solo hay un punto de tiempo para las citocinas para estos animales.

La figura 13 muestra que K44VHa-N56Q terapéutico protege a los sujetos de la EICH. Se transfirieron PBMC del donante 1 (12,0 x 106) a ratones NOD/SCID/yc el día 0 del estudio y se monitorizó la supervivencia. Se administró o bien AcM de control comenzando el día 7 del estudio (círculos), K44VHa-N56Q comenzando el día 7 del estudio (triángulos) o bien K44VHa-N56Q comenzando el día 14 del estudio (triángulos inversos) tres veces a la semana a 200 |ig/ratón. Los ratones se sacrificaron cuando se determinó que habían perdido el 20% de peso corporal o si el ratón estaba demacrado/moribundo o si tenía dolor o angustia. Muerte y sacrificio humanitario se usaron como sinónimos con el fin de realizar un seguimiento de la supervivencia.

La figura 14 muestra que K44VHa-N56Q puede proteger de la anemia inducida por EICH. Los ratones se inyectaron y se trataron tal como se describe para la figura 13. Los ratones no se habían sometido a tratamiento previo, es decir, no se les administraron células (asteriscos), o se les administraron PBMC humanas seguido por AcM de control comenzando el día 7 del estudio (círculos), K44VHa-N56Q comenzando el día 7 del estudio (triángulos) o K44VHa-N56Q comenzando el día 14 del estudio (triángulos inversos), administrado tres veces por semana a 200 |ig/ratón. Las muestras de sangre completa heparinizada recogidas del seno retroorbital se diluyeron 1:10 antes del análisis con un analizador hematológico automático (Sysmex XT-2000iv). Los valores totales resultantes de recuentos de glóbulos blancos resultante (figura 14A) y recuentos de glóbulos rojos (figura 14C), hematocrito (figura 14B) y hemoglobina (figura 14D) se multiplicaron por un factor de dilución de diez.

Descripción detallada de la divulgación

La presente divulgación proporciona moléculas y fragmentos de unión a antígeno de las mismas que se unen a IL-21. En algunos aspectos, tales moléculas son anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a IL-21. También se proporcionan polinucleótidos relacionados, composiciones que comprenden los anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y métodos para elaborar los anticuerpos anti-IL-21 y fragmentos de unión a antígeno. Se proporcionan además métodos para usar los nuevos anticuerpos anti-IL-21, tales como métodos para tratar enfermedades o trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios en un sujeto y usos de diagnóstico.

Para que la presente divulgación pueda entenderse más fácilmente, en primer lugar se definen determinados términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

I. Definiciones

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Los términos “un” (o “una”), así como los términos “uno o más” y “al menos uno”, pueden usarse de manera intercambiable en el presente documento.

Además, “y/o” debe tomarse como divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término “y/o” tal como se usa en una frase como “A y/o B” pretende incluir “A y B”, “A o B”, “A” (solo) y “B” (solo). Asimismo, el término “y/o” tal como se usa en una frase como “A, B y/o C” pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que se refiere esta divulgación. Por ejemplo, el Diccionario Conciso de Biomedicina y Biología Molecular, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; el Diccionario de Biología Celular y Molecular, 3a ed., 1999, Academic Press; y el Diccionario Oxford de Bioquímica y Biología Molecular, revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta divulgación.

Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxilo. Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o aspectos de la divulgación, que pueden tenerse como referencia a la memoria descriptiva en su conjunto.

Siempre que se describen realizaciones o aspectos con el lenguaje “que comprende”, también se proporcionan realizaciones o aspectos análogos descritos en cuanto a “que consiste en” y/o “que consiste esencialmente en”.

Los aminoácidos se denominan en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, se hace referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

El término “IL-21” se refiere a la citocina interleucina-21 y/o fragmentos activos de la misma. IL-21 se une al receptor de IL-21 en diversas células diferentes del sistema inmunitario, induciendo la transducción de señales en esas células tal como se describe en otra parte del presente documento. La IL-21 se ha caracterizado en la mayoría de sistemas de modelos animales más comunes. Pueden encontrarse las secuencias de ADNc y aminoácidos de la IL-21 humana, por ejemplo, en los números de registro de GenBank BC066260.1 (SEQ ID NO: 1) y AAH69124.1 (SEQ ID NO: 2). Las secuencias de ADNc y aminoácidos de IL-21 de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) pueden encontrarse, por ejemplo, como SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 3) y 4 (SEQ ID n O: 4) de la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2008-0267910 A1.

Los términos “inhibir”, “bloquear” y “suprimir” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a cualquier disminución estadísticamente significativa en la actividad biológica, incluyendo el bloqueo total de la actividad. Por ejemplo, “inhibición” puede referirse a una disminución de aproximadamente el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 100% en la actividad biológica. Por consiguiente, cuando los términos “ inhibición” o “supresión” se aplican para describir, por ejemplo, un efecto sobre la ruta de transducción de señales de IL-21, por ejemplo, en la transducción de señales en una célula que expresa el receptor de IL-21 (IL-21R) en presencia de IL-21, (por ejemplo, fosforilación de STAT3, producción de interferón-gamma IFN-y en células NK, diferenciación de células B en células plasmáticas o inhibición de la proliferación impulsada por IL-21 de células T CD4+ humanas no diferenciadas), los términos se refieren a la capacidad de una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, para disminuir de manera estadísticamente significativa la transducción de señal inducida por IL-21 a través de IL-21R en relación con la transducción de señal en una célula no tratada (control). La célula que expresa IL-21R puede ser una célula o línea celular que se produce de manera natural (por ejemplo, una célula T, una célula B, un linfocito citolítico natural (NK), una célula dendrítica u otro tipo de célula linfoide) o pueden producirse de manera recombinante introduciendo un ácido nucleico que codifica para IL-21R en una célula huésped. En un aspecto, la molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede inhibir la transducción de señales mediada por IL-21 en una célula que expresa IL-21R en al menos un 10%, o al menos un 20%, o al menos un 30%, o al menos al menos un 40%, o al menos un 50%, o al menos un 60%, o al menos un 70%, o al menos el un 80%, o al menos un 90% o aproximadamente un 100%, tal como se determina, por ejemplo, mediante citometría de flujo, inmunotransferencia de tipo Western, ELISA u otros ensayos tal como se describen en los ejemplos a continuación.

Los términos “anticuerpo” o “ inmunoglobulina”, tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, incluyen anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno o cadenas sencillas de los mismos.

Un anticuerpo típico comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CI. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de entramado (FW). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FW, dispuestas desde el extremo terminal amino hasta extremo terminal carboxilo en el siguiente orden: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Los anticuerpos a modo de ejemplo de la presente divulgación incluyen los anticuerpos monoclonales murinos producidos por hibridomas 19E3, 9F11, 8H10 y 8B6, versiones humanizadas, optimizadas por afinidad, devueltas a la línea germinal y/u otras de estos anticuerpos, y anticuerpo anti-IL-21 optimizado para la semivida en suero y anticuerpos YTE (por ejemplo, K44VHa-N56Q K44VHa6-N56Q o K2Ha-N56Q).

El término “vuelta a la línea germinal” significa que los aminoácidos en posiciones específicas en un anticuerpo se mutan de nuevo a los de la línea germinal.

El término “anticuerpo” puede referirse a una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, hidrato de carbono, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), mutantes Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos generados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una porción de determinación de antígeno de un anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno siempre que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2), basándose en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada denominados alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados con otras moléculas tales como toxinas, radioisótopos, etc.

Un anticuerpo “bloqueante” o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une, tal como IL-21. En determinados aspectos, los anticuerpos bloqueantes o los anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. Deseablemente, la actividad biológica se reduce en un 10%, un 20%, un 30%, un 50%, un 70%, un 80%, un 90%, un 95% o incluso un 100%.

El término “anticuerpo frente a IL-21” o “un anticuerpo que se une a IL-21” o “anticuerpo anti-IL-21” se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a IL-21 con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico o reactivo de diagnóstico para seleccionar como diana IL-21. El grado de unión de un anticuerpo anti-IL-21 a una proteína no relacionada con IL-21 es menos de aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo a IL-21 medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), BIACORE® (usando IL-21 recombinante como analito y anticuerpo como ligando, o viceversa), KINEXA® u otros ensayos de unión conocidos en la técnica. En determinados aspectos, un anticuerpo que se une a IL-21 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |iM, <100 nM, <10 nM, < 1 nM, <0,1 nM, <10 pM, <1 pMo <0,1 pM.

El término “fragmento de unión a antígeno” se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones determinantes de complementariedad variables de un anticuerpo intacto. Los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa pueden ser un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, ScFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Un “anticuerpo monoclonal” (AcM) se refiere a una población de anticuerpos homogénea implicada en el reconocimiento y unión altamente específicos de un único determinante antigénico, o epítopo. Esto contrasta con los anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos. El término “anticuerpo monoclonal” abarca tanto anticuerpos monoclonales intactos como completos, así como fragmentos de anticuerpos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), mutantes de cadena sencilla (scFv), proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Además, “anticuerpo monoclonal” se refiere a tales anticuerpos elaborados de diversas formas, que incluyen, pero no se limitan a, hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante y animales transgénicos.

El término “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo derivado de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, murina), que se ha modificado por ingeniería genética para contener secuencias no humanas (por ejemplo, murinas) mínimas. Normalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) se reemplazan por residuos de la CDR de una especie no humana (por ejemplo, ratón, rata, conejo o hámster) que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al, 1986, Nature, 321: 522-525; Riechmann et al, 1988, Nature, 332: 323-327; Verhoeyen et al, 1988, Science, 239: 1534-1536.). En algunos casos, los residuos de la región de entramado Fv (FW) de una inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas.

Los anticuerpos humanizados pueden modificarse adicionalmente mediante la sustitución de residuos adicionales en la región de entramado Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, los anticuerpos humanizados comprenderán sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos o tres, dominios variables que contienen todas o sustancialmente todas las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Los ejemplos de métodos usados para generar anticuerpos humanizados se describen en las patentes estadounidenses n.os 5.225.539 o 5.639.641.

Una “región variable” de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, o bien sea sola o bien en combinación. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera consisten cada una en cuatro regiones de entramado (FW) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las regiones FW y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de la secuencia entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda Md.)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273: 927-948)). Además, en ocasiones se usan en la técnica combinaciones de estos dos enfoques para determinar las CDR.

El sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland (1991)).

La numeración de la posición de los aminoácidos tal como en Kabat se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland (1991). Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más, correspondientes a un acortamiento o inserción en un FW o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un inserto de un solo aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y los residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 FW de cadena pesada.

Tabla 1

Bucle Kabat: AcM Chothia.

L1 L24-L34 L24-L34 1,24-1,34

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56

13 L89-L97 L89-L97 L89-L97

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 ..34

(Numeración de Kabat)

HI H31-H35 H26-H35 H26-H32

(Numeración de Chothia)

H2 H50-H65 H50-H5S H52-HS6

IB H95-H102 H95-H102 H95-H102

La numeración de residuos de Kabat puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat “convencional”. Chothia se refiere en cambio a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). El final del bucle CDR-H1 de Chothia cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 dependiendo de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B están presentes, el bucle termina en 32; si solo está presente 35A, el bucle termina en 33; si están presentes tanto 35A como 35B, el bucle termina en 34). Las regiones hipervariables de AcM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan mediante el software de modelado de anticuerpos AcM de Oxford Molecular. Véase la tabla 1.

IMGT (ImMunoGeneTics) también proporciona un sistema de numeración para las regiones variables de inmunoglobulina, incluyendo las CDR. Véase, por ejemplo, Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77 (2003). El sistema de numeración IMGT se basó en una alineación de más de 5000 secuencias, datos estructurales y caracterización de bucles hipervariables y permite una fácil comparación de las regiones variables y CDR para todas las especies. Según el esquema de numeración IMGT, VH-CDR1 está en las posiciones 26 a 35, VH-CDR2 está en las posiciones 51 a 57, VH-CDR3 está en las posiciones 93 a 102, VL-CDR1 está en las posiciones 27 a 32, VL-CDR2 está en las posiciones 50 a 52 y VL-CDR3 está en las posiciones 89 a 97.

Tal como se usa en toda la memoria descriptiva, las secuencias de CDR de VH descritas corresponden a las ubicaciones clásicas de numeración de Kabat, es decir, VH-CDR1 de Kabat está en las posiciones 31-35, VH-CDR2 está en la posiciones 50-65 y VH-CDR3 está en las posiciones 95-102. VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 también corresponden a ubicaciones de numeración de Kabat clásicas, concretamente, las posiciones 24-34, 50-56 y 89-97, respectivamente.

El término “anticuerpo humano” significa un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un anticuerpo producido por un humano elaborado usando cualquier técnica conocida en la técnica. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de los mismos y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada y/o ligera humana tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana.

El término “anticuerpos quiméricos” se refiere a anticuerpos en los que la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies. Normalmente, la región variable de las cadenas tanto ligera como pesada corresponde a la región variable de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas, mientras que las regiones constantes son homólogas a las secuencias en los anticuerpos derivados de otro (normalmente humano) para evitar provocar una respuesta inmunitaria en esa especie.

Los términos “YTE” o “mutante YTE” se refieren a una mutación en IgG1-Fc que da como resultado un aumento en la unión a FcRn humano y mejora la semivida en suero del anticuerpo que tiene la mutación. Un mutante YTE comprende una combinación de tres mutaciones, M252Y/S254T/T256E (numeración UE, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Servicio de Salud Pública de EE.UU., Institutos Nacionales de Salud, Washington, D.C.), introducidas en la cadena pesada de una IgG1. Véase la patente estadounidense n.° 7.658.921. Se ha demostrado que el mutante YTE aumenta la semivida en suero de los anticuerpos aproximadamente cuatro veces en comparación con las versiones de tipo natural del mismo anticuerpo (Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281: 23514-24 (2006); Robbie et al., (2013) Antimicrob. Agents Chemother. 57, 6147-6153). Véase también la patente estadounidense n.° 7.083.784.

La “afinidad de unión” generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un pareja de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente puede representarse mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos por más tiempo. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para medir la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse para los propósitos de la presente divulgación.

La “potencia” se expresa normalmente como un valor de CI⁵⁰, en nM o pM a menos que se indique lo contrario. La CI⁵⁰ es la concentración inhibitoria media de una molécula de anticuerpo. En ensayos funcionales, la CI⁵⁰ es la concentración que reduce una respuesta biológica en un 50% de su máximo. En estudios de unión de ligandos, la CI⁵⁰ es la concentración que reduce la unión al receptor en un 50% del nivel máximo de unión específica. La CI⁵⁰ puede calcularse mediante cualquier número de medios conocidos en la técnica.

La mejora en veces de la potencia de los anticuerpos o polipéptidos de la divulgación en comparación con un anticuerpo de referencia puede ser de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 110 veces, al menos aproximadamente 120 veces, al menos aproximadamente 130 veces, al menos aproximadamente 140 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 160 veces, al menos aproximadamente 170 veces, o al menos aproximadamente 180 veces o más.

“Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig secretada unida a los receptores Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas. (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos IgG de alta afinidad específicos dirigidos a la superficie de las células diana “arman” las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para tal destrucción. La lisis de la célula diana es extracelular, requiere contacto directo de célula a célula y no implica complemento. Se contempla que, además de los anticuerpos, otras proteínas que comprenden regiones Fc, específicamente proteínas de fusión Fc, que tienen la capacidad de unirse específicamente a una célula diana portadora de antígeno, podrán efectuar citotoxicidad mediada por células. Por simplicidad, la citotoxicidad mediada por células que resulta de la actividad de una proteína de fusión Fc también se denomina en el presente documento actividad ADCC.

Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está “aislado” es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que se halla en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aislados incluyen aquellos que se han purificado hasta el punto de que ya no se hallan en la forma en que se encuentran en la naturaleza.

En algunos aspectos, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que se aísla es sustancialmente puro.

Por “sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mamífero” se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que se desea diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, animales de granja, animales para deporte y animales de zoológico, incluyendo, por ejemplo, humanos, primates no humanos, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, osos, etc.

El término “composición farmacéutica” se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del principio activo sea eficaz y que no contenga componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la composición. Tal composición puede ser estéril.

Una “cantidad eficaz” de un anticuerpo tal como se describe en el presente documento es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una “cantidad eficaz” puede determinarse empíricamente y de manera rutinaria, en relación con el propósito establecido.

La palabra “marcador” cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo para generar un anticuerpo “marcado”. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable.

Términos como “que trata” o “tratamiento” o “tratar” o “que alivia” o “aliviar” se refieren a medidas terapéuticas que curan, ralentizan, disminuyen los síntomas y/o detienen la progresión de un estado o trastorno patológico diagnosticado. Por tanto, aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno. En determinados aspectos, un sujeto se “trata” con éxito de una enfermedad o trastorno inflamatorio, inmunitario o autoinmunitario según los métodos proporcionados en el presente documento si el paciente muestra, por ejemplo, alivio o eliminación total, parcial o transitoria de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno.

“Prevenir” o “prevención” se refiere a medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o retrasan el desarrollo de un estado o trastorno patológico específico. Por tanto, aquellos que necesitan prevención incluyen aquellos propensos a tener o susceptibles a padecer el trastorno. En determinados aspectos, una enfermedad o trastorno inflamatorio, inmunitario o autoinmunitario se previene con éxito según los métodos proporcionados en el presente documento si el paciente desarrolla, por ejemplo, de manera transitoria o permanente, menos síntomas o síntomas menos graves asociados con la enfermedad o trastorno, o una aparición posterior de síntomas asociados con la enfermedad o trastorno, que un paciente que no ha estado sujeto a los métodos de la divulgación.

Un “polinucleótido”, tal como se usa en el presente documento, puede incluir uno o más “ácidos nucleicos”, “moléculas de ácido nucleico” o “secuencias de ácido nucleico” y se refiere a un polímero de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye ADN y ARN. Los polinucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos mencionados en el presente documento, incluyendo ARN y a Dn .

El término “vector” significa un constructo, que es capaz de administrar, y en algunos aspectos, expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y determinadas células eucariotas, tales como células productoras.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y los no aminoácidos pueden interrumpirlo. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta divulgación se basan en anticuerpos, en determinados aspectos, los polipéptidos pueden presentarse como cadenas simples o cadenas asociadas.

Los términos “idéntico” o porcentaje de “ identidad” en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para una correspondencia máxima, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad puede medirse usando software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen en la técnica diversos algoritmos y software que pueden usarse para obtener alineaciones de secuencias de aminoácidos o nucleótidos.

Un ejemplo no limitativo de un algoritmo de alineación de secuencia es el algoritmo descrito en Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264-2268, modificado en Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 5873-5877 e incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402). En determinados aspectos, puede usarse BLAST con huecos tal como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266: 460-480.), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, Sur de San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son programas de software adicionales disponibles al público que pueden usarse para alinear secuencias. En determinados aspectos, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (por ejemplo, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 ó 90 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6). En determinados aspectos alternativos, el programa GAP en el paquete de software GCG, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) puede usarse para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, usando una matriz BLOSUM 62 o una matriz pA m 250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, en determinados aspectos, el porcentaje de identidad entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos se determina usando el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el porcentaje de identidad puede determinarse usando el programa ALIGN (versión 2.0) y usando un PAM120 con tabla de residuos, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Un experto en la técnica puede determinar los parámetros apropiados para la alineación máxima mediante software de alineación particular. En determinados aspectos, se usan los parámetros predeterminados del software de alineación.

En determinados aspectos, el porcentaje de identidad “X” de una primera secuencia de aminoácidos con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z), donde Y es el número de residuos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas en la alineación de las secuencias primera y segunda (alineadas mediante inspección visual o un programa de alineación de secuencias particular) y Z es el número total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es más larga que la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia con respecto a la segunda secuencia será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia con respecto a la primera secuencia.

Una “sustitución de aminoácidos conservadora” es aquella en la que un residuo de aminoácido se reemplaza por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas. (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina con una tirosina es una sustitución conservadora. En determinados aspectos, las sustituciones conservadoras en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la divulgación no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos al/a los antígeno(s), es decir, la IL-21 a la que se une el polipéptido o anticuerpo. Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión a antígeno se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Brummell et al, Biochem. 32: 1180-1 187 (1993)); Kobayashi et al, Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999); y Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: .412-417 (1997)).

II. Moléculas de unión anti-IL-21

La presente divulgación proporciona moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a IL-21. Las secuencias de aminoácidos (aa) y nucleótidos (nt) de longitud completa para IL-21 se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, los n.^os de registro de GenBank BC066260.1 (SEQ iD NO: 1) y AAH69 124.1 (SEQ ID NO: 2), respectivamente, para IL-21 humana, o publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2008-0267910 A1 para IL-21 de macaco cangrejero (Macaca fasciculari) (SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente). En algunos aspectos, las moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento son anticuerpos murinos, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. En determinados aspectos, las moléculas de unión a IL-21 son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos aspectos, las moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden un Fab, un Fab', un F(ab')² , un Fd, un Fv monocatenario o scFv, un Fv unido por disulfuro, un dominio V-NAR, un IgNar, un intracuerpo, un IgGACH2, un minicuerpo, un F(ab')3 un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de dominio único, DVD-Ig, Fcab, AcM², un (scFv)² o un scFv-Fc. En algunos aspectos, el anticuerpo es del subtipo IgG1 y comprende el triple mutante YTE, tal como se divulgó anteriormente en la sección de definiciones. Determinados anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de los mismos se proporcionan en la tabla 2 en la sección de ejemplos.

En determinados aspectos, esta divulgación proporciona una molécula de unión a IL-21 o fragmento de unión a antígeno de la misma, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede unirse específicamente al mismo epítopo de IL-21 como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) de 19E3, 9F11, 8B6 o 9H10. También se proporciona una molécula de unión a IL-21 o fragmento de unión a antígeno de la misma, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede inhibir de manera competitiva, o puede unirse a IL-21 con una mayor afinidad que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH y VL de 19E3, 9F11, 8B6 o 9H10. Tal como se proporciona en el presente documento, la VH y VL de 19e 3 comprenden las SEQ ID NO: 6 y 11, respectivamente, la VH y VL de 9F11 comprenden las SEQ ID NO: 28 y 33, respectivamente, la VH y VL de 8b 6 comprenden las SEQ ID NO: 42 y 47, respectivamente, y la VH y VL de 9H10 comprenden las SEQ ID NO: 52 y 57, respectivamente.

La divulgación proporciona además una molécula de unión a IL-21 o un fragmento de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, que incluye una región VL de anticuerpo. En determinados aspectos, la región VL incluye una, dos o tres VL-CDR, tal como una VLCDR1 idéntica o idéntica excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 58, una VLCDR2 idéntica o idéntica excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 59, o una VLCDR3 idéntica o idéntica excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido a SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 60. En determinados aspectos, la región VL contiene las secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 idénticas o idénticas excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de un aminoácido en una o más de las VL-CDR a: SEQ ID NO: 12, 13 y 14, SEQ ID NO: 34, 35 y 36, SEQ ID NO: 48, 49 y 50 o SEQ ID NO: 58, 59 y 60, respectivamente. En determinados aspectos, la región VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 57.

Se proporciona además una molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye una región VH de anticuerpo. En determinados aspectos, la región VH incluye una, dos o tres VH-CDR, tales como una VHCDR1 idéntica o idéntica excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 53, una VHCDR2 idéntica o idéntica excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 54, o una VHCDR3 idéntica o idéntica excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 55. En determinados aspectos, la región VH contiene las secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 idénticas o idénticas excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o sustituciones de aminoácido en una o más de las VH-CDR a: SEQ ID NO: 7, 8 y 9, SEQ ID NO: 29, 30 y 31, SEQ ID NO: 43, 44 y 45 o SEQ ID NO: 53, 54 y 55, respectivamente. En determinados aspectos, la región VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 52.

En aspectos particulares, una molécula de unión a IL-21 proporcionada en el presente documento comprende un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-21 que comprende una región VL y una región VH, donde la VL y VH contienen en conjunto las secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 idénticas o idénticas excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más CDR a: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 7, 8 y 9, SEQ ID NO: 34, 35, 36, 29, 30 y 31, SEQ ID NO: 48, 49, 50, 43, 44 y 45, o SEQ ID NO: 58, 59, 60, 53, 54 y 55, respectivamente.

Por ejemplo, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-21 que comprende una VH y una VL, donde la VH y VL contienen, respectivamente, secuencias de aminoácidos al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idénticas a las secuencias de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 y 40, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 57, respectivamente.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-IL-2 1 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH y VL de K44VHa-N56Q, la secuencia de aminoácidos de VH SEQ ID NO: 19 y la secuencia de aminoácidos de VL SEQ ID NO: 21.

Un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento, por ejemplo, tal como se describió anteriormente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo murino, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo multiespecífico, o cualquier combinación de los mismos. Un fragmento de unión a antígeno de anticuerpo anti-IL-21 puede ser un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento dsFv, un fragmento scFv o un fragmento sc(Fv)2.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-IL-2 1 o fragmento de unión a antígeno del mismo que puede unirse a moléculas de IL-21 entre especies, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento puede unirse a IL-21 de ratón, IL-21 de rata, IL-21 de conejo, IL-21 humana y/o IL-21 de macaco cangrejero. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento puede unirse a IL-21 humana e IL-21 de macaco cangrejero. En un ejemplo adicional, el anticuerpo o fragmento también puede unirse a IL-21 de ratón.

El receptor de IL-21 comparte una cadena gamma común con varios otros receptores de citocinas, por ejemplo, IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R e IL-15R. En determinados aspectos proporcionados en el presente documento, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse específicamente a IL-21, por ejemplo, IL-21 humana e IL-21 de macaco cangrejero e IL-21 de ratón, pero no se une específicamente a IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 o IL-15 humanas.

Un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento, por ejemplo, tal como se describió anteriormente, puede incluir, además de una VH y una VL, una región constante de cadena pesada o un fragmento de la misma. En determinados aspectos, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada humana, por ejemplo, una región constante de IgG humana, por ejemplo, una región constante de IgG1 humana. Tal como se describe en otra parte en el presente documento, en determinados aspectos, una región constante de cadena pesada o fragmento de la misma, por ejemplo, una región constante de IgG humana o fragmento de la misma, puede incluir una o más sustituciones de aminoácido con respecto a un dominio constante de IgG de tipo natural en el que la IgG modificada tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG de tipo natural. Por ejemplo, el dominio constante de IgG puede contener una o más sustituciones de aminoácido de residuos de aminoácidos en las posiciones 251-257, 285­ 290, 308-314, 385-389 y 428-436, en el que la numeración de las posiciones de los aminoácidos es según el índice EU tal como se establece en Kabat. En determinados aspectos, el dominio constante de IgG puede contener una o más de una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 252 con tirosina (Y), fenilalanina (F), triptófano (W) o treonina (T), una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 254 con treonina (T), una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 256 con serina (S), arginina (R), glutamina (Q), ácido glutámico (E), ácido aspártico (D) o treonina (T), una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 257 con leucina (L), una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 309 con prolina (P), una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 311 con serina ( S), una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 428 con treonina (T), leucina (L), fenilalanina (F) o serina (S), una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 433 con arginina (R), serina (S), isoleucina (I), prolina (P) o glutamina (Q), o una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 434 con triptófano (W), metionina (M), serina (S), histidina (H), fenilalanina (F) o tirosina. Más específicamente, el dominio constante de IgG puede contener sustituciones de aminoácido con respecto a un dominio constante de IgG humano de tipo natural, incluyendo como sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 252 con tirosina (Y), una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 254 con treonina (T) y una sustitución del aminoácido en la posición de Kabat 256 con ácido glutámico (E).

Esta divulgación proporciona un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo donde la cadena pesada es un mutante YTE de IgG1 humana, por ejemplo, la cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 24.

Un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento, por ejemplo, tal como se describió anteriormente, puede incluir, además de una VH y una VL, y opcionalmente una región constante de cadena pesada o fragmento de la misma, una región constante de cadena ligera o fragmento de la misma. En determinados aspectos, la región constante de cadena ligera es una región constante de cadena ligera kappa lambda, por ejemplo, una región constante kappa humana o una región constante lambda humana. En un aspecto específico, la región constante de cadena ligera es una región constante kappa humana.

Esta divulgación proporciona un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo donde la cadena ligera contiene una región constante kappa humana, por ejemplo, la cadena ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 26. En determinados aspectos, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada de YTE de IgG1 humana y una cadena ligera kappa humana, donde el anticuerpo se compone de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26, respectivamente, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo.

Los anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento pueden tener propiedades beneficiosas. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo puede inhibir, suprimir o bloquear la unión de IL-21 a un receptor de IL-21, por ejemplo, expresado en una célula T, una célula B, una célula NK, una célula NKT o una célula dendrítica, o expresado de manera recombinante en una célula no linfoide. Como ejemplo adicional, el anticuerpo o fragmento puede inhibir la unión de IL-21 humana o de macaco cangrejero al receptor de IL-21 humana o de macaco cangrejero pero no inhibe la unión de IL-21 de ratón al receptor de IL-21 de ratón. Tal anticuerpo anti-IL-21 o fragmento del mismo puede inhibir, suprimir o bloquear adicionalmente diversas actividades mediadas por IL-21, es decir, el anticuerpo o fragmento puede ser un antagonista de la actividad de IL-21. En determinados aspectos, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento del mismo proporcionado en el presente documento puede inhibir, suprimir o bloquear la fosforilación mediada por IL-21 en la ruta Jak/STAT, por ejemplo, inhibir, suprimir o bloquear la fosforilación de STAT3, en células que expresan IL-21R, por ejemplo, en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).

En determinados aspectos, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento del mismo proporcionado en el presente documento puede inhibir, suprimir o bloquear la producción de interferón gamma (IFN-y) mediada por IL-21 por células NK. Tal inhibición puede provenir de células NK que se producen de manera natural, por ejemplo, células NK humanas o células NK cultivadas, por ejemplo, células NK-92.

En aspectos particulares, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento del mismo proporcionado en el presente documento puede inhibir, suprimir o bloquear la activación, diferenciación o muerte de células B mediadas por IL-21 durante una respuesta inmunitaria humoral. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento del mismo proporcionado en el presente documento puede inhibir, suprimir o bloquear la diferenciación de células B mediada por iL-21 de células B estimuladas en células plasmáticas. Determinados anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden inhibir, suprimir o bloquear la diferenciación mediada por IL-21 humana y de macaco cangrejero de células B estimuladas en células plasmáticas. En determinados aspectos, las células B pueden ser células B aisladas a las que se añade IL-21 de manera exógena. En otros aspectos, las células B pueden estar en contacto con, o bien de manera natural o bien mediante cocultivo, células T c D4+ activadas que expresan IL-21. En otros aspectos, las células B humanas pueden estar en contacto con, o bien de manera natural o bien mediante cocultivo, células T CD4+ activadas humanas que expresan IL-21.

En determinados aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se proporciona en el presente documento, puede unirse a IL-21 con una afinidad de unión caracterizada por una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 0,1 pM tal como se mide en una plataforma de ensayo de exclusión cinética (KinExA) 3000.

En determinados aspectos, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse específicamente a IL-21, por ejemplo, IL-21 humana o IL-21 de macaco cangrejero, y fragmentos antigénicos de la misma con una constante de disociación o Kd de menos de 10~6 M, o de menos de 10~7 M, o de menos de 10‘8 M, o de menos de 10‘9 M, o de menos de 10'1° M, o de menos de 10‘11 M, de menos de 10‘12 M, de menos de 10'13 M, de menos de 10‘14 M, o de menos de 10‘15 M tal como se mide, por ejemplo, mediante KINEXA® o BIACORE®. En un aspecto, el anticuerpo anti-IL-21 humanizado K44VHa-N56Q puede unirse a IL-21 humana con una Kd de aproximadamente 515 fM (515 x 10‘15 M) y la IL-21 de macaco cangrejero con una Kd de aproximadamente 352 fM (352 x 10~15 M) tal como se mide mediante KINEXA®.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación se une a IL-21 y/o fragmentos antigénicos de la misma con una Koff de menos de 1x10‘3 s_1o menos de 2x10~3 s-1. En otros aspectos, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a IL-21 y fragmentos antigénicos de la misma con una Koff de menos de 10~3 s-1, menos de 5x10~3 s-1, menos de 10‘4 s-1, menos de 5x10‘4 s-1, menos de 10' 5 s-1, menos de 5x10‘5 s-1, menos de 10‘6 s-1, menos de 5X10’6 s-1, menos de 5x10‘7 s-1, menos de 10‘8 s-1, menos de 5x10‘8 s-1, menos de 10‘9 s-1, menos de 5x10‘9 s-1, o menos de 10‘10 s_1 tal como se mide, por ejemplo, mediante KINEXA® o BIACORE®.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación se une a IL-21 y/o fragmentos antigénicos de la misma con una constante de velocidad de asociación o velocidad Kon de al menos 105 M’1 s-1, al menos 5x105 M_1 s-1, al menos 106 M_1 s-1, al menos 5x106 M_1 s-1, al menos 107 M_1 s-1, al menos 5x107 M’1 s-1, o al menos 108 M_1 s-1, o al menos 109 M_1 s_1 tal como se mide, por ejemplo, mediante KINEXA® o BIACORE®.

Tal como se señaló anteriormente, una secuencia de aminoácidos VH y/o VL puede ser, por ejemplo, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% similar a una secuencia establecida en el presente documento, y/o comprenden 1, 2, 3, 4, 5 o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras con respecto a una secuencia expuesta en el presente documento. Un anticuerpo frente a IL-21 que tiene regiones VH y VL que tienen un determinado porcentaje de similitud con una región VH o una región VL, o que tiene una o más sustituciones, por ejemplo, pueden obtenerse sustituciones conservadoras mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican para las regiones VH y/o VL descritas en el presente documento, seguido de someter a prueba el anticuerpo alterado codificado para determinar la unión a IL-21 y, opcionalmente, realizar pruebas para determinar la función retenida usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado bien conocido en la técnica, por ejemplo, citometría de flujo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA), o cinética (por ejemplo, análisis KINEXA® o BIACORE™). Pueden emplearse fácilmente ensayos de unión directa así como formatos de ensayo de unión competitiva. (Véase, por ejemplo, Berzofsky et al., “Antibody-Antigen Interactions”, en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, N.Y. (1992); y métodos descritos en el presente documento). La afinidad medida de una interacción anticuerpo-antígeno particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, concentración de sal, pH, temperatura). Por tanto, las medidas de afinidad y otros parámetros de unión a antígenos (por ejemplo, % o Kd, K^on, K^off) se preparan con disoluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado, tal como se conoce en la técnica y tal como el tampón descrito en el presente documento.

La divulgación proporciona además un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento del mismo tal como se describió anteriormente, donde el anticuerpo se conjuga con un agente heterólogo. En determinados aspectos, el agente puede ser un agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de la respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o un fragmento del mismo, un marcador detectable, un polietilenglicol (PEG), o una combinación de dos o más de dichos agentes. Los anticuerpos anti-IL-21 heteroconjugados se describen con más detalle en otra parte en el presente documento.

En determinados aspectos, la molécula de unión a IL-21 es un polipéptido que no es un anticuerpo. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para identificar y producir polipéptidos que no son anticuerpos que se unen con alta afinidad a una proteína diana. Véase, por ejemplo, Skerra, Curr. Opin. BiotechnoL, 18: 295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15: 14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. BiotechnoL, 17: 653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275: 2668­ 76 (2008), y Skerra, FEBS J., 275: 2677-83 (2008). En determinados aspectos, la tecnología de presentación en fagos puede usarse para identificar/producir un polipéptido de unión a IL-21. En determinados aspectos, el polipéptido comprende un armazón proteico de un tipo seleccionado del grupo que consiste en proteína A, una lipocalina, un dominio de fibronectina, un dominio de repetición de consenso de anquirina y tiorredoxina.

III. Moléculas de unión que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos anti-IL-21 y fragmentos de unión a antígenos de los mismos

En determinados aspectos, esta divulgación proporciona una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo que los diversos anticuerpos anti-IL-21 descritos en el presente documento. El término “epítopo” tal como se usa en el presente documento se refiere a un determinante de proteína diana capaz de unirse a un anticuerpo de la divulgación. Los epítopos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Tales anticuerpos pueden identificarse en función de su capacidad para competir de manera cruzada (por ejemplo, para inhibir competitivamente la unión de, de manera estadísticamente significativa) con anticuerpos tales como 19E3, 9F11, 9H10 u 8B6, en ensayos convencionales de unión o actividad de IL-21. Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos anti-IL-21 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, que compiten por unirse a IL-21 con otro anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación, tales como anticuerpos monoclonales murinos 19E3, 9F11, 9H10 u 8B6, o variantes humanizados tal como se divulga en el presente documento. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de, por ejemplo, 19E3, 9F11, 9H10 u 8B6 demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ese anticuerpo por la unión a IL-21; tal anticuerpo puede, según la teoría no limitante, unirse al mismo epítopo o a uno relacionado (por ejemplo, estructuralmente similar o espacialmente próximo) en IL-21 que el anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo con el que compite. En un aspecto, el anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en IL-21 que, por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos 19E3, 9F11, 9H10 u 8B6.

IV. Actividad de las moléculas de unión a IL-21

En algunos aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede suprimir la transducción de señales mediada por IL-21 en células que expresan IL-21R. Por ejemplo, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede suprimir la fosforilación de STAT3 mediada por IL-21. Además, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la producción de IFNy por las células NK. Además, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede inhibir la diferenciación de células B estimuladas en células plasmáticas.

En algunos aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede suprimir la fosforilación de STAT3 mediada por IL-21 en células que expresan IL-21R (por ejemplo, PBMC) tal como se mide mediante citometría de flujo, con una CI⁵⁰ de menos de aproximadamente 500 pM, de menos de aproximadamente 350 pM, de menos de aproximadamente 250 pM, de menos de aproximadamente 150 pM, de menos de aproximadamente 100 pM, de menos de aproximadamente 75 pM, de menos de aproximadamente 60 pM, de menos de aproximadamente 50 pM, de menos de aproximadamente 40 pM, de menos de aproximadamente 30 pM, de menos de aproximadamente 20 pM, de menos de aproximadamente 15 pM, de menos de aproximadamente 10 pM o de menos de aproximadamente 5 pM. En determinados aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la fosforilación de STAT3 mediada por IL-21 humana en células que expresan IL-21R (por ejemplo, PBMc ) tal como se mide mediante citometría de flujo, con una CI⁵⁰ de aproximadamente 22 pM, aproximadamente 19 pM, aproximadamente 17 pM, aproximadamente 14 pM, aproximadamente 13 pM, aproximadamente 12 pM, aproximadamente 6 pM, aproximadamente 5 pM o aproximadamente 3 pM. En determinados aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo antilL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la fosforilación de STAT3 mediada por lL-21 de macaco cangrejero en células que expresan IL-21R (por ejemplo, PBMC) tal como se mide mediante citometría de flujo, con una Cl⁵⁰ de aproximadamente 52 pM, aproximadamente 51 pM, aproximadamente 46 pM, aproximadamente 19 pM, aproximadamente 16 pM, aproximadamente 10 pM o aproximadamente 6 pM.

En algunos aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la producción de IFNy mediada por IL-21 a partir de células NK tal como se mide mediante el ensayo monoplex de IFNy humano de MSD con una CI⁵⁰ de menos de aproximadamente 100 pM, de menos de aproximadamente 400 pM, de menos de aproximadamente 100 pM, de menos de aproximadamente 75 pM, de menos de aproximadamente 60 pM, de menos de aproximadamente 50 pM, de menos de aproximadamente 40 pM, de menos de aproximadamente 30 pM, de menos de aproximadamente 20 pM, de menos de aproximadamente 15 pM, de menos de aproximadamente 10 pM o de menos de aproximadamente 5 pM. En determinados aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la producción de IFNy mediada por IL-21 humana a partir de la línea celular NK-92 tal como se mide mediante el ensayo monoplex de IFNy humano de MSD con una CI⁵⁰ de aproximadamente 99 pM, aproximadamente 93 pM, aproximadamente 55 pM, aproximadamente 41 pM o aproximadamente 20 pM. En determinados aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la producción de IFNy mediada por IL-21 de macaco cangrejero a partir de la línea celular NK-92 tal como se mide mediante el ensayo monoplex de IFNy humano de MSD con una CI⁵⁰ de aproximadamente 83 pM, aproximadamente 81 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 37 pM o aproximadamente 3 pM.

En algunos aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la diferenciación de células B estimuladas mediada por IL-21, por ejemplo, células B no diferenciadas y/o células de memoria B estimuladas con F(ab')2 anti-CD40 y anti-IgM, en células plasmáticas, por ejemplo, células plasmáticas productoras de IgG, tal como se mide mediante citometría de flujo o ELISA con una CI ⁵⁰ de menos de aproximadamente 150 nM, de menos de aproximadamente 75 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 30 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 1600 pM, de menos de aproximadamente 1400 pM, de menos de aproximadamente 1000 pM, de menos de aproximadamente 800 pM, de menos de aproximadamente 700 pM o de menos de aproximadamente 600 pM. En determinados aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la diferenciación mediada por IL-21 humana de células B estimuladas, por ejemplo, células B no diferenciadas y/o células de memoria B simuladas con F(ab')2 anti-CD40 y anti-IgM, en células plasmáticas, por ejemplo, células plasmáticas productoras de IgG, tal como se mide mediante citometría de flujo o ELISA con una CI⁵⁰ de aproximadamente 115 nM, aproximadamente 47 nM, aproximadamente 1,5 nM, aproximadamente 777 pM, aproximadamente 618 pM o aproximadamente 573 pM. En determinados aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la diferenciación mediada por IL-21 de macaco cangrejero de células B humanas estimuladas, por ejemplo, células B no diferenciadas y/o células de memoria B simuladas con F(ab')2 anti-CD40 y anti-IgM, en células plasmáticas, por ejemplo, células plasmáticas productoras de IgG, tal como se mide mediante citometría de flujo o ELISA con una CI⁵⁰ de aproximadamente 74 nM, aproximadamente 30 nM, aproximadamente 9 nM, aproximadamente 1,3 nM, aproximadamente 1,0 nM, aproximadamente 775 pM o aproximadamente 659 pM. En determinados aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la diferenciación mediada por IL-21 de macaco cangrejero de células B estimuladas en células plasmáticas, pero no la diferenciación de células B mediada por IL-21 humana en células plasmáticas.

En determinados aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede suprimir la diferenciación de células B en células plasmáticas impulsada por células T CD4+ activadas que producen moléculas coestimuladoras tales como CD40L y citocinas trópicas de células B como IL-21. En otros aspectos, una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede inhibir la proliferación impulsada por iL-21 de células T CD4+ humanas no diferenciadas.

V. Preparación de anticuerpos anti-IL-21 y fragmentos de unión a antígeno

Los anticuerpos monoclonales anti-IL-21 pueden prepararse usando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Usando el método del hibridoma, se inmuniza un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado tal como se describió anteriormente para provocar la producción por linfocitos de anticuerpos que se unirán específicamente a un antígeno inmunizante. Los linfocitos también pueden inmunizarse in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aíslan y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada usando, por ejemplo, polietilenglicol, para formar células de hibridoma que luego pueden seleccionarse de linfocitos no fusionados y células de mieloma. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno elegido tal como se determina mediante inmunoprecipitación, inmunotransferencia o mediante un ensayo de unión in vitro (por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA); ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)) pueden propagarse entonces o bien en cultivo in vitro usando métodos convencionales (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) o bien in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales pueden luego purificarse del medio de cultivo o del líquido ascítico tal como se describió anteriormente para los anticuerpos policlonales.

Alternativamente, también pueden elaborarse anticuerpos monoclonales anti-IL-21 usando métodos de ADN recombinante tal como se describe en la patente estadounidense n.° 4.816.567. Los polinucleótidos que codifican para un anticuerpo monoclonal se aíslan de células B maduras o de células de hibridoma, tal como mediante RT-PCR usando cebadores oligonucleotídicos que amplifican específicamente los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y su secuencia se determina usando procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican para las cadenas pesada y ligera se clonan luego en vectores de expresión adecuados, que cuando se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen proteína inmunoglobulina, los anticuerpos monoclonales se generan mediante las células huésped. Además, los anticuerpos monoclonales anti-IL-21 recombinantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de las especies deseadas pueden aislarse de bibliotecas de presentación de fagos que expresan las CDR de la especie deseada tal como se describe (McCafferty et al., 1990, Nature, 348: 552-554.; Clackson et al., 1991, Nature, 352: 624-628; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581-597.).

El/los polinucleótido(s) que codifica(n) para un anticuerpo anti-IL-21 o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede(n) modificarse adicionalmente de varias maneras diferentes usando tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunos aspectos, los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón pueden sustituirse (1) con aquellas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o (2) con un polipéptido distinto de inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunos aspectos, las regiones constantes se truncan o se retiran para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.

En determinados aspectos, el anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos humanos pueden prepararse directamente usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Pueden generarse linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (véase, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1): 86-95; y la patente estadounidense 5.750.373).

Además, el anticuerpo humano anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede seleccionarse de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos, tal como se describe, por ejemplo, en Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14: 309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95: 6157-6162, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381 y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Las técnicas para la generación y uso de bibliotecas de fagos de anticuerpos también se describen en las patentes estadounidenses n.os 5.969.108, 6.172.197, 5.885.793, 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; 6.593.081; 6.300.064; 6.653.068; 6.706.484; y 7.264.963; y Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi: 10.1016/j.jmb.2007.12.018.

Se conocen en la técnica estrategias de maduración de afinidad y estrategias de intercambio de cadenas (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10: 779-783) y pueden emplearse para generar anticuerpos humanos de alta afinidad o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En algunos aspectos, un anticuerpo monoclonal anti-IL-21 puede ser un anticuerpo humanizado. También pueden usarse métodos para modificar por ingeniería genética, humanizar o remodelar la superficie de anticuerpos humanos o no humanos y se conocen bien en la técnica. Un anticuerpo humanizado, con superficie remodelada o modificado por ingeniería genética de manera similar puede tener uno o más residuos de aminoácidos de una fuente que no es humana, por ejemplo, pero no se limita a, ratón, rata, conejo, primate no humano u otro mamífero. Estos residuos de aminoácidos no humanos se reemplazan por residuos que a menudo se denominan residuos “importados”, que normalmente se toman de un dominio variable, constante u otro “importado” de una secuencia humana conocida. Tales secuencias importadas pueden usarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, potenciar o modificar la unión, afinidad, constante de asociación, constante de disociación, avidez, especificidad, semivida o cualquier otra característica adecuada, tal como se conoce en la técnica. En general, los residuos de CDR están directa y más sustancialmente implicados en influir en la unión de IL-21. Por consiguiente, parte o todas las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen mientras que las secuencias no humanas de las regiones variable y constante pueden reemplazarse con aminoácidos humanos u otros.

Los anticuerpos también pueden ser opcionalmente anticuerpos humanizados, anticuerpos con superficie remodelada, anticuerpos modificados por ingeniería genética o anticuerpos humanos modificados por ingeniería genética con retención de alta afinidad por el antígeno IL-21 y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, pueden prepararse opcionalmente anticuerpos anti-IL-21 humanizados (o humanos) o modificados por ingeniería genética y anticuerpos con superficie remodelada mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos conceptuales humanizados y modificados por ingeniería genética usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales, modificadas por ingeniería genética y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite analizar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno, tal como IL-21. De esta manera, los residuos de región de entramado (FW) pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias de importación y consenso de modo que se logre la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el/los antígeno(s) diana.

La humanización, la remodelación de la superficie o la modificación por ingeniería genética de anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente divulgación pueden realizarse usando cualquier método conocido, tal como, pero sin limitarse a, los descritos en, Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993), las patentes estadounidenses n.os 5.639.641, 5.723.323; 5.976.862; 5.824.514; 5.817.483; 5.814.476; 5.763.192; 5.723.323; 5.766.886; 5.714.352; 6.204.023; 6.180.370; 5.693.762; 5.530.101; 5.585.089; 5.225.539; 4.816.567, 7.557.189; 7.538.195; y 7.342.110; solicitudes internacionales n.os PCT/US98/16280; PCT/US96/18978; PCT/US91/09630; PCT/US91/05939; PCT/US94/01234; PCT/GB89/01334; PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; publicaciones de solicitud de patente internacional n.os WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; y publicación de patente europea n.° EP 229246.

Los anticuerpos humanizados anti-IL-21 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos también pueden prepararse en ratones transgénicos que contienen loci de inmunoglobulina humana que son capaces, tras la inmunización, de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Este enfoque se describe en las patentes estadounidenses n.os 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016.

En determinados aspectos, se proporciona un fragmento de anticuerpo anti-IL-21. Se conocen diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtienen mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). En determinados aspectos, los fragmentos de anticuerpos anti-IL-21 se producen de manera recombinante. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden expresarse y secretarse de E. coli u otras células huésped, permitiendo así la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Tales fragmentos de anticuerpo anti-IL-21 también pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos comentadas anteriormente. Los fragmentos de anticuerpo anti-IL-21 también pueden ser anticuerpos lineales tal como se describe en la patente estadounidense n.° 5.641.870. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos resultarán evidentes para el profesional.

Según la presente divulgación, las técnicas pueden adaptarse para la producción de anticuerpos de cadena sencilla específicos para IL-21 (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.946.778). Además, los métodos pueden adaptarse para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (véase, por ejemplo, Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)) para permitir la identificación rápida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por IL-21, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos pueden producirse mediante técnicas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a: (a) un fragmento F(ab')2 producido por digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; (b) un fragmento Fab generado reduciendo los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2, (c) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y (d) fragmentos Fv.

En determinados aspectos, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede modificarse para aumentar su semivida en suero. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo por mutación de la región apropiada en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo o mediante la incorporación del epítopo en una etiqueta de péptido que luego se fusiona con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo o bien en cualquier extremo o bien en el medio (por ejemplo, mediante síntesis de ADN o péptidos), o mediante mutación YTE. Se conocen en la técnica otros métodos para aumentar la semivida en suero de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, la conjugación con una molécula heteróloga tal como PEG.

Los anticuerpos anti-IL-21 heteroconjugados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos también se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto, por ejemplo, que tales anticuerpos dirijan las células inmunitarias a células no deseadas (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.676.980). Se contempla que puedan prepararse los anticuerpos anti-IL-21 heteroconjugados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

Los anticuerpos anti-IL-21 modificados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tal como se proporcionan en el presente documento pueden comprender cualquier tipo de región variable que proporcione la asociación del anticuerpo o polipéptido con IL-21. A este respecto, la región variable puede comprender o derivar de cualquier tipo de mamífero que pueda inducirse para montar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antígeno deseado. Como tal, la región variable de un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser, por ejemplo, de primate no humano, murino o humano (por ejemplo, macacos cangrejeros, macacos, etc.) o de origen lupino. En algunos aspectos, tanto las regiones variables como constantes de los anticuerpos anti-IL-21 modificados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son humanas. En otros aspectos, las regiones variables de anticuerpos compatibles (normalmente derivados de una fuente no humana) pueden modificarse por ingeniería genética o personalizarse específicamente para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. A este respecto, las regiones variables útiles en la presente divulgación pueden humanizarse o alterarse de otro modo mediante la inclusión de secuencias de aminoácidos importadas.

En determinados aspectos, los dominios variables tanto en las cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo se alteran mediante al menos reemplazo parcial de una o más CDR y/o mediante reemplazo parcial de la región de entramado y cambio de secuencia. Aunque las CDR pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que derivan las regiones de entramado, se prevé que las CDR derivarán de un anticuerpo de clase diferente y, en determinados aspectos, de un anticuerpo de una especie diferente. No es necesario reemplazar todas las CDR con las CDR completas de la región variable donante para transferir la capacidad de unión a antígeno de un dominio variable a otro. Más bien, solo es necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión a antígeno. Dadas las explicaciones expuestas en las patentes estadounidenses n.os 5.585.089, 5.693.761 y 5.693.762, estará dentro de la competencia de los expertos en la técnica, o bien llevando a cabo una experimentación de rutina o bien mediante pruebas de ensayo y error para obtener un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.

A pesar de las alteraciones de la región variable, los expertos en la técnica apreciarán que los anticuerpos anti-IL-21 modificados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de esta divulgación comprenderán anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) en los que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante se ha delecionado o alterado de otra modo para proporcionar las características bioquímicas deseadas, tales como una localización del tumor aumentada o una semivida en suero reducida cuando se compara con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante nativa o inalterada. En algunos aspectos, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones de la región constante compatibles con esta divulgación comprenden adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Es decir, los anticuerpos modificados divulgados en el presente documento pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o en el dominio constante de cadena ligera (CL). En algunos aspectos, se contemplan regiones constantes modificadas en las que uno o más dominios están parcial o totalmente delecionados. En algunos aspectos, los anticuerpos modificados comprenderán constructos o variantes de dominio delecionado en los que se ha delecionado todo el dominio CH2 (constructos ACH2). En algunos aspectos, el dominio de región constante omitido puede reemplazarse por un espaciador de aminoácidos corto (por ejemplo, 10 residuos) que proporciona algo de la flexibilidad molecular impartida normalmente por la región constante ausente.

Además de su configuración, se sabe en la técnica que la región constante media varias funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente CI del complemento a los anticuerpos activa el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar involucrada en la hipersensibilidad autoinmunitaria. Además, los anticuerpos se unen a las células a través de la región Fc, con un sitio del receptor Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un receptor Fc (FcR) en una célula. Existen varios receptores Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluyendo IgG (receptores gamma), IgE (receptores eta), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores Fc en la superficie celular desencadena varias respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen la absorción y destrucción de partículas recubiertas de anticuerpos, el aclaramiento de complejos inmunitarios, la lisis de células diana recubiertas de anticuerpos por células citolíticas (denominada citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas.

En determinados aspectos, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo proporciona funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan el perfil biológico del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo administrado. Por ejemplo, la deleción o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión al receptor Fc del anticuerpo modificado circulante. En otros casos, puede ser que las modificaciones de la región constante, según esta divulgación, moderen la unión del complemento y, por tanto, reduzcan la semivida en suero y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Aún pueden usarse otras modificaciones de la región constante para eliminar uniones disulfuro o restos de oligosacáridos que permiten una localización mejorada debido a una mayor especificidad antigénica o flexibilidad del anticuerpo. De manera similar, las modificaciones a la región constante según esta divulgación pueden realizarse fácilmente usando técnicas de modificación por ingeniería bioquímica o molecular bien conocidas dentro del alcance del experto en la técnica.

En determinados aspectos, una molécula de unión a IL-21 que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no tiene una o más funciones efectoras. Por ejemplo, en algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no tiene actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En determinados aspectos, el anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo no se une a un receptor Fc y/o factores del complemento. En determinados aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no tiene función efectora.

En determinados aspectos, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede modificarse por ingeniería genética para fusionar el dominio CH3 directamente a la región bisagra de los respectivos anticuerpos modificados o fragmentos de los mismos. En otros constructos, puede insertarse un espaciador de péptidos entre la región bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, pueden expresarse constructos compatibles en los que se ha delecionado el dominio CH2 y el dominio CH3 restante (modificado o no modificado) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Puede añadirse un espaciador de este tipo, por ejemplo, para garantizar que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región bisagra permanezca flexible. Los espaciadores de aminoácidos pueden, en algunos casos, resultar inmunogénicos y provocar una respuesta inmunitaria no deseada contra el constructo. Por consiguiente, en determinados aspectos, cualquier espaciador añadido al constructo puede ser relativamente no inmunogénico, o incluso omitirse por completo, para mantener las cualidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos modificados.

Además de la deleción de los dominios de la región constante completos, los anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento pueden modificarse mediante la deleción o sustitución parcial de unos pocos o incluso un solo aminoácido en una región constante. Por ejemplo, la mutación de un único aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión de Fc y por tanto aumentar la localización del tumor. De manera similar, uno o más dominios de región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, la unión de C1Q del complemento) pueden delecionarse total o parcialmente. Tales deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar características seleccionadas del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, semivida en suero) mientras se dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante en cuestión. Además, las regiones constantes de los anticuerpos anti-IL-21 divulgados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden modificarse mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que mejoran el perfil del constructo resultante. A este respecto, es posible interrumpir la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo, unión de Fc) mientras se mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado o fragmento de unión a antígeno del mismo. Determinados aspectos pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar características deseables tales como disminuir o aumentar la función efectora o proporcionar más unión de citotoxina o hidrato de carbono. En tales aspectos, puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de región constante seleccionados.

La presente divulgación abarca además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos anti-IL-21 murinos, quiméricos, humanizados o humanos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, expuestos en el presente documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservadoras, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos con aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro dentro de la misma clase general tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico o un aminoácido neutro con otro aminoácido neutro. Lo que se pretende con una sustitución conservadora de aminoácidos se conoce bien en la técnica.

Un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede modificarse adicionalmente para contener restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Estos restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la semivida biológica o la absorción de la proteína. Los restos también pueden reducir o eliminar cualquier efecto secundario deseable de las proteínas y similares. Puede encontrarse una descripción general de esos restos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

VI. Polinucleótidos que codifican para moléculas de unión a IL-21 y expresión de las mismas

Esta divulgación proporciona polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido que se une específicamente a IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, la divulgación proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo antiIL-21 o codifica para un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de este tipo. Los polinucleótidos de la divulgación pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN. El ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético; y puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido).

En determinados aspectos, puede aislarse un polinucleótido. En determinados aspectos, un polinucleótido puede ser sustancialmente puro. En determinados aspectos, un polinucleótido puede ser ADNc o derivar de ADNc. En determinados aspectos, puede producirse un polinucleótido de manera recombinante. En determinados aspectos, un polinucleótido puede comprender la secuencia codificante del polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que ayuda, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido de una célula huésped (por ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula). El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y la célula huésped puede escindir la secuencia líder para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar para una proproteína de unión a IL-21 que es la proteína madura más residuos de aminoácidos 5' adicionales.

En determinados aspectos, esta divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una VL de anticuerpo, en la que la VL comprende secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 idénticas o idénticas excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más de las VL-CDR a: SEQ ID NO: 12, 13 y 14, SEQ ID NO: 34, 35 y 36, SEQ ID NO: 48, 49 y 50, o SEQ ID NO: 58, 59 y 60, respectivamente.

La divulgación proporciona además un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una VH de anticuerpo, en la que la VH comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 idénticas o idénticas excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más de las VH-CDR a: SEQ ID NO: 7, 8 y 9, SEQ ID NO: 29, 30 y 31, SEQ ID NO: 43, 44 y 45, o SEQ ID NO: 53, 54 y 55, respectivamente.

La divulgación proporciona además un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una VL de anticuerpo, en la que la VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 57.

Además, la divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una VH de anticuerpo, en la que la VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 52.

En determinados aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una VH o VL codificada por un polinucleótido tal como se describió anteriormente, puede unirse específicamente a IL-21, por ejemplo, IL-21 humana o de macaco cangrejero. En determinados casos, tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse específicamente al mismo epítopo que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH y VL de 19E3, 9F11, 8B6 o 9H10. En determinados aspectos, la divulgación proporciona un polinucleótido o una combinación de polinucleótidos que codifican para una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a IL-21.

Se proporciona además un vector que comprende un polinucleótido tal como se describió anteriormente. Los vectores adecuados se describen en otra parte en el presente documento y los conocen los expertos en la técnica.

En determinados aspectos, la divulgación proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un polinucleótido o vector de la reivindicación tal como se describió anteriormente, que opcionalmente comprende además uno o más vehículos, diluyentes, excipientes u otros aditivos.

En determinados aspectos, la divulgación proporciona una composición de polinucleótidos que comprende: un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VH y un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VL. Según este aspecto, la VL y VH juntas pueden comprender las secuencias de aminoácido de VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 idénticas o idénticas excepto por ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones de aminoácido en una o más CDR a: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 7, 8 y 9, SEQ ID NO: 34, 35, 36, 29, 30 y 31, SEQ ID NO: 48, 49, 50, 43, 44 y 45, o SEQ ID NO: 58, 59, 60, 53, 54 y 55, respectivamente.

En aspectos adicionales, la divulgación proporciona una composición de polinucleótidos que comprende: un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VH y un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VL, en el que la VL y VH comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idénticas a las secuencias de aminoácidos de referencia: SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 y 40, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 47, o SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 57, respectivamente.

En determinados aspectos, la VH y VL se codifican mediante secuencias de ácido nucleico al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% idénticas a las secuencias de ácido nucleico de referencia SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 46, o SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 56, respectivamente.

En una composición de polinucleótidos tal como se describió anteriormente, el polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VH y el polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para una VL pueden residir en un solo vector, o pueden estar en vectores separados. Por consiguiente, la divulgación proporciona uno o más vectores que comprenden la composición de polinucleótidos descrita anteriormente.

En algunos casos, una composición de polinucleótidos que codifica para una VH y VL tal como se describió anteriormente puede codificar para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que puede unirse específicamente a IL-21, por ejemplo, IL-21 humana o de macaco cangrejero. En algunos aspectos, la composición de polinucleótidos codifica para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que puede unirse específicamente al mismo epítopo que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la VH y VL de 19E3, 9F11, 8B6 o 9H10.

Esta divulgación proporciona además una célula huésped que comprende un polinucleótido, composición de polinucleótidos o vector tal como se proporcionó anteriormente, donde la célula huésped puede, en algunos casos, expresar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-21. Una célula huésped de este tipo puede usarse en un método para elaborar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se proporciona en el presente documento, donde el método incluye (a) cultivar la célula huésped y (b) aislar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo expresado a partir de la célula huésped.

En determinados aspectos, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante del polipéptido maduro de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo fusionado en el mismo marco de lectura a una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexa-histidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano, o la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada de la proteína hemaglutinina de la gripe cuando se usa un huésped mamífero (por ejemplo, células COS-7).

También se proporcionan variantes de polinucleótidos. Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes o ambas. En algunos aspectos, las variantes de polinucleótidos contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunos aspectos, las variantes de polinucleótidos se producen mediante sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Las variantes de polinucleótidos pueden producirse por diversas razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un huésped en particular (cambiar codones en el ARNm humano a los preferidos por un huésped bacteriano tal como E. coli). También se proporcionan vectores y células que comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento.

En algunos aspectos, una secuencia de ADN que codifica para una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede construirse mediante síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótidos. Tales oligonucleótidos pueden diseñarse basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando aquellos codones que se favorecen en la célula huésped en la que se producirá el polipéptido recombinante de interés. Pueden aplicarse métodos convencionales para sintetizar una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica para un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, puede usarse una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retrotraducido. Además, puede sintetizarse un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican para porciones del polipéptido deseado pueden sintetizarse y luego ligarse. Los oligonucleótidos individuales contienen normalmente proyecciones 5' o 3' para el ensamblaje complementario.

Una vez ensambladas (mediante síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro método), las secuencias de polinucleótidos que codifican para un polipéptido aislado particular de interés pueden insertarse en un vector de expresión y unirse operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión de la proteína en un huésped deseado. El ensamblaje adecuado puede confirmarse, por ejemplo, mediante secuenciación de nucleótidos, mapeo de restricción y/o expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Con el fin de obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen puede unirse o asociarse operativamente con secuencias de control de expresión transcripcional y traduccional que son funcionales en el huésped de expresión elegido.

En determinados aspectos, los vectores de expresión recombinantes se usan para amplificar y expresar ADN que codifica para anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Los vectores de expresión recombinantes son constructos de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican para una cadena polipeptídica de un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, unidos operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados derivados de genes de mamíferos, microbianos, virales o de insectos. Una unidad transcripcional generalmente comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores transcripcionales, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, tal como se describe en detalle a continuación. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia de operador para controlar la transcripción. Puede incorporarse adicionalmente la capacidad de replicarse en un huésped, normalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes. Las regiones de ADN están unidas operativamente cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN para un péptido señal (líder secretor) se une operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está situado para permitir la traducción. Los elementos estructurales previstos para su uso en sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. Alternativamente, cuando una proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, la proteína puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Opcionalmente, este residuo puede escindirse posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

La elección de la secuencia de control de la expresión y del vector de expresión dependerá de la elección del huésped. Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de vector/huésped de expresión. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E. coli, incluyendo pCR 1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de una variedad de huéspedes más amplia, tales como M13 y fagos de ADN monocatenario filamentoso.

Las células huésped adecuadas para la expresión de una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo incluyen procariotas, levaduras, insectos o células eucariotas superiores bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero tal como se describe a continuación. También podrían emplearse sistemas de traducción sin células. Puede encontrarse información adicional sobre los métodos de producción de proteínas, incluyendo la producción de anticuerpos, por ejemplo, en la publicación de patente estadounidense n.° 2008/0187954, patentes estadounidenses n.os 6.413.746 y 6.660.501 y publicación de patente internacional n.° WO 04009823.

También pueden emplearse ventajosamente diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos o insectos para expresar moléculas de unión a IL-21 recombinantes, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. La expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos puede realizarse porque tales proteínas generalmente se pliegan correctamente, se modifican de manera apropiada y son completamente funcionales. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos adecuadas incluyen HEK-293 y HEK-293T, las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Celda 23: 175, 1981) y otras líneas celulares que incluyen, por ejemplo, células L, C127, 3T3, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados unidos al gen que va a expresarse y otras secuencias no transcritas flanqueantes 5' o 3', y secuencias no traducidas 5' o 3', tales como sitios de unión a ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme y secuencias de terminación de la transcripción. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos están revisados por Luckow y Summers, BioTechnology 6:47 (1988).

Pueden purificarse moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos producidos por un huésped transformado según cualquier método adecuado. Tales métodos convencionales incluyen la cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de cubierta de la gripe y glutatión-S-transferasa pueden unirse a la proteína para permitir una fácil purificación mediante el paso sobre una columna de afinidad apropiada. Las proteínas aisladas también pueden caracterizarse físicamente usando técnicas tales como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.

Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan proteína recombinante en medios de cultivo pueden concentrarse en primer lugar usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Finalmente, una o más etapas de cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios hidrófobos de RP-HPLC, por ejemplo, puede emplearse gel de sílice que tiene metilo colgante u otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente una molécula de unión a IL-21. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, también pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante homogénea.

Puede aislarse una proteína de unión a IL-21 recombinante, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo producido en cultivo bacteriano, por ejemplo, mediante extracción inicial de sedimentos celulares, seguido por una o más etapas de concentración, de desalado, de cromatografía de intercambio iónico acuoso o de exclusión molecular. Puede emplearse cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o uso de agentes de lisis celular.

Los métodos conocidos en la técnica para purificar anticuerpos y otras proteínas también incluyen, por ejemplo, los descritos en las publicaciones de patente estadounidense n.os 2008/0312425, 2008/0177048 y 2009/0187005.

VI. Métodos de tratamiento que usan anticuerpos terapéuticos anti-IL-21

Se proporcionan métodos para el uso de moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21, que incluyen fragmentos de unión a antígeno, variantes y derivados de los mismos, para tratar pacientes que tienen una enfermedad asociada con la expresión de IL-21 o células secretoras de IL-21. Por “células secretoras de IL-21” se entiende células que expresan IL-21, por ejemplo, células T cooperadoras activadas. Los métodos para detectar la expresión de IL-21 se conocen bien en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, técnicas de PCR, inmunohistoquímica, citometría de flujo, inmunotransferencia de tipo Western, ELISA y similares.

La siguiente descripción se refiere a métodos de diagnóstico y métodos de tratamiento de diversas enfermedades y trastornos con una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado que conserva las propiedades deseadas de los anticuerpos anti-IL-21 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, capaz de unirse específicamente a IL-21 y antagonizar la actividad de IL-21. En algunos aspectos, las moléculas de unión a IL-21 son anticuerpos murinos, humanos o humanizados. En algunos aspectos, el anticuerpo frente a IL-21 es idéntico a uno de los anticuerpos monoclonales murinos 19E3, 9F11, 9H10 u 8B6. En algunos aspectos, el anticuerpo frente a IL-21 se deriva de uno de los anticuerpos monoclonales murinos 19E3, 9F11, 9H10 u 8B6. En determinados aspectos, el anticuerpo derivado es un anticuerpo humanizado. En otros aspectos, la molécula de unión a IL-21 comprende una región constante de IgG1 humana mutada en YTE. En aspectos específicos, la molécula de unión a IL-21 es K44VHa-N56Q.

En un aspecto, el tratamiento incluye la aplicación o administración de moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo tal como se proporciona en el presente documento a un sujeto o paciente, o la aplicación o administración de la molécula de unión a IL-21 a un tejido aislado o línea celular de un sujeto o paciente, donde el sujeto o paciente tiene una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición a una enfermedad. En otro aspecto, el tratamiento también puede incluir la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo tal como se proporciona en el presente documento a un sujeto o paciente, o la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a IL-21 a un tejido aislado o línea celular de un sujeto o paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición a una enfermedad.

Las moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos proporcionados en el presente documento son útiles para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios. Tales enfermedades o trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios pueden ser una enfermedad impulsada por células B o una enfermedad impulsada por células T. En un aspecto, las moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos se proporcionan para su uso en el tratamiento o profilaxis de enfermedades o trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios. Los ejemplos de enfermedades o trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios incluyen, pero no se limitan a, vasculitis, por ejemplo, vasculitis por anticuerpos frente al citoplasma de los neutrófilos (ANCA), vasculitis asociada a ANCA (AAV) o vasculitis de arteritis de células gigantes (GCA), síndrome de Sjogren, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), pénfigo vulgar, nefritis lúpica, psoriasis, tiroiditis, diabetes tipo I, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, miastenia grave, neuromielitis óptica (NMO), enfermedad relacionada con IgG4, esclerosis sistémica, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), espondilitis anquilosante, dermatitis atópica, uveítis y enfermedad de injerto contra huésped (EICH). En un aspecto, las moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos se proporcionan para su uso en el tratamiento o profilaxis de enfermedades o neoplasias provocadas por células B. Un ejemplo de una neoplasia maligna impulsada por células B puede incluir linfoma folicular (FL), linfoma difuso de células B grandes (LDCBG), linfoma de Hodgkin (LH), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, macroglobulinemia de Waldenstrom y mieloma (MM). En un aspecto, las moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos se proporcionan para su uso en el tratamiento o profilaxis de enfermedades o neoplasias provocadas por células T. Un ejemplo de una neoplasia maligna impulsada por células T puede incluir el linfoma angioinmunoblástico de células T que es una neoplasia derivada de células T cooperadoras foliculares (Tfh), linfoma anaplásico de células grandes, leucemia de células T adultas, linfoma cutáneo de células T y síndrome de Sezary.

Según los métodos de la presente divulgación, al menos una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo tal como se define en otra parte del presente documento, se usa para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto a una respuesta autoinmunitaria. Por “respuesta terapéutica positiva” con respecto al tratamiento autoinmunitario se entiende cualquier mejora en los estados patológicos asociados con la actividad de estas moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos, y/o una mejora de los síntomas asociados con la enfermedad. Así, por ejemplo, una mejora de la enfermedad puede caracterizarse como una respuesta completa. Por “respuesta completa” se entiende la ausencia de una enfermedad clínicamente detectable con normalización de los resultados de las pruebas anteriores. En algunos casos, esta respuesta puede persistir, por ejemplo, durante al menos un mes después del tratamiento según los métodos de la divulgación. Alternativamente, una mejora de la enfermedad puede clasificarse como una respuesta parcial.

La respuesta clínica puede evaluarse mediante técnicas de detección, tales como obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM), obtención de imágenes por rayos x, tomografía computarizada (TC), citometría de flujo o análisis de clasificador de células activado por fluorescencia (FACS), histología, patología macroscópica y química de la sangre, incluyendo pero sin limitarse a cambios detectables mediante ELISA, ELISPOT, RIA, cromatografía y similares. Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto sometido a terapia con la molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, puede experimentar el efecto beneficioso de una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad.

También se proporciona el uso de moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos, para la monitorización diagnóstica de los niveles de proteínas (por ejemplo, niveles de IL-21) en sangre o tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Por ejemplo, la detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.

VII. Composiciones farmacéuticas y métodos de administración

Los métodos de preparación y administración de moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos proporcionados en el presente documento a un sujeto que los necesita se conocen bien por los expertos en la técnica o los determinan fácilmente. La vía de administración de la molécula de unión a IL-21, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye, por ejemplo, administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Si bien todas estas formas de administración se contemplan claramente dentro del alcance de la divulgación, otro ejemplo de una forma de administración sería una disolución para inyección, en particular para inyección o goteo intravenoso o intraarterial. Normalmente, una composición farmacéutica adecuada puede comprender un tampón (por ejemplo, tampón de acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (por ejemplo, albúmina humana), etc. En otros métodos compatibles con las enseñanzas en el presente documento, las moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos tal como se proporcionan en el presente documento pueden administrarse directamente al sitio de la población celular adversa aumentando así la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico. En un aspecto, la administración es directamente a las vías respiratorias, por ejemplo, mediante inhalación o administración intranasal.

Tal como se comenta en el presente documento, las moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos proporcionados en el presente documento pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de enfermedades mediadas por IL-21 tales como enfermedades o trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios. A este respecto, se apreciará que las moléculas de unión divulgadas pueden formularse para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. Las composiciones farmacéuticas según la presente divulgación pueden comprender un portador estéril, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina fisiológica, tampones no tóxicos, conservantes y similares. Con los propósitos de la presente solicitud, una cantidad farmacéuticamente eficaz de una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, conjugado o no conjugado, significa una cantidad suficiente para lograr una unión eficaz a una diana y lograr un beneficio, por ejemplo, para mejorar los síntomas de una enfermedad o estado o para detectar una sustancia o una célula. Las formulaciones adecuadas para su uso en los métodos terapéuticos divulgados en el presente documento se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16a ed. (1980).

Determinadas composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden administrarse por vía oral en una forma de dosificación aceptable que incluye, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, suspensiones o disoluciones acuosas. Determinadas composiciones farmacéuticas también pueden administrarse mediante aerosol nasal o inhalación. Tales composiciones pueden prepararse como disoluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.

La cantidad de una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento, variante o derivado del mismo, que puede combinarse con materiales portadores para producir una única forma de dosificación, variará dependiendo del sujeto tratado y del modo particular de administración. La composición puede administrarse como una dosis única, múltiples dosis o durante un periodo de tiempo establecido en una infusión. Los regímenes de dosificación también pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica).

Según el alcance de la presente divulgación, los anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse a un ser humano u otro animal según los métodos de tratamiento mencionados anteriormente en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Los anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos proporcionados en el presente documento pueden administrarse a tal humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la divulgación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional según técnicas conocidas. La forma y el carácter del portador o diluyente farmacéuticamente aceptable pueden venir dictados por la cantidad de principio activo con el que va a combinarse, la vía de administración y otras variables bien conocidas. También puede usarse un cóctel que comprende una o más especies de moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos, de la divulgación.

Por “dosis o cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” se entiende una cantidad de una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, que cuando se administra produce una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con una enfermedad o estado que va a tratarse.

Las dosis terapéuticamente eficaces de las composiciones de la presente divulgación, para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-21, tales como enfermedades o trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios, varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el paciente es un humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos, incluyendo mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de tratamiento pueden titularse usando métodos de rutina conocidos por los expertos en la técnica para optimizar la seguridad y la eficacia.

La cantidad de al menos una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión, variante o derivado del mismo que va a administrarse se determina fácilmente por un experto en la técnica sin experimentación indebida dada esta divulgación. Los factores que influyen en el modo de administración y la cantidad respectiva de al menos una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad, los antecedentes de la enfermedad y la edad, altura, peso, salud y condición física del individuo que se somete a la terapia. De manera similar, la cantidad de una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, que va a administrarse dependerá del modo de administración y de si el sujeto se someterá a una dosis única o dosis múltiples de este agente.

Esta divulgación también proporciona el uso de una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, inmunitario o autoinmunitario, por ejemplo, vasculitis, por ejemplo, vasculitis por ANCA o GCA, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico y/o nefritis lúpica, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, miastenia grave o EICH.

Esta divulgación también proporciona el uso de una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio, inmunitario o autoinmunitario, por ejemplo, vasculitis, por ejemplo, vasculitis por ANCA o GCA, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico y/o nefritis lúpica, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, miastenia grave o EICH.

VIII. Diagnóstico

Esta divulgación proporciona además un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de enfermedades mediadas por IL-21 tales como determinadas enfermedades o trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios, que implica medir el nivel de expresión de la proteína IL-21 en tejido o líquido corporal de un individuo y comparar el nivel de expresión medido con un nivel de expresión de IL-21 convencional en tejido o líquido corporal normal, por lo que un aumento del nivel de expresión en comparación con el nivel convencional es indicativo de un trastorno tratable por una molécula de unión a iL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se proporciona en el presente documento.

Los anticuerpos anti-IL-21 y fragmentos de unión a antígeno, variantes y derivados de los mismos proporcionados en el presente documento pueden usarse para analizar los niveles de proteína IL-21 en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, véase Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101: 916-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105: 3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión de la proteína IL-21 incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación o inmunotransferencia de tipo Western.

Por “someter a ensayo el nivel de expresión del polipéptido IL-21” se entiende medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel del polipéptido IL-21 en una primera muestra biológica o bien directamente (por ejemplo, determinando o estimando el nivel absoluto de proteína) o bien relativamente (por ejemplo, comparándolo con el nivel de polipéptido asociado a la enfermedad en una segunda muestra biológica). El nivel de expresión del polipéptido IL-21 en la primera muestra biológica puede medirse o estimarse y compararse con un nivel de polipéptido IL-21 convencional, tomándose el nivel convencional de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno o se determina promediando niveles de una población de individuos que no tienen el trastorno. Tal como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce el nivel de polipéptido IL-21 “convencional”, puede usarse repetidamente como un nivel convencional para la comparación.

Por “muestra biológica” se entiende cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, línea celular, cultivo de tejidos u otra fuente de células que potencialmente expresan IL-21. Los métodos para obtener biopsias de tejidos y fluidos corporales de mamíferos se conocen bien en la técnica.

IX. Kits que comprenden moléculas de unión a IL-21

Esta divulgación proporciona además kits que comprenden una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento y que puede usarse para realizar los métodos descritos en el presente documento. En determinados aspectos, un kit comprende al menos un anticuerpo anti-IL-21 purificado o fragmento de unión a antígeno del mismo en uno o más recipientes. En algunos aspectos, los kits contienen todos los componentes necesarios y/o suficientes para realizar un ensayo de detección, incluyendo todos los controles, las instrucciones para realizar los ensayos y cualquier software necesario para el análisis y la presentación de resultados. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que las moléculas de unión a IL-21 descritas, por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden incorporarse fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos que se conocen bien en la técnica.

X. Inmunoensayos

Las moléculas de unión a IL-21 proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de las moléculas proporcionadas en el presente documento pueden someterse a ensayo para determinar la unión inmunoespecífica mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden usarse incluyen pero no se limitan a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como inmunotransferencias de tipo Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), ELISPOT, inmunoensayos en “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de difusión de precipitina en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar solo algunos. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) vol. 1).

Las moléculas de unión a IL-21, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-21 o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos proporcionados en el presente documento pueden emplearse histológicamente, como en inmunofluorescencia, microscopía inmunoelectrónica o ensayos no inmunológicos, para la detección in situ de IL-21 o variantes conservadas o fragmentos de péptidos del mismo. Puede lograrse detección in situ retirando una muestra histológica de un paciente y aplicando a la misma una molécula de unión a IL-21 marcada, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o derivado del mismo, por ejemplo, aplicado superponiendo la molécula de unión a IL-21 marcada (por ejemplo, y anticuerpo o fragmento) en una muestra biológica. Mediante el uso de tal procedimiento, es posible determinar no solo la presencia de IL-21, o variantes conservadas o fragmentos de péptidos, sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente divulgación, los expertos en la técnica percibirán fácilmente que puede modificarse cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) para lograr tal detección in situ.

La actividad de unión de un lote dado de una molécula de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede determinarse según métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica podrán determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación de rutina.

Los métodos y reactivos adecuados para la determinación de las características de unión de una molécula de unión a IL-21 aislada, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o fragmento de unión a antígeno, variante o un derivado alterado/mutante del mismo, se conocen en la técnica y/o están disponibles comercialmente. Los equipos y software diseñados para tales análisis cinéticos están disponibles comercialmente (por ejemplo, BIAcore®, software BIAevaluation®, GE Healthcare; Software KINEXA®, Sapidyne Instruments).

La práctica de la presente divulgación empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D.N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. patente estadounidense n.° 4.683.195; Hames y Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, vols. 154 y 155; Mayer y Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londen); Weir y Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1986); y en Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

Los principios generales de la modificación por ingeniería genética de anticuerpos se establecen en Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2a ed.; Oxford Univ. Press). Los principios generales de la modificación por ingeniería genética de proteínas se establecen en Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press en Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra). Los principios generales de la unión de anticuerpos-hapteno y anticuerpos se establecen en: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2a ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); y Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman y Hall, Nueva York, N.Y.). Además, los métodos convencionales en inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente se siguen generalmente como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8a ed; Appleton y Lange, Norwalk, Conn.) y Mishell y Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

Los trabajos de referencia convencionales que establecen los principios generales de inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) “Monoclonal Antibody Technology” en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Ámsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4a ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6a ed.; Londres: Mospor); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5a ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann y Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003)); Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach y Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

Ejemplos

Los aspectos de la presente divulgación pueden definirse adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, que describen en detalle la preparación de determinados anticuerpos de la presente divulgación y métodos para usar anticuerpos de la presente divulgación. Será evidente para los expertos en la técnica que pueden practicarse muchas modificaciones, tanto de materiales como de métodos, sin apartarse del alcance de la presente divulgación.

Ejemplo 1. Producción y humanización de anticuerpos monoclonales murinos anti-IL-21

Inmunización de ratones y generación de hibridoma anti-IL-21

Ratones Balb/c hembra de seis semanas de edad recibieron 8 rondas de inyecciones intraperitoneales (IP) y metatarsianas de IL-21 humana recombinante purificada alternando con proteína IL-21 de macaco cangrejero conjugada con BSA (Imject Maleimide-Activated BSA Kit, Pierce). Brevemente, comenzando el día 1, los ratones se inmunizaron con 10 |ig por vía intraperitoneal y 2,5 |ig por vía metatarsiana de inmunógeno emulsionado en Imject Alum (Thermo Scientific) según las instrucciones del fabricante. La inmunización duró 28 días a intervalos de 4 días. Los sangrados de prueba se recogieron los días 15 y 28 mediante sangrados retroorbitales en tubos de separación de suero. Los sueros se analizaron mediante ELISA para determinar la unión directa a IL-21 y la competencia con IL-21R. Basándose en los títulos neutralizantes en el ELISA de competición, se seleccionaron ratones para recibir un refuerzo previo a la fusión con 10 |ig de IL-21 humana conjugada con BSA y se sacrificaron el día 30. Se recogieron esplenocitos y células de los ganglios linfáticos y se fusionaron con mieloma P3-X63-Ag8.653 usando PEG para generar hibridomas. Los hibridomas específicos anti-IL-21 se identificaron seleccionando los sobrenadantes de hibridoma en ELISA de unión directa y competición tal como se describió anteriormente. Los hibridomas positivos se analizaron adicionalmente para determinar la actividad de neutralización en un ensayo basado en células usando la modulación descendente de la fosforilación de STAT3 como lectura (señales de IL-21 a través de STAT3). Los hibridomas neutralizantes se clonaron luego con dilución limitada y se expandieron para la purificación del anticuerpo.

Se usó ELISA de competición a lo largo de la campaña de hibridomas para identificar los ratones que responden bien al tratamiento después de la inmunización con IL-21, seguido de la selección con el mismo método de los hibridomas. Brevemente, la placa Maxisorp ELISA (NUNC) se recubrió con 2 |ig/ml de IL-21R-Fc en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4°C durante la noche. A continuación, la placa se bloqueó con BSA al 3% en PBST (PBS Tween al 0,1%) a temperatura ambiente durante una hora. Paralelamente, los sangrados de prueba se diluyeron en serie (para detectar los animales que responden bien al tratamiento) o se normalizaron las concentraciones de IgG de los sobrenadantes del cultivo de hibridoma y se incubaron previamente con IL-21 biotinilada 2 nM. Después de la incubación previa, luego la mezcla se añadió a cada pocillo de la placa ELISA y se incubó adicionalmente a temperatura ambiente durante media hora. Después del lavado, se añadió estreptavidina-HRP a cada pocillo para detectar el nivel de IL-21 unida como un indicador de inhibición de la interacción IL-21/IL-21R-Fc mediante sangrados de prueba o IgG de hibridoma.

Aislamiento, clonación, secuenciación, expresión y purificación de AcM murinos anti-IL-21

Se analizaron los sobrenadantes del cultivo de hibridoma para determinar su capacidad inhibidora contra la interacción IL-21/IL-21R-Fc siguiendo el procedimiento descrito en ELISA de competición. Los positivos se sometieron a un procedimiento de clonación por dilución limitada (LDC) para garantizar la clonalidad. Una vez confirmadas las funcionalidades de los subclones, se sometieron a clonación molecular.

El ARNm de los hibridomas se aisló usando el kit Dynabeads mRNA Direct según las instrucciones del fabricante. A continuación, el ARNm se convirtió en ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa usando la transcriptasa inversa Superscript III. Se sintetizaron dos conjuntos de ADNc para evitar imprecisiones en la PCR. Los ADNc se usaron como moldes para amplificar regiones variables de anticuerpos de cadena ligera y cadena pesada (VL y VH). La PCR se realizó usando la polimerasa Taq de alta fidelidad de Invitrogen y el conjunto de cebadores de Ig de ratón de Novagen, que incluía seis conjuntos de cebadores de VH y siete conjuntos de cebadores de VL. Los productos de PCR de VL y VH amplificados se purificaron y clonaron en vectores Invitrogen pCR 2.1 Topo, que ligan fácilmente secuencias de ADN con extremos compatibles con T-A. La E. coli transformada se sembró en placas de agar X-gal/Carb. Las colonias de bacterias que contenían inserciones de PCR aparecieron blancas. Se seleccionaron colonias blancas al azar para PCR para verificar adicionalmente la inserción.

Se seleccionaron cuarenta y ocho colonias blancas de cada transformación para la secuenciación. Las colonias se inocularon en placas de 96 pocillos con medio LB/Carb y luego se estamparon en placas de agar LB/Carb. Las colonias que crecieron en las placas de agar se secuenciaron usando el cebador directo M13. Basándose en los resultados de las secuencias, se crearon cebadores que permitirían la amplificación por PCR de VL y VH añadiendo sitios de enzimas de restricción que son compatibles con el vector de expresión pOE de IgG humana. Se realizaron la digestión y el ligamiento con enzimas de restricción para clonar VL y VH en el vector, lo que dio como resultado un constructo de anticuerpo quimérico que contiene la región variable de ratón y la región constante humana. El ADN plasmídico se transfectó en células 293F usando el reactivo transfectina 293. Octet estimó los niveles de expresión de IgG en los sobrenadantes celulares. La IgG en el sobrenadante se purificó usando columnas de proteína A. La IgG purificada se analizó en SDS-PAGE.

Se usó ELISA para someter a prueba la reactividad cruzada de los clones de principales. Las citocinas sometidas a prueba incluyen 11-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15. La placa Maxisorp ELISA (NUNC) se recubrió con 2 |ig/ml de diferentes citocinas en PBS a 4°C durante la noche. A continuación, la placa se bloqueó con BSA al 3% en PBST (PBS Tween al 0,1%) a temperatura ambiente durante una hora. Las IgG de clon principales purificadas se diluyeron en serie en PBST BSA al 3% y luego se añadió la mezcla a cada pocillo de la placa ELISA y se incubó adicionalmente a temperatura ambiente durante media hora. Después del lavado, se añadió anticuerpo secundario-HRP a cada pocillo durante 1 hora. Los pocillos se lavaron primero con PBST y luego con PBS y se añadió la disolución de TMB de Pierce para detectar el anticuerpo secundario. Después de 5 minutos la reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N. A continuación, se leyeron las placas en un lector ELISA a 450 nm para detectar la unión.

Humanización de diversos AcM murinos anti-IL-21

Se generó AcM 9F11 murino y se caracterizó por Medlmmune, que muestra la actividad biológica deseada con la unión de KD de 10 nM a IL-21. El trabajo de humanización se llevó a cabo en Shanghai ChemPartner Co. usando la tecnología de injerto de CDR. Se verificaron las propiedades de los candidatos de anticuerpos humanizados con éxito, 9F11-4, 9F11-6 y 9F11-11 (los resultados se presentan a continuación). Las secuencias de la región V de 9F11 y los clones de 9F11 humanizados se muestran en la figura 1A.

La humanización del AcM 19E3 murino se realizó injertando las CDR de 19E3 en regiones de entramado de línea germinal humana seleccionadas. Las secuencias de la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) del AcM 19E3 murino se compararon con las secuencias de la línea germinal de anticuerpos humanos disponibles en las bases de datos públicas del NCBI. Las regiones de entramado aceptoras humanas se identificaron basándose en la homología de secuencia más alta. Cuando se elige una región de entramado aceptora óptima, se usaron varios otros criterios, incluyendo el emparejamiento de residuos críticos (zona Vernier, residuos de clase canónica y residuos de interfaz de Vh /VL), inmunogenicidad (frecuencia de línea germinal), estabilidad y expresión. En este caso, se identificó una familia de línea germinal como la región de entramado aceptora para VH: VH1-46. Los genes del segmento J se compararon con las secuencias parentales sobre la región de entramado 4 y los segmentos J y se seleccionó JH4 para la VH. Este molde aceptor de línea germinal completamente humana se denominó Ha. Para lograr la secuencia aceptora de VL de mayor homología, se combinó la región de entramado individual de tres líneas germinales humanas diferentes para diseñar una secuencia aceptora de línea germinal híbrida óptima. El molde humano elegido para la cadena de Vl , denominado K1, fue una combinación de 014 (región de entramado 1), 018 (región de entramado 2), L23 (región de entramado 3) y JK1 (región de entramado 4). La homología de región de entramado entre la secuencia murina y el molde humano fue de aproximadamente el 71% para VH y el 79% para VL.

Los residuos críticos de la región de entramado de ratón que se pensaba que afectaban a los bucles de CDR, estabilizan la estructura de las regiones variables y afectan el empaquetamiento y/o interacción entre cadenas de VH y VL se identificaron y se introdujeron selectivamente de nuevo en las regiones de entramado de la línea germinal humana para preservar mejor el epítopo de unión a 19E3 y la afinidad. En este caso, los residuos de ratón en 44V y 87F volvieron a mutarse en el molde humano de la cadena de VL como un segundo molde de región de entramado aceptor, denominado K2. La alineación de la cadena de VL parental con estas regiones de entramado aceptoras se muestra en la figura 1B.

Se diseñaron dos moldes de región de entramado aceptores humanos adicionales para la cadena de VH como herramientas para identificar la región de entramado que podría afectar la actividad de unión de 19E3 si el molde aceptor (Ha) completamente humano perdiera la afinidad de unión. Se diseñó un molde, denominado Hb, fusionando la región de entramado murina 1 con el molde humano VH1-46/JH4; otro molde, denominado He, se diseñó fusionando la región de entramado murina 3 con el molde humano VH1-46/JH4. La alineación de la cadena de VH parental con estas regiones de entramado aceptoras se muestra en la figura 1B.

Los residuos de CDR tal como se definen por Kabat se fusionaron en las regiones de entramado aceptoras diseñadas tanto para VH como para VL para generar el anticuerpo humanizado. En total, GeneART sintetizó tres genes de VH humanizados (Ha, Hb y He) y dos genes de VL (K1 y K2) y luego se clonaron en un vector de expresión de IgG1. Se ha generado y caracterizado un panel de variantes humanizadas en ensayos bioquímicos y biológicos. Se desarrolló un ensayo de competición de epítopos de HTRF para evaluar las actividades de unión a IL-21 de las variantes humanizadas. El molde Ha de VH completamente humanizado presentó una actividad de unión de IL-21 comparable a la VH de 19E3 murina, así como variantes híbridas Hb y He. K2, el molde de VL humanizado con dos residuos de ratón en la posición 44V y 87F presentó una mejor actividad de unión que la variante K1 completamente humanizada. Se demostró que la variante humanizada resultante (K2Ha) poseía afinidad de unión a antígeno y especificidad de epítopo similar a 19E3. Para minimizar el contenido de residuo de ratón en la variante humanizada de mejor comportamiento (K2Ha), el residuo de ratón a 87F se reemplazó con el residuo humano comparable pero no el 44v que era crítico para retener la actividad de unión a IL-21. Se identificó un sitio de glicosilación ligado a N (NYT) de alto riesgo en la cadena pesada de 19E3 en la posición 56 en CDR2 y se retiró reemplazando N por Q. El anticuerpo humanizado final (K44VHaN56Q) con solo un residuo de ratón mostró una actividad de unión indistinguible en comparación con 19E3 de ratón y mostró actividades biológicas dentro de 2-3 veces de 19E3 en todos los ensayos biológicos sometidos a prueba.

El AcM murino 9F11 mostró la actividad biológica deseada con una Kd de unión de 10 nM a IL-21. El trabajo de humanización se llevó a cabo en Shanghai ChemPartner Co. usando la tecnología de injerto de CDR. Se verificaron las propiedades de los anticuerpos candidatos exitosamente humanizados, 9F11-4, 9F11-6 y 9F11-11, mostrando que los anticuerpos retuvieron completamente la afinidad de unión y la actividad biológica con respecto a IL-21, en comparación con el 9F11 murino parental. Las secuencias de la región V de 9F11 y los clones de 9F11 humanizados se muestran en la figura 1.

Las propiedades de diversos anticuerpos anti-IL-21 proporcionados en el presente documento se muestran en la tabla 2.

Tabla 2: Ejemplos de anticuerpos anti-IL-21

ND: no realizado

Ejemplo 2. Afinidad de unión de K44VHa-N56Q a IL-21 humana y de macaco cangrejero recombinante

Este ejemplo muestra la determinación de las constantes de unión en equilibrio de fase de disolución (KD) para la interacción de K44VHa-N56Q con proteínas IL-21 humanas y de macaco cangrejero. La constante de disociación en equilibrio (KD) para la interacción de K44VHa-N56Q con IL-21 recombinante humana y de macaco cangrejero se midió usando una plataforma KinExA (Kinetic Exclusion Assay) 3000 (Sapidyne, Boise, ID). Se recubrieron cantidades separadas de 50 mg de perlas de azlactona (Thermo Scientific, Rockford, IL) con IL-21 humana (obtenida de Protein Sciences/ADPE) o IL-21 de macaco cangrejero (obtenida de Protein Sciences/ADPE) en concentraciones de 75 o 150 |ig/ml según las instrucciones del fabricante del instrumento. Las perlas se lavaron y bloquearon en tampón Tris 1 M, pH 8 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contenía albúmina sérica bovina 10 mg/ml (BSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MPO) y se almacenaron a 4°C hasta que se usaron. Se prepararon lotes de K44VHa-N56Q a concentraciones de 500 fM y 50 pM (series K44VHa-N56Q 500 fM y 50 pM, respectivamente) en tampón de muestra (solución salina tamponada con fosfato (PBS, Invitrogen), pH 7,4, BSA al 0,1%, azida de sodio al 0,02% (NaN3, Sigma-Aldrich)); cada uno se dispensó en 2 conjuntos separados de 13 tubos (1 para cada serie). Se añadió IL-21 humana o de macaco cangrejero en 1 tubo de cada serie a una concentración de 4 nM (K44VHa-N56Q 50 pM) o 100 pM (serie K44VHa-N56Q 500 fM), luego se diluyó en serie en 11 de los tubos restantes, dejando 1 tubo de muestra en cada serie como control de sólo receptor K44VHa-N56Q. Las concentraciones finales de IL-21 humana o de macaco cangrejero en las mezclas de muestras individuales oscilaron desde 1,95 fM hasta 100 pM (K44VHa-N56Q 500 fM) y desde 78,1 fM hasta 4 nM (K44VHa-N56Q 50 pM). Estas mezclas de muestras se equilibraron a temperatura ambiente durante de 2 a 7 días y se analizaron en la plataforma KinExA. Las suspensiones de perlas de azlactona recubiertas con IL-21 se diluyeron hasta 30 ml con tampón de instrumento (PBS, pH 7,4, NaN3 al 0,02%) en un vial de perlas y se fijaron al instrumento KinExA. Se usó un programa de tiempo definido por el usuario para transferir secuencialmente las perlas de IL-21/azlactona a una celda de flujo capilar en el instrumento, y se inyectaron mezclas de muestras individuales sobre las perlas recubiertas con IL-21. La disolución de muestra no unida se retiró lavando las perlas con tampón de instrumento. Una disolución de 1 ó 2Ag/ml del reactivo secundario anti-IgG humana (H+L) de cabra marcado con DyLight649 (Thermo Scientific) se pasó sobre las perlas para detectar el receptor (K44VHa-N56Q) que permanecía unido a las perlas recubiertas con IL-21. Las perlas se lavaron de nuevo con tampón de instrumento para retirar el exceso de marcador (no unido). Se midió la cantidad de fluorescencia que permanecía asociada con las perlas y la señal se convirtió en porcentaje de receptor libre (K44VHa-N56Q). Entre muestras, el paquete de perlas se lavó de la celda de flujo y se rellenó con perlas de azlactona recubiertas con IL-21 recién preparadas en preparación para la siguiente muestra. Una vez se habían recogido los datos para todas las muestras en cada serie (K44VHa-N56Q 500 fM y 50 pM), se generó una isoterma, que representó la cantidad de K44VHa-N56Q libre detectada en cada concentración de IL-21. Las 2 curvas de unión resultantes se evaluaron luego en un análisis de curva dual usando el software de evaluación del instrumento (KinExA Pro Software, v. 2.0.1.26, Sapidyne) a partir del cual se derivaron las Kd individuales para cada interacción.

La unión de K44VHa-N56Q a IL-21 humana y de macaco cangrejero se midió mediante KinExA. Se preparó K44VHa-N56Q en 2 series de concentraciones: 500 fM y 50 pM, y se diluyó en serie IL-21 humana o IL-21 de macaco cangrejero en cada serie. Una vez que se alcanzó el equilibrio, se usó el instrumento KinExA para medir la concentración de K44VHa-N56Q libre que quedaba en cada una de las mezclas de muestras. Esto se hizo registrando la cantidad de fluorescencia que permanecía asociada con las perlas recubiertas con IL-21 después de que las muestras de cada mezcla se pasaran sobre las perlas y luego se expusieran a un reactivo anti-IgG marcado con fluorescencia. Se realizó un gráfico de la cantidad de K44VHa-N56Q libre registrada frente a la concentración de proteína IL-21 humana o IL-21 de macaco cangrejero, y se usó el software de evaluación de la plataforma KinExA para ajustar cada conjunto de datos a un modelo de afinidad de un sitio. El software KinExA ajusta globalmente ambas curvas de unión (IgG 500 fM e IgG 50 pM) en un análisis de doble curva (figuras 2A y 2B, respectivamente, devolviendo disoluciones óptimas para varios parámetros simultáneamente y calculando la verdadera constante de unión de la fase de disolución. En estas condiciones, la Kd para la unión de K44VHa-N56Q a la proteína IL-21 humana se calculó que era de 515 fM (IC del 95% para Kd: de 279 a 844 fM), mientras que la unión de K44VHa-N56Q a la proteína IL-21 de macaco cangrejero se calculó que era de 352 fM (IC del 95% para Kd: de 134 a 685 fM).

Se demostró que K44VHa-N56Q se une débilmente a IL-21 murina con afinidad en |iM, medida en una plataforma KinExA.

Ejemplo 3. Estudios del mecanismo de acción para anticuerpos monoclonales anti-IL-21

Los clones anti-IL-21 bloquean la fosforilación inducida por IL-21 de STAT3

La capacidad de los anticuerpos anti-IL-21 purificados para inhibir la fosforilación de STAT3 (pSTAT3) inducida por IL-21 humana y de macaco cangrejero se determinó tal como se describe a continuación.

Brevemente, se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) totales de tubos CPT (BD Vacutainer) después de centrifugación según las instrucciones del fabricante. Se incubaron previamente anticuerpos anti-IL-21 con iL-21 humana o de macaco cangrejero (20 pM) en placas de fondo redondo de 96 pocillos durante 60 minutos a 37 grados. Después de esta incubación, las PBMC (0,4x106 por pocillo) se añadieron rápidamente a cada pocillo y se incubaron con IL-21/IgG durante 15 minutos a 37 grados. Después de la estimulación, las células se fijaron durante 10 minutos (a 37 grados) con 100 |il/pocillo de tampón de lisis/fijación (BD Phosflow) precalentado, seguido por permeabilización en hielo durante 30 minutos con 225 |il/pocillo de tampón de permeabilización III (BD Phosflow). Las células se lavaron dos veces (PBS/BSA al 2%) y se tiñeron con anticuerpo anti-pSTAT3 (pY705, BD Phosflow) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con tampón de tinción y se analizaron en un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences) usando el software FACSDiva.

La estimulación con IL-21 humana y de macaco cangrejero tal como se describe indujo un aumento de 3-5 veces de los niveles de pSTAT3 en PBMC humanas totales (figura 3A). Se muestran gráficos representativos que demuestran la inhibición de la regulación por incremento de pSTAT3 inducida por IL-21 por anticuerpos anti-IL-21 en la figura 3B. Todos los clones sometidos a prueba alcanzaron una inhibición del 100% en este ensayo. Los valores de CI50 de los clones anti-IL-21 en el ensayo pSTAT3 se resumen en la tabla 3. Estos datos muestran que los anticuerpos anti-IL-21 descritos son capaces de inhibir acontecimientos de señalización tempranos aguas abajo del IL-21R.

Tabla 3: Valores de CI50 de anticuerpos anti-IL-21 en el ensayo pSTAT3

Se ha demostrado que K44VHa-N56Q se une débilmente a IL-21 murina. La estimulación de esplenocitos de ratón con IL-21 murina indujo un aumento de 4 veces de los niveles intracelulares de STAT3 fosforilado. K44VHa-N56Q no pudo inhibir la fosforilación de STAT3 inducida por IL-21 murina. Estos datos sugieren que K44VHa-N56Q no neutraliza la bioactividad de IL-21 murina.

IL-21 es miembro de la familia de citocinas receptoras yc que utiliza la cadena gamma común junto con un(os) receptor(es) específico(s) para mediar la actividad biológica. Los linfocitos de sangre humana se estimularon con la cadena yc que utiliza citocinas IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 o IL-21 en presencia o ausencia de K44VHa-N56Q o un anticuerpo IgG1-YTE humano de control. La señalización aguas abajo se midió evaluando la fosforilación de moléculas STAt apropiadas para cada citocina. K44VHa-N56Q no tuvo ningún efecto sobre la señalización aguas abajo de las citocinas iL-2, IL-4, IL-7 o IL-15 relacionadas. Estos datos muestran que K44VHa-N56Q actúa específicamente para neutralizar la ruta de IL-21 en células humanas.

La señalización de IL-21 a través de su receptor relacionado conduce a la activación y fosforilación de STAT3. Los datos descritos en el presente documento demuestran que K44VHa-N56Q puede inhibir la regulación por incremento de pSTAT3 en respuesta tanto a IL-21 humana como de macaco cangrejero, pero no a IL-21 de ratón. Además, esta inhibición es específica para IL-21, ya que K44VHa-N56Q no afectó la activación de moléculas STAT aguas abajo de receptores de citocinas Yc relacionados tales como los receptores de IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15. En consecuencia, K44VHa-N56Q es un inhibidor potente y específico de los acontecimientos de señalización de IL-21R.

El bloqueo de IL-21 suprime la producción de IFNy por las células NK-92

El efecto de los anticuerpos anti-IL-21 purificados sobre la producción de IFNy inducida por IL-21 por las células NK-92 se evaluó tal como sigue.

Las células NK-92 se hicieron crecer en medios de crecimiento completos que consistían en medios de base MEM alfa Glutamax suplementados con bicarbonato de sodio (1,5 g/l), inositol (0,2 mM, Sigma Aldrich), 2-mercaptoetanol (0,1 mM), ácido fólico (0,02 mM, Sigma Aldrich), IL-2 recombinante (100 U/ml, R&D Systems), suero de caballo (12,5%) y suero bovino fetal (12,5%). Todos los reactivos se adquirieron de Invitrogen a menos que se indique lo contrario. Las células se lavaron y se resuspendieron en medios que no contenían IL-2 durante 16-24 horas antes de la estimulación con IL-21. Para evaluar la potencia de los clones anti-IL-21, se incubaron previamente anticuerpos con IL-21 humana o de macaco cangrejero (200 pM) en placas de fondo plano de 96 pocillos durante 60 minutos a 37 grados. A continuación, se añadieron 0,5x105 células NK-92 a la placa y se incubaron a 37 grados durante 24 horas. La producción de IFNy se cuantificó en el sobrenadante usando un ensayo de monoplex de IFNy humano MSD según las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery).

La capacidad de los clones anti-IL-21 para inhibir IFNy inducido por IL-21 humana y de macaco cangrejero por las células NK-92 se representa en la figura 4. Los clones K2Ha-N56Q, K(44V)Ha-N56Q y K(44V)Ha6-N56Q fueron capaces de inhibir completamente la producción de IFNy en estos cultivos, con una potencia similar contra IL-21 humana y de macaco cangrejero. En la tabla 4 se proporciona un resumen de los valores de CI50 de los clones evaluados en el ensayo de células NK-92. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-IL-21 sometidos a prueba modulan la actividad de las células NK-92 tal como se demuestra mediante un bloqueo completo en la producción de IFNy a las 24 horas.

Tabla 4 Valores de CI50 de anticuerpos anti-IL-21 en el ensayo NK-92

La diferenciación de células plasmáticas inducida por IL-21 exógena se inhibe mediante clones anti-IL-21

Para determinar el efecto de los anticuerpos anti-IL-21 sobre la actividad de las células B, se realizó un ensayo de diferenciación de células plasmáticas.

Se aislaron PBMC humanas de tubos CPT (BD Vacutainer) después de centrifugación según las instrucciones del fabricante. Las células B se seleccionaron negativamente usando reactivos de separación de células MACS (kit II de aislamiento de células B humanas, Miltenyi Biotec). La pureza de rutina para las células B usando esta técnica fue de > 97%. Es de destacar que las preparaciones de células B totales aisladas mediante este método contienen poblaciones de células B no diferenciadas y de memoria, pero las PC se excluyeron debido a la expresión de CD43, que se selecciona como diana por el cóctel de selección de anticuerpos del kit MACS. El medio de cultivo para estos experimentos fue RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con FCS al 10%, penicilina-estreptomicina (100 unidades/ml de penicilina, 100 |ig/ml de estreptomicina), 2-mercaptoetanol (55 |iM), L-glutamina (2 mM) y HEPES (5 mM). Los anticuerpos anti-IL-21 se incubaron previamente en placas de fondo redondo de 96 pocillos con el cóctel de estimulación que incluía IL-21 humana o de macaco cangrejero (2 nM), anticuerpo anti-CD40 (0,1 |ig/ml, IgG de cabra, R&D Systems) y F(ab')2 anti-IgM (5,0 |ig/ml, Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante 60 minutos a 37 grados. A continuación se añadieron 0,5-1,0 x 105 células B a la placa para un volumen final de 150 |il.

Después de 6 días de estimulación, las células se tiñeron y analizaron usando citometría de flujo para cuantificar la frecuencia de células plasmáticas en cultivo. Las células se lavaron (PBS/FBS al 2%) y se tiñeron durante 30 minutos a 4 grados con anticuerpo anti-IgD (FITC o PE); anticuerpo anti-CD38 (aloficocianina, clon HB7) (BD Pharmingen) y se analizaron en un citómetro de flujo LSRII usando el software FACSDiva. Además, se recogieron los sobrenadantes y se cuantificó la producción de Ig mediante ELISA. Brevemente, se recubrieron placas de fondo plano de 96 pocillos durante la noche a 4°C con 5 |ig/ml de anticuerpo de cabra anti-IgG humana diluido en PBS (Bethyl Laboratories). Las placas se lavaron y bloquearon con BSA al 0,2% en PBS. Los sobrenadantes se diluyeron y se incubaron en placas durante la noche. La Ig unida se detectó con anticuerpo de cabra anti-IgG humana-fosfatasa alcalina (0,2 |ig/ml, Bethyl Laboratories) diluido en tampón de bloqueo. Las placas se desarrollaron con comprimidos de fosfato de p-nitrofenilo SigmaFast (Sigma Aldrich) y se midió la absorbancia específica a 405 nm usando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices).

La estimulación de células B humanas tal como se describió anteriormente con IL-21 humana o de macaco cangrejero dio como resultado la generación de una población de PC IgD- CD38hi (figuras 5A y 5B). Varios clones, incluyendo 19E3.1, 9F11.1 y 9H10.1, pudieron inhibir completamente la diferenciación de PC en estas condiciones (figuras 5A y 5B). El clon 8B6.1 inhibió la diferenciación de PC inducida por IL-21 de macaco cangrejero pero no de IL-21 humana. Los valores de CI50 para los clones anti-IL-21 se resumen en la tabla 5. Además, en condiciones de control, la estimulación con IL-21, anticuerpo anti-CD40 y anticuerpo anti-IgM dio como resultado una producción de Ig en el intervalo de 30-40 |ig/ml el día 6 (figura 5C). Los clones 19E3.1 y 9F11.1 inhiben la secreción de Ig por las células B humanas de una manera dependiente de la dosis (figura 5C). El clon 19E3.1 fue capaz de inhibir la producción de IgG en respuesta a IL-21 humana y de macaco cangrejero en > 99%, mientras que 9F11.1 inhibió la producción de IgG por IL-21 humana y de macaco cangrejero en un 97% y un 79%, respectivamente. De manera acumulativa, estos datos sugieren que los clones anti-IL-21 descritos son capaces de inhibir significativamente la diferenciación de células plasmáticas humanas y la secreción de Ig inducida por IL-21 humana y de macaco cangrejero exógena.

Tabla 5: Valores de CI50 para anticuerpos anti-IL-21 en el ensayo de diferenciación de células plasmáticas

8B6

> 200 nM

8,9 nM

Los clones anti-IL-21 inhiben la diferenciación de PC inducida por células T CD4+ activadas

Los clones anti-IL-21 se sometieron a prueba para determinar su capacidad para bloquear la diferenciación de células plasmáticas inducida por células T CD4+ activadas en un ensayo de cocultivo tal como se describe a continuación.

Se aislaron PBMC humanas de tubos CPT (BD Biosciences) después de la centrifugación. Las células B y las células T CD4+ se seleccionaron negativamente usando reactivos de separación de células MACS (Miltenyi Biotec). La pureza de rutina para las células B totales y las células T CD4+ fue de > 97%. Las células T CD4+ se trataron con mitomicina-C (30 |ig/ml, Sigma Aldrich) durante 30 minutos a 37°C, luego se lavaron y se dejaron en reposo en medios completos a 37°C durante 30 minutos adicionales. Se cultivaron conjuntamente 1,0 x 105 células T CD4+ tratadas con mitomicina-C y 0,5 x 105 de células B purificadas (por pocillo) en un volumen final de 200 |il con perlas anti-CD3/anti-CD28 (razón de células T con respecto a perlas de 5:1). El medio de cultivo para todos los experimentos fue RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con FCS al 10%, penicilina-estreptomicina (100 unidades/ml de penicilina, 100 |ig/ml de estreptomicina), 2-mercaptoetanol (55 |iM), L-glutamina (2 mM) y HEPES (5 mM). Se añadieron anticuerpos anti-IL-21 a los cultivos a una concentración de 0-200 nM. Después de 7 días de cultivo, las células plasmáticas se cuantificaron mediante citometría de flujo. Las células se lavaron (PBS/FBS al 2%) y se tiñeron durante 30 minutos a 4 grados con anticuerpo anti-IgD (FITC o PE); anticuerpo anti-CD38 (aloficocianina, clon HB7) (BD Pharmingen) y se analizaron en un citómetro de flujo LSRII usando el software FACSDiva. Todas las condiciones se recogieron durante el mismo tiempo, por lo que el número de acontecimientos mostrados refleja el número relativo de células. Sin embargo, el número total de células se determinó usando AccuCount Particles (Spherotech).

El cocultivo de células B con células T CD4+ activadas dio como resultado la aparición de una población de PC IgD-CD38hi, expresando el 68,5% de las células CD19+ este fenotipo de PC el día 7 (figura 6A). La adición de 19E3.1 o 9F11.1 inhibió la diferenciación de PC de una manera dependiente de la dosis y cada uno logró una inhibición máxima del 80% y el 78%, respectivamente (figuras 6B y 6C). Estos datos sugieren que los clones anti-IL-21 pueden bloquear en gran medida la diferenciación de células plasmáticas inducida por la producción de novo de IL-21 a partir de células T activadas.

El clon anti IL-21 inhibe la expansión de células T CD4+ no diferenciadas

Se ha demostrado que la IL-21 apoya la proliferación de células T CD4+ en condiciones de cebado subóptimas. Se purificaron y estimularon in vitro células T CD4+ humanas no diferenciadas con anticuerpo anti-CD3 e IL-21 en presencia o ausencia del anticuerpo parental 19E3.1. La proliferación se evaluó midiendo la acumulación de ATP después de cuatro días en cultivo. Tal como se informó anteriormente, la cantidad de ATP detectada es directamente proporcional al número de células metabólicamente activas en cultivo. 19E3.1 atenuó la proliferación inducida por IL-21 (CI50 promedio = 61,02 pM para dos donantes) de una manera dependiente de la dosis. Estos datos muestran que el anticuerpo parental K44VHa-N56Q (MEDI7169) 19E3.1 inhibe la proliferación impulsada por IL-21 de células T CD4+ humanas no diferenciadas (figura 7).

Farmacocinética

La farmacocinética (PK) de K44VHaN56Q, un anticuerpo frente a YTE, se evaluó en tres estudios usando monos como modelo animal, que puede predecir la PK humana con una precisión razonable (Oitate et al., Drug Metab. Pharmacokinet. 26 (4): 423-430 (2011)). El aclaramiento es un parámetro de PK importante para la predicción de PK humana escalada a partir de datos animales; un valor de CL menor sugiere que una molécula puede permanecer más tiempo en el cuerpo. Los valores de CL para K44VHaN56Q en monos oscilan desde 1,08 hasta 4,37 ml/d/kg. Los anticuerpos terapéuticos típicos tales como bevacizumab (Avastin®), daclizumab (Zenapax®), infliximab (Remicade®) y rituximab (Rituxan®) están asociados con valores de CL respectivos de 5,78, 5,30, 11,5 y 17,0 (ml/d/kg) (Dong et al., Clin Pharmacokinet. 50(2): 131-142 (2011). Se supuso que el peso corporal del mono era de 3 kg). Estos valores de CL son mayores que los estimados para K44VHaN56Q. Por tanto, se espera que K44VHaN56Q permanezca en el cuerpo más tiempo que un anticuerpo terapéutico típico.

Ejemplo 4. Prevención de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) usando anticuerpos monoclonales anti-IL-21

Modelo de ratón de EICH xenogénico

La EICH se desarrolla cuando las células T transferidas (donantes) perciben antígenos extraños presentados por moléculas de MHC/HLA del huésped (receptor). Los ratones con deficiencia de la cadena y del receptor NOD/SCID/IL-2 (NSG) carecen de células T y B maduras, células NK funcionales y macrófagos. Estos ratones demuestran una disminución de la señalización de citocinas debido a la pérdida del receptor yc.

En un modelo xenogénico de EICH, las PMBC humanas se transfieren a receptores de ratón NSG. Dado que los ratones están inmunodeprimidos, el sistema inmunitario del ratón no rechaza las células humanas. Las células humanas reconocen el entorno del ratón como extraño y se activan y proliferan. Las células humanas activadas producen una “tormenta de citocinas”, lo que conduce a una cascada inmunorreactiva grave, que afecta al hígado, el tracto gastrointestinal y la piel, lo que finalmente provoca la muerte del animal. Puede aislarse una gran cantidad de células capaces de producir IL-21 de la sangre de ratones con EICH.

En el estudio profiláctico se usaron treinta y cinco ratones NSG hembra (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ; The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Los ratones tenían 5-7 semanas de edad y pesaban 16,8-22,4 gramos al comienzo del estudio.

Aislamiento de sangre periférica humana

Se recogió sangre humana de dos donantes sanos en tubos de preparación celular (CPT) (Becton Dickinson, San José, CA) que contenían heparina de sodio. Las células mononucleares se aislaron de los tubos CPT según las instrucciones del fabricante. Brevemente, los tubos se centrifugaron a temperatura ambiente durante 25 minutos a 1700 x g. Después de la centrifugación, se recogieron las células mononucleares. Las células se lavaron dos veces en PBS mediante centrifugación durante 10 minutos a una fuerza centrífuga relativa de 400 x g. A continuación, se contaron las células y se resuspendieron en la cantidad apropiada de PBS y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta las inyecciones (inmediatamente después del lavado final).

Anticuerpos

Se usó una IgG1 k-YTE humana (NIP-228-YTE; Medlmmune, Cambridge, R.U.) como AcM de control en este ejemplo. El AcM de control se dividió en alícuotas y se congeló como disolución madre a -80°C. El tampón de formulación era histidina 25 mM, sacarosa al 7%, polisorbato 80 al 0,02% (p/v), a pH 6,0. La disolución de dosificación se preparó diluyendo una alícuota de la disolución madre (60,6 mg/ml) con solución salina tamponada con fosfato PBS hasta 1 mg/ml. Las preparaciones de trabajo se almacenaron a 4-8°C.

Se almacenó K44VHa-N56Q (MEDI7169) a -80°C como disolución madre en alícuotas y congelada. El tampón de formulación era histidina 25 mM, sacarosa 205 mM, polisorbato 80 al 0,02% (p/v), a pH 6,0. La disolución de dosificación se preparó diluyendo una alícuota de la disolución madre (47,6 mg/ml) con PBS hasta 1 mg/ml. Las preparaciones de trabajo se almacenaron a 4-8°C.

Inyección de células humanas, tratamientos y evaluación de la EICH

La dosificación se realizó tal como se muestra en la tabla 6. Brevemente, se inyectaron por vía intraperitoneal (IP) 12,71 x 106 PBMC humanas purificadas del donante 1 o 13,46 x 106 PBMC humanas purificadas del donante 2 en ratones NSG hembra de 5-7 semanas de edad el día 0. Se administraron IP doscientos microgramos (en un volumen de 200 |il) de K44VHa-N56Q (MEDI7169), AcM de control o un volumen igual de PBS (vehículo) solo, tres veces a la semana comenzando el día -1, antes de inyectar PBMC humanas.

Tabla 6. Designación de grupos y niveles de dosis en el estudio profiláctico

H = hembra; Vi = viernes; IP = intraperitoneal; AcM = anticuerpo monoclonal; Lu = lunes; N/A = no aplicable, ya que los animales no recibieron dosis; PBMC = células mononucleares de sangre periférica; PBS = solución salina tamponada con fosfato; ROA = vía de administración; Mi = miércoles;

El peso corporal se midió individualmente durante todo el estudio, al menos una vez a la semana. Los ratones se sacrificaron cuando se determinó que habían perdido un 20% de peso corporal o si el ratón estaba demacrado/moribundo o si tenía dolor o angustia. Muerte y sacrificio humanitario se usaron como sinónimos con el fin de realizar un seguimiento de la supervivencia.

Evaluación del número y fenotipo de células T mediante citometría de flujo

Se extrajo sangre de los ratones del seno retroorbital en tubos Microtainer con heparina. En todos los experimentos en todos los puntos de tiempo, se usaron 100 |il de sangre. Se realizó una etapa de lisis de glóbulos rojos usando tampón de lisis ACK (Life Technologies, Grand Island, NY), las células restantes se incubaron con el bloqueante TruStain Fc (BioLegend, San Diego, CA), diluido 1:4, durante 10 minutos, luego se tiñeron durante 30 minutos a 4°C con el siguiente cóctel de anticuerpos para visualizar células T CD4 y CD8: anticuerpo anti-CD45 humano conjugado con V500 (clon HI130; BioLegend, San Diego, CA), anticuerpo anti-CD4 humano conjugado con AF700 (clon RPA-T4; BioLegend, CA) y anticuerpo anti-CD8 humano conjugado con BV711 (clon RPA-T8; BioLegend, San Diego, CA). Las muestras se lavaron, se fijaron en paraformaldehído al 2% y se procesaron en un citómetro de flujo Becton Dickinson LSR II usando el software FACSDiva. Las muestras se analizaron usando el software FlowJo (versión 9). Las células humanas se identificaron mediante aquellas que expresaban el antígeno CD45 humano. La sangre teñida (100 |il) para todas las condiciones se recogió en LSRlI para el mismo volumen, por lo que el número de acontecimientos mostrados refleja el número relativo de células para los diferentes tratamientos.

Evaluación de citocinas humanas en suero de ratones tratados mediante ELISA multiplex

Se recogieron y analizaron muestras de suero longitudinal usando un kit multiplex de Th17 humano (perla magnética, mezclado previamente) (Merck Millipore, Billerica, MA) con un analizador Luminex 200; se siguieron las instrucciones del fabricante.

Se usó GraphPad Prism (versión 6.0d para Mac OS X). Los resultados de citocinas en suero de ratones tratados con K44VHa-N56Q (MEDI7169) se compararon con los de los ratones tratados con AcM de control (donante 1) o con los de los ratones tratados con AcM de control y PBS (vehículo) combinados (donante 2). Estos datos se analizaron usando pruebas de la t para datos independientes con la corrección de Welch, a menos que se determinara que las varianzas eran significativamente diferentes mediante la prueba F, y luego se realizaron las pruebas de Mann Whitney. P <0,05 para todas las diferencias significativas.

K44VHa-N56Q (MEDI7169) inhibe la consunción y la expansión de células T inducidas por EICH xenogénica

Se ha informado que la IL-21 afecta la función de las células T. Por tanto, se investigó la capacidad de K44VHa-N56Q (MEDI7169) para inhibir la EICH xenogénica, que está mediada en gran parte por células T CD4+. Se inyectaron PBMC humanas en ratones NSG inmunodeprimidos, tal como se describió anteriormente, y se observó una enfermedad consuntiva el día 21 en ratones que recibieron AcM de control (AcM IgG1 humano) (figura 8A) o vehículo de PBS. Los ratones que recibieron 200 |ig de K44VHa-N56Q (MEDI7169) tres veces por semana a partir del día -1 parecían sanos (figura 8B) y no podían distinguirse de los ratones de control que no recibieron células humanas. El análisis de la sangre reveló que en los ratones que recibieron AcM de control (o PBS), las células CD45+ humanas se habían expandido (figura 8C). En comparación, los ratones que recibieron K44VHa-N56Q (MEDI7169) habían reducido significativamente las células CD45+ humanas presentes en la sangre (figura 8D). En ratones tratados con AcM de control (y PBS), esta expansión de células CD45+ humanas consistió principalmente en células CD4 positivas (figura 8E), mientras que el porcentaje de células CD4 positivas se redujo considerablemente en los ratones tratados con K44VHa-N56Q (MEDI7169), tal como se indicó en el día 35 (figura 8F). Estos resultados son coherentes con la inhibición de K44VHa-N56Q (MEDI7169) de la expansión de células T CD4+ humanas después del trasplante de PBMC humanas en ratones inmunodeprimidos.

Cuando se monitorizó a los ratones a lo largo del tiempo, se descubrió que los animales que recibieron vehículo de PBS o AcM de control tenían un aumento constante en el número de células CD45+ humanas. Sin embargo, estas células no se expandieron en ratones que recibieron K44VHa-N56Q (MEDI7169) (figura 9). Es importante destacar que aproximadamente 3 semanas después de la retirada de K44VHa-N56Q (MEDI7169), se descubrió que las células CD45+ humanas iniciaban la expansión, que luego volvió a disminuir al reanudar el tratamiento (figura 9). Estos datos demuestran que K44VHa-N56Q (MEDI7169) puede inhibir significativamente la expansión de células T, que es reversible tras la retirada.

K44VHa-N56Q (MEDI7169) evita la pérdida de peso y la muerte inducidas por EICH

La pérdida de peso corporal y la supervivencia se monitorizaron en ratones que o bien no recibieron células humanas (sin tratamiento previo) o bien que recibieron PBMC humanas con vehículo de PBS, AcM de control o K44VHa-N56Q (MEDI7169) iniciado un día (día -1) antes de que los ratones recibieran PBMC humanas. Se encontró que los ratones que recibieron PBS o AcM de control perdieron peso rápidamente (figura 10A) y o bien murieron o bien fueron sacrificados cuando el peso corporal disminuyó en un 20%. Todos los ratones (n = 16) que fueron inyectados con PBS o AcM de control en dos estudios separados o bien murieron o bien fueron sacrificados el día 37 del estudio después de recibir PBMC humanas (figura 10B). En cambio, todos los ratones (n = 10) que recibieron K44VHa-N56Q (MEDI7169) sobrevivieron y permanecieron sanos hasta que se retiró K44VHa-N56Q (MEDI7169) (figura 10B). En un experimento, los ratones se mantuvieron sanos durante aproximadamente 20 días después de la retirada de K44VHa-N56Q (MEDI7169) y luego disminuyeron rápidamente y murieron o fueron sacrificados poco después del día 31 del estudio (figura 10B). En un estudio separado que usó PBMC humanas de un segundo donante, los ratones permanecieron viables durante aproximadamente 40 días después de que se detuviera K44VHa-N56Q (MEDI7169). Estos datos demuestran que K44VHa-N56Q (MEDI7169) protege contra la letalidad, que es reversible cuando se retira K44VHa-N56Q (MEDI7169).

K44VHa-N56Q (MEDI7169) inhibe la producción de varias citocinas y es reversible

Se recogieron sueros de ratones inyectados con células del donante 2 (figura 11) o del donante 1 (figura 12), en diversos puntos de tiempo y se analizó la expresión de 25 citocinas usando el sistema MILLIPLEX MAP de Millipore. Más de la mitad de las citocinas examinadas estaban por debajo del nivel de detección. Para las citocinas que eran detectables, K44VHa-N56Q (MEDI7169) indujo una disminución significativa en GM-CSF, IL-10 y TNF en dos experimentos separados. En un experimento, IFNy disminuyó significativamente y tuvo una tendencia a la baja en un segundo experimento. Se encontró que IL-17A e IL-9 disminuyeron significativamente en uno de dos experimentos. En ambos experimentos, se encontró que la IL-5 aumentaba significativamente (figura 11). Se realizaron hemogramas completos (CBC, Complete Blood Count por sus siglas en inglés) usando el analizador de hematología Sysmex XT-2000iv y, lo que es más importante, no se observó un aumento de eosinófilos en ratones con IL-5 aumentada. Se encontró que la IL-21 estaba aumentada en ambos experimentos. La IL-21 aumentada es coherente con la obtenida en un estudio de toxicidad en macacos cangrejeros en los que la IL-21 aumentada era un reflejo de la cantidad de fármaco circulante que se unía a la citocina y la neutralizaba.

Tal como se muestra en la figura 9, K44VHa-N5 6Q (MEDI7 169) inhibió la expansión de células T CD4+, que fue reversible cuando se retiró el fármaco. Esto se confirmó en un segundo estudio (figura 12). Es de destacar que después de la expansión celular, también aumentaron varias citocinas, incluyendo TNF, IFNy e IL-10 (figura 12). Estos datos muestran que un anticuerpo anti-IL-21, concretamente, K44VHa-N56Q (MEDI7169) inhibe la expansión de células T y la producción de citocinas, que son reversibles cuando se detiene K44VHa-N56Q (MEDI7169).

Ejemplo 5. Tratamiento de la enfermedad injerto contra huésped (EICH) usando anticuerpos monoclonales anti-IL-21

Diseño experimental

En el estudio terapéutico se usaron veinte ratones NSG hembra (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ; The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Los ratones tenían 8 semanas de edad y pesaban 18,0-22,3 gramos al comienzo del estudio.

Se recogió y preparó sangre humana tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4.

Se obtuvieron, manipularon y almacenaron AcM de control y de prueba tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4.

La dosificación se realizó tal como se muestra en la tabla 7. Brevemente, se inyectaron IP 12 x 106 PBMC humanas purificadas del donante 1 en ratones NSG hembra de 8 semanas de edad el día 0. Se inyectaron IP 200 microgramos (en un volumen de 200 |il) de K44VHa-N56Q (MEDI7169) o AcM de control tres veces a la semana comenzando el día 7. A otro grupo se le inyectó K44VHa-N56Q (MEDI7169) (200 |ig en 200 |iL) IP tres veces a la semana comenzando el día 14.

Tabla 7. Designación de grupo y niveles de dosis en el estudio terapéutico

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   i . Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-21 que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en el que

   (a) la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; y

   (b) la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
2. 2. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1, que comprende además una región constante de cadena pesada, en el que la región constante de cadena pesada es un dominio constante de IgG.
3. 3. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 2, en el que el dominio constante de IgG comprende una o más sustituciones de aminoácido en relación con un dominio constante de IgG de tipo natural, y tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG que tiene el dominio constante de IgG de tipo natural.
4. 4. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 2 ó 3, en el que el dominio constante de IgG es un dominio constante de IgG1 humana.
5. 5. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID n O: 24; 0

   en el que la cadena ligera contiene una región constante kappa humana y comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 26; o

   en el que la cadena pesada y la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22.
6. 6. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo recombinante.
7. 7. Fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el fragmento de unión a antígeno es Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFvy sc(Fv)2.
8. 8. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se conjuga con un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente antimicrobiano, un agente terapéutico, un profármaco, un péptido, una proteína, una enzima, un lípido, un modificador de la respuesta biológica, un agente farmacéutico, un linfocina, un anticuerpo heterólogo o fragmento del mismo, un marcador detectable, un polietilenglicol (PEG), y cualquier combinación de los mismos.
9. 9. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y opcionalmente uno o más de un portador farmacéuticamente aceptable o un diluyente.
10. 10. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o composición según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno autoinmunitario en un sujeto, en el que la enfermedad autoinmunitaria es síndrome de Sjogren (SS), vasculitis asociada a ANCA (AAV), vasculitis de arteritis de células gigantes (GCA), lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, artritis reumatoide (AR), enfermedad de Crohn, miastenia grave, pénfigo vulgar, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), diabetes tipo I, enfermedad relacionada con IgG4, o cualquier combinación de los mismos.
11. 11. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición para su uso según la reivindicación 10, en el que la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistémico.
12. 12. Método para detectar niveles de expresión de IL-21 en una muestra que comprende (a) poner en contacto dicha muestra con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; y (b) detectar la unión a IL-21 en dicha muestra.
13. 13. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o composición según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedad de injerto contra huésped en un sujeto.