TW201620934A - 特異性針對il-21之結合分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供IL-21結合分子,例如抗IL-21抗體及其抗原結合片段。在某些態樣中,抗IL-21抗體及其片段可為融合瘤源鼠類單株抗體,及其人類化型式。在某些態樣中,結合分子(例如本文所提供之抗IL-21抗體及其抗原結合片段)抑制、遏止或拮抗IL-21活性。另外,本發明提供用於診斷及治療疾病或病症(例如與IL-21介導之信號轉導有關的發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症)的組合物及方法。在一個特定實施例中,本發明提供使用IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體及其抗原結合片段)治療或預防移植物抗宿主疾病(Graft-versus-host disease;GVHD)的方法。
Description
本申請案主張2014年4月8日申請之美國臨時專利申請案第61/976,684號的優先權,該案內容以引用的方式併入本文中。
隨本申請案提申之電子提交序列表的ASCII正文檔案(名稱:IL21_100P1_seqlist.txt;大小:55,898個位元組;及創建日期:2014年4月7日)之內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供特異性結合至IL-21的組合物及使用此類組合物的方法,例如用於治療或預防發炎性或自體免疫疾病或病症。
IL-21屬於細胞激素家族,包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9及IL-15,其皆結合至與共同細胞激素受體γ-鏈(γc)複合的專用(或共用)受體。此家族中的大部分細胞激素對於T細胞、B細胞及NK細胞之維持及功能而言具有極其重要的作用。IL-21的受體廣泛分佈於淋巴造血細胞及非造血細胞上,且IL-21起著多種作用。
舉例而言,IL-21與IL-21R接合引起若干種信號傳導路徑(包括Jak/STAT路徑)之活化(Davis,ID,等人,(2007)Clin Cancer Res 13,3630-3636;Fuqua,CF,等人,(2008)Cytokine 44,101-107;Habib,T,等人,(2002)Biochemistry 41,8725-8731)。更具體而言,IL-21活化
STAT1、STAT3及STAT5,如細胞內之此等分子之磷酸化增強所指示(Asao,H,等人,(2001)J Immunol 167,1-5;Diehl,SA,等人,(2008)J Immunol 180,4805-4815;Scheeren,FA,等人,(2008)Blood 111,4706-4715;Zeng,R,等人,(2007)Blood 109,4135-4142)。STAT3活化尤其已顯示在調節人類B細胞對IL-21的反應方面起著關鍵作用(Avery,DT,等人,(2008)J Immunol 181,1767-1779;Avery,DT,等人,J Exp Med 207,155-171)。
此外,IL-21有助於CD8+記憶T細胞及NK細胞之維持及功能,促進Th17及T濾泡輔助性(Tfh)細胞在小鼠(及可能人類)中之產生,及抑制調節性T細胞(Treg)之細胞產生。IL-21已顯示可調節NK細胞活性,包括對其成熟生長及溶胞活性的影響(Spolski,R,及Leonard,WJ,(2008)Curr Opin Immunol 20,295-301)。另外,IL-21已顯示可促進原代NK細胞與人類NK細胞株NK-92產生IFNγ(Kasaian,MT,等人,(2002)Immunity 16,559-569;Strengell,M,等人,(2003)J Immunol 170,5464-5469)。IL-21對非造血細胞亦具有多種影響,諸如基質細胞,其中其經由基質金屬蛋白酶(MMP)釋放而誘導發炎(Monteleone等人,(2006)Gut 55,1774-1780)。
IL-21的一種主要非冗餘作用為在體液性免疫反應期間促進B細胞活化、分化或死亡。IL-21對人類B細胞的影響已得到廣泛的研究。IL-21對B細胞存活、活化及增殖以及對B細胞分化成Ig分泌型漿細胞(PC)具有深刻的影響(Avery,DT,等人,(2008)J Immunol 181,1767-1779;Avery,DT,等人,J Exp Med 207,155-171);Bryant,VL,等人,(2007)J Immunol 179,8180-8190;Ettinger,R,等人,(2005)J Immunol 175,7867-7879;Parrish-Novak,J,等人,(2000)Nature 408,57-63;Pene,J,等人,(2004)J Immunol 172,5154-5157)。此外,IL-21產生增強為某些自體免疫疾病的特徵且可能導致自體抗體產生以及自體免疫
疾病的病理性特點。與表現共刺激分子(諸如CD40L)且產生B細胞趨向性細胞激素(諸如IL-21)之活化T細胞發生的相互作用可驅使B細胞活體內活化。
IL-21之過度表現為多種發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症的特點,且可能為自體抗體產生以及自體免疫疾病之病理性特點的重要驅動因素(Nakou等人,(2013)Clin.Exp.Rheumatol.31,172-179)。IL-21在促進體液性免疫反應方面的關鍵作用使得其成為潛在治療性干預以IL-21與病原性自體抗體之過度產生為特徵之病狀的重要焦點(Dolff等人,(2011)Arthritis Res.Ther.13,R157;Kang等人,(2011)Arthritis Res.Ther.13,R179;McGuire等人,(2011)Immunity 34,602-615;Liu等人,(2012)Arthritis Res.Ther.14,R255;Terrier等人,(2012)Arthritis Rheum.64,2001-2011;Li Q等人,(2013)PLoS One 8,e68145;Li Y等人,(2014)Neurol.Sci.35,29-34)。因此預期在自體免疫之背景下中和IL-21可影響咸信涉及免疫介導性疾病之發病機制的若干細胞群。此類疾病或病症包括(但不限於)血管炎,例如抗嗜中性球細胞質抗體(ANCA)或巨細胞動脈炎(GCA)血管炎;休格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、發炎性腸病、尋常天疱瘡、狼瘡腎炎、牛皮癬、甲狀腺炎、I型糖尿病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、僵直性脊椎炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、重症肌無力及移植物抗宿主疾病(GVHD)。
抗嗜中性球細胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)發病機制的特徵為針對蛋白酶3(PR3)及髓過氧化物酶(MPO)的主要自體抗體。產生IL-21的CD4+ T細胞在血液中擴增(Abdulahad等人,(2013)Arth Res & Ther 15:R70)。相對於健康對照者,AAV血清中存在的IL-21升高,且外源性IL-21在活體外誘導自AAV患者分離的PBMC在活體外分泌ANCA自體抗體。AAV係由肉芽腫病伴多血管炎(先前為韋格納氏肉芽
腫病(Wegener's granulomatosis))(GPA)、嗜伊紅血球肉芽腫病伴多血管炎(亦稱為徹奇-斯全司症候群(Churg-Strauss syndrome;CSS))及顯微鏡下多血管炎(MPA)組成。其通常集中在一起,但就流行病學而言,流行率及分佈不同。當前療法包括皮質類固醇、生物製劑(例如利妥昔單抗(rituximab))、免疫抑制性藥物、抗生素或血漿去除法,但對患者的預後仍然不良。尋找AAV療法的需求仍未得到滿足。
休格連氏症候群(SS)為一種自體免疫疾病,其特徵為自體抗體,諸如類風濕性因子(RF)以及針對若干種核抗原(諸如Ro/La)的自體抗體。SS為排在RA之後的第二大流行性自體免疫病狀。在美國,存在至少1百萬原發性休格連氏病患者,其中90%為女性。SS影響唾液腺,導致例如口乾及眼乾。另外,SS可影響身體的其他器官,包括腎臟、血管、肺、肝臟、胰臟、周邊神經系統及大腦且與其他自體免疫疾病有關,諸如狼瘡及類風濕性關節炎。大幅升高的血清IL-21含量與增加的IgG1及自體抗體的存在相關(Kang,2011)。在唾液腺之異位濾泡中,可發現IL-21及IL-21R含量升高(Kang,2011)。此外,IL-21已知可在NK細胞活化及細胞毒性方面起直接作用。在原發性休格連氏症候群患者的唾液腺中,發現過度表現活化受體NKp30的組織駐留型NK細胞之數量增加,且與病灶評分相關(Rusakiewicz等人,(2013)Sci.Transl.Med.5,195ra96)。此等NK細胞經由直接的NK細胞-基質細胞串擾而牽涉疾病的發病機制,導致組織損傷。IL-21及其受體亦表現於唾液腺浸潤體上(Kang,2011),且已報導產生IL-21的記憶性CCR9+ CD4+ Tfh細胞在大部分SS患者的循環系統中擴增(McGuire,2011)。另外,IL-21升高之患者中的Tfh細胞含量增加與腺體外表現有關(Szabo等人(2013)Clinical Immunol 147,95-104)。臨床前動物模型已證明IL-21抑制有益(Liu等人,(2012)J Oral Pathol Med)。SS無法治癒;當前療法的功效有限且無一者可視為疾病改善性療法。輕度至中度疾病係
藉由非處方藥,針對症狀進行治療。重度疾病在當前用羥氯喹、類固醇、甲胺喋呤、硫唑嘌呤或仿單核准適應症外之利妥昔單抗(off-label rituximab)治療。尋找SS有效療法的需求仍未得到滿足。
中和IL-21對於若干適應症(包括原發性SS及血管炎)具有潛在效用(Kang,2011;Bae等人,(2012)Allergy Asthma Immunol Res.4,351-356;Terrier,2012;Abdulahad,2013;Szabo,2013)。
IL-21對移植物抗宿主疾病(GVHD)的作用已得到廣泛研究。藉由流體動力學基因系統遞送時,IL-21已顯示可大大促進人類於小鼠異種GVHD且發現可增加B細胞、漿細胞及免疫球蛋白(Wu等人,(2013)Protein Cell 4,863-871)。反之,阻斷此系統中之IL-21據報導可減少胃腸道損傷、脾臟Th1細胞激素,及防止死亡(Hippen et al.,(2012)Blood 119,619-628)。此外,預防GVHD據報導依賴於Tregs之產生(Hippen等人,2012)。
本發明提供特異性結合至IL-21的組合物及使用此類組合物的方法,例如用於治療或預防發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症。
在一個特定態樣中,本發明提供使用包含特異性結合至IL-21之抗體或其片段的組合物治療或預防GVHD。舉例而言,在GVHD之異種小鼠模型中已顯示,抗IL-21組合物阻斷人類IL-21重新產生。該組合物當預防性與治療性給藥時,有效地抑制GVHD誘發的消耗病及死亡。
本發明之一些主要態樣概述如下。其他態樣描述於本發明之【實施方式】、實例、圖式及申請專利範圍章節中。希望本發明各章節中之說明結合其他章節閱讀。此外,本發明各章節中所述之各種實施例可以各種不同方式組合,且希望所有此類組合屬於本發明範疇
內。
本發明提供IL-21結合分子,例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段,例如能夠抑制IL-21與其受體之相互作用及抑制IL-21活性的單株抗體。
在一些情況下,一種經分離之結合分子或其抗原結合片段特異性結合至IL-21抗原決定基,其中該結合分子與包含19E3、9F11、8B6或9H10之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的抗體或其抗原結合片段特異性結合至相同的IL-21抗原決定基。
在一些情況下,一種經分離之結合分子或其抗原結合片段特異性結合至IL-21且競爭性地抑制包含19E3、9F11、8B6或9H10之VH及VL的抗體或其抗原結合片段結合IL-21。在一些情況下,19E3之VH及VL分別包含SEQ ID NO:6及11,9F11之VH及VL分別包含SEQ ID NO:28及33,8B6之VH及VL分別包含SEQ ID NO:42及47,且9H10之VH及VL分別包含SEQ ID NO:52及57。
在一些情況下,特異性結合至IL-21的經分離之結合分子或其抗原結合片段包含抗體VL,其中該VL包含VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13及14;SEQ ID NO:34、35及36;SEQ ID NO:48、49及50或SEQ ID NO:58、59及60一致,或除一或多個VL-CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
在一些情況下,特異性結合至IL-21的經分離之結合分子或其抗原結合片段包含抗體VH,其中該VH包含VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:7、8及9;SEQ ID NO:29、30及31;SEQ ID NO:43、44及45或SEQ ID NO:53、54及55一致,或除一或多個VH-CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
在一些情況下,特異性結合至IL-21的經分離之結合分子或其抗原結合片段包含抗體VL,其中該VL包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:57。
在一些情況下,特異性結合至IL-21的經分離之結合分子或其抗原結合片段包含抗體VH,其中該VH包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:52。
在一些情況下,結合分子或其片段包含抗體或其抗原結合片段。
在一些情況下,特異性結合至IL-21的經分離之抗體或其抗原結合片段包含VL及VH,該VL及VH包含VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13、14、7、8及9;SEQ ID NO:34、35、36、29、30及31;SEQ ID NO:48、49、50、43、44及45;或SEQ ID NO:58、59、60、53、54及55一致,或除一或多個CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
在一些情況下,經分離之抗體或其抗原結合片段特異性結合至IL-21,其中該抗體或抗原結合片段包含VH及VL,其中該VH及VL分別包含分別與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:
21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:37及40、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:47,以及SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:57。
在一些情況下,抗體或抗原結合片段包含VH及VL,其中該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO:19且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO:21。在一些情況下,抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區或其片段。在一些情況下,重鏈恆定區或其片段為IgG恆定區。在一些情況下,相對於野生型IgG恆定域,IgG恆定域包含一或多個胺基酸取代,其中相較於具有野生型IgG恆定域之IgG的半衰期,經修飾之IgG的半衰期延長。在一些情況下,IgG恆定域包含位置251至257、285至290、308至314、385至389及428至436之胺基酸殘基的一或多個胺基酸取代,其中胺基酸位置係根據如Kabat中所列之EU索引編號。在一些情況下,至少一個IgG恆定域胺基酸取代係選自由以下組成之群:(a)Kabat位置252之胺基酸經酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)或蘇胺酸(T)取代,(b)Kabat位置254之胺基酸經蘇胺酸(T)取代,(c)Kabat位置256之胺基酸經絲胺酸(S)、精胺酸(R)、麩醯胺酸(Q)、麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)或蘇胺酸(T)取代,(d)Kabat位置257之胺基酸經白胺酸(L)取代,(e)Kabat位置309之胺基酸經脯胺酸(P)取代,(f)Kabat位置311之胺基酸經絲胺酸(S)取代,(g)Kabat位置428之胺基酸經蘇胺酸(T)、白胺酸(L)、苯丙胺酸(F)或絲胺酸(S)取代,(h)Kabat位置433之胺基酸經精胺酸(R)、絲胺酸(S)、異白胺酸(I)、脯胺酸(P)或麩醯胺酸(Q)取代,
(i)Kabat位置434之胺基酸經色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)、絲胺酸(S)、組胺酸(H)、苯丙胺酸(F)或酪胺酸取代,及(j)兩種或兩種以上取代之組合。
在一些情況下,相對於野生型人類IgG恆定域,人類IgG恆定域包含Kabat位置252、254及256的胺基酸取代,其中(a)Kabat位置252之胺基酸經酪胺酸(Y)取代,(b)Kabat位置254之胺基酸經蘇胺酸(T)取代,及(c)Kabat位置256之胺基酸經麩胺酸(E)取代。
在一些情況下,人類IgG恆定域為人類IgG1恆定域。
在一些情況下,重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24。在一些情況下,輕鏈恆定區係選自由人類κ恆定區及人類λ恆定區組成之群。在一些情況下,輕鏈恆定區為人類κ恆定區。在一些情況下,重鏈及輕鏈分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:22,或SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:26。
在一些情況下,抗體或其抗原結合片段為鼠類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、多特異性抗體或其抗原結合片段。在一些情況下,抗原結合片段為Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv及sc(Fv)2。
在一些情況下,抗體或其抗原結合片段可結合至人類IL-21及食蟹獼猴(獼猴)IL-21。
在一些情況下,抗體或其片段不特異性結合至人類IL-2、IL-4、IL-7、IL-9或IL-15。
在一些情況下,抗體或其片段抑制IL-21結合至IL-21受體。
在一些情況下,抗體或其片段為IL-21活性拮抗劑。
在一些情況下,抗體或其片段可抑制IL-21介導人類周邊血液單
核細胞(PBMC)中之STAT3磷酸化。
在一些情況下,抗體或其片段可抑制人類及食蟹獼猴IL-21介導人類周邊血液單核細胞(PBMC)中之STAT3磷酸化。
在一些情況下,抗體或其片段可抑制IL-21介導NK細胞產生干擾素-γ(IFN-γ)。
在一些情況下,抗體或其片段可抑制人類及食蟹獼猴IL-21介導NK細胞產生干擾素-γ(IFN-γ)。在一些情況下,NK細胞為經培養之NK-92細胞。
在一些情況下,抗體或其片段可抑制IL-21介導B細胞分化成漿細胞。
在一些情況下,抗體或其片段可抑制人類及食蟹獼猴IL-21介導受刺激之B細胞分化成漿細胞。
在一些情況下,抗體或其片段可抑制CD4+ T細胞活化型B細胞分化成漿細胞。
在一些情況下,抗體或其抗原結合片段以藉由約100pM至約0.1pM之解離常數(KD)的親和力特徵特異性結合人類IL-21,如在動力學排除分析(Kinetic Exclusion Assay;KinExA)3000平台上所量測。
在一些情況下,抗體或其抗原結合片段以藉由約100pM至約0.1pM之解離常數(KD)的親和力特徵特異性結合食蟹獼猴IL-21,如在動力學排除分析(KinExA)3000平台上所量測。
在一些情況下,抗體或其抗原結合片段針對人類IL-21的KD為約0.515pM且針對食蟹獼猴IL-21的KD為約0.352pM。
在一些情況下,抗體或其片段係與選自由以下組成之群的藥劑結合:抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質、酵素、脂質、生物反應調節劑、醫藥劑、淋巴激素、異源抗體或其片段、可偵測標記、聚乙二醇(PEG),及兩種或兩種以上之任何該等藥劑之組合。
在一些情況下,組合物包含如本文所述的抗體或其片段,及載劑。載劑較佳為醫藥學上可接受之載劑。
在一些情況下,經分離之聚核苷酸包含編碼抗體VL的核酸,其中該VL包含VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13及14;SEQ ID NO:34、35及36;SEQ ID NO:48、49及50;或SEQ ID NO:58、59及60一致,或除一或多個VL-CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
在一些情況下,經分離之聚核苷酸包含編碼抗體VH的核酸,其中該VH包含VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:7、8及9;SEQ ID NO:29、30及31;SEQ ID NO:43、44及45;或SEQ ID NO:53、54及55一致,或除一或多個VH-CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
在一些情況下,經分離之聚核苷酸包含編碼抗體VL的核酸,其中該VL包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:57。在一些情況下,經分離之聚核苷酸包含編碼抗體VH的核酸,其中該VH包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:52。
在一些情況下,本文所述之聚核苷酸包含編碼抗體或其抗原結合片段的核酸,該抗體或其抗原結合片段包含可特異性結合至IL-21的本文所述VH或VL。在一些情況下,該抗體或其抗原結合片段與包
含19E3、9F11、8B6或9H10之VH及VL的抗體或其抗原結合片段特異性結合至相同的抗原決定基。
在一些情況下,本文所述之聚核苷酸包含編碼抗體或其抗原結合片段的核酸,該抗體或其抗原結合片段包含可結合至人類及食蟹獼猴IL-21的VH或VL。
在一些情況下,提供包含本文所述之聚核苷酸的載體。
在一些情況下,提供包含本文所述之聚核苷酸或本文所述之載體的組合物。
在一些情況下,提供編碼如本文所述之結合分子或其抗原結合片段的聚核苷酸或聚核苷酸組合。
在一些情況下,提供編碼本文所述之抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸或聚核苷酸組合。
在一些情況下,組合物包含含有編碼VH之核酸的聚核苷酸,及含有編碼VL之核酸的聚核苷酸,其中該VL及VH包含VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13、14、7、8及9;SEQ ID NO:34、35、36、29、30及31;SEQ ID NO:48、49、50、43、44及45;或SEQ ID NO:58、59、60、53、54及55一致,或除一或多個CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
在一些情況下,組合物包含含有編碼VH之核酸的聚核苷酸,及含有編碼VL之核酸的聚核苷酸,其中該VL及VH分別包含分別與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:37及
40、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:47,以及SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:57。
在一些情況下,VH及VL係由與選自由以下組成之群之參考核酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的核酸序列編碼:SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:46,或SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:56。
在一些情況下,包含編碼VH之核酸的聚核苷酸與包含編碼VL之核酸的聚核苷酸處於同一載體中。在一些情況下,提供如本文所述的載體。
在一些情況下,包含編碼VH之核酸的聚核苷酸與包含編碼VL之核酸的聚核苷酸處於不同載體中。在一些情況下,提供如本文所述的載體。
在一些情況下,如本文所述之組合物包括包含可特異性結合至IL-21之該VH及該VL的抗體或其抗原結合片段。在一些情況下,包含VH或VL的抗體或其抗原結合片段可結合至人類及食蟹獼猴IL-21。在一些情況下,該抗體或其抗原結合片段可與包含19E3、9F11、8B6或9H10之VH及VL的抗體或其抗原結合片段特異性結合至相同的抗原決定基。
在一些情況下,提供包含如本文所述之聚核苷酸的宿主細胞、如本文所述的組合物,或如本文所述的該或該等載體。
在一些情況下,產生如本文所述之抗體或抗原結合片段的方法包含(a)培養如本文所述之細胞;及(b)分離抗體或其抗原結合片段。
在一些情況下,提供診斷性試劑或包含本文所述之抗體或抗原結合片段的套組。
在一些情況下,用於減少IL-21誘導之STAT3於表現IL-21R之細胞中之磷酸化的方法包括使細胞與如本文所述之結合分子或其抗原結
合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物接觸。
在一些情況下,用於減少IL-21介導NK細胞產生IFNγ的方法包括使NK細胞與如本文所述之結合分子或其抗原結合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物接觸。
在一些情況下,用於減少IL-21介導未處理或記憶B細胞分化成漿細胞的方法包括使未處理或記憶B細胞與如本文所述之結合分子或其抗原結合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物接觸。
在一些情況下,漿細胞分化被CD4+ T細胞活化。
在一些情況下,治療個體之發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症的方法包括向需要治療之個體投與有效量之如本文所述之結合分子或其抗原結合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物。
在一些情況下,預防個體之發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症的方法包括向易患此疾病或病症之個體投與有效量之如本文所述之結合分子或其抗原結合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物。
在一些情況下,自體免疫疾病為休格連氏症候群(SS)、血管炎(ANCA/GCA)、全身性紅斑狼瘡或狼瘡腎炎、類風濕性關節炎(RA)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、重症肌無力或其任何組合。
在一些情況下,免疫介導性疾病或病症為GVHD。
在一些情況下,預防GVHD的方法包括減少或消除GVHD之症狀。
在一些情況下,所減少或消除之GVHD症狀為皮疹、水泡、噁心、食慾喪失、嘔吐、進食後早飽、腹瀉、腹部不適、腹脹、便血、
黃疸、尿赤、上腹部不適、水浮腫(或腫脹)、關節炎類似症狀、疼痛及僵硬、乾眼、眼發炎、口瘡、持久性咳嗽、呼吸短促、呼吸困難。
在一些情況下,抑制因GVHD所致之體重減輕的方法包括向患有GVHD或易患GVHD的個體投與如本文所述之結合分子或其抗原結合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物。
在一些情況下,用於減輕因GVHD所致之貧血的方法包括向患有GVHD或易患GVHD的個體投與如本文所述之結合分子或其抗原結合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物。
在一些情況下,抑制T細胞擴增的方法包括向患有GVHD或易患GVHD之個體投與如本文所述之結合分子或其抗原結合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物。
在一些情況下,用於減少患有GVHD或易患GVHD之個體中之細胞激素的方法包括向該個體投與如本文所述之結合分子或其抗原結合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物。
在一些情況下,偵測樣品中之IL-21表現量的方法包括(a)使該樣品與如本文所述之結合分子或其抗原結合片段、如本文所述之抗體或其抗原結合片段或如本文所述之組合物接觸及(b)偵測與該樣品中之IL-21的結合。
圖1A顯示鼠類單株抗體9F11(VH:SEQ ID NO:28,VL:SEQ ID NO:33)及三種人類化變異體(VH-4及VH-11:SEQ ID NO:41,VH-6:SEQ ID NO:42,VL-4及VL-6:SEQ ID NO:43,VL-11:SEQ ID NO:44)之可變區比對。人類與鼠類之間於構架區中不同的殘基加有雙下劃線。鼠類構架區中之回復突變為粗體,且CDR區域加有下劃線。圖1B顯示鼠類單株抗體19E3(VH:SEQ ID NO:6,VL:SEQ ID NO:11)及三種人類化VH變異體(SEQ ID NO 61、62及63)及兩種人類化VL變
異體(SEQ ID NO:64及65)之可變區比對。人類與鼠類之間於構架區中不同的殘基加有雙下劃線。鼠類構架區中之回復突變為粗體,且CDR區域加有下劃線。
圖2A及圖2B顯示500fM及50pM濃度之溶液相K44VHa-N56Q(MEDI7169)IgG與人類(圖2A)及食蟹獼猴(圖2B)IL-21競爭的KinExA雙重曲線擬合。
圖3A顯示人類或食蟹獼猴IL-21對人類PBMC中之STAT3磷酸化的影響。圖3B顯示人類及食蟹獼猴IL-21誘導人類PBMC中之STAT3磷酸化上調被抗IL-21抗體K2Ha-N56Q(倒三角形)、K44VHa-N56Q(MEDI7169)(菱形)及K44VHa6-N56Q(圓形)抑制。
圖4顯示人類(圖4A)及食蟹獼猴IL-21(圖4B)誘導NK-92細胞產生IFNγ受到抑制。
圖5顯示藉由人類(圖5A)或食蟹獼猴(圖5B)IL-21發生之IL-21誘導人類B細胞分化成漿細胞受到抑制。與對照相比,曲線顯示IgD- CD38hi之含量降低。圖5C顯示在對照條件下,IL-21、抗CD40及抗IgM刺激使得截至第6天的Ig產生在30-40μg/ml範圍內,且19E3.1及9F11.1抑制Ig產生。
圖6A顯示B細胞與活化CD4+ T細胞之共培養導致IgD- CD38hi PC群體之出現,截至第7天,其中68.5%之CD19+細胞表現此PC表型。圖6B及圖6C顯示添加19E3.1或9F11.1抑制PC分化。
圖7顯示抗IL21抗體(19E3.1)阻斷IL-21誘導T細胞擴增。人類T細胞係用重組人類IL-21與抗CD3之組合刺激。抗體19E3.1在指定濃度下添加且在第四天量化T細胞擴增。所有條件雙重複運作。對兩個獨特供者進行實驗。所示為一個代表性供者。
圖8顯示K44VHa-N56Q(MEDI7169)藉由限制CD4+ T細胞擴增來阻斷GVHD誘發性消耗病。研究第0天,將供者1之PBMC(12.71×106)
或供者2之PBMC(13.46×106)轉移至NOD/SCID/γc小鼠中。小鼠接受200μg對照mAb(圖8A)或K44VHa-N56Q(圖8B),一週給予3次,第-1天開始。小鼠每隔一週放血且藉由流式細胞術評估以測定人類CD45+細胞的數目及表型。圖8C及圖8D顯示自分別接受對照mAB或K44VHa-N56Q之小鼠所收集的人類CD45+細胞之百分比(自第21天開始,供者1;n=3(對照mAb),n=5(K44VHa-N56Q))。圖8E及圖8F顯示分別接受對照mAB或K44VHa-N56Q之小鼠之人類CD45+部分內的CD4+或CD8+細胞之百分比(自第35天開始,供者2;n=10(對照mAb+PBS媒劑)/n=5(K44VHa-N56Q))。所有條件均使100μL血液染色且在流式細胞儀上收集相同的時間長度,因此所顯示的事件數目反映相對細胞數目。第21天自血液收集之人類CD45+細胞之絕對數目的平均值±標準差對於供者1而言為n=3(729,111±113,899)(對照mAb)相對於n=5(39,104±5,159)(K44VHa-N56Q),P<0.0357。對於供者2而言,對照mAb與PBS組合,n=10(237,294±35,628)相對於K44VHa-N56Q,n=5(14,980±2,275),P=0.0007。
圖9顯示K44VHa-N56Q可逆地抑制受者小鼠中之人類細胞擴增。研究第0天,將供者2之PBMC(13.46×106)轉移至NOD/SCID/γc小鼠中。小鼠接受200μL PBS媒劑(方形),或200μg K44VHa-N56Q(三角形)或對照mAb(圓形),一週給予3次,第-1天開始,直至第44天。小鼠每隔一週放血且藉由流式細胞術評估以測定人類CD45+細胞的數目。資料指示所收集之人類細胞數目。所有條件均使100μL血液染色且在流式細胞儀上收集相同體積,因此所顯示的事件數目反映相對細胞數目。
圖10顯示K44VHa-N56Q預防GVHD誘發性體重減輕及死亡。研究第0天,將供者1之PBMC(12.71×106)轉移至NOD/SCID/γc小鼠中且小鼠隨後出現體重減輕(圖10A)及死亡(圖10B)。K44VHa-N56Q(三角
形)或對照mAb(填充圓)一週給予3次,每隻小鼠200μg,第-1天開始,直至第31天。未處理(空心圓)動物不接受人類細胞且不接受mAb。存活率百分比表示小鼠死亡或達到20%體重減輕及處死時。所示為兩個不同供者PBMC之兩個獨立實驗之一。
圖11顯示K44VHa-N56Q抑制細胞增殖及細胞激素產生。研究第0天,將供者2之PBMC(13.46×106)轉移至NOD/SCID/γc小鼠中且注射200μg K44VHa-N56Q或對照mAb,一週3次,第-1天開始。將小鼠放血且使用Millipore之MILLIPLEX MAP系統人類Th17套組評估血清中之細胞激素含量以確定細胞激素之存在。所示為IL-21(圖11A)、干擾素γ(圖11B)、腫瘤壞死因子α(圖11C)、IL-9(圖11D)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(圖11E)、IL-10(圖11F)及IL-5(圖11G)之血清含量(pg/mL)。
圖12顯示抗IL-21抑制細胞增殖及細胞激素產生具可逆性。第0天將供者1之PBMC(12.71×106)轉移至NOD/SCID/γc小鼠中且注射200μg K44VHa-N56Q(閉合符號)或對照mAb(開口符號),一週3次,第-1天開始,直至第31天,此時中止K44VHa-N56Q。第15、28、43及57天將小鼠放血,且使用Millipore之MILLIPLEX MAP系統人類Th17套組測定此等時間點時血清中之干擾素γ(圖12A)、腫瘤壞死因子α(圖12B)及IL-10(圖12C)的量。第7、21、35、51及57天亦將小鼠放血,且測定人類CD45+細胞數目(圖12D)。接受對照mAb的所有小鼠截至研究第28天均死亡;因此,對於此等動物而言,細胞激素僅存在一個時間點。
圖13顯示治療性K44VHa-N56Q預防個體患GVHD。研究第0天將供者1之PBMC(12.0×106)轉移至NOD/SCID/γc小鼠中且監測存活率。對照mAb始於研究第7天(圓形),K44VHa-N56Q始於研究第7天(三角形),或K44VHa-N56Q始於研究第14天(倒三角形),一週給予3次,每
隻小鼠200μg。若小鼠經測定失去20%體重或若小鼠消瘦/瀕死或以其他方式處於疼痛或痛苦中,則將小鼠安樂死。死亡與人道安樂死同義使用,用於追蹤存活之目的。
圖14顯示K44VHa-N56Q可預防GVHD誘發性貧血。注射小鼠且處理,如針對圖13所述。小鼠為未處理的,亦即不給予細胞(星號),或給予人類PBMC,隨後在研究第7天開始給予對照mAb(圓形)、在研究第7天開始給予K44VHa-N56Q(三角形),或在研究第14天開始給予K44VHa-N56Q(倒三角形),一週給予3次,每隻小鼠200μg。1:10稀釋自眶後竇收集的肝素化全血樣品,隨後用自動化血液學分析儀(Sysmex XT-2000iv)分析。所得總白血球(圖14A)及紅血球計數(圖14C)、血容比(圖14B)及血紅蛋白(圖14D)值係乘以稀釋因數十。
本發明提供結合至IL-21的分子及其抗原結合片段。在一些實施例中,此類分子為特異性結合至IL-21的抗體及其抗原結合片段。亦提供相關聚核苷酸、包含抗IL-21抗體或其抗原結合片段的組合物,及產生抗IL-21抗體及抗原結合片段的方法。另外提供使用新穎抗IL-21抗體的方法,諸如治療個體之發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症的方法;及診斷性用途。
為了使本發明可更容易理解,首先對某些術語進行定義。在通篇【實施方式】中,闡述其他定義。
除非上下文另外明確指示,否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用,單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。術語「一」以及術語「一或多個/種」及「至少一個/種」在本文中可互換使用。
此外,「及/或」視為特定揭示兩個指定特點或組件中之每一者
(在另一者存在或不存在下)。因此,諸如「A及/或B」之片語中所用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣,諸如「A、B及/或C」之片語中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之每一者:A、B及C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A及C;A及B;B及C;A(單獨);B(單獨);及C(單獨)。
除非另外定義,否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明相關之一般技術者通常所理解相同之含義。舉例而言,the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press;及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修訂,2000,Oxford University Press,為熟習此項技術者提供本發明中所用之許多術語的通用詞典。
單位、前綴及符號以其國際單位制(Système International de Unites;SI)接受形式表示。數值範圍包括界定該範圍之數字。除非另外指示,否則胺基酸序列以胺基至羧基取向自左向右書寫。本文所提供之標題不限制本發明之各種態樣或實施例,其可為參考說明書之總體性概述。因此,下文緊接著定義之術語參考整個說明書來更完全地定義。
每當實施例使用語言「包含」描述時,亦提供以術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」所述之其他類似實施例。
胺基酸在本文中可由其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名法委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所推薦之單字母符號來提及。-核苷酸同樣由其通常接受之單字母代碼來提及。
術語「IL-21」係指細胞激素介白素-21,及/或其活性片段。IL-
21結合至免疫系統之各種不同細胞上的IL-21受體,從而誘導彼等細胞中之信號轉導,如本文中別處所述。IL-21已用最常見的動物模型系統判別特徵。人類IL-21之cDNA及胺基酸序列可發現於例如GenBank寄存編號BC066260.1(SEQ ID NO:1)及AAH69124.1(SEQ ID NO:2)。食蟹獼猴(Macaca fascicularis)IL-21之cDNA及胺基酸序列可發現於美國專利申請公開案第2008-0267910 A1(以全文引用之方式併入本文中)號,例如SEQ ID NO:3(SEQ ID NO:3)及4(SEQ ID NO:4)。
術語「抑制」、「阻斷」及「抑止」在本文中可互換使用且係指生物活性之任何統計學顯著性降低,包括活性完全阻斷。舉例而言,「抑制」可指生物活性降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。因此,當應用術語「抑制」或「抑止」描述例如對IL-21信號轉導路徑的影響(例如在IL-21存在下對表現IL-21受體(IL-21R)之細胞中之信號轉導的影響)((例如STAT3之磷酸化、NK細胞產生干擾素-γ(IFN-γ)、B細胞分化成漿細胞,或IL-21驅動人類未處理CD4+ T細胞增殖受到抑制)時,該術語係指IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)能夠經由IL-21R而在統計學上顯著降低IL-21誘導性信號轉導(相對於未處理(對照)細胞中之信號轉導)。表現IL-21R的細胞可為天然產生之細胞或細胞株(例如T細胞、B細胞、天然殺手(NK)細胞、樹突狀細胞或其他類型的淋巴細胞)或可藉由將編碼IL-21R的核酸引入宿主細胞內而重組產生。在一個實施例中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可將表現IL-21R之細胞中的IL-21介導性信號轉導抑制至少10%或至少20%或至少30%或至少40%或至少50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%或約100%,如藉由例如流式細胞術、西方墨點法、ELISA或下文實例中所述的其他分析法測定。
如本文中可互換使用的術語「抗體」或「免疫球蛋白」包括完
整抗體及其任何抗原結合片段或單鏈。
典型抗體包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域C1。VH及VL區可進一步再分成高變區,稱為互補決定區(CDR),其中散置有更保守的區域,稱為構架區(FW)。每個VH及VL由三個CDR及四個FW構成,自胺基端至羧基端依以下順序排列:FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子,包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。本發明之例示性抗體包括融合瘤產生的鼠類單株抗體19E3、9F11、8H10及8B6;此等抗體之人類化、親和力最佳化、生殖系化及/或其他型式,血清半衰期最佳化抗IL-21 YTE抗體(例如K44VHa-N56Q K44VHa6-N56Q或K2Ha-N56Q)。
術語「生殖系化」意謂抗體中特定位置之胺基酸回復突變為生殖系中之彼等胺基酸。
術語「抗體」可指一種免疫球蛋白分子,其經由免疫球蛋白分子之可變區內的至少一個抗原識別位點來識別且特異性結合至標靶,諸如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂質或前述者之組合。如本文所用,術語「抗體」包含完整多株抗體、完整單株抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、單鏈Fv(scFv)突變體、多特異性抗體(諸如由至少兩種完整抗體產生的雙特異性抗體)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、包含抗體之抗原決定部分的融合蛋白,及包含抗原識別位點的任何其他經修飾之免疫球蛋白分子,只要該等抗體展現所需生物活性。抗體可基於免疫球蛋白重鏈恆定域身分
(分別稱為α、δ、ε、γ及μ)而為免疫球蛋白之五個主要類別:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,或其亞類(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)中的任一者。免疫球蛋白之不同類別具有不同且熟知之亞單元結構及三維組態。抗體可為裸抗體或與諸如毒素、放射性同位素等其他分子結合。
「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體為抑制或減少其所結合之抗原(諸如IL-21)之生物活性的抗體。在某些態樣中,阻斷抗體或拮抗劑抗體實質上或完全抑制抗原之生物活性。生物活性宜降低10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。
術語「IL-21抗體」或「結合至IL-21之抗體」或「抗IL-21」係指能夠以足夠親和力結合IL-21的抗體,使得抗體適用作靶向IL-21的治療劑或診斷性試劑。抗IL-21抗體與無關非IL-21蛋白質結合的程度小於抗體與IL-21結合的約10%,如藉由例如放射免疫分析(RIA)、BIACORE®(使用重組IL-21作為分析物及抗體作為配位體,或反之亦然)、KINEXA®或此項技術中已知的其他結合分析法所量測。在某些實施例中,結合至IL-21之抗體的解離常數(KD)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、10pM、1pM或0.1pM。
術語「抗原結合片段」係指完整抗體的一部分且指完整抗體的互補決定可變區。全長抗體之片段可為抗體之抗原結合片段。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體(例如ScFvs)及由抗體片段形成之多特異性抗體。
「單株抗體」(mAb)係指涉及單一抗原決定子或抗原決定基之高度特異性識別及結合的均質抗體。此與多株抗體形成對比,多株抗體典型地包括針對不同抗原決定子之不同抗體。術語「單株抗體」包含完整與全長單株抗體以及抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分之融合蛋白,及包含抗原識別位點之
任何其他經修飾之免疫球蛋白分子。此外,「單株抗體」係指以任何數目個方式產生的此類抗體,包括(但不限於)藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現及轉殖基因動物。
術語「人類化抗體」係指來源於非人類(例如鼠類)免疫球蛋白的抗體,其已經工程改造以含有最小非人類(例如鼠類)序列。典型地,人類化抗體為人類免疫球蛋白,其中互補決定區(CDR)中的殘基置換為具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)之CDR的殘基(Jones等人,1986,Nature,321:522-525;Riechmann等人,1988,Nature,332:323-327;Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536)。在一些情況下,人類免疫球蛋白之Fv構架區(FW)殘基置換為具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種之抗體中的相應殘基。
人類化抗體可藉由Fv構架區及/或所置換之非人類殘基內之其他殘基之取代而進一步修飾,以優化及最佳化抗體特異性、親和力及/或能力。一般而言,人類化抗體將包含至少一個及典型為兩個或三個含有對應於非人類免疫球蛋白之所有或實質上所有CDR區的實質上所有可變域,而所有或實質上所有FR區域為人類免疫球蛋白共同序列之彼等區域。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區或域(Fc)(典型地為人類免疫球蛋白恆定區或域)之至少一部分。用於產生人類化抗體之方法實例描述於美國專利第5,225,539號或第5,639,641號中。
抗體之「可變區」係指單獨或組合之抗體輕鏈可變區或抗體重鏈可變區。重鏈及輕鏈的可變區各由四個框架區(FW)組成,此等四個框架區經三個互補決定區(亦稱為高變區)連接。各鏈中的CDR藉由FW區緊密地結合在一起,且與來自其他鏈之CDR一起促進抗體之抗原結合位點的形成。確定CDR的技術至少有兩種:(1)基於交叉物種序列變化性之方法(亦即Kabat等人,Sequences of Proteins of
Immunological Interest,(第5版,1991,國家健康研究院(National Institutes of Health),Bethesda Md.));及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al-lazikani等人,(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。另外,該兩種方法有時組合用於此項技術中來確定CDR。
提及可變域中之殘基(大致為輕鏈之殘基1至107及重鏈之殘基1至113)時,一般使用Kabat編號系統(例如Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第5版,國家健康研究院公共健康服務部,Bethesda,Md.(1991))。
如Kabat之胺基酸位置編號係指Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,國家健康研究院公共健康服務部,Bethesda,Md.(1991)中之用於編譯抗體之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統,實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FW或CDR之縮短或插入的更少或額外胺基酸。舉例而言,重鏈可變域可包括位於H2之殘基52之後的單一胺基酸插入(殘基52a,根據Kabat)及重鏈FW殘基82後所插入之殘基(例如殘基82a、82b及82c等,根據Kabat)。
所指定抗體之殘基之Kabat編號可藉由比將抗體序列與「標準」Kabat編號序列在同源區域來確定。而Chothia提及結構環之位置(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。使用Kabat編號規
約進行編號時,Chothia CDR-H1環末端在H32與H34之間變化,此視環的長度而定(此原因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B;若既不存在35A、亦不存在35B,則環末端位於32;若僅存在35A,則環末端位於33;若35A與35B均存在,則環末端位於34)。AbM高變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷,且用於Oxford Molecular的AbM抗體模型化軟體中。參見表1。
IMGT(ImMunoGeneTics)亦為包括CDR之免疫球蛋白可變區提供一種編號系統。參見例如Lefranc,M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.27:55-77(2003),該文獻以引用的方式併入本文中。IMGT編號系統係基於超過5,000個序列之比對、結構資料及高變環之特徵分析且允許所有物種之可變區及CDR區容易比較。根據IMGT編號方案,VH-CDR1處於位置26至35,VH-CDR2處於位置51至57,VH-CDR3處於位置93至102,VL-CDR1處於位置27至32,VL-CDR2處於位置50至52,且VL-CDR3處於位置89至97。
如通篇說明書中所用,所述VH CDR序列對應於經典的Kabat編號位置,亦即Kabat VH-CDR1處於位置31至35、VH-CDR2處於位置50至65,且VH-CDR3處於位置95至102。VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3亦對應於經典的Kabat編號編號位置,亦即分別為位置24至34、50至56及89至97。
術語「人類抗體」意謂由人類產生的抗體,或胺基酸序列與人類產生之抗體對應、使用此項技術中已知之任何技術製得的抗體。人類抗體之此定義包括完整或全長抗體、其片段,及/或包含至少一種人類重鏈及/或輕鏈多肽的抗體,例如包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。
術語「嵌合抗體」係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列來源於兩種或兩種以上物種的抗體。通常,輕鏈與重鏈之可變區對應於來
源於具有所需特異性、親和力及能力之一種哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)之抗體的可變區,而恆定區與來源於另一物種(通常為人類)之抗體中之序列同源以避免在該物種中引發免疫反應。
術語「YTE」或「YTE突變體」係指IgG1 Fc中之突變,此突變引起與人類FcRn之結合增強且使具有此突變之抗體的血清半衰期延長。YTE突變體包含引入IgG1重鏈中之三種突變之組合:M252Y/S254T/T256E(EU編號,Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,美國國家健康研究院公共健康服務部,Washington,D.C.)。參見美國專利第7,658,921號,該專利以引用的方式併入本文中。YTE突變體已顯示可使抗體的血清半衰期延長為相同抗體之野生型形式的約四倍(Dall'Acqua等人,J.Biol.Chem.281:23514-24(2006);Robbie等人,(2013)Antimicrob.Agents Chemother.57,6147-6153)。亦參見美國專利第7,083,784號,該專利以全文引用的方式併入本文中。
「結合親和力」通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用力之總和。除非另有說明,否則如本文所用,「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(KD)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。低親和力抗體一般緩慢結合抗原且傾向於容易分解,而高親和力抗體一般較快結合抗原且傾向於較長時間保持結合狀態。此項技術中已知多種量測結合親和力的方法,其中任一者可用於本發明之目的。
除非另有說明,否則「效能」通常以IC50值(nM或pM)表示。IC50為抗體分子之中值抑制濃度。在功能分析中,IC50為使生物反應降低其最大值之50%的濃度。在配位體結合研究中,IC50為使受體結合減
少最大特異性結合水準之50%的濃度。IC50可藉由此項技術中已知之任何數目個方式計算。
相較於參考抗體,本發明之抗體或多肽的效能提高倍數可為至少約2倍、至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍,或至少約180倍或超過180倍。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式,其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如天然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)的分泌性Ig使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至攜帶抗原之靶細胞且隨後用細胞毒素殺死靶細胞。導向靶細胞表面的特異性高親和力IgG抗體「武裝」細胞毒性細胞且為此類殺滅所絕對需要的。靶細胞在細胞外溶胞,需要直接的細胞與細胞接觸且不涉及補體。預期除抗體之外,能夠特異性結合至攜帶抗原之靶細胞的包含Fc區之其他蛋白質(特定而言,Fc融合蛋白)將能夠實現細胞介導之細胞毒性。為了簡單起見,由Fc融合蛋白活性引起的細胞介導性細胞毒性在本文中亦稱作ADCC活性。
「分離」之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物為呈自然界中未發現之形式的多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物。分離之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物包括已在一定程度上純化,使得其不再呈自然界中所發現之形式的彼等物。在一些實施例中,分離之抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物為實質上純的。
「個體(subject)」或「個體(individual)」或「動物」或「患者」
或「哺乳動物」意謂需要診斷、預後或治療的任何個體,尤其哺乳動物個體。哺乳動物個體包括人類、馴養動物、農畜、運動動物及動物園動物,包括例如人類、非人類靈長類動物、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、熊等。
術語「醫藥組合物」係指一種製劑,其呈允許活性成分之生物活性得到有效發揮之形式,且其不含對組合物所投與之個體具有不可接受之毒性的其他組分。此類組合物可為無菌的。
如本文所揭示的抗體「有效量」為足以進行具體所述用途的量。「有效量」可憑經驗且以與所述用途相關的常規方式確定。
「標記」一詞當本文中使用時係指與抗體直接或間接結合以便產生「經標記」抗體的可偵測化合物或組合物。標記本身可偵測(例如放射性同位素標記或螢光標記),或在酶標記之情況下,可催化受質化合物或組合物發生可偵測的化學變化。
諸如「治療」或「治療」或「欲治療」或「緩解」或「欲緩解」之術語係指治癒、減緩、減輕及/或停止所診斷之病理性病狀或病症的症狀及/或進展的治療性措施。因此,需要治療者包括已患病症者。在某些實施例中,若患者顯示例如與疾病或病症有關之症狀的完全、部分或短暫減輕或消除,則個體的發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症得到本文中所提供之方法的成功「治療」。
「預防」係指防止及/或減緩所靶向病理性病狀或病症發展的預防性或防治性措施。因此,需要預防者包括傾向於患病或易患病者。在某些實施例中,若患者出現(例如暫時或永久性)與疾病或病症有關的症狀較少或較輕,或與疾病或病症有關的症狀發作晚於未接受本發明之方法的患者,則根據本文所提供之方法成功地預防發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症。
如本文所用,「聚核苷酸」可包括一或多種「核酸」、「核酸分
子」或「核酸序列」且係指具有任何長度之核苷酸聚合物,且包括DNA及RNA。聚核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基,及/或其類似物,或可藉由DNA或RNA聚合酶而併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包括經修飾之核苷酸,諸如甲基化核苷酸及其類似物。前述描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸,包括RNA及DNA。
術語「載體」意謂一種構築體,其能夠遞送且在一些實施例中能夠在宿主細胞中表現一或多種所關注基因或序列。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑結合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體,及某些真核細胞,諸如生產細胞。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指任何長度之胺基酸聚合物。聚合物可為線性或分枝聚合物,其可包含經修飾之胺基酸,且非胺基酸可間雜於其中。該等術語亦涵蓋已經天然修飾或藉由干預修飾之胺基酸聚合物;例如形成雙硫鍵、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化,或任何其他操縱或修飾,諸如與標記組分結合。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應瞭解,由於本發明之多肽係基於抗體,但在某些實施例中,多肽可呈單鏈或結合鏈形式存在。
在兩種或兩種以上核酸或多肽之上下文中之術語「一致」或「一致性」百分比係指兩種或兩種以上序列或子序列當根據最大相關性比較及比對(必要時,引入空隙)時為相同的或具有特定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基,其中不考慮任何保守性胺基酸取代作為序列一致性的一部分。一致性百分比可使用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢查來量測。此項技術中已知可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之
比對的各種演算法及軟體。
序列比對演算法之一個此類非限制性實例為Karlin等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268中所述、如Karlin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877中所修改之演算法,且該演算法併入NBLAST及XBLAST程式中(Altschul等人,1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)。在某些實施例中,可如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述使用空隙式BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人,1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)為可用於比對序列的其他公開可獲得的軟體程式。在某些實施例中,使用GCG套裝軟體中之GAP程序(例如使用NWSgapdna.CMP矩陣以及空隙權數40、50、60、70或80及長度權數1、2、3、4、5或6)測定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。在某些替代實施例中,併有Needleman及Wunsch之演算法(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的GCG套裝軟體中之GAP程式可用於測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比(例如使用BLOSUM 62矩陣或PAM250矩陣,及空隙權數16、14、12、10、8、6或4及長度權數1、2、3、4、5)。或者,在某些實施例中,使用Myers及Miller(CABIOS,4:11-17(1989))之演算法測定核苷酸或胺基酸序列之間的一致性百分比。舉例而言,可使用ALIGN程式(2.0版)及使用具有殘基表、空隙長度罰分12及空隙罰分4之PAM120測定一致性百分比,熟習此項技術者可藉由特定比對軟體確定適用於最大比對的參數。在某些實施例中,使用比對軟體的預設參數。
在某些實施例中,第一胺基酸序列相對於第二胺基酸序列之一致性百分比「X」係依100×(Y/Z)計算,其中Y為第一與第二序列比對時依一致匹配所評估之胺基酸殘基數目(如藉由目視檢查或特定序列
比對程式所比對)且Z為第二序列中的殘基總數。若第一序列之長度比第二序列長,則第一序列相對於第二序列之一致性百分比將高於第二序列相對於第一序列之一致性百分比。
「保守性胺基酸取代」為一個胺基酸殘基經具有類似側鏈之另一個胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族,包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例而言,用苯丙胺酸取代酪胺酸為保守性取代。在某些實施例中,本發明之多肽及抗體之序列中的保守性取代不消除含有胺基酸序列之多肽或抗體與抗原(亦即多肽或抗體所結合的IL-21)的結合。鑑別不消除抗原結合之核苷酸及胺基酸保守性取代的方法在此項技術中已熟知(參見例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1 187(1993);Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999);及Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。
本發明提供IL-21結合分子,例如特異性結合IL-21的抗IL-21抗體及其抗原結合片段。IL-21的全長胺基酸(aa)及核苷酸(nt)序列在此項技術中已知。對於人類IL-21而言,分別參見例如GenBank寄存編號BC066260.1(SEQ ID NO:1)及AAH69124.1(SEQ ID NO:2),或對於食蟹獼猴(Macaca fasciculari)IL-21而言,參見美國專利申請公開案第2008-0267910 A1號(分別為SEQ ID NO:3及4)。在一些實施例中,IL-21結合分子(例如本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段)為鼠類
抗體、人類化抗體或人類抗體。在某些實施例中,IL-21結合分子為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接之Fv、V-NAR域、IgNar、胞內抗體、IgG△CH2、微型抗體、F(ab')3、四功能抗體、三功能抗體、雙功能抗體、單域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2,或scFv-Fc。在一些實施例中,抗體為IgG1亞型且包含三重突變體YTE,如上文在定義章節中所揭示。某些抗IL-21抗體或其片段提供於實例章節之表2中。
在某些態樣中,本發明提供可與包含19E3、9F11、8B6或9H10之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的抗體或其抗原結合片段特異性結合至相同IL-21抗原決定基的IL-21結合分子或其抗原結合片段,例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段。亦提供可競爭性抑制IL-21或可以比包含19E3、9F11、8B6或9H10之VH及VL之抗體或其抗原結合片段大的親和力結合至IL-21的IL-21結合分子或其抗原結合片段,例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段。如本文所提供,19E3之VH及VL分別包含SEQ ID NO:6及11,9F11之VH及VL分別包含SEQ ID NO:28及33,8B6之VH及VL分別包含SEQ ID NO:42及47,且9H10之VH及VL分別包含SEQ ID NO:52及57。
本發明另外提供包括抗體VL區域的IL-21結合分子或抗原結合片段,例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段。在某些態樣中,VL區域包括一個、兩個或三個VL-CDR,諸如與SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:58一致或除八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致的VLCDR1;與SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:59一致或除八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致的VLCDR2;或與SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:
36、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:60一致或除八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致的VLCDR3。在某些態樣中,VL區域含有VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13及14;SEQ ID NO:34、35及36;SEQ ID NO:48、49及50;或SEQ ID NO:58、59及60一致或除一或多個VL-CDR中之八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致。在某些態樣中,VL區域包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:57至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列。
另外提供特異性結合至IL-21的結合分子或其抗原結合片段,例如包括抗體VH區域的抗IL-21抗體或其抗原結合片段。在某些態樣中,VH區域包括一個、兩個或三個VH-CDR,諸如與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:53一致或除八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致的VHCDR1;與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:54一致或除八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致的VHCDR2;與SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:55一致或除八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致的VHCDR3。在某些態樣中,VH區域含有VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:7、8及9;SEQ ID NO:29、30及31;SEQ ID NO:43、44及45;或SEQ ID NO:53、54及55一致或除一或多個VH-CDR中之八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致。在某些態
樣中,VH區域包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:52至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列。
在特定態樣中,本文所提供之IL-21結合分子包含抗IL-21抗體或其抗原結合片段。舉例而言,本發明提供特異性結合至IL-21的包含VL區域及VH區域之分離抗體或其抗原結合片段,其中該VL及VH共同地含有VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13、14、7、8及9;SEQ ID NO:34、35、36、29、30及31;SEQ ID NO:48、49、50、43、44及45;或SEQ ID NO:58、59、60、53、54及55一致或除一或多個CDR中之八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致。
舉例而言,本發明提供特異性結合至IL-21之包含VH及VL的經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該VH及VL分別含有分別與參考胺基酸序列SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:37及40、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:47,或SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:57至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列。
在一個態樣中,本發明提供包含K44VHa-N56Q之VH及VL(VH胺基酸序列SEQ ID NO:19及VL胺基酸序列SEQ ID NO:21)的抗IL-21抗體或其抗原結合片段。
本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段(例如如上文所述)可為例如鼠類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、
重組抗體、多特異性抗體或其任何組合。抗IL-21抗體的抗原結合片段可為Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dsFv片段、scFv片段或sc(Fv)2片段。
在一個態樣中,本發明提供的抗IL-21抗體或其抗原結合片段可結合至所有物種之IL-21分子,例如該抗體或片段可結合至小鼠IL-21、大鼠IL-21、兔IL-21、人類IL-21及/或食蟹獼猴IL-21。舉例而言,抗體或片段可結合至人類IL-21及食蟹獼猴IL-21。在另一實例中,抗體或片段亦可結合至小鼠IL-21。
IL-21受體與多種其他細胞激素受體(例如IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-9R及IL-15R)具有共同的γ鏈。在本文所提供之某些實施例中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段可特異性結合至IL-21,例如人類IL-21及食蟹獼猴IL-21及小鼠IL-21,但不特異性結合至人類IL-2、IL-4、IL-7、IL-9或IL-15。
除VH及VL之外,本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段(例如如上文所述)亦可包括重鏈恆定區或其片段。在某些態樣中,重鏈恆定區為人類重鏈恆定區,例如人類IgG恆定區,例如人類IgG1恆定區。如本文中在別處所述,在某些態樣中,重鏈恆定區或其片段(例如人類IgG恆定區或其片段)相對於野生型IgG恆定域可包括一或多個胺基酸取代,其中相較於具有野生型IgG恆定域之IgG之半衰期,經修飾之IgG的半衰期延長。舉例而言,IgG恆定域可含有位置251至257、285至290、308至314、385至389及428至436之胺基酸殘基的一或多個胺基酸取代,其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所列之EU索引進行。在某些態樣中,IgG恆定域可含有以下一或多者:Kabat位置252之胺基酸經酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)或蘇胺酸(T)取代;Kabat位置254之胺基酸經蘇胺酸(T)取代;Kabat位置256之胺基酸經絲胺酸(S)、精胺酸(R)、麩醯胺酸(Q)、麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)或
蘇胺酸(T)取代;Kabat位置257之胺基酸經白胺酸(L)取代;Kabat位置309之胺基酸經取代;Kabat位置311之胺基酸經絲胺酸(S)取代;Kabat位置428之胺基酸經蘇胺酸(T)、白胺酸(L)、苯丙胺酸(F)或絲胺酸(S)取代;Kabat位置433之胺基酸經精胺酸(R)、絲胺酸(S)、異白胺酸(I)、脯胺酸(P)或麩醯胺酸(Q)取代;或Kabat位置434之胺基酸經色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)、絲胺酸(S)、組胺酸(H)、苯丙胺酸(F)或酪胺酸取代。更具體而言,相對於野生型人類IgG恆定域,IgG恆定域可含有胺基酸取代,包括Kabat位置252之胺基酸經酪胺酸(Y)取代、Kabat位置254之胺基酸經蘇胺酸(T)取代,及Kabat位置256之胺基酸經麩胺酸(E)取代。
本發明提供抗IL-21抗體或其抗原結合片段,其中重鏈為人類IgG1 YTE突變體,例如重鏈可包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的重鏈胺基酸序列。
除VH及VL之外,本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段(例如如上文所述)亦可視情況包括重鏈恆定區或其片段、輕鏈恆定區或其片段。在某些態樣中,輕鏈恆定區為κ、λ輕鏈恆定區,例如人類κ恆定區或人類λ恆定區。在一特定態樣中,輕鏈恆定區為人類κ恆定區。
本發明提供抗IL-21抗體或其抗原結合片段,其中該輕鏈含有人類κ恆定區,例如輕鏈可包含與參考胺基酸序列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的輕鏈胺基酸序列。在某些態樣中,本發明提供包含人類IgG1 YTE重鏈及人類κ輕鏈的抗IL-21抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其任何抗原結合片段分別由SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:22,或SEQ ID NO:24及SEQ ID
NO:26組成。
本文所提供之抗IL-21抗體或其片段可具有有益特性。舉例而言,抗體或其片段可抑制、遏止或阻斷IL-21結合至IL-21受體,例如T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞或樹突狀細胞上所表現的IL-21受體,或在非淋巴細胞中重組表現的IL-21受體。作為另一實例,抗體或片段可抑制人類或食蟹獼猴IL-21結合至人類或食蟹獼猴IL-21受體,但不抑制小鼠IL-21結合至小鼠IL-21受體。此抗IL-21抗體或其片段可進一步抑制、遏止或阻斷各種IL-21介導性活性,亦即抗體或片段可為IL-21活性拮抗劑。在某些態樣中,本文所提供之抗IL-21抗體或其片段可抑制、遏止或阻斷以Jak/STAT路徑發生之IL-21介導性磷酸化,例如抑制、抑止或阻斷表現IL-21R之細胞(例如人類周邊血液單核細胞(PBMC))中之STAT3發生磷酸化。
在某些態樣中,本文所提供之抗IL-21抗體或其片段可抑制、遏止或阻斷IL-21介導NK細胞產生干擾素-γ(IFN-γ)。此類抑制可來自天然存在之NK細胞,例如人類NK細胞,或經培養之NK細胞,例如NK-92細胞。
在特定態樣中,本文所提供之抗IL-21抗體或其片段可在體液性免疫反應期間抑制、遏止或阻斷IL-21介導B細胞活化、分化或死亡。舉例而言,本文所提供之抗IL-21抗體或其片段可抑制、遏止或阻斷IL-21介導B細胞由受刺激之B細胞分化成漿細胞。本文所提供之某些抗體可抑制、抑止或阻斷人類及食蟹獼猴IL-21介導受刺激之B細胞分化成漿細胞。在某些態樣中,B細胞可為外源性添加有IL-21之經分離之B細胞。在其他態樣中,B細胞可天然地或經由共培養而與表現IL-21的活化CD4+ T細胞接觸。在其他態樣中,人類B細胞可天然地或經由共培養而與表現IL-21的人類活化CD4+ T細胞接觸。
在某些態樣中,如本文所提供之抗體或其抗原結合片段可以藉
由約100pM至約0.1pM之解離常數(KD)所判別的結合親和力結合至IL-21,如在動力學排除分析(KinExA)3000平台上所量測。
在某些態樣中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段可以小於10-6M或小於10-7M或小於10-8M或小於10-9M或小於10-10M或小於10-11M、小於10-12M、小於10-13M、小於10-14M或小於10-15M之解離常數或KD特異性結合至IL-21,例如人類IL-21或食蟹獼猴IL-21,及其抗原片段,如藉由例如KINEXA®或BIACORE®所量測。在一個態樣中,人類化抗IL-21抗體K44VHa-N56Q可以約515fM(515×10-15M)之KD結合至人類IL-21且以約352fM(352×10-15M)之KD結合至食蟹獼猴IL-21,如藉由KINEXA®所量測。
在另一個實施例中,本發明之抗IL-21抗體或其抗原結合片段係以小於1×10-3s-1或小於2×10-3s-1之Koff結合至IL-21及/或其抗原片段。在其他實施例中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段係以小於10-3s-1、小於5×10-3s-1、小於10-4s-1、小於5×10-4s-1、小於10-5s-1、小於5×10-5s-1、小於10-6s-1、小於5×10-6s-1、小於5×10-7s-1、小於10-8s-1、小於5×10-8s-1、小於10-9s-1、小於5×10-9s-1或小於10-10s-1之Koff結合至IL-21及其抗原片段,如藉由例如KINEXA®或BIACORE®所量測。
在另一個實施例中,本發明之抗IL-21抗體或其抗原結合片段係以至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1或至少108M-1s-1或至少109M-1s-1之結合速率或kon速率結合至IL-21及/或其抗原片段,如藉由例如KINEXA®或BIACORE®所量測。
如上文所指出,VH及/或VL胺基酸序列可與本文中所述之序列具有例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相似性,且/或相對於本文中所述之序列,包含1、2、3、4、5個或超過5個取代,例如保守性取代。含有與VH及VL區域具有一定相似性百分比之VH及VL區
域或具有一或多個取代(例如保守性取代)的IL-21抗體可如下獲得:對編碼本文所述之VH及/或VL區域的核酸分子進行突變誘發(例如定點突變誘發或PCR介導性突變誘發),隨後測試所編碼之變異抗體與IL-21的結合且視情況使用本文所述之功能性分析來測試所保留的功能。
抗體針對抗原的親和力或親合力可以實驗方式,使用此項技術中熟知的任何適合方法測定,例如流式細胞術、酶聯免疫吸附分析(ELISA),或放射免疫分析(RIA),或動力學(例如KINEXA®或BIACORETM分析)。可容易使用直接結合分析以及競爭性結合分析形式。(參見例如Berzofsky等人,"Antibody-Antigen Interactions,"於Fundamental Immunology,Paul,W.E.,編,Raven Press:New York,N.Y.(1984);Kuby,Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992);及其中所述方法)。若在不同條件(例如鹽濃度、pH、溫度)下量測,則特定抗體-抗原相互作用之所測親和力可變化。因此,親和力及其他抗原結合參數(例如KD或Kd、kon、koff)用抗體及抗原之標準化溶液及如此項技術中已知的標準化緩衝液(諸如本文所述之緩衝液)進行量測。
本發明進一步提供如上文所述的抗IL-21抗體或其片段,其中該抗體與異源藥劑結合。在某些態樣中,藥劑可為抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質、酵素、脂質、生物反應調節劑、醫藥劑、淋巴激素、異源抗體或其片段、可偵測標記、聚乙二醇(PEG),或兩種或兩種以上任何該等藥劑之組合。異結合物抗IL-21抗體在本文中別處更詳細論述。
在某些實施例中,IL-21結合分子為並非抗體的多肽。鑑別及產生以高親和力結合至蛋白質標靶之非抗體多肽的多種方法在此項技術中已知。參見例如Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304(2007);Hosse等人,Protein Science,15:14-27(2006);Gill等人,Curr.Opin.
Biotechnol.,17:653-658(2006);Nygren,FEBS J.,275:2668-76(2008)及Skerra,FEBS J.,275:2677-83(2008),各文獻以全文引用的方式併入本文中。在某些實施例中,噬菌體呈現技術可用於鑑別/產生IL-21結合性多肽。在某些實施例中,多肽包含選自由以下組成之群之類型的蛋白質骨架:蛋白質A、脂質運載蛋白、纖維結合蛋白域、錨蛋白共同重複域,及硫氧還蛋白。
在某些實施例中,本發明提供IL-21結合分子,例如與本文所述之各種抗IL-21抗體結合至相同抗原決定基的抗IL-21抗體或其抗原結合片段。如本文所用之術語「抗原決定基」係指能夠結合至本發明抗體的靶蛋白決定子。抗原決定基通常由化學活性表面分子族群(諸如胺基酸或糖側鏈)組成,且通常具有特定三維結構特徵,以及荷質比特徵。構形抗原決定基與非構形抗原決定基之區別在於,在變性溶劑存在下,與前者的結合消失,但後者則不然。此類抗體可基於其在標準IL-21結合或活性分析中與抗體(諸如19E3、9F11、9H10或8B6)交叉競爭(例如以統計顯著方式競爭性地抑制結合)的能力來鑑別。因此,在一個實施例中,本發明提供與本發明之其他抗IL-21抗體或其抗原結合片段(諸如鼠類單株抗體19E3、9F11、9H10或8B6,或如本文所揭示之人類化變異體)競爭結合至IL-21的抗IL-21抗體及其抗原結合片段,例如單株抗體。測試抗體抑制例如19E3、9F11、9H10或8B6結合的能力表明測試抗體可與該抗體競爭結合至IL-21;根據非限制性理論,此類抗體可與其所競爭之抗IL-21抗體或其抗原結合片段結合至相同或相關(例如結構上相似或空間上鄰近)的IL-21抗原決定基。在一個實施例中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段與例如鼠類單株抗體19E3、9F11、9H10或8B6結合至相同的IL-21抗原決定基。
在一些實施例中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止表現IL-21R之細胞中的IL-21介導性信號轉導。舉例而言,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止IL-21介導STAT3磷酸化。另外,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止NK細胞產生IFNγ。此外,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑制受刺激B細胞分化成漿細胞。
在一些實施例中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止表現IL-21R之細胞(例如PBMC)中發生的IL-21介導STAT3磷酸化,如藉由流式細胞術所量測,其中IC50低於約500pM、低於約350pM、低於約250pM、低於約150pM、低於約100pM、低於約75pM、低於約60pM、低於約50pM、低於約40pM、低於約30pM、低於約20pM、低於約15pM、低於約10pM或低於約5pM。在某些態樣中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止表現IL-21R之細胞(例如PBMC)中發生的人類IL-21介導STAT3磷酸化,如藉由流式細胞術所量測,其中IC50為約22pM、約19pM、約17pM、約14pM、約13pM、約12pM、約6pM、約5pM或約3pM。在某些態樣中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止表現IL-21R之細胞(例如PBMC)中發生的IL-21介導STAT3磷酸化,如藉由流式細胞術所量測,其中IC50為約52pM、約51pM、約46pM、約19pM、約16pM、約10pM或約6pM。
在一些實施例中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止IL-21介導NK細胞產生IFNγ,如藉由MSD人類IFNγ單工分析所量測,其中IC50低於約100pM、低於約400pM、低於約100pM、低於約75pM、低於約60pM、低於約50pM、低於約40pM、低於約30pM、低於約20pM、低於約15pM、低於約10pM或低於約5
pM。在某些態樣中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止人類IL-21介導NK-92細胞株產生IFNγ,如藉由MSD人類IFNγ單工分析所量測,其中IC50為約99pM、約93pM、約55pM、約41pM或約20pM。在某些態樣中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止食蟹獼猴IL-21介導NK-92細胞株產生IFNγ,如藉由MSD人類IFNγ單工分析所量測,其中IC50為約83pM、約81pM、約60pM、約37pM或約3pM。
在一些實施例中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止IL-21介導受刺激B細胞(例如經抗CD40及抗IgM F(ab')2刺激的未處理B細胞及/或B記憶細胞)分化成漿細胞,例如IgG產生性漿細胞,如藉由流式細胞術或ELISA所量測,其中IC50低於約150nM、低於約75nM、低於約50nM、低於約30nM、低於約10nM、低於約1,600pM、低於約1,400pM、低於約1000pM、低於約800pM、低於約700pM或低於約600pM。在某些態樣中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止人類IL-21介導受刺激B細胞(例如經抗CD40及抗IgM F(ab')2刺激之未處理B細胞及/或B記憶細胞)分化成漿細胞,例如IgG產生性漿細胞,如藉由流式細胞術或ELISA所量測,其中IC50為約115nM、約47nM、約1.5nM、約777pM、約618或約573pM。在某些態樣中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止食蟹獼猴IL-21介導受刺激人類B細胞(例如經抗CD40及抗IgM F(ab')2刺激之未處理B細胞及/或B記憶細胞)分化成漿細胞,例如IgG產生性漿細胞,如藉由流式細胞術或ELISA所量測,其中IC50為約74nM、約30nM、約9nM、約1.3nM、約1.0nM、約775pM或約659pM。在某些態樣中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止食蟹獼猴IL-21介導受刺激B細胞分化成漿細胞,但不抑止人類IL-21介導B細胞分化成漿細胞。
在某些態樣中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑止活化CD4+ T細胞驅使B細胞分化成漿細胞,活化CD4+ T細胞產生共刺激分子,諸如CD40L及B細胞趨向性細胞激素,諸如IL-21。在其他態樣中,IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可抑制IL-21驅動人類未處理CD4+ T細胞增殖。
單株抗IL-21抗體可使用融合瘤方法製備,諸如Kohler及Milstein(1975)Nature 256:495所述的彼等方法。使用融合瘤方法,如上所述使小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物免疫以誘發淋巴細胞產生將特異性結合至免疫抗原之抗體。淋巴細胞亦可在活體外免疫。免疫接種之後,將淋巴細胞分離且使用例如聚乙二醇將其與適合骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤細胞,接著可選擇而與不融合淋巴細胞及骨髓瘤細胞分離。如藉由免疫沈澱、免疫墨點法或藉由活體外結合分析(例如放射免疫分析(RIA);酶聯免疫吸附分析法(ELISA))所測定,產生特異性靶向所選抗原之單株抗體的融合瘤接著可在活體外培養物中使用標準方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)或在動物活體內作為腹水腫瘤增殖。單株抗體接著可如上文針對多株抗體所述自培養基或腹水純化。
或者,抗IL-21單株抗體亦可使用重組DNA方法,如美國專利第4,816,567號中所述產生。自成熟B細胞或融合瘤細胞中分離編碼單株抗體的聚核苷酸,諸如使用特異性擴增編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸引子進行RT-PCR來分離,且使用習知程序測定其序列。接著將編碼重鏈及輕鏈之經分離聚核苷酸選殖至適合表現載體中,當轉染至宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中(否則不產生免疫球蛋白)時,宿主細胞產生單株抗體。又,所需物種之重組抗IL-21單株抗體或其抗原結合片
段可自如所述表現所需物種之CDR的噬菌體呈現文庫中分離(McCafferty等人,1990,Nature,348:552-554;Clackson等人,1991,Nature,352:624-628;及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。
編碼抗IL-21抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸可使用重組DNA技術、以多種不同方式進一步修飾,以產生替代抗體。在一些實施例中,可用輕鏈及重鏈之恆定域(例如小鼠單株抗體之輕鏈及重鏈恆定域)取代(1)例如人類抗體之彼等區域以產生嵌合抗體或(2)非免疫球蛋白多肽以產生融合抗體。在一些實施例中,截短或移除恆定區以產生單株抗體之所需抗體片段。對可變區進行的定點或高密度突變誘發可用於最佳化單株抗體之特異性、親和力等。
在某些實施例中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段為人類抗體或其抗原結合片段。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術直接製備。可產生經活體外免疫或自產生針對靶抗原之抗體之經免疫個體中分離的不朽化人類B淋巴細胞(參見例如Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77頁(1985);Boemer等人,1991,J.Immunol.,147(1):86-95;及美國專利5,750,373)。
又,抗IL-21人類抗體或其抗原結合片段可選自噬菌體文庫,其中該噬菌體文庫表現人類抗體,如例如以下文獻中所述:Vaughan等人,1996,Nat.Biotech.,14:309-314;Sheets等人,1998,Proc.Nat'l.Acad.Sci.,95:6157-6162;Hoogenboom及Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381;及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.,222:581)。用於產生及使用抗體噬菌體的技術亦描述於美國專利第5,969,108號、第6,172,197號、第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號、第6,593,081號、第6,300,064號、第6,653,068號、第6,706,484號及第7,264,963號;及Rothe等人,2007,J.Mol.Bio.,
doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(各以全文引用的方式併入本文中)。
親和力成熟策略及鏈改組策略(Marks等人,1992,BioTechnology 10:779-783,該文獻以全文引用的方式併入本文中)在此項技術中已知且可用以產生高親和力人類抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中,抗IL-21單株抗體可為人類化抗體。亦可使用對非人類或人類抗體進行工程改造、人類化或重塑的方法且在此項技術中已熟知。經人類化、重塑或經類似工程改造之抗體可具有一或多個來自非人類來源(例如(但不限於)小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物或其他哺乳動物)之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基經通常稱為「輸入」殘基之殘基置換,該等殘基典型地取自已知人類序列之「輸入」可變域、恆定域或其他域。如此項技術中所知,此類輸入序列可用於降低免疫原性或減少、增強或修改結合、親和力、結合速率、解離速率、親合力、特異性、半衰期或任何其他適合特徵。一般而言,CDR殘基直接且最實質上與影響IL-21結合有關。從而維持非人類或人類CDR序列的一部分或全部,而可變區及恆定區之非人類序列可經人類或其他胺基酸置換。
抗體視情況亦可為經人類化、重塑、工程改造的抗體或人類抗體,其經工程改造而保持針對抗原IL-21的高親和力及其他有利生物特性。為實現此目標,經人類化(或人類)或經工程改造之抗IL-21抗體及經重塑之抗體視情況可藉由使用親本序列、經工程改造之序列及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種概念性人類化及工程改造產物的方法製備。三維免疫球蛋白模型通常可獲得,且為熟習此項技術者所熟悉。可利用說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。檢查此等顯示可分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用,亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原(諸如IL-21)之能力的殘基。以此方式,可自共同序列及輸入序列選擇構
架(FW)殘基且加以組合,以便達成所需抗體特徵,諸如對靶抗原之親和力增強。
本發明之抗IL-21抗體或其抗原結合片段可使用任何已知的方法進行人類化、重塑或工程改造,諸如(但不限於)以下文獻中所述的方法:Jones等人,Nature 321:522(1986);Riechmann等人,Nature 332:323(1988);Verhoeyen等人,Science 239:1534(1988));Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987);Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992);Presta等人,J.Immunol.151:2623(1993);美國專利第5,639,641號、第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5,814,476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號、第4,816,567,7,557,189號、第7,538,195及第7,342,110號;國際申請案第PCT/US98/16280號、第PCT/US96/18978號、第PCT/US91/09630號、第PCT/US91/05939號、第PCT/US94/01234號、第PCT/GB89/01334號、第PCT/GB91/01134號、第PCT/GB92/01755號;國際專利申請公開案第WO90/14443號、第WO90/14424號、第WO90/14430號;及歐洲專利公開案第EP 229246號,各文獻以引用的方式完全併入本文中,包括其中所引用之參考文獻。
抗IL-21人類化抗體及其抗原結合片段亦可於含有人類免疫球蛋白基因座的轉殖基因小鼠中產生,該等轉殖基因小鼠能夠在免疫接種後、在缺乏內源性免疫球蛋白產生的情況下產生人類抗體之完全譜系。此方法描述於美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號及第5,661,016號中。
在某些實施例中,提供抗IL-21抗體片段。已知用於產生抗體片
段的多種技術。傳統上,此等片段來源於完整抗體之蛋白分解消化(例如Morimoto等人,1993,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117;Brennan等人,1985,Science,229:81)。在某些實施例中,抗IL-21抗體片段係以重組方式產生。Fab、Fv及scFv抗體片段均可在大腸桿菌或其他宿主細胞中表現且自其中分泌,從而允許產生大量此等片段。此類抗IL-21抗體片段亦可自上文所論述之抗體噬菌體文庫分離。抗IL-21抗體片段亦可為線性抗體,如美國專利第5,641,870號中所述。產生抗體片段的其他技術對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。
根據本發明,可調適用於產生特異性針對IL-21之單鏈抗體的技術(參見例如美國專利第4,946,778號)。另外,可調適用於構築Fab表現文庫的方法(參見例如Huse等人,Science 246:1275-1281(1989)),以便快速且有效地鑑別對IL-21具有所需特異性的單株Fab片段,或其衍生物、片段、類似物或同源物。抗體片段可藉由此項技術中之技術產生,包括(但不限於):(a)F(ab')2片段,藉由胃蛋白酶消化抗體分子而產生;(b)Fab片段,藉由還原F(ab')2片段之二硫橋鍵產生;(c)Fab片段,藉由用木瓜蛋白酶及還原劑處理抗體分子而產生;及(d)Fv片段。
在某些態樣中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段可經修飾以便延長其血清半衰期。此可如下達成:例如,藉由使抗體或抗體片段中之適當區域突變而將救助受體結合性抗原決定基併入抗體或抗體片段中;或將抗原決定基併入肽標記中,接著在任一端或在中部與抗體或抗體片段融合(例如藉由DNA或肽合成);或YTE突變。延長抗體或其抗原結合片段之血清半衰期的其他方法(例如與諸如PEG之異質分子結合)在此項技術中已知。
異結合物抗IL-21抗體及其抗原結合片段亦屬於本發明範疇內。
異結合物抗體由兩個共價連接的抗體組成。已提出例如使免疫細胞靶向非所需細胞的此類抗體(參見例如美國專利第4,676,980號)。預期異結合物抗IL-21抗體及其抗原結合片段可使用已知的合成蛋白質化學方法(包括涉及交聯劑的彼等方法)活體外製備。舉例而言,免疫毒素可使用二硫化物交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築。適用於此目的之實例包括亞胺基硫醇酯及4-巰基丁醯亞胺甲酯。
如本文所提供之經修飾之抗IL-21抗體或其抗原結合片段可包含使得抗體或多肽與IL-21結合的任何類型之可變區。就此而言,可變區可包含或來源於任何類型的哺乳動物,其經誘導可建立體液性反應且產生針對所需抗原的免疫球蛋白。因而,抗IL-21抗體或其抗原結合片段之可變區可來源於例如人類、鼠類、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴、獼猴等)或狼。在一些實施例中,經修飾之抗IL-21抗體或其抗原結合片段的可變區與恆定區為人類。在其他實施例中,相容性抗體(通常來源於非人類來源)之可變區可經工程改造或經特定定製以改良結合特性或降低分子的免疫原性。就此而言,適用於本發明的可變區可經人類化或經由包含所輸入胺基酸序列而以其他方式改變。
在某些實施例中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段之重鏈與輕鏈中的可變域係藉由一或多個CDR之至少部分置換及/或藉由部分構架區置換及序列變化來改變。雖然CDR可來源於類別或甚至子類與構架區所來源之抗體相同的抗體,但可設想CDR將來源於不同類別的抗體且在某些實施例中來源於不同物種的抗體。無需用來自供者可變區的全部CDR置換所有CDR以將一個可變域的抗原結合能力轉移至另一者。實情為,僅需轉移為維持抗原結合位點活性所必需的彼等殘基。鑒於美國專利第5,585,089號、第5,693,761號及第5,693,762號中所述之解釋,因此藉由進行常規實驗或藉由試誤法測試來獲得免疫原性降低的功能性抗體完全屬於熟習此項技術者之能力範圍內。
不論可變區的改變,熟習此項技術者將瞭解,本發明之經修飾之抗IL-21抗體或其抗原結合片段將包含抗體(例如全長抗體或其抗原結合片段),其中一或多個恆定區域的至少一部分已缺失或以其他方式改變以便提供所需的生物化學特徵,諸如相較於免疫原性大致相同之包含原生或未改變恆定區的抗體,腫瘤局域化增強或血清半衰期縮短。在一些實施例中,經修飾之抗體之恆定區將包含人類恆定區。對與本發明相容之恆定區的修飾包含一或多個域中之一或多個胺基酸的添加、缺失或取代。亦即,本文所揭示之經修飾之抗體可包含對三個重鏈恆定域(CH1、CH2或CH3)中之一或多者及/或輕鏈恆定域(CL)的改變或修飾。在一些實施例中,涵蓋其中一或多個域部分缺失或完全缺失的經修飾之恆定區。在一些實施例中,經修飾之抗體包含其中整個CH2域已移除的域缺失構築體或變異體(△CH2構築體)。在一些實施例中,省去的恆定區域可經短胺基酸間隔子(例如10個殘基)置換,從而提供典型地由缺失恆定區所賦予的一些分子柔性。
此項技術中已知恆定區除其組態之外,亦介導若干效應功能。舉例而言,補體之C1組分結合至抗體使補體系統活化。補體活化在細胞病原體之調理及溶胞中具有重要作用。補體活化亦刺激發炎反應且亦可涉及自體免疫過敏性。此外,抗體經由Fc區結合至細胞,其中抗體Fc區上的Fc受體位點結合至細胞上的Fc受體(FcR)。特異性針對不同類別抗體的Fc受體存在多種,包括IgG(γ受體、IgE(η受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體)。抗體結合至細胞表面上的Fc受體觸發多種重要且不同的生物反應,包括抗體所塗顆粒之吞噬及摧毀、免疫複合體之清除、殺手細胞對抗體所塗靶細胞之溶解(稱為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性,或ADCC)、發炎性介體之釋放、免疫球蛋白產生之胎盤轉移及控制。
在某些實施例中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段提供改變的效
應功能,效應功能改變又影響所投與之抗體或其抗原結合片段的生物學概況。舉例而言,恆定區域之缺失或不活化(經由點突變或其他方式)可減少循環中之經修飾之抗體與Fc受體的結合。在其他情況下,其可為,符合本發明的恆定區修飾緩和補體結合且從而縮短血清半衰期且減少所結合細胞毒素的非特異性結合。然而恆定區之其他修飾可用於消除二硫鍵聯或寡醣部分,從而因抗原特異性或抗體柔性增強而局域化增強。類似地,根據本發明修飾恆定區容易使用熟習此項技術者之範圍內熟知的生物化學或分子工程技術達成。
在某些實施例中,作為抗體或其抗原結合片段的IL-21結合分子不具有一或多種效應功能。舉例而言,在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段不具有抗體依賴性細胞之細胞毒性(ADCC)活性且/或不具有補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在某些實施例中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段不結合至Fc受體及/或補體因子。在某些實施例中,抗體或其抗原結合片段不具有效應功能。
在某些實施例中,抗IL-21抗體或其抗原結合片段可經工程改造以使CH3域與相應經修飾之抗體或其片段之鉸鏈區直接融合。在其他構築體中,可將肽間隔子插入鉸鏈區與經修飾之CH2及/或CH3域之間。舉例而言,可表現其中CH2域已缺失且剩餘CH3域(經修飾或未經修飾)經5至20個胺基酸間隔子與鉸鏈區連接的相容性構築體。可添加此類間隔子,例如以確保恆定域之調控元件保持自由且可接近或鉸鏈區保持柔性。在一些情況下,胺基酸間隔子可證實具有免疫原性且誘發針對構築體的非所需免疫反應。因此,在某些實施例中,添加至構築體中之任何間隔子相對而言可具有非免疫原性,或甚至完全省去,以便維持經修飾之抗體之所需生物化學品質。
除完整恆定區域之缺失之外,本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段可藉由恆定區中之少數或甚至單個胺基酸之部分缺失或取
代而經修飾。舉例而言,CH2域之選定區域中單個胺基酸之突變可足以實質上減少Fc結合且從而增強腫瘤局域化。類似地,控制效應功能(例如補體C1Q結合)的一或多個一或多個恆定區域可完全或部分地缺失。恆定區之此類部分缺失可改良抗體或其抗原結合片段的所選特徵(例如血清半衰期),同時保留與本發明完整恆定區域有關的其他所需功能。此外,所揭示抗IL-21抗體及其抗原結合片段之恆定區可經由增強所得構築體之概況之一或多個胺基酸的突變或取代而經修飾。就此而言,可中斷保守結合位點(例如Fc結合)所提供之活性,同時實質上維持經修飾之抗體或其抗原結合片段之組態及免疫原性概況。某些實施例可包含一或多個胺基酸添加至恆定區中以增強所需特徵,諸如減少或增強效應功能或提供更多細胞毒素或碳水化合物連接。在此等實施例中,可能需要插入或複製來源於所選恆定區域的特定序列。
本發明進一步包含本文中所述之與鼠類、嵌合、人類化或人類抗IL-21抗體或其抗原結合片段實質上同源的變異體及等效物。此等物可含有例如保守性取代突變,亦即一或多個胺基酸經相似胺基酸取代。舉例而言,保守性取代係指一個胺基酸經相同通用類別內之另一胺基酸取代,例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸取代、一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸取代,或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸取代。保守性胺基酸取代之目的在此項技術中已熟知。
抗IL-21抗體或其抗原結合片段可進一步加以修飾以含有通常不為蛋白質之一部分的其他化學部分。彼等衍生化部分可改良蛋白質之溶解性、生物學半衰期或吸收。該等部分亦可減少或消除蛋白質及其類似物之任何所具副作用。針對彼等部分之概述可發現於Remington的Pharmaceutical Sciences,第20版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)中。
本發明提供包含核酸序列的聚核苷酸,該等核酸序列編碼特異性結合IL-21的多肽或其抗原結合片段。舉例而言,本發明提供包含核酸序列的聚核苷酸,該核酸序列編碼抗IL-21抗體或編碼此類抗體之抗原結合片段。本發明之聚核苷酸可呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因組DNA及合成DNA;且可為雙股或單股,且若為單股,則可為編碼股或非編碼(反義)股。
在某些實施例中,聚核苷酸可經分離。在某些實施例中,聚核苷酸可為實質上純的。在某些實施例中,聚核苷酸可為cDNA或來源於cDNA。在某些實施例中,聚核苷酸可以重組方式產生。在某些實施例中,聚核苷酸可包含用於成熟多肽的編碼序列,該成熟多肽與聚核苷酸在同一閱讀框架內融合,從而有助於例如宿主細胞表現及分泌多肽(例如前導序列充當用於控制多肽自細胞輸送的分泌序列)。具有前導序列之多肽為前蛋白且可具有藉由宿主細胞裂解以形成多肽之成熟形式的前導序列。聚核苷酸亦可編碼IL-21結合前蛋白,該前蛋白為具有額外5'胺基酸殘基的成熟蛋白質。
在某些態樣中,本發明提供包含編碼抗體VL之核酸的經分離之聚核苷酸,其中該VL包含VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13及14;SEQ ID NO:34、35及36;SEQ ID NO:48、49及50或SEQ ID NO:58、59及60一致,或除一或多個VL-CDR中之八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
本發明進一步提供包含編碼抗體VH之核酸的經分離之聚核苷酸,其中該VH包含VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:7、8及9;SEQ ID NO:29、30及31;SEQ ID NO:43、44及45或SEQ ID NO:53、54及55一致,或除一或多個VH-CDR中之八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或
一個胺基酸取代之外,其他一致。
本發明進一步提供包含編碼抗體VL之核酸的經分離之聚核苷酸,其中該VL包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:57。
此外,本發明提供包含編碼抗體VH之核酸的經分離之聚核苷酸,其中該VH包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:52。
在某些態樣中,包含由如上文所述之聚核苷酸編碼之VH或VL的抗體或其抗原結合片段可特異性結合至IL-21,例如人類或食蟹獼猴IL-21。在某些情況下,此類抗體或其抗原結合片段可與包含19E3、9F11、8B6或9H10之VH及VL的抗體或其抗原結合片段特異性結合至相同的抗原決定基。在某些態樣中,本發明提供編碼特異性結合至IL-21之結合分子(例如抗體或其抗原結合片段)的聚核苷酸或聚核苷酸組合。
進一步提供包含如上文所述之聚核苷酸的載體。適合載體描述於本文中別處,且已為一般技術者所知。
在某些態樣中,本發明提供組合物,例如醫藥組合物,其包含如上文所述之所主張聚核苷酸或載體,視情況進一步包含一或多種載劑、稀釋劑、賦形劑或其他添加劑。
在某些態樣中,本發明提供聚核苷酸組合物,其包含:包含編
碼VH之核酸的聚核苷酸,及包含編碼VL之核酸的聚核苷酸。根據此態樣,VL與VH一起可包含VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13、14、7、8及9;SEQ ID NO:34、35、36、29、30及31;SEQ ID NO:48、49、50、43、44及45;或SEQ ID NO:58、59、60、53、54及55一致或除一或多個CDR中之八個、七個、六個、五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致。
在其他態樣中,本發明提供聚核苷酸組合物,其包含:包含編碼VH之核酸的聚核苷酸及包含編碼VL之核酸的聚核苷酸,其中該VL及VH分別包含分別與以下參考胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:37及40、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:47,或SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:57。
在某些態樣中,VH及VL係由與以下參考核酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的核酸序列編碼:SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:46,或SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:56。
在如上文所述的聚核苷酸組合物中,包含編碼VH之核酸的聚核苷酸及包含編碼VL之核酸的聚核苷酸可存在於單個載體中,或可位於各別載體上。因此,本發明提供一或多個包含上述聚核苷酸組合物的載體。
在一些情況下,編碼如上文所述之VH及VL的聚核苷酸組合物可編碼可特異性結合至IL-21(例如人類或食蟹獼猴IL-21)的抗體或其抗
原結合片段。在一些態樣中,聚核苷酸組合物編碼可與包含19E3、9F11、8B6或9H10之VH及VL的抗體或其抗原結合片段特異性結合至相同抗原決定基的抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步提供包含如上文所提供之聚核苷酸、聚核苷酸組合物或載體的宿主細胞,其中宿主細胞在一些情況下可表現特異性結合至IL-21的抗體或其抗原結合片段。此宿主細胞可在產生如本文所提供之抗體或其抗原結合片段的方法中使用,其中該方法包括(a)培養宿主細胞及(b)將宿主細胞所表現的抗體或其抗原結合片段分離。
在某些實施例中,聚核苷酸包含成熟IL-21結合多肽(例如與標記序列在同一閱讀框架中融合的抗IL-21抗體或其抗原結合片段,該標記序列使得例如所編碼之多肽得到純化)的編碼序列。舉例而言,標記序列可為pQE-9載體所供應的六組胺酸標記,以便在細菌宿主之情況下對與標記融合之成熟多肽達成純化,或當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時,標記序列可為來源於流感紅血球凝集素蛋白質的紅血球凝集素(HA)標記。
亦提供聚核苷酸變異體。聚核苷酸變異體可含有編碼區、非編碼區或兩者中之改變。在一些實施例中,聚核苷酸變異體含有產生靜默取代、添加或缺失,但不改變所編碼多肽之特性或活性的變化。在一些實施例中,核苷酸變異體係藉由因基因密碼簡併所引起之靜默取代而產生。聚核苷酸變異體可出於多種原因產生,例如使特定宿主之密碼子表現最佳化(將人類mRNA中之密碼子改變成對於諸如大腸桿菌之細菌宿主為較佳的密碼子)。亦提供包含本文所述之聚核苷酸的載體及細胞。
在一些實施例中,編碼IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)之DNA序列可藉由化學合成、使用寡核苷酸合成儀構築。此類寡核苷酸可基於所需多肽之胺基酸序列且選擇在將產生所關注之
重組多肽之宿主細胞中有利的彼等密碼子來設計。可應用標準方法來合成編碼所關注之分離多肽的經分離之聚核苷酸序列。舉例而言,完整胺基酸序列可用於構築回復轉譯之基因。此外,可合成含有編碼特定分離多肽之核苷酸序列的DNA寡聚物。舉例而言,可合成編碼所需多肽之各部分的若干小寡核苷酸且接著接合。個別寡核苷酸典型地含有5'或3'突出端用於互補性組裝。
一經組裝(藉由合成、定點突變誘發或其他方法),可將編碼所關注之特定分離多肽的聚核苷酸序列插入表現載體中且可操作地連接至適用於在所需宿主中表現蛋白質之表現控制序列。正確組裝可例如依據核苷酸測序、限制酶圖譜及/或生物活性多肽在適合宿主中之表現來證實。為了達成所轉染基因在宿主中之高表現量,基因可操作地連接至或與所選表現宿主中具有功能性之轉錄及轉譯表現控制序列結合。
在某些實施例中,使用重組表現載體擴增及表現編碼抗IL-21抗體或其抗原結合片段的DNA。重組表現載體為可複製的DNA構築體,其具有編碼抗IL-21抗體或/及其抗原結合片段之多肽鏈的合成或cDNA源DNA片段,該等合成或cDNA源DNA片段可操作地連接至來源於哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的適合轉錄或轉譯調控元件。轉錄單元一般包含以下各者之組裝:(1)在基因表現方面具有調控作用的基因元件,例如轉錄啟動子或強化子;(2)轉錄成mRNA且轉譯成蛋白質之結構或編碼序列;及(3)適當轉錄及轉譯起始及終止序列,如下文所詳述。此類調控元件可包括控制轉錄的操縱序列。可另外併入通常由複製起點賦予之在宿主中複製之能力及促進識別轉型體之選擇基因。DNA區域當其在功能上彼此相關時可操作地連接。舉例而言,若信號肽(分泌前導序列)之DNA作為參與多肽分泌之前驅物表現,則其可操作地連接至多肽之DNA;若啟動子控制編碼序列之轉
錄,則其可操作地連接至該序列;或若核糖體結合位點經定位從而允許轉譯,則其可操作地連接至編碼序列。欲用於酵母表現系統中之結構元件包括能夠使宿主細胞達成細胞外分泌所轉譯蛋白質的前導序列。或者,在不使用前導或輸送序列表現重組蛋白質的情況下,該蛋白質可包括N末端甲硫胺酸殘基。此殘基可視情況隨後自所表現之重組蛋白質裂解而得到最終產物。
表現控制序列及表現載體之選擇將視宿主之選擇而定。可使用多種表現宿主/載體組合。適用於真核主體之表現載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列的載體。適用於細菌宿主之表現載體包括已知之細菌質體,諸如來自大腸桿菌之質體,包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物、更寬宿主範圍質體,諸如M13及絲狀單股DNA噬菌體。
適用於表現IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)的宿主細胞包括在適當啟動子之控制下的原核生物、酵母、昆蟲或更高級真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物,例如大腸桿菌或桿菌。更高級真核細胞包括如下所述之哺乳動物來源的所建立細胞株。亦可使用無細胞轉譯系統。關於蛋白質產生方法(包括抗體產生)的其他資訊可見於例如美國專利公開案第2008/0187954號、美國專利第6,413,746號及第6,660,501號以及國際專利公開案第WO 04009823號中,其各以全文引用的方式併入本文中。
亦宜使用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組IL-21結合分子,例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段。由於重組蛋白質一般正確摺疊、經適當修飾且具有完全功能,因此此類蛋白質可在哺乳動物細胞中表現。適合哺乳動物宿主細胞株之實例包括HEK-293及HEK-293T、Gluzman(Cell 23:175,1981)所述之COS-7猴腎細胞株及其他細胞株,包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、海
拉(HeLa)及BHK細胞株。哺乳動物表現載體可包含未轉錄元件,諸如複製起點、連接至待表現基因之適合啟動子及強化子,以及其他5'或3'側接未轉錄序列,以及5'或3'未轉譯序列,諸如必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點,以及轉錄終止序列。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質的桿狀病毒系統回顧於Luckow及Summers,BioTechnology 6:47(1988)中。
經轉型之宿主所產生的抗-HER2結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可根據任何適合方法純化。此類標準方法包括層析(例如離子交換、親和性及篩分管柱層析法)、離心、差異溶解性或用於蛋白質純化的任何其他標準技術。諸如六組胺酸、麥芽糖結合域、流感包膜序列及麩胱甘肽-S-轉移酶等親和性標記可連接至蛋白質,以藉由通過適當親和性管柱而容易純化。經分離之蛋白質亦可使用諸如蛋白分解、核磁共振及x射線結晶學之技術進行物理特徵分析。
舉例而言,來自分泌重組蛋白質至培養基中之系統的上清液可首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超過濾單元)濃縮。濃縮步驟之後,可將濃縮物施加於適合純化基質上。或者,可使用陰離子交換樹脂,例如具有側接二乙胺基乙基(DEAE)基團之基質或受質。基質可為丙烯醯胺、瓊脂糖、聚葡萄糖、纖維素或常用於純化蛋白質之其他類型。或者,可使用陽離子交換步驟。適合陽離子交換劑包括包含磺丙基或羧甲基之各種不溶基質。最後,使用疏水性RP-HPLC介質(例如具有側接甲基或其他脂族基的矽膠)的一或多個逆相高效液相層析(RP-HPLC)步驟可用於進一步純化IL-21結合分子。一些或所有前述純化步驟亦可以各種組合使用以提供均質重組蛋白質。
細菌培養物中所產生的重組IL-21結合蛋白(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)可經分離,例如藉由首先自細胞集結粒中萃取,隨後
進行一或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻層析步驟。可使用高效液相層析(HPLC)進行最後純化步驟。用於表現重組蛋白質的微生物細胞可藉由任何適宜方法(包括冷凍-解凍循環、音波處理、機械破碎或使用溶胞劑)來破碎。
此項技術中已知用於純化抗體及其他蛋白質的方法亦包括例如美國專利公開案第2008/0312425號、第2008/0177048號及第2009/0187005號中所述之彼等方法,各案以全文引用的方式併入本文中。
提供使用IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體,包括抗原結合片段、變異體及其衍生物)治療患有與IL-21表現或IL-21分泌性細胞有關之疾病之患者的方法。「IL-21分泌性細胞」意指表現IL-21的細胞,例如活化的T輔助細胞。用於偵測IL-21表現的方法在此項技術中已熟知且包括(但不限於)PCR技術、免疫組織化學、流式細胞術、西方墨點法、ELISA及其類似方法。
下文論述提及使用IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或抗原結合片段、保持本文所提供之抗IL-21抗體之所需特性(例如能夠特異性地結合IL-21且拮抗IL-21活性)的變異體或衍生物)診斷多種疾病及病症的方法及治療多種疾病及病症的方法。在一些實施例中,IL-21結合分子為鼠類、人類或人類化抗體。在一些實施例中,IL-21抗體與鼠類單株抗體19E3、9F11、9H10或8B6之一相同。在一些實施例中,IL-21抗體來源於鼠類單株抗體19E3、9F11、9H10或8B6之一。在某些實施例中,所得抗體為人類化抗體。在其他實施例中,IL-21結合分子包含YTE突變的人類IgG1恆定區。在特定實施例中,IL-21結合分子為K44VHa-N56Q。
在一個實施例中,治療包括向個體或患者施加或投與如本文所
提供之IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物),或向來自個體或患者之分離組織或細胞株施加或投與IL-21結合分子,其中該個體或患者患有疾病、疾病症狀或易患疾病。在另一個實施例中,治療亦可包括向個體或患者施加或投與包含IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)之醫藥組合物,或向來自個體或患者之分離組織或細胞株施加或投與包含IL-21結合分子之醫藥組合物,該個體或患者患有疾病,具有疾病症狀或易患疾病。
IL-21結合分子(例如本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)適用於治療多種發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症。此類發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症可為B細胞驅動性疾病或T細胞驅動性疾病。在一個實施例中,提供IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)用於治療或預防發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症。發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症之實例包括(但不限於)血管炎,例如抗嗜中性球細胞質抗體(ANCA)、ANCA相關性血管炎(AAV)或巨細胞動脈炎(GCA)血管炎;休格連氏症候群、發炎性腸病(IBD)、尋常天疱瘡、狼瘡腎炎、牛皮癬、甲狀腺炎、I型糖尿病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、僵直性脊椎炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎、克羅恩氏病、重症肌無力、視神經脊髓炎(NMO)、IgG4相關性疾病、全身性硬化症、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、僵直性脊椎炎、異位性皮膚炎、葡萄膜炎及移植物抗宿主疾病(GVHD)。在一個實施例中,提供IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)用於治療或預防B細胞驅動性疾病或惡性疾病。B細胞驅動性惡性疾病之實例可包括濾泡性淋巴瘤(FL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、慢性
淋巴細胞性白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症及多發性骨髓瘤(MM)。在一個實施例中,提供IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)用於治療或預防T細胞驅動性疾病或惡性疾病。T細胞驅動性惡性疾病之實例可包括血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤,其為濾泡性輔助T細胞(Tfh)的惡性疾病、多形性大細胞淋巴瘤、成人T細胞白血病、皮膚T細胞淋巴瘤及塞紮里症候群(Sezary syndrome)。
根據本發明之方法,至少一種IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物,如本文中在別處所定義)用於促進積極的治療反應(相對於自體免疫反應)。相對於自體免疫療法而言的「積極治療反應」意指與此等結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)之活性有關之疾病病狀的任何改善,及/或與疾病有關之症狀的改善。因此,舉例而言,疾病改善可以為完全反應為特徵。「完全反應」意指在校正任何先前測試結果的情況下不存在臨床上可偵測之疾病。根據本發明之方法治療之後,此反應在一些情況下可保持例如至少一個月。或者,疾病改善可歸類為部分反應。
臨床反應可使用篩選技術評估,諸如磁共振成像(MRI)掃描、x放射性成像、電腦化斷層攝影(CT)掃描、流式細胞術或螢光活化細胞分選儀(FACS)分析、組織學、大體病理學及血液化學,包括(但不限於)藉由ELISA、ELISPOT、RIA、層析及類似方法可偵測到的變化。除此等積極治療反應之外,經歷IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)治療的個體可經歷與疾病相關之症狀改善的有益作用。
亦提供IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)的用途,用於診斷性監測血液或組織中的蛋白質含量(例
如IL-21含量)作為臨床測試程序的一部分,以例如確定所指定治療方案的功效。舉例而言,藉由使抗體與可偵測物質偶合可促進偵測。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質及放射性物質。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶;適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素;適合螢光物質之實例包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素;發光物質之實例包括魯米諾(luminol);生物發光物質之實例包括螢光素酶、螢光素及水母素;且適合放射性物質之實例包括125I、131I、35S或3H。
製備及投與IL-21結合分子(例如本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)至有需要之個體的方法為熟習此項技術者所熟知或容易確定。投與IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)的途徑可為例如經口、非經腸、吸入或局部。如本文所用之術語非經腸包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、直腸或陰道投與。儘管所有此等投與形式明確涵蓋於本發明之範疇內,然而投與形式之另一實例為注射溶液,尤其用於靜脈內或動脈內注射或點滴的注射溶液。通常,適合醫藥組合物可包含緩衝液(例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液)、界面活性劑(例如聚山梨醇酯)、視情況存在之穩定劑(例如人類白蛋白)等。在與本文中之教示相容的其他方法中,IL-21結合分子(例如如本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)可直接遞送至有害細胞群位點,藉此增加患病組織於治療劑的暴露。在一個實施例中,直接投與呼吸道,例如吸入或鼻內投與。
如本文中所論述,IL-21結合分子(例如本文所提供之抗IL-21抗體
或其抗原結合片段、變異體或衍生物)可以醫藥學上有效量投與,以便活體內治療IL-21介導性疾病,諸如發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症。就此而言,應瞭解所揭示之結合分子可經調配以便促進投與及促進活性劑穩定性。根據本發明之醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之無毒無菌載劑,諸如生理鹽水、無毒性緩衝液、防腐劑及類似物。出於本申請案之目的,結合或未結合之IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)的醫藥學上有效量意謂足以達成與標靶之有效結合且達成益處(例如改善疾病或病狀之症狀或偵測物質或細胞)的量。適用於本文所揭示之治療性方法中的調配物描述於雷明頓(Remington)之Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.)第16版(1980)中。
本文所提供之某些醫藥組合物可以可接受劑型經口投與,包括例如膠囊、錠劑、含水懸浮液或溶液。某些醫藥組合物亦可藉由鼻用氣溶膠或吸入投與。此類組合物可使用苯甲醇或其他適合防腐劑、增強生物可用性之吸收促進劑及/或其他習知溶解或分散劑、於生理鹽水中製備成溶液。
可與載劑物質合併以製備單一劑型之IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其片段、變異體或衍生物)的量視所治療個體及特定投與方式而變。組合物可以單次劑量、多次劑量投與,或以輸注方式投與已確立之時段。亦可調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療性或預防性反應)。
根據本發明之範疇,抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可根據前述治療方法、以足以產生治療性作用的量投與人類或其他動物。本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物可以習知劑型投與此類人類或其他動物,習知劑型係根據已知技術、藉由將本發明之抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物與習
知醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑合併而製備。醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑之形式及特徵可依據與其合併之活性成分的量、投與途徑及其他熟知變數來確定。亦可使用包含本發明之一或多種IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)的混合物。
「治療有效劑量或量」或「有效量」意指IL-21結合分子(例如抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)當投與時相對於患有所治療之疾病或病狀之患者之療法引起積極治療反應的量。
本發明組合物用於治療IL-21介導性疾病(諸如發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症)之治療有效劑量視多種不同因素而變,包括投與方式、靶點、患者之生理狀態、患者是否為人類或動物、所投與之其他藥劑,及治療是否具預防性或治療性。通常,患者為人類,但亦可治療非人類哺乳動物,包括轉殖基因哺乳動物。治療劑量可使用熟習此項技術者已知之常規方法來滴定以使安全性及功效最佳化。
至少一種IL-21結合分子(例如抗體或其結合片段、變異體或衍生物)之投與量容易由一般技術者確定,而無需不當實驗來得到本發明。影響投與方式及至少一種IL-21結合分子(例如抗體、其抗原結合片段、變異體或衍生物)之相應量的因素包括(但不限於)經歷治療之個體的疾病嚴重程度、病史及年齡、身高、體重、健康及身體狀況。類似地,IL-21結合分子(例如抗體或其片段、變異體或衍生物)之投與量取決於投與方式及個體是否經歷此藥劑之單次給藥或多次給藥。
本發明亦提供IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)的用途,其用於治療發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症,例如血管炎(例如ANCA或GCA血管炎)、休格連氏症候群、全身性紅斑狼瘡及/或狼瘡腎炎、類風濕性關節炎、克羅恩氏病、重症肌無力或GVHD。
本發明亦提供IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)用於製造藥劑的用途,該藥劑用於治療發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症,例如血管炎(例如ANCA或GCA血管炎)、休格連氏症候群、全身性紅斑狼瘡及/或狼瘡腎炎、類風濕性關節炎、克羅恩氏病、重症肌無力或GVHD。
本發明進一步提供在診斷IL-21介導性疾病(諸如某些發炎性、免疫介導性或自體免疫疾病或病症)期間適用的診斷方法,其包括量測個體之組織或體液中的IL-21蛋白表現量及對所測表現量與正常組織或體液中的標準IL-21表現量進行比較,其中表現量相較於標準而言增加表示病症可藉由IL-21結合分子(例如本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段)治療。
使用熟習此項技術者已知的經典免疫組織化學方法,可利用本文所提供之抗IL-21抗體及其抗原結合片段、變異體及衍生物分析生物樣品中的IL-21蛋白含量(參見例如Jalkanen等人,J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen等人,J.Cell Biol.105:3087-3096(1987))。其他適用於偵測IL-21蛋白質表現之基於抗體之方法包括免疫分析,諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、免疫沈澱或西方墨點法。
「分析IL-21多肽之表現量」意指直接(例如藉由測定或估算絕對蛋白質含量)或相對(例如藉由與第二生物樣品中之疾病相關多肽含量比較)定性或定量量測或估算第一生物樣品中IL-21多肽之含量。可量測或估算第一生物樣品中之IL-21多肽表現量且與標準IL-21多肽含量比較,標準係獲自獲自未患病症之個體的第二生物樣品或依據得自未患病症之個體群體之平均含量來確定。如此項技術中所瞭解,一旦獲知「標準」IL-21多肽含量,則其可重複用作比較標準。
「生物樣品」意指獲自個體、細胞株、組織培養物或潛在表現
IL-21之細胞之其他來源的任何生物樣品。自哺乳動物獲得組織活檢及體液的方法在此項技術中已熟知。
本發明進一步提供包含IL-21結合分子(例如本文所述之抗IL-21抗體或其抗原結合片段)且可用於執行本文所述之方法的套組。在某些實施例中,套組在一或多個容器中包含至少一種經純化之抗IL-21抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,套組含有必需及/或足以進行偵測分析之所有組分,包括所有對照、進行分析之說明書及用於分析及呈現結果之任何所需軟體。熟習此項技術者容易認識到,所揭示之IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段)容易併入此項技術中已熟知之所確立套組形式之一中。
可藉由此項技術中已知之任何方法分析本文所提供之IL-21結合分子(例如本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)的免疫特異性結合。僅舉幾例而言,可使用的免疫分析包括(但不限於)使用諸如西方墨點法之技術的競爭性及非競爭性分析系統、放射免疫分析、ELISA(酶聯免疫吸附分析)、ELISPOT、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射分析、螢光免疫分析、蛋白質A免疫分析。此類分析為常規分析且在此項技術中已熟知(參見例如Ausubel等人編,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)第1卷,該文獻以全文引用的方式併入本文中)。
IL-21結合分子(例如本文所提供之抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)在組織學中(如在免疫螢光、免疫電子顯微術或非免疫學分析)可用於原位偵測IL-21或其保守性變異體或肽片段。原
位偵測可如下完成:自患者移出組織試樣,且向其施加經標記之IL-21結合分子,例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物,例如藉由將經標記之IL-21結合分子(例如抗體或片段)覆蓋至生物樣品上來施加。經由使用此類程序,不僅可測定IL-21或保守變異體或肽片段之存在,亦可測定其在所檢查組織中之分佈。使用本發明,一般技術者容易覺得多種組織學方法(諸如染色程序)中之任一者均可進行修改以達成此類原位偵測。
指定批次之IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物)之結合活性可根據熟知方法測定。熟習此項技術者使用常規實驗便能夠確定每次測定之操作及最佳分析條件。
適用於測定經分離之IL-21結合分子(例如抗IL-21抗體或其抗原結合片段、變異體或改變/突變型衍生物)之結合特徵的方法及試劑在此項技術中已知且/或可市購。針對此類動力學分析所設計之設備及軟體可市購(例如BIAcore®、BIAevaluation®軟體,GE Healthcare;KINEXA®軟體,Sapidyne Instruments)。
除非另外指明,否則使用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉殖基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習知技術實施本發明,此等習知技術屬於此項技術之技能範圍內。此類技術充分解釋於文獻中。參見例如Sambrook等人編(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2版;Cold Spring Harbor Laboratory Press);Sambrook等人編(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY);D.N.Glover編,(1985)DNA Cloning,Volumes I and II;Gait編(1984)Oligonucleotide Synthesis;Mullis等人之美國專利第4,683,195號;Hames及Higgins編(1984)Nucleic Acid Hybridization;Hames及Higgins編(1984)Transcription And Translation;Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,
Inc.);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986);Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning;the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Miller及Calos編(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory);Wu等人編,Methods In Enzymology,第154及155卷;Mayer及Walker編(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London);Weir及Blackwell編,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷;Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986);及Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。
通用的抗體工程改造原理闡述於Borrebaeck編,(1995)Antibody Engineering(第2版;Oxford Univ.Press)。通用的蛋白質工程改造原理闡述於Rickwood等人編,(1995)Protein Engineering,A Practical Approach(IRL Press,位於Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)。抗體及抗體-半抗原結合的通用原理闡述於:Nisonoff(1984)Molecular Immunology(第2版;Sinauer Associates,Sunderland,Mass.);及Steward(1984)Antibodies,Their Structure and Function(Chapman and Hall,New York,N.Y.)。另外,一般依循此項技術中已知且未具體描述的標準免疫學方法,如以下文獻中:Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York;Stites等人編,(1994)Basic and Clinical Immunology(第8版;Appleton & Lange,Norwalk,Conn.)以及Mishell及Shiigi(編)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and Co.,NY)。
闡述通用免疫學原理的標準參考文獻著作包括Current Protocols
in Immunology,John Wiley & Sons,New York;Klein(1982)J.,Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination(John Wiley & Sons,NY);Kennett等人編,(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press,NY);Campbell(1984)"Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Burden等人編,(Elsevere,Amsterdam);Goldsby等人編,(2000)Kuby Immunology(第4版;H.Freemand & Co.);Roitt等人(2001)Immunology(第6版;London:Mosby);Abbas等人(2005)Cellular and Molecular Immunology(第5版;Elsevier Health Sciences Division);Kontermann及Dubel(2001)Antibody Engineering(Springer Verlan);Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press);Lewin(2003)Genes VIII(Prentice Hall 2003);Harlow及Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press);Dieffenbach及Dveksler(2003)PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)。
上文所引述之所有參考文獻以及本文中所引述的所有參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。
以下實例係為了說明,而非為了限制而提供。
本發明之實施例可參考以下非限制性實例來進一步定義,該等非限制性實例詳細描述本發明之某些抗體的製備及使用本發明之抗體的方法。對於熟習此項技術者顯而易見的是,在不悖離本發明之範疇的情況下,可對材料與方法作出許多修改。
小鼠免疫及抗IL-21融合瘤產生
六週齡雌性Balb/c小鼠接受經純化之重組人類IL-21及食蟹獼猴IL-21蛋白質與BSA之結合物(Imject順丁烯二醯亞胺活化BSA套組,Pierce)交替進行的8輪腹膜內(IP)及蹠骨注射。簡言之,第1天開始用10μg IP及2.5μg蹠骨免疫原於Imject Alum(Thermo Scientific)中之乳液、根據製造商的說明書將小鼠免疫。免疫接種持續28天,間隔時間為4天。第15天及第28天,經由眶後放血將測試血液收集於血清分離管中。藉由ELISA,針對直接結合至IL-21及與IL-21R的競爭來分析血清。根據競爭ELISA中的中和效價,選擇小鼠來接受10μg人類IL-21與BSA結合物之融合前加打且在第30天處死。收穫脾細胞及淋巴結細胞且利用PEG使其與P3-X63-Ag8.653骨髓瘤融合以產生融合瘤。藉由在直接結合及競爭ELISA中篩選融合瘤上清液來鑑別抗IL-21特異性融合瘤,如前所述。在基於細胞的分析中,利用STAT3磷酸化之下調作為讀出來進一步測試陽性融合瘤的中和活性(IL-21經由STAT3傳導信號)。接著對中和融合瘤進行有限稀釋選殖且擴增用於抗體純化。
在整個融合瘤試驗中,使用競爭ELISA來鑑別免疫接種IL-21之後有良好反應的小鼠,隨後使用相同方法、根據中和融合瘤加以篩選。簡言之,Maxisorp ELISA盤(NUNC)在4℃用含有2μg/ml IL-21R-Fc之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)塗佈隔夜。該盤接著在室溫下用含有3% BSA之PBST(PBS+0.1% Tween)阻斷一小時。同時,連續稀釋測試血液(以篩選良好反應者)或校正融合瘤培養上清液中的IgG濃度且與2nM生物素化IL-21一起預培育。預培育之後,接著將混合物添加至ELISA盤之各孔中且在室溫下進一步培育半小時。洗滌之後,向各孔中添加抗生蛋白鏈菌素-HRP以偵測所結合IL-21之含量,作為測試血液或融合瘤IgG抑制IL-21/IL-21R-Fc相互作用的度量標準。
抗IL-21鼠類mAb之分離、選殖、測序、表現及純化
依循競爭ELISA中所述之程序,分析融合瘤培養上清液針對IL-
21/IL-21R-Fc相互作用的抑制能力。對陽性融合瘤進行有限稀釋選殖(LDC)程序以保證選殖性。證實次純系之功能性之後,對其進行分子選殖。
使用Dynabeads mRNA Direct套組,根據製造商說明書自融合瘤分離mRNA。接著使用SuperScript III逆轉錄酶、藉由逆轉錄酶聚合酶鏈反應將mRNA轉變成cDNA。合成兩組cDNA以避免PCR不準確。使用cDNA作為擴增抗體輕鏈及重鏈可變區(VL及VH)的模板。使用Invitrogen高保真度Taq聚合酶及Novagen小鼠Ig引子組(包括六個VH引子組及七個VL引子組)進行PCR。將經擴增之VL及VH PCR產物純化且選殖至Invitrogen pCR 2.1 Topo載體中,該等載體容易使DNA序列與T-A相容端接合。將經轉型之大腸桿菌塗鋪於X-gal/Carb瓊脂盤上。含有PCR插入物的細菌群落呈現白色。隨機選擇白色群落用於PCR以進一步檢驗插入。
選擇各種轉型所產生的四十八個白色群落用於測序。將群落接種於具有LB/Carb培養基的96孔盤中且接著壓印於LB/Carb瓊脂盤上。使用M13正向引子對瓊脂盤上生長的群落進行測序。根據序列結果,形成允許對VL及VH添加限制酶位點進行PCR擴增的引子,該等限制酶位點與人類IgG pOE表現載體相容。進行限制酶消化及接合以將VL及VH選殖至載體中,從而產生含有小鼠可變區及人類恆定區的嵌合抗體構築體。使用293轉染素試劑(293 transfectin reagent)將質體DNA轉染至293F細胞中。藉由Octet估算細胞上清液中的IgG表現量。使用蛋白質-A管柱純化上清液中的IgG。用SDS-PAGE分析經純化之IgG。
使用ELISA測試主要純系的交叉反應性。所測試的細胞激素包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9及IL-15。Maxisorp ELISA盤(NUNC)在4℃用含有2μg/ml不同細胞激素的PBS塗佈隔夜。該盤接著在室溫下用含有3% BSA之PBST(PBS+0.1% Tween)阻斷一小時。經純化之主要純系
IgG於PBST+3% BSA中連續稀釋且接著將混合物添加至ELISA盤之各孔中且在室溫下進一步培育半小時。洗滌之後,歷時1小時將二次抗體-HRP添加至各孔中。首先用PBST且接著用PBS洗滌各孔且添加得自Picrce的TMB溶液以偵測二次抗體。5'之後,藉由添加1N硫酸來中止反應。接著用ELISA讀取器在450nm讀盤以偵測結合。
各種抗IL-21鼠類mAb之人類化
產生鼠類mAb 9F11且藉由MedImmune分析特徵,其顯示相對於IL-21之結合KD為10nM的所需生物活性。在Shanghai ChemPartner Co.,使用CDR移植技術進行人類化處理。檢驗成功人類化之候選抗體9F11-4、9F11-6及9F11-11的特性(結果呈現於下文)。9F11及人類化9F11純系之V區域序列顯示於圖1A中。
藉由將19E3之CDR移植至所選人類生殖系構架上來對鼠類mAb 19E3進行人類化。對鼠類mAb 19E3之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的序列與可在公共NCBI資料庫中獲得之人類抗體生殖系序列進行比較。根據最高序列同源性鑑別人類受體構架。選擇最佳受體架構時,使用若干其他準則,包括關鍵殘基(維尼爾區(Vernier zone)、標準類殘基及VH/VL界面殘基)之匹配、免疫原性(生殖系頻率)、穩定性及表現。在此情況下,鑑別出一個生殖系家族為VH:VH1-46之受體架構。對J區段基因與親本序列在構架4及J區段上進行比較且選擇JH4用於VH。此完全人類生殖系受體模板命名為Ha。為了使VL受體序列達成最高同源性,對來自三種不同人類生殖系的個別構架區進行組合以設計出最佳的雜交生殖系受體序列。選用於VL鏈的人類模板(命名為K1)為O14(構架1)、O18(構架2)、L23(構架3)及JK1(構架4)之組合。鼠類序列與人類模板之間的構架同源性對於VH而言為約71%且對於VL而言為79%。
鑑別出被認為影響CDR環、使可變區結構穩定且影響VH與VL鏈
間堆積及/或相互作用的關鍵小鼠構架殘基且選擇性地引回至人類生殖系構架中以最佳地保留19E3結合抗原決定基及親和性。在此情況下,在作為第二受體構架模板的VL鏈人類模板(命名為K2)中,使44V及87F處的小鼠殘基產生回復突變。親本VL鏈與此等受體構架的比對顯示於圖1B中。
若完全人類受體模板(Ha)失去結合親和力,則設計用於VH鏈的另外兩種人類受體構架模板作為鑑別可影響19E3之結合活性之構架的工具。一個模板(命名為Hb)係藉由使鼠類構架1與VH1-46/JH4人類模板融合而設計;另一模板(命名為Hc)係藉由使鼠類構架3與VH1-46/JH4人類模板融合而設計。親本VH鏈與此等受體構架的比對顯示於圖1B中。
使如藉由Kabat所定義的CDR殘基融入針對VH與VL所設計的受體構架中以便產生人類化抗體。總共藉由GeneART合成三種人類化VH基因(Ha、Hb及Hc)及兩種VL基因(K1及K2),接著選殖至IgG1表現載體中。已產生一組人類化變異體且在生物化學及生物學分析中分析特徵。開發HTRF抗原決定基競爭分析以評估人類化變異體的IL-21結合活性。完全人類化VH模板Ha以及雜交變異體Hb及Hc展現與鼠類19E3 VH類似的IL-21結合活性。K2(位置44V及87F具有兩個小鼠殘基的人類化VL模板)展現的結合活性優於完全人類化K1變異體。所得人類化變異體(K2Ha)顯示具有與19E3類似的抗原結合親和力及抗原決定基特異性。為了使具有最佳性狀之人類化變異體(K2Ha)的小鼠殘基含量降至最低,用類似的人類殘基置換87F處、而非44V處之小鼠殘基,44V處之小鼠殘基對於保持IL-21結合活性具有關鍵作用。在19E3重鏈中鑑別出CDR2之位置56為高風險N連接型糖基化位點(NYT)且藉由用Q置換N來移除。僅有一個小鼠殘基的最終人類化抗體(K44VHaN56Q)與小鼠19E3相比,顯示不可區分的結合活性,且在所
有測試生物學分析中顯示的生物學活性在19E3的2-3倍範圍內。
鼠類mAb 9F11顯示相對於IL-21之結合KD為10nM的所需生物活性。在Shanghai ChemPartner Co.,使用CDR移植技術進行人類化處理。檢驗成功人類化之候選抗體9F11-4、9F11-6及9F11-11的特性,顯示相較於親本鼠類9F11,抗體完全保留針對IL-21的結合親和力及生物活性。9F11及人類化9F11純系之V區域序列顯示於圖1中。
本文所提供之各種抗IL-21抗體的特性顯示於表2中。
ND:未進行測試
此實例顯示測定K44VHa-N56Q與人類及食蟹獼猴IL-21蛋白質之相互作用的溶液相平衡結合常數(KD)。使用KinExA(動力學排除分析)3000平台(Sapidyne,Boise,ID)量測K44VHa-N56Q與重組人類(hu)及食蟹獼猴(cyno)IL-21之相互作用的平衡解離常數(KD)。各別50mg量之Azlactone珠粒(Thermo Scientific,Rockford,IL)根據儀器製造商的說明書用75μg/mL或150μg/mL濃度之huIL-21(獲自Protein Sciences/ADPE)或cynoIL-21(獲自Protein Sciences/ADPE)塗佈。珠粒於含有10mg/mL牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich,St.Louis,MPO)的
1M Tris緩衝液pH 8(Invitrogen,Carlsbad,CA)中洗滌且阻斷,且在4℃儲存直至使用。在樣品緩衝液(磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS,Invitrogen),pH 7.4;0.1% BSA;0.02%疊氮化鈉(NaN3,Sigma-Aldrich))中,以500fM及50pM之濃度(分別為500fM及50pM K44VHa-N56Q系列製備批量K44VHa-N56Q);將每一者分配至分開的2組13根管中(各系列用1根管)。每個系列向1根管中添加濃度為4nM(50pM K44VHa-N56Q)或100pM(500fM K44VHa-N56Q系列)的人類或食蟹獼猴IL-21,接著對剩餘11根管進行連續稀釋,每個系列中留1根樣品管作為K44VHa-N56Q單獨受體對照物。個別樣品混合物中之人類或食蟹獼猴IL-21的最終濃度在1.95fM至100pM範圍內(500fM K44VHa-N56Q),及78.1fM至4nM範圍內(50pM K44VHa-N56Q)。此等樣品混合物在室溫下平衡2天至7天,且在KinExA平台上分析。經IL-21塗佈的Azlactone珠粒漿料於珠粒小瓶中用儀器緩衝液(PBS,pH 7.4,0.02% NaN3)稀釋至30mL且附著至KinExA儀器。利用使用者定義的定時程式將IL-21/Azlactone珠粒依序轉移至儀器中的毛細流動池中,且將個別樣品混合物注射在經IL-21塗佈的珠粒上。藉由儀器緩衝液洗滌珠粒來移除未結合的樣品溶液。使1μg/mL或2μg/mL經DyLight649標記之山羊抗huIgG(H+L)第二試劑(Thermo Scientific)通過珠粒以偵測仍結合至經IL-21塗佈之珠粒的受體(K44VHa-N56Q)。珠粒再次用儀器緩衝液洗滌以移除過量(未結合)標記。量測仍與珠粒有關之螢光的量,且將信號換算為自由受體百分比(K44VHa-N56Q)。樣品之間,自流動池沖洗珠粒包且補充新鮮的經IL-21塗佈之Azlactone珠粒以備用於後續樣品。各系列(500fM及50pM K44VHa-N56Q)之所有樣品的資料一經收集,則產生等勢線,其標繪在IL-21之各種濃度下所偵測之游離K44VHa-N56Q的量。接著使用獲得各種相互作用之個別KD的儀器評估軟體(KinExA Pro Software,2.0.1.26版,
Sapidyne),在雙重曲線分析中評估所得的2條結合曲線。
藉由KinExA量測K44VHa-N56Q相對於人類及食蟹獼猴IL-21的結合。K44VHa-N56Q以2種濃度系列製備:500fM及50pM,且人類IL-21或食蟹獼猴IL-21蛋白質依各種系列連續稀釋。一旦達到平衡,則使用KinExA儀器量測各樣品混合物中剩餘之游離K44VHa-N56Q的濃度。此如下完成:使各種混合物之樣品通過珠粒且接著暴露於螢光標記之抗IgG試劑之後,記錄仍與IL-21所塗珠粒有關之螢光的量。對所記錄之游離K44VHa-N56Q的量相對於huIL-21或cynoIL-21蛋白質濃度作圖,且使用KinExA平台的評估軟體將各資料集相對於單位點親和模型擬合。在雙重曲線分析(分別為圖2A及圖2B中,根據若干參數同時回復最佳解且計算真實溶液相結合常數)中,KinExA軟體全面擬合兩個結合曲線(500fM及50pM IgG)。在此等條件下,K44VHa-N56Q結合至huIL-21蛋白質的KD經計算為515fM(KD之95% CI:279至844fM),而K44VHa-N56Q對於cynoIL-21蛋白質的結合經計算為352fM(KD之95% CI:134至685fM)。
K44VHa-N56Q經證明以μM親和力弱結合至鼠類IL-21,如用KinExA平台所量測。
抗IL-21純系阻斷IL-21誘導STAT3磷酸化
如下文所述測定經純化之抗IL-21抗體抑制人類及獼猴IL-21誘導STAT3磷酸化(pSTAT3)的能力。
簡言之,根據製造商說明書,在離心之後,自CPT管(BD Vacutainer)分離出全部的人類周邊血液單核細胞(PBMC)。抗IL-21抗體與人類或獼猴IL-21(20pM)一起在96孔圓底盤中、在37度下預培育60分鐘。此培育之後,向各孔中快速添加PBMC(0.4×106/孔)且與IL-21/IgG一起在37度下培育15分鐘。刺激之後,細胞用每孔100μl預溫
熱溶胞/固定緩衝液(BD Phosflow)固定10分鐘(在37度下),隨後在冰上用每孔225μl Perm緩衝液III(BD Phosflow)滲透30分鐘。洗滌細胞兩次(PBS/2% BSA)且在室溫下用抗pSTAT3(pY705,BD Phosflow)染色30分鐘。用染色緩衝液洗滌細胞且在LSR II流式細胞儀(BD Biosciences)上使用FACSDiva軟體分析。
如所述用人類及獼猴IL-21刺激誘導總人類PBMC中之pSTAT3含量增加3至5倍(圖3A)。表明抗IL-21抗體抑制IL-21誘導pSTAT3上調的代表性曲線顯示於圖3B中。所測試的所有純系在此分析中均達到100%抑制。pSTAT3分析中之抗IL-21純系之IC50值概述於表3中。此等資料顯示所述抗IL-21抗體能夠抑制IL-21R下游之早期信號傳導事件。
K44VHa-N56Q已顯示可弱結合至鼠類IL-21。用鼠類IL-21刺激小鼠脾細胞誘導磷酸化STAT3之細胞內含量增加4倍。K44VHa-N56Q不能抑制鼠類IL-21誘導STAT3磷酸化。此等資料表明K44VHa-N56Q不中和鼠類IL-21之生物活性。
IL-21為γc受體細胞激素家族之一員,其利用與特定受體匹配的共同γ鏈來介導生物活性。在K44VHa-N56Q或對照人類IgG1-YTE抗體的存在或不存在下,使用IL-2、IL-4、IL-7、IL-15或IL-21細胞激素,
使用γc鏈刺激人類血液淋巴細胞。藉由評估適於各細胞激素之STAT分子之磷酸化來量測下游信號傳導。K44VHa-N56Q對相關IL-2、IL-4、IL-7或IL-15細胞激素之下游信號傳導無影響。此等資料顯示K44VHa-N56Q具有特異性中和人類細胞中之IL-21路徑的作用。
IL-21經由其同源受體發生的信號傳導引起STAT3之活化及磷酸化。本文所述之資料證明K44VHa-N56Q可對人類與獼猴IL-21具有抑制pSTAT3上調的反應,但對小鼠IL-21則無。此外,此抑制特異性針對IL-21,原因在於K44VHa-N56Q的確不影響相關γc細胞激素受體(諸如IL-2、IL-4、IL-7及IL-15之受體)下游之STAT分子活化。因此,K44VHa-N56Q為IL-21R信號傳導事件的強效及特異性抑制劑。
IL-21阻斷抑止NK-92細胞產生IFNγ
如下評估經純化之抗IL-21抗體對IL-21誘導NK-92細胞產生IFNγ的影響。
NK-92細胞於由以下組成的完全生長培養基中生長:MEM alpha Glutamax基礎培養基,其補充有碳酸氫鈉(1.5g/L)、肌醇(0.2mM,Sigma Aldrich)、2-巰基乙醇(0.1mM)、葉酸(0.02mM,Sigma Aldrich)、重組IL-2(100U/ml,R&D Systems)、馬血清(12.5%)及胎牛血清(12.5%)。除非另外指明,否則所有試劑購自Invitrogen。洗滌細胞且再懸浮於不含有IL-2的培養基中維持16至24小時,隨後用IL-21刺激。為了評估抗IL-21純系之效能,將抗體與人類或獼猴IL-21(200pM)一起在96孔扁平底盤中、在37度下預培育60分鐘。接著將0.5×105個NK-92細胞添加至盤中且在37度下培育24小時。使用MSD人類IFNγ單工分析,根據製造商說明書(Meso Scale Discovery)量化上清液中的IFNγ產生。
抗IL-21純系抑制人類及獼猴IL-21誘導NK-92細胞產生IFNγ的能力呈現於圖4中。純系K2Ha-N56Q、K(44V)Ha-N56Q及K(44V)Ha6-
N56Q能夠完全抑制此等培養物中之IFNγ產生,針對人類及獼猴IL-21的效能類似。NK-92細胞分析中所評估之純系之IC50值的概要提供於表4中。此等資料證明,所測試的抗IL-21抗體調節NK-92細胞之活性,如依據IFNγ產生在24小時時完全阻斷所證明。
抗IL-21純系抑制外源性IL-21誘導漿細胞分化
為了測定抗IL-21抗體對B細胞活性的影響,進行漿細胞分化分析。
根據製造商說明書,離心之後,自CPT管(BD Vacutainer)中分離人類PBMC。使用MACS細胞分離試劑(人類B細胞分離套組II,Miltenyi Biotec)負向選擇B細胞。使用此技術所得的B細胞常規純度為>97%。值得注意的是,使用此方法分離的總B細胞製劑含有未處理B細胞與記憶B細胞之群體,但因CD43之表現而排除PC,MACS套組之抗體選擇混合物靶向CD43。用於此等實驗的培養基為RPMI 1640(Invitrogen),其補充有10%FCS、青黴素-鏈黴素(100個單位/毫升青黴素、100μg/ml鏈黴素)、2-巰基乙醇(55μM)、L-麩醯胺酸(2mM)及HEPES(5mM)。抗IL-21抗體於具有刺激混合物的96孔圓底盤中、在37度下預培育60分鐘,該混合物包括人類或獼猴IL-21(2nM)、抗CD40(0.1μg/ml,山羊IgG,R&D Systems),及抗IgM F(ab')2(5.0μg/ml,Jackson ImmunoResearch Laboratories)。接著向盤中添加0.5-1.0×105個B細胞,最終體積為150μl。
刺激6天之後,將細胞染色且使用流式細胞術分析以量化培養液中漿細胞之頻率。將細胞洗滌(PBS/2% FBS)且在4度下與抗IgD(FITC或PE)、抗CD38(別藻藍蛋白,純系HB7)(BD Pharmingen)染色30分鐘且在LSRII流式細胞儀上使用FACSDiva軟體分析。另外,收穫上清液且藉由ELISA量化Ig產生。簡言之,96孔扁平底盤在4℃用5μg/ml於PBS中稀釋之山羊抗人類IgG(Bethyl Laboratories)塗佈隔夜。洗滌盤且用含有0.2% BSA的PBS阻斷。稀釋上清液且在盤上培育隔夜。所結合的Ig用稀釋於阻斷緩衝液中的山羊抗人類IgG鹼性磷酸酶(0.2μg/ml,Bethyl Laboratories)偵測。盤使用SigmaFast磷酸對硝基苯酯錠劑(Sigma Aldrich)顯色且使用SpectraMax讀盤器(Molecular Devices)在405nm量測特定吸光度。
如上文所述之人類B細胞經人類或獼猴IL-21刺激引起IgD- CD38hi PC群體產生(圖5A及圖5B)。若干純系(包括19E3.1、9F11.1及9H10.1)能夠在此等條件下完全抑制PC分化(圖5A及圖5B)。純系8B6.1抑制獼猴IL-21(而非人類IL-21)所誘導之PC分化。抗IL-21純系之IC50值概述於表5中。另外,在對照條件下,經IL-21、抗CD40及抗IgM刺激使得截至第6天的Ig產生在30μg/ml至40μg/ml範圍內(圖5C)。純系19E3.1及9F11.1以劑量依賴性方式抑制人類B細胞分泌Ig(圖5C)。純系19E3.1能夠將作為對人類與獼猴IL-21之反應的IgG產生均抑制>99%,而9F11.1將人類及獼猴IL-21所致之IgG產生分別抑制97%及79%。累積起來,此等資料表明所述抗IL-21純系能夠顯著地抑制外源性人類及獼猴IL-21所誘導的人類漿細胞分化及Ig分泌。
抗IL-21純系抑制活化CD4+ T細胞所誘導的PC分化
在如下文所述的共培養物分析中,測試抗IL-21純系阻斷活化CD4+ T細胞所誘導之漿細胞分化的能力。
離心之後,自CPT管(BD Biosciences)中分離出人類PBMC。使用MACS細胞分離試劑(Miltenyi Biotec)負向選擇B細胞及CD4+ T細胞。總B細胞及CD4+ T細胞之常規純度為>97%。CD4+ T細胞在37℃經絲裂黴素-C(mitomycin-C)(30μg/ml,Sigma Aldrich)處理30分鐘,接著洗滌且在37℃、於完全培養基中擱置另外30分鐘。1.0×105個經絲裂黴素-C處理之CD4+ T細胞及0.5×105個經純化之B細胞(/孔)與抗CD3/抗CD28珠粒(T細胞與珠粒比率5:1)一起以200μl之最終體積共培養。用於所有實驗的培養基為RPMI 1640(Invitrogen),其補充有10% FCS、青黴素-鏈黴素(100個單位/毫升青黴素、100μg/ml鏈黴素)、2-巰基乙醇(55μM)、L-麩醯胺酸(2mM)及HEPES(5mM)。抗IL-21抗體以0-200nM之濃度添加至培養物中。培養7天之後,使用流式細胞術量化漿細胞。將細胞洗滌(PBS/2% FBS)且在4度下與抗IgD(FITC或PE)、抗CD38(別藻藍蛋白,純系HB7)(BD Pharmingen)染色30分鐘且在LSRII流式細胞儀上使用FACSDiva軟體分析。所有條件同時收集,因此所顯示事件的數目反映相對細胞數目。然而,總細胞數目係使用AccuCount Particles(Spherotech)測定。
B細胞與活化CD4+ T細胞之共培養導致IgD- CD38hi PC群體之出
現,截至第7天,其中68.5%之CD19+細胞表現此PC表型(圖6A)。19E3.1或9F11.1之添加以劑量依賴性方式抑制PC分化,各分別達成80%及78%之最大抑制(圖6B及圖6C)。此等資料表明抗IL-21純系可在很大程度上阻斷活化T細胞重新產生IL-21所誘導的漿細胞分化。
抗IL-21純系抑制未處理CD4+ T細胞擴增
IL-21已顯示可在次最佳致敏條件下支持CD4+ T細胞增殖。純化人類未處理CD4+ T細胞且在活體外、在親本抗體19E3.1存在或不存在下用抗CD3及IL-21刺激。培養四天之後,藉由量測ATP之聚集來評估增殖。如先前所報導,所偵測之ATP之量與培養中之代謝活性細胞的數目成正比。19E3.1以劑量依賴性方式減弱IL-21誘導的增殖(兩個供者的平均IC50=61.02pM)。此等資料顯示K44VHa-N56Q(MEDI7169)親本抗體19E3.1抑制IL-21驅動人類未處理CD4+ T細胞增殖(圖7)。
藥物動力學
在三項研究中,使用猴作為可以合理準確性預測人類PK的動物模型來評估K44VHaN56Q(YTE抗體)的藥物動力學(PK)(Oitate等人,Drug Metab.Pharmacokinet.26(4):423-430(2011))。清除率為根據動物資料按比例調整之用於預測人類PK的主要PK參數;較小CL值表明分子可在體內停留較長時間。K44VHaN56Q於猴中之CL值在1.08至4.37mL/d/kg範圍內。典型的治療性抗體,諸如貝伐單抗(Bevacizumab)(Avastin®)、達利珠單抗(Daclizumab)(Zenapax®)、英利昔單抗(Infliximab)(Remicade®)及利妥昔單抗(Rituximab)(Rituxan®),與相應CL值5.78、5.30、11.5及17.0(mL/d/kg)關聯(Dong等人,Clin Pharmacokinet.50(2):131-142(2011).猴體重假設為3kg)。此等CL值大於K44VHaN56Q之估算值。因此,預期K44VHaN56Q在體內停留的時間長於典型治療性抗體。
異種GVHD小鼠模型
當所轉移(供者)之T細胞感到宿主(受者)MHC/HLA分子所呈遞之外來抗原時,GVHD產生。NOD/SCID/IL-2受體γ鏈缺乏(NSG)小鼠缺少成熟T及B細胞、功能性NK細胞及巨噬細胞。此等小鼠顯示細胞激素信號傳導因γc受體損失而減少。
在異種GVHD模型中,將人類PMBC轉移至NSG小鼠受者中。由於小鼠免疫功能不全,因此小鼠免疫系統不排斥人類細胞。人類細胞識別小鼠環境為外來環境且變得活化且增殖。活化的人類細胞產生“細胞激素風暴”,產生重度免疫反應性級聯,從而影響肝臟、胃腸道及皮膚,最終導致動物死亡。可自GVHD小鼠血液中分離出能夠產生IL-21的大多數細胞。
預防性研究中使用三十五隻雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtm1Wj1/SzJ;The Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)。小鼠在研究開始時為5至7週齡且體重為16.8至22.4公克。
人類周邊血液之分離
自兩個健康供者收集人類血液置於含有肝素鈉的細胞製備管(CPT)(Becton Dickinson,San Jose,CA)中。根據製造商說明書自CPT管中分離出單核細胞。簡言之,將管在室溫下以1700×g離心25分鐘。離心之後,收穫單核細胞。細胞於PBS中藉由以400×g之相對離心力離心10分鐘來洗滌兩次。接著將細胞計數且再懸浮於適量PBS中且在注射之前,在室溫下保持(最後洗滌之後立即進行)。
抗體
在此實例中,使用人類IgG1κ-YTE(NIP-228-YTE;MedImmune,Cambridge,UK)作為對照mAb。將對照mAb等分試樣且作為儲備溶液在-80℃冷凍。調配緩衝液為25mM組胺酸、7%蔗糖、0.02%(w/v)聚山梨醇酯80,pH 6.0。藉由磷酸鹽緩衝生理鹽水PBS將儲備溶液之等
分試樣(60.6mg/mL)稀釋至1mg/mL來製備給藥溶液。處理製劑在4至8℃儲存。
K44VHa-N56Q(MEDI7169)作為經等分且冷凍的儲備溶液在-80℃儲存。調配緩衝液為25mM組胺酸、205mM蔗糖、0.02%(w/v)聚山梨醇酯80,pH 6.0。藉由PBS將儲備溶液之等分試樣(47.6mg/mL)稀釋至1mg/mL來製備給藥溶液。處理製劑在4至8℃儲存。
人類細胞之注射,GVHD之療法及評估
如表6中所示進行給藥。簡言之,第0天,將12.71×106個來自供者1的經純化之人類PBMC或13.46×106個來自供者2的經純化之人類PBMC腹膜內(IP)注射至5至7週齡雌性NSG小鼠中。腹膜內投與兩百微克(200μL體積)K44VHa-N56Q(MEDI7169)、對照mAb或相同體積的單獨PBS(媒劑),第-1天開始,一週3次,隨後注射人類PBMC。
F=雌性;Fr=星期五;IP=腹膜內;mAb=單株抗體;Mo=星期一;N/A=不適用,當動物未給藥時;PBMC=周邊血液單核細胞;PBS=磷酸鹽緩衝生理鹽水;ROA=投與途徑;W=星期三;在研究期間,個別地量測體重,每週至少一次。若小鼠經測定失去20%體重或若小鼠消瘦/瀕死或以其他方式處於疼痛或痛苦中,則將小鼠安樂死。死亡與人道安樂死同義使用,用於追蹤存活之目的。
藉由流式細胞術評估T細胞數目及表型
自小鼠眶後竇放血置於肝素微量採血管中。在所有實驗中,在所有時間點使用100μL血液。使用ACK溶胞緩衝液(Life Technologies,Grand Island,NY)執行紅血球溶胞步驟,剩餘細胞與1:4稀釋的TruStain Fc阻斷劑(BioLegend,San Diego,CA)一起培育10分鐘,接著在4℃用以下抗體混合物染色30分鐘以顯現CD4及CD8 T細胞:與V500結合的抗人類CD45(純系HI130;BioLegend,San Diego,CA)、與AF700結合的抗人類CD4(純系RPA-T4;BioLegend,CA),及與BV711結合的抗人類CD8(純系RPA-T8;BioLegend,San Diego,CA)。洗滌樣品,於2%多聚甲醛中固定,且在使用FACSDiva軟體的Becton Dickinson LSR II流式細胞儀上操作。使用FlowJo軟體(第9版)分析樣品。人類細胞依據表現人類CD45抗原的彼等細胞來鑑別。在LSRII上,所有條件下的染色血液(100μL)收集相同的體積,因此所顯示的事件數目反映不同療法中的相對細胞數目。
藉由多工ELISA評估經處理之小鼠血清中的人類細胞激素
收集縱向血清樣品且使用人類Th17多工套組(磁性珠粒,預混合)(Merck Millipore,Billerica,MA)聯合Luminex 200分析儀來分析;依循製造商說明書。
使用GraphPad Prism(Mac OS X使用6.0d版)。對經K44VHa-N56Q(MEDI7169)處理之小鼠產生的血清細胞激素與經對照mAb處理
之小鼠(供者1)或經對照mAb及PBS(媒劑)組合處理之小鼠(供者2)進行比較。除非方差經F檢驗測定為顯著不同的,否則使用不成對t檢驗(unpaired t-tests)聯合韋爾奇氏校正(Welch's correction)來分析此等資料,且接著進行曼-惠特尼檢驗(Mann Whitney tests)。對於所有顯著差異而言,P<0.05。
K44VHa-N56Q(MEDI7169)抑制異種GVHD誘發消瘦及T細胞擴增
已報導IL-21影響T細胞功能。因此,研究K44VHa-N56Q(MEDI7169)抑制異種GVHD的能力,異種GVHD在很大程度上由CD4+ T細胞介導。如上文所述,將人類PBMC注射至免疫功能不全NSG小鼠中,且第21天注意到接受對照mAb(人類IgG1 mAb)(圖8A)或PBS媒劑的小鼠出現消耗病。第-1天開始一週3次接受200μg K44VHa-N56Q(MEDI7169)的小鼠呈現健康狀態(圖8B)且與未接受人類細胞的對照小鼠無法區分。血液分析已揭露在接受對照mAb(或PBS)的小鼠中,人類CD45+細胞已擴增(圖8C)。相比之下,接受K44VHa-N56Q(MEDI7169)之小鼠的血液中存在的人類CD45+細胞顯著減少(圖8D)。在經對照mAb(及PBS)處理之小鼠中,人類CD45+細胞之此擴增大部分由CD4陽性細胞組成(圖8E),而經K44VHa-N56Q(MEDI7169)處理之小鼠中的CD4陽性細胞之百分比大大降低,諸如第35天所注意到(圖8F)。此等結果與以下一致:將人類PBMC移植入免疫功能不全小鼠中之後,K44VHa-N56Q(MEDI7169)抑制人類CD4+ T細胞擴增。
當隨著時間追蹤小鼠時,發現接受PBS媒劑或對照mAb之動物中的人類CD45+細胞數目穩定增加。然而,此等細胞在接受K44VHa-N56Q(MEDI7169)的小鼠中的確未擴增(圖9)。重要的是,K44VHa-N56Q(MEDI7169)停藥之後約3週,發現人類CD45+細胞開始擴增,在恢復處理時接著再次下降(圖9)。此等資料表明K44VHa-N56Q(MEDI7169)可顯著抑制T細胞擴增,此在停藥時為可逆的。
K44VHa-N56Q(MEDI7169)預防GVHD誘發體重減輕及死亡
監測到未接受人類細胞(未處理)或接受人類PBMC及PBS媒劑、對照mAb或K44VHa-N56Q(MEDI7169)的小鼠出現體重降低及存活,小鼠接受人類PBMC之前一天(第-1天)開始接受PBS媒劑、對照mAb或K44VHa-N56Q(MEDI7169)。發現接受PBS或對照mAb之小鼠出現體重快速降低(圖10A)及死亡或當體重下降20%時,施加安樂死。在兩項獨立研究中,注射PBS或對照mAb的所有小鼠(n=16)在接受人類PBMC之後的研究第37天死亡或安樂死(圖10B)。相比之下,接受K44VHa-N56Q(MEDI7169)的所有小鼠(n=10)存活且保持健康直至K44VHa-N56Q(MEDI7169)停藥(圖10B)。在一個實驗中,K44VHa-N56Q(MEDI7169)停藥之後,小鼠保持健康約20天,接著體重快速下降且研究第31天之後不久死亡或施加安樂死(圖10B)。在使用第二供者之人類PBMC的獨立研究中,停止K44VHa-N56Q(MEDI7169)之後,小鼠保持活力約40天。此等資料表明K44VHa-N56Q(MEDI7169)防止死亡,當K44VHa-N56Q(MEDI7169)停藥時,此為可逆的。
K44VHa-N56Q(MEDI7169)抑制若干細胞激素產生且為可逆的
在多個時間點收集來自注射有供者2(圖11)或供者1(圖12)細胞之小鼠的血清,且使用Millipore的MILLIPLEX MAP系統分析25種細胞激素的表現。所檢查之細胞激素中逾半低於偵測含量。對於可偵測的細胞激素而言,K44VHa-N56Q(MEDI7169)在兩個獨立實驗中誘導GM-CSF、IL-10及TNF發生明顯減少。在一個實驗中,IFNγ顯著減少,且在第二個實驗中,有降低傾向。在兩個實驗之一中,發現IL-17A及IL-9顯著減少。在兩個實驗中,均發現IL-5顯著增加(圖11)。使用Sysmex XT-2000iv血液學分析儀進行全血計數(CBC),且重要的是,在IL-5增加的小鼠中未注意到嗜伊紅血球增加。在兩個實驗中均發現IL-21增加。IL-21增加與食蟹獼猴毒性研究中所得結果一致,IL-
21增加反映循環中結合至且中和細胞激素之藥物的量。
如圖9中所示,K44VHa-N56Q(MEDI7169)抑制CD4+ T細胞擴增,當停藥時,此為可逆的。此在第二項研究中得到確認(圖12)。值得注意的是,細胞擴增之後,若干種細胞激素亦增加,包括TNF、IFNγ及IL-10(圖12)。此等資料顯示,抗IL-21抗體(亦即K44VHa-N56Q(MEDI7169))抑制T細胞擴增及細胞激素產生,當停止K44VHa-N56Q(MEDI7169)時,T細胞擴增與細胞激素產生均為可逆的。
實驗設計
治療性研究中使用二十隻雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtm1Wj1/SzJ;The Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)。小鼠在研究開始時為8週齡且體重為18.0至22.3公克。
如上文在實例4所述,收集且製備人類血液。
如上文在實例4中所述,獲得對照mAb及測試mAb,處置且儲存。
如表7中所示進行給藥。簡言之,第0天,將12×106個得自供者1之經純化之人類PBMC腹膜內注射至8週齡雌性NSG小鼠中。第7天開始,一週3次,腹膜內注射兩百微克(200μL體積)K44VHa-N56Q(MEDI7169)或對照mAb。另一組第14天開始,一週3次,腹膜內注射K44VHa-N56Q(MEDI7169)(200μg/200μL)。
F=雌性;Fr=星期五;IP=腹膜內;mAb=單株抗體;Mo=星期一;N/A=不適用,當動物未給藥時;PBMC=周邊血液單核細胞;PBS=磷酸鹽緩衝生理鹽水;ROA=投與途徑;W=星期三如上文在實例4中所述,對GVHD、T細胞數目及表型以及血清中之人類細胞激素進行評估。
全血計數之自動化評估
使用Sysmex XT-2000iv自動化血液學分析儀(Sysmex America,Mundelein,IL)評估總白血球數目,以及紅血球數目、血容比及血紅蛋白值。第7、14及21天,將小鼠眶後竇放血置於肝素微量採血管中。進行1:10稀釋(將20μL各全血樣品稀釋於180μL PBS中),接著將樣品輸入分析儀中且將所得資料乘以稀釋因數十。
K44VHa-N56Q(MEDI7169)之治療性處理保護小鼠免患GVHD
為了確定治療性給予的K44VHa-N56Q(MEDI7169)是否能夠保護小鼠免患GVHD,如上文所述注射人類PBMC,且在注射人類細胞後的第7天或第14天之後給予K44VHa-N56Q(MEDI7169)。如圖13中所示,接受對照mAb的小鼠在接受人類細胞之後的兩週內開始死亡,且截至第26天全部死亡。第7天接受K44VHa-N56Q(MEDI7169)的小鼠完全免於GVHD誘導的死亡。第14天(對照小鼠開始死亡之後)接受K44VHa-N56Q(MEDI7169)的小鼠部分地受到保護;第14天群組5隻小鼠中有2隻活過第26天,此時所有對照小鼠已死亡。第7天接受人類細胞及對照mAb的小鼠出現重度GVHD誘導的貧血。第7天開始接受K44VHa-N56Q(MEDI7169)的小鼠能夠維持較高的正常紅血球、血容比及血紅蛋白值,此更接近於未接受細胞之未處理動物的彼等值(圖 14)。
此等資料顯示,抗IL-21抗體(亦即K44VHa-N56Q)藉由減少或消除與疾病有關之症狀來保護小鼠免患GVHD。
***
對特定實施例之前述說明將因此充分地揭露本發明之一般性質:在不脫離本發明之一般概念的情況下,其他人可藉由應用此項技術之技能範圍內之知識、根據各種應用而容易潤飾及/或調適此等特定實施例,而無需進行不當實驗。因此,基於本文所呈現之教示內容及指導,希望此等調適及潤飾屬於所揭示實施例之等效物的含義及範圍內。應瞭解,本文中之片語或術語係出於說明而非限制之目的,因此本說明書中之術語或片語應由熟習此項技術者根據教示內容及指導進行解譯。本發明藉由以下申請專利範圍進一步描述。
<110> 美商麥迪紐有限責任公司
<120> 特異性針對IL-21之結合分子及其用途
<130> IL21-100P1
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<213> 食蟹獼猴
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<223> 人工序列之描述:19E3 VH序列之合成性人類化型式
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述:19E3 VL序列之合成性人類化型式
<400> 65
Claims (103)
- 一種特異性結合至IL-21抗原決定基的經分離之結合分子或其抗原結合片段,其中該結合分子與包含19E3、9F11、8B6或9H10之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的抗體或其抗原結合片段特異性結合至相同的IL-21抗原決定基。
- 一種經分離之結合分子或其抗原結合片段,其特異性結合至IL-21且競爭性地抑制包含19E3、9F11、8B6或9H10之VH及VL的抗體或其抗原結合片段結合IL-21。
- 如請求項1或2之結合分子或其片段,其中19E3之該VH及VL分別包含SEQ ID NO:6及11,9F11之該VH及VL分別包含SEQ ID NO:28及33,8B6之該VH及VL分別包含SEQ ID NO:42及47,且9H10之該VH及VL分別包含SEQ ID NO:52及57。
- 一種特異性結合至IL-21之包含抗體VL的經分離之結合分子或其抗原結合片段,其中該VL包含VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13及14;SEQ ID NO:34、35及36;SEQ ID NO:48、49及50或SEQ ID NO:58、59及60一致,或除一或多個該等VL-CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
- 一種特異性結合至IL-21之包含抗體VH的經分離之結合分子或其抗原結合片段,其中該VH包含VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:7、8及9;SEQ ID NO:29、30及31;SEQ ID NO:43、44及45或SEQ ID NO:53、54及55一致,或除一或多個該等VH-CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
- 一種特異性結合至IL-21之包含抗體VL的經分離之結合分子或其 抗原結合片段,其中該VL包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:57。
- 一種特異性結合至IL-21之包含抗體VH的經分離之結合分子或其抗原結合片段,其中該VH包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:52。
- 如請求項1至7中任一項之結合分子,其中該結合分子或其片段包含抗體或其抗原結合片段。
- 一種特異性結合至IL-21之包含VL及VH的經分離之抗體或其抗原結合片段,該VL及VH包含VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13、14、7、8及9;SEQ ID NO:34、35、36、29、30及31;SEQ ID NO:48、49、50、43、44及45;或SEQ ID NO:58、59、60、53、54及55一致,或除一或多個CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
- 一種特異性結合至IL-21的經分離之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包含VH及VL,其中該VH及VL分別包含分別與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:37及40、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:47,以及SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:57。
- 如請求項10之抗體或其抗原結合片段,其中該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO:19且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO:21。
- 如請求項8至11中任一項之抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈恆定區或其片段。
- 如請求項12之抗體或其抗原結合片段,其中該重鏈恆定區或其片段為IgG恆定區。
- 如請求項13之抗體或抗原結合片段,其中相對於野生型IgG恆定域,該IgG恆定域包含一或多個胺基酸取代,其中該經修飾之IgG的半衰期相較於具有該野生型IgG恆定域之IgG的半衰期延長。
- 如請求項14之經分離抗體或抗原結合片段,其中該IgG恆定域包含位置251至257、285至290、308至314、385至389及428至436之胺基酸殘基的一或多個胺基酸取代,其中該胺基酸位置編號係根據如Kabat中所列之EU索引進行。
- 如請求項15之經分離抗體或抗原結合片段,其中至少一個IgG恆定域胺基酸取代係選自由以下組成之群:(a)Kabat位置252之胺基酸經酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)或蘇胺酸(T)取代,(b)Kabat位置254之胺基酸經蘇胺酸(T)取代,(c)Kabat位置256之胺基酸經絲胺酸(S)、精胺酸(R)、麩醯胺酸(Q)、麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)或蘇胺酸(T)取代,(d)Kabat位置257之胺基酸經白胺酸(L)取代,(e)Kabat位置309之胺基酸經脯胺酸(P)取代, (f)Kabat位置311之胺基酸經絲胺酸(S)取代,(g)Kabat位置428之胺基酸經蘇胺酸(T)、白胺酸(L)、苯丙胺酸(F)或絲胺酸(S)取代,(h)Kabat位置433之胺基酸經精胺酸(R)、絲胺酸(S)、異白胺酸(I)、脯胺酸(P)或麩醯胺酸(Q)取代,(i)Kabat位置434之胺基酸經色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)、絲胺酸(S)、組胺酸(H)、苯丙胺酸(F)或酪胺酸取代,及(j)該等取代中之兩者或兩者以上之組合。
- 如請求項16之經分離抗體或抗原結合片段,其中相對於野生型人類IgG恆定域,該人類IgG恆定域包含Kabat位置252、254及256的胺基酸取代,其中(a)Kabat位置252之胺基酸經酪胺酸(Y)取代,(b)Kabat位置254之胺基酸經蘇胺酸(T)取代,及(c)Kabat位置256之胺基酸經麩胺酸(E)取代。
- 如請求項13至17中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中該人類IgG恆定域為人類IgG1恆定域。
- 如請求項17或18之抗體或其抗原結合片段,其中該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24。
- 如請求項8至19中任一項之抗體或其抗原結合片段,其包含選自由人類κ恆定區及人類λ恆定區組成之群的輕鏈恆定區。
- 如請求項20之抗體或其抗原結合片段,其中該輕鏈恆定區為人類κ恆定區。
- 如請求項21之抗體或其抗原結合片段,其中該重鏈及輕鏈分別包含胺基酸序列SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:22,或SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:26。
- 如請求項8至22中任一項之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或 其抗原結合片段為鼠類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、多特異性抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項8至23中任一項之抗原結合片段,其為Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv及sc(Fv)2。
- 如請求項8至24中任一項之抗體或其抗原結合片段,其可結合至人類IL-21及食蟹獼猴IL-21。
- 如請求項8至25中任一項之抗體或其片段,其不特異性結合至人類IL-2、IL-4、IL-7、IL-9或IL-15。
- 如請求項8至26中任一項之抗體或其片段,其抑制IL-21結合至該IL-21受體。
- 如請求項8至27中任一項之抗體或其片段,其為IL-21活性之拮抗劑。
- 如請求項8至28中任一項之抗體或其片段,其可抑制人類周邊血液單核細胞(PBMC)中IL-21介導之STAT3磷酸化。
- 如請求項29之抗體或其片段,其可抑制人類周邊血液單核細胞(PBMC)中人類及食蟹獼猴IL-21介導之STAT3磷酸化。
- 如請求項8至30中任一項之抗體或其片段,其可抑制IL-21介導之NK細胞產生干擾素-γ(IFN-γ)。
- 如請求項31之抗體或其片段,其可抑制人類及食蟹獼猴IL-21介導之NK細胞產生干擾素-γ(IFN-γ)。
- 如請求項31或32之抗體或其片段,其中該等NK細胞為經培養之NK-92細胞。
- 如請求項8至33中任一項之抗體或其片段,其可抑制IL-21介導之B細胞分化成漿細胞。
- 如請求項34之抗體或其片段,其可抑制人類及食蟹獼猴IL-21介導之受刺激之B細胞分化成漿細胞。
- 如請求項34或35之抗體或其片段,其可抑制CD4+ T細胞活化B細胞分化成漿細胞。
- 如請求項8至36中任一項之抗體或其抗原結合片段,其以藉由如用動力學排除分析(KinExA)3000平台所量測約100pM至約0.1pM之解離常數(KD)的親和力特徵特異性結合人類IL-21。
- 如請求項8至37中任一項之抗體或其抗原結合片段,其以藉由如用動力學排除分析(KinExA)3000平台所量測約100pM至約0.1pM之解離常數(KD)的親和力特徵特異性地結合食蟹獼猴IL-21。
- 如請求項37或38之抗體或其抗原結合片段,其中針對人類IL-21的KD為約0.515pM且針對食蟹獼猴IL-21的KD為約0.352pM。
- 如請求項8至39中任一項之抗體或其片段,其與選自由以下組成之群的藥劑結合:抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質、酵素、脂質、生物反應調節劑、醫藥劑、淋巴激素、異源抗體或其片段、可偵測標記、聚乙二醇(PEG),及兩種或兩種以上任何該等藥劑之組合。
- 一種組合物,其包含如請求項8至40中任一項之抗體或其片段,及載劑。
- 一種包含編碼抗體VL之核酸的經分離之聚核苷酸,其中該VL包含VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13及14;SEQ ID NO:34、35及36;SEQ ID NO:48、49及50;或SEQ ID NO:58、59及60一致,或除一或多個該等VL-CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
- 一種包含編碼抗體VH之核酸的經分離之聚核苷酸,其中該VH包含VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:7、8及9;SEQ ID NO:29、30及31;SEQ ID NO:43、44及45;或SEQ ID NO:53、54及55一致,或除一或多個該等VH-CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
- 一種包含編碼抗體VL之核酸的經分離之聚核苷酸,其中該VL包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:57。
- 一種包含編碼抗體VH之核酸的經分離之聚核苷酸,其中該VH包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:52。
- 如請求項42至45中任一項之聚核苷酸,其中包含該VH或該VL的抗體或其抗原結合片段可特異性結合至IL-21。
- 如請求項46之聚核苷酸,其中該抗體或其抗原結合片段與包含19E3、9F11、8B6或9H10之該VH及VL的抗體或其抗原結合片段特異性結合至相同的抗原決定基。
- 如請求項42至47中任一項之聚核苷酸,其中包含該VH或該VL的抗體或其抗原結合片段可結合至人類及食蟹獼猴IL-21。
- 一種載體,其包含如請求項42至48中任一項之聚核苷酸。
- 一種組合物,其包含如請求項42至48中任一項之聚核苷酸或如請求項49之載體。
- 一種聚核苷酸或聚核苷酸組合,其編碼如請求項1至8中任一項之結合分子或其抗原結合片段。
- 一種聚核苷酸或聚核苷酸組合,其編碼如請求項9至40中任一項 之抗體或其抗原結合片段。
- 一種組合物,其包含:包含編碼VH之核酸的聚核苷酸,及包含編碼VL之核酸的聚核苷酸,其中該VL及VH包含VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3胺基酸序列,該等胺基酸序列分別與SEQ ID NO:12、13、14、7、8及9;SEQ ID NO:34、35、36、29、30及31;SEQ ID NO:48、49、50、43、44及45;或SEQ ID NO:58、59、60、53、54及55一致,或除一或多個CDR中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外,其他一致。
- 一種組合物,其包含:包含編碼VH之核酸的聚核苷酸,及包含編碼VL之核酸的聚核苷酸,其中該VL及VH分別包含分別與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:37及40、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:47,及SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:57。
- 如請求項54之組合物,其中該VH及VL係由與選自由以下組成之群之參考核酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的核酸序列編碼:SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:46,或SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:56。
- 如請求項53至55中任一項之組合物,其中包含編碼VH之核酸的該聚核苷酸及包含編碼VL之核酸的該聚核苷酸處於同一載體中。
- 一種載體,其係根據請求項56。
- 如請求項53至55中任一項之組合物,其中包含編碼VH之核酸的該聚核苷酸及包含編碼VL之核酸的該聚核苷酸處於不同載體中。
- 一種載體,其係根據請求項58。
- 如請求項53至56或58中任一項之組合物,其中包含該VH及該VL的抗體或其抗原結合片段可特異性結合至IL-21。
- 如請求項60之組合物,其中包含該VH或該VL的抗體或其抗原結合片段可結合至人類及食蟹獼猴IL-21。
- 如請求項60或61之組合物,其中該抗體或其抗原結合片段可與包含19E3、9F11、8B6或9H10之該VH及VL的抗體或其抗原結合片段特異性結合至相同的抗原決定基。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項42至48或51至52中任一項之聚核苷酸,如請求項53至56、58、或60至62中任一項之組合物,或如請求項57或請求項59之載體。
- 一種製備如請求項8至40中任一項之抗體或抗原結合片段的方法,該方法包含(a)培養如請求項63之細胞;及(b)分離該抗體或其抗原結合片段。
- 一種診斷試劑,其包含如請求項8至40中任一項之抗體或抗原結合片段。
- 一種套組,其包含如請求項8至40中任一項之抗體,或如請求項41之組合物。
- 一種如請求項1至8中任一項之結合分子或其抗原結合片段、如請求項8至40中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項41之組合物的用途,其用於製造用以減少表現IL-21R之細胞中IL-21誘導之STAT3磷酸化的藥劑。
- 一種如請求項1至8中任一項之結合分子或其抗原結合片段、如請求項8至40中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項41之組合物的用途,其用於製造用以減少IL-21介導之NK細胞產生IFNγ的藥劑。
- 一種如請求項1至8中任一項之結合分子或其抗原結合片段、如請求項8至40中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項41之組合物的用途,其用於製造用以減少IL-21介導未處理或記憶B細胞分化成漿細胞的藥劑。
- 如請求項69之用途,其中漿細胞分化係由CD4+ T細胞活化。
- 一種如請求項1至8中任一項之結合分子或其抗原結合片段、如請求項8至40中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項41之組合物的用途,其用於製造用以治療自體免疫疾病或病症的藥劑。
- 一種如請求項1至8中任一項之結合分子或其抗原結合片段、如請求項8至40中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項41之組合物的用途,其用於製造用以預防自體免疫疾病或病症的藥劑。
- 如請求項71或72之用途,其中該自體免疫疾病為休格連氏症候群(Sjögren's syndrome,SS)、血管炎(ANCA/GCA)、全身性紅斑狼瘡或狼瘡腎炎、類風濕性關節炎(RA)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、重症肌無力,或其任何組合。
- 一種用於偵測樣品中之IL-21表現量的方法,該方法包含(a)使該樣品與如請求項1至8中任一項之結合分子或其抗原結合片段、如請求項8至40中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項41之組合物接觸及(b)偵測該樣品中與IL-21的結合。
- 一種包含第一抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物的用途,其 用於製造用以治療或預防移植物抗宿主疾病(GVHD)之藥劑,其中該第一抗體或片段特異性結合至IL-21抗原決定基,該IL-21抗原決定基為包含19E3、9F11、8B6或9H10之該重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之第二抗體或其抗原結合片段所特異性結合的相同IL-21抗原決定基。
- 一種包含第一抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物的用途,其用於製造用以治療或預防移植物抗宿主疾病(GVHD)之藥劑,其中該第一抗體或片段特異性結合至IL-21且競爭性地抑制包含19E3、9F11、8B6或9H10之該VH及VL之第二抗體或其抗原結合片段與IL-21之結合。
- 一種包含抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物之用途,其用於製造用以治療或預防移植物抗宿主疾病(GVHD)之藥劑,其中該抗體或片段特異性結合至IL-21且包含胺基酸序列分別與以下一致或除一或多者中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致的抗體VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3:(i)SEQ ID NO:12、13及14;(ii)SEQ ID NO:34、35及36;(iii)SEQ ID NO:48、49及50;或(iv)SEQ ID NO:58、59及60。
- 一種包含抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物之用途,其用於製造用以治療或預防移植物抗宿主疾病(GVHD)之藥劑,其中該抗體或片段特異性結合至IL-21,且包含胺基酸序列分別與以下一致或除一或多者中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致的抗體VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3:(i)SEQ ID NO:7、8及9;(ii)SEQ ID NO:29、30及31; (iii)SEQ ID NO:43、44及45;或(iv)SEQ ID NO:53、54及55。
- 一種包含抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物之用途,其用於製造用以治療或預防移植物抗宿主疾病(GVHD)之藥劑,其中該抗體或片段特異性結合至IL-21且包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:57。
- 一種包含抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物之用途,其用於製造用以治療或預防移植物抗宿主疾病(GVHD)之藥劑,其中該抗體或片段特異性結合至IL-21且包含與選自由以下組成之群的參考胺基酸序列至少85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:52。
- 如請求項75至80中任一項之用途,其中該抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列分別與以下一致或除一或多者中之四個、三個、兩個或一個胺基酸取代之外其他一致的VL-CDR1、VL-CRD2、VL-CDR3、VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3:(i)SEQ ID NO:12、13、14、7、8及9;(ii)SEQ ID NO:34、35、36、29、30及31;(iii)SEQ ID NO:48、49、50、43、44及45;或(iv)SEQ ID NO:58、59、60、53、54及55。
- 如請求項75至81中任一項之用途,其中該抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列分別與選自由以下組成之群的參考胺基酸序 列至少85%、90%、95%或100%一致的VH及VL:SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17;SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:21;SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25;SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39;SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39;SEQ ID NO:37及40;SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:47;以及SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:57。
- 如請求項75至82中任一項之用途,其中該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO:19且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO:21。
- 如請求項75至83中任一項之用途,其中該抗體或其抗原結合片段包含IgG恆定域。
- 如請求項84之用途,其中該IgG恆定域為IgG1恆定域。
- 如請求項84之用途,其中相對於野生型IgG恆定域,該IgG恆定域包含一或多個胺基酸取代,其中相較於具有該野生型IgG恆定域之IgG的半衰期,該經修飾之IgG的半衰期延長。
- 如請求項86之用途,其中該IgG恆定域包含Kabat位置251至257、285至290、308至314、385至389及428至436之胺基酸殘基的一或多個胺基酸取代。
- 如請求項86之用途,其中至少一個IgG恆定域胺基酸取代係選自由以下組成之群:(i)Kabat位置252之胺基酸經酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)或蘇胺酸(T)取代;(ii)Kabat位置254之胺基酸經蘇胺酸(T)取代;(iii)Kabat位置256之胺基酸經絲胺酸(S)、精胺酸(R)、麩醯胺酸(Q)、麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)或蘇胺酸(T)取代;(iv)Kabat位置257之胺基酸經白胺酸(L)取代; (v)Kabat位置309之胺基酸經脯胺酸(P)取代;(vi)Kabat位置311之胺基酸經絲胺酸(S)取代;(vii)Kabat位置428之胺基酸經蘇胺酸(T)、白胺酸(L)、苯丙胺酸(F)或絲胺酸(S)取代;(viii)Kabat位置433之胺基酸經精胺酸(R)、絲胺酸(S)、異白胺酸(I)、脯胺酸(P)或麩醯胺酸(Q)取代;(ix)Kabat位置434之胺基酸經色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)、絲胺酸(S)、組胺酸(H)、苯丙胺酸(F)或酪胺酸取代;及(x)該等取代中之兩者或兩者以上之組合。
- 如請求項86之用途,其中相對於野生型IgG恆定域,該IgG恆定域包含Kabat位置252、254及256之胺基酸取代,其中:(i)Kabat位置252之胺基酸經酪胺酸(Y)取代;(ii)Kabat位置254之胺基酸經蘇胺酸(T)取代;及(iii)Kabat位置256之胺基酸經麩胺酸(E)取代。
- 如請求項75至89中任一項之用途,其中該抗體或其抗原結合片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24的重鏈。
- 如請求項75至90中任一項之用途,其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由人類κ恆定區及人類λ恆定區組成之群的輕鏈恆定區。
- 如請求項91之用途,其中該輕鏈恆定區為人類κ恆定區。
- 如請求項75至92中任一項之用途,其中該抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列(i)SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18;(ii)SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:22;或(iii)SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:26。
- 如請求項75至93中任一項之用途,其中該抗原結合片段係選自 由以下組成之群:Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv及sc(Fv)2。
- 如請求項75至94中任一項之用途,其中該結合分子或其抗原結合片段係以藉由如用動力學排除分析(KinExA)3000平台所量測約100pM至約0.1pM之解離常數(KD)的親和力特徵特異性地結合人類IL-21。
- 如請求項95之用途,其中該KD為約0.515pM。
- 如請求項75至96中任一項之用途,其中該抗體或其抗原結合片段係以藉由如用動力學排除分析(KinExA)3000平台所量測約100pM至約0.1pM之解離常數(KD)的親和力特徵特異性地結合食蟹獼猴IL-21。
- 如請求項97之用途,其中該KD為約0.352pM。
- 如請求項75至98中任一項之用途,其中該抗體或其抗原結合片段為K44VHa-N56Q(SEQ ID:20及22)(MEDI7169)。
- 如請求項75至99中任一項之用途,其中該結合分子或其抗原結合片段係與異質製劑結合。
- 如請求項75至100中任一項之用途,其中該醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑中之一或多者。
- 如請求項75至101中任一項之用途,其中該醫藥組合物係藉由選自由以下組成之群的途徑投與:經口、非經腸、局部及吸入。
- 如請求項102之用途,其中該投與為非經腸投與。
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